KR20160027669A

KR20160027669A - 온도 감응성 글리콜 키토산 유도체를 이용한 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법

Info

Publication number: KR20160027669A
Application number: KR1020140116020A
Authority: KR
Inventors: 허강무; 강선웅; 강한창; 심혜은; 조익성; 조명옥
Original assignee: 충남대학교산학협력단; 한국화학연구원
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2016-03-10
Anticipated expiration: 2034-09-02
Also published as: JP2017526373A; WO2016036011A1; US20170275586A1; JP6581650B2; US10329527B2; KR101647793B1

Abstract

온도 감응성 글리콜 키토산 유도체를 이용한 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법이 개시된다. 개시된 스페로이드 형성용 배양 용기는 온도에 따라 가역적인 졸-겔 전이 특성을 갖는 글리콜 키토산 유도체가 배양 공간의 표면에 코팅된다.

Description

온도 감응성 글리콜 키토산 유도체를 이용한 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법{CELL CULTURE CONTAINER FOR FORMATION SPHEROID USING THERMOSENSITIVE GLYCOL CHITOSAN DERIVATIVES AND SPHEROID FORMATION METHOD USING THE SAME}

본 발명은 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid) 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법에 관한 것이다.

체내 세포 및 조직은 아주 복잡한 3차원 구조를 상호 작용하면서 성장하고 분화, 발전해 간다. 그러나 대부분의 세포 배양은 2차원으로 된 불침투성의 평평한 평면에서 이루어지고 있다. 따라서, 2차원 세포배양은 우리 체내 세포 환경 조건을 제대로 모사 하지는 못한다는 한계점을 지니고 있다.

최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid)의 배양이 주목을 받고 있다. 암을 모사하기 위한 세포 응집(cell aggregation)을 유도하기도 하고, 당뇨 치료를 위한 인슐린의 정상분비를 유도하기 위해서 췌도 세포를 이식함에 있어 응집된 세포를 이식하는 방법 등이 쓰이고 있어 스페로이드의 대량 생산이 요구되고 있다. 또한, 줄기 세포 연구가 성숙됨에 따라 배아 줄기세포를 3차원 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러 가지 방법이 시도되고 있다.

종래의 3차원 세포 배양 방법으로는 현적 배양법(Hanging-drop method), 회전식 배양법, 원심분리법, 마이크로 몰딩(Micromolding)법 등이 있으며, 예를 들어, 일본 특허공개 평6-327465호에서는 바닥면이 깔대기 형상인 웰에 복수의 단일세포를 씨딩하고, 바닥면에서 이 단일세포를 응집 및 분열시켜서 스페로이드를 배양하는 방법, 한국등록특허 제10-1341572호에서는 플레이트부: 및 상기 플레이트 부의 일면으로부터 연장되고, 내부에 중공형관을 포함하는 복수개의 세포 수용부;를 포함하는 3차원 세포 배양 용구를 이용하여 배양하는 방법을 개시하고 있다.

이러한 3차원 세포배양 방법은 재생 의료나 하이브리드(hybrid) 인공장기, 생체 유용 물질 생산, 생물 조직이나 기관 장기의 기능의 조사·탐색, 신약의 스크리닝(screening), 내분비 교란 물질 등의 영향을 평가하는 동물실험 대체법, 센서(sensor)기능을 가지는 세포 칩 등의 각 분야의 산업에 이용이 기대된다.

그러나, 이러한 기존의 3차원 세포배양 방법은 별도의 배양 용구를 필요로 하며, 배양 방법이 복잡할 뿐만 아니라 소요 시간도 긴 문제점이 있다.

일본 특허공개 평6-327465호 한국등록특허 제10-1341572호

본 발명의 과제는 온도에 따라 가역적인 졸-겔 전이 특성을 갖는 글리콜 키토산 유도체를 이용하여 간단한 방법으로 단시간에 3차원 세포 조직인 스페로이드를 형성할 수 있는 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법을 제공하는 것이다.

이를 위해 본 발명은

하기 화학식 1의 글리콜 키토산 유도체가 배양 공간의 표면에 코팅된 스페로이드 형성용 배양 용기를 제공한다:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

R₁은 C1∼C18의 알킬기이고,

x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.05≤x≤0.8, 0.05≤y≤0.15, 및 0.05≤z≤0.9이다.)

또한 본 발명은 세포 배양시 상기 화학식 1의 글리콜 키토산 유도체가 배양 공간의 표면에 코팅된 배양 용기를 사용하는, 스페로이드 형성 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 온도에 따른 가역적인 졸-겔 전이가 가능하고, 세포 친수성이 거의 없는 글리콜 키토산 유도체가 코팅된 배양 용기를 이용하여 세포를 배양한 후 온도 변화만으로 형성된 스페로이드를 분리하는 비교적 간단한 방법으로 단시간에 세포 스페로이드를 얻을 수 있다. 이렇게 형성된 세포 스페로이드는 세포의 특이적인 기능을 장기간에 걸쳐 유지할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 3의 a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 졸-겔 거동을 보여주는 사진이고, b)는 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 농도에 따른 졸-겔 전이 온도 변화 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 스페로이드 형성 방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 5의 a)는 마트리겔 코팅 배양 용기, b)는 N-아세틸레이트 글리콜 키토산 코팅 용기, c)는 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기에서 혈관내피전구세포 배양시 스페로이드 형성 모양을 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6의 A는 일반 배양 용기, 글리콜 키토산 코팅 용기, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기에서 심근 세포 배양시 세포 증식율 및 세포 생존율을 비교한 그래프, 도 5의 B는 일반 배양 용기, 글리콜 키토산 코팅 용기, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기에서 심근 세포 배양 시 생존/사멸 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 일반 배양 용기, 글리콜 키토산 코팅 용기, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기에서 심근 세포 배양시 세포 개수에 따른 스페로이드 형성 모양을 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 글리콜 키토산 코팅 배양 용기와 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기에서 심근 세포 배양시 세포 농도에 따른 심근세포 스페로이드 직경 분포를 나타낸 그래프이다.
도 9는 일반 배양 용기, 글리콜 키토산 코팅 배양 용기와 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기에서 형성된 심근세포 스페로이드를 각각 3일, 7일간 배양하여 스페로이드 상태로 생존/사멸 분석한 결과를 나타낸 공초점 형광현미경 사진이다.
도 10는 일반 배양 용기와 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기에서 연골 세포 배양 시 세포 개수에 따른 스페로이드 형성 모양을 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
도 11은 현적 배양법과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 용기를 이용한 스페로이드 형성방법의 스페로이드 형성 소요시간을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 특정 온도에서 가역적인 졸-겔 전이를 하는 온도감응 특성을 갖는 글리콜 키토산 유도체를 이용한 세포 배양을 통해 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid)를 형성하는 방법을 제시한다.

구체적으로, 본 발명에서는 하기 화학식 1에 나타낸 바와 같이, 5번 위치에 글리콜기가 치환된 글리콜 키토산 유도체에 있어서, 2번 위치의 아민기의 일부가 아세틸기와 R₁이C1∼C18의 알킬기인 알킬아실기로 치환된 글리콜 키토산 유도체를 이용한다:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

R₁은 C1∼C18의 알킬기이고,

상기 글리콜 키토산 유도체로 상전이 임계 온도가 37 ℃ 이하인 것을 이용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하기로 (ⅰ) N-프로피오닐레이트 글리콜 키토산; (ⅱ) N-부티로일레이트 글리콜 키토산; (ⅲ) N-펜타니오닐레이트 글리콜 키토산; (ⅳ) N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산; (ⅴ) N-아세틸레이트 글리콜 키토산이다.

본 발명의 글리콜 키토산 유도체는 상전이 임계 온도 이상의 온도에서는 화학 가교 형성 없이 이루어지는 하이드로젤(hydrogel)을 형성하고, 그 미만의 온도에서는 다시 겔 상태에서 졸 상태로 상 변화를 한다.

이러한 졸-겔 전이의 발생은 일정 수준의 치환도의 범위에서 일어나며, 졸-겔 전이가 가능한 임계 치환도는 20∼95%(화학식 1에서의 z 값 대응), 바람직하기로 20∼70%로, 상기 범위를 벗어나면 가역적인 졸-겔 전이가 발생하지 않는다. 상기 임계 치환도는 치환기의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 실시예에서 제조한 -NH 아실 글리콜 키토산의 치환도는 20∼67%의 범위 내에서 졸-겔 전이가 발생한다.

또한, 졸-겔 임계 온도는 소수성 치환기를 갖는 글리콜 키토산 유도체의 분자량에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하기로 상기 유도체는 중량평균분자량이 100∼5,000,000, 바람직하기로 200∼100,000의 범위에서 사용할 수 있다.

본 발명의 스페로이드 형성용 배양 용기는 그 내부 배양 공간의 표면에 상기한 글리콜 키토산 유도체가 코팅된다.

구체적으로 상기 배양 공간의 표면은 배양 용기와 세포가 접촉하는 부분을 말한다.

이때 배양 용기의 재질 및 형상은 특별히 제한되지 않는다. 일 예로 그 재질로, 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 및 실리콘 수지 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어지는 것이 가능하다.

상기 글리콜 키토산 유도체는 세포와 친화도가 낮아 세포 배양시 세포와 결합하지 않아 세포 응집을 유도한다. 따라서 이러한 글리콜 키토산 유도체가 코팅된 배양 용기에서 세포 배양시 효과적으로 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid) 형성이 가능하다.

이때 상기 글리콜 키토산 유도체는 세포 배양에 적합한 상전이 임계 온도를 갖기 위해 코팅용액 중 4 중량% 이상의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 코팅용액은 글리콜 키토산 유도체와 세포 배양용 배지를 포함한다.

본 발명의 스페로이드 형성 방법은 세포 배양 시 상기한 배양 용기를 사용한다.

배양 가능한 세포는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야에서 공지된 바의 어떤 세포 등이 사용이 가능하고, 일례로 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포 및 중간엽 줄기세포, 혈관내피전구세포(endothelial Progenitor Cell), 배아줄기세포(embryonic stem cell), 근모세포(myoblast), 심장줄기세포(cardiac stem cell) 등이 이용될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 이에 제한되지 않으나 골수, 근육, 지방, 제대혈, 양막, 또는 양수로부터 분리될 수 있다. 상기 혈관내피전구세포는 이에 제한되지 않으나 혈액, 제대혈, 배아 또는 골수로부터 분리될 수 있다.

일반적인 세포 배양 온도인 37 ℃ 이하의 상전이 임계 온도를 갖는 본 발명의 글리콜 키토산 유도체는 세포 배양 시 화학 가교 형성 없이 이루어지는 하이드로젤(hydrogel)을 형성하여 스페로이드 형성을 효과적으로 유도하고, 일정 크기의 스페로이드 형성 후 회수를 위해 상전이 임계 온도 미만의 온도로 감온시 다시 겔 상태에서 졸 상태로 상 변화를 하여 스페로이드의 분리가 용이하다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 기재한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: N- 헥사니오닐레이트 글리콜 키토산

하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 반응기에 아세틸화된 글리콜 키토산 10g(중량평균분자량 400 kDa, 아세틸화도 9.34±2.50 %(¹H NMR 측정시), Sigma-Aldrich, Inc., USA)을 증류수 1000ml에 용해한 다음, 글리콜 키토산과 헥사노익 무수물의 몰비가 0.4가 되도록 헥사노익 무수물 첨가한 후, 상온에서 48 시간 동안 교반하였다.

이어 반응을 종료한 후, 차가운 아세톤으로 침전시켜 반응물을 얻고, 원심분리를 통해 고형물을 얻었다. 분리한 고형물을 분획 분자량 (Molecular Weight Cut-off) 2 kDa의 투석막을 사용하여 3일 동안 증류수로 투석한 뒤 이어서 동결건조하였다. 이때 치환도(%)는 36.5±2.0, 수율은 82.3%였다.

[반응식 1]

¹ H- NMR 분석

상기에서 제조한 -NH 알킬아실 글리콜 키토산의 합성 여부를 확인하기 위해 ¹H-NMR 분석을 수행하였으며, 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다.

NMR 샘플은 D₂O를 용매로 사용하였고, 고분자를 1 wt%로 녹여 제조하였다. GC, HGC 각각의 스펙트럼 모두 δ= 4.71 ppm에서 용매로 사용한 D₂O의 피크가 나타나는 것을 확인하였고, δ= 3.68 ppm에서 글루코피라노실 고리의 H2-H8 피크가 나타났음을 관찰하였다. 또한 δ= 2.74 ppm 에서는 -NH ₂ 피크를, δ= 2.02 ppm 에서는 아세틸기인 -CO-CH ₃의 피크를 확인하였다. 글리콜 키토산에 헥사노일기를 붙인 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산(HGC)의 스펙트럼에서는 δ= 2.31 ppm에서 -CO-CH ₂-를,δ= 1.62 ppm에서 -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH ₂-CH₃의 피크가 추가적으로 나타난 것을 확인하였고, δ= 1.32 ppm 에서는 -CO-CH₂-CH ₂-CH ₂-CH₂-CH₃에 해당하는 피크가 나타나는 것을 볼 수 있다. 또한 δ= 0.89 ppm에서 -CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH ₃의 피크를 확인하였다.

FT - IR 분석

상기에서 제조한 -NH 알킬아실 글리콜 키토산의 합성 여부를 확인하기 위해 FT-IR 분석을 수행하였으며, 얻어진 결과를 도2에 나타내었다.시편은 KBr 펠렛으로 제조하였으며, 750~4000cm^-1범위에서 측정하였다. 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 각각의 스펙트럼에서 카보닐 결합(C=O)의 신축 진동을 나타내는 파장(1655cm^-1)과 C-H의 신축 진동을 나타내는 파장(2880-2930cm^-1) 모두 확인하였고, 글리콜 키토산의 스펙트럼에서는 1차 아민 결합의 굽힘 진동을 나타내는 흡수 파장이 1596cm^-1에서 나타났다. N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 스펙트럼에서는 1596cm^-1에서의 피크가 사라지고, 1555cm^-1에서 아미드 결합(N-H)의 굽힘 진동을 나타내는 흡수 파장을 확인하였다.

이와 같은 결과를 통해 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산이 잘 합성되었음을 확인할 수 있었다.

졸-겔 전이 거동

상기에서 제조한 -NH 알킬아실 글리콜 키토산을 PBS에 4 wt% 농도로 희석한 후 졸-겔 거동을 확인하였다.

도 3의 a)에 나타낸 바와 같이, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산은 낮은 온도에서는 잘 흐르는 졸 상태이지만 높은 온도에서는 젤 상태가 되어 바이알을 기울려도 잘 흐르지 않은 온도에 따른 졸-겔 상전이 거동을 확인할 수 있었다.

N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 졸-겔 전이온도는 튜브 전환법(tube inverting method)으로 측정하였고, 그 결과는 도 3의 b)에 나타내었다. 시료로 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산을 PBS(Phosphate-buffer saline)용액에 녹여 다양한 농도로 준비하였고, 4 ℃의 온도에서 보관하면서 충분히 용해시켰다. 준비된 시료는 Multi-Blok^® heater를 사용하여 온도를 올려가며 측정하였다. 바이알을 기울여 30초간 관찰하여 흐르면 졸 상태, 흐르지 않으며 겔 상태로 간주하였다.

도 3의 b)에 나타낸 바와 같이 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산을 3wt%로 녹였을 때에는 42±1, 4wt%의 경우 32.3±0.6, 5wt%의 경우 27.3±0.6에서 졸-겔 전이를 보이는 것을 확인하였다. 세포 배양 실험에서는 다양한 농도 중에서 37 ℃이하에서 졸-겔 전이가 일어나고, 점성이 더 낮은 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 4 wt% 농도로 하여 진행하였다.

제조예 2: N- 아세틸레이트 글리콜 키토산 제조

글리콜 키토산 0.2g(중량평균분자량 400 kDa, 아세틸화도 9.34±2.50 %(¹H NMR 측정시), Sigma-Aldrich, Inc., USA)을 25 ml 증류수에 용해한 뒤, 25 ml을 메탄올을 첨가하여 희석하였다. 얻어진 용액에 미리 계산된 함량의 아세트산 무수물(Sigma-Aldrich, Inc., USA)을 자석 교반기로 교반하면서 첨가하였다.

상온에서 48시간 동안 계속 교반한 후, 차가운 아세톤으로 침전시켜 반응물을 얻고, 원심분리를 통해 백색 고체를 얻었다. 이어서 얻어진 반응물을 1mol/L 수산화 나트륨 용액으로 12시간 동안 처리하여 O-아세틸기를 제거하였고, 분획 분자량(Molecular Weight Cut-off) 2 kDa의 투석막을 사용하여 3일 동안 증류수로 투석한뒤 이어서 동결건조하였다. 얻어진 N-아세틸레이트 글리콜 키토산의 아세틸화도는 92%이었다.

실시예 1: 온도감응성 글리콜 키토산을 이용한 세포 스페로이드 형성

도 4에 도시한 바와 같이, 직경 35 mm 페트리 접시에 4 wt%로 DMEM 배지에 녹여진 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산을 각각 250ul 씩 추가하여 바닥면 전체에 골고루 펴지도록 바늘이 없는 주사기 끝을 이용하여 발라주었다. 코팅된 페트리 접시를 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 over-night(O/N)으로 보관하였다. 하루 뒤, 배양한 랫드 태자 심근세포를 트립신효소 처리하여 단일 세포로 부유시켰다. 혈청이 함유된 배지로 트립신을 불활성화 시켜준 후, 원심 분리하여 세포를 모았다. 모아진 세포는 새 배지로 갈아준 뒤, 세포를 계수하였다. 계수한 세포는 최종 배지 볼륨을 3ml로 맞추어 코팅된 35mm 페트리 접시에 추가하였다. 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 하루 정도 배양하였다. 하루 뒤, 세포가 응집되었는지 현미경을 통하여 확인하였다.

실시예 2: 온도감응성 글리콜 키토산을 이용한 세포 스페로이드 형성

직경 35 mm 페트리 접시에 4 wt%로 DMEM 배지에 녹여진 마트리겔(BD-matrigel), N-아세틸레이트 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산을 각각 250ul 씩 추가하여 바닥면 전체에 골고루 펴지도록 바늘이 없는 주사기 끝을 이용하여 발라주었다. 코팅된 페트리 접시에 제대혈 줄기세포 유래 혈관전구세포를 6x10⁴개/100ul 깔아주고, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 24시간 배양하였다. 하루 뒤, 세포가 응집되었는지 현미경을 통하여 확인하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 마크리겔 코팅 배양 용기에서는 스페로이드가 형성되지 않고 세관(tubule)이 형성된 것과 달리, 아세틸화 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산이 각각 코팅된 배양 용기에서는 세포가 응집하여 스페로이드가 형성되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 1: 세포 증식율 및 세포 생존율 확인

96-웰 플레이트에 콜라겐을 코팅하였다. 랫드 태자로부터 분리한 심근세포를 2x10⁴개/100ul 깔아주었다. 다음날, 1wt % 로 희석한 글리콜 키토산, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 배지로 갈아주었다. 세포를 깔아준 다음날을 1일로 계산하였고 1, 3, 5, 7일 간격으로 새로운 배지로 갈아주면서, 일별로 MTT 분석을 시행하여 날짜에 따른 세포 증식율을 확인하였다.

5mg/ml MTT 시약을 각 웰당 20ul 씩 분주하여, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 인큐베이션 하였다. 웰에 있는 배지를 모두 제거하고, DMSO를 150ul씩 분주하였다. 플레이트를 호일로 감싸 빛을 차단시키고, 상온에서 15분 두었다. Spectra Max를 사용하여, 흡광도 540nm에서 측정하였다. 그 결과는 도 5의 A에 나타내었다.

직경 12mm 커버 슬립에 콜라겐을 코팅하여 24-웰 플레이트에 넣었다. 랫드 태자로부터 분리한 심근세포를 1x10⁵개 깔아주었다. 다음날, 1wt % 로 희석한 글리콜 키토산, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 배지로 교체해주었다. 배지 교체 3일 후, 생존/사멸 분석(Live-dead assay)(abcam, ab65470)를 시행하였고, 그 결과는 도 6의 B에 나타내었다.

도 6의 B에서 알 수 있는 바와 같이, 초록색 형광은 살아있는 세포, 붉은색 형광은 죽은 세포를 보여주는데, 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산에서 일부 세포들이 빨간색 형광을 띄긴 하였으나, 대부분 높은 생존율을 보였다. 이로부터 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산이 세포 생존율에 미치는 영향의 거의 미미함을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 세포 수에 따른 심근세포 스페로이드 형성과 장기간 배양시 세포 스페로이드의 생존율 확인

글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산이 심근세포의 삼차원 스페로이드 형성에 어떠한 영향을 끼치는지 확인하기 위하여 페트리 접시, 글리콜 키토산 코팅 접시, 그리고 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시 각각에 심근세포의 농도를 다양하게 하여 배양하였다.

심근세포의 개수를 각각 0.5x10⁵개, 1x10⁵개, 2x10⁵개, 5x10⁵개, 10x10⁵개로 하여 10%의 혈청과 1X 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지 3mL에 희석하고, 준비한 35mm 페트리 접시와 글리콜 키토산 및 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산을 코팅한 페트리 접시에 분주하였다. 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하루 배양하였다. 각각의 페트리 접시와 세포 농도, 그리고 시간에 따른 스페로이드 형성 모양을 광학현미경을 통해 X100 배율로 관찰하였다. 그 결과를 도 6의 A 및 B에 나타내었다.

도 7의 A 및 B에서 확인할 수 있듯이, 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산가 코팅된 접시에서 1일 차부터 스페로이드가 대부분 형성되었다. 2x10⁵개 ~ 10x10⁵개 심근세포에서 스페로이드는 잘 형성이 되었고, 대조군 페트리 접시에서는 세포수가 증가함에 따라 일부 스페로이드를 형성하는 반면 나머지는 단일 세포를 유지하여 부유하고 있었으며 몇몇 단일 세포들은 접시 바닥면에 부착함을 보였다. 주목할 점은 적은 수의 세포였지만 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산가 코팅된 접시에서는 글리콜 키토산 코팅군 중 2x10⁵개에서 형성되었던 스페로이드 크기와 유사한 것을 확인할 수 있었다.

대조군 페트리 접시는 심근세포들이 대부분 단일세포로 존재하며 바닥면에 부착되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 글리콜 키토산이 코팅된 페트리 접시에서 배양된 심근세포의 경우, 형성되었던 스페로이드가 바닥면에 부착되었고, 그 주변에 존재하는 단일세포 역시 바닥면에 부착한 것을 확인하였다. 반면 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 경우에는 스페로이드가 바닥에 달라붙지 않고 잘 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 3일 후에는 페트리 접시군에서 대부분의 세포들이 바닥면에 붙었으며 적은 수로 형성된 스페로이드 마저 부착하였다. 글리콜 키토산 코팅 접시는 1일 차에 형성된 스페로이드가 그대로 바닥면에 붙어 그 주변으로 세포들이 퍼져나가는 것을 확인하였다. N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시는 1일차와 유사한 모습을 그대로 유지를 하였으며, 바닥면에도 부착되지 않고 부유한 스페로이드가 잘 유지됨을 확인하였다.

이러한 결과로부터 스페로이드를 형성하기에 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시가 적은 수의 세포로도 스페로이드를 형성하기에 큰 문제점이 없었고, 3일이 지난 후에도 여전히 스페로이드를 형성함으로써 장기적 실험에 이용됨이 용이한 것으로 보인다.

도 8은 글리콜 키토산 코팅 배양 접시와 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시에서 심근 세포 배양시 세포 농도에 따른 심근세포 스페로이드 직경 분포를 나타낸 그래프이다.

다양한 세포 농도별로 스페로이드가 형성된 정도와 스페로이드의 직경 분포를 알아보기 위하여 위에서 만들어진 스페로이드를 3일간 배양하여 직경과 스페로이드 갯수를 계수하였다.

도 8을 참조하면, 2x10⁵개의 세포가 배양된 글리콜 키토산과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시를 비교해보면, 글리콜 키토산 코팅 접시의 경우 대부분의 스페로이드가 약 40um 정도의 직경을 갖는 것을 확인할 수 있었고, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시의 경우에는 주로 100um 이하의 직경을 가지면서도 글리콜 키토산보다 스페로이드 개수가 현저히 많은 것을 확인하였다. 5x10⁵개의 세포가 배양된 코팅 접시를 각각 비교해보면, 글리콜 키토산 코팅 접시에서 배양된 심근세포 스페로이드는 100um 이하의 직경 분포를 가지고, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시에서 배양된 스페로이드는 대부분 150um 이하의 직경 분포를 가지면서 글리콜 키토산보다 더 많은 스페로이드가 형성되었음을 확인하였다. 10x10⁵개의 경우, 글리콜 키토산 코팅 접시와 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시 모두 150um 이하의 직경을 갖는 스페로이드가 대부분이었지만, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시의 경우 더 많은 개수의 스페로이드를 형성하였고, 250um 부근의 직경을 갖는 스페로이드 역시 형성되는 것을 확인하였다.

상기에서 만들어진 스페로이드를 3일, 7일간 배양하여 스페로이드 상태 그대로 생존/사멸 분석(Live-dead assay)를 진행하였다. 공초점 형광현미경을 이용하여 촬영하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 3일 차에는 페트리 접시와 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시는 대부분 초록 형광을 띄고 있고 죽은 세포는 거의 관찰 되지 않았다. 반면에 3일 차 글리콜 키토산 코팅 접시의 스페로이드는 죽어있는 세포가 스페로이드 안에서부터 분포하고 있는 것을 관찰할 수 있었다. 7일 차에서도 3일 차와 비슷한 결과를 얻었다. N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시의 스페로이드가 7일 차에서 조금 더 죽은 세포를 관찰할 수 있었으나, 스페로이드 크기와 비교하였을 때는 글리콜 키토산보다 생존율은 더 높은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 글리콜 키토산, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시에서 심근 세포 스페로이드를 10일 동안 유지하였다. 글리콜 키토산 코팅과 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅을 비교해보았을 때, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산의 박동 세기가 글리콜 키토산의 박동 세기보다 일정하고 지속적이었다.

실험예 3: 세포 농도에 따른 연골세포 스페로이드 직경 분포

심근세포와 같이 유사한 결과가 나오는지를 확인하기 위해 다른 세포를 이용하여 동일한 실험을 진행하였다. 사용한 세포는 연골세포로 다양한 세포수를 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시에 분주하여 2일 뒤에 관찰하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 심근 세포와 달리 대조군 페트리 접시에서도 연골 세포 스페로이드를 잘 형성하였고, N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산에서는 더 작은 세포 수에서도 스페로이드를 잘 형성한다는 것을 관찰하였다.

실험예 4: 현적 배양법과의 스페로이드 형성 소요시간 비교

기존에 스페로이드를 제작하는 방법 중 현적 배양법(hanging drop)은 중력을 이용하는 방법으로 이것은 세포가 섞인 배지를 한 방울씩 페트리 접시 덮개에 떨어뜨려 덮어씌우는 것이다. 일정한 크기의 스페로이드를 만들 수 있는 장점이 있지만 많은 수의 스페로이드를 만들수록 시간은 오래 걸리고, 다루기가 쉽지 않은 단점이 있다. 1000개의 스페로이드를 만들었을 때 소요되는 시간을 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시와 비교하여 도 11에 나타내었다.

도 11을 참조하면, 종래 현적 배양법과 비교하여 N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산 코팅 접시를 이용하면 스페로이드 형성 시간이 현저히 단축되었다.

Claims

하기 화학식 1의 글리콜 키토산 유도체가 배양 공간의 표면에 코팅된 스페로이드 형성용 배양 용기:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R₁은 C1∼C18의 알킬기이고,
x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.05≤x≤0.8, 0.05≤y≤0.15, 및 0.05≤z≤0.9이다.)
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 글리콜 키토산 유도체는 치환도가 20∼95%인 것을 특징으로 스페로이드 형성용 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체는 하기 화합물 중에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 스페로이드 형성용 배양 용기:
(ⅰ) N-프로피오닐레이트 글리콜 키토산;
(ⅱ) N-부티로일레이트 글리콜 키토산;
(ⅲ) N-펜타니오닐레이트 글리콜 키토산;
(ⅳ) N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산;
(ⅴ) N-아세틸레이트 글리콜 키토산
제1항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체는 중량평균분자량이 200∼5,000,000인 것을 특징으로 하는 스페로이드 형성용 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체는 상전이 임계 온도 이상의 온도에서는 화학 가교 형성이 없이 이루어지는 하이드로젤을 형성하는 것을 특징으로 하는 스페로이드 형성용 배양 용기.
제1항에 있어서, 상기 상전이 임계 온도는 37 ℃ 이하인 것을 특징으로 하는 스페로이드 형성용 배양 용기.
세포 배양시 하기 화학식 1의 글리콜 키토산 유도체가 배양 공간의 표면에 코팅된 배양 용기를 사용하는, 스페로이드 형성 방법:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R₁은 C1∼C18의 알킬기이고,
x, y, z는 10 내지 10000의 정수이고, 이들의 몰%는 0.05≤x≤0.8, 0.05≤y≤0.15, 및 0.05≤z≤0.9이다.)
제7항에 있어서, 상기 화학식 1의 글리콜 키토산 유도체는 치환도가 20∼95%인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체는 하기 화합물 중에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(ⅰ) N-프로피오닐레이트 글리콜 키토산;
(ⅱ) N-부티로일레이트 글리콜 키토산;
(ⅲ) N-펜타니오닐레이트 글리콜 키토산;
(ⅳ) N-헥사니오닐레이트 글리콜 키토산;
(ⅴ) N-아세틸레이트 글리콜 키토산
제7항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체는 중량평균분자량이 200∼5,000,000인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체는 상전이 임계 온도 이상의 온도에서는 화학 가교 형성이 없이 이루어지는 하이드로젤을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 상전이 임계 온도는 37 ℃ 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 글리콜 키토산 유도체의 상전이 임계 온도 미만으로 온도를 낮추어 형성된 스페로이드를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.