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KR20170063670A - 세포독성 벤조다이아제핀 유도체 - Google Patents

세포독성 벤조다이아제핀 유도체 Download PDF

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KR20170063670A
KR20170063670A KR1020177009021A KR20177009021A KR20170063670A KR 20170063670 A KR20170063670 A KR 20170063670A KR 1020177009021 A KR1020177009021 A KR 1020177009021A KR 20177009021 A KR20177009021 A KR 20177009021A KR 20170063670 A KR20170063670 A KR 20170063670A
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ala
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라비 브이.제이. 차리
마이클 루이스 밀러
마나미 시즈카
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이뮤노젠 아이엔씨
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Abstract

본 발명은 항증식성 활성을 지니는 신규한 벤조다이아제핀 유도체 및 더 구체적으로는 화학식 (I) 내지 (VI)의 신규한 벤조다이아제핀 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포결합제에 결합되는 벤조다이아제핀 화합물의 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 상기 화합물 또는 컨쥬게이트를 이용하여 포유류에서 비정상적 세포 성장을 저해하거나 증식성 장애를 치료하는데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

세포독성 벤조다이아제핀 유도체{CYTOTOXIC BENZODIAZEPINE DERIVATIVES}
관련출원에 대한 참조
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. §119(e)) 하에서 2014년 9월 3일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/045,248호, 2014년 12월 3일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/087,040호, 2015년 4월 17일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/149,370호 및 2015년 5월 20일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/164,305호의 유익을 주장하며, 이들 각각의 전문은 모든 도면, 화학식, 명세서 및 청구범위를 포함하여, 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 신규한 세포독성 화합물, 및 이들 세포독성 화합물 및 세포 결합제를 포함하는 세포독성 컨쥬게이트에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 의약으로서, 특히 항증식제로서 유용한 신규한 벤조다이아제핀 화합물, 이의 유도체, 이의 중간체, 이의 컨쥬게이트, 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
벤조다이아제핀 유도체는 다양한 장애를 치료하기 위한 유용한 화합물이고, 항간질제(이미다조[2,1-b][1,3,5]벤조티아다이아제핀, 미국 특허 제4,444,688호; 미국 특허 제4,062,852호), 항균제(피리미도[1,2-c][1,3,5]벤조티아다이아제핀, 영국 특허 제1476684호), 이뇨제 및 혈압 강하제(피롤로(1,2-b)[1,2,5]벤조티아다이아제핀 5,5 다이옥사이드, 미국 특허 제3,506,646호), 혈중지질저하제(WO 03091232), 항우울제(미국 특허 제3,453,266호); 골다공증(일본 특허 제2138272호)와 같은 의약을 포함한다.
동물 종양 모델에서 벤조다이아제핀 유도체, 예컨대 피롤로벤조다이아제핀(PBD)은 항종양제(N-2-이미다졸릴 알킬 치환된 1,2,5-벤조티아다이아제핀-1,1-다이옥사이드, 미국 특허 제6,156,746호), 즉, 벤조-피리도 또는 다이피리도 티아다이아제핀(WO 2004/069843), 피롤로[1,2-b] [1,2,5] 벤조티아다이아제핀 및 피롤로[1,2-b][1,2,5] 벤조다이아제핀 유도체(WO2007/015280), 토메이마이신 유도체(예를 들어, 피롤로[1,4]벤조다이아제핀), 예컨대 WO 00/12508, WO2005/085260, WO2007/085930 및 유럽 특허 제2019104호에 기재된 것으로서 항-종양제로서 작용하는 것으로 나타났다.　 벤조다이아제핀은 또한 세포 성장 및 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(문헌[Kamal A., et al., Bioorg Med Chem. 2008 Aug 15;16(16):7804-10(및 그에 인용된 참고문헌); Kumar R, Mini Rev Med Chem. 2003 Jun; 3(4):323-39(및 그에 인용된 참고문헌); Bednarski J J, et al., 2004; Sutter A. P, et al., 2002; Blatt N B, et al., 2002), Kamal A. et al., Current Med. Chem., 2002; 2; 215-254, Wang J-J., J.Med. Chem., 2206; 49:1442-1449, Alley M.C. et al., Cancer Res. 2004; 64:6700-6706, Pepper C. J., Cancer Res 2004; 74:6750-6755, Thurston D.E. 및 Bose D.S., Chem Rev 1994; 94:433-465; 및 Tozuka, Z., et al., Journal of Antibiotics, (1983) 36; 1699-1708].　PBD의 일반적 구조는 미국 특허 공개 제20070072846호에 기재되어 있다. PBD는 치환체의 수, 유형 및 위치, 그들의 방향족 A 고리와 피롤로 C 고리 둘 다, 그리고 C 고리의 포화도가 상이하다. 작은 홈에서 첨가물을 형성하고 DNA를 가교하는 그들의 능력은 그들이 DNA를 가공하는 것을 방해할 수 있으며, 따라서 그들의 항증식제로서의 사용에 대한 가능성을 가진다.
임상에 들어가는 첫 번째 피롤로벤조다이아제핀인 SJG-136(NSC 694501)은 DNA 가닥 내 가교를 야기하는 강한 세포독성제이다(S.G Gregson et al., 2001, J. Med. Chem., 44: 737-748; M.C. Alley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6700-6706; J.A. Hartley et al., 2004, Cancer Res., 64: 6693-6699; C. Martin et al., 2005, Biochemistry., 44: 4135-4147; S. Arnould et al., 2006, Mol . Cancer Ther., 5: 1602-1509). SJG-136의 I상 임상 평가로부터의 결과는 이 약물이 극도로 낮은 용량에서 독성이고(최대 허용 용량 45㎍/㎡), 혈관 누출 증후군, 말초부종, 간독성 및 피로를 포함하는 몇몇 유해 효과가 주목된다는 것을 나타내었다. DNA 손상은 순환 림프구의 모든 용량에서 주목되었다(D.　Hochhauser et al., 2009, Clin. Cancer Res., 15: 2140-2147). 따라서, 다양한 증식성 질환 상태, 예컨대 암을 치료하는데 독성이 더 적고 여전히 치료적으로 활성인 개선된 벤조다이아제핀 유도체에 대한 필요가 존재한다.
본 명세서에 기재된 신규한 벤조다이아제핀 화합물 및 이의 컨쥬게이트는 다양한 종양 세포에 대해 놀랍게도 강한 효능을 가진다.
본 발명의 하나의 목적은 다음의 화학식 중 임의의 하나로 나타내는 세포독성 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다:
Figure pct00001
식 중:
L', L'' 및 L''' 중 하나는 다음의 화학식으로 나타내고:
-Z1-P-Z2-Rx-J (A)
다른 둘은 동일 또는 상이하고, -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO2R', -SO3H, -OSO3H, -SO2NR'R'', 사이아노, 아지도, -COR', -OCOR', 및 -OCONR'R''로부터 독립적으로 선택되며;
Z1 및 Z2 중 하나는 -C(=O)-이고, 다른 하나는 -NR5-이며;
P는 아미노산 잔기 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고;
Rx는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일이며;
J는 세포독성 화합물을 세포-결합제에 공유결합시킬 수 있는 반응기를 포함하는 모이어티이고;
N과 C 사이의 이중선
Figure pct00002
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 단, 그것이 이중 결합일 때, X는 없고 Y는 -H이거나, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며, 그것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고;
Y는 -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'R'', -NR'R'', -NR'COR'', -NR'NR'R'', 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 질소-함유 헤테로사이클(예를 들어, 질소 원자에 부착된 피페리딘, 테트라하이드로피롤, 피라졸, 몰폴린 등), -NR'(C=NH)NR'R''으로 나타내는 구아니디늄, 아미노산 잔기, 또는 -NRCOP'로 나타내는 펩타이드, -SR, -SOR', 할로겐, 사이아노, 아지도, -OSO3H, 아황산염(-SO3H 또는 -SO2H), 메타중아황산염(H2S2O5), 모노-, 다이-, 트라이- 및 테트라- 티오포스페이트(PO3SH3, PO2S2H2, POS3H2, PS4H2), 티오 포스페이트 에스터(RiO)2PS(ORi), RiS-, RiSO, RiSO2, RiSO3, 티오황산염(HS2O3), 아티온산염(HS2O4), 포스포로다이티오에이트(P(=S)(ORk')(S)(OH)), 하이드록삼산(Rk'C(=O)NOH) 및 폼알데하이드 설폭실레이트(HOCH2SO2 -) 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 이탈기이되, Ri는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이고, -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H, 및 -PO3H로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환되며; Ri는 추가로 본 명세서에 기재된 알킬에 대한 치환체로 선택적으로 치환될 수 있고; Rj는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며; Rk '는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴이고;
P'는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 잔기 또는 폴리펩타이드이며,
각각의 경우에 대해, R은 -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 또는 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R' 및 R''는 -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 및 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 각각 독립적으로 선택되며;
Rc는 -H 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형 또는 분지형 알킬이고;
n은 1 내지 24의 정수이며;
X'는 -H, 아민-보호기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 및 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 선택되고;
Y'는 -H, 옥소기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 선택적으로 치환되는 6- 내지 18-원 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 1 내지 6개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 선택되며;
R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO2R', -SO3 -H, -OSO3H, -SO2NR'R'', 사이아노, 아지도, -COR', -OCOR', 및 -OCONR'R''으로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R6는 -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, 또는 할로겐이며;
G는 -CH- 또는 -N-이고;
A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O-, 옥소(-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR5 및 -CRR'N(R5)-로부터 독립적으로 선택되며; 그리고
R5는 각각의 경우에 대해 독립적으로 -H 또는 선택적으로 치환되는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이다.
일 실시형태에서, 구조식 (I) 내지 (VI)의 화합물에 대해, G는 -CH-이다.
본 발명의 제2 목적은 본 발명의 신규한 벤조다이아제핀 화합물 또는 이의 유도체와 세포결합제의 컨쥬게이트를 제공하는 것이다. 이들 컨쥬게이트는 표적 세포에 특이적으로 전달되로 세포독성인 치료제로서 유용하다.
구체적으로, 본 발명의 컨쥬게이트는 세포독성 화합물 및 세포결합제(CBA)를 포함할 수 있되, 세포독성 화합물은 CBA에 공유결합되고, 상기 세포독성 화합물은 다음의 화학식 중 임의의 하나 또는 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
Figure pct00003
Figure pct00004
식 중:
L', L'' 및 L''' 중 하나는 다음의 화학식으로 나타내고:
-Z1-P-Z2-Rx-J' (A')
다른 둘은 동일 또는 상이하고, -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NR'COR'', -SR, -SOR'로 나타내는 설폭사이드, -SO2R'로 나타내는 설폰, 설폰산염 -SO3M, 황산염 -OSO3M, -SO2NR'R''로 나타내는 설폰아마이드, 사이아노, 아지도, -COR', -OCOR', 및 -OCONR'R''로부터 독립적으로 선택되며;
J'는 세포결합제에 공유 결합된 연결기를 포함하는 모이어티이고; 그리고
변수의 나머지는 화학식 (I) 내지 (VI)에 대해 상기 기재한 바와 같다.
일 실시형태에서, 구조식 (I') 내지 (VI')의 컨쥬게이트에 대해, G는 -CH-이다.
다른 실시형태에서, 구조식 (I') 내지 (VI')의 컨쥬게이트에 대해, 세포결합제는 항-엽산 수용체 항체 또는 이의 항체 단편이다. 더 구체적으로는, 항-엽산 수용체 항체는 huMOV19 항체이다.
또 다른 실시형태에서, 구조식 (I') 내지 (VI')의 컨쥬게이트에 대해, 세포결합제는 항-EGFR 항체 또는 이의 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 항-EGFR 항체는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 WO2012058592에 기재된 항체를 포함하는 비-길항제 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 비-작용성 항체, 예를 들어, 인간화된 ML66이다. 더 구체적으로는, 항-EGFR 항체는 huML66이다.
본 발명은 또한 신규한 벤조다이아제핀 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트, (및/또는 이의 용매화물, 수화물 및/또는 염) 및 담체(약제학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 포함한다. 본 발명은 추가적으로 신규한 벤조다이아제핀 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트(및/또는 이의 용매화물, 수화물 및/또는 염), 및 담체(약제학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하고, 추가로 제2 치료제를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 포함한다. 본 조성물은 포유류(예를 들어, 인간)에서 비정상적 세포 성장을 저해하거나 또는 증식성 장애를 치료하는 데 유용하다. 본 조성물은 포유류(예를 들어, 인간)에서 암, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 이식편대숙주병(GVHD), 이식거부반응, 낭창, 근육염, 감염, 면역결핍, 예컨대 AIDS 및 염증성 질환과 같은 병태를 치료하는 데 유용하다.
본 발명은 포유류에게 치료적 유효량의 신규한 벤조다이아제핀 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트(및/또는 이의 용매화물 및 염) 또는 이의 조성물을 단독으로 또는 제2 치료제와 병용하여 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유류(예를 들어, 인간)에서 비정상적 세포 성장을 저해하거나 또는 증식성 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 포유류 세포, 유기체 또는 관련된 병리학적 병태의 시험관내, 인시추 및 생체내 진단 또는 치료를 위해 신규한 벤조다이아제핀 화합물, 이의 유도체, 및 이의 컨쥬게이트를 합성하고 이용하는 방법을 포함한다.
본 발명의 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트, 및 이들을 포함하는 조성물은 장애, 예컨대 비정상적 세포성장(예를 들어, 암)을 특징으로 하는 장애의 중증도를 치료하거나 줄이는 데 유용하다. 본 발명의 화합물 및 컨쥬게이트에 대한 다른 적용은 포유류(예를 들어, 인간)에서 암, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 이식편대숙주병(GVHD), 이식거부반응, 낭창, 근육염, 감염, 면역결핍, 예컨대 AIDS 및 염증성 질환과 같은 병태를 치료하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
도 1은 T47D 세포 상의 비컨쥬게이팅 항체 huMOV19에 비교한 huMOV19-14 컨쥬게이트의 결합 친화도를 도시한 도면.
도 2는 huMOV19 -14 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성 및 특이성을 도시한 도면.
도 3은 huMOV19 -14 컨쥬게이트가 이웃하는 항원-음성 세포에 대해 약한 방관자(bystander) 세포독성 효과를 나타낸다는 것을 도시한 도면.
도 4a, 도 4b 및 도 4c는 다양한 세포주에 대한 huMy9 -6-14 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성을 도시한 도면.
도 5a 및 도 5b는 huMy9 -6-14 컨쥬게이트가 이웃하는 항원-음성 세포에 대해 방관자 세포 효과를 나타낸다는 것을 도시한 도면.
도 6은 NCI-H2110 보유 SCID 마우스에서 huMOV19 -80 및 huMOV19 -90 컨쥬게이트의 생체내 효능을 도시한 도면.
도 7a 내지 도 7d는 본 발명의 대표적인 컨쥬게이트의 질량분석법 프로파일을 도시한 도면.
도 8은 huML66 -90 컨쥬게이트의 질량분석법 프로파일을 도시한 도면.
도 9는 huML66 -90 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성 및 특이성을 도시한 도면.
도 10, 도 11 및 도 12는 huMOV19 -90 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성 및 특이성을 도시한 도면.
도 13은 huMOV19-90 컨쥬게이트가 이웃하는 항원-음성 세포에 대해 강한 방관자 세포독성 효과를 나타낸다는 것을 도시한 도면.
도 14는 NCI-H2110 보유 SCID 마우스에서 huMOV19 -90 컨쥬게이트의 생체내 효능을 도시한 도면.
도 15A 및 도 15B는 T47D 세포에 대한 비컨쥬게이팅 항체 huMOV19에 비교한 huMOV19-90 컨쥬게이트의 결합 친화도를 도시한 도면.
도 16은 본 발명의 대표적인 컨쥬게이트의 질량분석법 프로파일을 도시한 도면.
도 17는 NCI-H1703 NSCLC 보유 SCID 마우스에서 huML66 -90 컨쥬게이트의 생체내 효능을 도시한 도면.
도 18은 CD-1 마우스에서 huMOV19 -90의 약동학을 도시한 도면.
도 19A 및 도 19B는 huMOV19 -90 컨쥬게이트의 구조(도 19A), 및 시험관내 KB 자궁경부 암세포에서 형성된 huMOV19 -90 컨쥬게이트로부터의 분해대사물질의 인큐베이션, 정제, 및 단리를 위한 계획을 도시한 도면(도 19B). LC-MS에 의해 동정된 3종의 분해대사물질을 계산한 질량과 함께 나타낸다.
도 20은 T47D 세포에 대한 비컨쥬게이팅된 항체 huMOV19에 비교한 huMOV19 -107 컨쥬게이트의 결합 친화도를 도시한 도면.
도 21은 huMOV19 -90 및 huMOV19 -107 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성 및 특이성을 도시한 도면.
도 22는 보유 SCID 마우스 보유 NCI-H2110 NSCLC 이종이식편에서 huMOV19 -90 컨쥬게이트의 생체내 효능을 도시한 도면.
도 23은 SCID 마우스 보유 Hec-1b 자궁내막 이종이식편에서 huMOV19 -90 컨쥬게이트의 생체내 효능을 도시한 도면.
도 24는 SCID 마우스 보유 이시카와(Ishikawa) 자궁내막 이종이식편에서 huMOV19-90 컨쥬게이트의 생체내 효능을 도시한 도면.
도 25는 보유 SCID 마우스 보유 NCI-H2110 NSCLC 이종이식편에서 huMOV19 -107 컨쥬게이트의 생체내 효능을 도시한 도면.
도 26은 HNT-34 세포에 대한 비컨쥬게이팅 항체에 비교한 huCD123 - 6Gv4 . 7S3 -90 컨쥬게이트의 결합 친화도를 도시한 도면.
이제 본 발명의 특정 실시형태에 대해 상세하게 언급할 것이며, 이의 예는 수반하는 구조 및 식에 도시한다. 본 발명은 열거된 실시형태와 함께 기재할 것이지만, 그들은 본 발명의 해당 실시형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 대조적으로, 본 발명은 청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 동등물을 아우르는 것으로 의도된다. 당업자는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 다수의 방법 및 물질을 인식할 것이다.
본 명세서의 상이한 양상(예를 들어, 화합물, 화합물-링커 분자, 컨쥬게이트, 조성물, 이의 제조 및 사용방법) 하에 기재된 것을 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태 및 명세서의 상이한 부분(실시예에만 기재된 실시형태를 포함함)은 명확하게 부인되거나 또는 부적절하지 않다면, 본 발명의 하나 이상의 다른 실시형태와 조합될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 실시형태의 조합은 다수의 종속항을 통해 청구된 해당되는 구체적 조합으로 제한되지 않는다.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "세포결합제" 또는 "CBA"는 세포(예를 들어, 세포-표면 리간드 상에서) 결합하거나 또는 바람직하게는 특이적 방식으로 세포와 관련된 또는 세포에 가까운 리간드에 결합할 수 있는 화합물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 세포 또는 세포 근처의 리간드에 대한 결합은 특이적이다. CBA는 펩타이드 및 비펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "선형 또는 분지형 알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자의 포화된 선형 또는 분지형-쇄 1가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-뷰틸, 2-메틸-1-프로필, -CH2CH(CH3)2), 2-뷰틸, 2-메틸-2-프로필, 1-펜틸, 2-펜틸 3-펜틸, 2-메틸-2-뷰틸, 3-메틸-2-뷰틸, 3-메틸-1-뷰틸, 2-메틸-1-뷰틸, 1-헥실), 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-다이메틸-2-뷰틸, 3,3-다이메틸-2-뷰틸, 1-헵틸, 1-옥틸 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 알킬은 1 내지 10개의 탄소 원자를 가진다. 더 바람직하게는, 알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자를 가진다.
"선형 또는 분지형 알켄일 "은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소 이중 결합을 지니는 2 내지 20개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형-쇄 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하되, 알켄일 라디칼은 "시스" 및 "트랜스" 배향 또는 대안적으로 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다. 예는 에틸렌일 또는 비닐(-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 알켄일은 2 내지 10개의 탄소 원자를 가진다. 더 바람직하게는, 알킬은 2 내지 4개의 탄소 원자를 가진다.
"선형 또는 분지형 알킨일"은 적어도 하나의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, 삼중 결합을 지니는 2 내지 20개 탄소 원자의 선형 또는 분지형 1가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예는 에틴일, 프로핀일, 1-뷰틴일, 2-뷰틴일, 1-펜틴일, 2-펜틴일, 3-펜틴일, 헥신일 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 알킨일은 2 내지 10개의 탄소 원자를 가진다. 더 바람직하게는, 알킨일은 2 내지 4개의 탄소 원자를 가진다.
용어 "카보사이클", "카보사이클릴" 및 "탄소환식 고리"는 일환식 고리로서 3 내지 12개의 탄소 원자 또는 이환식 고리로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 1가 비방향족, 포화 또는 부분적 불포화 고리를 지칭한다. 7 내지 12개의 원자를 갖는 이환식 카보사이클은, 예를 들어, 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 배열될 수 있고, 9 또는 10개의 고리 원자를 갖는 이환식 카보사이클은 바이사이클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로서 또는 브릿지된 시스템, 예컨대 바이사이클로[2.2.1]헵탄, 바이사이클로[2.2.2]옥탄 및 바이사이클로[3.2.2]노난으로서 배열될 수 있다. 일환식 카보사이클의 예는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 1-사이클로펜트-1-엔일, 1-사이클로펜트-2-엔일, 1-사이클로펜트-3-엔일, 사이클로헥실, 1-사이클로헥스-1-엔일, 1-사이클로헥스-2-엔일, 1-사이클로헥스-3-엔일, 사이클로헥사다이엔일, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐, 사이클로데실, 사이클로운데실, 사이클로도데실 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "환식 알킬 " 및 " 사이클로알킬"은 상호호환적으로 사용될 수 있다. 그들은 1가 포화 탄소환식 고리 라디칼을 지칭한다. 바람직하게는, 환식 알킬은 3　내지 7원 일환식 고리 라디칼이다. 더 바람직하게는, 환식 알킬은 사이클로헥실이다.
용어 "환식 알켄일"은 고리 구조에서 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 탄소환식 고리 라디칼을 지칭한다.
용어 "환식 알킨일"은 고리 구조에서 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 탄소환식 고리 라디칼을 지칭한다.
"아릴"은 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 6 내지 18개의 탄소 원자의 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 일부 아릴기는 예시적 구조 "Ar"로서 나타낸다. 아릴은 포화, 부분적 불포화 고리, 또는 방향족 탄소환식 또는 복소환식 고리에 축합된 방향족 고리를 포함하는 이환식 라디칼을 포함한다. 전형적인 아릴기는 벤젠(페닐), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 인덴일, 인단일, 1,2-다이하이드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸 등으로부터 유도된 라디칼을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 아릴은 페닐기이다.
용어 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴" 및 "복소환식 고리"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 3 내지 18개의 고리 원자의 포화 또는 부분적으로 불포화된(즉, 고리 내에 하나 이상의 이중 및/또는 삼중 결합을 가짐) 탄소환식 라디칼을 지칭하며, 이때, 적어도 하나의 고리 원자는 질소, 산소, 인 및 황으로부터 선택된 헤테로원자이고, 남아있는 고리 원자는 C이며, 여기서, 하나 이상의 고리 원자는 선택적으로 이하에 기재한 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환된다. 헤테로사이클은 3 내지 7 고리 구성원을 갖는 1고리(2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자) 또는 7 내지 10개의 고리 구성원을 갖는 2고리(4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자), 예를 들어: 바이사이클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수 있다. 헤테로사이클은 문헌[Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968), 특히 1, 3, 4, 6, 7 및 9장; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950부터 현재까지), 특히 볼륨 13, 14, 16, 19 및 28; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다. "헤테로사이클릴 "은 또한 라디칼을 포함하며, 여기서 헤테로사이클 라디칼은 포화, 부분적 불포화 고리, 또는 방향족 탄소환식 또는 복소환식 고리와 함께 축합된다. 복소환식 고리의 예는 피롤리딘일, 테트라하이드로퓨란일, 다이하이드로퓨란일, 테트라하이드로티엔일, 테트라하이드로피란일, 다이하이드로피란일, 테트라하이드로티오피란일, 피페리디노, 몰폴리노, 티오몰폴리노, 티옥산일, 피페라진일, 호모피페라진일, 아제티딘일, 옥세탄일, 티에탄일, 호모피페리딘일, 옥세판일, 티에판일, 옥사제핀일, 다이아제핀일, 티아제핀일, 2-피롤린일, 3-피롤린일, 인돌린일, 2H-피란일, 4H-피란일, 다이옥산일, 1,3-다이옥솔란일, 피라졸린일, 다이티아닐, 다이티올란일, 다이하이드로피란일, 다이하이드로티엔일, 다이하이드로퓨란일, 피라졸리딘일이미다졸린일, 이미다졸리딘일, 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산일, 3-아자바이사이클로[4.1.0]헵탄일 및 아자바이사이클로[2.2.2]헥산일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 스피로 모이어티가 또한 이 정의의 범주에 포함된다. 고리 원자가 옥소(=O) 모이어티로 치환되는 복소환식기의 예는 피리미딘오일 및 1,1-다이옥소-티오몰폴린일이다.
용어 "헤테로아릴"은 5- 또는 6-원 고리의 1가 방향족 라디칼을 지칭하고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 18개 원자의 축합된 고리계(이 중 적어도 하나는 방향족임)를 포함한다. 헤테로아릴기의 예는 피리딘일(예를 들어, 2-하이드록시피리딘일을 포함), 이미다졸릴, 이미다조피리딘일, 피리미딘일(예를 들어, 4-하이드록시피리미딘일을 포함), 피라졸릴, 트라이아졸릴, 피라진일, 테트라졸릴, 퓨릴, 티엔일, 아이소옥사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 아이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀린일, 아이소퀴놀린일, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨란일, 신놀린일, 인다졸릴, 인돌리진일, 프탈라진일, 피리다진일, 트라이아진일, 아이소인돌릴, 프테리딘일, 퓨린일, 옥사다이아졸릴, 트라이아졸릴, 티아다이아졸릴, 퓨라잔일, 벤조퓨라잔일, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 퀴나졸린일, 퀸옥살린일, 나프티리딘일, 및 퓨로피리딘일이다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴기는 가능한 경우 부착된 탄소(탄소 연결) 또는 질소(질소 연결)일 수 있다. 예로서 그리고 제한 없이, 탄소 결합 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5 또는 6, 퓨란, 테트라하이드로퓨란, 티오퓨란, 티오펜, 피롤 또는 테트라하이드로피롤의 위치 2, 3, 4 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4 또는 5, 아이소옥사졸, 피라졸, 또는 아이소티아졸의 위치 3, 4 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 또는 아이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에서 결합된다.
예로서 그리고 제한 없이, 질소 결합 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 아이소인돌, 또는 아이소인돌린의 위치 2, 몰폴린의 위치 4, 및 카바졸, 또는 O-카볼린의 위치 9에서 결합된다.
헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴에 존재하는 헤테로원자는 NO, SO 및 SO2와 같은 산화된 형태를 포함한다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I를 지칭한다.
상기 기재된 알킬, 알켄일, 알킨일, 환식 알킬, 환식 알켄일, 환식 알킨일, 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴은 선택적으로 하나 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 이상)의 치환체로 치환될 수 있다.
치환체가 "치환되는" 것으로 기재된다면, 비수소 치환체는 치환체의 탄소, 산소, 황 또는 질소 상에서 수소 치환체 대신이다. 따라서, 예를 들어, 치환된 알킬 치환체는, 적어도 하나의 비수소 치환체가 알킬 치환체 상에서 수소 치환체의 자리에 있는 알킬 치환체이다. 설명을 위해, 모노플루오로알킬은 플루오로 치환체로 치환된 알킬이고, 다이플루오로알킬은 2개의 플루오로 치환체로 치환된 알킬이다. 치환체 상에 하나 초과의 치환이 있다면, (달리 언급되지 않는 한) 각각의 비수소 치환체는 동일 또는 상이할 수 있다는 것이 인식되어야 한다.
치환체가 "선택적으로 치환된"으로 기재된다면, 치환체는 (1) 치환되지 않거나 또는 (2) 치환될 수 있다. 치환체의 탄소가 치환체 목록 중 하나 이상으로 선택적으로 치환되는 것으로 기재된다면, 탄소 상의 수소 중 하나 이상(둘 이상이 있는 정도로)은 별도로 및/또는 함께 독립적으로 선택된 선택적 치환체로 치환될 수 있다. 치환체의 질소가 치환체 중 하나 이상으로 선택적으로 치환되는 것으로 기재된다면, 질소 상의 수소 중 하나 이상(둘 이상이 있는 정도로)은 각각 독립적으로 선택된 선택적 치환체로 치환될 수 있다. 하나의 예시적인 치환체는 -NR'R''로서 표현될 수 있되, R' 및 R''는 그들이 부착된 질소 원자와 함께 복소환식 고리를 형성할 수 있다. R' 및 R''로부터 형성된 복소환식 고리는 그들이 부착된 질소 원자와 함께 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다. 일 실시형태에서, 복소환식 고리는 3 내지 7개의 원자로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 복소환식 고리는 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 아이소옥사졸릴, 피리딜 및 티아졸릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서는 용어 "치환체" "라디칼" 및 "기"를 상호호환적으로 사용한다.
치환체의 기가 치환체 목록 중 하나 이상으로 선택적으로 치환되는 것으로 총괄적으로 기재된다면, 기는 (1) 비치환성 치환체, (2) 선택적 치환체에 의해 치환되지 않는 치환 가능한 치환체, 및/또는 (3) 선택적 치환체 중 하나 이상으로 치환된 치환 가능한 치환체를 포함할 수 있다.
치환체기 특정 수까지의 비-수소 치환체로 선택적으로 치환되는 것으로 기재된다면, 상기 치환체는 (1) 치환되지 않거나; 또는 (2) 특정 수까지의 비수소 치환체로 또는 치환체 상에서 최대 수까지의 치환 가능한 위치로, 어느 쪽이든 더 적은 쪽으로 치환될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 치환체가 3개까지의 비-수소 치환체로 선택적으로 치환되는 헤테로아릴로서 기재된다면, 3개 미만의 치환 가능한 위치를 지니는 임의의 헤테로아릴은 헤테로아릴이 치환 가능한 위치를 갖는 만큼 많은 비-수소 치환체까지로만 선택적으로 치환될 것이다. 이러한 치환체는, 비제한적 예에서, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR100, NR101R102, -NO2, -NR101COR102, -SR100, -SOR101로 나타내는 설폭사이드, -SO2R101로 나타내는 설폰, 설폰산염 -SO3M, a 황산염 -OSO3M, -SO2NR101R102로 나타내는 설폰아마이드, 사이아노, 아지도, -COR101, -OCOR101, -OCONR101R102 및 폴리에틸렌 글리콜 단위(-CH2CH2O)nR101로부터 선택될 수 있되, M은 H 또는 양이온(예컨대 Na+ 또는 K+)이고; R101, R102 및 R103은 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 (-CH2CH2O)n-R104로부터 선택되되, n은 1 내지 24의 정수, 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 아릴, 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 복소환식 고리 및 5 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 헤테로아릴이고; R104는 H 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이되, R100, R101, R102, R103 및 R104로 나타내는 기에서 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로사이클릴은 할로겐, -OH, -CN, -NO2 및 비치환 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 이상의) 치환체로 선택적으로 치환된다. 바람직하게는, 상기 기재한 선택적으로 치환되는 알킬, 알켄일, 알킨일, 환식 알킬, 환식 알켄일, 환식 알킨일, 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴에 대한 치환체는 할로겐, -CN, -NR102R103, -CF3, -OR101, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, -SR101, -SOR101, -SO2R101 및 -SO3M을 포함한다.
용어 "화합물" 또는 "세포독성 화합물", "세포독성 이량체 " 및 "세포독성 이 량체 화합물"은 상호 호환적으로 사용된다. 그들은 구조식 또는 화학식 EH는 이의 임의의 유도체가 본 발명에 개시된 화합물 또는 참고로 포함된 구조식 또는 화학식 또는 이의 임의의 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한 본 발명에 개시된 모든 화학식의 화합물의 입체이성질체, 기하학적 이성질체, 호변체, 용매화물, 대사산물, 염(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 염) 및 프로드러그, 및 프로드러그 염을 포함한다. 상기 용어는 또한 임의의 앞서 언급한 것의 임의의 용매화물, 수화물, 및 다형체를 포함한다. 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양상에서 "입체이성질체", "기하학적 이성질체", "호변체", "용매화물", "대사산물", "염", "프로드러그", "프로드러그 염", "컨쥬게이트", "컨쥬게이트 염", "용매화물", "수화물" 또는 "다형체"의 특정 인용은 용어 "화합물"이 이들 다른 형태의 인용 없이 사용되는 본 발명의 다른 양상에서 이들 형태의 의도된 생략으로서 해석되지 않을 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "컨쥬게이트"는 세포 결합제에 연결된 본 명세서에 기재된 화합물 또는 이의 유도체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "세포 결합제에 연결 가능한"은 세포 결합제에 이들 화합물 또는 이의 유도체를 결합하기에 적합한 적어도 하나의 연결기 또는 이의 전구체를 포함하는 본 명세서에 기재된 화합물 또는 이의 유도체를 지칭한다.
주어진 기의 "전구체"라는 용어는 임의의 탈보호, 화학적 변형 또는 결합 반응에 의해 해당 기를 야기할 수 있는 임의의 기를 지칭한다.
용어 "세포 결합제에 연결된"은 적합한 연결기 또는 이의 전구체를 통해 세포 결합제에 결합된 본 명세서에 기재된 화합물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 화학식 (I) 내지 (IV) 및 (VIII) 내지 (XI)의 화합물 및 약물-링커 화합물), 또는 이의 유도체 중 적어도 하나를 포함하는 컨쥬게이트 분자를 지칭한다.
용어 "키랄"은 거울상 이성질체 상대의 포개질 수 없는(non-superimposability) 특성을 갖는 분자를 지칭하는 반면, 용어 "비키랄(achiral)"은 그들의 거울상 이성질체 상대에 대해 포개질 수 있는 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성질체"는 동일한 화학적 구성 및 연결성을 갖지만 단일 결합에 관해 회전에 의해 상호 전환될 수 없는 공간에서의 그들의 원자의 상이한 배향을 지칭한다.
"부분입체이성질체"는 키랄성의 2 이상의 중심을 지니는 입체이성질체를 지칭하며, 이들 분자는 서로 거울 이성질체가 아니다. 부분입체이성질체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어 융점, 비등점, 스펙트럼 특성 및 반응성을 가진다. 부분입체이성질체의 혼합물은 고분해능 분석 절차, 예컨대 결정화, 전기영동 및 크로마토그래피 하에서 분리될 수 있다.
"거울상 이성질체"는 서로 거울상인 포개질 수 없는 화합물의 두 입체이성질체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 입체화학적 정의 및 관습은 일반적으로 문헌[S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 및 Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds," John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994]에 따른다. 본 발명의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 포함할 수 있고, 따라서, 상이한 입체이성질체 형태로 존재한다. 부분입체이성질체, 거울상 이성질체 및 아트롭 이성질체(atropisomer)뿐만 아니라 이들의 혼합물, 예컨대 라세미 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 발명의 화합물의 모든 입체이성질체 형태는 본 발명의 부분을 형성하는 것으로 의도된다. 다수의 유기 화합물이 광학적으로 활성인 형태로 존재하며, 즉, 그들은 평면 편광의 면을 회전시키는 능력을 가진다. 광학적으로 활성인 화합물을 설명함에 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 그의 키랄 중심(들)에 관해 분자의 절대 입체배치를 정하기 위해 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-)은 화합물에 의한 평면 편광의 회전 표시를 표기하기 위해 사용되며, (-) 또는 1은 화합물이 좌선성이라는 것을 의미한다. 접두사가 (+) 또는 d인 화합물은 우선성이다. 주어진 화학적 구조에 대해, 이들 입체이성질체는 그들이 서로 거울상이라는 것을 제외하고 동일하다. 특정 입체이성질체는 또한 거울상 이성질체로서 지칭될 수 있고, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상 이성질체의 혼합물로 불린다. 거울상 이성질체의 50:50 혼합물은 화학 반응 또는 공정에서 입체선택 또는 입체특이성이 없는 경우에 생길 수 있는 라세미 혼합물 또는 라세미체로서 지칭된다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는 두 거울상 이성질체 종의 등몰 혼합물을 지칭한다.
용어 "호변체" 또는 "호변체 형태"는 저에너지 장벽을 통해 호환될 수 있는 상이한 에너지의 구조적 이성질체를 지칭한다. 예를 들어, 양성자 호변체(또한 양성자성 호변체로서 알려짐)는 케토-엔오ㅗㄹ 및 이민-엔아민 이성질화와 같은 양성자의 이동을 통한 상호 전환을 포함한다. 원자가 호변체는 일부 결합 전자의 재편성에 의한 상호전환을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같은 용어 "프로드러그"는 더 활성인 모 형태로 효소적으로 또는 가수 분해적으로 활성화 또는 전환될 수 있는 본 발명의 화합물의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)] 참조. 본 발명의 프로드러그는 더 활성인 무 세포독성 약물로 전환될 수 있는 에스터-함유 프로드러그, 인산염-함유 프로드러그, 티오포스페이트-함유 프로드러그, 황산염-함유 프로드러그, 펩타이드-함유 프로드러그, D-아미노산-변형 프로드러그, 글리코실화된 프로드러그, β-락탐-함유 프로드러그, 선택적으로 치환되는 펜옥시아세트아마이드-함유 프로드러그, 선택적으로 치환되는 페닐아세트아마이드-함유 프로드러그, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로유리딘 프로드러그를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 프로드러그 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 본 발명의 화합물 및 상기 기재한 것과 같은 화학치료제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "프로드러그"는 또한 본 발명의 화합물을 제공하기 위한 생물학적 조건(시험관내 또는 생체내) 하에서 가수분해, 산화 또는 달리 반응될 수 있는 화합물의 유도체를 포함하는 것을 의미한다. 프로드러그는 생물학적 조건 하에서 이러한 반응 시에만 활성이 될 수 있거나 또는 그들은 그들의 비반응 형태에서 활성을 가질 수 있다. 본 발명에서 상정되는 프로드러그의 예는 생가수분해성 모이어티, 예컨대 생가수분해성 아마이드, 생가수분해성 에스터, 생가수분해성 카밤산염, 생가수분해성 탄산염, 생가수분해성 유레이드, 및 생가수분해성 인산염 유사체를 포함하는 본 명세서에 개시된 화학식 중 임의의 하나의 화합물의 유사체 또는 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 프로드러그의 다른 예는 -NO, -NO2, -ONO 또는 -ONO2 모이어티를 포함하는 본 명세서에 개시된 화학식 중 임의의 하나의 화합물의 유도체를 포함한다. 프로드러그는 전형적으로 문헌[Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5th ed)]에 의해 기재된 것과 같은 잘 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있고; 또한 문헌[Goodman and Gilman's, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8th ed., McGraw-Hill, Int.　Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs."]을 참조한다.
본 발명의 프로드러그의 하나의 바람직한 형태는 화합물/컨쥬게이트의 이민 결합과 이민 반응성 시약 사이에 형성된 부가물을 포함하는 본 발명의 화합물(임의의 링커기가 있거나 또는 없음) 및 컨쥬게이트를 포함한다. 본 발명의 프로드러그의 다른 바람직한 형태는 화학식 (I) 내지 (IV) 프로드러그와 같은 화합물을 포함하되, N과 C 사이의 이중선
Figure pct00005
이 단일 결합을 나타낼 때, X는 H 또는 아민 보호기이고, 화합물은 프로드러그가 된다. 본 발명의 프로드러그는 본 명세서에 기재된 프로드러그의 하나 또는 둘 다의 형태를 함유한다(예를 들어, 화합물/컨쥬게이트의 이민 결합과 이민 반응성 시약 사이에 형성된 부가물을 함유, 및/또는 X가 -H일 때, Y 이탈기를 함유).
용어 "이민 반응성 시약"은 이민기와 반응할 수 있는 시약을 지칭한다. 이민 반응성 시약의 예는 아황산염(H2SO3, H2SO2 또는 양이온과 함께 형성된 HSO3 -, SO3 2- 또는 HSO2 -의 염), 메타중아황산염(H2S2O5 또는 양이온과 함께 형성된 S2O5 2 -의 염), 모노, 다이, 트라이 및 테트라- 티오포스페이트(PO3SH3, PO2S2H3, POS3H3, PS4H3 또는 양이온과 함께 형성된 PO3S3 -, PO2S2 3 -, POS3 3 - 또는 PS4 3-의 염), 티오 포스페이트 에스터((RiO)2PS(ORi), RiSH, RiSOH, RiSO2H, RiSO3H), 다양한 아민(하이드록실 아민(예를 들어, NH2OH), 하이드라진(예를 들어, NH2NH2), NH2O-Ri, Ri'NH-Ri, NH2-Ri), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2 , 티오황산염(H2S2O3 또는 양이온과 함께 형성된 S2O3 2 -의 염), 아티온산염(H2S2O4 또는 양이온과 함께 형성된 S2O4 2 -의 염), 포스포로다이티오에이트(P(=S)(ORk)(SH)(OH) 또는 양이온과 함께 형성된 이들의 염), 하이드록삼산(RkC(=O)NHOH 또는 양이온과 함께 형성된 염), 하이드라자이드(RkCONHNH2), 폼알데하이드 설폭실레이트(HOCH2SO2H 또는 양이온과 함께 형성된 HOCH2SO2 -의 염, 예컨대 HOCH2SO2 -Na+), 당화 뉴클레오타이드(예컨대 GDP-만노스), 플루다라빈 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 여기서, Ri 및 Ri '는 각각 독립적으로 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이고, -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H, 및 -PO3H로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환되며; Ri 및 Ri '는 추가로 본 명세서에 기재된 알킬에 대한 치환체로 선택적으로 치환될 수 있고; Rj는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며; Rk는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴이다(바람직하게는, Rk는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이고; 더 바람직하게는, Rk는 메틸, 에틸 또는 프로필이다). 바람직하게는, 양이온은 1가 양이온, 예컨대 Na+ 또는 K+이다. 바람직하게는, 이민 반응성 시약은 아황산염, 하이드록실 아민, 유레아 및 하이드라진으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 이민 반응성 시약은 NaHSO3 또는 KHSO3이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 그리고 달리 표시되지 않는 한, 용어 "생 가수분해성 아마이드", "생가수분해성 에스터", "생가수분해성 카밤산염", "생가수 분해성 카밤산염", "생가수분해성 유레이드" 및 "생가수분해성 인산염 유사체"는 1) 화합물의 생물학적 활성을 파괴하지 않고, 해당 화합물에 대해 흡수, 작용의 지속기간 또는 작용의 개시와 같은 생체내에서 유리한 특성을 부여하거나; 또는 2) 그 자체가 생물학적으로 비활성이지만, 생체내에서 생물학적으로 활성인 화합물로 전환되는, 아마이드, 에스터, 카밤산염, 탄산염, 유레이드 또는 인산염 유사체를 각각 의미한다. 생가수분해성 아마이드의 예는 저급 알킬 아마이드, α-아미노산 아마이드, 알콕시아실 아마이드, 및 알킬아미노알킬카본일 아마이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 생가수분해성 에스터의 예는 저급 알킬 에스터, 알콕시아실옥시 에스터, 알킬 아실아미노 알킬 에스터, 및 콜린 에스터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 생가수분해성 카밤산염의 예는 저급 알킬아민, 치환된 에틸렌다이아민, 아미노산, 하이드록시알킬아민, 복소환식 및 헤테로방향족 아민 및 폴리에터 아민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히 바람직한 프로드러그 및 프로드러그 염은 이러한 화합물이 포유류에게 투여될 때 본 발명의 화합물의 생체이용성을 증가시키는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 어구 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기염을 지칭한다. 예시적인 염은 황산염, 시트르산염, 아세트산염, 옥살산염, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 질산염, 중황산염, 인산염, 산 인산염, 아이소니코틴산염, 락트산염, 살리실산염, 산 시트르산염, 타르타르산염, 올레산염, 탄산염, 판토텐산염, 산성주석산염, 아스코르브산염, 숙신산염, 말레산염, 겐티스산염, 푸마르산염, 글루콘산염, 글루쿠론산염, 당산염, 폼산염, 벤조산염, 글루탐산염, 메탄설폰산염, "메실산염", 에탄설폰산염, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염, 파모산(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염, 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨) 염, 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘) 염, 및 암모늄 염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 아세트산염 이온, 숙신산염 이온 또는 기타 반대 이온과 같은 다른 분자의 포함을 수반할 수 있다. 반대 이온은 모 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 더 나아가, 약제학적으로 허용 가능한 염은 그의 구조에서 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다중 하전된 원자가 약제학적으로 허용 가능한 염의 부분인 예는 다중 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물이 염기라면, 목적으로 하는 약제학적으로 허용 가능한 염은 당업계에서 이용 가능한 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 메탄설폰산, 인산 등과 같은 무기산으로, 또는 아세트산, 말레산, 숙신산, 만델산, 퓨마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 피라노시딜산, 예컨대 글루쿠론산 또는 갈락투론산, 알파 하이드록시산, 예컨대 시트르산 또는 타르타르산, 아미노산, 예컨대 아스팔트산 또는 글루탐산, 방향족산, 예컨대 벤조산 또는 신남산, 설폰산, 예컨대 p-톨루엔설폰산 또는 에탄설폰산 등과 같은 유기산으로 유리 염기의 처리에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물이 산이라면, 목적으로 하는 약제학적으로 허용 가능한 염은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 무기 또는 유기 염기, 예컨대 아민(1차, 2차 또는 3차), 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 등으로 유리산의 처리에 의해 제조될 수 있다. 적합한 염의 예시적인 예는 아미노산, 예컨대 글리신 및 아르기닌, 암모니아, 1차, 2차 및 3차 아민, 및 환식 아민, 예컨대 피페리딘, 몰폴린 및 피페라진으로부터 유래된 유기염, 및 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유래된 무기염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "용매화물"은 비공유 분자간 힘에 의해 결합되는 물, 아이소프로판올, 아세톤, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 및 에탄올아민 다이클로로메탄, 2-프로판올 등과 같은 용매의 화학량론적 또는 비화학량론적 양을 추가로 포함하는 화합물을 의미한다. 화합물의 용매화물 또는 수화물은 이민 모이어티의 용매화 또는 수화를 초래하기 위해화합물에 대해 적어도 1몰 당량의 하이드록실 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 또는 물의 첨가에 의해 용이하게 제조된다.
용어 "비정상적 세포 성장" 및 "증식성 장애"는 본 출원에서 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "비정상적 세포 성장"은, 달리 표시되지 않는 한, 정상 조절 메커니즘(예를 들어, 접촉 저해의 상실)과 독립적인 세포 성장을 지칭한다. 이는, 예를 들어, (1) 돌연변이된 타이로신 키나제의 발현 또는 수용체 타이로신 키나제의 과발현에 의해 증식하는 종양 세포(종양); (2) 비정상적 타이로신 키나제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포; (3) 수용체 타이로신 키나제에 의해 증식하는 임의의 종양; (4) 비정상적 세린/트레오닌 키나제 활성화에 의해 증식하는 임의의 종양; 및 (5) 비정상적 세린/트레오닌 키나제 활성화가 일어나는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포의 비정상적 성장을 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류의 생리학적 병태를 지칭하거나 또는 기재한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포 및/또는 양성 또는 전암성 세포를 포함한다.
"치료제"는 생물학적 제제(예컨대 항체, 펩타이드, 단백질, 효소) 또는 화학치료제를 둘 다 포함한다.
"화학치료제"는 암 치료에서 유용한 화학적 화합물이다.
"대사물질"은 구체화된 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트 또는 이의 염의 신체에서의 대사를 통해 생성된 산물이다. 화합물, 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트의 대사물질은 당업계에 공지된 일상적인 기법을 이용하여 동정될 수 있고, 그들의 활성은 본 명세서에 기재된 것과 같은 시험을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 산물은 투여된 화합물의 예를 들어 산화, 하이드록실화, 환원, 가수분해, 아마이드화, 탈아마이드화, 에스터화, 탈에스터화, 효소적 절단 등으로부터 초래될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 본 발명의 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트를 이들의 대사산물을 수득하기에 충분한 시간 기간 동안 포유류와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된, 화합물, 이의 유도체 또는 이의 컨쥬게이트를 포함하는 본 발명의 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트의 대사산물을 포함한다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 물질 또는 조성물은 제형을 포함하는 다른 성분과 화학적으로 및/또는 독물학상으로 양립 가능하여야 하고/하거나 포유류가 이에 의해 치료된다는 것을 나타낸다.
용어 "보호기" 또는 "보호 모이어티"는 특정 작용기를 차단 또는 보호하기 위해 통상적으로 사용되는 한편, 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트 상에서 다른 작용기와 반응하는 치환체를 지칭한다. 예를 들어, "아민 -보호기" 또는 "아미노-보호 모이어티"는 화합물에서 아미노 작용기를 차단하거나 또는 보호하는 아미노기에 부착된 치환체이다. 이러한 기는 당업계에 잘 공지되어 있고(예를 들어, 문헌[P. Wuts and T.　Greene, 2007, Protective Groups, Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ]) 카밤산염, 예컨대 메틸 및 에틸 카밤산염, FMOC, 치환된 에틸 카밤산염, 1,6-β-제거에 의해 절단된 카밤산염(또한 "자기 희 생(self im㏖ative)"으로 지칭됨), 유레아, 아마이드, 펩타이드, 알킬 및 아릴 유도체에 의해 예시된다. 적합한 아미노-보호기는 아세틸, 트라이플루오로아세틸, t-뷰톡시카본일 (BOC), 벤질옥시카본일(CBZ) 및 9-플루오렌일메틸렌옥시카본일(Fmoc)을 포함한다. 보호기 및 그들의 용도의 일반적 설명을 위해, 문헌[P. G.M. Wuts & T. W. Greene, Protective Groups, Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2007] 참조.
용어 "이탈기"는 치환 또는 대체 동안 떠나는 하전 또는 비하전 모이어티의 기를 지칭한다. 이러한 이탈기는 당업계에 잘 공지되어 있고, 할로겐, 에스터, 알콕시, 하이드록실, 토실레이트, 트라이플레이트, 메실레이트, 나이트릴, 아자이드, 카바메이트, 이황화물, 티오에스터, 티오에터 및 다이아조늄 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "2작용성 가교제", "2작용성 링커" 또는 "가교제"는 두 반응기를 갖는 변형제를 지칭하는데; 이 중 하나는 세포 결합제와 반응할 수 있는 반면, 다른 하나는 두 모이어티를 함께 연결하는 세포독성 화합물과 반응한다. 이러한 2작용성 가교제는 당업게에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Isalm and Dent, Bioconjugation chapter 5, p218-363, Groves Dictionaries Inc. New York, 1999] 참조). 예를 들어, 티오에터 결합을 통해 연결될 수 있는 2작용성 가교제는 말레이미도기를 도입하는 N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 또는 요오도아세틸기를 도입하는 N-숙신이미딜-4-(요오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB)를 포함한다. 세포 결합제에 말레이미도기 또는 할로아세틸기를 도입하는 다른 2작용성 가교제는 당업계에 잘 공지되어 있고(미국 특허 출원 제2008/0050310호, 제20050169933호, 미국 일리노이주 61105 록랜드 피.오. 박스 117에 소재한 피어스 바이오테크놀로지 인코포에이티드(Pierce Biotechnology Inc.)로부터 입수가능), 비스-말레이미도폴리에틸렌글리콜(BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, N-(β-말레이미도프로필옥시)숙신이미드 에스터(BMPS), γ-말레이미도뷰티르산 N-숙신이미딜 에스터(GMBS), ε-말레이미도카프론산 N-하이드록시숙신이미드 에스터(EMCS), 5-말레이미도발레르산 NHS, HBVS, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도카프로에이트)(이는 SMCC의 "장쇄" 유사체(LC-SMCC)임), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터(MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)-뷰티르산 하이드라자이드 또는 HCl 염(MPBH), N-숙신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBAP), N-숙신이미딜 요오도아세테이트(SIA), κ-말레이미도운데칸산 N-숙신이미딜 에스터(KMUA), N-숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-뷰티레이트(SMPB), 숙신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), 숙신이미딜-(4-비닐설폰일)벤조에이트(SVSB), 다이티오비스-말레이미도에탄(DTME), 1,4-비스-말레이미도부탄(BMB), 1,4　비스말레이미딜-2,3-다이하이드록시부탄(BMDB), 비스-말레이미도헥산(BMH), 비스-말레이미도에탄(BMOE), 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC), 설포숙신이미딜(4-요오도-아세틸)아미노벤조에이트(설포-SIAB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙신이미드 에스터(설포-MBS), N-(γ-말레이미도뷰트릴옥시)설포숙신이미드 에스터(설포-GMBS), N-(ε-말레이미도카프로일옥시)설포숙시미도 에스터(설포-EMCS), N-(κ-말레이미도운데카노일옥시)설포숙신이미드 에스터(설포-KMUS), 및 설포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)뷰티레이트(설포-SMPB)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
헤테로2작용성 가교제는 두 상이한 반응기를 갖는 2작용성 가교제이다. 아민-반응성 N-하이드록시숙신이미드기(NHS 기)와 카본일-반응성 하이드라진기를 둘 다 포함하는 헤테로2작용성 가교제는 또한 본 명세서에 기재된 세포독성 화합물을 세포결합제(예를 들어, 항체)에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 상업적으로 입수 가능한 헤테로2작용성 가교제의 예는 숙신이미딜 6-하이드라지노니코닌아마이드 아세톤 하이드라존(SANH), 숙신이미딜 4-하이드라지도테레프탈레이트 하이드로클로라이드(SHTH) 및 숙신이미딜 하이드라지늄 니코티네이트 하이드로클로라이드(SHNH)를 포함한다. 산-불안정 결합을 보유하는 컨쥬게이트는 또한 본 발명의 하이드라진-함유 벤조다이아제핀 유도체를 이용하여 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 2작용성 가교제의 예는 숙신이미딜-p-폼일 벤조에이트(SFB) 및 숙신이미딜-p-폼일펜옥시아세테이트(SFPA)를 포함한다.
이황화물 결합을 통해 세포독성 화합물과 세포 결합제의 결합을 가능하게 하는 2작용성 가교제는 당업계에 공지되어 있고, 다이티오피리딜기를 도입하기 위해 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)2-설포 부타노에이트(설포-SPDB)를 포함한다. 이황화물기를 도입하기 위해 사용될 수 있는 다른 2작용성 가교제는 당업계에 공지되어 있으며, 미국 특허 제6,913,748호, 제6,716,821호 및 미국 특허 공개 제20090274713호 및 제20100129314호에 개시되어 있고, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다. 대안적으로, 티올기를 도입하는 가교제, 예컨대 2-이미노티올란, 호모시스테인 티오락톤 또는 S-아세틸숙신 무수물이 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에 정의되는 바와 같은 "링커", "링커 모이어티" 또는 "연결기"는 세포 결합제 및 세포독성 화합물과 같은 2개의 기를 함께 연결하는 모이어티를 지칭한다. 전형적으로, 링커는 그것을 연겨하는 2개의 기가 연결되는 조건 하에서 실질적으로 비활성이다. 하나의 반응기가 링커 모이어티를 보유하는 화합물을 제공하도록 세포독성 화합물과 처음 반응될 수 있고, 제2 반응기가, 이어서 세포 결합제와 반응할 수 있도록, 2작용성 가교제는 2개의 반응기(링커 모이어티의 각각의 말단에서 하나씩)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 2작용성 가교제의 하나의 말단은 링커 모이어티를 보유하는 세포 결합제를 제공하도록 세포 결합제와 처음 반응될 수 있고, 제2 반응기는, 이이서 세포독성 화합물과 반응될 수 있다. 연결 모이어티는 특정 부위에서 세포독성 모이어티의 방출을 허용하는 화학적 결합을 함유할 수 있다. 적합한 화학적 결합은 당업계에 잘 공지되어 있고, 이황화물 결합, 티오에터 결합, 산 불안정 결합, 광 불안정 결합, 펩티다제 불안정 결합 및 에스터라제 불안정 결합을 포함한다(예를 들어 미국 특허 제5,208,020호; 제5,475,092호; 제6,441,163호; 제6,716,821호; 제6,913,748호; 제7,276,497호; 제7,276,499호; 제7,368,565호; 제7,388,026호 및 제7,414,073호). 이황화물 결합, 티오에터 및 펩티다제 불안정 결합이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 비절단성 링커, 예컨대 미국 특허 공개 제20050169933호에서 상세하게 기재되는 것, 또는 하전된 링커 또는 친수성 링커를 포함하고, 이들은 미국 특허 공개 제2009/0274713호, 미국 특허 공개 제2010/01293140호 및 WO 2009/134976에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 명확하게 참고로 포함된다.
일 실시형태에서, 하나의 말단에서 부착되는 반응기를 지니는 연결기, 예컨대 반응성 에스터는 다음으로부터 선택된다:
-O(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-O(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-O(CR20R21)m(알킨일)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-O(CR20R21)m(피페라지노)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-O(CR20R21)m(피롤로)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-O(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-S(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-S(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-S(CR20R21)m(알킨일)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-S(CR20R21)m(피페라지노)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-S(CR20R21)m(피롤로)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-S(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(알킨일)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q-(CO)tX'',
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(피페라지노)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q
(CO)tX'',
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(피롤로)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q -(CO)tX'',
-NR33(C=O)p"(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)m(알킨일)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)m(피페라지노)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(알킨일)n'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q -(CO)tX'',
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"A"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y''(CR24R25)q(CO)tX'',
식 중:
m, n, p, q, m', n', t'는 1 내지 10의 정수이거나, 또는 선택적으로 0이고;
t, m", n" 및 p"는 0 또는 1이며;
X"는 OR36, SR37, NR38R39로부터 선택되되, R36, R37, R38, R39는 H, 또는 1 또는 20개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 또는 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(OCH2CH2)n이고, R37은 선택적으로, 티올 보호기이며, t = 1일 때, COX''는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시프탈이미드 에스터, N-하이드록시 설포-숙신이미드 에스터, 파라-나이트로페닐 에스터, 다이나이트로페닐 에스터, 펜타플루오로페닐 에스터 및 그들의 유도체로부터 선택된 반응성 에스터를 형성하며, 상기 유도체는 아마이드 결합 형성을 용이하게 하고;
Y''는 없거나 또는 O, S, S-S 또는 NR32로부터 선택되되, R32는 R에 대해 상기 주어진 바와 동일한 정의를 갖거나; 또는
Y"이 S-S가 아니고 t = 0일 때, X"은 말레이미도기, 할로아세틸기 또는 SR37로부터 선택되되, R37은 상기와 동일한 정의를 가지고;
A"은 아미노산 잔기 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드이며;
R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26 및 R27은 동일 또는 상이하고, -H 또는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며;
R29 및 R30은 동일 또는 상이하고, -H 또는 1 내지 5개의 탄소 원자로부터의 알킬이며;
R33은 -H 또는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 R-(OCH2CH2)n-이거나, 또는 R33은 -COR34, -CSR34 , -SOR34 또는 -SO2R34이되, R34는 H 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일 또는, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(OCH2CH2)n이며; 그리고
R40 및 R41 중 하나는 선택적으로 음으로 또는 양으로 하전된 작용기이고, 다른 하나는 H 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 알켄일, 알킨일이다.
임의의 상기 연결기는 본 명세서에 기재된 임의의 화학식의 연결기를 대신하는 것을 포함하는, 본 발명의 임의의 화합물, 약물-링커 화합물 또는 컨쥬게이트로 존재할 수 있다.
용어 "아미노산"은 천연 유래 아미노산 또는 비천연 유래 아미노산을 지칭한다. 일 실시형태에서, 아미노산은 NH2-C(Raa'Raa)-C(=O)OH로 표시하되, Raa 및 Raa '는 각각 독립적으로 H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이거나, 또는 Raa 및 N-말단의 질소 원자는 함께 복소환식 고리(예를 들어, 프롤린에서와 같이)를 형성할 수 있다. 용어 "아미노산 잔기"는 하나의 수소 원자가 아미노산, 예컨대 -NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O-의 아민 및/또는 카복시 말단에서 제거될 때의 대응하는 잔기를 지칭한다.
용어 "양이온"은 양전하를 지니는 이온을 지칭한다. 양이온은 1가(예를 들어, Na+, K+ 등), 2가(예를 들어, Ca2 +, Mg2 + 등) 또는 다가(예를 들어, Al3+ 등)일 수 있다. 바람직하게는, 양이온은 1가이다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 목적으로 하는 생물학적 반응을 유발하는 활성 화합물 또는 컨쥬게이트의 해당 양을 의미한다. 이러한 반응은 치료 중인 질환 또는 장애 증상의 완화, 질환 증상의 또는 질환 그 자체의 재발의 예방, 저해 또는 지연, 질환 증상의 또는 질환 그 자체의 진행의 치료, 또는 예방, 저해 또는 지연이 없을 때에 비해 대상체의 수명의 증가를 포함한다. 유효량의 결정은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 당업자의 능력 내에서 용이하다. 화합물 I의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양에서 그리고 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 대상체에게 투여될 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트 또는 다른 치료제의 유효량은 다발성 골수종의 병기, 범주 및 상태 및 대상체의 특징, 예컨대 일반적 건강상태, 연령, 성별, 체중 및 약물 내약성에 의존할 것이다. 투여될 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트 또는 다른 치료제의 유효량은 또한 투여 경로 및 제형에 의존할 것이다. 투약량 및 간격은 목적으로 하는 치료적 효과를 유지하기에 충분한 활성 화합물의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조절될 수 있다.
세포독성 화합물
제1 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 세포독성 화합물(예를 들어, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 또는 (VI)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염)에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 세포독성 화합물은 구조식 (I) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 나타낸다.
특정 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, L', L" 및 L'" 중 하나는 화학식 (A)로 나타내고, 나머지는 각각 독립적으로 -H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 할로겐, -OH, (C1-C6)알콕시 또는 -NO2이다. 구체적으로, L', L" 및 L'" 중 하나는 화학식 (A)으로 나타내고, 나머지는 -H이다.
제1 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, L'는 화학식 (A)로 나타내며, L"와 L"'는 둘 다 -H이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제2 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, Rx는 할로겐, -OH, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시, 할로(C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q로 선택적으로 치환되는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬이며; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, Q는 i) -SO3H, -Z'-SO3H, -OPO3H2, -Z'-OPO3H2, -PO3H2, -Z'-PO3H2, -CO2H, -Z'-CO2H, -NR11R12 또는 -Z'-NR11R12, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는, ii) -N+R14R15R16X- 또는 -Z'-N+R14R15R16X-이며; Z'는 선택적으로 치환되는 알킬렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌 또는 선택적으로 치환되는 페닐렌이고; R14 내지 R16은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬이며; X-는 약제학적으로 허용 가능한 음이온이고; 남아있는 변수는 제2 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, Q는 -SO3H 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
제3 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, J는 NHRc1, -COOH, 및 -COE로 이루어진 군으로부터 선택된 반응기를 포함하는 모이어티이되, -COE는 반응성 에스터를 나타내고, Rc1은 -H 또는 할로겐, -OH 또는 (C1-C3)알콕시로 선택적으로 치환되는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1 또는 제2 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, J는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터, 나이트로페닐(예를 들어, 2 또는 4-나이트로페닐) 에스터, 다이나이트로페닐(예를 들어, 2,4-다이나이트로페닐) 에스터, 설포-테트라플루오로페닐(예를 들어, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 에스터, 및 펜타플루오로페닐 에스터로부터 선택된 COE이며; 남아있는 변수는 제3 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, COE는 N-하이드록시숙신이미드 에스터이다.
제4 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, L'는 다음의 화학식으로 나타낸다:
-NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-J (B1);
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J (B2);
-C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-J (C1); 또는
-C(=O)-P-NR5-Cy-(CRaRb)m'-J (C2),
식 중:
J는 -COE이고;
Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
m은 1 내지 6의 정수이고;
m'는 0 또는 1 내지 6의 정수이며;
Cy는 할로겐, -OH, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시, 또는 할로(C1-C3)알킬로 선택적으로 치환되는 선택적으로 치환되는 5 또는 6 고리 탄소 원자를 갖는 환식 알킬이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2 또는 제3 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, Ra와 Rb는 둘 다 H이고; 화학식 (B2) 및 (C2)에 대한 Cy는 사이클로헥산이며; R5는 H 또는 Me이고; 남아있는 변수는 제4 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, 화학식 (B2) 및 (C2)에서 m'는 0 또는 1이다.
제5 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, L'는 다음의 화학식으로 나타낸다:
-NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-S-Zs (B3); 또는
-C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-S-Zs (C3),
식 중:
Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
m은 1 내지 6의 정수이고;
Zs는 -H, -SRd, -C(=O)Rd1이거나 또는 다음의 화학식 중 임의의 하나로부터 선택된다:
Figure pct00006
Figure pct00007
식 중:
q는 1 내지 5의 정수이고;
n'는 2 내지 6의 정수이며;
M은 양이온(예를 들어, H+, Na+ 또는 K+)이고;
Rd는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이거나 또는 페닐, 나이트로페닐(예를 들어, 2 또는 4-나이트로페닐), 다이나이트로페닐(예를 들어, 2,4-다이나이트로페닐), 카복시나이트로페닐(예를 들어, 3-카복시-4-나이트로페닐), 피리딜 또는 나이트로피리딜(예를 들어, 4-나이트로피리딜)로부터 선택되며;
Rd1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이고;
남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3 또는 제4 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
일 실시형태에서, Zs는 -H이다. 다른 실시형태에서, Zs는 -SMe 또는 -SPy(Py는 피리딜임)이다.
또 다른 실시형태에서, Zs는 다음의 화학식 중 임의의 하나로부터 선택된다:
Figure pct00008
Figure pct00009
식 중, U는 -H 또는 -SO3M이며; 남아있는 변수는 화학식 (a1') 내지 (a15')에 대해 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q는 i) -SO3H, -Z'-SO3H, -OPO3H2, -Z'-OPO3H2, -PO3H2, -Z'-PO3H2, -CO2H, -Z'-CO2H, -NR11R12, 또는 -Z'-NR11R12, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는, ii) -N+R14R15R16X- 또는 -Z'-N+R14R15R16X-이며; Z'는 선택적으로 치환되는 알킬렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌 또는 선택적으로 치환되는 페닐렌이고; R14 내지 R16은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬이며; X-은 약제학적으로 허용 가능한 음이온이고; 남아있는 변수는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, Q는 -SO3H 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
특정 실시형태에서, Ra와 Rb는 둘 다 -H이고, R5는 H 또는 Me이며; 남아있는 변수는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, -(CRaRb)m-은 -(CH2)m"-C(Me2)-이고, m"은 1 내지 5의 정수이며; 남아있는 변수는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제6 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, P는 2 내지 10개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고; 남아있는 변수는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-나이트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu 및 Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met 및 Met-Ala로부터 선택되고; 남아있는 변수는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala 및 D-Ala-D-Ala이고; 남아있는 변수는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제7 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, N과 C 사이의 이중선
Figure pct00010
은 이중 결합을 나타내고; 남아있는 변수는 제1 실시형태, 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제8 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, N과 C 사이의 이중선
Figure pct00011
은 단일 결합을 나타내고, X는 -H 또는 아민 보호기이며; Y는 -H, -OR, -OCOR', -SR, -NR'R", 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 질소-함유 헤테로사이클, -SO3H, -SO2H 및 -OSO3H로부터 선택되고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 구체적 실시형태에 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, Y는 -H, -SO3M, -OH, -OMe, -OEt 또는 -NHOH로부터 선택되되, M은 -H, Na+ 또는 K+이고; 남아있는 변수는 제8 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, Y는 -H, -SO3M 또는 -OH이다.
제9 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, X'는 -H, -OH, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 또는 제8 구체적 실시형태에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, X'는 -H, -OH, (C1-C3)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 페닐이고; 남아있는 변수는 제9 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, X'는 -H, -OH 또는 -Me이다. 훨씬 더 구체적으로는, X'는 -H이다.
제10 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, Y'는 -H, 옥소기, (C1-C3)알킬 또는 할로(C1-C3)알킬이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 제9 구체적 실시형태에 기재된 바와 같다. 더 구체적으로는, Y'는 -H 또는 옥소이다. 훨씬 더 구체적으로는, Y'는 -H이다.
제11 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O-, -S-, -NR5- 및 옥소 -(C=O)-로부터 선택되며; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 구체적 실시형태에 기재된 바와 같다. 더 구체적으로는, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O- 및 -S-로부터 선택된다. 훨씬 더 구체적으로는, A 및 A'는 -O-이다.
제12 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, R6은 -OMe이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 제11 구체적 실시형태에서 기재한 바와 같다.
제13 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 독립적으로 -H, 할로겐, -NO2, -OH, (C1-C3-)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 (C1-C3)알콕시이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 또는 제12 구체적 실시형태에 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H이다.
제14 구체적 실시형태에 대해, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, R, R', R" 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 또는 제13 구체적 실시형태에서 기재된 바와 같다.
제15 구체적 실시형태에서, 구조식 (I), (II), (III), (IV), (V) 및 (VI)에 대해, N과 C 사이의 이중선
Figure pct00012
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단, 그것이 이중 결합일 때, X는 없고 Y는 -H이며, 그것이 단일 결합일 때, X는 -H이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이며;
R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H이고;
R6은 -OMe이며;
X'과 Y'는 둘 다 -H이고;
A 및 A'는 -O-이며;
M은 H, Na+ 또는 K+이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 구체적 실시형태에 기재된 바와 같다.
제16 구체적 실시형태에서, 본 발명의 세포독성 화합물은 다음의 화학식 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된다:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
,
식 중:
R100은 -OH, -OMe 또는
Figure pct00030
이고;
Y는 -H, -OH 또는 -SO3M이며; 그리고
M은 약제학적으로 허용 가능한 양이온(예를 들어, H+, Na+ 또는 K+)이고;
Zs는 -H, -SRd, -C(=O)Rd1이거나 또는 상기 기재한 화학식 (a1') 내지 (a15')로부터 선택된다.
구체적 실시형태에서, Zs는 상기 기재한 화학식 (a1) 내지 (a15)로부터 선택된다.
더 구체적 실시형태에서, Zs는 화학식 (a7), (a8), (a9) 및 (a15)로부터 선택된다. 훨씬 더 구체적인 실시형태에서, Zs는 화학식 (a9)로 나타낸다. 대안적으로, Zs는 화학식 (a7)로 나타낸다.
다른 구체적 실시형태에서, Zs는 -H이다.
다른 구체적 실시형태에서, Y는 -SO3M이다. 대안적으로, Y는 -OH이다.
또한 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 세포독성 화합물 또는 세포결합제-세포독성제 컨쥬게이트의 대사산물을 포함한다.
세포독성 화합물의 합성
본 발명의 세포독성 화합물은 미국 특허 제8,765,740호 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0238731호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 세포독성 이량체 화합물을 제조하기 위한 대표적인 방법은 실시예 1 내지 10에 나타낸다.
세포 결합제
치료제로서 본 발명의 컨쥬게이트의 유효성은 적절한 세포결합제의 주의 깊은 선택에 의존한다. 세포 결합제는 펩타이드 및 비-펩타이드를 포함하는 현재 공지된 임의의 종류, 또는 공지될 것일 수 있다. 일반적으로, 이들은 항체(예컨대, 다클론성 항체 및 단클론성 항체, 특히 단클론성 항체), 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 비타민(예컨대 엽산염 등, 이의 세포 표면 수용체, 예를 들어, 엽산 수용체에 결합할 수 있음), 영양소-수송 분자(예컨대 트랜스페린), 또는 임의의 다른 세포-결합 분자 또는 물질일 수 있다.
적절한 세포결합제의 선택은 표적화될 특정 세포 집단에 부분적으로 의존하는 선택물질이지만, 다수의(모두는 아니지만) 경우에, 인간 단클론성 항체는 적절한 하나가 이용 가능하다면, 양호한 선택이다. 예를 들어, 단클론성 항체 MY9는 CD33 항원에 특이적으로 결합하는 뮤린 IgG1 항체이고(J.D. Griffin et al., 백혈병 Res., 8:521 (1984)), 표적 세포가 급성 골수성 백혈병(AML)의 질환에서와 같이 CD33을 발현시킨다면, 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 단백질이 아니다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 세포 결합제는 비타민 수용체, 예컨대 세포-표면 수용체에 결합하는 비타민일 수 있다. 이와 관련하여, 비타민 A는 레티놀-결합 단백질(RBP)에 결합하여 복합체를 형성하는데, 이는 결국 고친화도로 STRA6 수용체에 결합하고, 비타민 A 섭취를 증가시킨다. 다른 예에서, 엽산/엽산염/비타민 B9는 세포-표면 엽산 수용체(FR), 예를 들어, FRα에 고친화도로 결합한다. FRα에 결합하는 엽산 또는 항체는 난소 및 다른 종양에 대해 발현되는 엽산 수용체를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 비타민 D 및 그의 유사체는 비타민 D 수용체에 결합한다.
다른 실시형태에서, 세포결합제는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 화합물(항체, 비항체 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함)이다. 바람직하게는, 단백질 또는 폴리펩타이드는 측쇄 -NH2 기를 지니는 하나 이상의 Lys 잔기를 포함한다. Lys 측쇄 -NH2 기는 2작용성 가교제에 공유결합할 수 있는데, 이는 결국 본 발명의 이량체 화합물에 연결되고, 따라서 본 발명의 이량체 화합물에 세포 결합제를 컨쥬게이팅한다. 각각의 단백질계 세포 결합제는 2작용성 가교제를 통해 본 발명의 화합물을 연결하기 위해 이용 가능한 다수의 Lys 측쇄 -NH2 기를 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 골수성 세포에 결합하는 GM-CSF, 리간드/성장 인자는 급성 골수성 백혈병으로부터의 병에 걸린 세포에 대한 세포결합제로서 사용될 수 있다. 활성화된 T-세포에 결합하는 IL-2는 이식편 거부반응의 예방을 위해, 이식편대숙주병의 치료 및 예방을 위해, 그리고 급성 T-세포 백혈병의 치료를 위해 사용될 수 있다. 멜라닌 세포에 결합하는 MSH는 흑색종에 대한 항체일 수 있기 때문에 흑색종의 치료를 위해 사용될 수 있다. 표피성장인자는 편평세포암, 예컨대 폐 및 두경부를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 소마토스타틴은 신경아세포종 및 기타 종양 유형을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 에스트로겐(또는 에스트로겐 유사체)은 유방암을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 안드로겐(또는 안드로겐 유사체)는 고환을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 집락 자극 인자, 또는 영양소-수송 분자일 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 항체 모방체, 예컨대 안키린 반복 단백질, 센티린, 또는 에드넥틴/모노바디이다.
다른 실시형태에서, 세포결합제는 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체, 단일쇄 항체, 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 단일쇄 단클론성 항체, 단클론성 항체 단편(또는 "항원-결합 부분"), 표적 세포에 특이적으로 결합하는 키메라 항체, 키메라 항체 단편(또는 "항원-결합 부분"), 표적 세포에 특이적으로 결합하는 도메인 항체(예를 들어, sdAb), 또는 도메인 항체 단편이다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 인간화된 항체, 인간화된 단일쇄 항체, 또는 인간화된 항체 단편(또는 "항원-결합 부분")이다. 구체적 실시형태에서, 인간화된 항체는 미국 특허 제7,342,110호 및 제7,557,189호에 기재되어 있는 huMy9-6 또는 다른 관련된 항체이다. 다른 구체적 실시형태에서, 인간화된 항체는 미국 가출원 특허 제61/307,797, 61/346,595호, 및 제61/413,172호 및 미국 특허 출원 제13/033,723호(미국 특허 공개 제2012/0009181 A1호에 기재된 바와 같음)에 기재되어 있는 항-엽산 수용체 항체이다. 모든 이들 출원의 교시는 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 재표면화된(resurfaced) 항체, 재표면화된 단일쇄 항체, 재표면화된 항체 단편(또는 "항원-결합 부분"), 또는 이중특이성 항체이다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 미니바디, 아비바디, 다이어바디, 트라이바디, 테트라바디, 나노바디, 프로바디, 도메인 항체, 또는 유니바디이다.
다시 말해서, 예시적인 세포 결합제는 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체, 단일쇄 항체, 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 단일쇄 단클론성 항체, 단클론성 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 키메라 항체, 키메라 항체 단편, 이중특이성 항체, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 도메인 항체, 도메인 항체 단편, 인터페론(예를 들어, α, β, γ), 림포카인(예를 들어, IL-2, IL-3, IL-4 및 IL-6), 호르몬(예를 들어, 인슐린, 갑상선 자극 방출 호르몬(TRH), 멜라닌 세포-자극 호르몬(MSH), 및 스테로이드 호르몬(예를 들어, 안드로겐 및 에스트로겐)), 비타민(예를 들어, 엽산염), 성장 인자(예를 들어, EGF, TGF-알파, FGF, VEGF), 집락 자극 인자, 영양소-수송 분자 (예를 들어, 트랜스페린; 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[O'Keefe et al. (1985) J. Biol . Chem. 260:932-937]), 센티린(피브로넥틴 III형 (FN3) 반복체의 공통 서열에 기반한 단백질 스캐폴드; 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2010/0255056호, 제2010/0216708호 및 제2011/0274623호), 안키린 반복 단백질(예를 들어, DARPin으로 공지된 설계된 안키린 반복 단백질; 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2004/0132028호, 제2009/0082274호, 제2011/0118146호 및 제2011/0224100호, 및 또한 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[C. Zahnd et al., Cancer Res . (2010) 70:1595-1605; Zahnd et al., J. Biol . Chem . (2006) 281(46):35167-35175; 및 Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A., Nature Biotechnology (2005) 23:1257-1268]), 안키린-유사 반복 단백질 또는 합성 펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2007/0238667호; 미국 특허 제7,101,675호; WO　2007/147213; 및 WO　2007/062466 참조), 에드넥틴(피브로넥틴 도메인 스캐폴드 단백질; 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2007/0082365호; 제2008/0139791호 참조), 아비바디(다이어바디, 트라이어바디, 및 테트라바디를 포함; 미국 특허 공개 제2008/0152586호 및 제2012/0171115호 참조), 이중 수용체 재표적화(DART) 분자(P.A. Moore et al., Blood, 2011; 117(17):4542-4551; Veri MC, et al., Arthritis Rheum, 2010 Mar 30; 62(7):1933-43; Johnson S, et al.　J Mol Biol, 2010 Apr 9;399(3):436-49), 세포 침투성 과급 단백질(Methods in Enzymol . 502, 293-319 (2012), 및 기타 세포-결합 분자 또는 물질을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 표적 세포 상의 모이어티, 예컨대 세포-표면 수용체에 결합하는 리간드일 수 있다. 예를 들어, 리간드는 성장 인자 수용체에 결합하는 성장 인자 또는 이의 단편일 수 있거나; 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 이의 단편일 수 있다. 특정 실시형태에서, 성장 인자 수용체 또는 사이토카인 수용체는 세포-표면 수용체이다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 부분(항체 유도체를 포함), 또는 특정 항체 모방체이며, CBA는 표적 세포 상의 리간드, 예컨대 세포-표면 수용체를 포함하는 세포-표면 리간드에 결합할 수 있다.
특정 예시적 항원 또는 리간드는 레닌; 성장 호르몬(예를 들어, 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 리포단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자(예를 들어, 인자 vmc, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자); 항-응고 인자(예를 들어, 단백질 C); 심방 나트륨 이뇨인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성체(예를 들어, 유로키나제, 인간 소변 또는 조직 유형 플라스미노겐 활성체); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES(즉, 활성화에 대해 조절된 정상 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증 단백질-1-알파; 혈청 알부민 (인간 혈청 알부민); 뮬러-저해 물질; 릴랙신 A-쇄; 릴랙신 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩타이드; 미생물 단백질(베타-락탐ase); DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(예를 들어, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관내피 성장 인자; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티즘성 인자; 신경영양 인자(예를 들어, 뼈 유래 신경영양 인자, 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6), 신경 성장 인자(예를 들어, NGF-β); 혈소판-유래 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자(예를 들어, aFGF 및 bFGF); 섬유아세포 성장 인자 수용체 2; 표피성장인자; 형질전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-알파, TGF-β1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, 및 TGF-5); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; 멜라노트랜스페린; EpCAM; GD3; FLT3; PSMA; PSCA; MUC1; MUC16; STEAP; CEA; TENB2; EphA 수용체; EphB 수용체; 엽산 수용체; FOLR1; 메소텔린; 크립토; 알파v베타6; 인테그린; VEGF; VEGFR; EGFR; 트랜스페린 수용체; IRTA1; IRTA2; IRTA3; IRTA4; IRTA5; CD 단백질(예를 들어, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD123, CD134, CD137, CD138 및 CD152), 하나 이상의 종양-관련 항원 또는 세포-표면 수용체(본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2008/0171040호 또는 미국 특허 공개 제2008/0305044호); 에리스로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 뼈형성 단백질; 인터페론(예를 들어, 인터페론-알파, -베타, 및 -감마); 집락 자극 인자(예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF); 인터류킨(예를 들어, IL-1 내지 IL-10); 수퍼옥사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원(예를 들어, HIV 외피의 일부); 수송 단백질, 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린(예를 들어, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM;) 종양 관련 항원(예를 들어, HER2, HER3 및 HER4 수용체); 엔도글린; c-Met; c-kit; 1GF1R; PSGR; NGEP; PSMA; PSCA; TMEFF2; LGR5; B7H4; 및 임의의 상기 열거한 폴리펩타이드의 단편을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 면역글로불린(Ig) 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉, 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함하는 전장 항체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL), 및 하나의 도메인, 즉, CL로 구성되는 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 추가로 상보성 결정 영역(CDR)으로 칭해지는 과변이 영역으로 다시 분할될 수 있다. 이러한 영역에 의해 더 보존된 프레임워크 영역(FR)이 배치된다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열되는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4.
특정 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM이다. 특정 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4; 또는 IgA1 또는 IgA2이다.
특정 실시형태에서, 세포결합제는 항체(예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,342,110호 및 제7,557,189호에 기재된 huMy9-6 또는 그의 관련된 항체)와의 항원-결합에 중요한 서열을 공유하는 단클론성 항체의 "항원-결합 부분"이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어(또는 때때로 "항체 단편"으로서 상호 호환적으로 지칭됨)는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 특정 단편에 의해 수행될 수 있다는 것을 나타내었다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (제한 없이): (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편(예를 들어, 파파인에 의해 분해되는 항체는 3가지 단편을 수득한다: 2개의 항원-결합 Fab 단편, 및 항원에 결합하지 않는 하나의 Fc 단편); (ii) F(ab') 2 단편, 즉, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편(예를 들어, 펩신에 의해 분해되는 항체는 2개의 단편(2가 항원-결합 F(ab')2 단편, 및 항원에 결합하지 않는 pFc' 단편)을 수득한다) 및 그의 관련된 F(ab') 1가 단위; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편(즉, Fab에 포함된 중쇄의 해당 부분); (iv) 항체의 단일 암 및 관련된 이황화 연결 Fv의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb (도메인 항체) 또는 sdAb(단일 도메인 항체) 단편(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 부분은 sdAb (단일 도메인 항체)이다.
특정 실시형태에서, 항원-결합 부분은 또한 자연적으로 존재하는 항체에서 발견되지 않을 수도 있는 구성요소 또는 서열에 추가로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 또한 포함하는 특정 공학 처리된 또는 재조합 유도체(또는 "유도체 항체")를 포함한다.
예를 들어, Fv 단편 중 2개의 도메인, 즉, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 그들은 그들을 단일 단백질 쇄로서 이루어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 표준 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있으며, 이때, VL 및 VH 영역은 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로서 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al. Science 242:423-426, 1988: 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988] 참조)를 형성하도록 쌍을 이룬다.
본 명세서에 기재된 모든 실시형태에서, scFv의 N-말단은 VH 도메인(즉, N-VH-VL-C), 또는 VL 도메인(즉, N-VL-VH-C)일 수 있다.
이가(또는 2가) 단일-쇄 가변 단편(이-scFvs, 2-scFv)는 두 scFv를 연결함으로써 공학 처리될 수 있다. 이는 2개의 VH 및 2개의 VL 영역을 지니는 단일 펩타이드 쇄를 생성하여, 종열 scFv(tascFv)를 수득한다. 수미식(head-to-tail) 방식으로 3개 이상의 scFv를 연결함으로써 더 많은 종열 반복부, 예컨대 트라이-scFv가 유사하게 생성될 수 있다.
특정 실시형태에서, scFv는 2개의 가변 영역이 함께 폴딩되기에 너무 짧은(약 5개의 아미노산) 링커 펩타이드를 통해 연결되어, scFv가 이량체화되게 하고, 다이어바디를 형성한다(예를 들어, 문헌[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993; Poljak et al., Structure 2:1121-1123, 1994] 참조). 다이어바디는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다. 다이어바디는 대응하는 scFv보다 40배까지 더 낮게 해리 상수를 갖는 것으로, 즉, 표적에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 갖는 것으로 나타났다.
여전히 더 짧은 링커(1 또는 2개의 아미노산)는 삼량체 또는 소위 트라이어 바디 또는 테트라바디의 형성을 야기한다. 테트라바디가 또한 유사하게 생성되었다. 그들은 다이어바디보다 그들의 표적에 대해 훨씬 더 높은 친화도를 나타낸다. 다이어바디, 트라이어바디, 및 테트라바디는 때때로 "아비바디 ( AVIBODY )(상표명)" 세포결합제(또는 축약해서 "아비바디")로 총괄적으로 불린다. 즉, 2, 3 또는 4개의 표적 결합 영역(TBR)을 갖는 아비바디는 다이어-, 트라이어- 및 테트라-바디로 통상적으로 알려져 있다. 예를 들어, 상세한 설명을 위해 전체 교시가 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 미국 특허 공개 제2008/0152586호 및 제2012/0171115호 참조.
모든 이들 형식은 2 이상의 상이한 항원에 대해 특이성을 지니는 가변 단편으로 구성될 수 있으며, 이 경우에 그들은 이중- 또는 다중-특이성 항체 유형이다. 예를 들어, 특정 이중특이성 종열다이-scFv는 이중 특이성 T 세포 관여항체(bi-specific T-cell engager(BiTE))로서 알려져 있다.
특정 실시형태에서, 종열 scFv 또는 다이어바디/트라이어바디/테트라바디에서 각각의 scFv는 동일 또는 상이한 결합 특이성을 가질 수 있고, 각각은 독립적으로 N-말단 VH 또는 N-말단 VL을 가질 수 있다.
단일쇄 Fv(scFv)는 또한 IgG-유사 특성을 얻기 위해 Fc 모이어티, 예컨대 인간 IgG Fc 모이어티에 융합될 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 그들은 여전히 단일 유전자에 의해 암호화된다. 포유류에서 이러한 scFv - Fc 단백질의 일시적 생성이 밀리그램 양을 용이하게 달성할 수 있기 때문에, 이 유도체 항체 형식은 다수의 연구 용도에 대해 특히 적합하다.
Fcab는 항체의 Fc 불변 영역으로부터 공학 처리된 항체 단편이다. Fcab는 가용성 단백질로서 발현될 수 있거나, 또는 그들은 전장 항체, 예컨대 IgG로 다시 공학 처리되어 mAb2를 생성할 수 있다. mAb2는 정상 Fc 영역 대신 Fcab를 지니는 전장 항체이다. 이들 추가적인 결합 부위에 의해, mAb2 이중특이성 단클론성 항체는 동시에 두 상이한 표적에 결합할 수 있다.
특정 실시형태에서, 공학 처리된 항체 유도체는 기능에 대해 비필수로 여겨지는 도메인을 제거함으로써 생성되는 항원-결합 Ig-유래 재조합 단백질("소형화된" 전체 크기 mAb)의 크기를 감소시켰다. 최고의 예 중 하나는 SMIP이다.
소형 모듈 면역약물 (small modular immunopharmaceutical) 또는 SMIP는 항체(면역글로불린)의 부분으로 대체로 구성된 인공 단백질이고, 약물로서 사용에 대해 의도된다. SMIP는 항체와 유사한 생물학적 반감기를 갖지만, 항체보다 더 작고, 따라서 더 양호한 조직 침투 특성을 가질 수 있다. SMIP는 하나의 결합 영역, 연결자로서 하나의 힌지 영역 및 하나의 효과기 도메인을 포함하는 단일쇄 단백질이다. 결합 영역은 변형된 단일쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 단백질의 나머지는 Fc(예컨대 효과기 도메인으로서 CH2 및 CH3) 및 항체, 예컨대 IgG1의 힌지 영역으로 구성될 수 있다. 유전자 변형 세포는 실제 항체보다 약 30% 더 작은 항체-유사 이량체로서 SMIP를 생성한다.
이러한 공학 처리된 소형화 항체의 다른 예는 "유니바디"인데, 이때 힌지 영역은 IgG4 분자로부터 제거되었다. IgG4 분자는 불안정하고, 경-중쇄 이형이량체를 서로 교환할 수 있다. 힌지 영역의 결실은 중쇄-중쇄 쌍을 완전히 방지하여, 고도로 특이적인 1가 경/중쇄 이형이량체를 이탈하는 한편, Fc 영역은 남겨서 생체내 안정성 및 반감기를 보장한다.
단일-도메인 항체(sdAb, 애블링스(Ablynx)에 의해 나노바디로 불리는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음)는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 전체 항체와 마찬가지로, 이는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있지만, 그의 단지 12 내지 15kDa의 분자량에 기인하여 훨씬 더 작다. 특정 실시형태에서, 단일-도메인 항체는 중쇄 항체(hcIgG)로부터 공학 처리된다. 첫 번째 이러한 sdAb는 VHH 단편으로 불리는 낙타에서 발견되는 hcIgG에 기반하여 공학 처리되었다. 특정 실시형태에서, 단일-도메인 항체는 VNAR 단편을 이용하여 IgNAR("면역글로불린 신규 항원 수용체", 이하 참조)로부터 공학 처리된다. 연골 어류(예컨대 상어)는 이러한 중쇄 IgNAR 항체를 가진다. 특정 실시형태에서, sdAb는 통상적인 면역글로불린 G(IgG)로부터의 이량체 가변 도메인, 예컨대 인간 또는 마우스로부터의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할함으로써 공학 처리된다. 특정 실시형태에서, 나노바디는 중쇄 가변 도메인으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 나노바디는 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, sdAb는 표적 항원에 대한 결합제에 대해 단일 도메인 중쇄 서열(예를 들어, 인간 단일 도메인 HC)의 라이브러리를 선별함으로써 얻어진다.
단일 가변 신규 항원 수용체 도메인 항체 단편(V NAR 또는 V NAR 도메인)은 연골어류(예를 들어, 상어) 면역글로불린 신규 항원 수용체 항체(IgNAR)로부터 유래된다. 가장 작은 것으로 알려진 면역글로불린-기반 단백질 스캐폴드 중 하나인, 이러한 단일 도메인 단백질은 바람직한 크기 및 수수께끼 에피토프(cryptic epitope) 인식 특성을 입증한다. 성숙 IgNAR 항체는 하나의 가변 신규 항원 수용체(VNAR) 도메인 및 5개의 불변 신규 항원 수용체(CNAR) 도메인의 동종이량체로 이루어진다. 이 분자는 고도로 안정하며, 효율적인 결합 특징을 가진다. 그의 고유한 안정성은 (i) 뮤린 항체에서 발견되는 통상적인 VH 및 VL 도메인에 비해 상당한 수의 하전된 그리고 친수성인 표면 노출 잔기를 제시하는 근본적인 Ig 스캐폴드; 그리고 (ii) 루프간 이황화 브릿지 및 루프내 수소 결합 패턴을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)에서 구조적 특징의 안정화 둘 다에 기인할 가능성이 있다.
미니바디는 CH 도메인, 예컨대 CH3γ1(IgG1의 CH3 도메인) 또는 CH4ε(IgE의 CH4 도메인)에 연결된 scFv를 포함하는 공학 처리된 항체 단편이다. 예를 들어, 암배 항원(carcinoembryonic antigen: CEA)에 특이적인 scFv는 미니바디를 생성하기 위해 CH3γ1에 연결되었는데, 이는 생체내에서 빠른 클리어런스와 결부된 우수한 종양 표적화를 갖는 것으로 이미 입증되었다(Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061, 1996). scFv는 N-말단 VH 또는 VL을 가질 수 있다. 연결은 비공유, 무힌지 미니바디를 초래하는 짧은 펩타이드(예를 들어, 2개의 아미노산 링커, 예컨대 ValGlu)일 수 있다. 대안적으로, 연결은 공유적, 힌지-미니바디를 생성하는 IgG1 힌지 및 GlySer 링커 펩타이드일 수 있다.
천연 항체는 단일 특이성이지만, 이가이고, 즉, 그들은 2개의 동일한 항원-결합 도메인을 발현시킨다. 대조적으로, 특정 실시형태에서, 특정 공학 처리된 항체 유도체는 2- 또는 다중-특이성 분자인데, 이는 각각 상이한 표적 특이성을 지니는 2 이상의 항원-결합 도메인을 가진다. 이중특이성 항체는 각각 별도의 특이성을 지니는 2개의 항체-생성 세포를 융합함으로써 생성될 수 있다. 이들 "쿼드로마(quadroma)"는 다중 분자종을 생성하였는데, 2개의 별도의 경쇄 및 2개의 별도의 중쇄는 다중 입체배치에서 쿼드로마를 재조합하는 것이 자유롭기 때문이다. 그 이후로, 이중특이성 Fab, scFv 및 전체 크기 mAb는 다양한 기법을 이용하여 생성되었다(상기 참조).
이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig) 단백질은 두 항원/에피토프를 동시에 표적화하는 이중-특이성 IgG의 유형이다(DiGiammarino et al., Methods Mol Biol. 899:145-56, 2012). 상기 분자는 통상적인 IgG와 유사한 입체배치로 Fc 영역 및 불변 영역을 포함한다. 그러나, DVD-Ig 단백질은 분자의 각각의 아암(arm)이 두 가변 도메인(VD)을 포함한다는 점에서 독특하다. 아암 내의 VD는 종열로 연결되고, 상이한 결합 특이성을 가질 수 있다.
삼중특이성 항체 유도체 분자는 또한, 예를 들어, 2개의 별도의 Fab 및 Fc를 지니는 이중특이성 항체를 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 하나의 예는 BiUII로 불리는 마우스 IgG2a 항-Ep-CAM, 래트 IgG2b 항-CD3 쿼드로마인데, 이는 종양 세포 발현 Ep-CAM, T 세포 발현 CD3, 및 대식세포 발현 FCγRI의 공동 국소화를 허용하는 것으로 생각되며, 따라서 면역 세포의 공동자극 및 항종양 작용을 강력하게 한다.
프로바디는 건강한 조직에 삽입물을 남기지만, (예를 들어, 질환 미세환경에서 풍부하거나 또는 특이적인 프로테아제에 의한 프로테아제 절단을 통해) 질환 미세환경에서 특이적으로 활성화되는 완전한 재조합, 가리움된 단클론성 항체이다. 문헌[Desnoyers et al., Sci Transl Med 5:207ra144, 2013] 참조. 유사한 가리움 기법이 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 대해 사용될 수 있다.
인트라바디는 세포내 항원에 결합하는 세포 내에서 작동하기 위한 세포내 국소화를 위해 변형된 항체이다. 인트라바디는 세포질에 남아있을 수 있거나, 또는 핵 국소화 신호를 가질 수 있거나, 또는 ER 표적화를 위한 KDEL 서열을 가질 수 있다. 인트라바디는 단일-쇄 항체(scFv), 초안정성을 지니는 알려진 면역글로불린 VL 도메인, 더 환원성인 세포내 환경에 대해 내성이 있는 선택된 항체일 수 있거나, 또는 말토스 결합 단백질 또는 다른 안정한 세포내 단백질과의 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이러한 최적화는 인트라바디의 안정성 및 구조를 개선시켰고, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 대한 일반적인 적용능력을 가질 수 있다.
본 발명의 항원-결합 부분 또는 유도체 항체는 그들이 유래/공학 처리된 항체에 비해 실질적으로 같은 또는 동일한 (1) 경쇄 및/또는 중쇄 CDR3 영역; (2) 경쇄 및/또는 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역; 또는 (3) 경쇄 및/또는 중쇄 영역을 가질 수 있다. 이들 영역 내의 서열은 CDR 영역 내의 치환을 포함하는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 보존적 치환이 있다. 대안적으로, 항원-결합 부분 또는 유도체 항체는 그들이 유래/공학 처리된 항체와 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 영역 및/또는 중쇄 영역을 가진다. 이들 항원-결합 부분 또는 유도체 항체는 항체에 비교하여 표적 항원에 대한 실질적으로 동일한 결합 특이성 및/또는 친화도를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 항원-결합 부분 또는 유도체 항체의 Kd 및/또는 k off 값은 본 명세서에 기재된 항체의 10배(더 높거나 또는 더 낮음), 5배(더 높거나 또는 더 낮음), 3배(더 높거나 또는 더 낮음) 또는 2배(더 높거나 또는 더 낮음) 내이다.
특정 실시형태에서, 항원-결합 부분 또는 유도체 항체는 완전 인간 항체, 인간화된 항체 또는 키메라 항체로부터 유래/공학 처리될 수 있고, 임의의 당업계에 인식된 방법에 따라 생성될 수 있다.
단클론성 항체 기법은 특이적 단클론성 항체의 형태로 극도로 특이적인 세포 결합제의 생성을 허용한다. 관심 대상의 항원, 예컨대 무손상 표적 세포, 표적 세포로부터 단리된 항원, 전체 바이러스, 약독된 전체 바이러스 및 바이러스 단백질, 예컨대 바이러스 외피 단백질을 이용하여 마우스, 래트, 햄스터 또는 임의의 다른 포유류를 면역화시킴으로써 생성된 단클론성 항체를 생성하기 위한 기법은 당업계에 특히 잘 공지되어 있다. 민감화된 인간 세포가 또한 사용될 수 있다. 단클론성 항체를 생성하는 다른 방법은 scFv(단일쇄 가변 영역), 구체적으로 인간 scFv의 파지 라이브러리의 사용이다(예를 들어, 그리피스(Griffiths) 등의 미국 특허 제5,885,793호 및 제5,969,108호; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 WO　92/01047; 라이밍(Liming) 등의 WO 99/06587 참조). 추가로, 미국 특허 제5,639,641호에 개시된 재표면화된 항체가 또한 키메라 항체 및 인간화된 항체와 같이 사용될 수 있다.
세포결합제는 또한 파지 디스플레이(예를 들어, 문헌[Wang et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA (2011) 108(17), 6909-6914] 참조) 또는 펩타이드 라이브러리 기법(예를 들어, 문헌[Dane et al., Mol . Cancer. Ther . (2009) 8(5):1312-1318] 참조)로부터 유래된 펩타이드일 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 CBA는 또한 항체 모방체, 예컨대 DARPin, 애피바디, 아필린, 이피틴, 앝니칼린, 아비머, 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩타이드, 모노바디, 또는 나노피틴을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "DARPin" 및 "(설계된) 안키린 반복 단백질"은 바람직한(때때로 특이적인) 표적 결합을 전형적으로 나타내는 특정 유전자 공학 처리된 항체 모방체를 지칭하기 위해 상호 호환적으로 사용된다. 표적은 단백질, 탄소수화물 또는 기타 화학적 독립체일 수 있고, 결합 친화도는 상당히 높을 수 있다. DARPin은 천연 안키린 반복부-함유 단백질로부터 유래될 수 있고, 바람직하게는 이들 단백질 중 적어도 3, 보통 4 또는 5개의 안키린 반복부 모티프(각각의 안키린 반복부 모티프에서 전형적으로 약 33개의 잔기)로 이루어진다. 특정 실시형태에서, DARPin은 약 4- 또는 5-반복부를 함유하고, 각각 약 14 또는 18　kDa의 분자량을 가질 수 있다. 1012개 이상의 변이체의 다양성을 지니는 무작위화된 잠재적 표적 상호작용 잔기를 지니는 DARPin의 라이브러리는 다양한 기법, 예컨대 리보솜 디스플레이 또는 신호 인식 입자(signal recognition particle: SRP) 파지 디스플레이를 이용하여 피코몰 친화도 및 특이성으로 목적으로 하는 표적(예를 들어, 수용체 작용제 또는 길항제, 역 작용제, 효소 저해제 또는 단순한 표적 단백질 결합제)에 결합하는 DARPin을 선택하는데 사용하기 위한 DNA 수준으로 생성될 수 있다. 예를 들어, DARPin에 대해 미국 특허 공개 제2004/0132028호, 제2009/0082274호, 제2011/0118146호 및 제2011/0224100호, WO 02/20565호 및 WO 06/083275호(이들의 전체 교시는 본 명세서에 참고로 포함됨), 및 또한 문헌[C. Zahnd et al. (2010) Cancer Res., 70:1595-1605; Zahnd et al. (2006) J. Biol . Chem., 281(46):35167-35175; 및 Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23:1257-1268(모두 본 명세서에 참고로 포함됨)] 참조. 또한 관련된 안키린-유사 반복 단백질 또는 합성 펩타이드에 대해 미국 특허 공개 제2007/0238667호; 미국 특허 제7,101,675호; WO　2007/147213; 및 WO　2007/062466(이들의 전체 교시는 본 명세서에 참고로 포함됨) 참조.
애피바디 분자는 고친화도로 매우 다수의 표적 단백질 또는 펩타이드에 결합하도록 공학 처리된 작은 단백질이며, 따라서 단클론성 항체를 모방한다. 애피바디는 58개의 아미노산을 지니는 3개의 알파 나선으로 이루어지며, 몰질량이 약 6 kDa이다. 그들은 고온(90℃) 또는 산성 및 알칼리성 조건(pH 2.5 또는 pH 11)을 견뎌 내는 것으로 나타났고, 서브-나노몰 범위 아래로 친화도를 지니는 결합제는 나이브 라이브러리 선택으로부터 얻어지며, 피코몰 친화도를 지니는 결합제는 친화도 성숙 후에 얻어졌다. 특정 실시형태에서, 애피바디는 공유적으로 표적화하는 결합을 위해 약한 친전자체에 컨쥬게이팅된다.
모노바디(또한 에드넥틴으로서 알려짐)는 항원에 결합할 수 있는 유전자 공학 처리된 항체 모방체 단백질이다. 특정 실시형태에서, 모노바디는 94개의 아미노산으로 이루어지고, 분자량이 약 10 kDa이다. 그들은 3개의 상보성 결정 영역에 대응하는 각각의 측면 상에서 배럴 및 3개의 노출된 루프를 형성하는 7개의 베타 시트와 함께 인간 피브로넥틴에, 더 구체적으로는 항체 가변 도메인과 유사한 구조를 갖는 그의 제10 세포밖 III형 도메인에 기반한다. 상이한 단백질에 대해 특이성을 지니는 모노바디는 루프 BC(제2 베타 시트와 제3 베타 시트 사이) 및 FG(제6 시트와 제7 시트 사이)를 변형시킴으로써 맞춤될 수 있다.
트라이바디는 평행 삼량체 복합체로 자기 조립되는 마우스 및 인간 연골 기질 단백질(CMP)의 C-말단 또꼬인 나선에 기반하여 설계된 자가-조립 항체 모방체이다. 이는 특이적 표적-결합 모이어티를 CMP로부터 유래된 삼량체화 도메인과 융합함으로써 생성된 고도로 안정한 삼량체 표적화 리간드이다. 얻어진 융합 단백질은 높은 안정성을 지니고 잘-한정된 평행 동종삼량체로 효율적으로 자가조립할 수 있다. 삼량체 표적화 리간드의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석은 대응하는 단량체에 비해 상당히 향상된 표적-결합 강도를 입증하였다. 세포-결합 연구는 이러한 트라이바디가 그들의 각각의 수용체에 대해 우수한 결합 강도를 가진다는 것을 확인하였다.
센티린은 공통 FN3 도메인 서열의 프레임워크를 구성하는 라이브러리를 이용하여 얻어질 수 있는 다른 항체 모방체이다(Diem et al., Protein Eng Des Sel ., 2014). 이 라이브러리는 FN3 도메인의 C-가닥, CD-루프, F-가닥 및 FG-루프 내의 다양화된 위치를 사용하며, 고친화도 센티린 변이체는 특이적 표적에 대해 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포결합제는 항-엽산 수용체 항체이다. 더 구체적으로는, 항-엽산 수용체 항체는 인간 엽산 수용체 1(또한 엽산 수용체 알파 (FR-α)로서 알려짐)에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "인간 엽산 수용체 1", "FOLR1" 또는 "엽산 수용체 알파(FR-α)"는 달리 표시되지 않는 한 임의의 천연 인간 FOLR1을 지칭한다. 따라서, 모든 이들 용어는 본 명세서에 표시되는 바와 같은 단백질 또는 핵산 서열을 지칭할 수 있다. 용어 "FOLR1"은 "전장", 비가공 FOLR1뿐만 아니라 세포 내의 가공으로부터 초래되는 FOLR1의 임의의 형태를 포함한다. FOLR1 항체는 (a) GYFMN(서열번호 1)을 포함하는 중쇄 CDR1; RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(서열번호 2)을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 YDGSRAMDY(서열번호 3)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 (b) KASQSVSFAGTSLMH(서열번호 4)를 포함하는 경쇄 CDR1; RASNLEA(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2; 및 QQSREYPYT(서열번호 6)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하되; Xaa1은 K, Q, H 및 R로부터 선택되고; Xaa2는 Q, H, N 및 R로부터 선택되며; Xaa3은 G, E, T, S, A 및 V로부터 선택된다. 바람직하게는, 중쇄 CDR2 서열은 RIHPYDGDTFYNQKFQG(서열번호 7)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 항-엽산 수용체 항체는 QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 8)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 인간 엽산 수용체 1에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에서, 항-엽산 항체 수용체는 2010년 4월 7일자로 ATCC에 기탁되고 ATCC 기탁 번호가 PTA-10772 및 PTA-10773 또는 10774인 플라스미드 DNA에 의해 암호화된 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에서, 항-엽산 수용체 항체는 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 9); 또는 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 10)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 인간 엽산 수용체 1에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에서, 항-엽산 수용체 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열의 중쇄 및 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 인간 엽산 수용체 1에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 바람직하게는, 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함한다(hu FOLR1).
다른 실시형태에서, 항-엽산 수용체 항체는 2010년 4월 7일자로 ATCC에 기탁되고 ATCC 기탁 번호가 PTA-10772 및 PTA-10773 또는 10774인 플라스미드 DNA에 의해 암호화된 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에서, 항-엽산 수용체 항체는 인간 엽산 수용체 1에 특이적으로 결합하고, QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS(서열번호 11)에 대해 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 도메인, 및 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR(서열번호 12); 또는 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR(서열번호 13)에 대해 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 인간화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
다른 실시형태에서, 항-엽산 수용체 항체는 huMov19 또는 M9346A이다(예를 들어, 미국 특허 제8,709,432호, 미국 특허 제8,557,966호 및 WO2011106528, 모두 본 명세서에 참고로 포함됨).
다른 실시형태에서, 세포결합제는 항-EGFR 항체 또는 이의 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 항-EGFR 항체는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 WO2012058592에 기재된 항체를 포함하는 비길항제 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 비-작용성항체, 예를 들어, 인간화된 ML66 또는 EGFR-8이다. 더 구체적으로는, 항-EGFR 항체는 huML66이다.
또 다른 실시형태에서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-EGFR 항체. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이중 밑줄 서열은 중쇄 또는 경쇄 서열의 가변 영역(즉, 중쇄 가변 영역 또는 HCVR, 및 경쇄 가변 영역 또는 LCVR)을 나타내는 반면, 볼드체 서열은 CDR 영역(즉, N-말단으로부터 C-말단까지, 중쇄 또는 경쇄 서열의 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 나타낸다.
Figure pct00031
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 서열번호 14의 중쇄 CDR1-CDR3 및/또는 서열번호 15의 경쇄 CDR1-CDR3을 포함하고, 바람직하게는 EGFR에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 서열번호 14에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 (HCVR) 서열, 및/또는 서열번호 15에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 (LCVR) 서열을 포함하고, 바람직하게는 EGFR에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,790,649호 및 WO 2012/058588에 기재된 항체이다. 일 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 huEGFR-7R 항체이다.
일 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 QVQLVQSGAEVAKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWVKQRPGQGLECIGTIYPGDGDTTYTQKFQGKATLTADKSSSTAYMQLSSLRSEDSAVYYCARYDAPGYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 16)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역 및 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLAWYQHKPGKGPKLLIHYTSTLHPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISSLEPEDIATYYCLQYDNLLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 17)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역, 또는 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLAWYQHKPGKGPKLLIHYTSTLHPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISSLEPEDIATYYCLQYDNLLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 18)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역 및 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역 및 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 서열번호 16의 중쇄 CDR1-CDR3, 및/또는 서열번호 17 또는 18의 경쇄 CDR1-CDR3을 포함하며, 바람직하게는 EGFR에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 서열번호 16에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 (HCVR) 서열 및/또는 서열번호 17 또는 18에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 (LCVR) 서열을 포함하고, 바람직하게는 EGFR에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 세포결합제는 항-CD19 항체, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,435,528호 및 WO2004/103272이다. 일 실시형태에서, 항-CD19 항체는 QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPGQGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 19)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역 및 EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYSLTISSMEPEDAATYYCHQRGSYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 20)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항-CD19 항체는 huB4 항체이다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD19 항체는 서열번호 19의 중쇄 CDR1-CDR3 및/또는 서열번호 20의 경쇄 CDR1 내지 CDR3을 포함하고, 바람직하게는 CD19에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD19 항체는 서열번호 19에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역(HCVR), 및/또는 서열번호 20에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하고, 바람직하게는 CD19에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 세포결합제는 항-Muc1 항체, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,834,155호, WO 2005/009369 및 WO 2007/024222에 기재된 것이다. 일 실시형태에서, 항-Muc1 항체는 QAQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGYIYPGNGATNYNQKFQGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDSAVYFCARGDSVPFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 21)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역 및 EIVLTQSPATMSASPGERVTITCSAHSSVSFMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSSLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQRSSFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 22)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항-Muc1 항체는 huDS6 항체이다.
또 다른 실시형태에서, 항-Muc1 항체는 서열번호 21의 중쇄 CDR1-CDR3 및/또는 서열번호 22의 경쇄 CDR1-CDR3을 포함하고, 바람직하게는 Muc1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-Muc1 항체는 서열번호 21에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 (HCVR) 서열 및/또는 서열번호 22에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열을 포함하고, 바람직하게는 Muc1에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 세포결합제는 항-CD33 항체 또는 이의 단편, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,557,189호, 제7,342,110호, 제8,119,787호 및 제8,337,855호 및 WO2004/043344에 기재된 항체 또는 이의 단편이다. 다른 실시형태에서, 항-CD33 항체는 huMy9-6 항체이다.
일 실시형태에서, 항-CD33 항체는 QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFQGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 23)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역, 및 EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPRLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYCHQYLSSRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 24)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD33 항체는 서열번호 23의 중쇄 CDR1-CDR3, 및/또는 서열번호 24의 경쇄 CDR1-CDR3을 포함하고, 바람직하게는 CD33에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD33 항체는 서열번호 23에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 (HCVR) 서열, 및/또는 서열번호 24에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 (LCVR) 서열을 포함하고, 바람직하게는 CD33에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 세포결합제는 항-CD37 항체 또는 이의 항체 단편, 예컨대 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제8,765,917호 및 WO 2011/112978에 기재된 것이다. 일 실시형태에서, 항-CD37 항체는 huCD37-3 항체이다.
일 실시형태에서, 항-CD37 항체는 DIQMTQSPSSLSVSVGERVTITCRASENIRSNLAWYQQKPGKSPKLLVNVATNLADGVPSRFSGSGSGTDYSLKINSLQPEDFGTYYCQHYWGTTWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 25)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역 및 QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHPSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 26)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역, 또는 QVQVQESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTTSGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSSLKSRLSIKKDHSKSQVFLKLNSLTAADTATYYCAKGGYSLAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 27)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역을 포함한다.
다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역 및 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 서열번호 26 또는 27의 중쇄 CDR1-CDR3, 및/또는 서열번호 25의 경쇄 CDR1-CDR3을 포함하고, 바람직하게는 CD37에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 서열번호 26 또는 27에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 및/또는 서열번호 25에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 (LCVR) 서열을 포함하고, 바람직하게는 CD37에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 EIVLTQSPATMSASPGERVTMTCSATSSVTYMHWYQQKPGQSPKRWIYDTSNLPYGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSDNPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 28)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 영역 및 QVQLQESGPGLLKPSQSLSLTCTVSGYSITSGFAWHWIRQHPGNKLEWMGYILYSGSTVYSPSLKSRISITRDTSKNHFFLQLNSVTAADTATYYCARGYYGYGAWFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 29)의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 영역을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 서열번호 29의 중쇄 CDR1-CDR3, 및/또는 서열번호 28의 경쇄 CDR1-CDR3을 포함하고, 바람직하게는 CD37에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 서열번호 29에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 (HCVR) 서열, 및/또는 서열번호 28에 대해 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열을 포함하고, 바람직하게는 CD37에 특이적으로 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 항-CD37 항체는 huCD37-50 항체이다.
세포결합제-약물 컨쥬게이트
본 발명은 또한 이황화물 링커, 티오에터 링커, 아마이드 결합 링커, 펩티다제-불안정 링커, 산-불안정 링커, 에스터라제-불안정 링커를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 링커를 통해 본 발명의 하나 이상의 세포독성 화합물에 연결된 세포결합제를 포함하는 세포결합제-약물 컨쥬게이트를 제공한다.
제2 실시형태에서, 본 발명은 세포독성 화합물 및 세포 결합제 (CBA)를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하되, 세포독성 화합물은 CBA에 공유 결합되고, 세포독성 화합물은 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 또는 (VI')에 의해 나타내며, 변수는 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, 세포독성 화합물은 구조식 (I') 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 나타낸다.
특정 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, L', L" 및 L'" 중 하나는 하기 화학식 (A')로 나타내고:
-Z1-P-Z2-Rx-J' (A'),
다른 하나는 -H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 할로겐, -OH, (C1-C6)알콕시 또는 -NO2이다. 구체적으로, L', L" 및 L'" 중 하나는 화학식 (A')로 나타내고, 다른 하나는 -H이다.
제1 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, L'는 화학식 (A')로 나타내고, L"과 L"'는 둘 다 -H이며; 남아있는 변수는 제1 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제2 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, Rx는 할로겐, -OH, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시, 할로(C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q로 선택적으로 치환되는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1 구체적 실시형태에 상기 기재된 바와 같다.
특정 실시형태에서, Q는 i) -SO3H, -Z'-SO3H, -OPO3H2, -Z'-OPO3H2, -PO3H2, -Z'-PO3H2, -CO2H, -Z'-CO2H, -NR11R12 또는 -Z'-NR11R12, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는, ii) -N+R14R15R16X- 또는 -Z'-N+R14R15R16X-이고; Z'는 선택적으로 치환되는 알킬렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌 또는 선택적으로 치환되는 페닐렌이며; R14 내지 R16은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬이고; X-는 약제학적으로 허용 가능한 음이온이며; 남아있는 변수는 제2 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, Q는 -SO3H 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
제3 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, J'는 CBA에 공유 결합된 모이어티를 포함하고, -NRc1 또는 -C(=O)-이되, Rc1은 할로겐, -OH 또는 (C1-C3)알콕시로 선택적으로 치환되는 -H 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1 또는 제2 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, J'는 -C(=O)-이고; 남아있는 변수는 제3 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제4 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, L'는 다음의 화학식으로 나타내고:
-NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-J' (B1');
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J' (B2');
-C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-J' (C1'); 또는
-C(=O)-P-NR5-Cy-(CRaRb)m'-J' (C2'),
식 중:
J'는 -C(=O)-이고;
Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
m은 1 내지 6의 정수이고;
m'는 0 또는 1 내지 6의 정수이며; 그리고
Cy는 할로겐, -OH, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시, 또는 할로(C1-C3)알킬로 선택적으로 치환되는 5 또는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는 환식 알킬이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2 또는 제3 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, Ra와 Rb는 둘 다 H이고; 화학식 (B2') 및 (C2')에 대한 Cy는 사이클로헥산이며; R5는 H 또는 Me이고; 남아있는 변수는 제4 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, 화학식 (B2') 및 (C2')의 m'는 0 또는 1이다.
제5 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, L'는 다음의 화학식으로 나타내고:
-NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-S-Zs1 (B3'); 또는
-C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-S-Zs1 (C3'),
식 중:
Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
m은 1 내지 6의 정수이고;
Zs1은 하기 화학식 중 임의의 하나로부터 선택되며:
Figure pct00032
식 중:
q는 1 내지 5의 정수이고;
n'는 2 내지 6의 정수이며;
U는 -H 또는 SO3M이고;
M은 약제학적으로 허용 가능한 양이온(예를 들어, H+, Na+ 또는 K+)이며; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3 또는 제4 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q는 i) -SO3H, -Z'-SO3H, -OPO3H2, -Z'-OPO3H2, -PO3H2, -Z'-PO3H2, -CO2H, -Z'-CO2H, -NR11R12, 또는 -Z'-NR11R12, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는, ii) -N+R14R15R16X- 또는 -Z'-N+R14R15R16X-이고; Z'는 선택적으로 치환되는 알킬렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌 또는 선택적으로 치환되는 페닐렌이며; R14 내지 R16은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬이고; X-은 약제학적으로 허용 가능한 음이온이며; 남아있는 변수는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, Q는 -SO3H 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
특정 실시형태에서, Ra와 Rb는 둘 다 -H이고, R5는 H 또는 Me이며; 남아있는 변수는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, -(CRaRb)m-은 -(CH2)m"-C(Me2)-이고, m"은 1 내지 5의 정수이며; 남아있는 변수는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제6 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, P는 2 내지 10개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고; 남아있는 변수는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-나이트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu 및 Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Met-Ala로부터 선택되고; 남아있는 변수는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, 및 D-Ala-D-Ala이고; 남아있는 변수는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제7 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI)에 대해, N과 C 사이의 이중선
Figure pct00033
은 이중 결합을 나타내고; 남아있는 변수는 제1 실시형태, 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다.
제8 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, N과 C 사이의 이중선
Figure pct00034
은 단일 결합을 나타내고, X는 -H 또는 아민 보호기이며; Y는 -H, -OR, -OCOR', -SR, -NR'R," 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 질소-함유 헤테로사이클, -SO3H, -SO2H 및 -OSO3H로부터 선택되고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 구체적 실시형태에서 기재한 바와 같다.
특정 실시형태에서, Y는 -H, -SO3M, -OH, -OMe, -OEt 또는 -NHOH로부터 선택되되, M은 -H, Na+ 또는 K+이고; 남아있는 변수는 제8 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, Y는 -H, -SO3M 또는 -OH이다.
제9 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, X'는 -H, -OH, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 또는 제8 구체적 실시형태에서 기재된 바와 같다.
특정 실시형태에서, X'는 -H, -OH, (C1-C3)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 페닐이고; 남아있는 변수는 제9 구체적 실시형태에서 상기 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, X'는 -H, -OH 또는 -Me이다. 훨씬 더 구체적으로는, X'는 -H이다.
제10 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, Y'는 -H, 옥소기, (C1-C3)알킬 또는 할로(C1-C3)알킬이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 제9 구체적 실시형태에서 기재된 바와 같다. 더 구체적으로는, Y'는 -H 또는 옥소이다. 훨씬 더 구체적으로는, Y'는 -H이다.
제11 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O-, -S-, -NR5-, 및 옥소 -(C=O)-로부터 선택되며; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 구체적 실시형태에서 기재한 바와 같다. 더 구체적으로는, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O- 및 -S-로부터 선택된다. 훨씬 더 구체적으로는, A 및 A'는 -O-이다.
제12 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, R6는-OMe이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 제11 구체적 실시형태에 기재되어 있다.
제13 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 독립적으로 -H, 할로겐, -NO2, -OH, (C1-C3-)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 (C1-C3)알콕시이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11 또는 제12 구체적 실시형태에 기재된 바와 같다. 더 구체적으로는, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H이다.
제14 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, R, R', R" 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 또는 제13 구체적 실시형태에서 기재한 바와 같다.
제14 구체적 실시형태에서, 구조식 (I'), (II'), (III'), (IV'), (V') 및 (VI')에 대해, N과 C 사이의 이중선
Figure pct00035
은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 단, 그것이 이중 결합 X는 없고 Y는 -H일 때, 그리고 그것이 단일 결합일 때, X는 -H이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이며;
R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H이고;
R6 -OMe이며;
X'과 Y'는 둘 다 -H이고;
A 및 A'는 -O-이며;
M은 H, Na+ 또는 K+이고; 남아있는 변수는 제1 실시형태 또는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제6 구체적 실시형태에서 기재한 바와 같다.
제15 구체적 실시형태에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 다음의 구조식 중 임의의 하나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 나타낸다:
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
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Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
식 중:
r은 1 내지 10의 정수이고;
Y는 -H, -OH 또는 -SO3M이며; 그리고
M은 약제학적으로 허용 가능한 양이온(예를 들어, H+, Na+ 또는 K+)이다.
더 구체적으로는, Y는 -SO3M이다. 대안적으로, Y는 -OH이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트, 예컨대 제2 실시형태 또는 제1 내지 제15 구체적 실시형태에 기재된 것은 1 내지 10종의 세포독성 화합물, 2 내지 9종의 세포독성 화합물, 3 내지 8종의 세포독성 화합물, 4 내지 7종의 세포독성 화합물, 또는 5 내지 6종의 세포독성 화합물을 포함할 수 있으며, 각각의 세포독성 화합물은 CBA에 세포독성 화합물을 연결하는 연결기를 포함하고, 컨쥬게이트 상에서 각각의 세포독성 화합물은 동일하다.
임의의 컨쥬게이트 실시형태, 예컨대 제2 실시형태 또는 제1 내지 제15 구체적 실시형태에서, 세포결합제는 종양 세포, 바이러스 감염 세포, 미생물 감염 세포, 기생충 감염 세포, 자가면역 세포, 활성화된 세포, 골수성 세포, 활성화된 T-세포, B 세포 또는 멜라닌 세포; CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, EpCAM, CanAg, CALLA 또는 Her-2 항원; Her-3 항원을 발현시키는 세포; 또는 인슐린 성장 인자 수용체, 표피성장인자 수용체 및 엽산 수용체를 발현시키는 세포로부터 선택된 표적 세포에 결합할 수 있다.
임의의 컨쥬게이트 실시형태, 예컨대 제2 실시형태 또는 제1 내지 제15 구체적 실시형태에서, 세포결합제는 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체, 단일쇄 항체, 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 단일쇄 단클론성 항체, 또는 단클론성 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 키메라 항체, 키메라 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 도메인 항체, 도메인 항체 단편, 림포카인, 호르몬, 비타민, 성장 인자, 집락 자극 인자, 또는 영양소-수송 분자일 수 있다.
항체는 재표면화된 항체, 재표면화된 단일쇄 항체, 또는 재표면화된 항체 단편일 수 있다.
항체는 단클론성 항체, 단일쇄 단클론성 항체, 또는 단클론성 이의 항체 단편일 수 있다.
항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일쇄 항체, 또는 인간화된 항체 단편일 수 있다.
상기 임의의 컨쥬게이트 실시형태, 예컨대 제2 실시형태 또는 제1 내지 제15 구체적 실시형태에서, 세포결합제는 항-엽산 수용체 항체 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 더 구체적으로는, 항-엽산 수용체 항체는 huMOV19 항체이다.
대안적으로, 상기 임의의 컨쥬게이트 실시형태, 예컨대 제2 실시형태 또는 제1 내지 제15 구체적 실시형태에서, 세포결합제는 항-EGFR 항체 또는 이의 항체 단편일 수 있다. 일 실시형태에서, 항-EGFR 항체는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된 WO2012058592에 기재된 항체를 포함하는 비-길항제 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-EGFR 항체는 비-작용성항체, 예를 들어, 인간화된 ML66이다. 더 구체적으로는, 항-EGFR 항체는 huML66이다.
본 발명은 임의의 본 명세서에 기재된 컨쥬게이트, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 세포결합제에 연결된 임의의 대상 화합물을 포함하는 컨쥬게이트를 추가로 제공한다.
본 발명은 포유류에게 치료적 유효량의 임의의 화합물(임의의 링커기를 지니거나 또는 없음) 또는 본 발명의 컨쥬게이트, 및 선택적으로, 제2 화학치료제를 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 비정상적 세포 성장을 저해하거나 또는 증식성 장애, 자가면역 장애, 골파괴 장애, 감염성 질환, 바이러스성 질환, 섬유소성 질환, 신경퇴행성 장애, 췌장 또는 신장 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
특정 실시형태에서, 제2 화학치료제는 포유류에게 순차적으로 또는 연속적으로 투여된다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 암, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 이식편대숙주병(GVHD), 이식거부반응, 낭창, 근육염, 감염 및 면역 결핍으로부터 선택된 병태를 치료하기 위한 것이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법 또는 컨쥬게이트는 암을 치료하는 것이다.
특정 실시형태에서, 암은 혈액암 또는 고형 종양이다. 더 구체적으로는, 암은 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 흑색종, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)), 유방암, 두경부의 편평세포암종, 전립선암, 자궁내막 암, 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종), 골수이형성 증후군(MDS), 복막암 또는 백혈병(예를 들어, 　급성 골수성 백혈병(AML), 급성 단핵구 백혈병, 전골수세포성 백혈병, 호산구 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병(예를 들어, B-ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML))이다.
세포결합제-약물 컨쥬게이트의 생성
세포결합제에 대한 본 발명의 세포독성 화합물 또는 이의 유도체를 연결하기 위해, 세포독성 화합물, 예컨대 화합물 14(실시예 1), 23(실시예 2), 35(실시예 3), 49(실시예 4), 80(실시예 5), 90(실시예 6), 63(실시예 7), 또는 70(실시예 8)은 결합된 반응기를 지니는 연결 모이어티를 포함할 수 있다. 이들 화합물은 세포 결합제에 직접적으로 연결될 수 있다. 세포결합제-세포독성제 컨쥬게이트를 생성하기 위해, 결합된 반응기를 갖는 세포독성 화합물을 연결하기 위한 대표적인 공정은 실시예 11, 13, 14 내지 17, 19 및 20에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 2작용성 가교 시약은 하나의 결합된 반응기를 지니는 연결 모이어티를 보유하는 화합물(즉, 약물-링커 화합물)을 제공하기 위해 세포독성 화합물과 처음 반응될 수 있고, 이어서, 세포 결합제와 반응될 수 있다. 대안적으로, 2작용성 가교 시약의 하나의 말단은 하나의 결합된 반응기를 지니는 연결 모이어티를 보유하는 세포 결합제를 제공하기 위해 세포 결합제와 처음 반응될 수 있고, 이어서, 세포독성 화합물과 반응될 수 있다. 연결 모이어티는 특정 부위에서 세포독성 모이어티의 방출을 허용하는 화학 결합을 함유할 수 있다. 적합한 화학적 결합은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 이황화물 결합, 티오에터 결합, 산 불안정 결합, 광 불안정 결합, 펩티다제 불안정 결합 및 에스터라제 불안정 결합을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호; 제5,475,092호; 제6,441,163호; 제6,716,821호; 제6,913,748호; 제7,276,497호; 제7,276,499호; 제7,368,565호; 제7,388,026 및 제7,414,073호 참조). 이황화물 결합, 티오에터 및 펩티다제 불안정 결합이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 비절단성 링커, 예컨대 미국 특허 공개 제 2005/0169933호에 상세하기 기재되어 있는 것, 또는 하전된 링커 또는 친수성 링커를 포함하고, 미국 특허 공개 제2009/0274713호, 미국 특허 공개 제2010/01293140호 및 WO 2009/134976에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 명확하게 참고로 포함되어 있다.
일 실시형태에서, 수성 완충제 중의 세포결합제(예를 들어, 항체)의 용액은 다이티오피리딜기를 도입하기 위해 몰과량의 2작용성 가교제, 예컨대 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)2-설포 부타노에이트(설포-SPDB)와 함께 인큐베이션될 수 있다. 변형된 세포결합제(예를 들어, 변형된 항체)는 이어서, 본 명세서에 기재된 티올-함유 세포독성 화합물, 예컨대 화합물 98 또는 99(실시예 9 및 10)과 반응되어, 본 발명의 이황화물-연결 세포결합제-세포독성제 컨쥬게이트를 생성한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 티올-함유 세포독성 화합물, 예컨대 화합물 98 또는 99는 2작용성 가교제, 예컨대 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)부타노에이트(SPDB), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜다이티오)2-설포 부타노에이트(설포-SPDB)와 반응하여 세포독성제-링커 화합물을 형성하고, 이어서, 세포 결합제와 반응하여 본 발명의 이황화물-연결 세포결합제-세포독성제 컨쥬게이트를 생성할 수 있다. 세포독성제-링커 화합물은 세포결합제와 반응하기 전에 정제 없이 인시츄로 제조될 수 있다. 대표적인 과정은 실시예 12 및 18에 기재되어 있다. 대안적으로, 세포독성제-링커 화합물은 세포결합제와 반응하기 전에 정제될 수 있다.
세포 결합제-세포독성제 컨쥬게이트는 당업계에 공지된 임의의 정제 방법, 예컨대 미국 특허 제7,811,572호 및 미국 특허 공개 제2006/0182750호에 기재된 것을 이용하여 정제될 수 있으며, 이들 둘 다 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 세포결합제-세포독성제 컨쥬게이트는 접선 유동 여과, 흡착 크로마토그래피, 흡착 여과, 선택적 침전, 비흡수 여과 또는 이의 조합을 이용하여 정제될 수 있다. 바람직하게는, 접선 유동 여과(TFF, 또한 직교류 여과, 한외여과 및 정용여과로서 알려짐) 및/또는 흡착 크로마토그래피 수지는 컨쥬게이트의 정제를 위해 사용된다.
대안적으로, 세포결합제(예를 들어, 항체)는 몰과량의 항체 변형제, 예컨대 2-이미노티올란, L-호모시스테인 티오락톤(또는 유도체), 또는 N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)와 함께 인큐베이션되어 설프하이드릴기를 도입할 수 있다. 이어서, 변형된 항체는 적절한 이황화물-함유 세포독성제와 반응되어, 이황화물-연결 항체-세포독성제 컨쥬게이트를 생성한다. 이어서, 항체-세포독성제 컨쥬게이트는 상기 기재한 방법에 의해 정제될 수 있다. 세포 결합제는 또한 미국 특허 제7,772485호 및 제7.855,275호에 개시된 티올 모이어티, 예컨대 시스테인-공학 처리된 항체를 도입하기 위해 공학 처리될 수 있다.
다른 실시형태에서, 수성 완충제 중의 세포결합제(예를 들어, 항체) 용액은 말레이미도기를 도입하기 위해 몰과량의 항체-변형제, 예컨대 N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트와 함께 또는 요오도아세틸기를 도입하기 위해 N-숙신이미딜-4-(요오도아세틸)-아미노벤조에이트(SIAB)와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이어서, 변형된 세포결합제(예를 들어, 변형된 항체)는 티오에터-연결 세포결합제-세포독성제 컨쥬게이트를 생성하기 위해 티올-함유 세포독성제와 반응된다. 이어서, 컨쥬게이트는 상기 기재된 방법에 의해 정제될 수 있다.
항체 분자 당 결합된 세포독성 분자의 수는 280㎚ 및 330㎚에서 흡광도 비를 측정함으로써 분광학적으로 결정될 수 있다. 1 내지 10종의 세포독성 화합물/항체 분자(들)의 평균은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 연결될 수 있다. 항체 분자 당 연결된 세포독성 화합물의 바람직한 평균 수는 2 내지 5이고, 가장 바람직하게는 2.5 내지 4.0이다.
본 발명의 세포결합제-약물 컨쥬게이트를 제조하기 위한 대표적인 방법은 제8,765,740호 및 미국 특허 출원 공개 제 2012/0238731호에 기재되어 있다. 이들 참고문헌의 전체 교시는 본 명세서에 참고로 포함된다.
화합물 및 컨쥬게이트의 세포독성
본 발명의 세포독성 화합물 및 세포결합제-약물 컨쥬게이트는 시험관내 다양한 암 세포주의 증식을 억제하는 그들의 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 인간 자궁경부 암종 세포주 KB, 인간 급성 단핵구 백혈병 세포주 THP-1, 인간 전골수세포성 백혈병 세포주 HL60, 인간 급성 골수성 백혈병 세포주 HNT-34와 같은 세포주는 이들 화합물 및 컨쥬게이트의 세포독성 평가를 위해 사용될 수 있다. 평가될 세포는 1 내지 5일 동안 화합물 또는 컨쥬게이트 및 공지된 방법에 의한 직접적 분석에서 측정되는 세포의 살아있는 분획에 노출될 수 있다. 이어서, IC50 값은 분석 결과로부터 계산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 시험관내 세포주 민감성 선별, 예컨대 미국 국립 암 연구소에 의해 기재된 것(본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Voskoglou-Nomikos et al., 2003, Clinical Cancer Res. 9: 42227-4239] 참조)은 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트에 의한 치료에 민감할 수 있는 암 유형을 결정하기 위한 가이드 중 하나로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체-세포독성제 컨쥬게이트의 시험관내 효능 및 표적 특이성의 예는 도 2 및 도 4에 나타낸다. 모든 컨쥬게이트는 낮은 피코몰 범위에서 IC50을 지니는 항원 양성 암 세포에 대해 극도로 세포독성이다. 항원 음성 세포주는 동일한 컨쥬게이트에 노출될 때 가변적으로 남아있었다.
일 예에서, 세포 결합제/세포독성제 컨쥬게이트의 생체내 효능이 측정되었다. SCID 마우스 보유 NCI-H2110 종양 세포는 huMov19-80 및 huMov19-90 컨쥬게이트로 처리되었고, 상당한 종양 퇴행이 다회 용량에서 관찰된 반면, 비처리 마우스는 종양이 빠르게 성장되었다(도 6). 5㎍/㎏만큼 낮은 용량에서 huMov19-90 컨쥬게이트에 대한 활성이 관찰되었다.
조성물 및 사용방법
본 발명은 본 명세서에 기재된 신규한 벤조다이아제핀 화합물(예를 들어, 인돌리노벤조다이아제핀 또는 옥사졸리디노벤조다이아제핀), 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트, (및/또는 이의 용매화물, 수화물 및/또는 염) 및 담체(약제학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 포함한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 신규한 벤조다이아제핀 화합물, 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트, (및/또는 이의 용매화물, 수화물 및/또는 염) 및 담체(약제학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하고, 추가로 제2 치료제를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 포함한다. 본 조성물은 포유류(예를 들어, 인간)에서 비정상적 세포 성장을 저해하거나 또는 증식성 장애를 치료하는 데 유용하다. 본 조성물은 또한 포유류(예를 들어, 인간)에서 우울증, 불안, 스트레스, 공포증, 공황, 불쾌감, 정신 의학적 장애, 통증 및 염증성 질환을 치료하는 데 유용하다.
본 발명은 포유류에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 신규한 벤조다이아제핀 화합물(예를 들어, 인돌리노벤조다이아제핀 또는 옥사졸리디노벤조다이아제핀), 이의 유도체, 또는 이의 컨쥬게이트, (및/또는 이의 용매화물 및 염) 또는 이의 조성물을 단독으로 또는 제2 치료제와 병용하여 투여하는 단계를 포함하는 포유류(예를 들어, 인간)에서 비정상적 세포 성장을 저해하거나 또는 증식성 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 치료가 필요한 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 임의의 컨쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하는 치료방법을 제공한다.
유사하게, 본 발명은 표적 세포 또는 표적 세포를 함유하는 조직을 유효량의 본 발명의 임의의 세포독성 화합물-세포 결합제 (예를 들어, 세포 결합제에 연결된 인돌리노벤조다이아제핀 또는 옥사졸리디노벤조다이아제핀 이량체), 이의 염 또는 용매화물을 포함하는 세포독성제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 선택된 세포 집단에서 세포사를 유도하는 방법을 제공한다. 표적 세포는 세포결합제가 결합할 수 있는 세포이다.
원한다면, 다른 활성제, 예컨대 다른 항-종양제는 컨쥬게이트와 함께 투여될 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및 부형제는 잘 공지되어 있고 임상 상황 보장으로서 당업자에 의해 결정될 수 있다.
적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 (1) 약 1㎎/㎖ 내지 25㎎/㎖ 인간 혈청 알부민을 함유하거나 또는 함유하지 않는 둘베코 인산염 완충제 식염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 식염수(0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스을 포함하고; 또한 트립타민 및 안정제, 예컨대 트윈(Tween) 20과 같은 항산화제를 함유할 수 있다.
선택된 세포 집단에서 세포사를 유도하기 위한 방법은 시험관내, 생체내 또는 생체밖에서 실행될 수 있다.
시험관내 사용의 예는 병에 걸린 또는 악성 종양 세포를 사멸시키기 위해 동일한 환자에게 골수 이식물의 투여 전 자가 골수 치료; 적격 T 세포를 사멸시키고 이식편대숙주병(GVHD)을 예방하기 위한 골수 이식 전의 치료; 표적 항원을 발현시키지 않는 목적으로 하는 변이체를 제외하고 모든 세포를 사멸시키기 위한 세포 배양물의 치료; 또는 목적으로 하지 않는 항원을 발현시키는 변이체를 사멸시키기 위한 치료를 포함한다.
비임상 시험관내 용도의 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
생체밖 임상 사용의 예는 암 치료에서 또는 자가면역 질환의 치료에서 자가 이식 전 골수로부터 종양 세포 또는 림프계 세포를 제거하는 것, 또는 GVHD를 예방하기 위한 이식 전 자가 또는 동종이계 골수 또는 조직으로부터 T 세포 및 기타 림프계 세포를 제거하는 것이다. 치료는 다음과 같이 수행될 수 있다. 골수는 환자 또는 다른 개체로부터 채취되고, 이어서, 본 발명의 세포독성제를 첨가한 혈청을 함유하는 배지에서 인큐베이션시키고, 농도는 약 37℃에서 약 30분 내지 약 48시간 동안 약 10μM 내지 1pM의 범위에 있다. 인큐베이션 농도 및 시간의 정확한 조건, 즉, 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 인큐베이션 후에, 골수 세포는 혈청을 함유하는 배지로 세척하고 나서, 환자에게 공지된 방법에 따라 정맥내로 복귀된다. 환자가 골수의 채취와 처리 세포의 재주입 사이에 비박피성 화학치료 또는 전체 신체 조사 과정과 같은 다른 치료를 받는 상황에서, 치료된 골수 세포는 표준 의학적 도구를 이용하여 액체 질소 중에서 저장된다.
임상적 생체내 용도를 위해, 본 발명의 세포독성제는 멸균을 위해 그리고 내독소 수준을 위해 시험되는 용액 또는 동결건조 분말로서 공급될 것이다. 컨쥬게이트 투여의 적합한 프로토콜의 예는 다음과 같다. 매주 정맥내 볼루스로서 4주 동안 1주마다 컨쥬게이트가 제공된다. 볼루스 용량은 5 내지 10㎖의 인간 혈청 알부민이 첨가될 수 있는 50 내지 1000㎖의 정상 식염수로 제공된다. 투약량은 정맥내로 투여 당 10㎍ 내지 2000㎎일 것이다(100 ng 내지 20㎎/㎏/일의 범위). 4주의 치료 후에, 환자는 1주 기준으로 치료를 계속해서 받을 수 있다. 투여 경로, 희석제, 투약량, 시간 등에 관해 특정 임상 프로토콜은 임상 상황 보장으로서 당업자에 의해 결정될 수 있다.
선택된 세포 집단에서 세포사를 유도하는 생체내 또는 생체밖 방법에 따라 치료될 수 있는 의학적 병태의 예는, 예를 들어, 암, 자가면역질환, 예컨대 전신 낭창, 류마티스 관절염, 및 다발성 경화증; 이식편거부반응, 예컨대 신장 이식거부반응, 간 이식거부반응, 폐 이식거부반응, 심장 이식거부반응, 및 골수 이식거부반응; 이식편대숙주병; 바이러스성 감염, 예컨대 CMV 감염, HIV 감염, AIDS 등; 및 기생충 감염, 예컨대 편모충증, 아메바증, 주혈흡충증 및 당업자에 의해 결정된 바와 같은 기타를 포함하는 임의의 유형의 악성종양을 포함한다.
암 치료법 및 그들의 투약량, 투여 경로 및 권장 용법은 당업계에 공지되어 있으며, 의사 처방 참고문헌(Physician's Desk Reference: PDR)으로서 이러한 문헌에 기재되어 있다. PDR은 다양한 암의 치료에서 사용된 제제의 투약량을 개시한다. 치료적으로 유효한 이들 앞서 언급한 화학치료 약물의 투약 요법 및 투약량은 치료 중인 특정 암, 질환 정도 및 당업계의 의사에게 친숙한 다른 인자에 의존할 것이며, 의사에 의해 결정될 수 있다. PDR의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 명확하게 포함된다. 당업자는 다음의 매개변수 중 하나 이상을 이용하여 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 화학치료제 및 컨쥬게이트의 투약 요법 및 투약량을 결정하도록 PDR을 검토할 수 있다. 이들 매개변수는 하기를 포함한다:
종합 지수
제조업자에 따라
제품(회사의 또는 등록상표 약물 명칭에 따라)
범주 지수
일반적/화학적 지수(비상표 공통 약물 명칭)
의약의 색 이미지
FDA 라벨링과 일치되는 제품 정보
화학물질 정보
기능/작용
적응증 및 금기
시행 연구, 부작용, 경고
유사체 및 유도체
세포독성제의 당업자는 얻어진 화합물이 출발 화합물의 특이성 및/또는 활성을 여전히 보유하는 그러한 방식으로 본 명세서에 기재된 각각의 세포독성제가 변형될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 당업자는 또한 다수의 이들 화합물이 본 명세서에 기재된 세포독성제 대신 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 세포독성제는 본 명세서에 기재된 화합물의 유사체 및 유도체를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌 및 다음의 실시예는 그들의 전문이 명확하게 참고로 포함된다.
실시예
본 발명은 이제 비제한적 예를 참고로 하여 예시할 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 백분율, 비율, 부 등은 중량이다. 모든 시약은 뉴저지주에 소재한 알드리치 케미컬스 코포레이션(Aldrich Chemical Co.) 또는 기타 공급원으로부터 구입하였다. 핵 자기 공명(1H NMR) 스펙트럼을 브루커(Bruker) 400 MHz 기기에 대해 획득하였다. 브루커 달톤 에스콰이어 3000(Bruker Daltonics Esquire 3000) 기기 상에서 질량 스펙트럼을 획득하고 나서, 전자분무 이온화를 이용하여 애질런트(Agilent) 6120 단일 쿼드로폴 MS를 이용하는 애질런트 1260 인피니티 LC 상에서 LCMS를 획득하였다.
다음의 용매, 시약, 보호기, 모이어티 및 기타 설계를 괄호 안의 그들의 약어에 의해 지칭할 수 있다:
Me = 메틸; Et = 에틸; Pr = 프로필; i-Pr = 아이소프로필; Bu = 뷰틸; t-Bu = tert-뷰틸; Ph = 페닐 및 Ac = 아세틸
AcOH 또는 HOAc = 아세트산
ACN 또는 CH3CN = 아세토나이트릴
Ala = 알라닌
aq = 수성
BH3·DMS = 보란 다이메틸설파이드 복합체
Bn = 벤질
Boc 또는 BOC = tert-뷰톡시카본일
CBr4 = 사브롬화탄소
Cbz 또는 Z = 벤질옥시카본일
DCM 또는 CH2Cl2 = 다이클로로메탄
DCE = 1,2-다이클로로에탄
DMAP = 4-다이메틸아미노피리딘
DI 물 = 탈이온수
DIBAL = 다이아이소뷰틸알루미늄 수소화물
DIEA 또는 DIPEA = N,N-다이아이소프로필에틸아민
DMA = N,N-다이메틸아세트아마이드
DMF = N,N-다이메틸폼아마이드
DMSO = 다이메틸 설폭사이드
DTT = 다이티오트레이톨
EDC = 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드
EEDQ = N-에톡시카본일-2-에톡시-1,2-다이하이드로퀴놀린
ESI 또는 ES = 전자분무 이온화
EtOAc = 에틸아세테이트
Gly = 글리신
g = 그램
h = 시간
HATU = N,N,N'N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)우로늄 헥사포스페이트
HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피
HOBt 또는 HOBT = 1-하이드록시벤조트라이아졸
LAH = 리튬 알루미늄 수소화물
LC = 액체 크로마토그래피
LCMS = 액체 크로마토그래피 질량분석법
min = 분
㎎ = 밀리그램
㎖ = 밀리리터
m㏖ = 밀리몰
㎍ = 마이크로그램
㎕ = 마이크로리터
μ㏖ = 마이크로몰
Me = 메틸
MeOH = 메탄올
MeI = 요오드화메틸
MS = 질량분석법
MsCl = 메탄설폰일 클로라이드(염화메실)
Ms2O = 메탄설폰 무수물
NaBH(OAc)3 = 트라이아세톡시보로하이드라이드 나트륨
NHS = N-하이드록시숙신아마이드
NMR = 핵 자기 공명 분광학
PPh3 = 트라이페닐포스핀
PTLC = 분취 박막 크로마토그래피
rac = 라세미 혼합물
Rf = 지연 인자
RPHPLC 또는 RP-HPLC = 역상 고성능 액체 크로마토그래피
RT 또는 rt = 실온(주위, 약 25℃)
sat 또는 포화 = 포화
STAB = 트라이아세톡시보로하이드라이드 나트륨(NaBH(OAc)3)
TBSCl 또는 TBDMSCl = tert-뷰틸다이메틸실릴 클로라이드
TBS = tert-뷰틸다이메틸실릴
TCEP·HCl = 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 염
TEA = 트라이에틸아민(Et3N)
TFA = 트라이플루오로아세트산
THF = 테트라하이드로퓨란
TLC = 박막 크로마토그래피
Val = 발린
실시예 1. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-6-옥소헥사노에이트(화합물 14)의 합성
Figure pct00068
단계 1: Z-Gly-Gly-OH 화합물 1 (5.0 g, 18.78m㏖) 및 H-Gly-Ot -Bu·HCl 화합물 2(3.46 g, 20.66m㏖)를 DMF(37.6㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(3.96 g, 20.66m㏖) 및 HOBt(2.88 g, 18.78m㏖)를 반응 플라스크에 첨가하고 나서, DIPEA(8.18㎖, 46.9m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 Ar 하에 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고 나서, 포화 NH4Cl, 포화 NaHCO3, 다음에 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 생성물을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(MeOH/DCM, 구배, 0% 내지 5%)에 의해 정제하여 순수한 화합물 3을 백색 고체로서(6.35 g, 89% 수율) 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.18-8.13 (m, 2H), 7.48 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 7.37-7.36 (m, 3H), 7.34-7.32 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.09 (q, 1H, J = 5.2 Hz), 3.74 (t, 4H, J = 6.1 Hz), 3.67 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 3.17 (d, 2H, J = 5.2 Hz), 1.41 (s, 9H). LCMS = 4.28 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 324.15 (M-t-Bu+H).
Figure pct00069
단계 2: 화합물 3(6.3 g, 16.60m㏖)을 MeOH(52.7㎖) 및 물(2.64㎖) 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 Ar으로 퍼지하고 나서, 5분 동안 탈기시켰다. Pd/C(습윤, 10%)(0.884 g, 0.830m㏖)을 서서히 첨가하였다. 이어서, 1분 동안 풍선으로부터의 H2에서 버블링하였다. 반응물을 H2 풍선 하에 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, 필터 케이크를 MeOH(30㎖)로 세척하고, 농축시켰다. CH3CN(20㎖)을 잔사에 첨가하여 농축시켰다. 이를 2회 이상 반복하여 끈적거리는 고체를 얻었다. 잔사를 EtOAc/헥산(2:1, 50㎖) 중에서 슬러리화하고 나서, EtOAc/헥산(1:1, 30㎖)으로 린스하였다. 고체를 진공/N2하에서 1시간 동안 건조시켜 화합물 4를 백색 고체로서(3.66 g, 90% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.21-8.18 (m, 1H), 8.12 (bs, 1H), 3.76 (bs, 2H), 3.73 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 3.13 (s, 2H), 1.93 (bs, 2H), 1.41 (s, 9H).
Figure pct00070
단계 3: 아민 화합물 4(1.0 g, 4.08m㏖) 및 모노 메틸아디페이트(664㎕, 4.48m㏖)를 DMF(13.59㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(860㎎, 4.48m㏖) 및 HOBt (624㎎, 4.08m㏖)를 반응 혼합물에 첨가한 후에, DIEA(1.424㎖, 8.15m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM/MeOH(20㎖, 5:1)로 희석시키고 나서, 포화 NH4Cl, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 생성물을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(구배, 0% 내지 20% MeOH/DCM)에 의해 정제하여 순수한 화합물 5 백색 고체로서(1.5 g, 95% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.17-8.06 (m, 3H), 3.74-3.71 (m, 6H), 3.59 (s, 3H), 2.32 (bt, 2H, J = 6.9 Hz), 2.14 (bt, 2H, J = 6.7 Hz), 1.52-1.49 (m, 4H), 1.41 (s, 9H).
Figure pct00071
단계 4: 화합물 5(1.5 g, 3.87m㏖)를 TFA(5.97㎖, 77.0m㏖) 및 탈이온수(300㎕) 중에서 실온에서 밤새 교반시켰다. CH3CN(10㎖)를 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 5분 동안 교반시켰다. 혼합물은 다량의 백색 침전물고 함께 걸쭉하게 되었다. 더 많은 CH3CN(30㎖)을 첨가하고 나서 추가 5분 동안 교반시켰다. 혼합물을 여과 후, 진공/N2 하에서 1시간 동안 건조시켜 순수한 화합물 6을 백색 고체로서(0.7 g, 55% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.56 (s, 1H), 8.16-8.06 (m, 3H), 3.73 (dt, 6H, J = 8.6, 6.1 Hz), 3.59 (s, 3H), 2.32-2.29 (m, 2H), 2.16-2.13 (m, 2H), 1.51 (bt, 4H, J = 3.5 Hz).
Figure pct00072
단계 5: 아닐린 화합물 7(100㎎, 0.653m㏖) 및 산 화합물 6(227　㎎, 0.685m㏖)을 CH2Cl2/MeOH(4.35㎖/2.2㎖) 중에서 실온에서 현탁시켰다. EEDQ (323㎎, 1.306m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 용매를 농축시키고 나서, 잔사를 EtOAc(15㎖) 중에서 슬러리화하고, 여과시켰다. 고체를 EtOAc로 세척하고 나서(2 x 15㎖) 진공/N2 하에서 건조시켜 화합물 8 백색 고체로서(260㎎, 85% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.74 (s, 1H), 8.21-8.19 (m, 2H), 8.11-8.08 (m, 1H), 7.45 (s, 2H), 6.96 (s, 1H), 5.17 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 4.45 (d, 4H, J = 5.6 Hz), 3.87 (d, 2H, J = 5.8 Hz), 3.75 (dd, 4H, J = 5.7, 13.4 Hz), 3.58 (s, 3H), 2.31-2.27 (m, 2H), 2.16-2.13 (m, 2H),1.52-1.48 (m, 4H). LCMS = 0.886 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 489.3 (M+Na).
Figure pct00073
단계 6: 다이올 화합물 8(260㎎, 0.557m㏖) 및 사브롬화탄소(555　㎎, 1.672m㏖)을 DMF(5.57㎖) 중에 용해시켰다. 트라이페닐포스핀(439㎎, 1.672m㏖)을 첨가하고 나서, 갈색 혼합물을 Ar 하에 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM/MeOH(10:1, 30㎖)로 희석시키고 나서, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(MeOH/DCM, 0% 내지 10%, 구배)에 의해 정제하여 화합물 9를 황색 고체로서 얻었다. 생성물을 CH2Cl2/EtOAc(1:10, 30㎖) 중에서 슬러리화하고, 이어서 여과시켰다. 고체를 EtOAc로 세척하고 나서, 진공/N2 하에 건조시켜 순수한 화합물 9를 회백색 고체로서 (170㎎, 52% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.95 (s, 1H), 8.25-8.20 (m, 2H), 8.12-8.10 (m, 1H), 7.65 (s, 2H), 7.22 (s, 1H), 4.68 (s, 3H), 3.89 (d, 2H, J = 5.8 Hz), 3.77 (dd, 4H, J = 5.7, 7.4 Hz), 3.58 (s, 3H), 2.31-2.27 (m, 2H), 2.16-2.13 (m, 2H), 1.51-1.49 (m, 4H). LCMS = 3.335 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 593.2 (M+H).
Figure pct00074
단계 7: 다이브로마이드 화합물 9(109㎎, 0.184m㏖) 및 IGN 단량체 화합물 10(119㎎, 0.405m㏖)을 DMF(1.84㎖) 중에 용해시켰단. 탄산칼륨(63.6㎎, 0.460m㏖)을 첨가하고 나서, 실온에서 밤새 교반시켰다. 물(20㎖)을 반응 혼합물에 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 슬러리를 실온에서 5분 동안 교반시키고 나서, 이어서, 여과시키고 진공/N2 하에서 1시간 동안 건조시켰다. 조질의 생성물을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(MeOH/CH2Cl2, 구배, 0% 내지 5%)에 의해 정제하여 화합물 11을 황색 고체(160㎎, 60% 수율, 70% 순도)로서 얻었다. LCMS = 5.240 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1019.7 (M+H).
Figure pct00075
단계 8: 다이이민 화합물 11(140㎎, 0.11m㏖)을 1,2-다이클로로에탄(1.1㎖) 중에 용해시켰다. NaBH(OAc)3(23.29㎎, 0.11m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응물을 CH2Cl2(30㎖)로 희석시키고 나서, 포화 aq NH4Cl 용액(15㎖)으로 중단시켰다. 층을 분리시키고 나서, 염수로 세척하고, Na2SO4 로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 조질의 잔사를 RPHPLC(C18 칼럼, CH3CN/H2O, 구배, 35% 내지 55%)에 의해 정제하여 백색 거품같은 고체(33㎎, 29% 수율)로서 모노 이민 화합물 12를 수득하고, 출발 물질 화합물 11을 또한 회수하였다(25㎎). LCMS = 7.091 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1021.7 (M+H).
Figure pct00076
단계 9: 메틸에스터 화합물 12(33㎎, 0.029m㏖)를 THF(1.09㎖) 및 물(364㎕) 중에 용해시켰다. LiOH(6.97㎎, 0.291m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 1.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 H2O(5㎖)로 희석시키고 나서, 0.5 M aq HCl을 이용하여 대략 pH 4까지 산성화시켰다. 수성층을 CH- 2Cl2/MeOH(3:1, 3 x 20㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후 농축시켜 조질의 화합물 13을 황색 고체(29㎎, 99% 수율)로서 얻었다. LCMS = 5.356 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1007.7 (M+H).
Figure pct00077
단계 10: CH2Cl2(2.3㎖) 중에서 실온에서 산 화합물 13(29㎎, 0.023m㏖) 및 N-하이드록시숙신아마이드(21.21㎎, 0.184m㏖)의 교반 용액에 EDC·HCl(22.08㎎, 0.115m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고 나서, 물(1 x 15㎖) 및 염수(1 x 15㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 생성물을 RPHPLC(C18 칼럼, CH3CN/H2O, 구배, 35% 내지 55%)에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 나서, 동결건조시켜 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸 페닐)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 14를 백색 거품같은 고체(8㎎, 31% 수율)로서 얻었다. LCMS = 5.867 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1104.7 (M+H).
실시예 2. (1r,4r)-2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)카바모일)사이클로헥산-카복실레이트(화합물 23)의 합성
Figure pct00078
단계 1: 아민 화합물 4(200㎎, 0.815m㏖) 및 1,4-트랜스-사이클로헥산다이카복실산 모노메틸에스터 화합물 15(182㎎, 0.978m㏖)을 DMF(2.72㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(188㎎, 0.978m㏖) 및 HOBt(125　㎎, 0.815m㏖)를 반응 혼합물, 다음에 DIEA(285㎕, 1.631m㏖)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고 나서, 포화 NH4Cl, 포화 NaHCO3, 염수, 및 물로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 끈적거리는 잔사로 농축시켰다. CH3CN(15㎖)을 잔사에 첨가하여 농축시켰다. 이를 2회 이상 반복하여 화합물 16을 건조 백색 분말(300㎎, 85% 수율)로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.16 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 8.04 (dt, 2H, J = 5.6, 14.8 Hz), 3.74-3.69 (m, 6H), 3.59 (s, 3H), 2.31-2.25 (m, 1H), 2.20-2.13 (m, 1H), 1.94-1.91 (m, 2H), 1.82-1.79 (m, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.34 (d, 3H, J = 11.7 Hz).
Figure pct00079
단계 2: TFA (1.40㎖, 18.14m㏖) 및 DI 물(67.8㎕)을 실온에서 아무것도 섞지 않은 화합물 16(300㎎, 0.726m㏖)에 첨가하고 나서, 3시간 동안 교반시켰다. CH3CN(20㎖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 농축시켰다. 이를 2회 이상 반복하여 화합물 17 백색 고체로서(230㎎, 89% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.16-8.13 (m, 1H), 8.07-8.01 (m, 2H), 3.76-3.73 (m, 4H), 3.70 (bd, 2H, J　= 5.1 Hz), 3.59 (s, 3H), 2.31-2.25 (m, 1H), 2.19-2.14 (m, 1H), 1.94-1.91 (m, 2H), 1.82-1.79 (m, 2H), 1.42-1.26 (m, 4H).
Figure pct00080
단계 3: 아닐린 화합물 7(135㎎, 0.881m㏖) 및 산 화합물 17(331　㎎, 0.925m㏖)을 실온에서 CH2Cl2/MeOH(2.9㎖/1.5㎖) 중에서 현탁시켰다. EEDQ(436㎎, 1.763m㏖)를 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 용매를 농축시키고 나서, 잔사를 EtOAc(15㎖) 중에서 슬러리화하고, 여과시켰다. 고체를 EtOAc(2 x 15㎖)로 세척하고 나서 진공/N2 하에 건조시켜 화합물 18 백색 고체로서(330㎎, 61% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.73 (s, 1H), 8.18 (dt, 2H, J = 6.0, 19.2 Hz), 8.09-8.01 (m, 2H), 7.45 (s, 2H), 6.96 (s, 1H), 5.17 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 4.45 (d, 4H, J = 5.6 Hz), 3.88-3.84 (m, 3H), 3.77-3.69 (m, 8H), 3.63 (s, 2H), 3.59 (s, 6H), 2.30-2.22 (m, 2H), 2.19-2.13 (m, 2H), 1.94-1.90 (m, 4H), 1.82-1.78 )m, 4H), 1.41-1.26 (m, 8H).
Figure pct00081
단계 4: 화합물 18(330㎎, 0.536m㏖) 및 CBr4(533㎎, 1.608m㏖)를 DMF(5.36㎖) 중에 용해시켰다. PPh3(422㎎, 1.608m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하였는데, 이때에 반응물은 약간의 발열과 함께 황색으로 변하였다. 반응물을 Ar 하에 4시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고 나서, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(MeOH/CH2Cl2, 구배, 0% 내지 10%)에 의해 정제하여 화합물 19 백색 고체로서(234㎎, 64% 수율)을 얻었다. LCMS = 4.453 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 617.10 (M+H).
Figure pct00082
단계 5: 화합물 20을 실시예 1에서 화합물 11과 유사하게 제조하였다. 화합물 20을 정제 후 황색 고체로서 얻었다(264㎎, 60% 수율). LCMS = 4.831 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1045.20 (M+H).
Figure pct00083
단계 6: 화합물 21을 실시예 1의 화합물 12와 유사하게 제조하였다. 화합물 21을 C18 정제 후 백색 고체로서 얻었다(51㎎, 31% 수율). LCMS = 5.127 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1047.30 (M+H).
Figure pct00084
단계 7: 메틸에스터 화합물 21(48㎎, 0.046m㏖)을 1,2-다이클로로에탄(3.06㎖) 중에 용해시켰다. 트라이메틸스탄올(124㎎, 0.688m㏖)을 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 80℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 실온에서 냉각시키고 나서 물(15㎖)로 희석시켰다. 수성층을 1 M HCl을 이용하여 대략 pH 4로 산성화시켰다. 혼합물을 CH2Cl2/MeOH(10:1, 3 x 20㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고 나서, Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔의 짧은 패드를 통해 플러깅하고 나서, CH2Cl2/MeOH(10:1, 이어서, 5:1, 2 x 30㎖)로 플러슁하고 나서, 농축시켰다. 산 화합물 22을 황색 고체로서 얻었고, 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다(48㎎, 100% 수율). LCMS = 5.338 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1033.7 (M+H).
Figure pct00085
단계 8: 화합물 23을 실시예 1의 화합물 13과 유사하게 제조하였다. (1r,4r)-2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)아미노)-2-옥소에틸) 아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)카바모일)사이클로헥산카복실레이트, C18 정제 후에 화합물 23을 백색 고체로서 얻었다(8㎎, 19% 수율). LCMS = 6.007 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1130.8 (M+H).
실시예 3. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12, 12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트(화합물 35)의 합성
Figure pct00086
단계 1: Z-Val-OH 화합물 24(3.0 g, 11.94m㏖) 및 L-Ala-OtBu 화합물 25 (1.907 g, 13.13m㏖)를 DMF(23.88㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(2.52 g, 13.13m㏖) 및 HOBt(2.011 g, 13.13m㏖)를 반응 혼합물에 첨가한 다음, DIEA(4.59㎖, 26.3m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 반응물을 실온에서 밤새 Ar 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고 나서, 포화 NaHCO3 포화 NH4Cl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 구배, 0% 내지 50%)에 의해 정제하여 화합물 26을 백색 고체로서 얻었다(3.68 g, 81% 수율). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.39-7.29 (m, 5H), 6.29 (bd, 1H, J = 6.9 Hz), 5.34 (bd, 1H, J = 8.4 Hz), 5.11 (s, 2H), 4.45 (p, 1H, J = 7.2 Hz), 4.02-3.98 (m, 1H), 2.18-2.09 (m, 1H), 1.56 (s, 9H), 1.37 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 0.98 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.93 (d, 3H, J = 6.8 Hz). LCMS = 5.571 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 323.25 (M-tBu+H).
Figure pct00087
단계 2: 화합물 26(3.68 g, 9.72m㏖)을 MeOH(30.9㎖) 및 물(1.543㎖) 중에 용해시켰다. 용액을 Ar으로 퍼지하고 나서 5분 동안 탈기시켰다. Pd/C(10%, 습윤, 0.517 g)을 반응 혼합물에 서서히 첨가하였다. 이어서, H2를 잠깐 동안 버블링시켰다. 버블링을 중단하고 나서, 이어서, 반응물을 H2 벌륜(balloon) 하에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, 필터 케이크를 MeOH(30㎖)로 세척하고, 농축시켜 화합물 27을 백색 고체로서 얻었다(2.35 g, 99% 수율). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.79-7.77 (m, 1H), 4.50 (p, 1H, J = 7.3 Hz), 3.27 (d, 1H, J = 3.9 Hz), 2.34-2.26 (m, 1H), 1.49 (s, 9H), 1.40 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 1.01 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 0.86 (d, 3H, J = 6.9 Hz).
Figure pct00088
단계 3: 아민 화합물 27(2.35 g, 9.62m㏖) 및 모노 메틸아디페이트(1.69　g, 10.58m㏖)를 DMF(32.1㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(1.94 g, 10.10m㏖) 및 HOBt(1.47 g, 9.62m㏖)를 반응 혼합물에 첨가한 다음, DIEA(3.36㎖, 19.24m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM/MeOH(20㎖, 5:1)로 희석시키고 나서, 포화 NH4Cl, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 생성물을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 구배, 0% 내지 50%)에 의해 정제하여 화합물 28 백색 고체로서 얻었다(2.77 g, 75% 수율). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.29 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 6.12 (d, 1H, J = 8.6　Hz), 4.43(p, 1H, J = 7.2 Hz), 4.27 (dd, 1H, J = 6.4, 8.6 Hz), 3.66 (s, 3H), 2.35-2.31 (m, 2H), 2.26-2.23 (m, 2H), 2.12-2.03 (m, 1H), 1.70-1.63 (m, 4H), 1.46 (s, 9H), 1.36 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 0.95 (분명한 t, 6H, J = 6.6 Hz).
Figure pct00089
단계 4: TFA(8.28㎖, 108.0m㏖) 및 물(0.56㎖)을 아무것도 섞지 않은 화합물 28(2.77 g, 7.17m㏖)에 실온에서 첨가하고 나서, 2.5시간 동안 교반시켰다. CH3CN (30㎖) 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 농축시켰다. 이를 2회 이상 반복하여 화합물 29를 연한 황색 고체를 얻었다(2.0 g, 84% 수율). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (bs, 1H), 7.29 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.14 (d, 1H, 6.8 Hz), 4.58 (p, 1H, J = 7.1 Hz), 4.37 (t, 1H, J = 8.7 Hz), 3.68 (s, 3H), 2.37-2.32 (m, 4H), 2.03-1.99 (m, 2H), 1.69-1.63 (m, 4H), 1.49 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 0.97 (d, 3H, J = 4.8 Hz), 0.96 (d, 3H, J = 4.8 Hz).
Figure pct00090
단계 5: 아닐린 화합물 7(150㎎, 0.98m㏖) 및 산 화합물 29(340　㎎, 1.03m㏖)를 실온에서 CH2Cl2/MeOH(3.26㎖, 1.62㎖) 중에서 현탁시켰다. EEDQ(484㎎, 1.96m㏖)를 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 용매를 농축시키고 나서, 잔사를 EtOAc/Et2O(15㎖, 15㎖) 중에서 슬러리화하고 나서, 여과시켰다. 고체를 Et2O(2 x 15㎖)로 세척하고 나서, 진공/N2 하에 건조시켜 화합물 30 백색 고체로서 (150㎎, 33% 수율) 얻었다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3): δ 7.61 (s, 2H), 7.47 (d, 1H, J = 7.1 Hz), 7.14 (s, 1H), 6.64 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 4.82-4.75 (m, 1H), 4.45-4.40 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 2.36-2.27 (m, 4H), 2.16-2.07 (m, 1H), 1.68-1.59 (m, 4H), 1.47 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 0.98 (d, 3H, J = 3.6 Hz), 0.95 (d, 3H, J = 4.8 Hz). LCMS = 3.073 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 466.25 (M+H).
Figure pct00091
단계 6: 다이올 화합물 30(150㎎, 0.322m㏖) 및 CBr4(321㎎, 0.967m㏖)를 DMF(3222 ㎕) 중에 용해시켰다. PPh3(254㎎, 0.967m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하였는데, 이 때에 반응물은 약간 발열되면서 적분홍색으로 바뀌었다. 반응물을 Ar 하에 4시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석시키고 나서, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/헥산s, 구배, 0% 내지 100%)에 의해 정제하여 화합물 31 회백색 고체로서 얻었다(473㎎, 75% 수율). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.19 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 7.85 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.64 (s, 2H), 7.21 (s, 1H), 4.68 (s, 3H), 4.37 (p, 1H, J = 7.0 Hz), 4.18 (dd, 1H, J = 7.2, 8.4 Hz), 3.58 (s, 3H), 2.32-2.29 (m, 2H), 2.33-2.12 (m, 2H), 2.01-1.91 (m, 1H), 1.53-1.49 (m, 4H), 1.31 (d, 3H, J = 7.1 Hz), 0.89 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 0.85 (d, 3H, J = 6.8 Hz). LCMS = 5.259 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 592.05 (M+H).
Figure pct00092
단계 7: 화합물 32를 실시예 1에서 화합물 11과 유사하게 제조하였다. 화합물 32를 정제 후에 황색 고체로서 얻었다(162㎎, 57% 수율, 70% 순도). LCMS = 6.461 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1018.7 (M+H).
Figure pct00093
단계 8: 화합물 33을 실시예 1의 화합물 12와 유사하게 제조하였다. 화합물 33을 C18 정제 후에 백색 고체로서 얻었다(40㎎, 31% 수율). LCMS = 5.528 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1020.30 (M+H).
Figure pct00094
단계 9: 화합물 34를 실시예 2의 화합물 22와 유사하게 제조하였다. 화합물 34를 실리카 플러그 후에 황색 고체로서 얻었다(38㎎, 100% 수율). LCMS = 5.211 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1006.35 (M+H).
Figure pct00095
단계 10: 화합물 35를 실시예 1의 화합물 14와 유사하게 제조하였다. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12, 12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 35를 C18 정제 후에 백색 고체로서 얻었다(8㎎, 20% 수율). LCMS = 7.031 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1103.7 (M+H).
실시예 4. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 2-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)-3,6,9,12-테트라옥소-2,5,8,11-테트라아자헵타데칸-17-오에이트(화합물 49)의 합성
Figure pct00096
단계 1: (5-아미노-1,3-페닐렌)다이메탄올 화합물 7(5.0 g, 32.6m㏖)을 THF(65.3㎖) 중에서 용해시켰다. TBSCl(12.30 g, 82m㏖) 및 이미다졸(6.67 g, 98m㏖)을 첨가하고 나서, 실온에서 밤새 Ar 하에 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 나서, 포화 NH4Cl 및 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 구배, 0% 내지 30%)에 의해 정제하여 황색 오일로서 화합물 37(13 g, 100% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.71 (s, 1H), 6.60 (s, 2H), 4.65 (s, 4H), 0.94 (s, 18 H), 0.10 (s, 12 H).
Figure pct00097
단계 2: DMF(52.4㎖) 중의 아닐린 화합물 37(10 g, 26.2m㏖)의 교반 용액에 Cs2CO3(8.54 g, 26.2m㏖)을 첨가하였다. 메틸요오드화물(1.474㎖, 23.58m㏖)을 첨가하고 나서 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 물(10㎖) 및 EtOAc (30㎖)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 층을 분리시키고 나서 EtOAc로 추출하였다(2x). 유기층을 물로 세척하고 나서(4x), Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 구배, 0% 내지 10%)에 의해 정제하여 목적으로 하는 모노-메틸화된 생성물 화합물 38(3.8 g, 37% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.63 (s, 1H), 6.52 (s, 2H), 4.67 (s, 4H), 2.84 (s, 3H), 0.94 (s, 18H), 0.10 (s, 12H).
Figure pct00098
단계 3: 아닐린 화합물 38(1.0 g, 2.53m㏖) 및 Z-Gly-OH(0.582 g, 2.78m㏖)을 DMF(8.42㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(1.21 g, 6.32m㏖) 및 DMAP(340㎎, 2.78m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 80℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 나서, 포화 NaHCO3 및 물(2x)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 구배, 0% 내지 30% 내지 100%)에 의해 정제하여 황색의 끈적이는 고체로서 화합물 39(780㎎, 53% 수율)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.27 (m, 6H), 6.90 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 4.62 (s, 4H), 3.58 (s, 2H), 3.16 (s. 3H), 0.83 (s, 18H), 0.00 (s, 12 H).
Figure pct00099
단계 4: 화합물 39(1.26 g, 2.147m㏖)를 MeOH(6.82㎖) 및 THF(6.8㎖) 중에 용해시키고 나서, 용액을 N2로 퍼지하였다. Pd/C(10%, 0.228 g, 0.215m㏖)를 첨가하고 나서, H2를 몇 분 동안 버블링하였다. 반응물을 H2 벌륜 하에 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, MeOH로 세척하고 나서, 농축시켜 순수한 화합물 40(1 g, 100% 수율)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.41-7.30 (m, 2H), 7.27-7.21 (m, 1H), 7.06 (s, 2H), 4.65 (s, 4H), 3.23 (s, 3H), 3.12 (s, 2H), 0.82 (s, 18H), 0.00 (s, 12H).
Figure pct00100
단계 5: 아민 화합물 40(1.0 g, 1.988m㏖) 및 Z-Gly-Gly-Gly-OH(662　㎎, 2.385m㏖)를 DMF(6.63㎖) 중에서 용해시켰다. EDC·HCl (457㎎, 2.385m㏖) 및 HOBT (304㎎, 1.988m㏖)를 반응 혼합물에 첨가한 다음, DIEA(694㎕, 3.98m㏖)에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 나서, 포화 NaHCO3, 염수 및 물로 세척하였다(2x). 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(MeOH/DCM, 구배, 0% 내지 10%)에 의해 정제하여 백색의 끈적거리는 거품으로서 화합물 41(994㎎, 71% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400　MHz, CDCl3): δ 7.38-7.32 (m, 7H), 7.31-7.27 (m, 2H), 7.01 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 4.74 (s, 4H), 3.97 (d, 2H, J = 4.6 Hz), 3.92 (d, 2H, J = 5.3 Hz), 3.74 (d, 2H, J = 3.7 Hz), 3.27 (s, 3H), 0.94 (s, 18H), 0.11 (s, 12H).
Figure pct00101
단계 6: 화합물 41(994㎎, 1.418m㏖)을 MeOH(6.65㎖) 및 물(443㎕) 중에서 현탁시키고 나서, N2로 퍼지시켰다. Pd/C(10% 습윤, 302㎎, 0.284m㏖)을 첨가하고 나서, H2를 몇 분 동안 버블링시켰다. 반응물을 H2 벌륜 하에서 밤새 교반시켰다. 용액을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서 MeOH로 세척하였고 농축시켜 순수한 화합물 42(725㎎, 90% 수율)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.10-7.97 (m, 1H), 7.91-7.85 (m, 1H), 7.31-7.23 (m, 1H), 7.05 (s, 2H), 7.65 (s, 4H), 3.68-3.62 (m, 2H), 3.56-3.45 (m, 1H), 3.09 (s, 3H), 3.08-3.06 (m, 2H), 3.06-3.03 (m, 2H), 0.82 (s, 18H), 0.00 (s, 12H). LCMS = 5.574 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 567.30 (M+H).
Figure pct00102
단계 7: 아민 화합물 42(725㎎, 1.279m㏖) 및 모노 메틸아디페이트(246㎎, 1.535m㏖)를 DMF(6.5㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(294㎎, 1.535m㏖) 및 HOBt(196㎎, 1.279m㏖)를 반응 혼합물에 첨가한 후에, DIEA(447㎕, 2.56m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM(20㎖)으로 희석시키고 나서, 포화 NH4Cl, 포화 NaHCO3, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 생성물을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(MeOH/DCM, 구배, 0% 내지 10%)에 의해 정제하여 화합물 43(425㎎, 33% 수율)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.30 (s, 1H), 7.01 (s, 2H), 6.89-6.85 (m, 1H), 6.75-6.72 (m, 1H), 6.41-6.40 (m, 1H), 4.73 (s, 4H), 3.98-3.96 (m, 4H), 3.74 (bd, 2H, J = 3.5 Hz), 3.66 (s, 3H), 3.27 (s, 3H), 2.33 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.28 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 0.94 (s, 18H), 0.11 (s, 12H). LCMS = 7.709 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 709.35 (M+H).
Figure pct00103
단계 8: 화합물 43(422㎎, 0.417m㏖)을 THF(1.89㎖) 및 물(189㎕) 중에서 용해시켰다. HCl(수성, 5 M)(833㎕, 4.17m㏖)을 첨가하고 나서 반응물을 실온에서 2.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 농축시키고 나서. ACN(대략 15㎖)를 잔사에 첨가하여 농축시켰다. 이를 2회 초과로 반복하여 화합물 44 백색 거품으로서 (200㎎, 100% 수율)를 얻었다. LCMS = 0.389 분(8분 방법). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.09-8.04 (m, 2H), 7.93-7.90 (m, 1H), 7.30 (bs, 1H), 7.14 (s, 2H), 4.52 (s, 4H), 3.71-3.68 (m, 4H), 3.58 (s, 3H), 3.17 (bs, 3H), 2.22-2.18 (m, 2H), 2.15-2.12 (m, 2H), 1.53-1.47 (m, 4H).
Figure pct00104
단계 9: 다이올 화합물 44(110㎎, 0.229m㏖) 및 CBr4(228㎎, 0.687m㏖)를 DMF(2.29㎖) 중에 용해시켰다. PPh3 (180㎎, 0.687m㏖) 반응 혼합물에 첨가하였는데, 이 시점에 반응물은 약간의 발열과 함께 적분홍색으로 바뀌었다. 반응물을 Ar 하에 6시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 CH2Cl2/MeOH(10:1)로 희석시키고 나서, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(MeOH/CH2Cl2, 구배, 0% 내지 10%)에 의해 정제하여 화합물 45(30㎎, 22% 수율)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.46 (bs, 1H), 7.32-7.26 (m, 2H), 7.26-7.19 (m, 2H), 6.89-6.85 (m, 1H), 4.60 (d, 2H, J = 3.6 Hz), 4.48 (d, 2H, J = 3.9 Hz), 3.98 (d, 4H, J = 5.1 Hz), 3.76 (bs, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.30 (bs, 3H), 2.34 (bt, 2H, J = 6.7 Hz), 2.30 (bt, 2H, J = 6.6 Hz), 1.70-1.64 (m, 4H). LCMS = 4.326 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 605.10 (M+H).
Figure pct00105
단계 10: 화합물 46을 실시예 1의 화합물 11과 유사하게 제조하였다. 화합물 46을 정제 후에 황색 고체로서 얻었다(40㎎, 59% 수율). LCMS = 4.751 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1033.35 (M+H).
Figure pct00106
단계 11: 화합물 47을 실시예 1의 화합물 12와 유사하게 제조하였다. 화합물 47을 C18 정제 후에 백색 고체로서 얻었다(14㎎, 32% 수율). LCMS = 5.857 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1035.7 (M+H).
Figure pct00107
단계 12: 화합물 48을 실시예 2의 화합물 22와 유사하게 제조하였다. 화합물 48을 실리카 플러그 후에 황색 고체로서 얻었다(7㎎, 100% 수율). LCMS = 4.817 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1021.35 (M+H).
Figure pct00108
단계 13: 화합물 49를 실시예 1의 화합물 14와 유사하게 제조하였다. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 2-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4] 다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)-3,6,9,12-테트라옥소-2,5,8,11-테트라아자헵타데칸-17-오에이트, 화합물 49를 C18 정제 후에 백색 고체로서 얻었다(6.5㎎, 74% 수율). LCMS = 5.805 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1118.7 (M+H).
실시예 5. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트(화합물 80)의 합성
Figure pct00109
단계 1: (S)-2-(((벤질옥시)카본일)아미노)프로판온산(5 g, 22.40m㏖) 및 (R)-tert-뷰틸 2-아미노프로파노에이트 하이드로클로라이드(4.48 g, 24.64m㏖)를 무수 DMF(44.8㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(4.72 g, 24.64m㏖), HOBt(3.43 g, 22.40m㏖), 및 이어서, DIPEA(9.75㎖, 56.0m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 아르곤 하에 실온에서, 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 다이클로로메탄으로 희석시키고, 이어서, 포화 염화암모늄, 포화 중탄산나트륨, 물, 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켰다. 조질의 오일을 실리카겔 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 화합물 71(5.6 g, 71% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.39-7.34 (m, 5H), 6.54 (s, 1H) 5.28 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.47-4.43 (m, 1H), 4.48 (s, 1H), 1.49 (s, 9H), 1.42-1.37 (m, 6H).
Figure pct00110
단계 2: 화합물 71(5.6 g, 15.98m㏖)을 메탄올(50.7㎖) 및 물(2.54㎖) 중에서 용해시켰다. 용액을 5분 동안 아르곤으로 퍼지하였다. 탄소 상 팔라듐(습윤, 10%)(0.850 g, 0.799m㏖)을 서서히 첨가하였다. 반응물을 밤새 수소 분위기 하에 교반시켰다. 용액을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, 메탄올로 린스하고 나서, 농축시켰다. 잔사를 메탄올 및 아세토나이트릴과 공비 혼합하고 나서, 얻어진 오일을 고진공 상에 직접 두어서 화합물 72(3.57 g, 100% 수율)를 제공하여, 다음 단계에서 직접 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.67 (s, 1H), 4.49-4.42 (m, 1H), 3.54-3.49 (m, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.40 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.36 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
Figure pct00111
단계 3: 화합물 72 (3.57 g, 16.51m㏖) 및 모노 메틸아디페이트(2.69㎖, 18.16m㏖)를 무수 DMF(55.0㎖) 중에서 용해시켰다. EDC·HCl(3.48 g, 18.16m㏖) 및 HOBt((2.53 g, 16.51m㏖)를 첨가한 다음에, DIPEA(5.77㎖, 33.0m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 반응물을 다이클로로메탄/메탄올(80㎖, 5:1)로 희석시키고 나서, 포화 염화암모늄, 포화 중탄산나트륨, 및 염수로 세척하였다. 이를 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 스트리핑하였다. 화합물을 아세토나이트릴과 공비혼합하고(5x), 이어서, 고진공 상에서 35℃에서 펌핑하여 화합물 73(5.91 g, 100% 수율)을 제공하였다. 조질의 물질을 정제 없이 다음 단계에 대해 취하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.67 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.22 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 4.56-4.49 (m, 1H), 4.46-4.38 (m, 1H), 3.68 (s, 3H), 2.37-2.33 (m, 2H), 2.27-2.24 (m, 2H), 1.70 -1.68 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.40 (s, 3H), 1.38 (s, 3H).
Figure pct00112
단계 4: 화합물 73(5.91 g, 16.5m㏖)을 TFA(25.4㎖, 330m㏖) 및 탈이온수(1.3㎖) 중에서 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 아세토나이트릴과 함께 농축시키고 나서, 고진공 상에 두어서 건조시켜 조질의 화합물 74(4.99 g, 100% 수율)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.44 (d, 1H, J = 7.2 Hz,), 6.97 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 4.81-4.73 (m, 1H), 4.59-4.51 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.39-2.32 (m, 2H), 2.31-2.23 (m, 2H), 1.70-1.61 (m, 4H), 1.48(d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.40 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
Figure pct00113
단계 5: 화합물 74(4.8 g, 15.88m㏖)를 무수 다이클로로메탄(101㎖) 및 무수 메탄올(50.4㎖) 중에서 용해시켰다. (5-아미노-1,3-페닐렌)다이메탄올(2.316 g, 15.12m㏖) 및 EEDQ(7.48 g, 30.2m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서, 밤새 교반시켰다. 용매를 스트리핑하고 나서, 조질의 물질을 실리카겔 크로마토그래피(다이클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 화합물 75(1.65 g, 25% 수율)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.68 (s, 1H), 8.29 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 8.11 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 7.52 (s, 2H), 6.97 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 4.45 (s, 4H), 4.39-4.32 (m, 1H), 4.28-4.21 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 2.30-2.27 (m, 2H), 2.17-2.13 (m, 2H), 1.54-1.45 (m, 4H) 1.30 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.20 (d, 3H, J = 7.2 Hz). MS (m/z): 460.2 (M + Na)+.
Figure pct00114
단계 6: 화합물 75(0.486 g, 1.111m㏖) 및 사브롬화탄소(1.105 g, 3.33m㏖)를 무수 DMF(11.11㎖) 중에 용해시켰다. 트라이페닐포스핀(0.874　g, 3.33m㏖)을 첨가하고 나서 반응물을 아르곤 하에 4시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM/MeOH(10:1)로 희석시키고 나서, 물 및 염수로 세척하였다. 이를 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 물질을 실리카겔 크로마토그래피(DCM/MeOH)에 의해 정제하여 화합물 76(250㎎, 40% 수율)을 제공하였다.1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.82 (s, 1H), 8.38 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 8.17 (d, 1H, J = 6.0 Hz), 7.76 (s, 2H), 7.22 (s, 1H), 4.66 (s, 4H), 4.38-4.31 (m, 1H), 4.25-4.19 (m, 1H), 3.56 (s, 3H), 2.30-2.27 (m, 2H), 2.18-2.15 (m, 2H), 1.53-1.51 (m, 4H), 1.32 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.21 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
Figure pct00115
단계 7: 화합물 77을 실시예 1의 11과 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 실리카겔 크로마토그래피(다이클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 화합물 77(340㎎, 60% 수율, 77% 순도)을 제공하였다. LCMS = 5.87 분(15분 방법). MS (m/z): 990.6 (M + 1)+.
Figure pct00116
단계 8: 화합물 78을 실시예 1의 12와 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 RPHPLC(C18 칼럼, 아세토나이트릴/물)를 통해 정제하여 화합물 78(103㎎, 30% 수율)을 제공하였다. LCMS = 6.65 분(15분 방법). MS (m/z): 992.7 (M + 1)+.
Figure pct00117
단계 9: 화합물 78을 실시예 2의 22와 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 실리카 플러그를 통과시켜 화합물 79(38㎎, 55% 수율, 75% 순도)를 제공하였다. LCMS = 5.83 분(15분 방법). MS (m/z): 978.6 (M + 1)+.
Figure pct00118
단계 10: 화합물 80을 실시예 1의 14와 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 RPHPLC(C18 칼럼, 아세토나이트릴/물)를 통해 정제시켜 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 80(6.5㎎, 30% 수율)을 제공하였다. LCMS = 6.53 분(15분 방법). MS (m/z): 1075.7 (M + 1)+ 및 1097.7(M + Na)+.
실시예 6. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 90의 합성
Figure pct00119
단계 1: (S)-2-(((벤질옥시)카본일)아미노)프로판온산(5 g, 22.40m㏖) 및 (S)-tert-뷰틸 2-아미노프로파노에이트 하이드로클로라이드(4.48 g, 24.64m㏖)를 무수 DMF(44.8㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(4.72 g, 24.64m㏖), HOBt(3.43 g, 22.40m㏖), 및 DIPEA(9.75㎖, 56.0m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 아르곤 하에, 실온에서, 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 다이클로로메탄으로 희석시키고 나서, 포화 염화암모늄, 포화 중탄산나트륨, 물, 및 염수로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 농축시켰다. 조질의 오일을 실리카겔 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 화합물 81(6.7 g, 85% 수율)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.38-7.31 (m, 5H), 6.53-6.42 (m, 1H), 5.42-5.33 (m, 1H), 5.14 (s, 2H), 4.48-4.41 (m, 1H), 4.32-4.20 (m, 1H), 1.49 (s, 9H), 1.42 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 1.38 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
Figure pct00120
단계 2: 화합물 81(6.7 g, 19.12m㏖)을 메탄올(60.7㎖) 및 물(3.03㎖) 중에서 용해시켰다. 용액을 아르곤과 함께 5분 동안 퍼지시켰다. 탄소 상 팔라듐 (습윤, 10%)(1.017 g, 0.956m㏖)을 서서히 첨가하였다. 반응물을 밤새 수소 분위기 하에 교반시켰다. 용액을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, 메탄올로 린스하고 나서, 농축시켰다. 메탄올 및 아세토나이트릴과 함께 공비혼합하고 나서, 얻어진 오일을 고진공 상에 직접 두어서 화합물 82(4.02 g, 97% 수율)를 제공하고, 다음 단계에서 직접 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.78-7.63 (m, 1H), 4.49-4.42 (m, 1H), 3.55-3.50 (m, 1H), 1.73 (s, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.39 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.36 (d, 3H, J = 6.8 Hz).
Figure pct00121
단계 3: 화합물 82(4.02 g, 18.59m㏖) 및 모노 메틸아디페이트(3.03㎖, 20.45m㏖)를 무수 DMF(62.0㎖) 중에서 용해시켰다. EDC·HCl(3.92 g, 20.45m㏖), HOBt(2.85 g, 18.59m㏖) 및 DIPEA(6.49㎖, 37.2m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 반응물을 다이클로로메탄/메탄올(150㎖, 5:1)로 희석시키고 나서, 포화 염화암모늄, 포화 중탄산나트륨, 및 염수로 세척하였다. 이를 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 스트리핑하였다. 화합물을 아세토나이트릴과 공비혼합하고(5x), 이어서, 고진공 상에서 35℃에서 펌핑하여 화합물 83(6.66 g, 100% 수율)을 제공하였다. 조질의 물질을 정제 없이 다음 단계에 대해 취하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.75 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.44 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 4.52-4.44 (m, 1H), 4.43-4.36 (m, 1H), 3.65 (s, 3H), 2.35-2.29 (m, 2H), 2.25-2.18 (m, 2H), 1.71-1.60 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.36 (t, 6H, J = 6.0 Hz).
Figure pct00122
단계 4: 화합물 83(5.91 g, 16.5m㏖)을 TFA(28.6㎖, 372m㏖) 및 탈이온수(1.5㎖) 중에서 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 아세토나이트릴과 함께 농축시키고 나서 고진공 상에 두어서 조질의 화합물 84를 끈적거리는 고체로서 (5.88 g, 100% 수율) 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.21 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 4.69-4.60 (m, 1H), 4.59-4.51 (m, 1H), 3.69 (s, 3H), 2.40-2.33 (m, 2H), 2.31-2.24 (m, 2H), 1.72-1.63 (m, 4H), 1.51-1.45 (m, 3H), 1.42-1.37 (m, 3H).
Figure pct00123
단계 5: 화합물 84(5.6 g, 18.52m㏖)를 무수 다이클로로메탄(118㎖) 및 무수 메탄올(58.8㎖) 중에 용해시켰다. (5-아미노-1,3-페닐렌)다이메탄올(2.70 g, 17.64m㏖) 및 EEDQ(8.72 g, 35.3m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서, 밤새 교반시켰다. 용매를 스트리핑하고 나서, 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 얻어진 슬러리를 여과 후, 에틸 아세테이트로 세척하고 나서 진공/N2 하에 건조시켜 화합물 85(2.79 g, 36% 수율)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.82 (s, 1H), 8.05, (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.01 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 7.46 (s, 2H), 6.95 (3, 1H), 5.21-5.12 (m, 2H), 4.47-4.42 (m, 4H), 4.40-4.33 (m, 1H), 4.33-4.24 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 2.33-2.26 (m, 2H), 2.16-2.09 (m, 2H), 1.54-1.46 (m, 4H), 1.30 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.22 (d, 3H, J = 4.4 Hz).
Figure pct00124
단계 6: 화합물 85 (0.52 g, 1.189m㏖) 및 사브롬화탄소(1.183 g, 3.57m㏖)를 무수 DMF(11.89㎖) 중에 용해시켰다. 트라이페닐포스핀(0.935 g, 3.57m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 아르곤 하에 4시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 DCM/MeOH(10:1)로 희석시키고 나서, 물 및 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 물질을 실리카겔 크로마토그래피(DCM/MeOH)에 의해 정제하여 화합물 86(262㎎, 39% 수율)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.01 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 8.03 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.67 (s, 2H), 7.21 (s, 1H), 4.70-4.64 (m, 4H), 4.40-4.32 (m, 1H), 4.31-4.23 (m, 1H), 3.58 (s, 3H), 2.34-2.26 (m, 2H), 2.18-2.10 (m, 2H), 1.55-1.45 (m, 4H), 1.31 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.21 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
Figure pct00125
단계 7: 화합물 87을 실시예 1에서 화합물 11과 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 실리카겔 크로마토그래피(다이클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 화합물 87(336㎎, 74% 수율)을 제공하였다. LCMS = 5.91 분(15분 방법). MS (m/z): 990.6 (M + 1)+.
Figure pct00126
단계 8: 화합물 88을 실시예 1의 화합물 12와 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 RPHPLC(C18 칼럼, 아세토나이트릴/물)를 통해 정제하여 화합물 88(85.5㎎, 25% 수율)을 제공하였다. LCMS =6.64 분(15분 방법). MS (m/z): 992.6 (M + 1)+.
Figure pct00127
단계 9: 화합물 88을 실시예 2의 화합물 22와 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 실리카 플러그를 통과시켜 화합물 89(48.8㎎, 80% 수율)를 제공하였다. LCMS = 5.89 분(15분 방법). MS (m/z): 978.6 (M + 1)+.
Figure pct00128
단계 10: 화합물 90을 실시예 1의 화합물 14와 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 RPHPLC(C18 칼럼, 아세토나이트릴/물)를 통해 정제하여 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((R)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸) 페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노) -1-옥소프로판-2-일)아미노)-6-옥소헥사노에이트, 화합물 90(8.2㎎, 30% 수율)을 제공하였다. LCMS = 6.64 분(15분 방법). MS (m/z): 1075.4 (M + 1)+.
실시예 7. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 1-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)-1,4,7,10-테트라옥소-2,5,8,11-테트라아자테트라데칸-14-오에이트(화합물 63)의 합성
Figure pct00129
단계 1: Z-Gly-Gly-GlyOH 화합물 50 (1.0 g, 3.09m㏖) 및 β-알라닌 메틸에스터·HCl(453㎎, 3.25m㏖)을 DMF(12.37㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(623㎎, 3.25m㏖) 및 HOBt(497㎎, 3.25m㏖)를 반응 혼합물에 첨가하고 나서, DIEA(1.08㎖, 6.19m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 다음날, 다수의 백색 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 CH2Cl2/MeOH(5:1, 30㎖)로 희석시키고 나서, 포화 NaHCO3, 포화 NH4Cl 및 염수로 세척하였다. 유기층은 혼탁하게 되었다. EtOAc(15㎖)를 유기층에 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 혼합물을 여과 후, 고체를 물(10㎖) 및 CH3CN(2 x 15㎖)으로 세척하여 순수한 화합물 51을 정제 없이 백색 분말(880㎎, 70% 수율)로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.16 (bt, 1H, J = 5.4 Hz), 8.11 (bt, 1H, J = 5.6 Hz), 7.88-7.85 (m, 1H), 7.49 (bt, 1H, J = 5.5 Hz), 7.40-7.31 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 3.74 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 3.67 (t, 4H, J = 6.2 Hz), 3.60 (s, 3H), 3.29 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 2.47 (t, 3H, J = 6.9 Hz).
Figure pct00130
단계 2: 화합물 51(876㎎, 2.145m㏖)을 MeOH(20.4㎖) 및 물(1.02㎖) 중에 용해시키고, Ar으로 퍼지하고 나서. 용액을 5분 동안 탈기시켰다. Pd/C(10%, 50% 물로 습윤, 228㎎)을 서서히 첨가하였다. H2를 벌륜을 통해 잠깐 동안 버블링시켰다. 반응물을 H2 벌륜 하에서 밤새 교반시켰다. H2O(대략 3㎖)을 반응 혼합물에 첨가하여 형성된 모든 백색 고체를 용해시켰다. 이어서, 용액을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서, 필터 케이크를 MeOH(30㎖)로 세척하였고 농축시켰다. 잔사를 CH3CN(20㎖) 중에서 용해시키고 나서, 농축시켰다. 이를 2회 이상 반복하였다. 얻어진 고무질 고체를 CH3CN(대략 15㎖)의 첨가에 의해 침전시켰다. 걸쭉한 백색 슬러리를 10분 동안 교반시키고, 여과 후, CH3CN을 이용하여 세척하였다. 고체를 진공/N2 하에서 1.5시간 동안 건조시켜 화합물 52를 백색 고체로서 (450㎎, 76% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.18-8.12 (m, 2H), 7.88 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 3.75 (s, 2H), 3.65 (d, 2H, J = 5.9 Hz), 3.6 (s, 3H), 3.33-3.27 (m, 4H), 2.47 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 1.94 (bs, 1H).
Figure pct00131
단계 3: NaOH(1.665 g, 41.6m㏖)을 MeOH(66.1㎖) 및 물(13.22㎖) 중에서 트라이메틸 벤젠-1,3,5-트라이카복실레이트 화합물 53(5 g, 19.82m㏖)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 Ar 하에 3시간 동안 환류시켰다. 백색 침전물의 로트가 형성되었다. 용액을 실온에서 냉각시키고 나서, 고체가 용해될 때까지 H2O로 희석시켰다. 혼합물을 수성 5 N HCl을 이용하여 pH 대략 2 내지 3으로 산성화시키고, EtOAc로 추축하고 나서(3x), Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 생성물을 뜨거운 EtOAc(50㎖) 중에 용해시키고, 실온에서 서서히 냉각시켰다. 침전물을 여과시켰다(침전물은 부산물이었고, 생성물이 아님). 모액을 농축시켜 화합물 54를 백색 고체로서 (3.45 g, 78% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13.62 (bs, 2H), 8.65 (s, 3H), 3.93 (s, 3H). LCMS = 3.209 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 244.90 (M+H).
Figure pct00132
단계 4: 2산 화합물 54(1.0 g, 4.46m㏖)를 THF(17.84㎖) 중에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시키고, BH3·DMS(THF 중의 2 M)(8.92㎖, 17.84m㏖)을 Ar 하에서 서서히 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 5분 동안 교반시키고, 이어서, 실온으로 가온시키고 밤새 교반시켰다. 반응물을 공기에 대해 개방하고 나서, MeOH로 서서히 중단시킨 다음, 기체 발생이 관찰되지 않을 때까지 H2O를 서서히 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 나서(2x) 층을 분리시켰다. 유기층을 대략 3% H2O2, 수성 시트르산 용액 및 염수로 세척하고 나서, Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 구배, 20% 내지 100%)에 의해 정제하여 다이올 화합물 55를 백색 고체로서 (385㎎, 44% 수율) 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.81 (s, 2H), 7.52 (s, 1H), 5.33 (bs, 2H), 4.56 (s, 4H), 3.86 (s, 3H).
Figure pct00133
단계 5: 다이올 화합물 55(320㎎, 1.631m㏖)을 DCM(10.9㎖) 중에서 Ar 하에 용해시켰다. 용액을 -5℃로 냉각시키고 나서, TEA(0.568㎖, 4.08m㏖)를 첨가한 다음, MsCl(0.292㎖, 3.75m㏖)을 서서히 첨가하였는데, 이 시점에 색상은 첨가 시 즉시 황색으로, 그 다음에 진한 적색/갈색으로 변화되었다. 반응 혼합물을 -5℃에서 Ar 하에 1.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음물로 중단시키고 나서, EtOAc로 추출하였다(2x). 유기층을 물로 세척하고 나서(2x), Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 농축시켜 조질의 다이메실레이트 화합물 56(435㎎, 76% 수율)을 얻었다.
Figure pct00134
단계 6: 다이메실레이트 화합물 56(435㎎, 1.11m㏖)을 DMF(5.55㎖) 중에 용해시켰다. IGN 단량체 화합물 10(719㎎, 2.444m㏖)을 첨가한 다음에, K2CO3(384㎎, 2.78m㏖)을 실온에서 Ar 하에 밤새 교반시켰다. 물(20㎖)을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 슬러리를 5분 동안 교반시키고 나서, 여과 후, 진공/N2 1.5시간 동안 건조시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피(EtOAc/헥산, 구배, 50% 내지 100%; 이어서, 5% MeOH/DCM)에 의해 정제하여 황색 고체로서 화합물 57(535㎎, 64% 수율, 2 단계)을 얻었다. LCMS = 6.973 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 749.4 (M+H).
Figure pct00135
단계 7: 화합물 57(100㎎, 0.134m㏖)을 DCE(1.34㎖) 중에 용해시켰다. 트라이메틸스탄올(362㎎, 2.003m㏖)을 첨가하고 나서, 80℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 실온에서 냉각시키고 나서, 물로 희석시켰다. 수성층을 1M HCl을 이용하여 대략 pH 4로 산성화시키고, DCM으로 추출하고 나서(3x), Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 생성물을 짧은 실리카 플러그를 통해 플러깅하고 나서, DCM/MeOH(10:1, 50㎖)로 플러슁하고, 농축시켜 연한 황색 고체(100㎎, 100% 수율)로서 화합물 58을 얻었다. LCMS = 5.872 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 735.3 (M+H).
Figure pct00136
단계 8: 산 화합물 58(80㎎, 0.087m㏖) 및 아민 화합물 52(36　㎎, 0.131m㏖)을 DMF(871㎕) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(25㎎, 0.131m㏖) 및 DMAP(10.6㎎, 0.087m㏖)을 첨가하고 나서, 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 물(4㎖)을 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 슬러리를 5분 동안 교반시키고 나서, 여과 후 진공/N2 하에 건조시켰다. 조질의 잔사를 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피 (MeOH/DCM, 구배, 0% 내지 20%)에 의해 정제하여 화합물 60을 황색 고체(37㎎ , 43% 수율)로서 얻었다. LCMS = 4.605 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 991.35 (M+H).
Figure pct00137
단계 9: 화합물 61을 실시예 1의 화합물 12와 유사하게 제조하였다. 화합물 61을 C18 정제 후 백색 고체로서 얻었다(8㎎, 25% 수율). LCMS = 5.421 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 993.7 (M+H).
Figure pct00138
단계 10: 화합물 62를 실시예 2의 화합물 22와 유사하게 제조하였다. 짧은 실리카 플러그를 통해 플러깅한 후에 조질의 화합물 62를 황색 고체로서 얻었다(13㎎, 90% 수율). LCMS = 4.693 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 979.35 (M+H).
Figure pct00139
단계 11: 화합물 63을 실시예 1의 화합물 14와 유사하게 제조하였다. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 1-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4] 다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조 [5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)-1,4,7,10-테트라옥소-2,5,8,11-테트라아자테트라데칸-14-오에이트, 화합물 63을 C18 정제 후에 백색 고체로서 얻었다(4㎎, 31% 수율). LCMS = 5.495 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1076.7 (M+H).
실시예 8. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일 3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)벤즈아미도) 프로판아미도)프로판아미도)프로파노에이트(화합물 70)의 합성
Figure pct00140
단계 1: Z-L-Ala-L-Ala-OH 화합물 64 (3.0 g, 10.19m㏖) 및 β-알라닌 메틸에스터·HCl(1.565 g, 11.21m㏖)을 DMF(20.39㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl (2.150 g, 11.21m㏖) 및 HOBt(1.561 g, 10.19m㏖)를 첨가한 다음, DIPEA(4.44㎖, 25.5m㏖)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 Ar 하에 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 나서 포화 NH4Cl, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 헥산을 유기층에 첨가하였는데, 이 시점에 용액은 침전물에 의해 혼탁하게 되었다. 슬러리를 몇 분 동안 교반시키고, 여과 후, EtOAc/헥산(3:1)을 이용하여 고체로 세척하였다. 고체를 진공/N2 하에 건조시켜 순수한 화합물 65를 백색 고체로서 얻었다(3.11 g, 80% 수율). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.91 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 7.46 (d, 1H, J = 7.4 Hz), 6.39-7.30 (m, 5H), 5.02 (d, 2H, J = 2.3 Hz), 4.20 (p, 1H, J = 7.2 Hz), 4.04 (p, 1H, J = 7.3 Hz), 3.59 (s, 3H), 3.30-3.22 (m, 1H), 2.45 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 1.18 (분명한 t, 6H, J = 7.2 Hz). LCMS = 3.942 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 380.10 (M+H).
Figure pct00141
단계 2: 화합물 65(1.0 g, 2.64m㏖)를 메탄올(12.55㎖), 물(0.628㎖) 및 THF(2㎖) 중에 용해시켰다. 용액을 Ar으로 퍼지하고, 이어서, 5분 동안 탈기시켰다. Pd/C(10%, 50% 물로 습윤, 0.140 g)을 서서히 첨가하였다. H2를 몇 분 동안 용액 내로 버블링시키고 나서, 반응물을 추가로 H2 벌륜(1 atm) 하에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 나서 MeOH(30㎖)로 세척하고, 농축시켰다. CH3CN(15㎖)을 잔사에 첨가하여 농축시켰다. 이를 2회 이상 반복하여 화합물 66 회백색 고체로서 얻었다(650㎎, 100% 수율). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.03-7.99 (m, 2H), 4.24-4.18 (m, 1H), 3.60 (s, 3H), 3.31-3.22 (m, 5H), 2.46 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 1.17 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 1.12 (d, 3H, J = 6.9 Hz).
Figure pct00142
단계 3: 화합물 67을 실시예 7의 60과 유사하게 제조하였다. 화합물 67을 실리카겔 플래쉬 크로마토그래피 후에 황색 고체로서 얻었다(69㎎, 53% 수율). LCMS = 4.843 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 962.25 (M+H).
Figure pct00143
단계 4: 화합물 68을 실시예 1의 12와 유사하게 제조하였다. 화합물 68을 C18 정제 후 백색 고체로서 얻었다(11.5㎎, 19% 수율). LCMS = 5.136 분(8분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 964.35 (M+H).
Figure pct00144
단계 5: 화합물 69를 실시예 2의 22와 유사하게 제조하였다. 조질의 화합물 69를 짧은 실리카 플러그를 통한 플러깅 후에 황색 고체로서 얻었다(13㎎, 100% 수율). LCMS = 5.640 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 950.4 (M+H).
Figure pct00145
단계 6: 화합물 70을 실시예 1의 14와 유사하게 제조하였다. 2,5-다이옥소피롤리딘-1-일-3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4] 다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-12a,13-다이하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)벤즈아미도) 프로판아미도)프로판아미도) 프로파노에이트, 화합물 70을 C18 정제 후 백색 고체로서 얻었다(5㎎, 35% 수율). LCMS = 6.138 분(15분 방법). 관찰한 질량 (ESI+): 1047.4 (M+H).
실시예 9. (12S,12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4-머캅토-4-메틸펜탄아미도)아세트아미도) 아세트아미도)아세트아미도)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4] 다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)벤질)옥시)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-12-설폰산(화합물 98)의 합성
Figure pct00146
단계 1: 화합물 4 (2.0 g, 8.15m㏖) 및 4-메틸-4-(메틸다이설판일)펜탄산 (1.743 g, 8.97m㏖)을 무수 DMF(27.2㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(1.719 g, 8.97m㏖) 및 HOBt(1.249 g, 8.15m㏖)를 첨가하고 나서, DIPEA(2.85㎖, 16.31m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응물을 다이클로로메탄/메탄올(5:1)로 희석시키고 나서, 포화 염화암모늄, 포화 중탄산나트륨, 및 염수로 세척하였다. 이를 황산나트륨으로 건조시키고 나서, 여과 후, 스트리핑하였다. 조질의 오일을 아세토나이트릴과 공비 혼합하고(3x), 이어서, 고진공으로 35℃에서 약 1.5시간 동안 펌핑하여 화합물 91을 제공하였고, 이를 추가 정제 없이 취하였다(3.44 g, 100% 수율). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.18-8.09 (m, 3H), 3.76-3.68 (m, 6H), 2.41 (s, 3H), 2.28-2.21 (m, 2H), 1.84-1.77 (m, 2H), 1.41 (s, 9H), 1.25 (s, 6H).
Figure pct00147
단계 2: 화합물 91(3.44 g, 8.15m㏖)을 TFA(12.56㎖, 163m㏖) 및 탈이온수(0.65mL) 중에서 실온에서 3.5시간 동안 교반시켰다. 반응물을 아세토나이트릴로 희석시키고 증발건조시켰다. 조질의 고체를 에틸 아세테이트를 이용하여 슬러리화하고 나서, 여과 후, 에틸 아세테이트로 세정하고, 이어서, 다이클로로메탄/메탄올(1:1)로 세정하여 화합물 92(2.98 g, 100% 수율)를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 8.19-8.08 (m, 3H), 3.80-3.68 (m, 6H), 2.41 (s, 3H), 2.28-2.20 (m, 2H), 1.85-1.76 (m, 2H), 1.25 (s, 6H).
Figure pct00148
단계 3: 화합물 92 (1.74 g, 4.76m㏖)를 다이클로로메탄(30.2㎖) 및 메탄올(15.11㎖) 중에 용해시켰다. N-에톡시카본일-2-에톡시-1,2-다이하이드로퀴놀린(2.243 g, 9.07m㏖) 및 (5-아미노-1,3-페닐렌)다이메탄올(0.695 g, 4.53m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 용매를 제거하고 나서, 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 고체를 셀라이트를 통해 여과 후, 에틸 아세테이트 및 이어서 메탄올로 세척하였다. 여과액을 증발시키고 실리카겔 크로마토그래피(다이클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 화합물 93(569㎎, 25% 수율)을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 9.74 (s, 1H), 8.24-8.15 (m, 3H), 7.45 (s, 2H), 6.96 (s, 1H), 5.17 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 4.45 (d, 4H, J = 5.6 Hz,), 3.87 (d, 2H, J = 6.0 Hz,), 3.77 (d, 2H, J = 6.0 Hz,), 3.73 (d, 2H, J = 5.6 Hz,), 2.40 (s, 3H), 2.28-2.21 (m, 2H), 1.83 -1.76 (m, 2H), 1.24 (s, 6H).
Figure pct00149
단계 4: 화합물 93(305㎎, 0.609m㏖)을 무수 DCM(5.992㎖) 중에서 현탁시켰다. 용액이 균질하게 될 때까지 무수 DMF를 첨가하였다(대략 2.5㎖). 용액을 아세톤/드라이 아이스 욕에서 10℃로 냉각시켰다. 트라이에틸아민(0.425㎖, 3.05m㏖)을 첨가하고 나서, 메탄설폰 무수물(274㎎, 1.523m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 10℃ 1시간 동안 교반시켰다. 반응물을 얼음물로 퀀칭시키고 나서, 찬 에틸 아세테이트/메탄올(20:1)로 추출하였다. 유기층을 얼음물로 세척하고 나서, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 후, 농축시켰다. 조질의 물질을 고진공에서 건조시켜 화합물 94(380㎎, 95% 수율)를 제공하였다. LCMS = 4.2 분(15분 방법). MS (m/z): 655.0 (M-1)-.
Figure pct00150
단계 5: 화합물 95를 실시예 7의 화합물 57과 유사하게 제조하였다. 조질의 고체를 다이클로로메탄/메탄올(10:1) 중에 용해시키고 나서, 물로 세척하고, 유기물을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 진공에서 제거하고 나서, 실리카겔 크로마토그래피(다이클로로메탄/메탄올)에 의해 정제하여 화합물 95(445㎎, 42% 수율, 54% 순도)를 제공하였다. LCMS = 6.64 분(15분 방법). MS (m/z): 1053.4 (M + 1)+ 및 1051.3 (M -1)-.
Figure pct00151
단계 6: 화합물 95(445㎎, 0.423m㏖)를 1,2-다이클로로에탄(2.82㎖) 중에서 용해시켰다. 트라이아세톡시보로하이드라이드 나트륨(80㎎, 0.359m㏖)을 첨가하고 나서 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응물을 다이클로로메탄으로 희석시키고 나서, 포화 염화암모늄으로 세척하였다. 유기층을 염수로 세척하고 나서, 건조시켜 화합물 95, 96 및 96a(496㎎)의 혼합물을 제공하였다. 이 조질의 혼합물을 2-프로판올(39.17㎖) 및 물(19.59㎖) 중에서 용해시켰다. 중아황산나트륨(245㎎, 2.35m㏖)을 첨가하고 나서, 실온에서 3.5시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 냉동시키고 동결건조시켜 거품같은 백색 고체를 제공하고, 이를 RPHPLC(C18, 아세토나이트릴/물)에 의해 정제하여 화합물 97(54㎎, 10% 수율) 및 화합물 96a(24㎎, 5% 수율)를 제공하였다. LCMS (화합물 97) = 4.83 분(15분 방법) 및 LCMS (화합물 96a) = 8.05 분(15분 방법).
Figure pct00152
단계 7: CH3CN (3.85㎖) 중의 화합물 97(54㎎, 0.047m㏖)의 교반 용액에 새로 제조한 TCEP/pH 6.5 완충제 용액(TCEP·HCl(46.7㎎)을 몇 방울의 탈이온수 중에서 용해시키고 나서, 포화 중탄산나트륨을 대략 pH 6.5까지 적가함. 용액을 0.55㎖의 pH=6.5, 1 M 인산나트륨 완충제로 희석시킴) 및 메탄올(2.75㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시키고, 이어서, 냉동 및 동결건조시켰다. 고체를 RPHPLC(C18, 아세토나이트릴/ 물)에 의해 정제하여 (12S,12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4-머캅토-4-메틸펜탄아미도)아세트아미도) 아세트아미도)아세트아미도)-5-((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4] 다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)벤질)옥시)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-12-설폰산, 화합물 98(2㎎, 4% 수율)을 제공하였다. LCMS = 4.32 분(15분 방법). MS (m/z): 1089.3 (M -1)-.
실시예 10. N-(2-((2-((2-((3,5-비스((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)-4-머캅토-4-메틸펜탄아마이드(화합물 99)의 합성
Figure pct00153
화합물 99를 실시예 9의 화합물 98과 유사하게 제조하였다. N-(2-((2-((2-((3,5-비스((((S)-8-메톡시-6-옥소-11,12,12a,13-테트라하이드로-6H-벤조[5,6][1,4]다이아제피노[1,2-a]인돌-9-일)옥시)메틸)페닐)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)아미노)-2-옥소에틸)-4-머캅토-4-메틸펜탄아마이드, 화합물 99를 C18 정제 후 백색 고체로서 얻었다(6.3㎎, 27% 수율). LCMS = 7.26 분(15분 방법). MS (m/z): 1033.5 (M +Na)+.
실시예 11. huMOV19 -14의 제조
50mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 15% v/v DMA(N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.0㎎/㎖ huMOV19 항체 및 8 몰 당량 화합물 14(90:10 DMA:물 중의 5배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)을 함유하는 반응물을 6시간 동안 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고, 완충제를 NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스(Illustra Sephadex) G-25 DNA 등급, GE 헬스케어(GE Healthcare))를 이용하여 250mM 글리신, 10mM 히스티딘, 1% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 교환하였다. 슬라이드-어-라이저(Slide-a-Lyzer) 투석 카세트(써모사이언티픽(ThermoScientific) 20,000 MWCO)를 이용하여 4℃에서 20시간 동안 동일한 완충제 중에서 투석을 수행하였다.
정제한 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 IGN91 분자 평균 3.0(화합물 14에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,280㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 90% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), <0.1% 비컨쥬게이팅된 화합물 14(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해) 및 최종 단백질 농도 0.78㎎/㎖를 갖는 것으로 발견되었다. 컨쥬게이팅된 항체는 겔 칩 분석에 의해 87% 초과로 무손상이 되는 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도 7a에 나타낸다.
실시예 12. huMOV19 - 설포 - SPDB -98의 제조
10mM N,N-다이아이소프로필에틸 아민(DIPEA)을 함유하는 DMA 중에서 3.9mM 화합물 98 및 3　mM 설포-SPDB 링커의 최종 농도를 함유하는 인시츄 혼합물을 15mM HEPES pH 8.5 (90:10 물: DMA) 중에 4㎎/㎖ huMOV19 항체를 함유하는 반응물에 20배 과량의 얻어진 화합물 98-설포-SPDB-NHS를 첨가하기 전에 60분 동안 인큐베이션시켰다. 용액을 밤새 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스(Illustra Sephadex) G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 100mM 알기닌, 20mM 히스티딘, 2% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 완충제를 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 10,000 MWCO)를 이용하여 투석을 4℃에서 밤새 동일한 완충제 중에서 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 98의 평균 3.7개 분자(화합물 98에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,484㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M- 1를 이용하는 SEC에 의해), 99% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), 및 최종 단백질 농도 0.18㎎/㎖인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도　7A에 나타낸다.
실시예 13. huMOV19 -35의 제조
50mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 15% v/v DMA(N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.5㎎/㎖ huMOV19 항체 및 5몰 당량의 화합물 35(90:10 DMA:물 중의 5배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)를 함유하는 반응물을 6시간 동안 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)를 이용하여 250mM 글리신, 10mM 히스티딘, 1% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50 μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 완충제 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 10,000 MWCO)를 이용하여 동일한 완충제 중에서 8시간 동안 실온에서 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 35의 평균 2.9개 분자(IGN128에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,484㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 97% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), <1% 비컨쥬게이팅된 화합물 35(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해) 및 최종 단백질 농도 1.4㎎/㎖인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도　7A에 나타낸다.
실시예 14. huMOV19 -63의 제조
50mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 15% v/v DMA(N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.0㎎/㎖ huMOV19 항체 및 7몰 당량의 화합물 63(90:10 DMA:물 중의 5-배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)을 함유하는 반응물을 6시간 동안 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 250mM 글리신, 10mM 히스티딘, 1% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50 μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 완충제 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 20,000 MWCO)를 이용하여 동일한 완충제 중에서 4℃에서 20시간 동안 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 63의 평균 2.7개 분자(IGN131에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,280㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 99% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), <0.1% 비컨쥬게이팅된 화합물 63(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해) 및 최종 단백질 농도 1.6㎎/㎖인 것을 발견하였다. 컨쥬게이트된 항체는 겔 칩 분석에 의해 90% 초과로 무손상인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도　7B에 나타낸다.
실시예 15. huMOV19 -80의 제조
50mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 15% v/v DMA(N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.0㎎/㎖ huMOV19 항체 및 7몰 당량의 화합물 80(90:10 DMA:물 중의 5-배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)을 함유하는 반응물을 6시간 동안 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 250mM 글리신, 10mM 히스티딘, 1% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50 μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 완충제 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 20,000 MWCO)를 이용하여 동일한 완충제 중에서 4℃에서 20시간 동안 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 80의 평균 2.5개 분자(화합물 80에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,280㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 99% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), <0.1% 비컨쥬게이팅된 화합물 80(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해) 및 최종 단백질 농도 2.4㎎/㎖인 것을 발견하였다. 겔 칩 분석에 의해 컨쥬게이팅된 항체는 90% 무손상이 되는 것을 발견하였다.
실시예 16. huMOV19 -90의 제조
15mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 15% v/v DMA(N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.0㎎/㎖ huMOV19 항체 및 3.9몰 당량의 화합물 90(95:5 DMA:50mM 숙신산염 pH 5.5 4시간 동안 25℃에서 5-배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)을 함유하는 반응물을 4시간 동안 25℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 10mM 숙신산염, 50mM 염화나트륨, 8.5% w/v 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50 μM 중아황산나트륨 pH 6.2 제형 완충제로 완충제 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 30,000 MWCO)를 이용하여 동일한 완충제 중에서 실온에서 4시간 동안, 그 다음에 4℃에서 밤새 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 최종 단백질 농도 1.8㎎/㎖ 및 항체 당 연결된 화합물 90의 평균 2.7개 분자(IGN152에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,280㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 98.3% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해); 및 <1.1% 비컨쥬게이팅된 화합물 90(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해)인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도 7b에 나타낸다.
실시예 17. huMOV19 -49의 제조
50mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 10% v/v DMA (N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.0㎎/㎖ huMOV19 항체 및 5몰 당량의 화합물 49(90:10 DMA:물 중의 5-배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)를 함유하는 반응물을 4시간 동안 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, 완충제를 NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 250mM 글리신, 10mM 히스티딘, 1% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 20,000 MWCO)를 이용하여 4시간 동안 실온에서 동일 완충제 중에서 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 49의 평균 2.8개 분자(화합물 49에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,280㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 94% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), <0.1% 비컨쥬게이팅된 화합물 49(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해) 및 최종 단백질 농도 1.5㎎/㎖인 것을 발견하였다. 컨쥬게이팅된 항체는 겔 칩 분석에 의해 95% 초과 무손상인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도 7c에 나타낸다.
실시예 18. huMOV19 - 설포 - SPDB -99의 제조
4mM 말레이미도프로피온산 MPA을 이용하는 캡핑 전에 10mM N,N-다이아이소프로필에틸 아민(DIPEA)을 함유하는 DMA 중의 1.95mM 화합물 99 및 1.5mM 설포-SPDB 링커의 최종 농도를 함유하는 인시츄 혼합을 20분 동안 인큐베이션시켰다. 6-배 과량의 얻어진 99-설포-SPDB-NHS를 15mM HEPES pH 8.5(82:18 물: DMA) 중에서 2.5㎎/㎖ huMOV19 항체를 함유하는 반응물에 첨가하였다. 용액을 밤새 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, 완충제를 NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 20mM 히스티딘, 50mM 염화나트륨, 8.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50 μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 10,000 MWCO)를 이용하여 동일한 완충제 중에서 밤새 4℃에서 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 99의 평균 1.6개 분자(화합물 99에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,484㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 99% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), 및 최종 단백질 농도 0.59㎎/㎖인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도 7c에 나타낸다.
실시예 19. huMOV19 -70의 제조
50mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 10% v/v DMA(N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.0㎎/㎖ huMOV19 항체 및 5몰 당량의 화합물 70(90:10 DMA:물 중의 5-배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)을 함유하는 반응물을 4시간 동안 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, 완충제를 NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 20mM 히스티딘, 100mM 알기닌, 2% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50 μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 교환하였다. 정제 후, 투석을 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 20,000 MWCO)를 이용하여 18시간 동안 4℃에서 동일한 완충제 중에서 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 70의 평균 3.0개 분자(화합물 70에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,484㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30,115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 94% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), <　0.1% 비컨쥬게이팅된 화합물 70(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해) 및 최종 단백질 농도 1.3㎎/㎖인 것을 발견하였다.
실시예 20. huMOV19 -23의 제조
50mM HEPES (4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 15% v/v DMA (N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중에서 2.5㎎/㎖ huMOV19 항체 및 4몰 당량의 화합물 23(90:10 DMA:물 5-배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)을 함유하는 반응물을 6시간 동안 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, 완충제를 NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 250mM 글리신, 10mM 히스티딘, 1% 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50μM 중아황산나트륨 제형 완충제 pH 6.2로 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 10,000 MWCO)를 이용하여 동일한 완충제 중에서 8시간 동안 실온에서 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 23의 평균 2.8개 분자(화합물 23에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,484㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30,115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 98% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해), <　3% 비컨쥬게이팅된 화합물 23(아세톤 침전, 역상 HPLC 분석에 의해) 및 최종 단백질 농도 1.3㎎/㎖인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도 7d에 나타낸다.
실시예 21. huMOV19 -14, huMOV19 -90 및 huMOV19 -107 컨쥬게이트의 결합 친화도에 대한 유동 세포 분석
100㎕/웰의 컨쥬게이트 huMOV19 -14, huMOV19 -90 또는 huMOV19 -107 또는 항체 huMOV19를 3x 10-8 M의 출발 농도에서 96-웰 플레이트(팔콘(Falcon), 둥근 바닥) 내 FACS 완충제(1% BSA, 1x PBS) 중에서 2회 중복해서 희석시키고 나서, FACS 완충제 중에서 4℃에서 3배 연속 희석시켰다. 열 비활성화 10% FBS(라이프 테크놀로지즈), 0.1㎎/㎖ 겐타마이신(라이프 테크놀로지즈) 및 0.2 IU 소 인슐린/㎖(시그마)로 보충한 RPMI-1640(라이프 테크놀로지즈)에서 성장시킨 T47D 세포(인간 유방 종양)를 PBS 중에서 1회 세척하고 나서, 베르센(versene)(라이프 테크놀로지즈)로 제거하였다. T47D 세포를 성장 배지에서 재현탁시켜(상기 참조) 베르센을 중화시키고, 쿨터 계수기에서 계수화하였다. 이어서, 세포를 차가운 FACS 완충제 중에서 2회 세척하고, 1200 rpm에서 5분 동안 세척 사이에서 원심분리시켰다. 100㎕/㎖의 2x104개 세포/웰을 컨쥬게이트, 항체 또는 FACS 완충제만을 함유하는 웰에 첨가하고 나서, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 세포를 앞에서와 같이 원심분리시키고 나서, 200㎕/웰로 차가운 FACS 완충제 중에서 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 200㎕/웰 FITC-컨쥬게이팅된 염소 항-인간-IgG-Fc 2차 항체(포함된 대조군은 비염색 세포 및 2차 항체만으로 염색된 것임)로 40분 동안 4℃에서 염색하고 나서, 원심분리시키고, 200㎕/웰로 차가운 PBS-D에서 1회 세척하였다. 세포를 200㎕/웰 1% 폼알데하이드/PBS-D에서 고정시키고 나서, 4℃에서 저장하였다. 저장 후에, 컨쥬게이트 또는 항체의 세포 표면 염색을 FACS 칼리버(Calibur)(BD 바이오사이언시즈)에 대해 유세포 분석기를 이용하여 검출하였다. 기하학적 수단을 그래프패드 프리즘을 이용하여 컨쥬게이트 또는 항체의 로그 농도에 대해 플롯팅하고 나서, EC50을 비선형 4-모수 로지스틱 회귀 분석을 통해 계산하였다.
결합 분석을 huMOV19-90 컨쥬게이트에 대해 반복하고 나서, 데이터를 도 15B에 나타낸다.
도 1, 도 15A, 도 15B 및 도 20에 나타낸 바와 같이, 컨쥬게이트는 유세포 분석기에서 비컨쥬게이팅된 항체로서 표적 항원을 발현시키는 T47D 세포의 표면에 대해 유사하게 결합함으로써, 결합이 컨쥬게이션 과정에 의해 영향받지 않음을 입증한다.
실시예 22. huMOV19 -14 컨쥬게이트에 대한 세포독성 분석
100㎕/웰의 huMOV19 -14 컨쥬게이트를 3.5x10-9M 내지 3.5 x10-8 M의 출발 농도에서 96-웰 플레이트(코닝(Corning), 편평 바닥)에서 열 비활성화 10% FBS(라이프 테크놀로지즈) 및 0.1㎎/㎖ 겐타마이신(라이프 테크놀로지즈)로 보충한 RPMI-1640(라이프 테크놀로지즈)에서 3회 희석시키고 나서, 주위 온도 초과로 배지에서 3회 연속해서 희석시켰다. 열 비활성화 10% FBS(라이프 테크놀로지즈) 및 0.1㎎/㎖ 겐타마이신(라이프 테크놀로지즈)으로 보충한 EMEM(ATCC) 중에서 성장시킨 KB 세포(협측 상피 종양)를 PBS 중에서 1회 세척하고 나서, 0.05% 트립신-EDTA(라이프 테크놀로지즈)로 제거하였다. KB 세포를 성장 배지(상기 참조)에서 재현탁시켜 트립신을 중화시키고, 쿨터 계수기 상에서 계수화하였다. 100㎕/㎖의 1x103개 세포/웰을 컨쥬게이트를 함유하는 웰 또는 배지 단독에 첨가하고 나서, 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2와 함께 5일 동안 1M 차단 항-FOLR1 항체(huMOV19)와 함께 및 항체 없이 인큐베이션시켰다. 총 용적은 200㎕/웰이다. 인큐베이션 후에, 20㎕/웰 WST-8(도진도(Dojindo))의 세포 생존도를 분석하고 나서, 2시간 동안 진행시켰다. 450 및 620㎚에서 플레이트 판독기 상에서 흡광도를 판독하였다. 620㎚에서 흡광도를 450㎚에서 흡광도로부터 차감하였다. 배지만을 함유하는 웰에서 배경을 보정한 흡광도로부터 추가로 차감하고 나서, 비처리 세포의 생존 분획(SF)을 엑셀에서 계산하였다. ADC 농도(M) 대 SF의 XY 그래프를 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)을 이용하여 생성하였다.
도 2에 나타내는 바와 같이, 컨쥬게이트는 4x10-12 M의 IC50을 지니는 KB 세포에 대해 고도로 강하다. 과량의 비컨쥬게이팅된 항체의 첨가는 세포독성 효과를 상당히 감소시키는데, 이는 항원-특이성을 입증한다.
실시예 23. huMOV19 -14 및 huMOV19 - 90 컨쥬게이트에 대한 방관자 세포독성 분석
100㎕/웰의 huMOV19 -14 또는 huMOV19 -90을 1 e-10M 또는 4 e-10M 사이의 농도에서 96-웰 플레이트(팔콘, 둥근 바닥)에서 열 비활성화 10% FBS(라이프 테크놀로지즈), 0.1㎎/㎖ 겐타마이신(라이프 테크놀로지즈) 및 βME(라이프 테크놀로지즈)로 보충한 RPMI-1640(라이프 테크놀로지즈)에서 6회 중복해서 희석시켰다. 재조합 FOLR1(FR1#14)를 발현시키는 300.19 세포(마우스) 또는 발현 벡터가 없는(모체)를 쿨터 계수기 상에서 계수화하였다. 50㎕/㎖의 1000 FR1#14 세포/웰을 컨쥬게이트 또는 배지만을 함유하는 웰에 첨가하고 나서, 50㎕/㎖의 2000 모 세포/웰을 컨쥬게이트 또는 배지만을 함유하는 웰에 첨가하고, FR1#14와 모 세포를 둘 다 컨쥬게이트 또는 배지만을 함유하는 웰에 함께 첨가하였다. 모든 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2와 함께 4일 동안 인큐베이션시켰다. 총 용적을 150㎕/웰. 인큐베이션 후에, 세포 생존도를 75㎕/웰 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo)(프로메가(Promega))의 첨가에 의해 분석하고 나서, 45분 동안 진행시켰다. 발광을 루미노미터 상에서 판독하고 나서, 배지만을 함유하는 웰의 배경을 모든 값으로부터 차감하였다. 각각의 세포 처리의 평균의 막대 그래프를 그래프 패드 프리즘을 이용하여 그래프화하였다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 컨쥬게이트 huMOV19 -14는 이웃하는 항원-음성 세포 상에서 약한 방관자 세포독성 효과를 나타내었다.
도 13에 나타내는 바와 같이, 컨쥬게이트 huMov19 - 90는 강한 방관자 사멸 활성을 나타낸다.
실시예 24. huMy9 -6-14 컨쥬게이트에 대한 시험관내 세포독성 분석
컨쥬게이트의 희석을 적절한 성장 배지에서 2 x 103 내지 1 x 104개 세포/웰을 함유하는 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 세포 및 배지를 함유하지만, 시험 화합물을 결여하는 대조군 웰뿐만 아니라 배지만을 함유하는 웰을 각각의 분석 플레이트에 포함시켰다. 플레이트를 6% CO2를 함유하는 습한 분위기에서 37℃에서 4 내지 6일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, WST-8 시약, 10% v/v(메릴랜드주 게이더스버그에 소재한 도진도 몰레큘러 테크놀로지즈(Dojindo Molecular Technologies))를 웰에 첨가하고 나서, 플레이트를 37℃에서 2 내지 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 이중 파장 방식 450㎚/650㎚에서 플레이트-판독기 분광 광도계 상에서 흡광도를 측정하고 나서, 650㎚에서 흡광도(세포에 의한 비특이적 광산란)를 차감하였다. 각각의 웰에서 세포의 분명한 살아있는 분획을 배지 배경 흡광도에 대해 처음 보정함으로써, 그리고 이어서, 각각의 값을 대조군(비처리 세포) 웰 내의 값의 평균으로 나눔으로써 계산하였다.
도 3에 나타내는 바와 같이, 컨쥬게이트는 다양한 항원 양성 암 세포에 대해 고도로 강한 반면; 항원 음성 L-540 세포는 동일한 컨쥬게이트에 노출될 때 생존으로 남아있다.
실시예 25. huMy9 -6-14 컨쥬게이트에 대한 방관자 세포독성 분석
항원-음성 RADA-1 세포에 대해 세포독성이 아니지만 항원-양성 카라(KARA) 세포 모두를 사멸시킨 huMy9 -6-14의 농도를 결정하기 위한 예비 시험을 행하였다. RADA-1(500개 세포/웰) 및 KARA(500, 1000, 2000, 4000개 세포/웰)을 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 플레이팅하였다. huMy9 -6-14의 희석을 세포 배양 배지(10% 열 비활성화 태아 소 혈청 및 50㎎/ℓ 겐타마이신으로 보충한 RPMI1640 배지)에서 제조하고 나서, 세포에 첨가하였다. 플레이트를 4일 동안 37℃에서 인큐베이션시키고 나서, 각각의 웰 내 세포 생존도를 WST-8 시약(도진도 몰레큘러 테크놀로지즈 인코포레이티드)을 이용하여 결정하였다. 컨쥬게이트의 방관자 효능을 시험하기 위해, RADA-1 및 KARA 세포를 상이한 비로 함께 혼합하고 나서(500 RADA-1 세포 + KARA 세포 없음; 500 RADA-1 세포 + 500 KARA 세포; 500 RADA-1 세포 + 1000 KARA 세포; 500 RADA-1 세포 + 2000 KARA 세포; 500 RADA-1 세포 + 4000 KARA 세포), 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 플레이팅하였다. 이어서, huMy9 -6-14의 1.0e-9M 또는 5.0e-10M - RADA-1 세포에 대해 세포독성이 아니지만 모든 KARA 세포를 사멸시킨 농도 -을 세포 혼합물에 첨가하였다. 플레이트를 4일 동안 37℃에서 인큐베이션시키고 나서, 각각의 웰에서 RADA-1 세포의 생존도를 WST-8 시약(도진도 몰레큘러 테크놀로지즈 인코포레이티드)을 이용하여 결정하였다. 흡광도를 이중 파장 방식 450㎚/650㎚으로 플레이트-판독기 분광 광도계 상에서 측정하고, 650㎚에서의 흡광도(세포에 의한 비특이적 광산란)를 차감하였다.
도 5에서 나타내는 바와 같이, 컨쥬게이트는 이웃하는 항원-음성 세포에 대해 방관자 사멸 효과를 나타낸다.
실시예 26. 암컷 SCID 마우스에서 NCI-H2110 NSCLC 이종이식물에 대한 단일-용량 huMOV19-80 및 huMOV19-90의 항종양 활성
암컷 CB.17 SCID 마우스, 6주령을 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 받았다. 마우스를 우측 옆구리에 피하 주사에 의해 0.1㎖ 50% 매트리겔/무혈청 배지에서 현탁시킨 1 x 107개의 NCI-H2110 종양 세포로 접종하였다. 종양 용적이 대략 100㎣(접종 후 7일)에 도달되었을 때, 동물을 종양 용적을 기준으로 각각 6마리 마우스 5개 그룹으로 무작위화하였다. 마우스는 비히클 대조군(0.2㎖/마우스), huMOV19 -80 또는 huMOV19 -90을 제1일(접종 후 8일)의 huMOV19-80 또는 huMOV19 - 90 농도를 기준으로 5 및 25㎍/㎏으로 단일 IV 투여를 받았다. huMOV19는 엽산 수용체 1(FOLR1)에 선택적으로 결합하는 인간화된 단클론성 항체이다.
종양 크기를 캘리퍼를 이용하여 3차원으로 매주 2 내지 3회 측정하였다. 종양 용적을 식 V = 길이 x 폭 x 높이 x ½를 이용하여 ㎣로 표현하였다. 종양 용적이 50% 이상만큼 감소되었을 때 마우스는 부분적 퇴행(PR)을 갖는 것으로 고려하였고, 감지할 수 있는 종양을 검출할 수 없을 때 완전한 종양 퇴행(CR)을 갖는 것으로 고려하였다. 종양 용적은 스터디로그(StudyLog) 소프트웨어에 의해 결정하였다.
종양 성장 저해(T/C 값)를 하기 식을 이용하여 결정하였다:
T/C(%) = 치료한 종양 용적의 중앙값/대조군의 중앙값 종양 용적 x 100.
비히클 대조군의 종양 용적이 사전 결정된 크기 1000㎣에 도달되었을 때, 종양 용적을 치료(T) 및 비히클 대조군(C) 그룹에 대해 동시에 결정하였다. 무종양 마우스(0㎣)를 포함하는 각각의 처리군의 1일 중앙값 종양 용적을 결정하였다. NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42%는 최소 수준의 항종양 활성이다. T/C <10%는 높은 항종양 활성 수준으로 고려된다.
도 6에서 나타내는 바와 같이, huMOV19 -90 컨쥬게이트는 5와 25㎍/㎏ 용량 둘 다에서 고도로 활성인 반면; huMOV19 -80 컨쥬게이트는 25㎍/㎏ 용량에서 고도로 활성이다.
실시예 27. huML66 -90의 제조
15mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진 에탄설폰산) pH 8.5 완충제 및 10% v/v DMA(N,N-다이메틸아세트아마이드) 공용매 중의 2.0㎎/㎖ huML66 항체, 항-EGFR 항체(본 명세서에 전문이 참고로 포함된 WO 2012/058592 참조), 및 3.5몰 당량 화합물 90(90:10 DMA:50mM 숙신산염 pH 5.5로 4시간 동안 25℃에서 5-배 과량의 중아황산나트륨으로 전처리)을 함유하는 반응물을 4시간 동안 25℃에서 인큐베이션시켰다. 반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, 완충제를 NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 20mM 히스티딘, 50mM 염화나트륨, 8.5% w/v 수크로스, 0.01% 트윈-20, 50 μM 중아황산나트륨 pH 6.2 제형 완충제로 교환하였다. 투석을 동일한 완충제 중에서 4시간 동안 실온에서, 그리고 이어서, 밤새 4℃에서 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 30,000 MWCO)를 이용하여 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 최종 단백질 농도 0.9㎎/㎖ 및 항체 당 연결된 화합물 90의 평균 2.7개 분자(화합물 90에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,280㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huML66 항체에 대해 ε280㎚= 205,520㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis에 의해), 99.1% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해); 및 <　1% 비컨쥬게이팅된 IGN149(이중 칼럼, 역상 HPLC 분석)인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도 8에 나타낸다.
실시예 28. huML66 -90 컨쥬게이트에 대한 시험관내 세포독성 분석
세포 성장을 저해하는 huML66 -90 컨쥬게이트의 능력을 시험관내 세포독성 분석을 이용하여 측정하였다. 표적 세포를 완전 RPMI 배지(RPMI-1640, 10% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 모두 인비트로젠사(Invitrogen)의 시약)에서 100㎕로 웰 당 1 내지 2,000개 세포로 플레이팅하였다. 항체를 3배 연속 희석을 이용하여 완전 RPMI 배지내로 희석시키고, 100㎕를 웰 마다 첨가하였다. 최종 농도는 전형적으로 3 x 10-8 M 내지 4.6 x 10-12 M의 범위이다. 세포를 5 내지 6이리 동안 습한 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 인큐베이션시켰다. 남아있는 세포의 생존도를 표색 WST-8 분석(미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 도진도 몰레큘러 테크놀로지즈 인코포레이티드)에 의해 결정하였다. WST-8은 살아있는 세포에서 탈수소효소에 의해 조직 배양 배지에서 가용성인 오렌지색 포마잔 생성물로 환원된다. 생성된 포마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례한다. WST-8을 최종 용적 10%로 첨가하고 나서, 플레이트를 추가 2 내지 4시간 동안 습윤화된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다중 웰 플레이트 판독기에서 450㎚에서의 흡광도(A450)를 측정함으로써 분석하였다. 배지 및 WST-8만을 지니는 웰의 배경 A450 흡광도를 모든 값으로부터 차감하였다. 각각의 샘플값을 비처리 세포를 지니는 웰의 평균값으로 나눔으로써 생존도%를 계산하였다. 생존도% = 100*(A450 처리 샘플 - A450 배경)/(A450 비처리 샘플 - A450 배경). 생존도% 값을 각각의 처리를 위해 반-로그 플롯으로 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 용량 반응 곡선을 비선형 회귀에 의해 생성하고, 각각의 곡선의 EC50 값을 그래프패드(GraphPad) 프리즘(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드 소프트웨어)을 이용하여 계산하였다.
시험관내 세포독성 활성
huML66 -90 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성을 과량의 비컨쥬게이팅된 항체의 존재 및 부재에서 평가하고 나서, EGFR-발현 세포에서 비특이적 huIgG -90 컨쥬게이트의 활성과 비교하고, 전형적인 세포독성 분석으로부터의 결과를 도 9에 나타낸다. huML66 -90 컨쥬게이트는 16 pM의 EC50 값으로 디트로이트(Detroit)-562 SCC-HN 세포의 특이적 세포 사멸을 초래하였다. 과량의 비컨쥬게이팅된 항체의 존재는 활성을 상당히 감소시켰고, 대략 2nM의 EC50 값을 초래하였다. 유사하게, 비-결합 huIgG 대조군 항체와의 huIgG -90 컨쥬게이트는 대략 8nM의 EC50 값으로 세포 사멸을 초래하였다.
마찬가지로, huML66 -90 컨쥬게이트는 12pM의 EC50 값을 지니는 NCI-H292 NSCLC 세포의 특이적 세포 사멸을 초래하였다. 과량의 비컨쥬게이팅된 항체의 존재는 활성을 상당히 감소시켰고, 대략 2nM의 EC50 값을 초래하였다. 유사하게, 비-결합 huIgG 대조군 항체와의 huIgG -90 컨쥬게이트는 대략 8nM의 EC50 값으로 세포 사멸을 초래하였다.
유사하게, NCI-H1703 세포의 특이적 세포 사멸을 또한 관찰하였다.
컨쥬게이트 디트로이트 EC 50 (pM) NCI-H292 EC 50 (pM) NCI-H1703 EC 50 (pM)
huML66 -90 16 12 20
huML66 -90 +차단 2,350 1,570 2,140
huIgG - 90 대조군 8,350 8,350 N/A
실시예 29. huMOV19 -90에 대한 시험관내 세포독성 활성
100 ㎕/웰의 huMOV19 -90 컨쥬게이트를 3.5e-9 M 및 3.5 e-8 M의 시작 농도에서 3회 중복해서 96-웰 플레이트(코닝, 편평 바닥)에서 열 비활성화 10% FBS(라이프 테크놀로지즈) 및 0.1㎎/㎖ 겐타마이신(라이프 테크놀로지즈)으로 보충한 RPMI-1640(라이프 테크놀로지즈) 중에서 각각 희석시키고, 주위 온도 초과로 배지에서 3회 연속 희석시켰다. 열 비활성화 10% FBS (라이프 테크놀로지즈) 및 0.1㎎/㎖ 겐타마이신(라이프 테크놀로지즈)로 보충한 EMEM(ATCC)에서 성장시킨 KB 세포(협측 상피 종양)를 PBS 중에서 1회 세척하고 나서, 0.05% 트립신-EDTA(라이프 테크놀로지즈)로 제거하였다. 시험한 다른 세포는 열 비활성화 10% FBS (라이프 테크놀로지즈) 및 0.1㎎/㎖ 겐타마이신(라이프 테크놀로지즈)로 보충한 RPMI-1640(라이프테크놀로지즈)에서 성장시킨 NCI-H2110(NSCLC) 및 T47D(유방 상피)였다. T47D 배지를 또한 0.2 IU/㎖ 소 인슐린으로 보충하였다. 모든 세포를 성장 배지에서 재현탁시켜(상기 참조) 트립신을 중화시키고, 혈구계를 이용하여 계수화하였다. 100㎕/㎖의 1000 KB 세포/웰 또는 2000 T47D 및 NCI-H2110 세포/웰을 컨쥬게이트 또는 배지만을 함유하는 웰에 첨가하고 나서, 5% CO2와 함께 5일 동안 1μM 차단 항-FOLR1 항체(huMOV19)와 함께 그리고 항체 없이 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 총 용적은 200㎕/웰이다. KB 세포에 대한 각각의 컨쥬게이트의 시작 농도는 3.5e-9 M이고, T47D 및 NCI-H2110 세포에 대해, 각각의 컨쥬게이트의 시작 농도는 3.5e-8 M이었다. 인큐베이션 후에, 세포 생존도는 20㎕/웰 WST-8(도진도)의 첨가에 의해 분석하고 나서, 2시간 동안 진행시켰다. 450 및 620㎚에서 플레이트 판독기 상에서 흡광도를 판독하였다. 620㎚에서 흡광도를 450㎚에서의 흡광도로부터 차감하였다. 배지만을 함유하는 웰의 배경을 보정한 흡광도로부터 추가로 차감하고 나서, 비처리 세포의 살아있는 분획(SF)을 엑셀에서 계산하였다. ADC 농도(M) 대 SF의 XY 그래프를 그래프 패드 프리즘을 이용하여 생성하였다.
도 10 내지 도 12 및 표 2에 나타내는 바와 같이, huMOV19 -90 컨쥬게이트는 KB 세포, T47 D 세포 및 NCI-H2110 세포에 대해 고도로 강하다. 과량의 비컨쥬게이팅된 항체의 첨가는 세포독성 효과를 상당히 감소시켰는데, 이는 항원-특이성을 입증한다.
KB NCI-H2110 T47D
-차단 +차단 -차단 +차단 -차단 +차단
IC50 4e-12 M 8e-10 M 2e-11 M 1e-8 M 3e-11 M 8e-9 M
다른 실험에서, 세포 성장을 저해하는 컨쥬게이트의 능력을 WST-8-기반 시험관내 세포독성 분석을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트 내 세포(전형적으로, 1x103개/웰)을 총 용적 0.2㎖로 적절한 세포 배양 배지에서 다양한 농도에서 컨쥬게이트로 처리하였다. 세포 및 배지를 함유하지만, 시험 화합물이 없는 대조군 웰, 및 배지만을 함유하는 웰을 각각의 분석 플레이트에 포함시켰다. 플레이트를 6% CO2를 함유하는 습한 분위기에서 37℃에서 4 내지 6일 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, WST-8 시약(10%, 용적/용적; 도진도 몰레큘러 테크놀로지즈)을 웰에 첨가하고 나서, 플레이트를 37℃에서 2 내지 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 흡광도를 이중 파장 방식 450㎚/620㎚에서 플레이트 판독기 분광광도계 상에서 측정하고, 620㎚에서의 흡광도(세포에 의한 비특이적 광산란)를 차감하였다. 얻어진 OD450 값을 그래프패드 프리즘 v4(GraphPad Prism v4)(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드 소프트웨어)를 이용하여 세포의 분명한 생존 분획을 계산하였다. 각각의 웰에서 세포의 분명한 생존 분획을 배지 배경 흡광도에 대해 처음 보정하고, 각각의 값을 이어서 대조군 웰(비처리 세포) 내 값의 평균으로 나눔으로써 계산하였다. 용량 반응 곡선을 그래프패드 프리즘에서 가변 기울기를 이용하여 S자형 곡선 적합화를 이용하여 비선형 회귀에 의해 생성하였다. IC50(저해 농도 50%)는 소프트웨어에 의해 생성하였다.
컨쥬게이트는 도 21 및 표 3에서 나타낸 바와 같은 시험 세포주 이시카와(자궁내막 암), KB(자궁경부 암) 및 NCI-H2110(비소 세포 폐 암종)에 대해 활성이었다. 세포-사멸 활성은 FOLR1-의존적이었는데, 과량의 비변형 huMOV19 항체(1μM)가 컨쥬게이트(20 내지 200배)의 효능을 현저하게 감소시켰기 때문이다.
Figure pct00154
실시예 30. 암컷 SCID 마우스에서 NCI-H2110 NSCLC 이종이식물에 대한 단일-용량 huMOV19 -90 컨쥬게이트의 항종양 활성
6주령의 암컷 CB.17 SCID 마우스는 찰스 리버 래버러토리즈로부터 받았다. 마우스를 우측 옆구리에 피하 주사에 의해 0.1㎖ 50% 매트리겔/무혈청 배지에서 현탁시킨 1 x 107개 NCI-H2110 종양 세포로 접종하였다. 종양 용적이 대략 100㎣(접종 후 7일)에 도달되었을 때, 동물을 종양 용적을 기준으로 각각 6마리 마우스 4개 그룹으로 무작위화하였다. 마우스는 비히클 대조군(0.2㎖/마우스),또는 huMOV19-90을, 제1일(접종 후 8일)의 화합물90의 농도를 기준으로 1, 3 또는 5㎍/㎏으로 단일 IV 투여를 받았다.
종양 크기를 캘리퍼를 이용하여 3차원으로 매주 2회 내지 3회 측정하였다. 종양 용적을 식 V = 길이 x 폭 x 높이 x ½를 이용하여 ㎣로 표현하였다. 종양 용적이 50% 이상만큼 감소되었을 때 마우스는 부분적 퇴행(PR)을 갖는 것으로 고려하였고, 감지할 수 있는 종양을 검출할 수 없을 때 완전한 종양 퇴행(CR)을 갖는 것으로 고려하였다. 종양 용적은 스터디로그(StudyLog) 소프트웨어에 의해 결정하였다.
종양 성장 저해(T/C 값)를 하기 식을 이용하여 결정하였다:
T/C(%) = 치료한 종양 용적의 중앙값/대조군의 중앙값 종양 용적 x 100.
비히클 대조군의 종양 용적이 사전 결정된 크기 1000㎣에 도달되었을 때, 종양 용적을 치료(T) 및 비히클 대조군(C) 그룹에 대해 동시에 결정하였다. 무종양 마우스(0㎣)를 포함하는 각각의 처리군의 1일 중앙값 종양 용적을 결정하였다. NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42%는 최소 수준의 항종양 활성이다. T/C <10%는 높은 항종양 활성 수준으로 고려된다.
도 14에서 나타내는 바와 같이, huMOV19 -90 컨쥬게이트는 3㎍/㎏ 용량에서 활성이고, 5㎍/㎏ 용량에서 고도로 활성이다.
실시예 31. 화합물 107의 합성
Figure pct00155
단계 1: 화합물 82 (500㎎, 2.31m㏖), 4-메틸-4-(메틸다이설판일)펜탄산 (449㎎, 2.31m㏖), EDC·HCl(465㎎, 2.43m㏖), HOBt(354㎎, 2.31m㏖) 및 DIPEA(0.81㎖, 4.62m㏖)를 DMF(7.7㎖) 중에서 용해시키고 나서, 반응이 완료될 때까지 밤새 교반시켰다. 반응물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 나서, 포화 중탄산나트륨, 포화 염화암모늄으로, 그리고 물로 2회 세척하였다. 유기물을 진공에서 농축 건조시켜 화합물 100(875㎎, 96% 수율)을 다음 단계에서 직접 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8.15 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 8.02 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 4.26-4.33 (m, 1H), 4.03-4.12 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.18-2.22 (m, 2H), 1.76-1.80 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.24 (s, 6H), 1.24 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.19 (d, 3H, J = 7.2 Hz).
Figure pct00156
단계 2: TFA (2.6㎖) 및 물(0.17㎖)을 아무것도 섞지 않은 화합물 100(875　㎎, 2.23m㏖)에 첨가하고 나서, 반응이 완료될 때까지 실온에서 교반시켰다. 반응물을 희석시키고 나서, 아세토나이트릴과 공비 혼합하여 끈적거리는 오일을 얻었다. 이어서, 아세토나이트릴 및 물로 희석시키고, 냉동 및 동결건조시켜 화합물 101(1g, 100% 수율)을 회백색 고체로서 제공하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. LCMS = 3.99 분(8분 방법). MS (m/z): 337.0 (M + 1)+.
Figure pct00157
단계 3: 화합물 101(923㎎, 1.65m㏖) 및 (5-아미노-1,3-페닐렌)다이메탄올(240㎎, 1.57m㏖)을 DMF(5.2㎖) 중에 용해시켰다. EDC·HCl(601㎎, 3.13m㏖) 및 DMAP(96㎎, 0.78m㏖)를 실온에서 첨가하고 나서, 반응물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 반응물을 에틸 아세테이트로 희석시키고 나서, 물로 3회 세척하였다. 유기층을 건조시키고 나서, 진공에서 농축시키고, 실리카겔 크로마토그래피(DCM/MeOH)에 의해 정제하여 화합물 102(150㎎, 20% 수율)를 제공하였다. LCMS = 3.91 분(8분 방법). MS (m/z): 472.2 (M + 1)+. 1H NMR (400 MHz, MeOD): δ 9.69 (s, 1H), 8.21 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 8.18 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.52 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 4.58 (s, 4H), 4.44-4.48 (m, 1H), 4.29-4.32 (m, 1H), 3.34 (s, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.34-2.40 (m, 2H), 1.90-1.95 (m, 2H), 1.43 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.36 (d, 3H, J = 7.2 Hz), 1.30 (s, 6H).
Figure pct00158
단계 4: 화합물 102를 실시예 9의 화합물 94와 유사하게 제조하였다. 조질의 물질을 고진공 하에 건조시켜 화합물 103(174㎎, 101% 수율)을 제공하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다. LCMS = 4.95 분(8분 방법).
Figure pct00159
단계 5: 화합물 103을 실시예 7의 화합물 57과 유사하게 제조하였다. 조질의 고체는 화합물 104(203㎎, 44% 수율, 60% 순도)를 함유하였고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다. LCMS = 5.68 분(8분 방법). MS (m/z): 1024.3(M + 1)+.
Figure pct00160
단계 6: 화합물 104를 실시예 1의 화합물 12과 유사하게 제조하였다. 조질의 잔사를 RPHPLC(C18 칼럼, CH3CN/H2O, 구배, 50% 내지 65%)에 의해 정제하여 고체로서 모노 이민 화합물 105(22㎎, 16% 수율, 90% 순수)를 수득하였다. LCMS = 6.00 분(8분 방법). MS (m/z): 1027.3(M + 1)+.
Figure pct00161
단계 7: 화합물 106을 실온에서 THF(0.5㎖) 및 ACN(0.23㎖) 중에서 용해시켰다. 이어서, 이를 실시예 9의 화합물 98과 유사하게 제조하였다. 완료까지 혼합물을 교반시키고, 이어서, DCM 및 DI수로 희석시켰다. 유기층을 염수로 세척하고, 건조 후 여과시켰다. 여과액을 농축시켜 조질의 티올, 화합물 106(21㎎, 100% 수율)을 제공하고, 이를 다음 반응에서 직접 사용하였다. LCMS = 5.67 분(8분 방법). MS (m/z): 980.4 (M + 1)+.
Figure pct00162
단계 8: 화합물 106(21㎎, 0.021m㏖)을 2-프로판올(1428 ㎕) 및 물(714 ㎕) 중에서 현탁시켰다. 메타중아황산염 나트륨(22.30㎎, 0.214m㏖)을 첨가하고 나서, 반응물을 완료까지 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 아세토나이트릴/물로 희석시키고, 냉동 후 동결건조시켰다. 얻어진 백색 분말을 RPHPLC(C18 칼럼, CH3CN/H2O, 구배, 20% 내지 40%)에 의해 정제하고 나서, 목적으로 하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 화합물 107(5.3㎎, 23% 수율)을 제공하였다. LCMS = 5.67 분(8분 방법). MS (m/z): 1060.2 (M - 1)-.
실시예 32. huMOV19 - 설포 - SPDB -107(또는 huMOV19 -107) 컨쥬게이트의 제조
숙신산염 완충제(pH 5) : DMA(30 : 70) 중의 1.95mM 화합물 107 및 1.5mM 설포-SPDB 링커의 최종 농도를 함유하는 인시츄 혼합물을 15mM HEPES pH 8.5 중의 4　㎎/㎖ huMOV19 항체(87:13, 물: DMA)를 함유하는 반응물에 7-배 과량의 107-설포-SPDB-NHS를 첨가하기 전에 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 용액을 밤새 25℃에서 컨쥬게이팅시켰다.
반응 후, 컨쥬게이트를 정제하고 나서, 완충제를 NAP 탈염 칼럼(일러스트라 세파덱스 G-25 DNA 등급, GE 헬스케어)을 이용하여 10mM 트리스, 80mM NaCl, 50 uM 중아황산염, 3.5% 수크로스, 0.01% 트윈-20 제형 완충제 pH 7.6으로 교환하였다. 슬라이드-어-라이저 투석 카세트(써모사이언티픽 10,000 MWCO)를 이용하여 동일한 완충제 중에서 밤새 4℃에서 투석을 수행하였다.
정제된 컨쥬게이트는 항체 당 연결된 화합물 107의 평균 2.7개 분자(화합물 107에 대해 몰 흡광 계수 ε330㎚= 15,484㎝-1M-1 및 ε280㎚= 30, 115㎝-1M-1, 및 huMOV19 항체에 대해 ε280㎚= 201,400㎝-1M-1을 이용하여 UV-Vis 및 SEC에 의해), 95% 단량체(크기 배제 크로마토그래피에 의해); 및 최종 단백질 농도 1.1㎎/㎖인 것을 발견하였다. MS 분광학 데이터를 도 16에 나타낸다.
실시예 33. 암컷 SCID 마우스에서 NCI-H1703 NSCLC 이종이식물에 대한 단일-용량 huML66 -90 컨쥬게이트의 항종양 활성
6주령의 암컷 CB.17 SCID 마우스는 찰스 리버 래버러토리즈로부터 받았다. 마우스를 우측 옆구리에 피하 주사에 의해 0.2㎖ 50% 매트리겔/무혈청 배지에서 현탁시킨 5 x 106개 NCI-H1703 종양 세포로 접종하였다. 종양 용적이 대략 100㎣(접종 후 16일)에 도달되었을 때, 동물을 종양 용적을 기준으로 각각 6마리 마우스 4개 그룹으로 무작위화하였다. 마우스는 비히클 대조군(0.1㎖/마우스) 또는 huML66-90을 제1일(접종 후 17일)의 화합물 90의 농도를 기준으로 5, 20 또는 50㎍/㎏로 단일 IV 투여를 받았다.
종양 크기를 캘리퍼를 이용하여 3차원으로 매주 2회 내지 3회 측정하였다. 종양 용적을 식 V = 길이 x 폭 x 높이 x ½를 이용하여 ㎣로 표현하였다. 종양 용적이 50% 이상만큼 감소되었을 때 마우스는 부분적 퇴행(PR)을 갖는 것으로 고려하였고, 감지할 수 있는 종양을 검출할 수 없을 때 완전한 종양 퇴행(CR)을 갖는 것으로 고려하였다. 종양 용적은 스터디로그(StudyLog) 소프트웨어에 의해 결정하였다.
종양 성장 저해(T/C 값)를 하기 식을 이용하여 결정하였다:
T/C(%) = 치료한 종양 용적의 중앙값/대조군의 중앙값 종양 용적 x 100.
비히클 대조군의 종양 용적이 사전 결정된 크기 1000㎣에 도달되었을 때, 종양 용적을 치료(T) 및 비히클 대조군(C) 그룹에 대해 동시에 결정하였다. 무종양 마우스(0㎣)를 포함하는 각각의 처리군의 1일 중앙값 종양 용적을 결정하였다. NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42%는 최소 수준의 항종양 활성이다. T/C <10%는 높은 항종양 활성 수준으로 고려된다.
도 17에서 나타내는 바와 같이, huML66 -90 컨쥬게이트는 20㎍/㎏ 및 50㎍/㎏에서 고도로 활성이고, 20㎍/㎏은 최소 유효 용량(MED)이다.
실시예 34. 암컷 CD-1 마우스에서 단일-용량 huMov19 -90 컨쥬게이트의 약동학
7주령의 암컷 CD-1 마우스는 찰스 리버 래버러토리즈로부터 받았다. 마우스는 옆 꼬리 정맥을 통해 단일 정맥내 볼루스 주사로서 huMov19 -90 컨쥬게이트의 단일 IV 투여를 받았다. 각각의 마우스는 Ab에 기반하여 2.5㎎/㎏의 용량을 받았다. 용량 및 주사 용적을 각각의 마우스의 체중을 기준으로 개별화하였다. 주사를 27 게이지, ½ 인치 니들로 적합화한 1.0㎖ 주사기를 이용하여 수행하였다. huMov19 -90 컨쥬게이트의 투여 후 2 및 30분에, 그리고 2, 4 및 8시간에, 그리고 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28일에, 마우스를 아이소플루란 흡입에 의해 마취시키고, 대략 150㎕의 혈액을 헤파린화된 모세관 내로 우측 안구뒤 혈동을 통해 마우스로부터 수집하였다. 각각의 시점에(제0일 내지 제21일), 혈액을 한 마리 그룹에서 모든 3마리 마우스로부터 수집하였다. 그룹을 차례대로 방혈시키고; 따라서 세트한 마우스는 24시간 기간 내에 2회 초과로 방혈시키지 않는다. 최종 시점에, 투여 후 28일에, 모든 마우스를 샘플 수집을 위해 포함시켰다. 혈액 샘플을 원심분리시켜 혈장을 분리시켰다. 30㎕ 혈장을 각각의 샘플 및 시점에 대해 개개 라벨링한 마이크로원심분리관에 옮기고, 이어서, ELISA에 의한 후속 분석을 허용하기 위해 -80℃로 냉동 저장하여 항-인돌리노벤조다이아제핀 항체를 이용하여 총 Ab(비컨쥬게이팅된 Ab와 무손상 컨쥬게이트 둘 다) 및 무손상 컨쥬게이트의 농도를 결정하였다.
도 18에 나타내는 바와 같이, huMov19 -90 컨쥬게이트는 항체의 컨쥬게이트와 유사한 클리어런스를 가진다.
실시예 35. 단백질 A 수지를 이용한 친화도 포획에 의한 분해대사물질 풍부화
엽산 수용체 α(FRα)를 발현시키는 KB 세포를 5 × T150 조직 배양 플레이트에서 배양시켰다. 포화량의 FRα-표적화 huMov19 -90 컨쥬게이트를 5% CO2와 함께 완충시킨 습한 인큐베이터에서 24시간 동안 37℃에서 KB 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 24시간 후에, 세포-유출된 분해대사물질을 함유하는 배지를 채취하고 나서, 다음 분석을 위해 풀링하였다.
포화량의 항-인돌리노벤조다이아제핀 항체를 밤새 인큐베이션에 의해 4 ℃에서 단백질 A의 슬러리에 결합시켰다. 1㎖의 사전 결합 단백질 A/항-인돌리노벤조다이아제핀 항체 복합체를 몇 시간 동안 종단간 로테이터(end-to-end rotator) 상에서 25㎖의 배지와 함께 인큐베이션시켰다. 수지를 1000rpm에서 부드럽게 원심분리시키고, 상청액을 부었다. 분해대사물질에 결합된 단백질-A/항-인돌리노벤조다이아제핀 항체 수지를 PBS로 세척하였다. 분해대사물질을 아세톤 추출에 의해 유기상으로 방출시켰다. 유기 용액이 완전히 증발될 때까지 분해대사물질을 밤새 진공건조시켰다. 분해대사물질을 수 중에서 20% 아세토나이트릴을 이용하여 재구성하고, LC/MS에 의해 분석하였다.
MS 분석
세포 분해대사물질을 Q-추출 고분해능 질량 분광학(써모)을 이용하여 UHPLC/MS/MS에 의해 동정하였다. 추출된 이온 크로마토그래(XIC)을 사용하여 표적 세포 분해대사물질을 동정하고 특성규명하였다. 특징적 인돌리노벤조다이아제핀(286 m/z) 질량 신호를 함유하는 모든 분해대사물질 종을 동정하였다(도 19A 및 도 19B).
실시예 36. 암컷 CB.17 SCID 마우스에서 NCI-H2110 NSCLC 이종이식물 , Hec -1b 자궁내막 이종이식물 및 이시카와 자궁내막 이종이식물에 대한 단일-용량 huMov19-90의 항종양 활성
6주령의 암컷 CB.17 SCID 마우스는 찰스 리버 래버러토리즈로부터 받았다. 마우스의 하나의 코호트를 우측 옆구리에서 피하 주사에 의해 0.1㎖ 50% 매트리겔/무혈청 배지에서 현탁시킨 1 x 107개 NCI-H2110 종양 세포로 접종하였다. 마우스의 제2 코호트를 우측 옆구리에서 피하 주사에 의해 0.1㎖ 무혈청 배지 중에서 현탁시킨 1 x 107개 Hec-1b 종양 세포로 접종하였다. 마우스의 제3 코호트를 우측 옆구리에서 피하 주사에 의해 0.1㎖ 50% 매트리겔/무혈청 배지 중에서 현탁시킨 1 x 107개 이시카와 종양 세포로 접종하였다.
종양 용적이 대략 100㎣(접종 후 제7일에 NCI-H2110, 접종 후 제7일에 Hec-1b, 및 접종 후 제17일에 이시카와)에 도달되었을 때, 동물을 종양 용적을 기준으로 각각 6마리 마우스의 그룹으로 무작위화하였다.
NCI-H2110 이종이식물 실험에서 마우스는 제1일(접종 후 제8일)에 약물 농도에 기반하여 비히클 대조군(0.2㎖/마우스) 또는 1, 3 또는 5㎍/㎏에서 huMov19-90의 단일 IV 투여를 받았다.
Hec-1b 이종이식물 실험에서 마우스는 제1일(접종 8일 후)에 약물 농도에 기반하여 비히클 대조군(0.2㎖/마우스) 또는 10 또는 30㎍/㎏에서 huMov19-90 또는 30㎍/㎏에서 비표적화 대조군 컨쥬게이트 chKTI-90의 단일 IV 투여를 받았다.
이시카와 이종이식물 실험에서 마우스는 비히클 대조군(0.2㎖/마우스) 또는 제1일(접종 후 제18일) 약물 농도에 기반하여 10 또는 30㎍/㎏에서 huMov19-90 또는 30㎍/㎏에서 비표적화 대조군 컨쥬게이트 chKTI-90의 단일 IV 투여를 받았다.
모든 실험에 대해, 종양 크기를 캘리퍼를 이용하여 3차원으로 매주 2 내지 3회 측정하였다. 종양 용적을 식 V = 길이 x 폭 x 높이 x ½를 이용하여 ㎣로 표현하였다. 종양 용적이 50% 이상만큼 감소되었을 때, 마우스는 부분적 퇴행(PR)을 갖는 것으로 고려하였고, 감지할 수 있는 종양을 검출할 수 없을 때 완전한 종양 퇴행(CR)을 갖는 것으로 고려하였다. 종양 용적은 스터디로그(StudyLog) 소프트웨어에 의해 결정하였다.
종양 성장 저해(T/C 값)를 하기 식을 이용하여 결정하였다:
T/C(%) = 치료한 종양 용적의 중앙값/대조군의 중앙값 종양 용적 x 100.
비히클 대조군의 종양 용적이 사전 결정된 크기 1000㎣에 도달되었을 때, 종양 용적을 치료(T) 및 비히클 대조군(C) 그룹에 대해 동시에 결정하였다. 무종양 마우스(0㎣)를 포함하는 각각의 처리군의 1일 중앙값 종양 용적을 결정하였다. NCI 표준에 따르면, T/C ≤ 42%는 최소 수준의 항종양 활성이다. T/C <10%는 높은 항종양 활성 수준으로 고려된다.
도 22에서 나타내는 바와 같이, huMov19-90 컨쥬게이트는 1㎍/㎏의 용량에서 NCI-H2110 이종이식물 모델에서 비활성이고, T/C 13% 및 1/6 PR에 의해 3㎍/㎏의 용량에서 활성이며, T/C 2%, 6/6 PR 및 4/6 CR에 의해 5㎍/㎏의 용량에서 고도로 활성이었다.
도 23에서 나타낸 바와 같이, huMov19-90 컨쥬게이트는 T/C 15% 및 1/6 PR에 의해 10㎍/㎏의 용량에서 Hec-1b 이종이식물 모델에서 활성이고, T/C 9%, 6/6 PR 및 6/6 CR에 의해 30㎍/㎏ 용량에서 고도로 활성이었다. 비표적화 대조군 컨쥬게이트 chKTI-90은 T/C 34%로 30㎍/㎏의 용량에서 활성이었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, huMov19-90 컨쥬게이트를 T/C 27%, 6/6 PR 및 6/6 CR에 의해 10㎍/㎏의 용량에서 이시카와 이종이식물 모델에서 활성이고, 15%, 6/6 PR 및 6/6 CR의 T/C로 30㎍/㎏의 용량에서 활성이었다. 비-표적화 대조군 컨쥬게이트 chKTI-90은 T/C 24% 및 4/6 PR에 의해 30㎍/㎏의 용량에서 활성이었다.
실시예 37. 암컷 CB.17 SCID 마우스에서 NCI-H2110 NSCLC 이종이식물에 대한 단일-용량 huMov19 -107의 항종양 활성
SCID 마우스에서 huMOV19-107의 생체내 항종양 활성을 상기 실시예 30에 기재한 프로토콜에 따라 수행하였다. 도 25에 나타낸 바와 같이, huMov19 -107 컨쥬게이트는 10㎍/㎏ 용량 및 6/6 CR에서 고도로 활성이었다.
실시예 38. CD123-90 컨쥬게이트의 결합 친화도
예시적인 인간화된 항-CD123 항체인 huCD123-6Gv4.7S3 항체의 ADC 컨쥬게이트의 결합 친화도를 평가하고, HNT-34 세포를 이용하는 유세포분석기에 의해 대응하는 비컨쥬게이팅된 항체와 비교하였다. HNT-34 세포(5×104개 세포/샘플)를 200㎕ FACS 완충제(2% 정상 염소 혈청으로 보충한 DMEM) 중에서 ADC 및 비컨쥬게이팅된 huCD123-6Gv4.7S3 항체의 농도를 달리하여 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 펠렛화하고 나서, 2회 세척하고 나서, 100㎕의 피코에리트린(PE)-컨쥬게이팅된 염소 항-인간 IgG-항체(잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratory))와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 다시 펠렛화하고 나서, FACS 완충제로 세척하고, 1% 폼알데하이드를 함유하는 200㎕의 PBS 중에서 재현탁시켰다. HTS 멀티웰 샘플러를 이용하는 FACSCalibur 유세포 분석기, 또는 FACS 어레이 유세포 분석기를 이용하여 샘플을 획득하고 나서, 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro)(모두 미국 샌디에이고 BD 바이오사이언시즈사(BD Biosciences)제)를 이용하여 분석하였다. 각각의 샘플에 대해, FL2에 대한 기하평균 형광 강도를 계산하고, 반로그 플롯에서 항체 농도에 대해 플롯팅하였다. 용량-반응 곡선을 비선형 회귀에 의해 생성하고, 각각의 항체의 겉보기 해리 상수(Kd)에 대응하는 각각의 곡선의 EC50 값을 그래프패드 프리즘 v4(캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 그래프패드 소프트웨어)를 이용하여 계산하였다.
도 26에 나타낸 바와 같이, 컨쥬게이션은 예시적인 항-CD123 항체의 결합 친화도에 단지 보통으로 영향을 미쳤다.
실시예 39. huCD123 -90에 대한 시험관내 세포독성 활성
세포 표면 상에서 CD123을 발현시키는 세포를 사멸시키는 huCD123-6의 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)인 항-CD123 항체의 능력을 시험관내 세포독성 분석을 이용하여 측정하였다. 세포주를 세포 공급자(ATCC 또는 DSMZ)에 의해 권장되는 배양 배지에서 배양시켰다. 100㎕의 배양 배지에서 2,000 내지 10,000개의 세포를 편평 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 세포 표면 상에서 Fc 수용체를 차단하기 위해, 배양 배지를 100nM chKTI 항체(동일한 아이소타입의 항체)로 보충하였다. 컨쥬게이트를 3배 연속 희석을 이용하여 배양물 배지에 희석시키고, 100㎕을 웰 마다 첨가하였다. CD123-독립적 세포독성의 기여를 결정하기 위해, 컨쥬게이트 전에 일부 웰에 CD123 차단(예를 들어, chCD123-6 항체 100nM)을 첨가하였다. 세포 및 배지를 함유하지만, 컨쥬게이트가 없는 대조군 웰뿐만 아니라 배지만을 함유하는 웰을 각각의 분석 플레이트에서 포함하였다. 분석을 각각의 데이터 지점에 대해 3회 중복해서 수행하였다. 플레이트를 4 내지 7일 동안 습윤화한 6% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 각각의 웰 내 생존 세포의 상대적 수를 세포 계수 키트-8(메릴랜드주 록빌에 소재한 도진도 몰레큘러 테크놀로지즈 인코포레이티드)에 기반한 WST-8을 이용하여 결정하였다. 각각의 웰 내 세포의 분명한 살아있는 분획을 배지 배경 흡광도에 대해 처음 보정함으로써, 그리고 각각의 값을 대조군 웰(비처리 세포) 내 값의 평균으로 나눔으로써 계산하였다. 세포의 생존 분획을 반-로그 플롯에서 컨쥬게이트 농도에 대해 플롯팅하였다.
상이한 유래(AML, B-ALL, CML 및 NHL)의 15종의 CD123-양성 세포주를 연구에서 사용하였다(표 4). 대다수의 세포주는 적어도 하나의 음성 예후 인자(예를 들어, P-당단백질의 과발현, EVI1의 과발현, p53 변경, DNMT3A 돌연변이, FLT3 내부 종열 중복)를 지니는 악성 종양을 운반하는 환자로부터 유래되었다. 컨쥬게이트는 서브-pM 내지 낮은nM 범위의 IC50 값을 지니는 이들 세포주에 대한 높은 효능을 입증하였다(표 4).
상이한 유래의 CD123-양성 세포주에 대한 huCD123 -6-90 컨쥬게이트의 시험관내 세포독성
세포주 유래 음성 예후 인자 IC50 (M)
THP1 AML p53 결실 6.7E-12
SHI-1 AML p53 유전자 변경 1.3E-11
KO52 AML p53 돌연변이체, Pgp 과발현 1.4E-11
KASUMI-3 AML EVI1 및 Pgp 과발현 9.8E-12
KG-1 AML p53 돌연변이체, Pgp 과발현 2.2E-10
OCI-AML2 AML DNMT3A 돌연변이 8.8E-11
HNT-34 AML MECOM (EVI1) 과발현 2.0E-12
MV4-11 AML FLT3 내부 종열 중복 5.6E-13
MOLM-13 AML FLT3 내부 종열 중복 4.9E-13
EOL-1 AML 2.5E-12
MOLM-1 CML EVI1 및 Pgp 과발현 2.9E-11
KOPN8 B-ALL 1.1E-11
JM-1 B-ALL 2.4E-11
KCL-22 CML 3.0E-11
그랜타519(Granta519) NHL 1.2E-12
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 및 수탁 번호/데이터베이스 서열(폴리뉴클레오타이드와 폴리펩타이드 서열을 둘 다 포함)은 각각의 개개 간행물, 특허 출원, 인터넷 사이트 및 수탁 번호/데이터베이스 서열이 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시하는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ImmunoGen, Inc. <120> CYTOTOXIC BENZODIAZEPINE DERIVATIVES <130> WO/2016/036801 <140> PCT/US2015/048059 <141> 2015-09-02 <150> US 62/045,248 <151> 2014-09-03 <150> US 62/087,040 <151> 2014-12-03 <150> US 62/149,370 <151> 2015-04-17 <150> US 62/164,305 <151> 2015-05-20 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FOLR1 antibody heavy chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Phe Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FOLR1 antibody heavy chain CDR2 <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Lys, Gln, His, or Arg <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Gln, His, Asn, or Arg <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Gly, GLu, Thr, Ser, Ala, or Val <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Gly, Glu, Thr, Ser, Ala, or Val <400> 2 Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FOLR1 antibody heavy chain CDR3 <400> 3 Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met 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Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Arg Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Asn Val Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Trp Gly Thr Thr Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-CD37 antibody immunoglobulin heavy chain <400> 26 Gln Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Lys Lys Asp His Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Gly Tyr Ser Leu Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 27 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-CD37 antibody immunoglobulin heavy chain <400> 27 Gln Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Lys Lys Asp His Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gly Gly Tyr Ser Leu Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 28 <211> 213 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-CD37 antibody immunoglobulin light chain <400> 28 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Thr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Leu Pro Tyr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 449 <212> PRT <213> artificial <220> <223> anti-CD37 antibody immunoglobulin heavy chain <400> 29 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Phe Ala Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Leu Tyr Ser Gly Ser Thr Val Tyr Ser Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn His Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly

Claims (124)

  1. 다음의 화학식 중 임의의 하나 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 나타내는 세포독성 화합물:
    Figure pct00163

    Figure pct00164

    식 중:
    L', L'' 및 L''' 중 하나는 다음의 화학식으로 나타내고:
    -Z1-P-Z2-Rx-J (A)
    다른 둘은 동일 또는 상이하고, -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO2R', -SO3H, -OSO3H, -SO2NR'R'', 사이아노, 아지도, -COR', -OCOR', 및 -OCONR'R''로부터 독립적으로 선택되며;
    Z1 및 Z2 중 하나는 -C(=O)-이고, 다른 하나는 -NR5-이며;
    P는 아미노산 잔기 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고;
    Rx는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일이며;
    J는 세포독성 화합물을 세포-결합제에 공유결합시킬 수 있는 반응기를 포함하는 모이어티이고;
    N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00165
    은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 단, 그것이 이중 결합일 때, X는 없고 Y는 -H이거나, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며, 그것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이고;
    Y는 -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'R'', -NR'R'', -NR'COR'', -NR'NR'R'', 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 질소-함유 헤테로사이클(예를 들어, 질소 원자에 부착된 피페리딘, 테트라하이드로피롤, 피라졸, 몰폴린 등), -NR'(C=NH)NR'R''으로 나타내는 구아니디늄, 아미노산 잔기, 또는 -NRCOP'로 나타내는 펩타이드, -SR, -SOR', 할로겐, 사이아노, 아지도, -OSO3H, 아황산염(-SO3H 또는 -SO2H), 메타중아황산염(H2S2O5), 모노-, 다이-, 트라이- 및 테트라- 티오포스페이트(PO3SH3, PO2S2H2, POS3H2, PS4H2), 티오 포스페이트 에스터(RiO)2PS(ORi), RiS-, RiSO, RiSO2, RiSO3, 티오황산염(HS2O3), 아티온산염(HS2O4), 포스포로다이티오에이트(P(=S)(ORk')(S)(OH)), 하이드록삼산(Rk'C(=O)NOH) 및 폼알데하이드 설폭실레이트(HOCH2SO2 -) 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 이탈기이되, Ri는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이고, -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H, 및 -PO3H로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환되며; Ri는 추가로 본 명세서에 기재된 알킬에 대한 치환체로 선택적으로 치환될 수 있고; Rj는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며; Rk '는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴이고;
    P'는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 아미노산 잔기 또는 폴리펩타이드이며,
    각각의 경우에 대해, R은 -H, 1 내지 10개의 탄소 원자 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 또는 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    R' 및 R''는 -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 및 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 각각 독립적으로 선택되며;
    Rc는 -H 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형 또는 분지형 알킬이고;
    n은 1 내지 24의 정수이며;
    X'는 -H, 아민-보호기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 및 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 선택되고;
    Y'는 -H, 옥소기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 선택적으로 치환되는 6- 내지 18-원 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 1 내지 6개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 선택되며;
    R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SO2R', -SO3 -H, -OSO3H, -SO2NR'R'', 사이아노, 아지도, -COR', -OCOR', 및 -OCONR'R''으로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    R6는 -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, 또는 할로겐이며;
    G는 -CH- 또는 -N-이고;
    A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O-, 옥소(-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR5 및 -CRR'N(R5)-로부터 독립적으로 선택되며; 그리고
    R5는 각각의 경우에 대해 독립적으로 -H 또는 선택적으로 치환되는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조식:
    Figure pct00166

    또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 나타내는, 세포독성 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, L', L" 및 L'" 중 하나는 화학식 (A)로 나타내고, 나머지는 각각 독립적으로 -H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 할로겐, -OH, (C1-C6)알콕시, 또는 -NO2를 갖는 선형 또는 분지형 알킬인, 세포독성 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L', L" 및 L'" 중 하나는 화학식 (A)로 나타내고, 나머지는 -H인, 세포독성 화합물.
  5. 제3항에 있어서, L'는 화학식 (A)로 나타내고; L"과 L'"은 둘 다 -H인, 세포독성 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Rx는 할로겐, -OH, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시, 할로(C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q로 선택적으로 치환되는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬인, 세포독성 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, J는 NHRc1, -COOH, 및 -COE로 이루어진 군으로부터 선택된 반응기를 포함하는 모이어티이되, -COE는 반응성 에스터를 나타내고, Rc1은 할로겐, -OH 또는 (C1-C3)알콕시로 선택적으로 치환되는 -H 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬인, 세포독성 화합물.
  8. 제7항에 있어서, COE는 N-하이드록시숙신이미드 에스터, N-하이드록시 설포숙신이미드 에스터, 나이트로페닐(예를 들어, 2 또는 4-나이트로페닐) 에스터, 다이나이트로페닐(예를 들어, 2,4-다이나이트로페닐) 에스터, 설포-테트라플루오로페닐(예를 들어, 4-설포-2,3,5,6-테트라플루오로페닐) 에스터, 및 펜타플루오로페닐 에스터로부터 선택되는, 세포독성 화합물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 반응기는 N-하이드록시숙신이미드 에스터인, , 세포독성 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, L'는 다음의 화학식으로 나타내는, 세포독성 화합물:
    -NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-J (B1);
    -NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J (B2);
    -C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-J (C1), 또는
    -C(=O)-P-NR5-Cy-(CRaRb)m'-J (C2)
    식 중:
    J는 -COE이고;
    Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
    m은 1 내지 6의 정수이고;
    m'는 0 또는 1 내지 6의 정수이며; 그리고
    Cy는 할로겐, -OH, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시 또는 할로(C1-C3)알킬로 선택적으로 치환되는 5 또는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는 환식 알킬이다.
  11. 제10항에 있어서, Ra와 Rb는 둘 다 H이고; 화학식 (B2) 및 (C2)에 대한 Cy는 사이클로헥산이며; R5는 H 또는 Me인, 세포독성 화합물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, m'는 0 또는 1인, 세포독성 화합물.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, L'는 다음의 화학식으로 나타내는, 세포독성 화합물:
    -NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-S-Zs (B3); 또는
    -C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-S-Zs (C3),
    식 중:
    Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
    m은 1 내지 6의 정수이고;
    Zs는 -H, -SRd, -C(=O)Rd1이거나 또는 다음의 화학식 중 임의의 하나로부터 선택되고:
    Figure pct00167

    Figure pct00168

    식 중:
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    n'는 2 내지 6의 정수이며;
    U는 -H 또는 SO3M이고;
    M은 H+, Na+ 또는 K+이며;
    Rd는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이거나 또는 페닐, 나이트로페닐(예를 들어, 2 또는 4-나이트로페닐), 다이나이트로페닐(예를 들어, 2,4-다이나이트로페닐), 카복시나이트로페닐(예를 들어, 3-카복시-4-나이트로페닐), 피리딜 또는 나이트로피리딜(예를 들어, 4-나이트로피리딜)로부터 선택되고; 그리고
    Rd1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이다.
  14. 제6항 내지 제10항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q는 i) -SO3H, -Z'-SO3H, -OPO3H2, -Z'-OPO3H2, -PO3H2, -Z'-PO3H2, -CO2H, -Z'-CO2H, -NR11R12, 또는 -Z'-NR11R12, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는, ii) -N+R14R15R16X- 또는 -Z'-N+R14R15R16X-이며; Z'는 선택적으로 치환되는 알킬렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌 또는 선택적으로 치환되는 페닐렌이고; R14 내지 R16은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬이며; X-는 약제학적으로 허용 가능한 음이온인, 세포독성 화합물.
  15. 제14항에 있어서, Q는 SO3H 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 세포독성 화합물.
  16. 제13항에 있어서, Ra와 Rb는 둘 다 -H이고, R5는 H 또는 Me인, 세포독성 화합물.
  17. 제13항에 있어서, -(CRaRb)m-은 -(CH2)m"-C(Me2)-이고, m"은 1 내지 5의 정수인, 세포독성 화합물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, P는 2 내지 10개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드인, 세포독성 화합물.
  19. 제18항에 있어서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드인, 세포독성 화합물.
  20. 제19항에 있어서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-나이트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu 및 Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met 및 Met-Ala으로부터 선택된, 세포독성 화합물.
  21. 제20항에 있어서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala 및 D-Ala-D-Ala인, 세포독성 화합물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00169
    은 이중 결합을 나타내는, 세포독성 화합물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00170
    은 단일 결합이고, X는 -H 또는 아민 보호기이며; Y는 -H, -OR, -OCOR', -SR, -NR'R", 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 질소-함유 헤테로사이클, -SO3H, -SO2H 및 -OSO3H로부터 선택되는, 세포독성 화합물.
  24. 제23항에 있어서, Y는 -H, -SO3M, -OH, -OMe, -OEt 또는 -NHOH로부터 선택되되, M은 -H, Na+ 또는 K+인, 세포독성 화합물.
  25. 제24항에 있어서, Y는 -H, -SO3M 또는 -OH인, 세포독성 화합물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, X'는 -H, -OH, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포독성 화합물.
  27. 제26항에 있어서, X'는 -H, -OH, (C1-C3)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 페닐인, 세포독성 화합물.
  28. 제27항에 있어서, X'는 -H, -OH 또는 -Me인, 세포독성 화합물.
  29. 제28항에 있어서, X'는 -H인, 세포독성 화합물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, Y'는 -H, 옥소기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택된, 세포독성 화합물.
  31. 제30항에 있어서, Y'는 -H, 옥소기, (C1-C3)알킬 또는 할로(C1-C3)알킬인, 세포독성 화합물.
  32. 제30항에 있어서, Y'는 -H 또는 옥소인, 세포독성 화합물.
  33. 제30항에 있어서, Y'는 -H인, 세포독성 화합물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O-, -S-, -NR5- 및 옥소 -(C=O)-로부터 선택되는, 세포독성 화합물.
  35. 제34항에 있어서, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O- 및 -S-로부터 선택되는, 세포독성 화합물.
  36. 제35항에 있어서, A 및 A'는 -O-인, 세포독성 화합물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, R6은 -OMe인, 세포독성 화합물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 독립적으로 -H, 할로겐, -NO2, -OH, (C1-C3-)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 (C1-C3)알콕시인, 세포독성 화합물.
  39. 제38항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H인, 세포독성 화합물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, R, R', R" 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬인, 세포독성 화합물.
  41. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00171
    은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단, 그것이 이중 결합일 때, X는 없고 Y는 -H이며, 그것이 단일 결합일 때, X는 -H이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이며;
    R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H이며;
    R6 -OMe이고;
    X'과 Y'는 둘 다 -H이며;
    A 및 A'는 -O-이고; 그리고
    M은 H, Na+ 또는 K+인, 세포독성 화합물.
  42. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 다음의 화학식 중 임의의 하나 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택되되:
    Figure pct00172

    Figure pct00173

    Figure pct00174

    Figure pct00175

    Figure pct00176

    Figure pct00177

    Figure pct00178

    Figure pct00179

    Figure pct00180

    Figure pct00181

    Figure pct00182

    Figure pct00183

    Figure pct00184

    Figure pct00185

    Figure pct00186

    Figure pct00187

    식 중:
    R100은 -OH, -OMe 또는
    Figure pct00188
    이고;
    Y는 -H, -OH 또는 -SO3M이며;
    M은 H+, Na+ 또는 K+이고;
    Zs는 -H, -SRd, -C(=O)Rd1이거나 또는 하기 화학식 중 임의의 하나로부터 선택되고:
    Figure pct00189

    Figure pct00190

    식 중:
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    n'는 2 내지 6의 정수이며;
    U는 -H 또는 SO3M이고; 그리고
    Rd는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이거나 또는 페닐, 나이트로페닐(예를 들어, 2 또는 4-나이트로페닐), 다이나이트로페닐(예를 들어, 2,4-다이나이트로페닐), 카복시나이트로페닐(예를 들어, 3-카복시-4-나이트로페닐), 피리딜 및 나이트로피리딜(예를 들어, 4-나이트로피리딜)로부터 선택되고; 그리고
    Rd1은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬인, 세포독성 화합물.
  43. 제42항에 있어서, Y는 -SO3M인, 세포독성 화합물.
  44. 세포독성 화합물 및 세포결합제(CBA)를 포함하는 컨쥬게이트로서, 상기 세포독성 화합물은 상기 CBA에 공유결합되고, 상기 세포독성 화합물은 다음의 화학식 중 임의의 하나 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 컨쥬게이트:
    Figure pct00191

    Figure pct00192

    식 중:
    L', L'' 및 L''' 중 하나는 다음의 화학식으로 나타내고:
    -Z1-P-Z2-Rx-J' (A')
    다른 둘은 동일 또는 상이하고, -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NR'COR'', -SR, -SOR'로 표시되는 설폭사이드, -SO2R'로 표시되는 설폰, 설폰산염 -SO3M, 황산염 -OSO3M, -SO2NR'R''으로 표시되는 설폰아마이드, 사이아노, 아지도, -COR', -OCOR', 및 -OCONR'R''로부터 독립적으로 선택되며;
    Z1 및 Z2 중 하나는 -C(=O)-이고, 다른 하나는 -NR5-이며;
    P는 아미노산 잔기 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드이고;
    Rx는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일이며;
    J'는 세포결합제에 공유 결합된 연결기를 포함하는 모이어티이고;
    N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00193
    은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내며, 단, 그것이 이중 결합일 때, X는 없고 Y는 -H이거나, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 그것이 단일 결합일 때, X는 -H 또는 아민 보호 모이어티이며;
    Y는 -OR, -OCOR', -OCOOR', -OCONR'R'', -NR'R'', -NR'COR'', -NR'NR'R'', 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 질소-함유 헤테로사이클(예를 들어, 피페리딘, 테트라하이드로피롤, 피라졸, 몰폴린, 등), -NR'(C=NH)NR'R''로 나타내는 구아니디늄, 아미노산 잔기, 또는 -NRCOP'로 나타내는 펩타이드, -SR, -SOR', 할로겐, 사이아노, 아지도, -OSO3H, 아황산염(-SO3H 또는 -SO2H), 메타중아황산염(H2S2O5), 모노-, 다이-, 트라이-, 및 테트라- 티오포스페이트(PO3SH3, PO2S2H2, POS3H2, PS4H2), 티오 포스페이트 에스터(RiO)2PS(ORi), RiS-, RiSO, RiSO2, RiSO3, 티오황산염(HS2O3), 아티온산염(HS2O4), 포스포로다이티오에이트(P(=S)(ORk ')(S)(OH)), 하이드록삼산(Rk'C(=O)NOH), 및 폼알데하이드 설폭실레이트(HOCH2SO2 -) 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 이탈기이되, Ri는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이고, -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H, 및 -PO3H로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환되고; Ri는 추가로 본 명세서에 기재된 알킬에 대한 치환체로 선택적으로 치환될 수 있으며; Rj는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이고; Rk '는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴이며;
    P'는 아미노산 잔기 또는 2 내지 20개의 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드이고;
    R은 각각의 경우에 대해, -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 또는 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R' 및 R''는 -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 및 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 각각 독립적으로 선택되고;
    Rc는 -H 또는 치환 또는 비치환된 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이며;
    n은 1 내지 24의 정수이고;
    X'는 -H, 아민-보호기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 6 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 및 O, S, N 및 P로부터 독립적으로 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 선택되며;
    Y'는 -H, 옥소기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 선택적으로 치환되는 6- 내지 18-원 아릴, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 선택적으로 치환되는 5- 내지 18-원 헤테로아릴 고리, 1 내지 6개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환되는 3- 내지 18-원 복소환식 고리로부터 선택되고;
    R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 -H, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 폴리에틸렌 글리콜 단위 -(CH2CH2O)n-Rc, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, -SOR'로 나타내는 설폭사이드, -SO2R'로 나타내는 설폰, -SO3H, -OSO3H, -SO2NR'R'', 사이아노, 아지도, -COR', -OCOR', 및 -OCONR'R''로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되며;
    R6은 -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, 또는 할로겐이고;
    G는 -CH- 또는 -N-이며;
    A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O-, 옥소(-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR5 및 -CRR'N(R5)-로부터 독립적으로 선택되며;
    R5는 각각의 경우에 대해, 독립적으로 -H 또는 선택적으로 치환되는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬이다.
  45. 제44항에 있어서, 상기 화합물은 하기 구조식 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 나타내는, 컨쥬게이트:
    Figure pct00194
    .
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, L', L" 및 L'" 중 하나는 화학식 (A')로 나타내고, 나머지는 -H, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬, 할로겐, -OH, (C1-C6)알콕시 또는 -NO2인, 컨쥬게이트.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, L', L" 및 L'" 중 하나는 화학식 (A')로 나타내고, 나머지는 -H인, 컨쥬게이트.
  48. 제47항에 있어서, L'는 화학식 (A')로 나타내고; L"과 L'"은 둘 다 -H인, 컨쥬게이트.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, Rx는 할로겐, -OH, -SO3H, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시, 할로(C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q로 선택적으로 치환되는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형, 분지형 또는 환식 알킬인, 컨쥬게이트.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, J'는 CBA에 공유결합된 모이어티를 포함하고, -NRc1 또는 -C(=O)-이되, Rc1은 -H 또는 할로겐, -OH 또는 (C1-C3)알콕시로 선택적으로 치환되는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬인, 컨쥬게이트.
  51. 제52항에 있어서, J'는 -C(=O)-인, 컨쥬게이트.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, L'는 다음의 화학식으로 나타내는, 컨쥬게이트:
    -NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-J' (B1');
    -NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m'-J' (B2');
    -C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-J' (C1'), 또는
    -C(=O)-P-NR5-Cy-(CRaRb)m'-J' (C2')
    식 중:
    J'는 -C(=O)-이고;
    Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
    m은 1 내지 6의 정수이고;
    m'는 0 또는 1 내지 6의 정수이며; 그리고
    Cy는 할로겐, -OH, (C1-C3)알킬, (C1-C3)알콕시, 또는 할로(C1-C3)알킬로 선택적으로 치환되는 5 또는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는 환식 알킬이다.
  53. 제52항에 있어서, Ra와 Rb는 둘 다 H이고; 화학식 (B2') 및 (C2')에 대한 Cy는 사이클로헥산이며; R5는 H 또는 Me인, 컨쥬게이트.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, m'는 0 또는 1인, 컨쥬게이트.
  55. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, L'는 다음의 화학식으로 나타내는, 컨쥬게이트:
    -NR5-P-C(=O) 내지 (CRaRb)m-S-Zs1 (B3'); 또는
    -C(=O)-P-NR5-(CRaRb)m-S-Zs1 (C3'),
    식 중:
    Ra 및 Rb는 각각의 경우에 대해, 각각 독립적으로 -H, (C1-C3)알킬, 또는 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q이며;
    m은 1 내지 6의 정수이고;
    Zs1는 하기 화학식 중 임의의 하나로부터 선택되며:
    Figure pct00195

    Figure pct00196
    ,
    식 중:
    q는 1 내지 5의 정수이고;
    n'는 2 내지 6의 정수이며;
    U는 -H 또는 SO3M이고; 그리고
    M은 H+, Na+ 또는 K+이다.
  56. 제49항 내지 제52항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하전된 치환체 또는 이온화 가능한 기 Q는 i) -SO3H, -Z'-SO3H, -OPO3H2, -Z'-OPO3H2, -PO3H2, -Z'-PO3H2, -CO2H, -Z'-CO2H, -NR11R12, 또는 -Z'-NR11R12, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는, ii) -N+R14R15R16X- 또는 -Z'-N+R14R15R16X-이며; Z'는 선택적으로 치환되는 알킬렌, 선택적으로 치환되는 사이클로알킬렌 또는 선택적으로 치환되는 페닐렌이고; R14 내지 R16은 각각 독립적으로 선택적으로 치환되는 알킬이며; X-은 약제학적으로 허용 가능한 음이온인, 컨쥬게이트.
  57. 제56항에 있어서, Q는 SO3H 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 컨쥬게이트.
  58. 제55항에 있어서, Ra와 Rb는 둘 다 -H이고, R5는 H 또는 Me인, 컨쥬게이트.
  59. 제55항에 있어서, -(CRaRb)m-은 -(CH2)m"-C(Me2)-이고, m"은 1 내지 5의 정수인, 컨쥬게이트.
  60. 제44항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, P는 2 내지 10개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드인, 컨쥬게이트.
  61. 제60항에 있어서, P는 2 내지 5개의 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드인, 컨쥬게이트.
  62. 제60항에 있어서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Lle-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-나이트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu, β-Ala-Leu-Ala-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Arg, Arg-Val, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, 및 Met-Ala으로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  63. 제62항에 있어서, P는 Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala 및 D-Ala-D-Ala인, 컨쥬게이트.
  64. 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00197
    은 이중 결합을 나타내는, 컨쥬게이트.
  65. 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00198
    은 단일 결합을 나타내고, X는 -H 또는 아민 보호기이며; Y는 -H, -OR, -OCOR', -SR, -NR'R," 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 질소-함유 헤테로사이클, -SO3H, -SO2H 및 -OSO3H으로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  66. 제65항에 있어서, Y는 -H, -SO3M, -OH, -OMe, -OEt 또는 -NHOH로부터 선택되되, M은 -H, Na+ 또는 K+인, 컨쥬게이트.
  67. 제66항에 있어서, Y는 -H, -SO3M 또는 -OH인, 컨쥬게이트.
  68. 제44항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, X'는 -H, -OH, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  69. 제68항에 있어서, X'는 -H, -OH, (C1-C3)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 페닐인, 컨쥬게이트.
  70. 제69항에 있어서, X'는 -H, -OH 또는 -Me인, 컨쥬게이트.
  71. 제70항에 있어서, X'는 -H인, 컨쥬게이트.
  72. 제44항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, Y'는 -H, 옥소기, 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선택적으로 치환되는 선형, 분지형 또는 환식 알킬, 알켄일 또는 알킨일로 이루어진 군으로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  73. 제72항에 있어서, Y'는 -H, 옥소기, (C1-C3)알킬 또는 할로(C1-C3)알킬인, 컨쥬게이트.
  74. 제72항에 있어서, Y'는 -H 또는 옥소인, 컨쥬게이트.
  75. 제72항에 있어서, Y'는 -H인, 컨쥬게이트.
  76. 제44항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O-, -S-, -NR5- 및 옥소 -(C=O)-로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  77. 제76항에 있어서, A와 A'는 동일 또는 상이하고, -O- 및 -S-로부터 선택되는, 컨쥬게이트.
  78. 제77항에 있어서, A 및 A'는 -O-인, 컨쥬게이트.
  79. 제44항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, R6은 -OMe인, 컨쥬게이트.
  80. 제44항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 독립적으로 -H, 할로겐, -NO2, -OH, (C1-C3-)알킬, 할로(C1-C3)알킬 또는 (C1-C3)알콕시인, 컨쥬게이트.
  81. 제80항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H인, 컨쥬게이트.
  82. 제44항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, R, R', R" 및 R5는 각각 독립적으로 -H 또는 (C1-C3)알킬인, 컨쥬게이트.
  83. 제44항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    N과 C 사이의 이중선
    Figure pct00199
    은 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고, 단, 그것이 이중 결합일 때, X는 없고 Y는 -H이며, 그것이 단일 결합일 때, X는 -H이고, Y는 -OH 또는 -SO3M이며;
    R1, R2, R3, R4, R1', R2', R3' 및 R4'는 모두 -H이고;
    R6 -OMe이며;
    X'과 Y'는 둘 다 -H이고;
    A 및 A'는 -O-이며; 그리고
    M은 H, Na+ 또는 K+인, 컨쥬게이트.
  84. 제44항에 있어서, 상기 화합물은 다음의 화학식 중 임의의 하나 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택되는, 컨쥬게이트:
    Figure pct00200

    Figure pct00201

    Figure pct00202

    Figure pct00203

    Figure pct00204

    Figure pct00205

    Figure pct00206

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    Figure pct00208

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    Figure pct00213

    Figure pct00214

    Figure pct00215

    Figure pct00216

    Figure pct00217

    Figure pct00218

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    Figure pct00220

    Figure pct00221

    Figure pct00222

    Figure pct00223

    Figure pct00224


    Figure pct00225

    Figure pct00226

    Figure pct00227

    Figure pct00228

    Figure pct00229

    Figure pct00230

    Figure pct00231

    Figure pct00232

    식 중:
    r은 1 내지 10의 정수이고;
    Y는 -H, -OH 또는 -SO3M이며; 그리고
    M은 H+, Na+ 또는 K+이다.
  85. 제84항에 있어서, Y는 -SO3M인, 컨쥬게이트.
  86. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제(CBA)는 종양 세포, 바이러스 감염 세포, 미생물 감염 세포, 기생충 감염 세포, 자가면역 세포, 활성화된 세포, 골수성 세포, 활성화된 T-세포, B 세포 또는 멜라닌 세포; CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, EpCAM, CanAg, CALLA, 또는 Her-2 항원; Her-3 항원을 발현시키는 세포; 또는 인슐린 성장 인자 수용체, 표피성장인자 수용체, 및 엽산 수용체를 발현시키는 세포로부터 선택된 표적 세포에 결합하는, 컨쥬게이트.
  87. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제는 표적 세포에 특이적으로 결합하는 항체, 단일쇄 항체, 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 단일쇄 단클론성 항체, 또는 단클론성 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 키메라 항체, 키메라 항체 단편, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 도메인 항체, 도메인 항체 단편, 림포카인, 호르몬, 비타민, 성장 인자, 집락 자극 인자, 또는 영양소-수송 분자인, 컨쥬게이트.
  88. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제는 항-엽산 수용체 항체 또는 이의 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  89. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제는 항-EGFR 항체 또는 이의 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  90. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제는 항-CD33 항체 또는 이의 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  91. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제는 항-CD19 항체 또는 이의 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  92. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제는 항-Muc1 항체 또는 이의 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  93. 제44항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포결합제는 항-CD37 항체 또는 이의 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  94. 제87항 내지 제93중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 재표면화된(resurfaced) 항체, 재표면화된 단일쇄 항체, 또는 재표면화된 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  95. 제87항 내지 제93중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체, 단일쇄 단클론성 항체, 또는 단클론성 이의 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  96. 제87항 내지 제93중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체, 인간화된 단일쇄 항체, 또는 인간화된 항체 단편인, 컨쥬게이트.
  97. 제88항에 있어서, 상기 항-엽산 수용체 항체는 huMOV19 항체인, 컨쥬게이트.
  98. 제88항에 있어서, 상기 항-엽산 수용체 항체는:
    a) 서열번호 1의 중쇄 CDR1; 서열번호 7의 중쇄 CDR2 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3; 및
    b) 서열번호 4의 경쇄 CDR1; 서열번호 5의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6의 경쇄 CDR3을 포함하는, 컨쥬게이트.
  99. 제88항에 있어서, 상기 항-엽산 수용체 항체는
    a) 서열번호 11에 대해 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR); 및
    b) 서열번호 12 또는 서열번호 13에 대해 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는, 컨쥬게이트.
  100. 제88항에 있어서, 상기 항-엽산 수용체 항체는
    a) 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
    b) 서열번호 12 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 컨쥬게이트.
  101. 제88항에 있어서, 상기 항-엽산 수용체 항체는
    a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및
    b) 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  102. 제88항에 있어서, 상기 항-엽산 수용체 항체는
    a) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및
    b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  103. 제89항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는 huML66 항체인, 컨쥬게이트.
  104. 제89항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는
    a) 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄; 및
    b) 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  105. 제89항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는 huEGFR-7R인, 컨쥬게이트.
  106. 제89항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체는
    a) 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄; 및
    b) 서열번호 17 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  107. 제90항에 있어서, 상기 항-CD33 항체는 huMy9-6 항체인, 컨쥬게이트.
  108. 제90항에 있어서, 상기 항-CD33 항체는
    a) 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄; 및
    b) 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  109. 제91항에 있어서, 상기 항-CD19 항체는 huB4 항체인, 컨쥬게이트.
  110. 제91항에 있어서, 상기 항-CD19 항체는
    a) 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄; 및
    b) 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  111. 제92항에 있어서, 상기 항-Muc1 항체는 huDS6 항체인, 컨쥬게이트.
  112. 제92항에 있어서, 상기 항-Muc1 항체는
    a) 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄; 및
    b) 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  113. 제93항에 있어서, 상기 항-CD37 항체는 huCD37-3 항체인, 컨쥬게이트.
  114. 제93항에 있어서, 상기 항-CD37 항체는
    a) 서열번호 26 또는 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄; 및
    b) 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  115. 제93항에 있어서, 상기 항-CD37 항체는 huCD37-50 항체인, 컨쥬게이트.
  116. 제93항에 있어서, 상기 항-CD37 항체는
    a) 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄; 및
    b) 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 컨쥬게이트.
  117. 제44항 내지 제116항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  118. 포유류에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제44항 내지 제116항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 및 선택적으로, 화학치료제를 투여하는 단계를 포함하는, 비정상적 세포 성장을 저해하거나, 또는 포유류에서 증식성 장애, 자가면역 장애, 골 파괴 장애, 감염성 질환, 바이러스성 질환, 섬유소성 질환, 신경퇴행성 장애, 췌장 또는 신장 질환을 치료하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 방법은 암, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 이식편대숙주병(GVHD), 이식거부반응, 낭창, 근육염, 감염, 및 면역결핍증으로 이루어진 군으로부터 선택된 병태를 치료하기 위한, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 방법은 암을 치료하기 위한, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 암은 난소암, 췌장암, 자궁경부 암, 흑색종, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암), 유방암, 두경부의 편평세포암종, 전립선암, 자궁내막 암, 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종), 골수이형성 증후군(MDS), 복막암, 또는 백혈병(예를 들어, 　급성 골수성 백혈병(AML), 급성 단핵구 백혈병, 전골수세포성 백혈병, 호산구 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병(예를 들어, B-ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL) 및 만성 골수성 백혈병(CML))인, 방법.
  122. 제120항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병(AML)인, 방법.
  123. 제120항에 있어서, 상기 암은 비-소세포 폐암인, 방법.
  124. 제120항에 있어서, 상기 암은 난소암인, 방법.
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