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KR20180029953A - 세포 또는 유기체의 게놈으로의 ＤＮＡ 서열의 표적화 혼입을 위한 Ｃａｓ 9 레트로바이러스 인테그라제 시스템 및 Ｃａｓ 9 재조합효소 시스템 - Google Patents

세포 또는 유기체의 게놈으로의 ＤＮＡ 서열의 표적화 혼입을 위한 Ｃａｓ 9 레트로바이러스 인테그라제 시스템 및 Ｃａｓ 9 재조합효소 시스템 Download PDF

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KR20180029953A
KR20180029953A KR1020177031337A KR20177031337A KR20180029953A KR 20180029953 A KR20180029953 A KR 20180029953A KR 1020177031337 A KR1020177031337 A KR 1020177031337A KR 20177031337 A KR20177031337 A KR 20177031337A KR 20180029953 A KR20180029953 A KR 20180029953A
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글로리아 모
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엑셀리겐 사이언티픽, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시 내용은, 관심 대상의 DNA 서열(또는 관심 대상의 유전자)을 세포 또는 유기체의 게놈 내 표적된 위치로 전달하기 위하여, 바이러스성 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소가 부착된 카스9, Cpf1, TALE 및 징크 핑거 단백질(zinc finger protein)과 같은 공학적으로 조작된 단백질의 이용에 관한 것이다. DNA 절단에 있어서 그의 기능에 대해 비활성인 카스9의 이용은, 상동성 재조합을 위한 기타 다른 시스템에서 의도되는 바와 같은 DNA 파괴(break)를 유발하지 않으면서, RNA 가이드의 이용에 의해 DNA를 표적하는 카스9 단백질 능력의 이용을 가능하게 할 것이다. 바이러스성 인테그라아제 또는 재조합효소에 부착된 징크 핑거 단백질 또는 TALE(DNA의 특정 서열에 결합하는 공학적으로 조작된 단백질)의 이용이 또한 개시된다. 이러한 시스템은 실험실 및 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 유전자는, 세포 내 정상 유전자 산물을 회복하기 위하여 그의 유전자 산물을 생산하는 능력을 결여한 유전자를 갖는 세포 내로 포함될 수 있다(예를 들어, 유전자 산물은 단백질 또는 특수화된 RNA일 수 있다).

Description

세포 또는 유기체의 게놈으로의 ＤＮＡ 서열의 표적화 혼입을 위한 Ｃａｓ 9 레트로바이러스 인테그라제 시스템 및 Ｃａｓ 9 재조합효소 시스템
관련 출원에 대한 상호 참고문헌
본 출원은, 2015년 3월 31일 출원된 미국 가출원 62,140,454, 2015년 8월 27일 출원된 미국 가출원 62,210,451, 및 2015년 10월 12일 출원된 미국 가출원 62,240,359의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 모든 목적에 대해 참고문헌으로 포함된다.
서론
본 개시 내용은, 관심 대상의 DNA 서열(또는 관심 대상의 유전자)을 세포 또는 유기체의 게놈 내 표적된 위치로 전달하기 위하여, 링커에 의해 바이러스성 인테그라아제(integrase)(예를 들어, HIV 또는 MMTV 인테그라아제) 또는 재조합효소와 부착된, 카스(Cas)9(크리스퍼(CRISPR): 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 단백질), TALE 및 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein)과 같이 게놈 특이성을 나타내는 DNA 결합 단백질을 갖는 공학적으로 조작된(engineered) 단백질의 이용에 관한 것이다. DNA를 절단하는데 있어서 그의 기능에 대해 비활성인 카스9의 이용은, 상동성 재조합을 위하여 기타 다른 시스템에서 의도되는 바와 같은 DNA 파괴를 유발하지 않으면서 RNA 가이드(gRNA)의 이용에 의해 DNA를 표적하는 카스9 단백질 능력의 이용을 가능하게 할 것이다. 바이러스성 인테그라아제 또는 재조합효소에 부착된 징크 핑거 단백질 또는 TALE(DNA의 특정 서열에 결합하는 공학적으로 조작된 단백질)의 이용이 또한 개시된다. 본 시스템은 실험실 및 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 관심 대상의 유전자(들)를 함유하는 도너 (donor) DNA는, 기존의 방법을 통해 비-표적(off target) 절단 가능성 없이 숙주 게놈 내로 쉽게 도입될 수 있다. 도너 DNA는 또한 "녹아웃(knock out)" 전략을 촉진하기 위해 공학적으로 조작될 수 있다. 카스9 표적화의 특이성을 개선하기 위한 새로운 전략이 또한 논의된다. 이 전략은, 어떤 가이드 RNA가 카스9의 특이적 표적화를 제공하는지 발견하기 위한 분석에서, 가이드 RNA와 게놈성 DNA와 함께 표면 결합된 d카스9(그의 DNA 절단능에 대해 비활성인 카스 9)를 이용한다. 이는 크리스퍼/카스9의 생체 내 적용에서 특히 중요할 것이며, 실리코(silico) 예측 모델의 현재 한계를 극복하지만, 이는 또한 실리코 예측 모델과 연결하여 어떤 gRNA가 분석에서 사용될 지를 지식적으로 결정하는 데에 사용될 수 있다.
게놈 서열 분석(sequencing) 기법 및 분석 방법에서의 현재의 진보는, 다양한 범위의 생물학적 기능 및 질병과 연관된 유전적/게놈성 인자를 목록화하고 지도화하는 능력을 현저히 가속화시켜 왔다. 개별적인 유전적 요소의 선택적 교란 (perturbation)을 가능하게 함으로써 원인(causal) 유전자 변이의 체계적인 역조작 (reverse engineering)을 가능하게 하는데, 또한 합성 생물학, 생명공학, 및 의약 응용분야를 진보시키는 데, 정확한 게놈 표적화 기술이 요구된다. 설계자 징크 핑거, 전사 활성자-유사 이펙터(TALE: transcription activator-like effector), 크리스퍼/카스9 또는 메가뉴클레아제(meganuclease)와 같은 게놈-편집(genome-editing) 기법이 표적된 게놈 교란을 생성하는데 이용가능하며, 소정의 게놈 내 특정 장소 (location) 내로 DNA 서열(전체 유전자 서열 포함)의 혼입을 가능하게 할 신규 게놈 공학적 조작 기술에 대한 요구가 남아있다. 이는 공학적으로 조작된 유전자를 발현하는 세포주 또는 유전자이식(transgenic) 유기체의 생산, 또는 그를 필요로 하는 대상체에서 기능장애 유전자의 대체를 가능하게 할 것이다.
인테그라아제는 숙주 게놈(포유동물, 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 개구리, 물고기, 식물(작물 및 애기장대와 같은 실험용 식물), 실험실용 또는 생의학적 세포주 또는 일차 세포 배양물, C. 엘레간스(C. elegans), 파리(초파리), 등) 내로 바이러스성 핵산의 삽입을 가능하게 하는 바이러스성 단백질이다. 인테그라아제는, 바이러스성 핵산 서열을 숙주 게놈 내로 혼입시키기 위하여 인테그라아제를 숙주 게놈과 회합시키는데 숙주의 DNA 결합 단백질을 이용한다. 인테그라아제는 HIV(인간 면역결핍 바이러스)와 같은 레트로바이러스에서 발견된다. 인테그라아제는 그들의 게놈이 숙주 DNA 내로 삽입되도록 하는 바이러스성 유전자에 대한 서열에 따라 달라진다. 문헌 [Leavitt et. al, Journal of Biological Chemistry, 1993, volume 268, pages 2113-2119]은 위치 지정 돌연변이유발 및 시험관 내 연구를 이용함으로써 HIV1 인테그라아제의 기능을 시험하였다. Leavitt는 또한 바이러스성 인테그라아제에 의한 숙주 게놈 내로의 HIV1 DNA(역전사 후 생성됨)의 통합에 중요한 U5 및 U3 HIV1 att 위치의 서열을 표시한다.
본 개시 내용은, 원하는 핵산(DNA) 서열을 게놈 내 특정 장소에서 그 게놈 내로 특이적으로 삽입하는 것을 가능하게 함으로써 현재의 게놈 편집 기술을 개선한다. DNA 결합능을 갖는 재조합 공학적으로 조작된 인테그라아제(또는 재조합효소)는 게놈 내 소정의 DNA 서열에 결합하고, 위치 특이적 방식으로 게놈 내로 소정의 핵산 서열을 삽입하기 위하여, 인테그라아제 인식 도메인(예컨대, HIV1(또는 기타 다른 레트로바이러스) att 위치)을 갖는 제공된 DNA 서열 및/또는 상동염기서열 (homology arm)을 인식할 것이다. 본 개시 내용의 일 양태는 유전자의 전사 출발 위치 직후 정지 코돈(UAA, UAG 및/또는 UGA)의 DNA 서열을 삽입하는 것을 포함한다. 이는 세포 또는 유기체의 게놈 내 유전자 전사의 효과적인 저해를 가능하게 할 것이다.
본 개시 내용은, 징크 핑거 단백질, 탈렌(TALEN) 및 크리스퍼/카스9, 또는 CpF1과 같은 기타 다른 크리스퍼 단백질 등을 포함하는 DNA 타겟팅 기술을, 레트로바이러스성 인테그라아제와 연결하여 DNA 타겟팅 인테그라아제를 형성한다. 그 다음, 관심 대상의 유전자(GOI)는 DNA 표적화 인테그라아제와 제공되어 이는 표적된 방식으로 게놈 내로 혼입될 수 있다. GOI는 상동염기서열을 이용하여 설계되어 그의 게놈 내 삽입에 대해 또 다른 수준의 특이성을 제공할 것이다.
본 개시 내용은 특히 레트로바이러스성 인테그라아제와의 연결을 위해 DNA를 절단하는데 비활성인 변종 카스9의 이용에 관한 것이다.
본 개시 내용은 다음을 포함하는 시스템을 포함한다: A) 예를 들어, DNA 절단능에 대해 비활성인 카스 단백질(예를 들어, 카스9)에 공유결합적으로 연결된 바이러스성 인테그라아제(또는 박테리아성 재조합효소)를 포함한다. 대안적으로, 바이러스성 인테그라아제(또는 재조합효소)는, TALE 단백질 또는 징크 핑거 단백질에 공유결합적으로 연결되며, 여기서 이들 단백질은 게놈에서 DNA의 특정 서열을 표적하도록 설계된다. 이는 발현 벡터 내에 또는 정제된 단백질로서 제공될 수 있다; B) 원하는 게놈 내에 혼입되는, 상동염기서열이 있거나 또는 없는 관심 대상의 유전자(또는 관심 대상의 DNA 서열). 관심 대상의 GOI 또는 DNA 서열은 필요에 따라 바이러스성 인테그라아제에 의해 인식되도록 변형될 수 있다. 기타 다른 시약이 폴리뉴클레오티드 형질감염 및/또는 단백질의 세포 내로의 도입에 필요하였다. DNA 서열의 비표적 통합에 대한 분석. 일 양태에서, 삽입된 DNA 서열 내로 공학적으로 조작된 마커 서열을 이용한다.
본 명세서는, 작동적으로 연결된, a) 카스9, 비활성 카스9, 또는 Cpf1, 또는 이의 일부를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열; b) 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소(transposase), 또는 이의 일부를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열; 및 c) 핵산 링커를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 이때 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 핵산 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 연결되고, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 유기체 내 융합 단백질로서 발현될 수 있는, 핵산 구조물이 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 27 내지 46, 49, 56, 또는 68, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 카스9, 비활성 카스9, 또는 Cpf1은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 50, 52, 69, 72 내지 78, 또는 86 내지 92, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15, 17, 19, 21, 23, 47, 55, 62, 64, 66, 70, 또는 79, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소는 서열번호 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 48, 63, 65, 67, 71, 또는 80, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 본 명세서는 또한 상기 핵산 구조물을 포함하는 유기체를 기재한다. 본 명세서는 또한 융합 단백질을 포함하는 유기체를 기재하며 이때 유기체는 변형된 게놈을 갖는다.
본 명세서는, a) 카스9, 비활성 카스9, 또는 Cpf1, 또는 이의 일부를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열: b) 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소, 또는 이의 일부를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열; 및 c) 핵산 링커를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유기체를 제공하고, 이때 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 핵산 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 연결되고, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 유기체 내 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
본 명세서는 또한, a) 촉매적으로 비활성인 카스9, 카스9, TALE 단백질, 징크 핑거 단백질, 또는 Cpf1 단백질인, 표적 DNA 서열로 표적되는 제1 단백질; b) 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소인 제2 단백질; 및 c) 제2 단백질에 제1 단백질을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일부 구현예에서, 제2 단백질은 인테그라아제이거나; 인테그라아제는 HIV1 인테그라아제 또는 렌티바이러스성(lentiviral) 인테그라아제이거나; 링커 서열은 길이가 하나 이상인 아미노산이거나; 제1 단백질은 촉매적으로 비활성인 카스9이다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 길이가 4 개 내지 8 개의 아미노산이거나; 제1 단백질은 TALE 단백질이거나; 제1 단백질은 징크 핑거 단백질이다. 융합 단백질이 TALE 또는 징크 핑거 단백질을 포함하는 일부 구현예에서, 표적 DNA 서열은 길이가 약 16 개 내지 약 24 개의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 제1 단백질은 카스9 또는 촉매적으로 비활성인 카스9이고, 이때 하나 이상의 가이드 RNA가 약 16 개 내지 약 24 개 염기쌍의 표적 DNA 서열의 표적화에 사용된다.
본 명세서는 또한, a) 게놈성 DNA 내 표적 서열을 확인하는 단계; b) 제1항에 따른 융합 단백질이 게놈성 DNA 내 표적 서열에 결합하도록 설계하는 단계; 3) 관심 대상의 DNA 서열이 게놈성 DNA 내로 혼입되도록 설계하는 단계; 및 d) 세포 또는 유기체 내로 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열의 도입을 가능하게 하는 기법에 의해, 세포 또는 유기체에 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열을 제공하는 단계를 포함하고, 이때 관심 대상의 DNA 서열은 게놈성 DNA의 표적 서열에 통합되는, 게놈 DNA 내로 DNA 서열을 삽입하는 방법을 제공한다.
본 명세서는 또한, a) 카스9, 촉매적으로 비활성인 카스9, TALE 단백질, 징크 핑거 단백질, 표적 DNA 서열에 결합하도록 공학적으로 조작된 Cpf1 단백질인 제1 단백질에 대한 제1 코딩 서열; b) 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소인 제2 단백질에 대한 제2 코딩 서열; c) 제1 및 제2 단백질 사이에 아미노산 링커를 형성하는 제1 및 제2 코딩 서열 사이의 DNA 서열; d) 선택적으로, 인테그라아제에 의해 인식된 att 위치에 의해 둘러싸인 관심 대상의 발현된 DNA 서열, 및 선택적으로 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하고, 이때 제1 단백질은 결정된 DNA 서열에 표적되고, 제1 단백질은 아미노산 링커 서열에 의해 제2 단백질에 연결되는, 뉴클레오티드 벡터를 제공한다.
본 명세서는, a) 유전자 내 ATG 시작 코돈을 확인하는 단계; b) 제1항에 따른 융합 단백질을 이용하여 유전자의 ATG 시작 코돈 직후의 표적 서열에 결합하도록 융합 단백질 시스템을 설계하는 단계; c) 하나 이상의 연속적인 정지 코돈인 관심 대상의 DNA 서열을 설계하는 단계; 및 d) 세포 또는 유기체 내로 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열의 도입을 가능하게 하는 기법에 의해, 세포 또는 유기체에 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열을 제공하는 단계를 포함하고, 이때 관심 대상의 DNA 서열은 게놈성 DNA의 표적 서열에 통합되고, 유전자의 전사는 저해되는, 세포 또는 유기체에서 유전자 전사를 저해하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제2 단백질은 재조합효소이고; 재조합효소는 Cre 재조합효소 또는 이의 변형된 형태이며, 이때 변형된 Cre 재조합효소는 구성적(constitutive) 재조합효소 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 벡터는 세포 내에서 발현될 역전사효소 유전자를 추가로 포함한다.
본 명세서는 또한, DNA 결합 단백질/인테그라아제 융합 및 길이 약 15 개 내지 약 100 개의 염기쌍의 RNA의 정제된 단백질을 포함하고, 이때 DNA 결합 단백질은 게놈 내에서 표적된 DNA 서열에 대해 공학적으로 조작된 카스9, Cpf1, TALEN 및 징크 핑거 단백질로부터 선택되고, 이때 인테그라아제는 HIV 인테그라아제, 렌티바이러스성 인테그라아제, 아데노바이러스성 인테그라아제, 레트로바이러스성 인테그라아제, 또는 MMTV 인테그라아제인, 조성물을 제공한다.
하기의 상세한 기재는 당업자가 본 개시 내용을 실시하는 것을 돕기 위하여 제공된다. 그렇다 하더라도, 당업자는 본 발견의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에서 논의된 구현예에서의 변형 및 변경을 만들어 낼 수 있으므로, 이러한 상세한 기재가 본 개시 내용을 과도하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시 내용 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 그 문맥이 명백하게 그렇지 않은 것을 지시하지 않는다면, 복수의 지칭을 포함한다. 본 개시 내용 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 단수 또는 포괄적일 수 있다. 예를 들어, A 또는 B는 A 및 B일 수 있다.
내인성
본 명세서에서 기재된 바와 같은 내인성 핵산, 뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 숙주 유기체에 관련하여 정의된다. 내인성 핵산, 뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 숙주 유기체에서 자연발생적인 것이다.
외인성
본 명세서에서 기재된 바와 같은 외인성 핵산, 뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 숙주 유기체에 관련하여 정의된다. 외인성 핵산, 뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 단백질은 숙주 유기체에서 자연발생적이지 않은 것이거나, 숙주 유기체에서 다른 장소에 있는 것이다.
녹아웃(Knockout)
유전자는 외인성 핵산이 숙주 유기체 내로 형질전환되어(예를 들어, 랜덤 삽입 또는 상동성 재조합), (예를 들어, 결실, 삽입에 의한) 유전자의 붕괴를 초래하는 경우, 녹아웃된 것으로 여겨진다.
유전자의 녹아웃시, 상응하는 단백질의 활성은 감소될 수 있다. 예를 들어, 유전자가 녹아웃되지 않은 동일한 단백질의 활성에 비교시, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 100%이다.
유전자 외의 녹아웃시, 녹아웃되지 않았던 유전자에 비하여, 유전자의 전사는 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 100% 감소될 수 있다.
변형된
변형된 유기체는 변형되지 않은 유기체와 상이한 유기체이다. 예를 들어, 변형된 유기체는 표적된 유전자 서열의 녹아웃을 결과로서 초래하는 개시 내용의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 변형된 유기체는 변형된 게놈을 가질 수 있다.
변형된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 변형되지 않은 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 상이하다. 예를 들어, 핵산 서열은 삽입된, 결실된 또는 부가된 하나 이상의 핵산을 가질 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열은 삽입된, 결실된, 또는 부가된 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다.
작동적으로 연결된
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 제어 요소에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 프로모터 및/또는 전사 종결자를 포함한다. 핵산 서열은 또 다른 헥산 서열과 기능적 관계에 배치되는 경우 작동적으로 연결된 것이다. 예를 들어, 전구서열 또는 분비성 리더(secretory leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되거나; 번역을 용이하게 하기 위하여 배치되는 경우 리보솜 결합 위치는 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 작동적으로 연결된 서열은 근접성일 수 있으며, 분비 리더의 경우 근접성 및 판독 상(reading phase)에 있다.
숙주 세포 또는 숙주 유기체
숙주 세포는 본 개시 내용의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 다세포성 유기체의 일부이다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 단세포성 유기체로서 배양된다.
숙주 유기체는 임의의 적합한 숙주, 예를 들어 미생물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 미생물은, 예를 들어 박테리아(예를 들어, 대장균(E. coli)), 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)), 및 식물을 포함한다. 유기체는 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 유기체는 단세포성 또는 다세포성일 수 있다.
숙주 세포는 원핵성일 수 있다. 적합한 원핵성 세포로는, 이에 제한되지는 않지만, 대장균, 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 및 쉬겔라(Shigella) 종의 임의의 다양한 실험실 균주를 포함한다(예를 들어, 문헌 [Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181]; 미국 특허 6,447,784; 및 문헌 [Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302]에 기재된 바와 같음). 본 개시 내용에 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 및 S. 티피무리움(S. typhimurium)을 포함한다. 적합한 쉬겔라 균주는, 이에 제한되지는 않지만, 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei), 및 쉬겔라 디센테리에(Shigella disenteriae)를 포함한다. 통상적으로, 실험실 균주는 비병원성인 것이다. 기타 다른 적합한 박테리아의 비제한적인 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 슈도모나스 푸디타 (Pseudomonas pudita), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니(Pseudomonas mevalonii), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 및 로도코커스 종(Rhodococcus sp)을 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 유기체는 진핵성이다. 적합한 진핵성 숙주 세포는, 이에 제한되지는 않지만, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 진균류 세포, 및 조류 세포를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드[핵산 및 단백질]
본 개시 내용의 단백질은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단백질은 고체 상 펩티드 합성 또는 액체 상 펩티드 합성으로서도 알려져 있는 고전적인 방식인 펩티드 합성에 의한 것 중 어느 하나를 이용하여 합성될 수 있다. 출발 주형으로서 Val-Pro-Pro, 에날라프릴(Enalapril) 및 리시노프릴(Lisinopril)을 이용하여, X-Pro-Pro, X-Ala-Pro, 및 X-Lys-Pro와 같은 몇 가지 일련의 펩티드 유사체(이때, X는 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)는 고체 상 또는 액체 상 펩티드 합성을 이용하여 합성될 수 있다. 가용성 올리고머성 지지체에 커플링된 펩티드 및 올리고뉴클레오티드의 라이브러리의 액체 상 합성을 실시하기 위한 방법이 또한 기재되어 왔다. 문헌 [Bayer, Ernst and Mutter, Manfred, Nature 237:512-513 (1972)]; [Bayer, Ernst, et al., J. Am. Chem. Soc. 96:7333-7336 (1974)]; [Bonora, Gian Maria, et al., Nucleic Acids Res. 18:3155-3159 (1990)]. 액체 상 합성 방법이 반응 물질을 고체 상에 부착시키는 데 적합한 제1 반응 물질 상에 존재하는 구조물을 필요로 하지 않는다는 점에서, 액체 상 합성 방법은 고체 상 합성 방법에 비해 장점을 갖는다. 또한, 액체 상 합성 방법은 고체 상과 제1 반응물질(또는 중간체 생성물) 간의 결합을 분할할 수 있는 화학 조건을 회피하는 것을 필요로 하지 않는다. 추가적으로, 균질 용액 내 반응은, 고체 상 합성에서 존재하는 것과 같은 불균질 고체 상/액체 상 시스템에서 수득되는 것보다 더 양호한 수율 및 더 완벽한 반응을 제공할 수 있다.
올리고머-지지된 액체 상 합성에서, 증가하는 생성물은 큰 용해성 중합체성 기에 부착된다. 합성의 각 단계로부터의 생성물은, 비교적 큰 중합체-부착된 생성물과 미반응된 반응물질간에 크기에서의 큰 차이를 기준으로, 미반응된 반응물질로부터 이후 분리될 수 있다. 이는 반응이 균질 용액에서 일어나는 것을 가능하게 하며, 전통적인 액체 상 합성과 연관된 지루한 정제 단계를 제거한다. 올리고머-지지된 액체 상 합성은 펩티드의 자동적 액체 상 합성에 또한 맞추어진다. 문헌 [Bayer, Ernst, et al., Peptides: Chemistry, Structure, Biology, 426-432].
고체 상 펩티드 합성의 경우, 절차는 적절한 아미노산의 바람직한 서열의 펩티드 내로의 순차적인 조립을 수반하는 한편, 성장하는 펩티드의 말단은 불용성 지지체로 연결된다. 일반적으로, 펩티드의 카르복실 말단은 중합체에 연결되며, 이는 분할 시약을 이용한 처리시 중합체로부터 자유롭게 될 수 있다. 일반적인 방법에서, 아미노산은 수지 입자에 결합되며, 펩티드는 보호된 아미노산의 연속적인 첨가에 의해 단계적인 방식으로 생성되어 아미노산의 사슬을 생산한다. Merrifield에 의해 기재된 기법의 변형이 일반적으로 사용된다. 예를 들어, 문헌 [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 96: 2989-93 (1964)]을 참조한다. 자동화된 고체 상 방법에서, 펩티드는 카르복시-말단 아미노산을 유기 링커(예를 들어, PAM, 4-옥시메틸페닐아세트아미도메틸)를 부하함으로써 합성되며, 이는 디비닐 벤젠으로 가교결합된 불용성 폴리스티렌 수지에 공유결합적으로 부착된다. 말단 아민은 t-부틸옥시카르보닐을 차단함으로써 보호될 수 있다. 히드록실기 및 카르복실기는 일반적으로 O-벤질 기로 차단함으로써 보호된다. 합성은 Applied Biosystems사(미국 캘리포니아주 ㅍ포스터 시티 소재)로부터 입수가능한 것과 같은 자동화된 펩티드 합성기 내에서 달성된다. 합성 후, 생성물이 수지로부터 제거될 수 있다. 차단 기는, 수립된 방법에 따라, 플루오르화수소산 또는 트리플루오로메틸 술폰산을 이용함으로써 제거된다. 관례적인 합성은 0.5 밀리몰의 펩티드 수지를 생산할 수 있다. 분할 및 정제 후, 대략 60% 내지 70%의 수율로 통상적으로 생산된다. 생성물 펩티드의 정제는, 예를 들어 메틸-부틸 에테르와 같은 유기 용매로부터 펩티드를 결정화하고, 이후 증류수 내에 용해하고, 투석(대상 펩티드의 분자량이 약 500 달톤보다 큰 경우)을 이용하거나 또는 펩티드의 분자량이 500 달톤 미만인 경우 역상 고압 액체 크로마토그래피(예를 들어, 0.1% 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴을 용매로서 이용하여 C18 컬럼을 사용)를 이용함으로써 달성된다. 정제된 펩티드는 동결건조될 수 있고, 사용시까지 건조한 상태로 저장될 수 있다. 결과로서 생성된 펩티드의 분석은 분석적 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 전자분무 질량 분석법(ES-MS)의 일반 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
기타 다른 경우에, 단백질, 예를 들어 단백질은 재조합 방법에 의해 생산된다. 본 명세서에서 기재된 임의의 단백질의 생산을 위하여, 그러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 사용될 수 있다. 숙주 세포는 보다 고등의 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 보다 하등의 진핵 세포, 예컨대 효모일 수 있거나, 또는 숙주는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 발현 벡터의 숙주 세포 내로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포솜, 핵 내로의 직접 미세주입법(microinjection), 스크레이프 부하(scrape loading), 바이오리스틱 (biolistic) 형질전환 및 전기천공법(electroporation)을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 재조합 유기체로부터의 단백질의 큰 규모의 생산은 상업적 규모로 실시된 잘 수립된 공정이고, 당업자의 능력 내에서 충분하다.
코돈 최적화
암호화하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 코돈은 "편향(biased)" 또는 "최적화"되어 숙주 유기체의 코돈 선호도(codon usage)를 반영할 수 있다. 예를 들어, 암호화 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 코돈은 "편향" 또는 "최적화"되어 엽록체 코돈 선호도 또는 핵 코돈 선호도를 반영할 수 있다. 대부분의 아미노산은 둘 이상의 상이한 (퇴화) 코돈에 의해 암호화되며, 각종 유기체가 다른 것들에 선호하는 특정 코돈을 이용한다는 것은 잘 인식되어 있다. "편향된" 또는 "최적화된" 코돈은 명세서 전체에 걸쳐 상호변경가능하게 사용될 수 있다. 코돈 편향은, 예를 들어 조류를 포함한 상이한 식물에서 담배에 비해 다양하게 편향될 수 있다. 일반적으로, 선택된 코돈 편향은, 본 개시 내용의 핵산으로 형질전환되고 있는 식물(또는 그 안에 있는 세포소기관)의 코돈 선호도를 반영한다.
특정 코돈 선호도에 대해 편향된 폴리뉴클레오티드는 새로이 합성될 수 있거나, 또는 예를 들어 위치 지정 돌연변이유발 방법에 의해, 관례적인 재조합 DNA 기법을 이용하여 유전적으로 변형되어 그들이 엽록체 코돈 선호도에 대해 편향되도록 하나 이상의 코돈을 변화시킬 수 있다.
서열 동일성 백분율
핵산 또는 폴리펩티드 서열들 간의 서열 동일성 백분율 또는 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 일 예는 BLAST 알고리즘으로, 이는 예를 들어 문헌 [Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬(alignment)의 민감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 11의 단어 길이(W), 10의 예측(E), 100의 컷오프(cutoff), M=5, N=4, 및 두 가닥 모두의 비교를 기본값(default)으로서 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 3의 단어 길이(W), 10의 예측(E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 기본값으로서 사용한다(예를 들어, 문헌 [Henikoff & Henikoff (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:10915]에 기재된 바와 같음). 서열 동일성 퍼센트의 계산에 추가하여, BLAST 알고리즘은 또한 두 개의 서열들 간의 유사성의 통계적 분석을 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Karlin & Altschul, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA, 90:5873-5787 (1993)]에 기재된 바와 같음). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 일 측정은 최소 합계 확률(P(N))로, 이는 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 간의 매치가 우연히 일어날 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산 대 참조 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 참조 서열에 대해 유사한 것으로 여겨진다.
본 개시 내용은 A) 예를 들어, DNA 절단능에 대해 비활성인, 카스 단백질(예를 들어, 카스9)에 공유결합적으로 연결된 바이러스성 인테그라아제(또는 재조합효소)를 포함하는 시스템을 포함한다. 대안적으로, 바이러스성 인테그라아제(또는 박테리아성 또는 파지 재조합효소)는 TALE 단백질 또는 징크 핑거 단백질에 공유결합적으로 연결되며, 여기서 이들 단백질은 게놈 내 DNA의 특정 서열을 표적화하도록 설계된다.
이는 발현 벡터 내에 또는 정제된 단백질로서 제공될 수 있다. B) 원하는 게놈 내로 혼입되는 상동염기서열 없이 또는 그를 갖는 관심 대상의 유전자(또는 관심 대상의 DNA 서열). GOI 또는 관심 대상의 DNA 서열은 필요에 따라 바이러스성 인테그라아제에 의해 인식되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스성 att 위치는 DNA 서열의 말단에 첨가될 수 있다. C) 폴리뉴클레오티드 형질감염 및/또는 단백질의 세포로의 도입에 필요한 기타 다른 시약.
핵산
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본 개시 내용에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이의 유사체 중 어느 하나의 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3 차원의 구조물을 가질 수 있으며, 알려진 또는 미지의, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예들이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저(messenger) RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭(short interfering) RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조물에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
가이드 RNA
본 개시 내용의 양태에서, 용어 "키메라성 RNA", "키메라성 가이드 RNA", "가이드 RNA", "단일 가이드 RNA" 및 "합성 가이드 RNA"는 상호교환가능하게 사용되고, 가이드 서열, tracr 서열 및 tracr 메이트(mate) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "가이드 서열"은 표적 위치를 특정하는 가이드 RNA 내의 약 20 bp(12 bp 내지 30 bp)를 지칭하며, 이는 용어 "가이드" 또는 "스페이서 (spacer)"와 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "tracr 메이트 서열"은 또한 "직접 반복 서열(들)"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
야생형
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "야생형"은 숙련자가 이해하는 기술 용어이며, 돌연변이 또는 변종 형태와 구분되는 자연 중에 발생하는 바와 같은, 유기체, 균주(strain), 유전자 또는 특징의 통상적인 형태이다.
변종
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "변종" 또는 "돌연변이"는 자연 발생하는 것에서 벗어나는 패턴을 갖는 성질의 표출을 의미하는 것으로 받아들여져야 한다. 유전자와 관련하여, 이들 용어는 특히 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 삽입, 결실, 유전자 이동(shift)을 포함하는 야생형 유전자와 상이하게 하는 유전자에서의 다수의 변화를 나타낸다.
공학적으로 조작된
용어 "자연발생적이지 않은" 또는 "공학적으로 조작된"은 상호교환가능하게 사용되며, 인공 기술의 수반을 나타낸다. 이 용어가 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭하는 경우, 그 핵산 분자 또는 폴리펩티드가, 자연에서 자연적으로 회합되고, 자연에서 발견되는 바와 같은 하나 이상의 기타 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미한다.
상보적
"상보성"은, 핵산이 전통적인 왓슨-크릭 또는 기타 다른 전통적이지 않은 유형 중 어느 하나에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 퍼센트는 제2 핵산 서열과 함께 수소 결합을 형성할 수 있는(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍) 핵산 분자 내 잔기의 백분율을 표시한다(예를 들어, 10 개 중 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개인 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보성). "완전히 상보적"은 핵산 서열의 모든 연속적인 잔기가 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 연속적인 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "실질적으로 상보적"은, 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 상보성 정도, 또는 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸친 백분율을 지칭하거나, 또는 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 두 개의 핵산을 지칭한다.
아미노산
전체 명, 3 문자 코드, 1 문자 코드
아스파르트산 Asp D
글루탐산 Glu E
라이신 Lys K
아르기닌 Arg R
히스티딘 His H
티로신 Tyr Y
시스테인 Cys C
아스파라긴 Asn N
글루타민 Gln Q
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
글리신 Gly G
알라닌 Ala A
발린 Val V
류신 Leu L
이소류신 Ile I
메티오닌 Met M
프롤린 Pro P
페닐알라닌 Phe F
트립토판 Trp W
본 명세서에서 사용된 바와 같은 표현 "아미노산"은 천연 및 합성 아미노산을 모두 포함하는 것을 의미한다. "표준 아미노산"은 자연발생적인 단백질/펩티드에서 일반적으로 발견되는 20 개의 표준 L-아미노산 중 임의의 것을 의미한다. "비-표준 아미노산 잔기"는, 합성적으로 제조되거나 천연 공급원으로부터 유도되는지의 여부에 관계없이 표준 아미노산 외의 임의의 아미노산을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "합성 아미노산"은 화학적으로 변형된 아미노산을 포괄하며, 염, 아미노산 유도체(예컨대, 아미드), 및 치환기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본 개시 내용의 펩티드 내에 함유된, 그리고 특히 카르복시-말단 또는 아미노-말단에서 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 또는 그의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 기타 다른 화학 기로 치환함으로써 변형될 수 있다. 추가적으로, 이황화물 연결은 펩티드 내에 존재 또는 부재할 수 있다.
아미노산은 측쇄 R을 기준으로 7 개의 군으로 분류될 수 있다: (1) 지방족 측쇄; (2) 히드록실(OH) 기를 함유하는 측쇄; (3) 황 원자를 함유하는 측쇄; (4) 산성 기 또는 아미드 기를 함유하는 측쇄; (5) 염기성 기를 함유하는 측쇄; (6) 방향족 고리를 함유하는 측쇄; 및 (7) 프롤린, 즉 측쇄가 아미노기와 융합된 이미노산.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "보존성 아미노산 치환"은 본 명세서에서 하기 5 개 군 중 하나 내에서 교환되는 바와 같이 정의된다:
I. 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 그들의 아미드;
Asp, Asn, Glu, Gin;
III. 극성, 양으로 하전된 잔기:
His, Arg, Lys;
IV. 큰, 지방족, 비극성 잔기;
Met, Leu, He, Val, Cys(Ile; 자동 수정은 읽을 수 없음)
V. 큰, 방향족 잔기:
Phe, Tyr, Tip(Trp, 유사)
본 개시 내용은, 달리 제공되지 않는 경우, 당업계의 기술에 속하는, 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈학 및 재조합 DNA의 통상의 기법을 이용한다. 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989)]; [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))]; [시리즈 METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))]을 참조한다.
벡터
유전자 발현 벡터(DNA-계 또는 바이러스성)는 세포 또는 조직에서 융합 인테그라아제를 발현하고, 또한 관심 대상의 DNA 서열(또는 유전자)을 인테그라아제 또는 재조합효소가 숙주 종 또는 세포의 게놈 내로 그 DNA(또는 유전자)를 통합시키는 데 필요한 적절한 위치에 제공하는 데 사용될 것이다. 다수의 유전자 발현 벡터가 당업계에서 알려져 있다. 벡터는 관심 대상의 유전자(또는 관심 대상의 DNA 서열)를 위해 이용될 것이다. 벡터는 당업계에서 알려진 다수의 제한 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
크리스퍼/카스9
크리스퍼/카스9는 미국 특허 8697359, 미국 특허 8889356 및 문헌 [Ran et al, Nature Protocols, 2013, volume 8, pages 2281-2308]에 기재되어 있다. 카스9 단백질은, 게놈 내 DNA의 특정 서열에 결합하기 위하여 RNA 가이드를 이용한다. RNA 가이드(가이드 RNA)는 길이가 10 개 내지 40 개, 12 개 내지 35 개, 15 개 내지 30 개, 또는 예를 들어, 18 개 내지 22 개, 또는 20 개인 뉴클레오티드로 설계될 수 있다. 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 카스9를 이용하는, 문헌 [Hsu et al, Nature Biotechnology, September 2013, volume 31, pages 827-832]을 참조한다. 또 다른 주요 카스9는 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus Aureus)로부터의 것이다(S. 파이오제네스의 것보다 더욱 작은 카스9). 카스9 단백질은 DNA 서열의 특정 영역에 결합하기 위하여 가이드 RNA를 이용한다.
촉매적으로 비활성 형태의 카스9가 문헌 [Guilinger et al, Fusion of catalytically inative Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification, Nature Biotechnology, April 25, 2014, volume 32, pages 577-582]에 기재되어 있다. Guilinger외 다수는 촉매적으로 비활성인 카스9를 Fok1 효소에 부착시켜 게놈성 DNA에서 절단부를 형성하는 데 있어서 더 큰 특이성을 달성한다. 이러한 촉매적으로 비활성인 카스9는, DNA를 절단할 수는 없는 반면, 카스9가 게놈성 DNA의 결합에 대한 RNA 가이드를 이용하는 것을 가능하게 한다.
카스9는 또한 그의 자연의 야생형 형태, 및 또한 세포 내에서 카스9 구조물의 더 양호한 발현을 위해 인간 최적화된 코돈 형태로 이용가능하다(문헌 [Mali et al, Science, 2013, volume 339, pages 823-826] 참조). 카스9의 코돈 최적화는 그의 발현을 위한 종에 따라 수행될 수 있다. 인테그라아제/카스9 융합 단백질의 단백질 형태(애비1으로서도 알려짐) 또는 뉴클레오티드 발현 벡터 형태가 생산되느냐에 따라, 최적화된 또는 비-최적화된 (야생형) 형태가 사용될 수 있다.
특정 DNA 서열을 향한 RNA 가이드는 각종 컴퓨터-기반 도구에 의해 설계될 수 있다.
크리스퍼/CPF1
Cpf1은, 게놈성 DNA에서 특정 서열을 결합하기 위하여 가이드 RNA를 이용하는 또 다른 단백질이다. Cpf1은 또한 DNA를 절단하여 엇갈림(staggered) 절단을 만든다. Cpf1은 절단능에 대해 촉매적으로 비활성으로 될 수 있다.
기타 다른 크리스퍼 단백질
이들은, DNA를 절단하는 능력을 갖는지의 여부에 관계없이, 특정 DNA 서열을 표적하기 위하여 가이드 RNA를 이용하는 단백질이다. 이들 단백질들 중 일부는 기타 다른 효소/촉매 기능을 자연적으로 가질 수 있다.
탈렌(TALEN)
전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제(탈렌)는 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 분할 도메인에 융합시킴으로써 생성된 제한 효소를 갖는 융합 단백질이다. 이들 시약은 효율적이고, 프로그램화가능하며, 특이적 DNA 분할을 가능하게 하고, 동일계내(in situ) 게놈 편집을 위한 강력한 도구를 나타낸다. 전사 활성자-유사 이펙터(TALE)는 실질적으로 임의의 DNA 서열을 결합하기 위하여 신속하게 공학적으로 조작될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 탈렌은 광범위하고, 또 다른 탈렌으로부터의 보조 없이 이중 가닥 DNA를 분할할 수 있는 단량체성 탈렌을 포함한다. 용어 탈렌은 또한 동일한 위치에서 DNA를 분할하는데 함께 작용하도록 공학적으로 조작된 탈렌들의 쌍의 하나 또는 두 멤버(member) 모두를 지칭하는 데 사용된다. 함께 작용하는 탈렌은, DNA의 손잡이 방향(handedness)을 지칭하는, 왼쪽-탈렌 및 오른쪽-탈렌으로서 지칭될 수 있다. 미국 특허 8,440,432를 참조한다.
TAL 이펙터는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비된 단백질이다. DNA 결합 도메인은 12 번째 및 13 번째 아미노산을 제외하고 고도로 보존된 33 개 내지 34 개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 두 장소는 매우 가변적이고(반복 가변성 2잔기(RVD: Repeat Variable Diresidues), 특정 뉴클레오티드 인식과의 강한 상관관계를 나타낸다. 아미노산 서열과 DNA 인식 간의 이러한 단순한 관계는 적절한 RVD를 함유하는 반복 절편들(segment)의 조합을 선택함으로써 특정 DNA 결합 도메인의 공학적 조작을 가능하게 한다.
인테그라아제 또는 재조합효소는 효모 또는 세포 분석에서 활성인 혼성 인테그라아제 또는 재조합효소를 구축하는 데 사용될 수 있다. 이들 시약은 또한 식물 세포 및 동물 세포에서 활성이다. 탈렌 연구는 야생형 Fokl 분할 도메인을 사용하였지만, 일부 이후의 탈렌 연구는 또한 분할 특이성 및 분할 활성을 개선시키기 위해서 설계된 돌연변이를 갖는 Fokl 분할 도메인 변종을 사용하였다. 탈렌 DNA 결합 도메인과 인테그라아제 또는 재조합효소 도메인 간의 아미노산 잔기의 수와, 두 개의 개별적인 탈렌 결합 위치 간의 염기 수는 모두 고도의 활성을 달성하기 위한 파라미터이다. 탈렌 DNA 결합 도메인과 인테그라아제 또는 재조합효소 도메인간의 아미노산 잔기의 수는, 복수의 TAL 이펙터 반복 서열과 인테그라아제 또는 재조합효소 도메인 사이에 스페이서(스페이서 서열과 다름)의 도입에 의해 변형될 수 있다. 스페이서 서열은 6 개 내지 102 개 또는 9 개 내지 30 개의 뉴클레오티드 또는 15 개 내지 21 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 이들 스페이서는 DNA 표적 단백질(카스9, TALE 또는 징크 핑거 단백질)과 인테그라아제 또는 재조합효소간에 연결을 제공하는 것 외에 기타 다른 활성을 혼성 단백질에 일반적으로 제공하지 않을 것이다. 스페이서에 대한 아미노산 및 본 개시 내용에서의 기타 다른 용도를 위한 아미노산이 존재한다.
아미노산 서열 및 탈렌 결합 도메인의 DNA 인식 간의 관계는 설계가능한 단백질을 가능하게 한다. 이 경우, TALE 결합 도메인에서 발견되는 반복적인 서열의 부적절한 어닐링으로 인해 인공 유전자 합성은 문제가 있다. 이에 대한 일 해결책은 올리고뉴클레오티드 조립에 뒤이어 전체 유전자 증폭이라는 2 단계 PCR에서의 조립에 적합한 올리고뉴클레오티드를 찾기 위해 공개적으로 입수가능한 소프트웨어 프로그램인 DNAWorks를 이용하는 것이다. 공학적으로 조작된 TALE 구조물을 생성하기 위한 다수의 모듈 조립 방법 또한 당업계에 보고되어 있다.
일단 탈렌 유전자가 함께 조립되면, 이들은 플라스미드 내로 삽입되고; 플라스미드는 이어서 표적 세포를 형질감염시키는 데 사용되고, 여기서 유전자 산물이 발현되고 핵을 도입하여 게놈에 접근한다. 탈렌은, 세포들이 반응하는, 이중-가닥 파괴(DSB)를 유도함으로써 DNA 수복으로 게놈을 편집하는 데 사용되지만, 본 개시 내용은 바이러스성 인테그라아제 또는 박테리아성 또는 파지 재조합효소의 힘을 이용하여 관심 대상의 DNA 서열을 게놈 내 표적된 위치 내로 삽입하고자 한다. WO 2014134412 및 미국 특허 8748134의 개시 내용을 참조한다.
징크 핑거 단백질
DNA 결합을 위한 징크 핑거 단백질 및 그의 설계는 미국 7928195, 미국 2009/0111188, 및 미국 7951925에 기재되어 있다. 징크 핑거 단백질은 다수의 연결된 징크 핑거 도메인을 명시된 순서로 DNA의 특정 서열에 결합한다. 징크 핑거 단백질 엔도뉴클레아제는 잘 확립되어 있다.
징크 핑거 단백질(ZFP)은 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합할 수 있는 단백질이다. 징크 핑거들은 아프리카 발톱 두꺼비(제노푸스 래비스(Xenopus laevis))의 난자로부터의 전사 인자인 TFIIIA에서 최초로 확인되었다. 이러한 ZFP 부류의 단일 징크 핑거 도메인은 길이가 약 30 개 아미노산이고, 몇몇 구조 연구로부터 이는, 두 개의 시스테인과 두 개의 히스티딘에 의한 아연 원자의 배위를 통하여 특정 입체 배좌로 유지되는, 베타 회전(두 개의 보존된 시스테인 잔기를 함유) 및 알파 나선(두 개의 보존된 히스티딘 잔기를 함유)을 함유한다는 것이 증명되었다. ZFP의 이러한 부류는 또한 C2H2 ZFP로도 알려져 있다. ZFP의 추가의 부류가 또한 제안되어 왔다. 예를 들어, Cys-Cys-His-Cys (C3H) ZFP의 논의에 대한 문헌 [Jiang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:10723-10730]을 참조한다. 이제까지, 10,000 개가 넘는 징크 핑거 서열이 알려지거나 추정적인 수천 개의 전사 인자들 내에서 확인되어 왔다. 징크 핑거 도메인은 DNA 인식뿐만 아니라, RNA 결합 및 단백질-단백질 결합에도 연루된다. 이러한 부류의 분자는 모든 인간 유전자들 중 약 2%를 구성할 것으로 현재 추산되어 있다.
많은 징크 핑거 단백질은, 각 핑거 도메인에서 단일 아연 원자를 정사면체-배위하는 시스테인 및 히스티딘 잔기를 보존하였다. 특히, 대부분의 ZFP는 일반 서열: -Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His-(서열번호 49, 여기서 X는 임의의 아미노산(C2H2 ZFPs)을 나타냄)의 핑거 성분에 의해 특징지어진다. 이렇게 가장 광범위하게 표시되는 부류의 아연-배위 서열은 특정 간격(spacing)을 갖는 두 개의 시스테인 및 두 개의 히스티딘을 함유한다. 각각의 핑거의 접힌 구조는 역평행 β-회전, 핑거 팁 영역 및 짧은 양친매성 α-나선을 함유한다. 금속 배위 리간드는 아연 이온에 결합하고, zif268-형 징크 핑거의 경우에서, 짧은 양친매성 α-나선은 DNA의 주요 그루브(groove)에 결합한다. 추가적으로, 징크 핑거의 구조는 특정의 보존된 소수성 아미노산 잔기에 의해(예를 들어, 제1 보존된 Cys에 바로 선행하는 잔기 및 핑거의 나선 절편의 +4 위치에서의 잔기) 그리고 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기를 통한 아연 배위에 의해 안정화된다.
게놈성 DNA에서 특정 표적 서열에 결합할 수 있는 기타 다른 DNA 결합 단백질
이런 단백질은, 각종 유기체의 게놈성 DNA의 특정 서열에 결합할 수 있는 징크 핑거 단백질, 탈렌 및 크리스퍼 단백질에 관련되지 않은 것들을 포함한다. 이들은 전사 인자, 전사 리프레서(repressor), 메가뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 DNA 결합 도메인 및 기타를 포함할 수 있다.
인테그라아제
인테그라아제 및 이의 엔도뉴클레아제 융합 단백질은 미국 2009/0011509에 기재되어 있다. 도입된 인테그라아제는 렌티바이러스성 인테그라아제 및 HIV1(인간 면역결핍 바이러스 1) 인테그라아제이다. 본 개시 내용은 촉매적으로 비활성인(또는 활성인) 카스9, TALE 또는 징크 핑거 단백질을 인테그라아제에 융합시켜서, 그 인테그라아제를 사용자에 의해 선택된 게놈에서 DNA의 특정 영역에 표적한다.
기타 다른 레트로바이러스성 인테그라아제와 같이, HIV-1 인테그라아제는 긴 말단 반복서열(LTR)의 U3 및 U5 영역에 위치한 바이러스성 DNA의 말단에서 특별한 특징부를 인식할 수 있다((Brown, 1997). LTR 말단은 레트로바이러스의 통합 기계에 의한 인식을 위해 cis에서 요구되는 것으로 생각되는 유일한 바이러스 서열이다. 짧은 불완전한 전환된 반복서열은 쥐과 및 조류 레트로바이러스 모두에서의 LTR의 외측 가장자리에 존재한다(문헌 [Reicin et al., 1995]에 의해 검토됨). 레트로바이러스성 DNA 말단에서 최외측 위치 3 및 4에 위치된 부말단 CA(3' 말단 가공된 뉴클레오티드가 있는 1 및 2 위치)와 함께, 이들 서열은 시험관 내 및 생체 내 프로바이러스성(proviral) 통합을 정정하는 데 필요 충분하다. CA 디뉴클레오티드에 대한 내부 서열은 최적 인테그라아제 활성에 중요한 것으로 보인다(Brin & Leis, 2002a; Brin & Leis, 2002b; Brown, 1997). HIV-1 LTR의 말단 15 bp는 정확한 3' 말단 가공 및 시험관 내 가닥 전달 반응에 매우 중요한 것으로 나타났다(Reicin et al., 1995; Brown, 1997). HIV-1 IN에 의해, 더 긴 기질이 짧은 기질보다 더욱 효율적으로 사용되며, 이는 결합 상호작용이 바이러스성 DNA 말단으로부터 내측으로 적어도 14 bp 내지 21 bp를 연장함을 나타낸다. 문헌 [Brin and Leis (2002a)]은 HIV-1 LTR의 특이적 특징들을 분석하였으며, U5 LTR이 시험관 내 IN 가공에 더 효율적인 기질이라 하더라도(Bushman & Craigie, 1991; Sherman et al., 1992), U3 및 U5 LTR 인식 서열 둘 모두가 IN-촉진된 공동의 DNA 통합에 요구된다고 결론지었다. IN 인식 서열의 위치 17 내지 20은 공동의 DNA 통합 메커니즘에 필요하지만, HIV-1 IN은 불변성 부말단 CA 디뉴클레오티드로부터 연장하는 U3 및 U5 말단 모두에서 상당한 변화를 감내한다(Brin & Leis, 2002b). 본 개시 내용은, 게놈 내로 통합되는 관심 대상의 DNA 서열 또는 유전자를 수용하기 위한 장소인 5' 및 3' 말단에서 바이러스성(레트로바이러스성 또는 HIV) LTR 영역을 함유하는 DNA 벡터를 포함한다. LTR 영역은, 이들이 적절한 통합을 위해 인테그라아제와 상호작용하는 기능을 하는 한, 전장 LTR이어야 할 필요는 없다. LTR 영역은 검출가능성이거나(예를 들어, 형광), PCR 검출, 또는 선택성 마커(예를 들어, 항생제 내성)를 함유하도록 변형될 수 있다. 벡터는, LTR 영역이 (제한 엔도뉴클레아제에 대해 설계된 제한 위치를 통해) DNA 단편의 5' 및 3' 말단에 존재하도록, 절단되고 선형화되도록 설계된다.
인테그라아제는 유연성 링커에 의해 연결된 3 개의 도메인으로 이루어진다. 이들 도메인은 N-말단 HH-CC 아연-결합 도메인, 촉매성 코어 도메인 및 C-말단 DNA 결합 도메인이다(Lodi et al, Biochemistry, 1995, volume 34, pages 9826-9833). 본 개시 내용의 일부 양태에서, 카스9(또는 기타 다른 DNA 결합 분자)에 결합된 인테그라아제는 C-말단 결합 도메인을 갖지 않을 것이다. 본 개시 내용의 일 양태에서, 두 개의 상이한 융합 단백질이 생산될 것인데, 여기서 하나는 인테그라아제의 N-말단 아연 결합 도메인과 융합된 촉매적으로 비활성인 카스9(또는 TALE 또는 징크 핑거 단백질)이고, 다른 하나는 인테그라아제의 촉매적 코어 도메인과 융합된 촉매적으로 비활성인 카스9(또는 TALE 또는 징크 핑거 단백질)를 갖는다. 두 개의 상이한 융합 단백질은 TALE-Fok1 또는 징크 핑거-Fok1 시스템으로 알려진 바와 같이 게놈성 DNA의 반대 가닥에 결합하도록 설계될 것이다. 이러한 방식으로, N-말단 도메인 및 촉매적 코어가 게놈성 DNA 상의 위치에서 접촉하는 경우, 이는 인테그라아제 활성을 나타낼 것이다. 인테그라아제의 완전한 활성은 또한 인테그라아제의 4량체를 연루하는 것으로 관찰되어 왔기 때문에, 융합 단백질은 길이가 1 개 내지 20 개의 아미노산 또는 길이가 4 개 내지 12 개의 아미노산일 수 있는 유연성 링커에 의해 연결된 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 인테그라아제 단백질을 이용하여 설계될 수 있다.
재조합효소
Cre, Flp, R, Dre, Kw, 및 Gin 재조합효소를 포함하는 재조합효소는 미국 8816153 및 미국 2004/0003420에 기재되어 있다. Cre 재조합효소와 같은 재조합효소는 게놈으로부터의 서열을 잘라내기 위하여 LoxP 위치를 사용한다. 재조합효소는 그의 재조합 활성에 대하여 구성적으로 활성되고 덜 위치특이적이 되도록 변형될 수 있다. 이에 따라, 서열 특이성을 갖지 않는 그러한 구성적으로 활성인 재조합효소 단백질을, 본 개시 내용의 융합 단백질 내로 포함시킴으로써 게놈 내 DNA의 특정 서열에 대해 표적하는 것이 가능하다. 이러한 방식으로, 크리스퍼/카스9, TALE 또는 징크 핑거 단백질 도메인은, 재조합효소가 그의 재조합 활성에 기여할 DNA 서열을 특정한다. 그러한 재조합효소 단백질은 야생형으로, 재조합효소 활성에 대하여 구성적으로 활성이거나 활성이 아닐 수 있다. 카스9-Gin 또는 카스9-Cre와 같은 카스9-재조합효소는 링커 서열의 이용 또는 직접 융합에 의해 생산될 수 있다.
융합 단백질에 대한 핵 국소화 신호 서열(NLS: Nuclear Localization Signal Sequence)
신호 펩티드 도메인(또한 "NLS"로도 지칭됨)은, 예를 들어 효모 GAL4, SKI3, L29 또는 히스톤 H2B 단백질, 폴리오마 바이러스 거대 T 단백질, VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, SV40 VP1 또는 VP2 캡시드 단백질, 아데노바이러스 E1a 또는 DBP 단백질, 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질, 간염 바이러스 코어 항원 또는 포유동물 라민(lamin), c-myc, max, c-myb, p53, c-erbA, jun, Tax, 스테로이드 수용체 또는 Mx 단백질(문헌 [Boulikas, Crit. Rev. Eucar. Gene Expression, 3, 193-227 (1993)] 참조), 유인원(simian) 바이러스 40("SV40") T-항원(Kalderon et. al, Cell, 39, 499-509 (1984)) 또는 알려진 핵 국소화를 갖는 기타 다른 단백질로부터 유래된다. NLS는, 예를 들어 SV40 T-항원으로부터 유래되며, 당업계에서 알려진 기타 다른 NLS 서열일 수 있다. 탠덤 NLS 서열이 사용될 수 있다.
링커 영역
합성되는 융합 단백질/펩티드 사이에 사용된 다양한 링커는 아미노산으로 구성될 것이다. DNA 수준에서, 이들은 유전자 코드에서 알려진 바와 같은 3 개의 염기쌍(bp) 코돈으로 나타내어진다. 링커는 길이가 1 개 내지 1000 개 및 그 사이의 임의의 정수 개의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 링커는 길이가 1 개 내지 200 개의 아미노산이거나, 링커는 길이가 1 개 내지 20 개의 아미노산이다.
발현 벡터
많은 핵산이 세포 내로 도입되어 유전자의 발현을 이끌 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 핵산은 DNA, RNA, 및 핵산 유사체를 포함하고, 핵산은 이중가닥 또는 단일가닥(즉, 센스 또는 안티센스 단일 가닥)이다. 핵산 유사체는 염기 모이어티(moiety), 당 모이어티, 또는 포스페이트 골격에서 변형되어, 예를 들어 핵산의 안정성, 혼성화 또는 용해도를 개선할 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형은 데옥시티미딘에 대해 데옥시우리딘, 및 데옥시시티딘에 대해 5-메틸-2'-데옥시시티딘 및 5-브로모-2'-독시시티딘을 포함한다. 당 모이어티의 변형은 2'-0-메틸 또는 2'-0-알릴 당을 형성하는 리보오스 당의 2'히드록실의 변형을 포함한다. 데옥시리보오스 포스페이트 골격은 모르폴리노 핵산을 생산하도록 변형될 수 있으며, 여기서 각각의 염기 모이어티는 6-원 모르폴리노 고리, 또는 펩티드 핵산에 연결될 수 있는데, 여기서 데옥시포스페이트 골격은 슈도펩티드 골격으로 대체되고, 4 개의 염기는 보유된다. 문헌 [Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(3): 187]; 및 [Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5]을 참조한다. 추가적으로, 데옥시포스페이트 골격은, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 골격, 포스포로아미다이트, 또는 알킬 포스포로트리에스테르 골격으로 대체될 수 있다. 핵산 서열은 프로모터와 같은 조절 영역에 작동적으로 연결될 수 있다. 조절 영역은 임의의 화학종으로부터의 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, '작동적으로 연결된'은 표적 핵산의 전사를 허용 또는 촉진시키도록 하는 방식으로 핵산 서열에 대한 조절 영역의 배치(positioning)를 지칭한다. 임의의 형태의 프로모터가 핵산 서열에 대해 작동적으로 연결될 수 있다. 프로모터의 예로는, 이에 제한되지 않지만, 조직-특이적 프로모터, 구성 프로모터, 및 특정 자극에 대해 반응성 또는 비반응성인 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)를 포함한다.
핵산 구조물에서 유용할 수 있는 추가의 영역으로는, 이에 제한되지 않지만, 폴리아데닐화 서열, 번역 제어 서열(예를 들어, 내부 리보솜 도입 절편, IRES), 인핸서(enhancer), 유도성 요소, 또는 인트론을 포함한다. 그러한 조절 영역은, 전사, mRNA의 안정성, 번역 효율 등에 영향을 미침으로써 발현을 증가시킬 수 있지만, 필수적이지는 않을 수 있다. 그러한 조절 영역은 세포(들) 내 핵산의 최적 발현을 수득하고자 함에 따라 핵산 구조물 내에 포함될 수 있다. 때때로 그러한 추가 요소 없이 충분한 발현이 수득될 수 있다.
핵산 구조물이 신호 펩티드 또는 선택성 마커를 암호화하는 데 사용될 수 있다. 신호화(마커) 펩티드는 암호화된 폴리펩티드가 특정 세포 장소(예를 들어, 세포 표면)를 지향하도록 이용될 수 있다. 그러한 선택성 마커의 비제한적인 예는 푸로마이신(puromycin), 간시클로버(ganciclovir), 아데노신 데아미나아제(ADA), 아미노글리코시드 인산기 전이효소(neo, G418, APH), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 하이그로마이신-B-인산전달효소, 티미딘 키나아제(TK), 및 크산틴-구아닌 포스포리보실기 전이효소(XGPRT)를 포함한다. 이들 마커는 배양에서 안정적인 형질전환체를 선발하는 데 유용하다. 기타 다른 선택성 마커로는 형광 폴리펩티드, 예컨대 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 또는 황색 형광 단백질을 포함한다.
핵산 구조물은, 당업계에서 알려진 각종 생물학적 기법을 이용하여 임의의 유형의 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 기법의 비제한적인 예는, 트랜스포존 (transposon) 시스템, 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 바이러스, 또는 리포좀의 이용, 또는 핵산을 세포로 전달할 수 있는, 전기천공법, 미세주입법, 또는 인산칼슘 침전과 같은 기타 다른 비-바이러스 방법을 포함한다. 뉴클레오펙션 (Nucleofection) TM으로 명명되는 시스템이 또한 사용될 수 있다.
핵산은 벡터 내로 혼입될 수 있다. 벡터는 운반체로부터 표적 DNA 내로 이동하도록 설계된 임의의 특정 DNA 절편을 포함하는 광범위한 용어이다. 벡터는 발현 벡터 또는 벡터 시스템으로 지칭될 수 있으며, 이는 게놈 또는 기타 다른 표적된 DNA 서열, 예컨대 에피솜, 플라스미드, 또는 심지어는 바이러스/파지 DNA 절편 내로 DNA 삽입을 일으키는 데 요구되는 일단의 성분들이다. 벡터는 거의 종종, 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 카세트를 함유하며, 이때 발현 제어 서열은 또 다른 DNA 서열 또는 mRNA 각각의 전사 및/또는 번역을 제어 및 조절하는 DNA 서열이다.
벡터의 많은 상이한 유형이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 플라스미드 및 레트로바이러스 벡터를 비롯한 바이러스성 벡터가 알려져 있다. 포유동물 발현 플라스미드는 통상적으로 복제 기원, 적합한 프로모터 및 선택적인 인핸서를 갖고, 또한 임의의 필요한 리보솜 결합 위치, 폴리아데닐화 위치, 스플라이스 도너 및 억셉터 위치, 전사 종결 서열, 및 5' 플랭킹(flanking) 비-전사된 서열을 갖는다. 그러한 벡터로는 플라스미드(이는 또 다른 유형의 벡터의 운반체일 수 있음), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스(예를 들어, 변형된 HIV-1, SIV 또는 FIV), 레트로바이러스(예를 들어, ASV, ALV 또는 MoMLV), 및 트랜스포존(P-요소, Tol-2, 프로그 프린스(Frog Prince), 피기백(piggyBac) 또는 기타)이 포함된다.
본 개시 내용에서의 사용을 위한 박테리아 및 바이러스성 유전자 및 단백질은 아래 "본 개시 내용의 서열"이라는 제목의 섹션에서 열거된다. 기타 다른 바이러스성 인테그라아제, 예를 들어 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV)로부터의 것들 및 아데노바이러스가 또한 본 명세서에서 개시된 방법 및 조성물 중에 사용될 수 있다.
편집된 세포들의 혼합된 개체군은 유전자 편집을 받은 세포들 및 받지 않은 세포들의 혼합물로 여겨진다.
예시적인 애비1 시험관 내 분석
1) 애비1 단백질을 가이드 RNA와 함께 인큐베이션시킨다;
2) 애비1/가이드 RNA를 부분적인 LTR을 갖는 도너 DNA와 함께 인큐베이션하여 전-개시(pre-initiation) 복합체를 형성한다;
3) 전-개시 복합체를 편집될 유전자(예를 들어, CXCR4)를 함유한 플라스미드와 인큐베이션시킨다; 및
4) 도너 DNA 통합을 위한 PCR 및 DNA 서열분석 확인.
카스9프로토콜은, 예를 들어 문헌 [Gagnon et al., 2014, http://labs.mcb.harvard.edu/schier/VertEmbryo/cas9_Protocols.pdf]에 기재되어 있다.
인테그라아제 활성에 대한 분석은, 예를 들어 문헌 [Merkel et al., Methods, 2009, volume 47, pages 243-248]에 기재되어 있다.
본 개시 내용의 이들 및 기타 다른 특징, 양태, 및 장점은 하기 기재, 첨부된 청구범위 및 수반된 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 a) 예시적인 촉매적으로 비활성인 카스9/HIV1 인테그라아제 융합 단백질, b) 예시적인 TALE/HIV1 인테그라아제 융합 단백질, c) 예시적인 징크 핑거 단백질/HIV1 인테그라아제 융합 단백질, 및 d) 표적된 위치에서 DNA의 반대 면에 대해 설계된 예시적인 카스9/HIV1 인테그라아제 융합 단백질을 나타낸다. 융합 단백질 각각은 DNA의 특이적 표적 서열에 결합한다. "ZnFn"은 징크 핑거 단백질이다. "인테그라아제"는, 하나의 인테그라아제 단위 또는 예를 들어 짧은 아미노산 링커에 의해 연결된 두 개의 인테그라아제 단위를 나타낸다. 일부 구현예에서, 인테그라아제는 재조합효소에 의해 대체될 수 있다. 카스9는 촉매적으로 활성 또는 비활성일 수 있다.
도 2는, 촉매적으로 비활성인 카스9/인테그라아제 융합 단백질을 포함하는 벡터, 관심 대상의 DNA 서열을 포함하는 벡터, 및 역전사효소를 포함하는 벡터를 포함하는 DNA 플라스미드 시스템을 나타낸다. 가이드 RNA(gRNA) 또는 RNA는 별도로 제공될 수 있다. 또 다른 벡터는 gRNA를 발현하는 데 사용될 수 있다. "1 또는 2"는 하나의 인테그라아제 또는 예를 들어 아미노산 링커에 의해 연결된 두 개의 인테그라아제를 지칭한다.
도 3은 뉴클레오티드 서열 촉매적으로 비활성인 카스9/인테그라아제 융합 단백질, 가이드 RNA, 관심 대상의 DNA(유전자) 서열, 및 역전사효소를 포함하는 예시적인 DNA 플라스미드를 나타낸다. 바이러스성 att 위치는 관심 대상의 DNA 서열에 제공되어, 인테그라아제의 세포의 게놈성 DNA 내로의 혼입을 가능하게 할 수 있다. 가이드 RNA(gRNA) 또는 RNA는 별도로 제공될 수 있다. 또 다른 벡터가 gRNA를 발현하는 데 사용될 수 있다. "1 또는 2"는 하나의 인테그라아제 또는 예를 들어, 아미노산 링커에 의해 연결된 두 개의 인테그라아제를 지칭한다.
도 4는 흐름도를 나타낸다. 도 2 및 도 3에 나타낸 벡터를 이용하는 일 예시적인 방법을 도 4에 나타내며, 이는 다음과 같다: 1) 역전사효소는 벡터로부터 발현된 att 위치를 갖는 관심 대상의 DNA 서열을 전사한다(대안적으로 att 위치를 갖는 선형 DNA가 사용됨), 2) 융합 카스9/인테그라아제는 가이드 RNA을 기준으로 게놈성 DNA 상의 위치를 표적한다, 3) 인테그라아제는 관심 대상의 DNA 서열 상의 att(LTR) 위치를 인식하고, 그 DNA를 표적된 위치에서 게놈 내로 통합시키고, 4) 관심 대상의 DNA 서열의 적절한 삽입에 대해 확인하기 위하여, 분석(예를 들어, PCR(중합효소 연쇄 반응))을 수행한다. 분석은 비특이적 통합에 대해 확인하기 위하여 수행될 수 있다.
도 5는 가이드 NrF2-sgRNA2 및 sgRNA3을 이용한 Nrf2의 애비1(Abbie1) 유전자 편집 표적화 엑손 2를 나타낸다.
도 6은 애비1 유전자 편집에 의해 생성된 이론적 데이터를 나타낸다.
도 7은 가이드 Nrf2-sgRNA 3을 이용하여 Nrf2의 애비1 유전자 편집 표적화 엑손 2를 나타낸다.
도 8은 혼합된(pooled) Hek293T 세포 내 Nrf2의 애비1 녹아웃을 나타낸다.
도 9는 혼합된 Hek293T 세포 내 Nrf2의 애비1 녹아웃을 나타낸다.
도 10은 애비1 유전자 편집 표적화 CXCR4 엑손 2를 나타낸다.
도 11은 대장균의 분리 및 정제 후 애비1 단백질의 검출을 나타낸다. 쿠마씨 (Coomassie) 염색된 겔.
실시예
하기 실시예는 본 개시 내용의 출원의 예시를 제공하고자 하는 것이다. 하기 실시예는 본 개시 내용의 범주를 완전히 정의하거나, 그렇지 않으면 그를 한정하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 당업계에서 알려진 많은 기타 다른 방법들이 본 명세서에 구체적으로 기재되거나 참조된 예들을 대신하여 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1: 카스9-인테그라아제 융합 단백질의 발현을 위한 DNA 벡터
촉매적으로 비활성인 카스9의 DNA 서열은 12 bp, 15 bp, 18 bp, 21 bp, 24 bp, 27 bp 또는 30 bp 스페이서(카스9와 인테그라아제 간의 링커로서 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개의 아미노산에 대한 코드) 및 HIV1 인테그라아제를 갖는 발현 벡터 내로 혼입된다. 기타 다른 실험에서, 인테그라아제보다는 박테리아 또는 파지 기원의 재조합효소가 사용된다. 이는, 이들을 임의의 기타 다른 위치의 DNA에서 재조합하는 것을 가능하게 하는 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 Hin 재조합효소(서열번호 25) 및 Cre 재조합효소(서열번호 26)를 포함한다. 융합 단백질을 분리하기 위하여 His 또는 cMyc 태그(또는 단백질 정제에 유용한 기타 다른 서열)가 포함될 수 있다. 발현 벡터는 벡터가 제공될 세포에서 활성화된 프로모터를 사용한다. CMV(거대세포바이러스 프로모터)는 포유동물 세포를 위한 발현 벡터에 흔히 사용된다. U6 프로모터 또한 흔히 사용된다. T7 프로모터는 특정 구현예에서 시험관 내 전사에 사용될 수 있다.
실시예 2: 관심 대상의 DNA 서열(관심 대상의 유전자)의 발현을 위한 DNA 벡터
관심 대상의 DNA 서열은 적절한 발현 벡터 내로 삽입될 것이고, 위치가 관심 대상의 DNA 서열에 적절히 부가되서 HIV1 인테그라아제가 게놈 내로의 통합을 위한 서열을 인지할 것이다. 이러한 위치는 att 위치(U5 및 U3 att 위치)로 명명된다(문헌 [Masuda et al, Journal of Virology, 1998, volume 72, pages 8396-8402] 참조). 게놈 내 타겟 위치에 대한 상동염기서열은 관심 대상의 DNA(유전자) 서열의 5' 및 3' 말단에 측접하는 영역 내에 포함될 수 있다(문헌 [Ishii et al, PLOS ONE, September 24, 2014, DOI: 10.1371/journal.pone.0108236] 참조). 재조합효소를 사용하는 경우, 인테그라아제 인식 위치는 포함되지 않을 수 있다. 약물 내성 마커(예를 들어, 블라스티시딘 또는 푸로마이신)와 같은 마커가 관심 대상의 DNA 서열의 삽입에 대한 확인을 위해, 그리고 게놈 내 랜덤 삽입에 대한 분석을 돕기 위하여 포함될 것이다. 이러한 내성 마커는 표적된 게놈 랜딩 패드(landing pad)로부터 그를 제거하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 예를 들어, LoxP 위치를 갖는 푸로마이신 내성 유전자를 측접하고 외생적으로 발현된 CRE를 도입하는 것은 내부 서열을 제거하여 LoxP 위치를 함유하는 상처를 남길 것이다.
실시예 3: 역전사효소 발현을 위한 DNA 벡터
벡터 내에 관심 대상의 설계된 DNA 서열(유전자)이 RNA로서 발현되고, 인테그라아제 효소에 의한 통합을 위해 DNA로 다시 전환되어야 할 것이므로 시스템에서 역전사효소가 또한 공동발현될 수 있다. 역전사 효소는 그 기원이 바이러스(예를 들어, HIV1와 같은 레트로바이러스)일 수 있다. 이는 관심 대상의 DNA 서열과 동일한 벡터 내에 통합될 수 있다.
실시예 4: 관심 대상의 DNA 서열과 함께 DNA 표적-인테그라아제(또는 재조합효소)의 공동 발현
세포를 게놈 내 표적 위치에 대해 요구되는 카스9 RNA 가이드와 함께, 상기 기재된 벡터에 대해 전기천공시켰다. 일부 실험에서, 모든 성분을 발현한 벡터가 만들어졌다(융합 카스9/인테그라아제(또는 재조합효소), 카스9 RNA 가이드, 및 인테그라아제 인식 위치를 갖고, 상동염기서열은 갖거나 갖지 않은 관심 대상의 DNA 서열). 벡터 내에 관심 대상의 설계된 DNA 서열(Gene사)이 RNA로서 발현되고, 인테그라아제 효소에 의한 통합을 위해 DNA로 다시 전환되어야 할 것이므로 시스템에서 역전사효소가 또한 공동발현될 수 있다. 역전사 효소는 그 기원이 바이러스(예를 들어, HIV1와 같은 레트로바이러스)일 수 있다. 기타 다른 실험에서, 관심 대상의 DNA 서열은 세포 내로의 도입 전에 선형화된다. 카스9 RNA 가이드 서열 및 관심 대상의 DNA 서열은 표준 분자 생물학 프로토콜에 의해 설계되고, 이용 전에 벡터 내로 삽입되어야 하였다.
실시예 5: 비표적 삽입을 위한 시험 실험 및 분석
특정 유전자의 발현이 빠진 세포, 예컨대 녹아웃 마우스 모델로부터의 마우스 배아 섬유아세포 또는 소정의 유전자에 대해 녹아웃이 되도록 유전적으로 유전공학적으로 조작된 세포를 관심 대상의 유전자가 포함된 상기 벡터로 형질감염 또는 전기천공시킨다. 삽입된 유전자를 커버하도록 설계된 키메라성 프라이머 세트 및 측접 게놈성 서열은 편집된 세포들의 초기 풀을 스크리닝하는 데 사용될 것이다. 제한 희석 클로닝(LDC) 및/또는 FACS 분석을 이후 수행하여 단일클론성을 보장한다. 차세대 서열분석(NGS) 또는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 분석을, 분리된 클론이 설계된 편집에 대해 동질성인지 보장하기 위한 최종 품질 제어 단계로서 수행한다. 스크리닝을 위한 기타 다른 메커니즘은, 이에 제한되지는 않지만 qRT-PCR 및 적절한 항체를 이용하는 웨스턴 블로팅을 포함할 수 있다. 단백질이 세포의 특정 표현형과 연관되는 경우, 세포는 그 표현형의 구제에 대해 검사될 수 있다. 세포의 게놈은 DNA 삽입의 특이성에 대해, 그리고 존재하는 경우 비표적 삽입의 상대적인 수를 알아내기 위하여 분석된다.
실시예 6: 카스9 연결된 인테그라아제 단백질 발현 및 분리
대장균 또는 곤충 세포 내에서 유전자 발현을 위해 설계된 벡터는 대장균 또는 곤충 세포 내로 통합되고, 소정의 기간 동안 발현되도록 둘 것이다. 몇몇 설계는 카스9(또는 비활성 카스9) 연결된 인테그라아제 단백질을 생성하도록 이용될 것이다. 벡터는 또한 높은 순도 및 수율을 갖는 단백질의 궁극적인 분리를 위해 His 또는 cMyc 태그에 제한되지 않는 태그를 포함할 것이다. 키메라성 단백질의 제조는 이에 제한되지는 않지만 표준 크로마토그래피 기법을 포함할 것이다. 단백질은 또한 하나 이상의 NLS(핵 국소화 신호 서열) 및/또는 TAT 서열을 이용하여 설계될 수 있다. 핵 국소화 신호는 단백질이 핵으로 들어가는 것을 가능하게 한다. TAT 서열은 단백질의 셀 내로의 더 용이한 도입을 가능하게 한다(이는 세포-침투 펩티드이다). 당업계에서의 기타 다른 세포 침투 펩티드가 고려될 수 있다. 발현을 위한 충분한 시간이 발생된 후, 단백질 용해물은 세포로부터 수집되어, 사용된 태그에 따라 달라지는 적절한 컬럼 내에서 정제될 것이다. 정제된 단백질은 이후 적절한 완충 용액 내에 배치되어 -20℃ 또는 -80℃ 중 어느 하나의 온도에서 저장될 것이다.
실시예 7: 정지 코돈을 전사 시작 위치의 바로 업스트림에 혼입시키는 데 카스9-인테그라아제를 이용
본 개시 내용은 녹아웃 세포주 또는 유기체를 만들기 위한 방법을 포함한다. 상기 시스템은 관심 대상의 DNA 서열과 함께 사용되어 타겟 유전자에 대한 ATG 시작 위치 직후 1 개, 3 개, 6 개, 10 개, 15 개 또는 20 개의 연속적인 정지 코돈이 위치된다. 이는 ATG 시작 위치 후에 즉각적인 정지 코돈에 도달하는 때에 전사/번역이 정지됨에 따라, 이는 효과적인 유전자 녹아웃을 만들 것이다. 추가의 정지 코돈은 전사효소의 가능한 번져나감을 방지하는 것을 도울 것이다(전사효소가 첫번째 정지 코돈을 지나치는 경우).
실시예 8: 세포의 게놈을 편집하기 위하여 정제된 단백질로서 애비1(또는 기타 다른 특이적 DNA 결합 도메인을 갖는 기타 다른 변형)을 이용
애비1 분리된 단백질(레트로바이러스성 인테그라아제에 연결된 기타 다른 특정 DNA 서열 결합 단백질)을 바이러스 LTR 영역을 갖는 삽입성/통합성 DNA와 함께 적합한 완충액 내에 인큐베이션한다. (경우에 따라 4량체 또는 기타 다른 다량체의 형성을 위해). 대안적으로, 가이드 RNA를 갖는 분리된 애비1 단백질의 예비제조된(premade) 조성물은 삽입성 DNA 서열과 조합될 수 있다. 가이드 RNA를 포함시키고, 인큐베이션하여 가이드 RNA를 혼입시킨다. 애비1/DNA 제조물을 세포 내로 형질감염 또는 전기천공시킨다(또는 단백질을 세포에 제공하는 기타 다른 기법). 게놈/DNA 편집이 일어나도록 시간을 허용한다. 설계된 삽입성 DNA 서열의 세포의 게놈성 DNA의 특정 위치 내로의 삽입에 대해 확인한다. PCR 및 DNA 서열분석에 의해 비특이적 삽입에 대해 확인한다.
현재 계획된 바에 따르면, 박테리아 발현 벡터는 pMAL-c5e일 것이며, 이는 NEB로부터의 생산중단된 제품으로, Genscript사에 대한 사내 자체 클로닝 선택 중 하나이다. 코돈-최적화된 Spy 카스9는 his-태그 및 말토오스-결합 단백질(MBP) 태그를 갖는 프레임 내 TEV 프로테아제 분할 위치를 이용하여 클로닝된다. ORF는 유도성 Tac 프로모터 하에 존재하며, 벡터는 또한 더 강한 조절을 위해 lac 리프레서 (LacI)에 대해 코딩한다. 아밀로오스 수지는 상당히 비싸기 때문에, MBP는 단지 안정화 태그로서만 사용될 것이며, 정제 태그로는 사용되지 않을 것이다. 가용성의 발현된 재료는 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제될 것이며, 이후 카스9는 TEV 프로테아제에 의해 MBP로부터 방출되고, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되고, 겔 여과에 의해 정련된다(polished).
실시예 9: 융합 단백질에 대한 구조물의 설계
서열 특이적 징크 핑거 도메인, TALE, 또는 표적 DNA 서열을 향한 크리스퍼 기반 접근을 위한 가이드 RNA를 설계한다. 선택한 온라인 설계 소프트웨어를 이용한다.
위치 특이적 융합 인테그라아제 단백질을 형성하기 위하여, 인테그라아제, 전이효소 또는 재조합효소에 대한 코딩 서열; 적합한 아미노산 링커; 적절한 징크 핑거, TALE 또는 크리스퍼 단백질(예를 들어, 카스9, Cpf1); 및 핵 국소화 신호(또는 미토콘드리아 국소화 신호)를 갖는 DNA 구조물을 생산한다. 이들은 다수의 정렬로 구체화된다. 원하는 경우 단백질 분리 및 정제(예를 들어, 말토오스 결합 단백질(MBP) 또는 His 태그)를 위한 적합한 태그가 포함될 수 있다.
DNA 구조물은 당업계에서 일반적인 포유동물 세포 프로모터 또는 박테리아 프로모터를 이용할 수 있다(예를 들어, CMV, T7 등).
대장균을 공급원으로서 이용하여 재조합 융합 단백질을 생산할 수 있다. 단백질을 당업계의 표준 수단에 의해 분리한다(예를 들어, MBP 컬럼, 니켈-세파로오스 컬럼, 등).
도너-RNP 복합체를 조립한다(RNA 올리고를 듀플렉스(duplex)하고(융합 단백질이 그의 DNA 결합능에 대해 엔도뉴클레아제 비활성인 크리스퍼 관련 단백질, 예를 들어, 애비1을 갖는 경우) 본 발명의 융합 단백질과 혼합) - RNP를 형성하는 이들 단계들은 징크 핑거 도메인 및 TALE에서는 필요하지 않다.
1. 도너 DNA와 적절한 LRT 도메인 및 삽입성 서열, 및 융합 단백질을 혼합하고, 10 분 동안 인큐베이션한다(대안적으로, RNP 복합체 형성 후 도너 DNA를 첨가한다).
2. 뉴클레아제가 없는 IDTE 완충액 내 각각의 RNA 올리고(crRNA 및 tracrRNA)를 재현탁시킨다. 예를 들어, 최종 농도 100 μM를 이용한다.
3. 멸균 미세원심분리관 내 등몰량의 농도로 두 개의 RNA 올리고를 혼합한다. 예를 들어, 하기 표를 이용하여 3 μM의 최종 듀플렉스 농도를 생성한다: 성분 양 100 μM crRNA 3 ㎕ 100 μM tracrRNA 3 ㎕ 뉴클레아제가 없는 듀플렉스 완충액 94 ㎕ 최종 부피 100 ㎕.
4. 95℃에서 5 분 동안 가열한다.
5. 열을 제거하고, 벤치 탑에서 실온(15℃ 내지 25℃)까지 냉각되도록 둔다.
6. 필요에 따라, 뉴클레아제가 없는 듀플렉스 완충액 내에서 RNA를 작업 농도로 희석 듀플렉스한다(예를 들어, 3 μM).
7. 융합 단백질을 작업 버퍼(20 mM HEPES, 150 mM KCl, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, pH 7.5)내에서 작업 농도(예를 들어, 5 μM)로 희석한다.
8. 각각의 형질감염을 위해, 1.5 pmol의 듀플렉스된 RNA 올리고(단계 A5)를 1.5 pmol의 융합 단백질(단계 A6)과 Opti-MEM 매질 내에서 최종 부피 12.5 ㎕로 조합한다.
9. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하여 RNP 복합체를 조립한다.
실시예 10: 96-웰 플레이트 내 역 형질감염 gRNA-융합 단백질
1. 하기를 실온에서 20 분 동안 인큐베이션하여 형질감염 복합체를 형성한다: 성분 양 RNP(단계 A8) 12.5 ㎕ 리포펙타민(Lipofectamine)® RNAiMAX 형질감염 시약 1.2 ㎕ Opti-MEM® 매질 11.3 ㎕ 총 부피 25.0 ㎕
2. 인큐베이션 동안(단계 B1), 항생제 없이 완전 배지를 이용하여 배양 세포를 400,000 세포/mL로 희석한다.
3. 인큐베이션이 완료되면, (단계 B1으로부터) 25 ㎕의 형질감염 복합체를 96-웰 조직 배양 플레이트에 첨가한다.
4. (단계 B2로부터) 125 ㎕의 희석된 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트(50,000 세포/웰; RNP의 최종 농도는 10 nM이 될 것이다)에 첨가한다.
5. 형질감염 복합체 및 세포를 담은 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 내에서 48 시간 동안 인큐베이션한다(37℃, 5% CO2). 표적상 돌연변이를 검출하기 위하여, 적절한 프라이머를 이용하여 PCR을 사용한다(도너 서열 내의 프라이머 및 표적 삽입 위치를 둘러싼 프라이머).
실시예 11: 크리스퍼/카스9의 특이성을 시험하기 위한 프로토콜
비오틴에 연결된 d카스9(DNA 절단 비활성 카스9)를 생산한다(d카스9-비오틴). 카스9(s 파이오제네스(s pyogenes), s 아우레우스(s aureus) 등). 비오틴화 방법은 하기 기재된다.
비오틴화 방법 #1: N- 또는 C-말단에서 avi-태그(약 15 잔기)를 공학적으로 조작하고, WT(태그되지 않음) 단백질로서 발현 및 정제한다. 대장균 비오틴 리가제(BirA) 및 비오틴을 이용하여 avi-태그된 카스9를 비오틴화한다. 본 발명자는 이 방법을 이용하여 케모카인(chemokine)을 비오틴화한다. avi-태그 기술에 대한 IP는 수년 전에 만료된 것으로 여긴다.
비오틴화 방법 #2.1: 석신이미딜-에스테르로 작용화된 비오틴은 표면-노출된 리신 잔기에 혼입될 수 있다(효소 반응은 요구되지 않음). 카스9와 같이 큰 단백질의 경우, 이는 실현가능한 선택안일 수 있다.
비오틴화 방법 #2.2: 동일한 방식으로, 비오틴-말레이미드는 상업적으로 입수가능하고, 이들은 표면-노출된 시스테인(효소 없음)에서 접합될 수 있다.
시험은 DNA-결합 및 분할 면에서 비오틴화된 카스9를 특징화하기 위하여 달성될 것이다.
스트렙트아비딘-코팅된 96-웰 플레이트는 상업적으로 입수가능하지만, 또한 사내에서 자체로 생산될 수도 있다.
d카스9-비오틴을 플라스틱 플레이트(96-웰, 24-웰, 384-웰 등)에 결합시킨다.
설계된 가이드 RNA를 각각의 웰에 제공한다. 가이드 RNA가 카스9 단백질과 상호작용하는 시간을 허용한다.
게놈성 DNA를 각 웰 또는 표적된 서열을 갖는 DNA에 제공한다. 카스9가 DNA에 결합되도록 시간을 허용한다.
적절한 완충액을 이용하여 웰을 세척한다.
어댑터(adpater)(DNA 올리고머)를 제공한다. 결합되는 시간을 허용한다.
게놈성 DNA를 제한-소화하여 이를 더 다루기 쉽고, 어댑터에 결찰시키기에 더 용이하게 만든다.
웰을 세척한다.
결합 위치를 확인하기 위하여 DNA 서열을 수행한다(표적 상 대 표적 외).
실시예 12: 애비 1을 통한 NRF2 편집
도 5는 가이드 NrF2-sgRNA2 및 sgRNA3을 이용하는 Nrf2의 애비1 유전자 편집 표적화 엑손 2를 나타낸다. 애비1 편집을 통한 녹아웃을 위해 Nrf2 유전자좌를 표적하는 엑손 2에 대해 PCR 스크리닝한다. 가이드 NrF2-sgRNA 2 및 3을 사용하여 Nrf2의 애비1 형질감염 표적화 엑손 2는 표적된 영역에서 도너의 통합을 나타내었다. 독특한 밴드가 1 내지 8에서와 같이 확인된다.
도 6은 애비1 유전자 편집에 의해 생성된 이론적 데이터를 나타낸다. sgRNA 1 내지 3을 이용하여 게놈 재료를 표적하기 위한 애비1 시스템을 통하여 삽입된 도너 DNA를 시각화하는 DNA 겔 전기영동의 표시. 검은 밴드는 PCR 방법론으로 인한 배경 생성물을 나타낸다. 적색 밴드는 삽입물 및 삽입물의 영역을 측접하는 유전 재료를 증폭시킴으로써 생성된 독특한 생성물을 나타낸다. 다수의 밴드는 표적된 영역에서 가능한 다수의 삽입을 나타낸다.
도 7은 가이드 Nrf2-sgRNA 3을 이용하는 Nrf2의 애비1 유전자 편집 표적화 엑손 2를 나타낸다. 애비1 편집을 통한 녹아웃을 위해 Nrf2 유전자좌를 표적하는 엑손 2에 대해 PCR 스크리닝한다. 가이드 NrF2-sgRNA 3을 사용하여 Nrf2의 표적화 엑손 2는 도너 삽입을 암시하였으며, 이는 도너 서열 및 인접 위치가 예측된 삽입에 대해 설계된 PCR 프라이머에 의해 표시되는 바와 같다. 독특한 밴드가 1 내지 4에서와 같이 확인된다.
도 8은 혼합된 Hek293T 세포에서 Nrf2의 애비1 녹아웃을 나타낸다. (A) 혼합된 HEK293T 개체군 내 Nrf2의 녹아웃을 나타내는 55 kD 동형단백질(isoform)(Santa Cruz Bio사)에 대한 다중클론성 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석. (B) GAPDH(Santa Cruz Bio사) 부하 제어군.
도 9는 혼합된 Hek293T 세포에서 Nrf2의 애비1 녹아웃을 나타낸다. (A) HEK 293t 세포에서 Nrf2 혼합된 개체군의 녹아웃을 나타내는 Nrf2(Abcam)에 대한 단일클론성 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 분석. (B) GAPDH 부하 제어군. (C) 대조군에 비교하여 발현 비율에서 감소를 나타내는 농도계측 분석의 평균.
애비1 처리된 세포는 도너 DNA의 통합을 나타내는 독특한 PCR 밴드를 생성한다. HEK293T 혼합된 세포주에서 녹아웃의 표현형 확인은, 독특하며 상이한 항체를 갖는 두 개의 동형단백질을 프로빙하는(probing) 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인되었다. 통합에 의한 약 80% 녹아웃이 혼합된 개체군 내에서 2 주 내에 관찰되었다.
실시예 13: 애비1을 통한 CXCR4 편집
도 10은 CXCR4 엑손 2를 표적하는 애비1 유전자 편집을 나타낸다. 애비1을 통해 편집된 CXCR4의 표적화 엑손 2를 PCR 스크리닝한다. 4 개 세트의 프라이머를 관심 대상의 영역에 대하여 설계하였다. 세트 번호 2 및 4는 관심 대상의 영역에서 도너 DNA의 통합을 암시하는 독특한 밴드를 생성하는 것으로 보인다.
실시예 14: 애비1을 이용하여 NRF2 유전자좌에서 녹-인(knock-in) 실험을 위한 형질감염
유의: 500 ng 단백질 및 120 ng sgRNA를 단일 반응을 위해 사용한다. DNA의 양은 도너 구조물의 크기에 따라 달라진다. 도너 DNA(LTR 서열을 갖는 DNA)는 세포에 대해 제공/형질감염/전기천공되기 전, 동안 또는 후에 애비1과 함께 인큐베이션될 수 있다. 모든 반응은 멸균 생물안전 캐비넷(cabinet) 내에서 제조된다.
제1 일: 인간 배아 신장(HEK 293T) 세포를 24-웰 배양 플레이트(Corning사) 내에 10% 소 태아 혈청(Omega Scientific사)으로 보충된 500 ㎕ DMEM(Gibco사) 중의 HEK293T 세포(ATCC)를 웰 당 200,000개로 접종시켰다. 24 시간 동안 세포가 회복되도록 하였다.
제2 일: 애비1 제조:
튜브 1:
실온에서 10분 동안, 감소된-혈청 형질감염 매질(OptiMEM, Life Technologies사) 내 1:1 몰 비의 정제된 애비1 단백질(서열번호 58) 및 도너 DNA (서열번호 101). 1.3 배 몰 과량(대략 120 ng)으로의 sgRNA를 단백질/DNA 복합체에 첨가하고, 실온에서 추가 10 분 동안 인큐베이션을 계속하였다. 이 혼합물의 부피는 25 ㎕이다.
튜브 2:
2 ㎕의 형질감염 시약(RNAiMAX, Life Technologies사)을 23 ㎕의 OptiMEM에 첨가하였다. 그리고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.
튜브 1 및 튜브 2(최종 부피 50 ml)를 합하고 실온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다.
전체 50 ㎕ 형질감염 혼합물을 웰에 첨가하였다.
혼합된 개체군 내에서 게놈 DNA 편집의 확인을 위해 혼합 편집된 세포들의 절반을 형질감염 후 48 시간에 수확하였다. 편집된 게놈의 확인은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행하였다. 본 발명자들은 하기 기재된 바와 같이(PCR 프로토콜 참조) 표적된 영역에 대하여 PCR을 수행하였으며, 나머지는 6 cm 배양접시(Corning사) 상에 접종하고 48 시간 동안 회복되도록 하였다.
제5 일: 웨스턴 블롯팅을 통한 표현형 변화의 스크리닝
표준 웨스턴 블롯 분석을, 55 kD 동형단백질(Santa Cruz Biotechnology사, sc-722) 및 98 kD 동형단백질(Abcam사, ab-62352)을 표적하는 일차 항체를 이용하여, NrF2 동형단백질에 대하여 수행하였다. GAPDH(Santa Cruz Biotechnology사, sc-51907).
실시예 15: Nrf2 및 CXCR4 유전자좌에 대해 애비1을 이용한 유전자 편집의 검출을 위한 PCR 조건
인간 Nrf2에 대한 등록 번호(Accession number)
유니프로트(Uniprot): Q16236
엔셈블(Ensembl) 유전자 ID: ENSG00000116044
Nrf2(엑손2)에 대한 편집 표적 서열 및 PAM: sgRNA 설계 1 내지 3에 대해 사용됨.
Figure pct00001
Nrf2 표적에서 통합의 검출을 위한 프라이머 키
프라이머 세트 1: 프라이머 1:5'-GTGTTAATTTCAAACATCAGCAGC-3', 프라이머 2: 5'- GACAAGACATCCTTGATTTG-3'
프라이머 세트 2: 프라이머 1:5'-GAGGTTGACTGTGTAAATG-3', 프라이머 2: 5'- GATACCAGAGTCACACAACAG-3'
프라이머 세트 3: 프라이머 1: 5'-TCTACATTAATTCTCTTGTGC-3', 프라이머 2:5'- GATACCAGAGTCACACAACAG-3'
인간 CXCR4에 대한 등록 번호
유니프로트 P61073
엔셈블 유전자 ID: ENSG00000121966
CXCR4(엑손 2)에 대한 편집 표적 서열 및 PAM: sgRNA 설계1에 대해 사용됨.
Figure pct00002
CXCR4 타겟에서 통합의 검출을 위한 프라이머 키
프라이머 세트 1: 프라이머 1: 5'- TCTACATTAATTCTCTTGTGC-3', 프라이머 2: 5'- GACAAGACATCCTTGATTTG-3'
프라이머 세트 2: 프라이머 1: 5'- TCTACATTAATTCTCTTGTGC-3', 프라이머 2: 5'- GATACCAGAGTCACACAACAG -3'
프라이머 세트 3: 프라이머 1: 5'- GAGGTTGACTGTGTAAATG -3', 프라이머 2: 5'- GACAAGACATCCTTGATTTG-3'
프라이머 세트 4: 프라이머 1: 5'- GAGGTTGACTGTGTAAATG -3', 프라이머 2: 5'- GATACCAGAGTCACACAACAG -3'
통합된 도너 DNA의 검출을 위해 사용된 PCR 사이클링 조건
* 어닐링(annealing) 온도는 프라이머 서열에 따라 달라질 것임에 유의한다.
1. 초기 변성: 4 분 94
2. 변성: 30 초 94
3. 어닐링: 30 초 55
4. 연장: 30 초 72
5. 단계 2로 감: 40 사이클
6. 최종 연장: 4 분 72
7. 최종 유지: ∞ 4
비오틴화에 대해 Avi-태그된 카스9
카스9 비오틴화에 사용된 avi-태그의 서열
아미노산 서열:
Figure pct00003
핵산 서열:
Figure pct00004
첫 번째 밑줄 부분 = 카스9 C-말단
이탤릭체 부분 = 제한 위치/링커
두 번째 밑줄 부분 = avi-태그(비오틴화 위치 강조)
실시예 16: 애비1 융합 단백질에 대한 발현 프로토콜
전장 융합 단백질(서열번호 57)을 함유하는 발현 구조물의 형질전환.
-80℃ 냉동고에서 컴피턴트(competent) 대장균 세포를 취한다.
수조를 42℃로 한다.
1.5 ml 튜브(에펜도르프 또는 유사물) 내에 컴피턴트 세포를 넣는다. DNA 구조물을 형질전환하기 위하여, 50 ㎕ 의 컴피턴트 세포를 사용한다.
튜브를 얼음 중에 유지시킨다.
50 ng의 환형 DNA를 대장균 세포 내로 첨가한다. 얼음 상에서 10 분 동안 인큐베이션하여 컴피턴트 세포를 해동시킨다.
DNA와 대장균이 있는 튜브(들)를 42℃의 수조 내에 45 초 동안 둔다. 튜브를 다시 얼음 상에 2 분 동안 두어 대장균 세포에 대한 손상을 감소시킨다.
1 ml의 LB(첨가된 항생제 없음)를 첨가한다. 튜브들을 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨다(튜브를 30 분 동안 인큐베이션할 수 있음).
결과로 생성된 배양물 약 100 ㎕를 LB 플레이트 상에 적절한 항생물질과 함께 도말한다.
약 12 시간 내지 16 시간 후 콜로니들(colonies)을 취한다.
접종 및 확장
LB 및 항생물질을 함유하는 1 리터의 플라스크를 접종한다.
0.6 OD가 달성될 때까지 박테리아 배양이 성장하도록 두고, 이후 1 mM 최종 농도에서 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 이용하여 유도한다.
배양물이 6 시간 내지 8 시간 동안 확장되도록 하고, 현탁된 박테리아 배양물을 최소 2000 G 력으로 10 분 동안 원심분리한다.
이후에 추가로 가공하기 위하여 -80℃에서 펠렛을 동결시킨다.
단백질 제조 및 정제
모든 단계는 실온에서 수행된다.
20 mM 트리스 pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.1 mg/ml 달걀 흰자 리소자임 내에서 동결-해동의 2 회 사이클에 의해 세포를 용해시킨다. 6,000 g에서 15 분 동안 원심분리하고 상청액을 유지한다.
20 mM Tris pH 8.0, 300 mM 염화나트륨 내에서 평형화된 Ni-IDA 아가로스 컬럼 상에 상청액을 부하한다. 이미다졸의 0 mM 내지 200 mM 구배를 이용하여 단백질을 용리한다. 7% SDS-PAGE에 의해 융합 단백질을 함유하는 분획을 확인한다.
분획들을 혼합하고 20 mM Tris pH 8.0로 희석하여 최종 NaCl 농도가 50 mM이 되도록 한다. Q-세파로스 컬럼 상에 부하하고, 염화나트륨의 0 mM 내지 500 mM 구배를 이용하여 용리한다. 7% SDS-PAGE에 의해 융합 단백질을 함유하는 분획을 확인한다.
분획들을 혼합하고 20 mM Tris pH8.0로 희석하여 최종 NaCl 농도가 100 mM이 되도록 한다. SP-세파로스 컬럼 상에 부하하고, 염화나트륨의 0 mM 내지 500 mM 구배를 이용하여 용리한다. 7% SDS-PAGE에 의해 융합 단백질을 함유하는 분획을 확인한다.
분획들을 혼합하고, UV 흡광도 280 nm에서 농도를 측정하고, 원심분리 필터에 의해 최종 농도 400 ㎍/ml로 농축한다. 최종 농도 50%로 글리세롤을 첨가한다. -20℃에서 저장한다.
특정 구현예들이 본 명세서에 나타내어지고 기재되었지만, 그러한 구현예들은 단지 예시를 위해 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 변형, 변화, 및 치환은 이제 본 개시 내용에서 벗어나지 않으면서 당업자에게 일어날 것이다. 본 명세서에 기재된 개시 내용의 구현예에 대한 각종 대안들이 본 개시 내용의 실시에 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 개시 내용의 범주를 규정하고, 이들 청구범위 및 그의 균등물의 범주 내의 방법 및 구조는 그에 의해 커버되는 것으로 의도된다.
본 개시 내용의 서열들
하기 제공된 각각의 서열에 대하여, 하기 정보가 제공된다: 서열 유형(핵산 또는 아미노산), 공급원(예를 들어, 대장균), 길이, 및 식별 번호(이용가능한 경우).
본 개시 내용의 제1 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 카스9, Cpf1, TALE, 또는 ZnFn 단백질을 암호화할 수 있다. 본 개시 내용의 제2 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 인테그라아제, 전이효소, 또는 재조합효소를 암호화할 수 있다. 하기에 예시적인 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열 및 단백질 서열이, 예시적인 링커 서열과 함께 열거되었으며, 이는 본 명세서에서 기재된 조성물(구조물, 융합 단백질) 및 방법에서 사용될 수 있다. 하기 표 1에서 열거되지 않았지만 본 명세서에서 기재된 조성물(구조물, 융합 단백질) 및 방법에서 사용될 수 있는 기타 다른 폴리뉴클레오티드 서열, 단백질 서열, 또는 링커 서열이 본 개시 내용에 제공될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 49, 서열번호 57, 서열번호 58 및/또는 이의 일부.
링커는 임의의 길이일 수 있으며, 예를 들어 길이가 3 개 내지 300 개의 뉴클레오티드, 길이가 6 개 내지 60 개의 뉴클레오티드, 또는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 융합되는 것을 허용하는 임의의 길이이다. 폴리펩타이드는 유기체, 예를 들어 대장균에 의해 제조될 수 있거나, 합성 제조되거나, 이들 모두의 조합에 의해 제조될 수 있다.
예시적인 핵산 서열: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 27 내지 47, 49, 55, 56, 57, 62, 64, 66, 68, 70, 79, 82, 및 83.
예시적인 아미노산 서열: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 48, 50, 52, 58, 63, 65, 67, 69, 71, 72 내지 78, 및 80.
제1 단백질, 제2 단백질, 또는 링커
제1 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 서열
서열번호		 제2 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 서열
서열번호		 링커 서열
서열번호
또는 서열
1 내지 14, 27 내지 46, 50, 52, 56, 57, 68, 69, 72 내지 78, 86 내지 92, 200 내지 253 15 내지 26, 47, 48, 55, 57, 62 내지 67, 70, 71, 79, 80 51, 54, 61,
GGS
서열의 일부 목록
유전자
(단백질) 		박테리아/바이러스 DNA 서열 단백질 서열 서열번호
(DNA, 단백질)
카스9 S. 써모필러스(S. thermophilus) HQ712120.1 Q03JI6.1 서열번호 1, 2
P. 멀토사이다(P. multocida) Q9CLT2.1 서열번호 3, 4
S. 뮤탄스(S. mutans) Q8DTE3.1 서열번호 5, 6
N. 메닌기타이데스(N. meningitides) C9X1G5.1 서열번호 7, 8
S. 미티스(S. mitis) KJQ69483.1 서열번호 9, 10
S. 마카카에(S. macacae) EHJ52063.1 서열번호 11,12
스테필로코커스 아우레우스 KKJ92487.1 서열번호 49, 50
S. 파이오제네스 AFV37892.1 서열번호 13, 14
인테그라아제 HIV1 ABR68182.1 서열번호 15, 16
유인원 T-림프구 바이러스 AAA47841.1 서열번호 17, 18
S. 뉴모니아(S. pneumonia) CBW38769.1 서열번호 19, 20
대장균 CAA41325.1 서열번호 21, 22
렌티바이러스 서열번호 47, 48
재조합효소 써모언에어로박테리움 파지(Thermoanaerobacterium phage) YP _006546326.1 서열번호 23 24
추가 서열들
서열번호 1
명칭: S. 써모필러스 Csn1 cds HQ712120.1
서열:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
서열번호 2
서열:
Figure pct00008
서열번호 3
명칭: P.멀토사이다 카스9
서열:
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
서열번호 4
서열:
Figure pct00012
서열번호 5
명칭: S.뮤탄스 카스9
서열:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
서열번호 6
서열:
Figure pct00017
Figure pct00018
서열번호 7
명칭: N.메닌기타이데스 카스9
서열:
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
서열번호 8
서열:
Figure pct00022
서열번호 9
서열:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
서열번호 10
명칭: gi|777888062|gb|KJQ69483.1| 크리스퍼-회합된 엔도뉴클레아제 카스9 [스트렙토코커스 미티스]
서열:
Figure pct00026
Figure pct00027
서열번호 11
서열:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
서열번호 12
명칭: gi|357584860|gb|EHJ52063.1| 크리스퍼-회합된 단백질 카스9/Csn1, 하위유형 II/NMEMI [스트렙토코커스 마카카에 NCTC 11558]
서열:
Figure pct00032
Figure pct00033
서열번호 13
서열:
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
서열번호 14
명칭: gi|409693032|gb|AFV37892.1| 크리스퍼-회합된 단백질, Csn1 군 [스트렙토코커스 파이오제네스 A20]
서열:
Figure pct00037
Figure pct00038
서열번호 15
명칭: gi|150381361|gb|EF472760.1| HIV-1 클론 39B(미국 인테그라아제 (pol) 유전자 유래), 일부 cds
서열:
Figure pct00039
Figure pct00040
서열번호 16
명칭: gi|150381362|gb|ABR68182.1| 인테그라아제, 일부 [인간 면역결핍 바이러스 1]
서열:
Figure pct00041
서열번호 17
명칭: gi|459980|gb|L20651.1|STLKIAPOL 유인원 T-세포 림프친화 바이러스 유형 I 인테그라아제 (pol) 유전자, 일부 cds
서열:
Figure pct00042
서열번호 18
명칭: gi|459981|gb|AAA47841.1| 인테그라아제, 일부 [유인원 T-림포친화 바이러스 1]
서열:
Figure pct00043
서열번호 19
명칭: gi|321156784:1-1509 스트렙토코커스 뉴모니에 통합성 및 접합성 요소 ICESpn11930, 균주 11930
서열:
Figure pct00044
Figure pct00045
서열번호 20
명칭: gi|321156785|emb|CBW38769.1| 인테그라아제 [스트렙토코커스 뉴모니에]
서열:
Figure pct00046
Figure pct00047
서열번호 21
명칭: gi|43090:1-436 대장균(Tn5086) 디하이드로폴레이트 환원효소 유형 VII에 대한 dhfrVII 유전자 및 sulI 유전자, 5' 말단(인테그라아제)
서열:
Figure pct00048
서열번호 22
명칭: gi|43091|emb|CAA41325.1| 인테그라아제, 일부(플라스미드) [대장균]
서열:
Figure pct00049
서열번호 23
>gi|397912605:40372-41898 써모언에어로박테리움 파지 THSA-485A, 완전한 게놈 -재조합효소
Figure pct00050
Figure pct00051
서열번호 24
>gi|397912662|ref|YP_006546326.1| 재조합효소 [써모언에어로박테리움 파지 THSA-485A]
Figure pct00052
Figure pct00053
서열번호 25
Gin 재조합효소
>gi|657193240|sp|Q38199.2|GIN_BPD10 RecName: 전체=세린 재조합효소 gin; AltName: 전체=G-절편 인버타제; 짧음=Gin
Figure pct00054
서열번호 26
Cre 재조합효소
>gi|375331813|dbj|BAL61207.1| Cre 재조합효소 [Cre-발현 벡터 pHVX2-cre]
Figure pct00055
서열번호 27 내지 46
이들은 본 발명에 기재된 바와 같은 인테그라아제 또는 재조합효소에의 연결에서의 사용을 위한 TALE 반복 모듈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 예시적인 서열이다.
서열번호 27
명칭: NI
서열:
Figure pct00056
서열번호 28
명칭: NG
서열:
Figure pct00057
서열번호 29
명칭: HD
서열:
Figure pct00058
서열번호 30
명칭: NN
서열:
Figure pct00059
서열번호 31
명칭: NI-NI
서열:
Figure pct00060
서열번호 32
명칭: NI-NG
서열:
Figure pct00061
서열번호 33
명칭: NI-HD
서열:
Figure pct00062
서열번호 34
명칭: NI-NN
서열:
Figure pct00063
서열번호 35
명칭: NG-NI
서열:
Figure pct00064
서열번호 36
명칭: NG-NG
서열:
Figure pct00065
서열번호 37
명칭: NG-HD
서열:
Figure pct00066
서열번호 38
명칭: NG-NN
서열:
Figure pct00067
서열번호 39
명칭: HD-NI
서열:
Figure pct00068
서열번호 40
명칭: HD-NG
서열:
Figure pct00069
서열번호 41
명칭: HD-HD
서열:
Figure pct00070
서열번호 42
명칭: HD-NN
서열:
Figure pct00071
서열번호 43
명칭: NN-NI
서열:
Figure pct00072
서열번호 44
명칭: NN-NG
서열:
Figure pct00073
서열번호 45
명칭: NN-HD
서열:
Figure pct00074
서열번호 46
명칭: NN-NN
서열:
Figure pct00075
서열번호 47
명칭: gi|71796612|gb|DQ084353.1| 양 렌티바이러스 분리물 Ov10 인테그라아제 (pol) 유전자, 일부 cds
서열:
Figure pct00076
Figure pct00077
서열번호 48
명칭: gi|71796613|gb|AAZ41325.1| 인테그라아제, 일부 [양 렌티바이러스]
서열:
Figure pct00078
서열번호 49
>gb|AYLT01000127.1|:11804-12046 스태필로코커스 아우레우스 하위종 아우레우스 SK1585 contig000127, 전체 게놈 숏건(shotgun) 서열
Figure pct00079
서열번호 50
>gi|669035130|gb|KFD30483.1| 가상 단백질 D484_02234 [스태필로코커스 아우레우스 하위종 아우레우스 SK1585] - s 아우레우스 카스9
Figure pct00080
서열번호 51
명칭: 링커2의 dna
서열:
Figure pct00081
서열번호 52
명칭: d카스9 단백질
서열:
Figure pct00082
Figure pct00083
서열번호 53
명칭: ATG를 갖는 NLS 뉴클레오티드
서열:
Figure pct00084
서열번호 54
명칭: GGS 링커 뉴클레오티드
서열:
Figure pct00085
서열번호 55
명칭: 합성 인테그라아제
서열:
Figure pct00086
Figure pct00087
서열번호 56
명칭: ATG를 갖는 d카스9 뉴클레오티드
서열:
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
서열번호 57
명칭: 애비1(NLS-링커1-인테그라아제-링커2-d카스9) -DNA 서열
서열:
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
서열번호 58
명칭: 애비1(결합 기반 인테그라아제 편집기)의 번역
서열:
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
도너 DNA 경우( 인테그라아제 인식을 위한 LTR 영역의 att 위치).
서열번호 59
명칭: U3att
서열:
Figure pct00103
서열번호 60
명칭: U5att
서열:
Figure pct00104
NLS-링커1-인테그라아제-링커2-d카스9, 또는 인테그라아제-링커1-NLS-링커2-d카스9 또는 인테그라아제-링커2-d카스9-링커1-NLS 또는 인테그라아제-링커2-d카스9-NLS
링커 1 = GGS
서열번호 61
명칭: 링커 2
서열:
Figure pct00105
서열번호 62
명칭: MMTV 인테그라아제 cDNA, gb|AF071010.1|:16-1113 마우스 유방 종양 바이러스 추정 인테그라아제, env 다단백질, 및 초항원 mRNA, 완전한 cds
서열:
Figure pct00106
Figure pct00107
서열번호 63
명칭: gi|3273866|gb|AAC24859.1| 추정 인테그라아제 [마우스 유방 종양 바이러스]
서열:
Figure pct00108
Figure pct00109
서열번호 64
명칭: gb|AXUN02000059.1|:5116-8850 용기박터 프래질리스(Youngiibacter fragilis) 232.1 contig_151, 전체 게놈 샷건 서열 - 재조합효소
서열:
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
서열번호 65
명칭: gi|564135645|gb|ETA81829.1| 재조합효소 [용기박터 프래질리스 232.1]
서열:
Figure pct00114
Figure pct00115
서열번호 66
명칭: gi|571264543:16423-16770 클로스트리듐 디피실 트랜스포존 Tn6218, 균주 Ox42 전이효소
서열:
Figure pct00116
서열번호 67
명칭: gi|571264559|emb|CDF47133.1| 전이효소 [펩토클로스트리듐 디피실]
서열:
Figure pct00117
서열번호 68
명칭: gb|CP009444.1|:1317724-1320543 프란시셀라 필로미라지아(Francisella philomiragia) 균주 GA01-2801, 완전한 게놈 Cpf1
서열:
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
서열번호 69
명칭: gi|754264888|gb|AJI57252.1| 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1, 하위 유형 프레프란(PREFRAN) [프란시셀라 필로미라지아]
서열:
Figure pct00122
Figure pct00123
서열번호 70
명칭: gi|438609|gb|L21188.1|HIV1NY5A 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 인테그라아제 유전자, 3' 말단
서열:
Figure pct00124
Figure pct00125
서열번호 71
명칭: gi|438610|gb|AAC37875.1| 인테그라아제, 일부 [인간 면역결핍 바이러스 1]
서열:
Figure pct00126
서열번호 72
명칭: gi|545612232|ref|WP_021736722.1| 유형 V 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1 [애시드아미노코커스 종, BV3L6]
서열:
Figure pct00127
Figure pct00128
서열번호 73
명칭: gi|769142322|ref|WP_044919442.1| 유형 V 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1 [라크노스피라세 박테리움 MA2020]
서열:
Figure pct00129
Figure pct00130
서열번호 74
명칭: gi|489130501|ref|WP_003040289.1| 유형 V 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1 [프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)]
서열:
Figure pct00131
Figure pct00132
서열번호 75
명칭: gi|502240446|ref|WP_012739647.1| 유형 V 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1 [[유박테리움 엘리겐스(Eubacterium] eligens)]
서열:
Figure pct00133
Figure pct00134
서열번호 76
명칭: gi|537834683|ref|WP_020988726.1| 유형 V 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1 [렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai)]
서열:
Figure pct00135
Figure pct00136
서열번호 77
명칭: gi|739008549|ref|WP_036890108.1| 유형 V 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1 [포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis)]
서열:
Figure pct00137
Figure pct00138
서열번호 78
명칭: gi|517171043|ref|WP_018359861.1| 유형 V 크리스퍼-회합된 단백질 Cpf1 [포르피로모나스 마카카에]
서열:
Figure pct00139
Figure pct00140
서열번호 79
명칭: 유니프로트 위치 상에서 발견되는 인테그라아제 단백질 서열. DNA 서열을 GenBank로부터 수득하였다.
서열:
Figure pct00141
Figure pct00142
서열번호 80
명칭: sp|P04585|1148-1435
서열:
Figure pct00143
서열번호 81
징크 핑거 단백질을 특징화하는 단백질 도메인
Figure pct00144
(예를 들어, X(2-4)는 XX 또는 XXX 또는 XXXX를 의미한다)
서열번호 82
>gi|1616606|emb|X97044.1| 마우스 유방 종양 바이러스 5' LTR DNA
Figure pct00145
Figure pct00146
Figure pct00147
서열번호 83
>gi|1403387|emb|X98457.1| 마우스 유방 종양 바이러스 3' LTR
Figure pct00148
Figure pct00149
서열번호 84
>gi|119662099|emb|AM076881.1| 인간 면역결핍 바이러스 1 프로바이러스성(proviral) 5' LTR, TAR 요소 및 U3, U5 및 R 반복 영역, 클론 PG232.14
Figure pct00150
서열번호 85
>gi|1072081|gb|U37267.1|HIV1U37267 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 3' LTR 영역
Figure pct00151
서열번호 86 내지 99가 존재함
서열번호 100
neo의 세포 게놈 내로의 삽입을 위한 올리고(5' 및 3' HIV LTR의 완전한 서열 이용)
Figure pct00152
Figure pct00153
첫번째 5'LTR을 밑줄표시하고, 일반 텍스트는 neo이며, 3'LTR은 굵은글씨로 표시된다(1179 bp)
서열번호 101
5'LTR 및 3'LTR의 약어 버전으로 그 안에 neo 서열을 갖는 것(224 bp)
첫번째 5'LTR을 밑줄표시하고, 일반 텍스트는 neo이며, 3'LTR은 굵은글씨로 표시된다.
Figure pct00154
Figure pct00155
서열번호 72에 대하여
Genbank 단백질 ID: WP_021736722.1
NR 데이터베이스로부터의 NCBI 단백질 GI 또는 국소 GI(WGS 데이터베이스로부터 유래된 단백질의 경우): 545612232
WGS 데이터베이스에서 Contig ID: AWUR01000016.1
Contig 설명: 애시드아미노코커스 종 BV3L6 contig00028, 전체 게놈 샷건 서열
단백질 완전성: 완성
실험적으로 분석된 단백질: 8
비-중복 세트: nr
유기체: 애시드아미노코커스_sp_BV3L6
분류학: 박테리아, 페르미쿠테스(Firmicutes), 네가티브쿠테스 (Negativicutes), 셀레노모나달레스(Selenomonadales), 애시드아미노코카세아 (Acidaminococcaceae), 애시드아미노코커스, 애시드아미노코커스 종 BV3L6
서열번호 73에 대하여
Genbank 단백질 ID: WP_044919442.1
NR 데이터베이스로부터의 NCBI 단백질 GI, 또는 국소 GI(WGS 데이터베이스로부터 유래된 단백질의 경우): 769142322
WGS 데이터베이스에서 Contig ID: JQKK01000008.1
Contig 설명: 라크노스피라세 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) MA2020 T348DRAFT_스캐폴드00007.7_C, 전체 게놈 샷건서열
단백질 완전성: 완성
실험적으로 분석된 단백질: 9
비-중복 세트: nr
유기체: 라크노스피라세_박테리움_MA2020
분류학: 박테리아, 페르미쿠테스, 클로스트리디아, 라크노스피라세, 미분류된 라크노스피라세, 라크노스피라세 박테리움 MA2020
개시된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 추가 핵산 서열 및 단백질 서열 - CPF 1 배열. 서열번호 86-92; 차트의 위에서부터 바닥까지의 순서
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
Figure pct00159
개시된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 추가 핵산 서열 및 단백질 서열 - Cfp1 인간 분할 단백질 배열. 서열번호 86(제1열) 및 서열번호 90(제2열).
Figure pct00160
Figure pct00161
개시된 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 추가 핵산 서열 및 단백질 서열. 문헌 [Haft, D., et al. PLoS Computational Biology, November 2005, Vol. 1, Issue 6, pp. 474-483]으로부터 취한 표. 서열번호 200-253; 차트의 맨 위부터 바닥까지의 순서.
Figure pct00162
Figure pct00163
편집 표적 서열 및 Nrf2(엑손 2)에 대한 PAM: sgRNA 설계 1-3을 위해 이용됨
서열번호 254
Figure pct00164
서열번호 255
Figure pct00165
서열번호 256
Figure pct00166
Nrf2 타겟에서 통합의 검출을 위한 프라이머 키
프라이머 세트1:
서열번호 257
프라이머 1:
Figure pct00167
,
서열번호 258
프라이머 2:
Figure pct00168
프라이머 세트 2:
서열번호 259
프라이머 1:
Figure pct00169
,
서열번호 260
프라이머 2:
Figure pct00170
프라이머 세트 3:
서열번호 261
프라이머 1:
Figure pct00171
,
서열번호 262
프라이머 2:
Figure pct00172
인간 CXCR4에 대한 등록 번호
유니프로트 P61073
엔셈블 유전자 ID: ENSG00000121966
CXCR4(엑손 2)에 대한 편집 표적 서열 및 PAM: sgRNA 설계1에 사용됨
서열번호 263
Figure pct00173
CXCR4 표적에서 통합의 검출을 위한 프라이머 키
프라이머 세트 1:
서열번호 264
프라이머 1:
Figure pct00174
,
서열번호 265
프라이머 2:
Figure pct00175
프라이머 세트 2:
서열번호 266
프라이머 1:
Figure pct00176
,
서열번호 267
프라이머 2:
Figure pct00177
프라이머 세트 3:
서열번호 268
프라이머 1:
Figure pct00178
,
서열번호 269
프라이머 2:
Figure pct00179
프라이머 세트 4:
서열번호 270
프라이머 1:
Figure pct00180
,
서열번호 271
프라이머 2:
Figure pct00181
비오틴화를 위해 Avi-태그된 카스9
카스9 비오틴화에 사용된 avi-태그의 서열
아미노산 서열:
서열번호 272
Figure pct00182
핵산 서열:
서열번호 273
Figure pct00183
<110> EXELIGEN SCIENTIFIC, INC. SHEIKH, Ferrukh KAWAMURA, Tetsuya MO, Gloria <120> CAS 9 RETROVIRAL INTEGRASE AND CAS 9 RECOMBINASE SYSTEMS FOR TARGETED INCORPORATION OF A DNA SEQUENCE INTO A GENOME OF A CELL OR ORGANISM <130> 2000PCT <150> US 62/140,454 <151> 2015-03-31 <150> US 62/210,451 <151> 2015-08-27 <150> US 62/240,359 <151> 2015-10-12 <160> 274 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4167 <212> DNA <213> S.thermophilus <400> 1 atgactaagc catactcaat tggacttgat attggaacga atagtgttgg atgggctgta 60 ataactgata attacaaggt tccgtctaaa aaaatgaaag tcttaggaaa tacgagtaaa 120 aagtatatca aaaagaacct gttaggtgta ttactctttg actctggaat cacagcagaa 180 ggaagaagat tgaagcgtac tgcaagaaga cgttatacta gacgccgtaa tcgtatcctt 240 tatttgcagg aaatttttag cacggagatg gctacattag atgatgcttt ctttcaaaga 300 cttgacgatt cgtttttagt tcctgatgat aaacgtgata gtaagtatcc gatatttgga 360 aacttagtag aagaaaaagt ctatcatgat gaatttccaa ctatctatca tttaaggaaa 420 tatttagcag atagtactaa aaaagcagat ttgcgtctag tttatcttgc attggctcat 480 atgattaaat atagaggtca cttcttaatt gaaggagagt ttaattcaaa aaataatgat 540 attcagaaga attttcaaga ctttttggac acttataatg ctatttttga atcggattta 600 tcacttgaga atagtaaaca acttgaggaa attgttaaag ataagattag taaattagaa 660 aagaaagatc gtattttaaa actcttccct ggggagaaga attcggggat tttttcagag 720 tttctaaagt tgattgtagg aaatcaagct gattttagga aatgttttaa tttagacgaa 780 aaagcctcct tacatttttc caaagaaagc tatgatgaag atttagagac tttgttaggt 840 tatattggag atgattacag tgatgtcttt ctcaaagcaa agaaacttta tgatgctatt 900 cttttatcgg gttttctgac tgtaactgat aatgagacag aagcacctct ctcttctgct 960 atgataaagc gatataatga acacaaagaa gatttagcgt tactaaagga atatataaga 1020 aatatttcac taaaaacgta taatgaagta tttaaagatg acaccaaaaa tggttatgct 1080 ggttatattg atggaaaaac aaatcaggaa gatttctacg tatatctaaa aaacctattg 1140 gctgaatttg aaggtgcgga ttattttctt gaaaaaattg atcgagaaga ttttttgaga 1200 aagcaacgta catttgacaa tggttcgata ccatatcaga ttcatcttca agaaatgaga 1260 gcaattcttg ataagcaagc taaattttat cctttcttgg ctaaaaataa agaaagaatc 1320 gagaagattt taaccttccg aattccttat tatgtaggtc 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ttaaattatc cgaagatgct 780 aaactacagt tttctaagga tacttatgaa gaagatttag gagaattact tggaaaaatc 840 ggagataatt atgcagattt atttatatca gctaaaaatc tttatgatgc tattttgcta 900 tcaggaattt taacaataga tgacaacacg acaaaggctc cgttgtctgc ttcaatgatt 960 aaacgttatg aggaacatca ggaagattta gcacaactta agaaatttat ccgtcagaat 1020 ttaccagatc aatatagtga ggttttttct gataaaacaa aggatggcta tgctggttat 1080 attgatggaa aaacgaatca ggaggccttt tataaataca tcaaaaatat gctgtcaaaa 1140 acagaaggtg cagattattt tcttgacaaa attgatcgtg aagacttttt gagaaaacag 1200 agaacgtttg ataatggttc cgttccgcat cagattcatc tgcaagagat gcatgctatt 1260 ttacgacgtc agggtgaata ctatccattc ttgaaagaaa atcaggataa aattgaaaaa 1320 atcttaacgt ttagaattcc ttactacgtt ggtcctttgg cgcgaaaagg tagccgcttt 1380 gcctgggcag aatacaaggc ggataaaaaa gttacgccat ggaattttga tgatattctt 1440 gataaagaaa aatcagcaga agaattcatc acacgcatga ctttaaatga tttgtattta 1500 cctgaagaaa aagtcttacc aaagcatagt cttgtttatg aaacgtttaa tgtttacaat 1560 gagttaacta aagttaagta tgtcaatgag caagggaaag ccattttctt tgatgccaat 1620 atgaagcaag agatttttga tcatgttttt aaagaaaatc ggaaagttac taaagataaa 1680 cttttaaatt atttgaataa agagtttgaa gaatttagaa ttgttaactt aactggactg 1740 gataaggaaa ataaagcctt taattccagt cttggaacct atcatgattt gcgtaaaatt 1800 ttagataaat cattcttaga tgataaagta aatgaaaaga taattgagga tatcattcaa 1860 acactaactc tgtttgaaga cagagaaatg attcgtcagc gtcttcaaaa gtatagtgat 1920 atttttacaa cacagcaatt gaaaaaactt gaacgccgtc attatacagg ttggggaaga 1980 ttatcagcga agttaatcaa tggtattcga gataaacaga gtaataagac tattctgggt 2040 tatttgattg atgatggtta tagcaatcgt aactttatgc agttgattaa tgacgattct 2100 cttcctttta aagaagaaat tgctagggca caagtcattg gagaaacaga tgacttaaat 2160 caacttgtta gtgatattgc tggcagtcct gctattaaaa agggaatttt acaaagtctg 2220 aaaattgtag atgagcttgt taaagtcatg gggcataatc ctgctaacat tgttatcgaa 2280 atggcgcgtg aaaatcagac tacagccaaa gggcgtcgca gttcacagca acgttataaa 2340 cgacttgagg aggcaataaa aaatcttgac catgatttaa atcataagat tttaaaagaa 2400 cacccaacag ataatcaagc tttacagaat gaccgtcttt tcttatatta tctccaaaat 2460 ggccgagata tgtatactga agatccactt gatattaatc gtttaagtga ttatgatatc 2520 gaccatatta ttccacaatc ttttataaaa gatgactcta ttgacaataa ggttctggtt 2580 tcatcagcta aaaaccgtgg gaaatcggat aatgtaccga gtgaagatgt tgtcaatagg 2640 atgagaccgt tttggaataa attattgagc tgtggattga tttctcaacg gaaatacagc 2700 aatctaacca aaaaagaatt aaaaccagat gataaggctg gtttcatcaa acgtcaattg 2760 gttgagacaa gacaaattac aaagcatgtt gcacaaattt tagacgctcg ttttaataca 2820 aaacgtgatg aaaataaaaa agtaattcgt gatgtcaaaa ttatcacttt aaaatctaat 2880 ttagtttcac aatttcgtaa agactttaaa ttttacaaag tacgtgagat taatgattac 2940 catcatgcgc atgacgctta tcttaatgca gttataggaa aagctttatt agatgtttat 3000 ccgcagttag agcccgaatt tgtttatggt gagtaccctc attttcatgg atataaagaa 3060 aataaagcaa ctgctaagaa atttttctat tcaaatatta tgaatttttt taagaaagat 3120 gatatccgta ccgatgaaaa tggtgagatt gtttggaaaa aagatgagca tatttctaat 3180 attaaaaggg tgctttccta tccccaagtt aatattgtta agaaagtaga aatacagact 3240 gttggacaaa atgggggact ttttgacgat aatcctaaat caccattaga 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ctgcttcact aattcgaata cctgtaagca acaatactat agcaagatca 960 taatagtttg catttctgca ttggcgtaac acatcaaaaa atgcatgtaa ttcatggatt 1020 tctagaaatt tagaatcatg tctttctttt gctttacgcc ttttctctag tgaaatatct 1080 agttttaccg cagtcattgg agaaaactta atgacattat ataacacacc atgattaaaa 1140 atcttattac aagtactttt tatatgagtc attgttgaag gcgatgcatc atacatttct 1200 aaatatttat tgagactatt tttcatcaga agtggagtaa tcctgtctaa caaaaaatca 1260 tctcctataa ttttcccaag acgcttcata accagtagtt ctctctgaat tgtttgtggt 1320 ttaacagaga cacaccaagt ctgaaaccaa ttttctttta actctccaaa tgttgtaatc 1380 agttcaggac tatactgact ttcaaatgaa gtagttagtc tatctatttt atcaagaacc 1440 tctctttcag cttgtttcct cgccctacta gtattcttag tataacttac agttactgat 1500 ttccacttt 1509 <210> 20 <211> 502 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 20 Met Tyr Tyr Val Thr Lys Thr Asn Ser Lys Gly Gln Pro Leu Tyr Gln 1 5 10 15 Val Val Glu Lys Tyr Lys Asp Pro Leu Thr Gly Lys Trp Lys Ser Val 20 25 30 Thr Val Ser Tyr Thr Lys Asn Thr Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Glu 35 40 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gcgtggcata tacgatatag atacatttgt ggaaagatct 1260 acaattgtag cacagagaat agaagaaaca cagaaaagta tagatgtgct tgtgcaaaaa 1320 atagaagaag aaaagaataa aagagacaaa gaaaaaatac ttccggaaat tcggcatgtg 1380 ttggatctat attggaaaac agacgacatt gcacaaaaaa atatgttgtt aaagagcgta 1440 cttgaaaaag cagaatatct aaaagaaaag aagcagagag aagacaactt cgaactttgg 1500 atttatccaa agctgcctga aaaatag 1527 <210> 24 <211> 508 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium phage THSA-485A <400> 24 Met Asn Arg Val Cys Ile Tyr Leu Arg Lys Ser Arg Ala Asp Glu Glu 1 5 10 15 Ile Glu Lys Glu Leu Gly Gln Gly Glu Thr Leu Ala Lys His Arg Lys 20 25 30 Ala Leu Leu Lys Phe Ala Lys Glu Lys Asn Leu Asn Ile Val Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Glu Ile Val Ser Gly Glu Ser Leu Ile His Arg Pro Glu Met 50 55 60 Leu Glu Leu Leu Lys Glu Val Glu Gln Gly Met Tyr Asp Ala Val Leu 65 70 75 80 Cys Met Asp Leu Gln Arg Leu Gly Arg Gly Asn Met Gln Glu Gln Gly 85 90 95 Leu Ile Leu Glu Ala Phe Lys Lys Ser Asn Thr Lys Ile Ile Thr Leu 100 105 110 Gln Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Asn 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gcggaaaaca ggctttggaa 60 acggtgcaga ggctccttcc agtgctttgt caggcacacg gcctcactcc ggaacaagtg 120 gtcgcgatcg caagccacga cggaggaaag caagccttgg aaacagtaca gaggctgttg 180 cctgtgctgt gccaagcgca cggt 204 <210> 46 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 ctgaccccag agcaggtcgt ggcaatcgcg agcaataacg gcggaaaaca ggctttggaa 60 acggtgcaga ggctccttcc agtgctttgt caggcacacg gcctcactcc ggaacaagtg 120 gtcgcaatcg cgagcaataa cggcggaaaa caggctttgg aaacggtgca gaggct 176 <210> 47 <211> 219 <212> DNA <213> Ovine lentivirus <400> 47 catagtaaat ggcatcaaga tgctatgtca ttgcagttag attttgggat accgaaaggt 60 gcggcagaag atatagtaca acaatgtgaa gtatgtcagg aaaataaaat gcctagcacc 120 atcagaggaa gtaacaaaag agggatagat cattggcagg tggattatac tcattataaa 180 gacaaaataa tattggtatg ggtagaaaca aattcggga 219 <210> 48 <211> 73 <212> PRT <213> Ovine lentivirus <400> 48 His Ser Lys Trp His Gln Asp Ala Met Ser Leu Gln Leu Asp Phe Gly 1 5 10 15 Ile Pro Lys Gly Ala Ala Glu Asp Ile Val Gln Gln Cys Glu Val 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tctattttga gaaagagaat 420 attgatactt caagagagta caataaattc ctcttaagca cttatgctgc gctggcacag 480 gaagagatag aaactatttc aaactctacg atgtggggtt atgagaaaag gtttctaaag 540 ggtatcccaa agttcaaccg cttatatgga tacaaagtca tccatgcagg ggatgattcc 600 caattgattg ttcttgaaga tgaagcaaaa atcgtaagaa tgatgtatga acagtacctt 660 caagggaaga cgttcactga tattgcaagg gcgctaacag aagctggagt gaaaacagcc 720 aaagggaagg atgtctggat aggcggcatg ataaagcata ttttatccaa cgtcacctac 780 accggtaaca agcttacacg agaactgaaa agagatttat ttacgaacaa agttaatagc 840 ggtgaacggg atcaggtttt tataggaaac actcacgaac cgatcatcag caatgatatt 900 ttcaatcttg ttcaaaagaa gcttgaggcc aatacgaagg aaagaaagcc cagtgagaag 960 cgagagaaga accacatgtc tggtcggcta ctttgcggaa gatgtggata cagttttacc 1020 ataattcaca atagagcttc tcatcacttt aagtgtagcc ctaaaatcat gggggtctgt 1080 gattctgaac tttatcggga tgcggatatt cgagaaatga tgatgagggc aatgtatata 1140 aaatatgact tcaccgatga agacatagta ctaaaactgc tgaaggaact ccaggtcatc 1200 aatcaaaatg atcactttga gtttcatagg ctaaagttta tcactgaaat tgaaatcgta 1260 aaaaggcagc aggccatttc agatagatat tcagctatta gcatagaaaa aatggaagaa 1320 gaataccgca cttttgaaag caagattgcg aaaattgagg atgacaggta catcagaatc 1380 gatgcagtgg agtggttaaa gaaaaacaag acgctggatt cttttatcgc tcaggtcacc 1440 actaaaatat tgcgagcttg ggtttccgag atgactgttt atacacgaga tgacttttta 1500 gtgcagtgga ttgacggaac tcaaactgag ataggaagct gcgagcatca tcttgtgaag 1560 gatagaaata gtaagagtta cgagtccggt gaagaaacga gcaggagggc caaatttgaa 1620 gtcaaccaca ttagtgaaac caccgaagga caaggagaac ttgatctctt aagcaagagt 1680 gcaagttcaa acaatgaaga tagtaatcaa ccagaaaata attctacggg aaaggaggag 1740 cttgaattga acttaaacag taatgcagaa attatcaaaa ttgagcccgg gcaaagggac 1800 tatattatga agaatttgca caagagcctg agtgcaaata tgatgatgca aaatgcttca 1860 gtacacacgg caagtattaa caaacctaga cttaagactg ctgcttactg cagaatctca 1920 acagattcag aagaacaaaa ggtaagcttg aaaacccaag tagcctatta cacttatctg 1980 attctaaagg atccccaata tgaatatgca ggcatctatg ccgatgaagg tatatcaggg 2040 cgttctatga aaaaccgtac agaatttctc aaactactcg aagaatgtaa agccgggaat 2100 gtggacttga ttttaaccaa gtcaatctca cggtttagca gaaacgcatt agattgcttg 2160 gaacagatca ggatgctgaa gtcgctgcca agtccagttt atgtgtattt tgagaaagag 2220 aatattcata caaaagatga gaagagtgag ctgatgattt ctatttttgg aagtatcgct 2280 caggaagaga gcgtaaacat gggagaagcc atggcttggg gaaaacggag atatgctgag 2340 agagggatag taaacccaag tgttgcacct tatggatata gaacggtcag aaaaggtgaa 2400 tgggaggtgg ttgaagaaga agctacgatc attagaagaa tttatcggat gctcctaagt 2460 ggaaagagta ttcatgaaat cacaaaggag ctctccatgg agaagataaa gggtcctggc 2520 ggcaacgagc agtggcatct tcaaaccatt agaaatatct tgagaaatga aatctatagg 2580 ggtaactacc tttatcaaaa ggcttatatc aaggacacga tcgagaagaa ggtggtaatg 2640 aatcgaggag aactgccaca gtatctcata gagaatcatc ataaagccat tgttgacaat 2700 gagacctggg aaaaggtcca gaaggtacta gaagccagaa gggaaaaata tgagaataaa 2760 aagtccataa cttatcctga agacaaaatg aaaaacgctt ctcttgaaga tatttttacc 2820 tgtggagaat gtggaagtaa aataggccat agaaggagca tccagagctc taatgagatt 2880 cattcctgga tctgcacaaa agccgctaag tctttcttgg tggactcgtg taagtccaca 2940 agcgtatatc agaagcacct ggagctgcat tttatgaaga ctcttctcga tattaaaaag 3000 catcgttctt tcaaagatga ggtgctcacc tatattcgaa cccaagaagt agatgaaaag 3060 gaagagtgga gaatcaaagt catagagaaa cgaatcaaag atcttaacag agagctttat 3120 aatgcggtag accaggagct caataaaaaa ggtcaggact ccaggaaagt tgatgagctc 3180 acagagaaaa ttgtggatct tcaagaggaa ttaaaggtgt ttagggaccg aaaggcaaag 3240 gttgaggatc ttaaagctga gcttgaatgg ttcctaaaga agctggaaac cattgatgac 3300 gctcgagtaa aaagaaatga aggaataggc cacggtgaag agatctactt cagagaagat 3360 atttttgaaa gaatagtaag gagtgcacag ctttatagcg atggaaggat cgtctacgaa 3420 ctaagcctcg ggatccagtg gttcattgac tttaaataca gcgcatttca gaagcttctt 3480 ataaagtgga aggataaaca aagggcagaa gaaaaagagg cttttcttga ggggccggaa 3540 gttaaagagc tgctggaatt ttgtaaggaa ccgaagagct actctgattt acatgccttc 3600 atgtgtgaga gaaaagaggt gtcttatagc tatttcagga aattggtgat aagacctttg 3660 atgaagaaag gaaagctgaa gttcaccata ccagaagatg ttatgaatag gcatcagaga 3720 tacacatcaa tctaa 3735 <210> 65 <211> 1244 <212> PRT <213> Youngiibacter fragilis 232.1 <400> 65 Met Lys Asp Asn Asp Lys Arg Met Trp Val Gln Thr Leu Trp Asn Pro 1 5 10 15 Ile Asn Glu Arg His Lys Ser Pro Leu Asp Ser Pro Glu Pro Gly Ile 20 25 30 Lys Val Ala Ala Tyr Cys Arg Val Ser Met Lys Glu Glu Glu Gln Leu 35 40 45 Arg Ser Leu Glu Asn Gln Val His His Tyr Thr His Phe Ile Lys Ser 50 55 60 Lys Pro Asn Trp Arg Phe Val Gly Val Tyr Tyr Asp Asp Gly Ile Ser 65 70 75 80 Ala Ala Met Ala Ser Gly Arg Arg Gly Phe Gln Arg Ile Ile Arg His 85 90 95 Ala Glu Glu Gly Lys Val Asp Leu Ile Leu Thr Lys Asn Ile Ser Arg 100 105 110 Phe Ser Arg Asn Ser Lys Glu Leu Leu Asp Ile Ile Asn Gln Leu Lys 115 120 125 Ala Ile Gly Val Gly Ile Tyr Phe Glu Lys Glu Asn Ile Asp Thr Ser 130 135 140 Arg Glu Tyr Asn Lys Phe Leu Leu Ser Thr Tyr Ala Ala Leu Ala Gln 145 150 155 160 Glu Glu Ile Glu Thr Ile Ser Asn Ser Thr Met Trp Gly Tyr Glu Lys 165 170 175 Arg Phe Leu Lys Gly Ile Pro Lys Phe Asn Arg Leu Tyr Gly Tyr Lys 180 185 190 Val Ile His Ala Gly Asp Asp Ser Gln Leu Ile Val Leu Glu Asp 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ttaaaaaaga tttggcagaa 720 gagctaacct ttgatattga ctacaaaaca tctgaagtta atcaaagagt tttttcactt 780 gatgaagttt ttgagatagc aaactttaat aattatctaa atcaaagtgg tattactaaa 840 tttaatacta ttattggtgg taaatttgtt aatggtgaaa atacaaagag aaaaggtata 900 aatgaatata taaatctata ctcacagcaa ataaatgata aaacacttaa aaaatataaa 960 atgagtgttt tatttaagca aattttaagt gatacagaat ctaaatcttt tgtaattgat 1020 aagttagaag atgatagtga tgtagttaca acgatgcaaa gtttttatga gcaaatagca 1080 gcttttaaaa cattagaaga aaagtctatt aaggaaacat tatctttact atttgatgat 1140 ttaaaagctc aaaaacttga tttgagtaaa atttatttta aaaatgataa atctcttact 1200 gatctatcac aacaagtttt tgatgattat agtgttattg gtacagcggt actagaatat 1260 ataactcaac aagtagcacc taaaaatctt gataacccta gtaagaaaga gcaagattta 1320 atagccaaaa aaactgaaaa agcaaaatac ttatctctag aaactataaa gcttgcctta 1380 gaagaattta ataagtatag agatatagat aaacagtgta ggtttgaaga aatatttgca 1440 agctttgcag atattccggt gctatttgat gaaatagctc aaaacaaaaa caatttggca 1500 cagatatcta tcaaatatca aaatcaaggt aaaaaagacc tgcttcaaac 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gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt 660 caaaattttc gggtttatta cagggacagc agaaatccac tttggaaagg accagcaaag 720 ctcctctgga aaggtgaagg ggcagtagta atacaagata atagtgacat aaaagtagtg 780 ccaagaagaa aagcaaagat cattagggat tatggaaaac agatggcagg tgatgattgt 840 gtggcaagta gacaggatga ggattag 867 <210> 80 <211> 288 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 80 Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala Gln Asp Glu His Glu Lys Tyr His 1 5 10 15 Ser Asn Trp Arg Ala Met Ala Ser Asp Phe Asn Leu Pro Pro Val Val 20 25 30 Ala Lys Glu Ile Val Ala Ser Cys Asp Lys Cys Gln Leu Lys Gly Glu 35 40 45 Ala Met His Gly Gln Val Asp Cys Ser Pro Gly Ile Trp Gln Leu Asp 50 55 60 Cys Thr His Leu Glu Gly Lys Val Ile Leu Val Ala Val His Val Ala 65 70 75 80 Ser Gly Tyr Ile Glu Ala Glu Val Ile Pro Ala Glu Thr Gly Gln Glu 85 90 95 Thr Ala Tyr Phe Leu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Trp Pro Val Lys Thr 100 105 110 Ile His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr Gly Ala Thr Val Arg Ala 115 120 125 Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile Lys Gln Glu Phe Gly Ile Pro Tyr Asn 130 135 140 Pro Gln Ser Gln Gly Val Val Glu Ser Met Asn Lys Glu Leu Lys Lys 145 150 155 160 Ile Ile Gly Gln Val Arg Asp Gln Ala Glu His Leu Lys Thr Ala Val 165 170 175 Gln Met Ala Val Phe Ile His Asn Phe Lys Arg Lys Gly Gly Ile Gly 180 185 190 Gly Tyr Ser Ala Gly Glu Arg Ile Val Asp Ile Ile Ala Thr Asp Ile 195 200 205 Gln Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg 210 215 220 Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asn Pro Leu Trp Lys Gly Pro Ala Lys 225 230 235 240 Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val Val Ile Gln Asp Asn Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Val Pro Arg Arg Lys Ala Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly 260 265 270 Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys Val Ala Ser Arg Gln Asp Glu Asp 275 280 285 <210> 81 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(5) <223> At least two Xaa are present; if present, can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(24) <223> At least three Xaa are present; if present, can be any naturally occurring amino acid <400> 81 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His 20 25 <210> 82 <211> 1321 <212> DNA <213> Mouse mammary tumor virus <400> 82 atgccgcgcc tgcagcagaa atggttgaac tcccgagagt gtcctacact taggggagaa 60 gcagccaagg ggttgtttcc cacccagaac gacccatctg cgcacacacg gatgagcccg 120 tcaaacaaag acatattcat tctctgctgc aaacttggca tagctctgct ttgcctgggg 180 ctattggggg aagttgcggt tcatgctcgc agggctctca cccttgactc ttttaatagc 240 tcttctgtgc aagattacaa tctaaacaat tcggagaact cgaccttcct cctgaggcaa 300 ggaccacagc caacttcctc ttacaagccg catcgattta gtccttcaga aatagaaata 360 agaatgcttg ctaaaaatta tatttttacc aatgagacca atccaatagg tcgattatta 420 attactatgt taagaaatga atcattatct tttagtacta tttttactca aattcagaag 480 ttagaaatgg gaatagaaaa tagaaagaga cgctcagcct cagttgaaga acaggtgcaa 540 ggactaaggg cctcaggcct agaagtaaaa agggggaaga ggagtgcgct tgtcaaaata 600 ggagacaggt ggtggcaacc aggaacttat aggggacctt acatctacag accaacagac 660 gcccccttac cgtatacagg aagatatgac ctaaattttg ataggtgggt cacagtcaat 720 ggctataaag tgttatacag atccctcccc tttcgtgaaa ggctcgccag agctagacct 780 ccttggtgcg tgttgtctca ggaagaaaaa gacgacatga aacaacaggt acatgattat 840 atttatctag gaacaggaat gaacttttgg agatattata ccaaggaggg ggcagtggct 900 agactattag aacacatttc tgcagatact aatagcatga gttattatga ttagccttta 960 ttggcccaat cttgtggttc ccagggttca agtaggttca tggtcacaaa ctgttcttaa 1020 aaacaaggat gtgagacaag tggtttcctg gcttggtttg gtatcaaatg ttttgatctg 1080 agctctgagt gttctgtttt cctatgttct tttggaatct atccaagtct tatgtaaatg 1140 cttatgtaaa ccaaagtata aaagagtgct gattttttga gtaaacttgc aacagtccta 1200 acattcacct ctcgtgtgtt tgtgtctgtt cgccatcccg tctccgctcg tcacttatcc 1260 ttcactttcc agagggtccc cccgcagacc ccggtgaccc tcaggttggc cgactgcggc 1320 a 1321 <210> 83 <211> 1082 <212> DNA <213> Mouse mammary tumor virus <400> 83 atgccgcgcc tgcagcagaa atggttgaac tcccgagagt gtcctacact taggagagaa 60 gcagccaagg ggttgtttcc caccaaggac gacccgtctg cgtgcacgcg gatgagccca 120 tcagacaaag acatactcat tctctgctgc aaacttggca tagctctgct ttgcctgggg 180 ctattggggg aagttgcggt tcgtgctcgc agggctctca cccttgattc ttttaataac 240 tcttctgtgc aagattacaa tctaaacgat tcggagaact cgaccttcct cctggggcaa 300 ggaccacagc caacttcctc ttacaagcca caccgacttt gtccttcaga aatagaaata 360 agaatgcttg ctaaaaatta tatttttacc aatgagacca atccaatagg tcgattatta 420 atcatgatgt ttagaaatga atctttgtct tttagcacta tatttactca aattcaaagg 480 ttagaaatgg gaatagaaaa tagaaagaga cgctcaacct cagttgaaga acaggtgcaa 540 ggactaaggg cctcaggcct agaagtaaaa aggggaaaga ggagtgcgct tgtcaaaata 600 ggagacaggt ggtggcaacc agggacttat aggggacctt acatctacag accaacagac 660 gccccgctac catatacagg aagatacgat ttaaattttg ataggtgggt cacagtcaac 720 ggctataaag tgttatacag atccctcccc cttcgtgaaa gactcgccag ggctagacct 780 ccttggtgtg tgttaactca ggaagaaaaa gacgacatga aacaacaggt acatgattat 840 atttatctag gaacaggaat gaacttctgg ggaaagatat ttgactacac cgaagaggga 900 gctatagcaa aaattatata taatatgaaa tatactcatg ggggtcgcat tggcttcgat 960 cccttttgaa acatttataa atacaattag gtctaccttg cggttcccaa ggtttaagta 1020 agttcagggt cacaaactgt tcttaaaaca aggatgtgag acaagtggtt tcctgacttg 1080 gt 1082 <210> 84 <211> 771 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 84 ggcaagaaat ccttgatttg tgggtctact acacacaagg cttcttccct gattggcaaa 60 actacacacc gggaccaggg gtcagatatc cactgacctt tggatggtgc tacaagctag 120 tgccagttga cccaaaggaa gtagaagagg ctaaccaaag agaagacaac tgtttgctac 180 accctatgag cctgcatgga atagaggacg aagacagaga agtattaaag tggcagtttg 240 acagcagcct agcacgcaga cacatggccc gcgagctaca tccagagtat tacaaagact 300 gctgacacag aaaagacttt ccgctaggac tttccactga ggcgttccag ggggagtggt 360 ctaggcagga ctaggagtgg ccaaccctca gatgctgcat ataagcagct gcttttcgcc 420 tgtactaggt ctctctaggt ggaccagatc tgagcctagg cgctctctgg ctatctaagg 480 aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc tctaagtagt gtgtgcccgt 540 ctgttgtgtg actctagtaa ctagagatcc ctcagaccaa ctttagtagt gtaaaaaatc 600 tctagcagtg gcgcccgaac agggacccga aagtgaaagc aggaccagag gagatctctc 660 gacgcaggac tcggcttgct gaaagtgcac tcggcaagag gcgagagcag cggcgactgg 720 tgagtacgcc gaattttatt ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat a 771 <210> 85 <211> 493 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 85 atgggtggca agtggtcaga aagtagtgtg gttagaaggc atgtaccttt aagacaaggc 60 agctatagat cttagccgct ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc 120 acagagaaga tcagttgaac cagaagaaga tagaagaggc catgaagaag aaaacaacag 180 attgttccgt ttgttccgtt ggggactttc caggagacgt ggcctgagtg ataagccgct 240 ggggactttc cgaagaggcg tgacgggact ttccaaggcg acgtggcctg ggcgggactg 300 gggagtggcg agccctcaga tgctgcatat aagcagctgc tttctgcctg tactgggtct 360 ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 420 aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 480 tctggtatct aga 493 <210> 86 <211> 1307 <212> PRT <213> Acidaminococcus sp. BV3L6 <400> 86 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His Ile Phe 195 200 205 Thr Arg 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176 000 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <400> 178 000 <210> 179 <400> 179 000 <210> 180 <400> 180 000 <210> 181 <400> 181 000 <210> 182 <400> 182 000 <210> 183 <400> 183 000 <210> 184 <400> 184 000 <210> 185 <400> 185 000 <210> 186 <400> 186 000 <210> 187 <400> 187 000 <210> 188 <400> 188 000 <210> 189 <400> 189 000 <210> 190 <400> 190 000 <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <400> 200 000 <210> 201 <400> 201 000 <210> 202 <400> 202 000 <210> 203 <400> 203 000 <210> 204 <400> 204 000 <210> 205 <400> 205 000 <210> 206 <400> 206 000 <210> 207 <400> 207 000 <210> 208 <400> 208 000 <210> 209 <400> 209 000 <210> 210 <400> 210 000 <210> 211 <400> 211 000 <210> 212 <400> 212 000 <210> 213 <400> 213 000 <210> 214 <400> 214 000 <210> 215 <400> 215 000 <210> 216 <400> 216 000 <210> 217 <400> 217 000 <210> 218 <400> 218 000 <210> 219 <400> 219 000 <210> 220 <400> 220 000 <210> 221 <400> 221 000 <210> 222 <400> 222 000 <210> 223 <400> 223 000 <210> 224 <400> 224 000 <210> 225 <400> 225 000 <210> 226 <400> 226 000 <210> 227 <400> 227 000 <210> 228 <400> 228 000 <210> 229 <400> 229 000 <210> 230 <400> 230 000 <210> 231 <400> 231 000 <210> 232 <400> 232 000 <210> 233 <400> 233 000 <210> 234 <400> 234 000 <210> 235 <400> 235 000 <210> 236 <400> 236 000 <210> 237 <400> 237 000 <210> 238 <400> 238 000 <210> 239 <400> 239 000 <210> 240 <400> 240 000 <210> 241 <400> 241 000 <210> 242 <400> 242 000 <210> 243 <400> 243 000 <210> 244 <400> 244 000 <210> 245 <400> 245 000 <210> 246 <400> 246 000 <210> 247 <400> 247 000 <210> 248 <400> 248 000 <210> 249 <400> 249 000 <210> 250 <400> 250 000 <210> 251 <400> 251 000 <210> 252 <400> 252 000 <210> 253 <400> 253 000 <210> 254 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 254 gcgacggaaa gagtatgagc tgg 23 <210> 255 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 255 tatttgactt cagtcagcga cgg 23 <210> 256 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 256 tggaggcaag atatagatct tgg 23 <210> 257 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 257 gtgttaattt caaacatcag cagc 24 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 258 gacaagacat ccttgatttg 20 <210> 259 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 259 gaggttgact gtgtaaatg 19 <210> 260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 260 gataccagag tcacacaaca g 21 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 261 tctacattaa ttctcttgtg c 21 <210> 262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 262 gataccagag tcacacaaca g 21 <210> 263 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 263 gggcaatgga ttggtcatcc tgg 23 <210> 264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 264 tctacattaa ttctcttgtg c 21 <210> 265 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 265 gacaagacat ccttgatttg 20 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 266 tctacattaa ttctcttgtg c 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 267 gataccagag tcacacaaca g 21 <210> 268 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 268 gaggttgact gtgtaaatg 19 <210> 269 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 269 gacaagacat ccttgatttg 20 <210> 270 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 270 gaggttgact gtgtaaatg 19 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 271 gataccagag tcacacaaca g 21 <210> 272 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 272 Gly Gly Asp Leu Glu Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Ile Glu Trp His Glu 20 <210> 273 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 273 ggcggcgacc tcgagggtag cggtctgaac gatatttttg aagcgcagaa aattgaatgg 60 catgaataa 69 <210> 274 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 274 Cys Cys His Cys 1

Claims (25)

  1. 작동적으로 연결된,
    a) 카스9, 비활성 카스9, 또는 Cpf1, 또는 이의 일부를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열:
    b) 인테그라아제(integrase), 재조합효소, 또는 전이효소(transposase), 또는 이의 일부를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    c) 핵산 링커를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열
    을 포함하고,
    이때 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 핵산 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 연결되고, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 유기체 내 융합 단백질로서 발현될 수 있는, 핵산 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 27 내지 46, 49, 56, 또는 68, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 핵산 구조물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 카스9, 비활성 카스9, 또는 Cpf1은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 50, 52, 69, 72 내지 78, 또는 86 내지 92, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 핵산 구조물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 15, 17, 19, 21, 23, 47, 55, 62, 64, 66, 70, 또는 79, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 핵산 구조물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소는 서열번호 16, 18, 20, 22, 24, 25, 26, 48, 63, 65, 67, 71, 또는 80, 또는 이에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나를 포함하는 것인, 핵산 구조물.
  6. 제1항의 핵산 구조물을 포함하는 유기체.
  7. 제1항의 융합 단백질을 포함하고, 변형된 게놈을 갖는 유기체.
  8. a) 카스9, 비활성 카스9, 또는 Cpf1, 또는 이의 일부를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열:
    b) 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소, 또는 이의 일부를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    c) 핵산 링커를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드 서열
    을 포함하고,
    이때 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 5' 및 3' 말단을 포함하고, 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 핵산 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 연결되고, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 유기체 내 융합 단백질로서 발현될 수 있는, 유기체.
  9. a) 촉매적으로 비활성인 카스9, 카스9, TALE 단백질, 징크 핑거 단백질(Zinc finger protein), 또는 Cpf1 단백질인, 표적 DNA 서열로 표적되는 제1 단백질;
    b) 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소인 제2 단백질; 및
    c) 제2 단백질에 제1 단백질을 연결하는 링커
    를 포함하는, 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제2 단백질은 인테그라아제인 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인테그라아제는 HIV1 인테그라아제 또는 렌티바이러스성(lentiviral) 인테그라아제인, 융합 단백질.
  12. 제9항에 있어서, 상기 링커 서열은 길이가 하나 이상의 아미노산인, 융합 단백질.
  13. 제9항에 있어서, 상기 제1 단백질은 촉매적으로 비활성인 카스9인, 융합 단백질.
  14. 제9항에 있어서, 상기 링커 서열은 길이가 4 개 내지 8 개의 아미노산인, 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 단백질은 TALE 단백질인, 융합 단백질.
  16. 제9항에 있어서, 상기 제1 단백질은 징크 핑거 단백질인, 융합 단백질.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 표적 DNA 서열은 길이가 약 16 개 내지 약 24 개의 염기쌍인, 융합 단백질.
  18. 제9항에 있어서, 상기 제1 단백질은 카스9 또는 촉매적으로 비활성인 카스9이고, 이때 하나 이상의 가이드 RNA는 약 16 개 내지 약 24 개 염기쌍의 표적 DNA 서열의 표적하는데 사용되는 것인, 융합 단백질.
  19. a) 게놈성 DNA 내 표적 서열을 확인하는 단계;
    b) 제1항에 따른 융합 단백질이 게놈성 DNA 내 표적 서열에 결합하도록 설계하는 단계;
    c) 관심 대상의 DNA 서열이 게놈성 DNA 내로 혼입되도록 설계하는 단계; 및
    d) 세포 또는 유기체 내로 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열의 도입을 가능하게 하는 기법에 의해, 세포 또는 유기체에 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열을 제공하는 단계로, 이때 관심 대상의 DNA 서열은 게놈성 DNA의 표적 서열에 통합되는 단계
    를 포함하는 게놈 DNA 내로 DNA 서열을 삽입하는 방법.
  20. a) 카스9, 촉매적으로 비활성인 카스9, TALE 단백질, 징크 핑거 단백질, 또는 표적 DNA 서열에 결합하도록 공학적으로 조작된(engineered) Cpf1 단백질인 제1 단백질에 대한 제1 코딩 서열;
    b) 인테그라아제, 재조합효소, 또는 전이효소인 제2 단백질에 대한 제2 코딩 서열;
    c) 제1 및 제2 단백질 사이에 아미노산 링커를 형성하는 제1 및 제2 코딩 서열 사이의 DNA 서열;
    d) 선택적으로, 인테그라아제에 의해 인식된 att 위치에 의해 둘러싸인 관심 대상의 발현된 DNA 서열, 및 선택적으로 하나 이상의 가이드 RNA
    를 포함하고,
    이때 제1 단백질은 결정된 DNA 서열에 표적되고, 제1 단백질은 아미노산 링커 서열에 의해 제2 단백질에 연결되는, 뉴클레오티드 벡터.
  21. a) 유전자 내 ATG 시작 코돈을 확인하는 단계;
    b) 제1항에 따른 융합 단백질을 이용하여 유전자의 ATG 시작 코돈 직후의 표적 서열에 결합하도록 융합 단백질 시스템을 설계하는 단계;
    c) 하나 이상의 연속적인 정지 코돈인 관심 대상의 DNA 서열을 설계하는 단계; 및
    d) 세포 또는 유기체 내로 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열의 도입을 가능하게 하는 기법에 의해, 세포 또는 유기체에 융합 단백질 및 관심 대상의 DNA 서열을 제공하는 단계
    를 포함하고,
    이때 관심 대상의 DNA 서열은 게놈성 DNA의 표적 서열에 통합되고, 유전자의 전사는 저해되는, 세포 또는 유기체에서 유전자 전사를 저해하는 방법.
  22. 제9항에 있어서, 상기 제2 단백질은 재조합효소인 융합 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 상기 재조합효소는 Cre 재조합효소 또는 이의 변형된 형태이며, 이때 변형된 Cre 재조합효소는 구성적(constitutive) 재조합효소 활성을 갖는 것인 융합 단백질.
  24. 제20항에 있어서, 세포 내에서 발현될 역전사효소 유전자를 추가로 포함하는 벡터.
  25. DNA 결합 단백질/인테그라아제 융합 및 길이가 약 15 개 내지 약 100 개인 염기쌍의 RNA의 정제된 단백질을 포함하고, 이때 DNA 결합 단백질은 게놈 내에서 표적된 DNA 서열로 공학적으로 조작된 카스9, Cpf1, 탈렌(TALEN) 및 징크 핑거 단백질로부터 선택되고, 이때 인테그라아제는 HIV 인테그라아제, 렌티바이러스성 인테그라아제, 아데노바이러스성 인테그라아제, 레트로바이러스성 인테그라아제, 또는 MMTV 인테그라아제인, 조성물.
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