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KR20160005140A - 조직 복구 및 재생을 위한 세포 증식 방법 및 약제학적 제제 - Google Patents

조직 복구 및 재생을 위한 세포 증식 방법 및 약제학적 제제 Download PDF

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KR20160005140A
KR20160005140A KR1020157036694A KR20157036694A KR20160005140A KR 20160005140 A KR20160005140 A KR 20160005140A KR 1020157036694 A KR1020157036694 A KR 1020157036694A KR 20157036694 A KR20157036694 A KR 20157036694A KR 20160005140 A KR20160005140 A KR 20160005140A
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South Korea
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cells
mesenchymal stem
serum
present
cell
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Application number
KR1020157036694A
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English (en)
Inventor
오사무 혼모우
기요히로 호우킨
Original Assignee
훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠
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Publication date
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Priority claimed from JP2007236499A external-priority patent/JP2009065884A/ja
Priority claimed from JP2007278049A external-priority patent/JP2009107929A/ja
Priority claimed from JP2007278083A external-priority patent/JP2009100719A/ja
Application filed by 훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠 filed Critical 훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 생물학적 조직 복구/재생을 위한 안전하고 효과적인 약제학적 제제를 제공하기 위해, 살아있는 개체로부터 수집된 세포를 엑스 비보로 빠르고 대량으로 증식하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 동종(자연발생 포함) 혈청을 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 것에 의해 살아있는 개체로부터 수득된 시료 중의 세포를 증식하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 동종 혈청은 혈청 종양 마커 및/또는 감염 인자에 대해 음성인 것으로 결정되었고, 상기 수집된 시료에 첨가된 항응고제(예를 들면, 헤파린, 헤파린 유도체, 또는 그의 염)의 양은 시료의 부피 대비 5 U/mL 미만이거나 또는 배양의 개시시에 배지 중의 항응고제의 양은 0.5 U/mL 미만이다. 본 발명은 또한 상기 방법의 이용에 관한 것이다.

Description

조직 복구 및 재생을 위한 세포 증식 방법 및 약제학적 제제{Cell growth method and pharmaceutical preparation for tissue repair and regeneration}
본 발명은 살아있는 개체로부터 수집된 세포를 엑스 비보(ex vivo)로 빠르게 대량으로 증식시키는 방법; 상기 방법에 의해 증식된 세포; 상기 세포를 포함하는 생물학적 조직 복구 및 재생을 위한 약제학적 제제(pharmaceutical preparation); 및 상기 약제학적 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히 중간엽 줄기 세포의 자가이식(autotransplantation)을 위해 적합하고 특히 신경계의 조직의 복구 및 재생에 적용가능하다.
이전에는 손상된 신경 조직의 기능 회복은 매우 어려운 것으로 간주되었다. 그러나, 최근에 자발적으로 증식하는 능력 및 다능성을 보유한 신경 줄기 세포가 성체 뇌에서 발견되었다. 이 발견에 근거하여, 재생 의학이 중추신경계에 관해 활발하게 연구되었다. 손상된 세포를 보충하기 위한 세포 치료법(cell therapy)은 줄기 세포를 이용한 재생 의학으로서 실제 적용에 가장 근접한 것으로 고려된다. 세포 치료법에서, 공여체에 의해 제공된 세포들(이하에서, 공여 세포(donor cell)로 지칭됨)은 엑스 비보에서 배양되고, 증식되고, 및/또는 분화하도록 유도된다. 적절한 형태의 세포가 수용체(recipient)의 손상된 조직 세포를 보충하기 위해 수용체인 살아있는 개체에 투여된다.
뇌 신경 질환의 경우, 신경계의 세포로의 분화능을 갖는 세포가 조직으로부터 추출되고, 배양되고 개체로 이식되는 것인 시도가 허혈 또는 외상 모델에 대해 이루어졌다. 예를 들면, 본 발명자들은 신경 세포로 분화할 수 있는 세포를 포함하는 세포 분획이 골수 세포에 존재한다는 것을 이미 발견하고 이 세포들을 랫트의 탈수초화 척수 모델에 이식하면 탈수초화 액손을 재수초화시킨다는 것을 더 입증하였다 (특허문헌 1).
질병의 치료, 특히, 뇌경색에서 기인되는 허혈성 뇌 질환과 같은, 급성기의 증상을 갖는 질병의 치료에서 공여 세포의 이용을 위해, 공여 세포를 빠르게 대량으로 증식시키는 것이 중요하다. 엑스 비보로 세포를 증식시키기 위한 다양한 시도가 세포 생존율을 개선하고 증식 속도를 증가시키기 위해 이루어졌다.
예를 들면, 다양한 성장-촉진 물질로 보충된 배지가 세포 증식 속도를 개선시키기 위해 이용된다. 예를 들면, 특허문헌 2는 백혈구 저해 인자가 세포 증식 속도를 증가시킨다는 것을 개시한다. 특허문헌 3은 조혈 세포의 증식을 위한 재조합 인간 혈청 알부민을 함유한 배지를 개시한다. 특허문헌 4는 비타민 C 및 염기성 섬유모세포 성장 인자를 함유한 배지에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시한다. 다른 성장 인자(예를 들면, 상피 세포 성장 인자, 신경 세포 성장 인자, 간 세포 성장 인자, 트롬보포이에틴, 및 인터루킨)의 이용도 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다.
*세포 증식 속도를 보다 더 증가시키는 배양 물질도 개발되었다. 예를 들면, 특허문헌 5는 기저막 세포외 매트릭스(basement membrane extracellular matrix) 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시한다.
또한, 혈청이 일반적으로 성장-촉진 물질로 이용된다. 현재까지, 우태혈청(FBS) 또는 다른 세포 성장 인자를 포함한 약 10% 내지 20%의 외래 동물 혈청으로 보충된 배지가 줄기 세포 배양에서 널리 이용되고 있다. 그러나, FBS와 같은 동물 세포는 로트(lot) 별로 조성이 상이하고 또한 바이러스 또는 프리온과 같은 병원체에 의한 가능한 오염의 문제를 갖는다.
그와 같은 문제를 해결하기 위해, 무혈청 배지도 개발되었다 (예를 들면, 특허문헌 2 및 3 참조). 그러나, 그와 같은 무혈청 배지에서의 배양은 현재의 상황 하에서 혈청-보충 배지에서의 배양과 동등한 증식을 거의 가져오지 않는다.
반면에, 인간 혈청을 이용하기 위한 시도에서, 태아 혈청의 이용은 윤리적 관점에서 어렵기 때문에 성인 혈청이 이용된다 (예를 들면, 특허문헌 6 내지 8 참조). 성체 혈청의 이용의 장점은 수집되는 공여 세포가 유래된 개체의 자가 혈청이 이용될 수 있다는 것이다. 자가 혈청의 이용은 적합성(compatibility) 및 안전성의 관점에서 매우 바람직하다.
성체 혈청의 이용의 단점은 예를 들면, FBS를 이용하여 수득된 것보다 더 낮은 성장-촉진 활성이다. 성체 혈청은 그 자체로 불충분한 세포 성장-촉진 활성을 보이며 따라서, FBS를 이용하여 수득된 것과 동등한 성장을 수득하기 위해 FBS를 더 첨가하거나(특허문헌 6) 또는 다른 성장 인자를 첨가하는 것(특허문헌 7)을 불가피하게 요구한다. 그러나, FBS를 이용하여 수득된 것과 동등한 효과가 성장 인자 등을 첨가하는 것에 의해 수득되는 경우, 전술된 바와 같은 급성기의 질환의 치료에 적용가능한 신속한 대량 증식이 수득될 수 없다.
반면에, 살아있는 개체로부터 수집된 세포를 배양/증식시키는 통상적인 방법은 혈액 응집을 피하기 위해 공여체로부터의 혈액 성분을 포함하는 조직 또는 세포의 수집 동안 헤파린을 첨가하는 단계를 포함한다 (예를 들면, 특허문헌 9 및 비-특허문헌 1과 2 참조). 통상적인 케이스(예를 들면, 일반적인 골수 이식을 위한 골수 세포의 수집)에서, 투여된 헤파린의 양은 세포 용액의 부피에 대해 약 수십 U/mL (약 20 내지 40 U/mL)이다. 예를 들면, 특허문헌 8은 약 5 내지 15 U/mL 범위로 헤파린을 함유한 헤파린/완충 용액을 골수액에 첨가하는 것을 개시한다. 특허문헌 2는 헤파린이 배양 배지에 더 포함되는 것인 방법을 개시한다.
헤파린은 또한 전술된 혈액 응고를 방지하기 위한 적용 외에, 증식 보조제(growth aid)로 이용된다. 예를 들면, 특허문헌 4는 헤파린이 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)의 그의 수용체에 대한 친화도를 강화시키는 효과를 갖는다는 것을 개시한다. 또한, 특허문헌 10은 신경 줄기 세포 성장을 위한 보조제로서, 술페이트화 글리코사미노글리칸 함유 헤파린의 변형된 형태를 개시한다. 그러나, 헤파린을 이용한 이 방법들도 현재의 상황 하에서 충분히 빠르고 광범위한 성장 속도를 달성할 수 없다.
한편, 손상된 경우, 살아있는 개체는 손상 부위가 자율적으로 복구되는 메카니즘을 갖는다. 따라서, 어느 정도의 손상은 기능적 손상 없이 복구될 수 있다. 그러나, 내생적 복구(endogenous repair) 메카니즘은 큰 손상의 경우 충분하지 않다. 이 경우, 복구가 지연되거나 또는 손상이 불완전하게 복구되어, 기능적 손상을 남길 수 있다. 그와 같은 손상을 입은 생물학적 조직, 특히, 신경 조직 등은 통상적으로 복구하는 것이 매우 어려운 것으로 고려된다. 그러나, 줄기 세포가 다능성을 갖는다는 최근의 발견으로, 손상된 세포를 그와 같은 줄기 세포로 보충하기 위한 시도가 이루어졌다. 예를 들면, 특허문헌 11은 중간엽 줄기 세포가 질병의 급성기 (허혈증 유도의 3시간 내지 24시간 후)에 뇌경색 모델 렛트에 투여되고 결과적으로 유의성 있는 치료 효과를 생성했다는 것을 개시한다.
그러나, 손상 부위가 손상으로부터의 시간의 경과 때문에 어느 정도까지 안정화된 아급성기 이후에 상실된 기능을 복구하는데 효과적인 방법은 보고된 바 없다.
특허문헌 1: 팜플렛 WO02/00849A1 특허문헌 2: 국제특허출원의 국내공개 제2002-518990호 특허문헌 3: 일본특허공개 제2005-204539호 특허문헌 4: 일본특허공개 제2006-136281호 특허문헌 5: 일본특허공개 제2003-52360호 특허문헌 6: 일본특허공개 제10-179148호 특허문헌 7: 일본특허공개 제2003-235548호 특허문헌 8: 일본특허공개 제2006-55106호 특허문헌 9: 팜플렛 WO01/48147A1 특허문헌 10: 일본특허공개 제2005-218308호 특허문헌 11: 팜플렛 WO2005/007176
비-특허문헌 1: F. Takaku, "Manual of Bone Marrow Transplantation", first edition, CHUGAI-IGAKUSHA, 1996, p. 86 비-특허문헌 2: Y. Miura, ed., "Method of Hematopoietic Stem Cell Culture" first impression of revised 2nd edition, CHUGAI-IGAKUSHA, 1989, p. 38
따라서, 본 발명의 목적은 세포 이식을 위해 엑스 비보로 세포를 증식시키는 통상적인 기법의 문제를 해결하고 세포를 통상적인 방법보다 더 높은 증식 속도로 빠르게 대량으로 증식시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 증식된 세포를 이용하여, 조직 복구를 보조하기 위한 매우 실용적인 제제를 제공하는 것이다. 이 제제는 손상의 아급성기 또는 그 이후에 투여되는 경우에도 치료 효과를 갖는다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 세포 배양의 다양한 조건 및 절차를 조사하였고, 그 과정에서 혈액 응고를 예방하기 위한 목적으로 통상적으로 이용되는 헤파린에 중점을 두는 것에 의해 연구를 수행하였다. 결론적으로, 본 발명자들은 헤파린이 세포 증식에 대해 유의성 있는 저해 효과를 갖는다는 것을 발견했다. 추가적인 연구의 결과로, 본 발명자들은 세포들이 헤파린과의 접촉을 포함하지 않는 조건 하에서 배양되는 한, 탁월한 증식 효율성을 갖는(빠르게 증식하는) 세포가 FBS 대신에 동종(allogeneic)(자가발생형(autogenic) 포함) 혈청을 이용한 배양 방법에서도 수득될 수 있고, 수득된 세포는 높은 분화능을 가지며 안전하다는 것을 발견했다. 이 발견에 근거하여, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명은 배지 중에서 세포를 배양하는 것에 의해 살아있는 개체로부터 수집된 시료 중의 세포를 증식시키는 방법으로서, 상기 방법은 동종 혈청을 포함하는 배지에서, 항응고제와의 실질적인 접촉 없이 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다. 본 발명에서, 동종 혈청은 종양 마커 및/또는 감염 인자에 대해 음성인 것으로 결정되는 것이 바람직하다. 또한, 동종 혈청은 수집된 세포들이 유래된 개체로부터 수득된 자가 혈청인 것이 바람직하다.
본 발명에서, 혈청 종양 마커의 예는 페리틴, CEA, AFP, BFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CA72-4, STN, DUPAN-2, SLX, ST-439, SPAN-1, SCC, PSA, G-세미노프로테인(seminoprotein), TPA, CYFRA, PAP, NSE, C-펩티드, PIVKA, Pro-GRP, HCGβ, 엘라스타아제, β2 마이크로글로불린, S-NTX, 항-p53 항체, 및 HER2를 포함할 수 있다. 감염 인자의 예는 HIV, ATL, HB, HC, 매독(syphilis), 및 인간 파보바이러스(human parvovirus) B19를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 수집된 시료에 첨가된 항응고제의 양이 시료의 부피에 대해 5 U/mL 미만인 것인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 배양의 개시 시에 배지 중의 항응고제의 양은 0.5 U/mL 미만인 것인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항응고제가 헤파린, 헤파린 유도체, 또는 그의 염인 것인 세포 증식 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포가 혈청을 함유한 배지에서 증식되는 것인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 세포가 상기 세포가 유래된 동물의 종과 동일한 종의 동물 개체의 혈청을 포함하는 배지에서 증식되는 것인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 세포가 자가혈청을 포함하는 배지에서 증식되는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 배지가 1 내지 20 부피%의 혈청 함량을 갖는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 줄기 세포가 증식되는 것인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 중간엽 줄기 세포가 증식되는 것인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 세포가 증식되는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 줄기 세포가 미분화 상태에서 증식되는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 중간엽 줄기 세포가 배지 중의 세포의 밀도가 5,500개의 세포/cm2 이상에 도달한 시점에 계대배양되는 것인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 배지가 주당 1회 이상 교체되는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 세포의 총 갯수가 100,000,000개 이상에 도달할 때까지 계대배양이 반복되는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포가 CD24 발현을 갖지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 방법에 의해 배양된 단리된 배양된 인간 세포에 관한 것이다.
본 발명은 세포가 표 1에 기재된 양성 그룹의 90% 이상의 CD 항원의 발현을 가지며 표 1에 기재된 음성 그룹의 90% 이상의 CD 항원의 발현을 갖지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 방법에 의해 배양된 단리된 배양된 인간 세포에 관한 것이다.
상기 세포는 세포들이 인간에서 발현이 바람직하지 않은 모든 다양한 암-관련 유전자, 예를 들면, EWI-FLI-1, FUS-CHOP, EWS-ATF1, SYT-SSX1, PDGFα, FLI-1, FEV, ATF-1, WT1, NR4A3, CHOP/DDIT3, FUS/TLS, BBF2H7, CHOP, MDM2, CDK4, HGFR, c-met, PDGFα, HGF, GFRA1, FASN, HMGCR, RGS2, PPARγ, YAP, BIRC2, 루미칸(lumican), 칼데스몬(caldesmon), ALCAM, Jam-2, Jam-3, 카데린(cadherin) II, DKK1, Wnt, 뉴클레오스테민(Nucleostemin), 뉴로피브로민(Neurofibromin), RB, CDK4, p16, MYCN, 텔로미어(telomere), hTERT, ALT, Ras, TK-R, CD90, CD105, CD133, VEGFR2, CD99, ets, ERG, ETV1, FEV, ETV4, MYC, EAT-2, MMP-3, FRINGE, ID2, CCND1, TGFBR2, CDKNIA, p57, p19, p16, p53, IGF-1, c-myc, p21, 사이클린 D1, 및 p21의 이상(aberrant) 발현을 갖지 않는 것을 더 특징으로 한다. 이 이상 발현은 건강한 개체에서의 상응하는 발현 수준보다 유의성 있게 더 높은 발현을 의미한다.
본 발명은 상기 세포를 이용하여 조직 복구/재생을 위한 약제학적 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포를 포함하는, 조직 복구/재생용 약제학적 제제에 관한 것이다.
본 발명은 손상 부위의 복구 또는 노화에서 기인된 노화 부위의 복구를 보조하기 위한 약제학적 제제로서, 세포는 중간엽 줄기 세포이고, 정맥내로, 요막 천자(lumbar puncture)를 통해, 뇌내로, 뇌실내로, 국소로, 또는 동맥내로 투여되는 것인 약제학적 제제에 관한 것이다. 조직은 구체적으로 한정되지 않으며 뇌 또는 척수를 포함한 신경계의 조직, 신장, 췌장, 간, 장, 위, 소화기관, 폐, 심장, 비장, 혈관, 혈액, 피부, 뼈, 연골, 치아 및 전립선에 의해 예시될 수 있다. 세포는 바람직하게는 자가 세포이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조직 복구/재생을 위한 약제학적 제제는 질병 또는 질환의 아급성기 또는 그 이후에 투여되고 사이토카인 분비, 혈관형성, 및/또는 신경 재생에 의해 손상 부위의 복구를 보조한다.
일 구체예에서, 손상 부위는 신장이고, 약제학적 제제는 BUN 값 및/또는 크레아틴 값의 개선에 의해 손상 부위의 복구를 촉진한다.
일 구체예에서, 손상 부위는 췌장이고, 약제학적 제제는 혈당 수준, 혈청 Glu A1 농도, 및/또는 혈청 HbA1C 농도의 개선에 의해 손상 부위의 복구를 촉진한다.
일 구체예에서, 손상 부위는 심장이고, 약제학적 제제는 혈청 프로스타글란딘 D 합성효소 농도 및/또는 혈청 호모시스테인 농도의 개선에 의해 손상 부위의 복구를 촉진한다.
일 구체예에서, 손상 부위는 간이고, 약제학적 제제는 GOT 값, GPT 값, 및/또는 γ-GTP 값의 개선에 의해 손상 부위의 복구를 촉진한다.
일 구체예에서, 손상 부위는 뇌이고, 약제학적 제제는 실어증의 지표로 작용하는 SLTA 값 및/또는 지적능력 회복의 지표로 작용하는 WAIS-R 값의 개선을 촉진하는 것에 의해 실어증 또는 치매를 치료할 수 있다.
일 구체예에서, 손상 부위는 전립선이고, 약제학적 제제는 PSA 값의 개선에 의해 손상 부위의 복구를 촉진한다.
본 발명의 조직 복구/재생을 위한 약제학적 제제에 의해 표적화되는 질환 또는 질병의 예는 구체적으로 신장 손상, 간 손상, 당뇨병을 포함한 췌장 장애, 양성 전립선 비대증, 고지혈증, 실어증 및 치매를 포함한 고등 뇌 기능장애(higher brain dysfunction), 소생-후 뇌병증(post-resuscitation encephalopathy), 심장병, 및 척수 손상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 세포를 제조하기 위한 키트로서, 상기 키트는 0.5 U/mL 미만의 양으로 항응고제를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지가 충진된 용기를 포함하는 것인 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 세포를 제조하기 위해 필요한 다른 시약, 장치, 또는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 헤파린은 상기 키트에서 존재하는 경우, 항응고제로 이용된다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 세포를 본 발명의 방법에 의해 배양하는 단계, 암-관련 유전자의 발현에 대해, 이전 단계에서 수득된 세포를 조사하는 단계, 및 상기 조사에서 안전한 것으로 확인된 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 조직 복구/재생을 위한 세포 치료법(cell therapy)에 관한 것이다. 이때, 조사될 암-관련 유전자의 예는 앞서 예시된 것들을 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 세포 치료법은 허혈성 신경 질환의 치료이고 상기에서 조직은 신경계의 조직이고, 세포는 자가 중간엽 줄기 세포이고, 정맥내로, 요막 천자를 통해, 뇌내로, 뇌실내로, 또는 동맥내로 투여된다.
본 명세서는 본 출원의 우선권을 위한 기초로 작용하는 일본특허출원 제2007-235436호 (2007년 9월 11일에 제출됨), 제2007-236499호 (2007년 9월 12일에 제출됨), 제2007-267211호 (2007년 10월 12일에 제출됨), 제2007-278049호 (2007년 10월 25일에 제출됨), 및 제2007-278083호 (2007년 10월 25일에 제출됨)의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
이하에서, 본 발명에 따른 세포 증식 방법이 보다 상세하게 설명될 것이다.
본 발명의 방법은 배지에서 세포를 배양하는 것에 의해, 살아있는 개체로부터 수집된 시료 중의 세포를 증식시키는 방법이고, 상기 방법은 동종 혈청을 포함하는 배지에서, 항응고제와의 실질적인 접촉 없이 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 상기 동종 혈청은 혈청 종양 마커 및/또는 감염 인자에 대해 음성인 것으로 결정된 것이 바람직하다. 또한, 상기 동종 혈청은 상기 수집된 세포들이 유래된 개체의 자가 혈청인 것이 바람직하다.
이때, 본 발명에서 조사될 혈청 종양 마커의 예는 페리틴, CEA, AFP, BFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CA72-4, STN, DUPAN-2, SLX, ST-439, SPAN-1, SCC, PSA, G-세미노프로테인, TPA, CYFRA, PAP, NSE, C-펩티드, PIVKA, Pro-GRP, HCGβ, 엘라스타아제, β2 마이크로글로불린, S-NTX, 항-p53 항체, 및 HER2를 포함할 수 있다. 상기 감염 인자의 예는 HIV, ATL, HB, HC, 매독, 및 인간 파보바이러스 B19를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 시료는 증식할 수 있는 능력을 가지며 및/또는 조직 복구/재생을 위해 유용한 세포를 포함하는 체액 및/또는 조직이다. 시료의 예는 골수액, 혈액(말초 혈액 또는 제대혈), 및 림프와 같은 체액; 근육 조직, 골 조직, 피부, 림프 조직, 혈관(vascular channel), 및 소화 기관과 같은 조직; 및 배아(인간 배아 제외)를 포함한다. 살아있는 개체로부터 수집된 시료는 전체 시료로, 또는 필요한 경우, 처리(예를 들면, 불필요한 성분의 제거, 특정한 세포 분획의 정제, 및 효소 처리) 후에 본 발명에 따른 증식 방법에 적용된다.
본 명세서에서, 구 "항응고제와 (세포의) 실질적인 접촉 없이(without substantial contact (of the cells) with an anticoagulant)"는 세포 수집부터 전체 배양 기간까지의 시점에 항응고제가 실질적으로 감소된 양으로 이용된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 이는 항응고제가 세포 수집용 용기(혈액 수집 튜브, 등)의 내벽이 항응고제 용액으로 적셔질 정도로 첨가되거나; 항응고제가 첨가되지 않거나; 또는 시료 중의 항응고제가 배양의 개시 전에 실질적으로 제거되는 경우에 수득된 상태를 의미한다.
보다 빠르고 광범위한 세포 증식을 수득하기 위해, 시료 수집 동안 첨가되는 항응고제의 양은 작은 것이 바람직하다. 응고를 피하기 위해, 수집된 세포들은 수집 후 즉시(예를 들면, 30분 내에) 배양 단계로 전환된다. 보다 바람직하게는, 세포들은 항응고제와의 실질적인 접촉으로부터 배제된다. 이 절차는 놀라울 정도로 높은 증식 속도를 가져오고, 이는 통상적인 속도보다 3배 내지 100배 더 높다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 살아있는 개체로부터 수집된 시료에 첨가된(즉, 수집된 시료를 담기 위한 혈액 수집 튜브에 미리 배치된) 항응고제의 양은 시료의 부피에 대해 5 U/mL 미만, 바람직하게는 2 U/mL 미만, 훨씬 더 바람직하게는, 0.2 U/mL 미만이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 살아있는 개체로부터 수집된 시료 중의 세포의 배양 동안 배지에 존재하는 항응고제의 양은 배지의 부피에 대해 0.5 U/mL 미만, 바람직하게는 0.2 U/mL 미만, 가장 바람직하게는 0.02 U/mL 미만이다. 보다 구체적으로, 시료 수집을 위한 혈액 수집 튜브에 첨가된 항응고제의 양은 미리 감소되고, 및/또는 배지에 첨가되는 항응고제의 양은 배양의 개시시에 배지의 부피에 대해 5 U/ml 미만이 되도록 조절된다.
또한, 본 명세서에서 용어 "항응고제(anticoagulant)"는 체액 또는 배지에 존재하는 경우, 세포 표면으로의 결합을 통해 항-혈액 응고 효과를 갖는 세포외 매트릭스와 상호작용하고 세포와 세포외 매트릭스 간의 부착, 세포들 간의 부착, 또는 세포와 기질(substrate) 간의 부착을 억제하는 물질을 의미한다. 예를 들면, 헤파린 및 헤파린 유도체 (예를 들면, 일본특허 공개 제2005-218308A호에 개시된, 헤파린을 구성하는 D-글루코사민의 6번 위치에서 탈황화(desulfation)에 의해 수득된 글리코사미노글리칸), 또는 그의 염이 일반적으로 이용된다.
본 발명의 방법에서, 세포 증식용 배지는 배지가 세포 배양의 분야에서 통상적으로 이용되는 한 특별히 한정되지 않는다. 보다 빠르고 광범위한 증식을 수득하기 위해, 혈청-함유 배지가 바람직하다. 사용된 혈청-함유 배지는 본 명세서 중의 다른 절에서 기재된 바와 같은 표준 배지에 기반하고, 상기 배지의 12% 미만의 양으로 혈청을 첨가하는 것에 의해 제조된다. 혈청 공여체인 개체의 부담을 고려할 때, 혈청의 양이 적을수록 더 바람직하다. 세포 증식을 빠르게 촉진하는 원하는 효과를 생성하는 범위를 고려하여, 혈청의 양은 바람직하게는 1 부피% 내지 20 부피%, 보다 바람직하게는 3 부피% 내지 12부피%, 훨씬 더 바람직하게는 5 부피% 내지 10 부피%이다.
본 발명의 방법에서, 사용된 혈청은 포유동물의 혈청 및 세포가 유래된 개체의 혈청(자가 혈청)이다. 그러나, 배양대상 세포가 인간 세포일 경우, 자가 혈청은 수집하기가 어렵다. 그와 같은 경우에, 세포가 항응고제와의 실질적인 접촉 없이 배양되는 한, 심지어 외래 동물 혈청(예를 들면, FBS), 또는 인간과 같은 동일한 종의 또 다른 개체의 혈청(타가(allologous) 혈청)을 이용하여 높은 증식 효율성이 달성될 수 있다. 그러나, 항응고제의 부재에 의해 발생한 본 발명의 효과는 예를 들면, FBS의 이용에 의한 경우보다 인간 혈청의 이용에 의해 보다 유의성 있게 수득된다. 혈청은 말초 혈액으로부터 유래된 혈청이거나 또는 제대혈로부터 유래된 혈청일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증식되는 세포들은 혈액 성분을 포함하는 시료로부터 제조되고 부착-배양(adhesion-culture)된 세포이기만 하면 된다. 그의 예는 중간엽 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 제대혈 중간 세포, 각막 줄기 세포, 간 줄기 세포, 및 췌장 줄기 세포와 같은 체세포 줄기 세포; 태아 줄기 세포와 같은 배아 줄기 세포 단핵구(인간 배아 제외); 골아세포(osteoblast), 섬유모세포, 인대 세포, 표피 세포, 및 혈관 내피 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 양태에서, 본 발명의 방법은 줄기 세포 증식을 위해 적합하고, 예를 들면, 중간엽 줄기 세포를 증식시키기 위해 이용된다.
중간엽 줄기 세포는 중간엽 조직의 간질 세포(interstitial cell)에 미량으로 존재하는 줄기 세포이고 다능성 및 자가-복제 능력을 갖는다. 상기 세포는 최근년에 골 세포, 연골 세포, 및 지방 세포와 같은 결합 조직으로 분화되며, 또한 신경 세포 또는 심근 세포로의 분화능을 갖는 것으로 확인되었다.
일 양태에서, 본 발명의 방법은 인간 세포를 증식시키기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 증식되는 세포는 인간이 아닌 동물의 세포일 수 있다(예를 들면, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 및 햄스터와 같은 설치류; 침팬지와 같은 영장류; 소, 염소, 및 양과 같은 우제류(Artiodactyla)의 동물; 말과 같은 기제류(Perissodactyla)의 동물; 및 토끼, 개, 및 고양이).
또한, 본 발명의 방법의 일 양태에서, 줄기 세포는 미분화 상태로 증식될 수 있다.
일반적으로, 미분화 상태의 줄기 세포는 살아있는 개체로의 도입 후에, 보다 높은 증식 속도 및 보다 높은 생존율을 갖는다. 예를 들면, 빠른 대량의 세포 증식을 요구하는 허혈성 뇌 질환의 치료를 위해, 수집된 줄기 세포들을 미분화 상태로 증식시키는 것에 의해 단기간 내에 필요한 갯수까지 증식시킬 수 있다.
대안적으로, 특정 세포 종으로 분화된 세포가 필요한 경우, 줄기 세포 또는 미분화 세포(blast cell)가 미분화 상태로 대량으로 증식되고 뒤이어, 다량의 분화된 세포를 수득하기 위해, 예를 들면, 그와 같은 분화를 유도하는 공지된 성장 인자의 첨가에 의해 또는 그와 같은 특성을 갖는 유전자에 의한 형질감염에 의해 원하는 세포종으로 분화하도록 유도될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 중간엽 줄기 세포는 배지 중의 세포의 밀도가 5,500개의 세포/cm2 이상에 도달한 시점에 계대 배양되는 것이 바람직하다.
배지 중의 세포의 밀도가 세포의 특성 및 분화의 방향에 영향을 미친다. 예를 들면, 중간엽 줄기 세포의 배양에서, 배지 중의 세포의 밀도가 8,500개의 세포/cm2를 초과하면, 세포의 특성이 변화된다. 따라서, 8,500개의 세포/cm2 이하의 세포 밀도에서, 보다 바람직하게는 세포 밀도가 5,500개의 세포/cm2 이상에 도달한 시점에 세포를 계대 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 바람직한 양태에서, 배지는 주당 1회 이상 교체된다.
배지 교체는 세포 배양 및 증식을 위해 필요한 영양분, 성장 인자, 성장-촉진 물질 등을 공급하고, 세포 대사에 의해 생성된 락트산과 같은 폐기물을 제거하여 배지의 pH를 일정 수준에서 유지하기 위해 요구된다. 배지 교체는 세포 종류, 배양 조건 등에 따라 선택되는 기간으로 수행된다. 특히, 인간 혈청-함유 배지가 이용되는 경우, 혈청 공여자의 부담을 고려할 때, 보다 적은 횟수의 배지 교체가 더 바람직하다. 예를 들면, 중간엽 줄기 세포가 본 발명의 방법에 의해 배양되는 경우, 배지 교체는 주당 1회 이상, 보다 바람직하게는 주당 1회 내지 2회 수행된다. 본 발명의 방법은 필요한 갯수의 세포를 수득하기 위해 요구되는 배양 기간을 단축한다. 따라서, 배지 교체에 의해 이용되는 혈청의 양이 감소될 수 있다.
본 발명의 방법의 바람직한 양태에서, 계대 배양은 세포의 총 갯수가 100,000,000개의 세포 이상에 도달할 때까지 반복될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용한 세포 배양은 통상적인 세포 배양보다 3배 내지 100배 더 높은 증식 속도를 가져온다. 따라서, 세포가 단기간에 대량으로 수득될 수 있다. 필요한 세포의 갯수는 세포의 사용 목적에 따라 다를 수 있다. 예를 들면, 뇌경색에서 기인된 허혈성 뇌 질환의 치료를 위한 이식을 위해 요구되는 중간엽 줄기 세포의 갯수는 10,000,000개 이상인 것으로 사료된다. 본 발명의 방법의 이용은 통상적으로 12일 내에 10,000,000개의 중간엽 줄기 세포를 제공할 수 있다. 그와 같은 빠른 세포 증식은 이전에는 달성된 바 없었고 최초로 본 발명의 방법에 의해 달성되었다. 또한, 이 방법에 의해 수득된 세포들 자체는 탁월한 증식 효율성을 갖는다. 실질적으로 헤파린을 포함하지 않는 혈청-함유 배지에서의 배양이 그와 같은 빠른 세포 증식 또는 높은 증식 효율성(빠른 증식)을 갖는 세포를 제공할 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 놀라운 것이다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 세포는 높은 분화능을 가지며 안전하다. 본 발명자들은 상기 세포를 "체세포 기초 줄기 세포(somatic fundamental stem cell)"로 표시했다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 "체세포 기초 줄기 세포"는 외래 혈청(예를 들면, FBS)을 이용한 배양에 의해 수득된 세포에서의 발현 수준과 상이한 발현 수준(발현의 존재 또는 부재 또는 감소된/증가된 발현)을 갖는 특정한 유전자를 포함한다.
예를 들면, 표 1은 자가혈청-배양된 세포에서 발현된 세포 표면 항원(CD 항원)의 그룹 및 자가혈청-배양된 줄기 세포에서 발현되지 않는 CD 항원의 그룹을 보여준다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포는 표 1에 기재된 양성 그룹 중의 90% 이상의 CD 항원이 상기 세포에서 발현되고 표 1에 기재된 음성 그룹 중의 90% 이상의 CD 항원은 상기 세포에서 발현되지 않는다는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포들은 외래 혈청(예를 들면, FBS)-배양된 세포에서 발현된 분화 마커 CD 24가 발현되지 않는다는 것을 특징으로 한다. 이는 본 발명에 따른 세포들이 보다 미분화된 상태를 유지한다는 것을 보여준다.
표 3은 5개의 케이스에서 공통으로 증가된 또는 감소된 발현을 보였던 사이토카인을 보여준다. 또한, 표 4는 5개의 케이스에서 공통으로 2배 이상 상이한 발현 수준을 갖는 유전자 그룹을 보여준다. 이 표들에 표시된 바와 같이, 일련의 성장 인자들이 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포에서 발현되고, 특히, EGF의 경우, 그 발현 수준은 외래 혈청(예를 들면, FBS)을 이용한 배양 방법에서의 발현 수준보다 더 높다. 이는 아마도 본 발명의 세포의 증식에 대한 우위의 원인을 시사한다.
또한, 표 2는 FBS-배양된 세포 및 자가혈청-배양된 세포를 포함하는 5개의 케이스에서 공통으로 증가된 또는 감소된 발현을 보이는 성장 인자-관련 인자들을 보여준다. 이 표에 표시된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포는 외래 혈청(예를 들면, FBS)를 이용한 배양 방법에서 수득된 발현 수준보다 암-관련 유전자 그룹의 더 낮은 발현 또는 그의 더 낮은 발현 수준을 갖는다. 바람직하지 않은 암-관련 유전자의 예는 EWI-FLI-1, FUS-CHOP, EWS-ATF1, SYT-SSX1, PDGFα, FLI-1, FEV, ATF-1, WT1, NR4A3, CHOP/DDIT3, FUS/TLS, BBF2H7, CHOP, MDM2, CDK4, HGFR, c-met, PDGFα, HGF, GFRA1, FASN, HMGCR, RGS2, PPARγ, YAP, BIRC2, 루미칸, 칼데스몬, ALCAM, Jam-2, Jam-3, 카데린 II, DKK1, Wnt, 뉴클레오스테민, 뉴로피브로민, RB, CDK4, p16, MYCN, 텔로미어, hTERT, ALT, Ras, TK-R, CD90, CD105, CD133, VEGFR2, CD99, ets, ERG, ETV1, FEV, ETV4, MYC, EAT-2, MMP-3, FRINGE, ID2, CCND1, TGFBR2, CDKNIA, p57, p19, p16, p53, IGF-1, c-myc, p21, 사이클린 D1, 및 p21을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "감소된(또는 증가된) 발현 수준(decreased (or increased) expression level)은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 알고리즘 (GeneChip Algorithm (AFFYMETRIX, Inc.)에 근거한 "신호 로그 비(Signal Log Ratio)"가 "-1≤" 또는 "1≤" (즉, 기준(baseline)과 실험 어레이간의 유전자 발현 수준의 비가 2배 이상이다(표 5)), 보다 바람직하게는, "-2≤" 또는 "2≤" (즉, 기준과 실험 어레이간의 유전자 발현 수준의 비가 4배 이상이다)인 것을 의미하도록 의도된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "표에 기재된 유전자(gene described in the table)"는 이 표에서 "프로브 세트 ID(Probe Set ID)"에 의해 식별된 유전자를 의미하도록 의도된다 (이 유전자는 해당 유전자의 기능을 보유하는 변이체를 포함한다). 이 유전자들은 유전자 심볼(Gene Symbol)로 표시된 유전자에 상응한다. 유전자 심볼은 미국 NCBI에 의해 각 유전자와 고유하게 연관된 명칭이다. 프로브 세트 ID와 유전자 심볼의 세부사항은 AFFYMETRIX, Inc.의 NetAffx 데이터베이스에 기재되고 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 이해된다. 유전자에 대해 사용된 용어 "변이체(variant)"는 용어 "유전자 변이체(gene variant)"와 호환적으로 이용되고 (i) 하나 이상의 염기의 결실, 치환, 또는 첨가에 의해 식별된 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변이체, (ii) 엄격한(stringent) 조건 하에서 식별된 유전자에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변이체, 및 (iii) 식별된 유전자의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 변이체 중 하나를 의미하도록 의도된다. 이 변이체들 모두는 식별된 유전자의 기능을 보유한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "유전자 기능(gene function)"은 용어 "유전자에 의해 코딩된 단백질의 기능(functions of a protein encoded by the gene)"과 호환가능하게 사용된다. "표에 기재된 유전자(gene described in the table)"에 의해 코딩된 단백질은 잘 알려진 기능을 갖는 단백질이고, 그 기능을 확인하기 위한 분석 시스템도 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 그와 같은 유전자 변이체를 용이하게 제조하고 그들의 기능을 용이하게 확인하기 위해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 기법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 특정한 혼성화 방법 및 "엄격한" 혼성화 조건이 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, J. Sambrook and D. W. Russell, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY (2001)" (참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같은 방법과 같은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명에서, CD 항원의 그룹은 Affymetrix, Inc의 GeneChip Operating Software (GCOS)에서 분석 모드를 이용하여 수득된 결과에 근거하여 "발현된다(expressed)" 또는 "발현되지 않는다(not expressed)"로 확인된다. 또한, 표에 기재된 유전자의 기능을 보유한 유전자 변이체에 의해 코딩된 단백질은 표에 기재된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 변이체일 수 있다. 단백질에 대해 사용된 용어 "변이체"는 용어 "단백질 변이체(protein variant)"와 호환가능하게 사용되고 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환, 또는 첨가에 의해, 식별된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 의미하도록 의도된다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 또한 그와 같은 단백질 변이체를 용이하게 제조하고 그들의 기능을 용이하게 확인하기 위해 당해 기술 분야에서 잘 알려진 기법을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 세포는 조직 복구 및 재생에서 이용할 수 있는 증식하는 능력을 갖는 세포이다. 조직 복구 및 재생에서 이용되는 공여 세포(donor cell)의 예는 자가(autologous) 또는 타가(allologous) 조직 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포이다. 따라서, 본 발명에 따른 세포는 조직 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 윤리적 문제, 감염 위험, 면역억제제 사용의 필요성 등을 고려하여, 바람직하게는 자가 세포, 특히, 공여 세포에서 비침습적으로 확보될 수 있는 체세포 줄기 세포(예를 들면, 골수 세포)로부터 유래된 세포이다.
조직 줄기 세포, 체세포 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포는 포유동물 개체의 조직 또는 체액으로부터 공급될 수 있다. 이 세포들의 공급원(source)으로서 바람직한 조직의 예는 근육조직, 혈관, 소화기관, 모근, 치수(dental pulp), 및 배아(인간 배아 제외)를 포함한다. 공급원으로서 바람직한 체액의 예는 골수액, 혈액(말초 혈액 또는 제대혈), 및 림프를 포함한다. 특히, 복구되고 재생될 대상이 신경계의 조직인 경우, 공여 세포 공급원의 예는 골수, 말초 혈액, 제대혈, 태아(fetal embryo), 및 뇌를 포함한다. 복구되고 재생될 대상이 조혈 조직인 경우, 공급원의 예는 골수, 말초혈액, 제대혈, 및 태아를 포함한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 의도된 세포를 용이하게 제조하기 위해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려진 기법을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 세포는 조직 복구 및 재생에서 이용가능한 세포이고, 따라서, 바람직하게는 부착성 세포(adherent cell)이고, 보다 바람직하게는 예를 들면, 중간엽 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 각막 줄기 세포, 간 줄기 세포, 및 췌장 줄기 세포와 같은 체세포 줄기 세포; 태아 줄기 세포와 같은 배아 줄기 세포 단핵구(인간 배아 제거); 및 골모세포, 섬유모세포, 인대 세포, 표피 세포, 및 혈관 내피 세포로부터 유래된 세포이다. 급성기의 신경 질환의 치료에서 세포를 사용하기 위해, 본 발명에 따른 세포는 줄기 세포, 특히, 중간엽 줄기 세포로부터 유래되는 것이 바람직하다. 중간엽 줄기 세포는 중간엽 조직의 간질 세포에 미량으로 존재하고 다능성 및 자가-복제 능력을 갖는 줄기 세포이다. 상기 세포들은 최근에, 골세포, 연질 세포 및 지방 세포와 같은 결합 조직 세포로 분화될 뿐 아니라, 신경 세포 또는 심근 세포로의 분화능을 갖는 것으로 확인되었다. 이 상황에서, 미분화 상태의 줄기 세포가 살아있는 개체로의 도입 후에 더 높은 성장 속도 및 더 높은 생존율을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 세포가 줄기 세포로부터 유래된 미분화 상태의 세포인 것인 바람직하다.
본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 인간-유래 세포이고, 인간이 아닌 포유동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 및 햄스터와 같은 설치류; 침팬지와 같은 영장류; 소, 염소, 및 양과 같은 우제류의 동물; 말과 같은 기제류의 동물; 및 토끼, 개, 및 고양이)로부터 유래된 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 자가혈청은 세포가 유래된 개체의 혈청(자가혈청)이다. 그러나, 높은 증식 속도는 또한 자가혈청의 이용이 어려운 경우 다른 성인의 혈청을 이용하여 수득될 수 있다.
전술된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포들은 외래 혈청 존재 시의 증식 속도 보다, 동종 혈청, 특히, 자가혈청의 존재시 더 높은 증식 속도를 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 세포는 높은 분화능을 갖는 보다 미분화된 상태에서 유지되는 안전한 세포이다. 본 발명에 따른 세포 배양에서 사용되는 배지는 세포 유형, 원하는 분화의 방향 및 수준, 필요한 성장 속도 등에 따라 당해 기술 분야에서 공지된 다양한 표준 배지(예를 들면, DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium), NPBM, 및 αMEM)에서 선택된다. 바람직하게는 DMEM이 사용된다.
일 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 배양된 세포가 조직 복구/재생을 위한 약제학적 제제의 제조에서 이용될 수 있다.
개체에게 투여 시, 활성 성분으로서 본 발명의 증식 방법에 의해 수득된 세포를 포함하는 치료제는 그의 기능을 상실한 조직을 복구시키고 재생할 수 있다. 특히, 중간엽 줄기 세포가 사용되는 경우, 허혈성 뇌 질환의 뇌 조직이 복구되고 재생될 수 있다(WO02/00849A1 참조). 본 명세서에서 사용된 조직 복구 및 재생은 기능의 복구 및 재생과 동의어이다. 예를 들면, 신경계의 조직의 복구/재생의 치료적 효과는 신경보호 효과(예를 들면, 액손의 재수초 형성(remyelination)), 향신경성(neurotrophic) 효과(예를 들면, 신경 아교세포의 보충), 뇌 혈관형성, 신경 재생 등을 포괄한다. 구체적으로, 본 발명의 방법에 의해 증식된 세포를 포함하는 약제학적 제제의 치료적 효과는 독립체(entity)로서 조직 복구/재생 및 현상으로서 조직의 복구/재생을 의미한다. 증식된 세포가 조직 복구/재생을 위해 이용되는 경우, 공여 세포의 공급원은 말초혈액의 검사에 의해 미리 HIV, ATL, HB, HC, 매독, 인간 파보바이러스 B19, 등에 의해 감염되지 않은 것으로 확인되는 것이 바람직하다.
또한, 일 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 증식된 세포들은 질병 또는 병원균에 의한 감염의 진단에서 이용된다. 예를 들면, 암 위험도는 개체로부터 수집되고 엑스 비보로 증식된 세포에 포함된 암-관련 유전자의 상태를 조사하는 것에 의해 진단될 수 있다.
또한, 개체의 프리온 질병은 통상적인 검사 방법에 의해 검출하기 어렵다. 그러나, 그와 같은 프리온 질병은 본 발명의 방법에 의해 세포를 증식시키고, 그에 의해 비정상적 프리온을 검출 민감도와 동일하거나 또는 그보다 높은 수준까지 빠르게 증폭시키는 것에 의해 검출될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 방법에 의해 증식된 세포는 인 비보(in-vivo) 또는 인-비트로(in-vitro) 실험에서 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증식된 세포들을 포함하는 조직 복구/재생용 약제학적 제제(pharmaceutical preparation)의 예는 약제학적으로 허용가능한 희석제, 부형제, 및/또는 기제(base)와 조합된, 본 발명의 방법을 이용하여 엑스 비보로 증식된 세포를 포함하는 이식용 주사제(예를 들면, 신경 전구 체포, 조혈 줄기 세포, 간 세포, 췌장 세포, 또는 림프구를 함유한 주사제) 및 이식물(예를 들면, 심근세포 쉬트, 인공 피부, 인공 각막, 인공 치근, 및 인공 관절)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 배양된 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 신경계의 조직의 복구/재생을 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 자가 중간엽 줄기 세포가 증식되고 허혈성 신경 질환의 치료를 위한 약제학적 제제에서 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 제제에 함유된 세포는 상기 세포가 투여될 개체로부터 유래된 세포(자가 세포)이다.
그와 같은 세포 치료법에 의해 표적화된 신경계의 질환의 예는 중추 및 말초 탈수초성 질환(central and peripheral demyelinating disease), 중추 및 말초 퇴행성 질환, 뇌졸중(뇌경색, 뇌출혈, 및 지주막하 출혈 포함), 뇌종양, 치매를 포함한 고등 기능장애(higher dysfunction including dementia), 정신질환, 간질, 신경계의 외상성 질환(두부 손상, 뇌 좌상, 및 척수 손상 포함), 척수 경색, 및 프리온 질병(예를 들면, 크로이츠펠트-야콥 병(Creutzfeldt-Jacob disease), 쿠루병(kuru disease), 소 해면 양뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 및 스크라피(scrapie))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 증식된 세포들은 또한 신경계 질환이 아닌 다른 질환의 치료를 위해 유용하다. 예를 들면, 급성 백혈병의 치료를 위해, 조혈 줄기 세포가 엑스 비보로 증식되고 골수에 이식될 수 있다. 통상적인 골수 이식은 일반적으로 수용자의 체중당 자가이식의 경우 2x108 개의 세포를 필요로 하고, 타가이식(allotransplantation)의 경우 4x108 개의 세포를 필요로 하며, 따라서, 세포 공여자로부터 수집된 골수액의 양은 1000 mL에 이를 수 있다. 그러나, 세포 공여자의 신체적 부담은 본 발명의 방법을 이용하여 엑스 비보로 세포를 빠르게 증식시키는 것에 의해 경감될 수 있다. 또한, 바이러스 감염 등의 치료를 위해, 환자의 말초혈액으로부터 수집된 T-림프구가 본 발명의 방법을 이용하여 엑스 비보로 증식되고 이 환자에게 이식될 수 있다.
조직 복구/재생을 위한 세포 보충에서 이용되는 공여 세포의 공급원은 자가 또는 타가 조직 줄기 세포 또는 체세포 줄기 세포, 또는 배아 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 윤리적 문제, 감염 위험, 및 면역억제제를 이용할 필요와 같은 어려움을 고려할 때 비침습적으로 공여 세포를 확보할 수 있는, 자가 세포, 특히, 체세포 줄기 세포(예를 들면, 골수 세포)를 이용한 자가이식 치료법이 바람직하다. 자가이식 치료법이 어려운 경우, 다른 인간 또는 다른 동물로부터 유래된 세포가 이용될 수 있다. 공여 세포는 배양 직전에 수집된 시료에 포함된 세포일 수 있거나, 또는 배양의 개시시에 시료에 포함된 항응고제의 양이 5 U/mL 미만으로 유지되는 경우 동결보존된 세포일 수 있다. 대안적으로, 자가 세포는 예를 들면, WO 2005/001732A1에 기재된 치료 세포 전달 지원 시스템을 이용한 치료 모델에서 입증된 바와 같이, 미리 증식되고, 동결보존되고, 질병의 시료 시에 투여될 수 있다.
세포의 공급원은 바람직하게는 복구/재생될 특정한 조직의 세포종으로 분화될 것으로 이미 알려진 세포들, 예를 들면, 동일한 배엽층(germ layer)의 세포들, 또는 전능성(totipotent) 줄기 세포를 포함하는 공급원이다. 그러나, 어느 정도까지 상이한 배엽층(예를 들면, 태아 간 세포)으로 분화된 줄기 세포들은 또한 신경계의 세포들(예를 들면, WO 01/00849A1에 기재된 세포들)과 같은 다른 조직 세포들로 재분화되는 것으로 확인되었다. 이 발견을 고려하여, 세포들이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 분화-유도 인자 또는 그 등가물을 이용하여 원하는 세포종으로 분화되도록 유도될 수 있는 한, 그들로부터 유래된 상이한 배엽층의 세포들을 포함하는 조직이 이용될 수 있다.
복구되는 조직이 신경계의 조직인 경우, 공여 세포 공급원의 예는 골수, 말초 혈액, 제대혈, 태아, 및 뇌로부터 유래된 세포를 포함한다. 복구되는 조직이 조혈 조직인 경우, 공급원의 예는 골수, 말초 혈액, 제대혈, 또는 태아에 포함된 조혈 줄기 세포 및 제대혈 줄기 세포를 포함한다.
신경계의 조직의 복구를 위한 골수-유래 중간엽 줄기 세포의 이용은 예를 들면, 하기의 장점을 갖는다: 1) 세포가 유의성 있는 효과를 생성할 것으로 기대될 수 있다, 2) 세포가 부작용의 낮은 위험도를 갖는다, 3) 충분한 공여 세포가 공급될 것으로 기대될 수 있다, 4) 세포가 비침습적 치료 및 자가이식을 달성한다; 따라서, 5) 그와 같은 세포 치료법은 낮은 감염 위험도를 갖는다, 6) 면역 거부의 위험이 없다, 7) 윤리적 문제를 유발하지 않는다, 8) 용이하게 사회적으로 허용가능하다, 및 9) 일반적인 의료적 관리로 용이하게 확립된다. 또한, 골수 이식 치료법은 임상에서 이미 이용되는 치료이고 또한 안전한 것으로 확인되었다. 또한, 높은 이동 특성을 갖는, 골수-유래 줄기 세포가 그들의 치료적 효과를 발휘하기 위해 국소 이식 및 정맥내 투여에 의해 의도된 손상 조직에 도달할 수 있다.
골수액이 예를 들면, 수집물 공급원(인간 포함)으로 작용하는 동물을 국소 마취 또는 전신마취시키고 바늘을 흉골 또는 장골에 삽입하고, 주사기를 이용하여 흡인하는 것에 의해 수집될 수 있다. 또한, 제대혈에 대한 확립된 기법은 바늘을 신생아의 탯줄에 바늘을 직접 삽입하는 단계, 주사기를 이용한 흡인에 의해 그로부터 제대혈을 수집하는 단계, 및 수집된 제대혈을 보관하는 단계를 포함한다. 통상적인 방법에서, 항응고제가 수집된 골수액에서 혈액 성분들이 응고되는 것을 방지하기 위해 이용된다. 대조적으로, 본 발명의 방법에서, 전술된 바와 같이 항응고제가 이용되지 않아도 된다.
본 발명의 방법에 의해 증식된 세포를 포함하는 약제학적 제제를 손상된 조직에 전달하는 가능한 방법은 예를 들면, 수술적 수단에 의한 국소 이식, 정맥내 투여, 요막 천자를 통한 투여, 국소 주사를 통한 투여, 피하 투여, 피내 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 뇌내 투여, 뇌실내 투여, 또는 정맥 투여이다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 증식된 세포는 이식물, 세포 쉬트 베이스(cell sheet base), 인공 관절 등에 함유되거나 또는 접종될 수 있고, 살아있는 개체로 이식될 수 있다.
예를 들면, 세포가 신경계의 복구를 위해 이용되는 경우, 주사에 의해 환자에게 세포를 이식하는 것은 인공 뇌척수액, 염수, 등을 이용하여 부유 상태인 이식될 세포를 주사기에 충진하는 단계; 수술에 의해 손상된 신경 조직을 노출시키는 단계; 및 주사기의 내용물을 이 주사 부위에 직접 주사하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 조직에서 이동가능할 정도로 높은 이동 특성을 갖는 세포(예를 들면, WO 02/00849A1에 기재된 세포)가 손상 부위의 주변에 이식될 수 있다. 또한, 그와 같은 세포들은 뇌척수액으로의 주사에 의해 효과를 발휘하는 것으로 기대될 수 있다. 이 경우, 세포들은 통상적인 요막 천자를 통해 주사될 수 있고, 따라서 환자가 수술하지 않고 병실에서 국소 마취 하에서 치료될 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 세포들은 정맥내 주사에 의해 효과를 발휘할 것으로 기대될 수 있다. 이 경우, 통상적인 주입 방식에 의해 이식을 가능하게 하고 병실에서 이식 절차를 수행한다는 점에서 세포들이 바람직하다.
본 발명에 따른 세포 증식을 위해 적합한 배지는 세포의 종류, 원하는 분화의 방향 및 수준, 필요한 증식 속도 등에 따라 선택된다. 신경계의 복구를 위해 이용되는 중간엽 줄기 세포를 증식시키기 위해 적합한 배지의 예는 하기에 예시된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 외에, NPBM(Neural Progenitor Basal Medium: Clontech 제조) 및 αMEM 배지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그와 같은 표준 배지는 전술된 바와 같이 혈청으로 보충되고, 필요한 경우, 영양 인자(예를 들면, 아미노산), 항생제, 성장 인자 및/또는 성장 촉진 물질 등에 의해 더 보충된다.
표준 배지의 특정한 예는 하기의 농도(mg/L)로 하기 성분을 포함하는 둘베코 변형 배지(Dulbecco's modified media)를 포함한다:
CaCl2 (무수물): 160 내지 240
KCl: 320 내지 480
Fe(NO3)3·9H2O: 0.08 내지 1.2
MgSO4 (무수물): 80 내지 120
NaCl: 5120 내지 7680
NaHCO3: 2960 내지 4440
NaH2PO4·H2O: 100 내지 150
D-글루코오스: 3600 내지 5400
페놀 레드: 12 내지 18
소디움 피루베이트: 88 내지 132
L-아르기닌·HCl: 67 내지 101
L-시스테인·2HCl: 50 내지 76
L-히스티딘·HCl·H2O: 34 내지 50
L-이소루이신: 84 내지 126
L-루이신: 84 내지 126
L-라이신·HCl: 117 내지 175
L-메티오닌: 24 내지 36
L-페닐알라닌: 53 내지 79
L-세린: 34 내지 50
L-쓰레오닌: 76 내지 114
L-트립토판: 13 내지 19
L-티로신 (디소디움 염): 83 내지 125
L-발린: 75 내지 113
콜린 클로라이드: 3.2 내지 4.8
D-Ca-판토텐산: 3.2 내지 4.8
폴산: 3.2 내지 4.8
i-이노시톨: 5.8 내지 8.6
니아신아미드: 3.2 내지 4.8
피리독살·HCl: 3.2 내지 4.8
리보플라빈: 0.3 내지 0.5
티아민·HCl: 3.2 내지 4.8
필요한 경우, 세포 배양 분야에서 통상적으로 이용되는 항생제(예를 들면, 페니실린 및 스트렙토마이신)가 단독으로 또는 조합되어 이용될 수 있다. 복수의 항생제의 조합된 이용이 바람직하다. 예를 들면, 페니실린과 스트렙토마이신이 조합되어 이용되는 경우, 그들의 양은 배지의 부피 대비, 각각 0.5 내지 2 부피%, 바람직하게는 0.8 내지 1.2 부피%이다.
배지에 함유된 저-분자량 아미노산의 예는 L-알라닌, L-아스파르테이트, L-시스테인, L-글루타민, L-이소루이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-쓰레오닌, L-티로신, L-발린, L-아스코르브산, 및 L-글루탐산을 포함한다. 이 아미노산들은 세포 배양의 분야에서 통상적으로 이용되는 배지에 영양분으로 포함된다.
또한, 본 발명자들은 배지 총량의 0.1 내지 2%(중량/부피)의 양의 글루타민의 첨가가 중간엽 줄기 세포의 빠른 증식을 위해 필수적이라는 것을 발견했고 배지 중에서 0.1 내지 2%(중량/부피)의 양을 유지하기 위한 글루타민의 보충이 빠른 증식을 촉진한다는 것을 또한 발견하였다.
표준 배지는 필요한 경우, 성장 인자, 성장-촉진 물질, 및/또는 분화-유도 인자로 보충될 수 있다. 성장 인자, 성장-촉진 물질, 및/또는 분화-유도 인자는 원하는 분화의 방향 및 수준, 필요한 증식 속도, 등에 따라 선택된다. 그의 예는 아스코르브산 및 니코틴아미드와 같은 비타민; NGF 및 BDNF와 같은 향신경성(neurotrophic) 인자; BMP와 같은 골원성 인자; 및 표피 세포 성장-촉진 물질, 염기성 섬유모세포 성장-촉진 물질, 인슐린-유사 성장-촉진 물질, 및 IL-2와 같은 사이토카인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 세포 배양 방법은 구체적으로 예를 들면, 하기와 같이 수행된다:
1. 전술된 바와 같이 내벽이 헤파린 용액으로 적셔진 주사기를 이용하여 살아있는 개체로부터 수집된 시료를 37±0.5℃에서 미리 보관된 배지에 100배 이하, 바람직하게는 10배 이하, 보다 바람직하게는 2배 내지 6배의 희석 비율로 첨가한다. 그 후, 상기 용액을 배양 디쉬에 접종하고 5% CO2하에 37±0.5℃에서 인큐베이션시킨다. 배지를 1주 1회 이상, 통상적으로 1주 1회 내지 2회 교체한다. 배지는 적절한 표준 배지에 혈청 및 필요한 보조물(aid)을 첨가하여 제조하고, 여과 멸균기를 이용하여 멸균시키고, 소량으로 나누고, 4℃에서 냉각 박스(cool box)에서 보관한다. 배지를 미리 37±0.5℃로 유지시키고 이용한다. 37.5℃를 초과하는 온도에서, 증가된 수의 세포들이 사멸한다. 대조적으로, 36.5℃ 미만의 온도에서, 세포들은 느리게 증식한다. CO2 농도는 바람직하게는 5±1%의 범위이다. 모든 단계에서, 세포와 접촉되는 용액은 이 온도 범위에서 유지시킨다. 결과적으로, 빠른 증식이 촉진된다.
2. 세포들이 배양 디쉬 바닥에 부착한 것을 확인한다. 이때, 배지 및 배지 중에 부유된 혈액 세포 성분들을 분리하고 흡인(suction)에 의해 제거한다. 뒤이어, 부착성 줄기 세포의 표면을 인산염-완충 염수를 세척액으로 하여 세척한다.
3. 세포들을 가이드라인으로서, 디쉬 중의 세포 밀도가 8,500 개의 세포/cm2를 초과하지 않도록, 5,500 개의 세포/cm2 이상에 도달하는 시점, 즉, 세포가 60 내지 80%, 바람직하게는 65 내지 75%의 합류(confluence)에 도달한 시점에 계대 배양한다. 계대 배양을 위해, 주로 트립신 및 선택적으로 EDTA(에틸렌디아민테트라아세테이트)로 구성된 해리제(dissociation agent)를 3 mL/디쉬의 양으로 첨가한다. 37±0.5℃에서 3내지 5분 동안 인큐베이션한 후, 부착성 줄기 세포가 디쉬로부터 해리된 것을 확인하다. 배지를 따라내기(decantation)에 의해 분리 용액(separation solution)으로 교체하고, 배지 중의 세포를 미리 정해진 원심분리 튜브로 옮기고 원신분리에 의해 침전시키고, 뒤이어 계대 배양한다. 배양, 배지 교체, 및 계대 배양을 포함하는 사이클을 적어도 중간엽 줄기 세포의 총 갯수가 100,000,000개 이상의 세포에 도달할 때까지 반복한다. 배지 교체는 1주 1회 이상 수행된다.
의도된 갯수의 세포를 빠르게 수득하기 위해 이 사이클을 반복한다(예를 들면, 중간엽 줄기 세포의 경우, 1x108 개의 세포가 2주 내에 수득될 수 있다).
원하는 경우, 세포 스카폴드 물질(cell scaffold material)이 증식 후 세포의 해리를 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 스카폴드 물질의 바람직한 예는 다공성 무기 세라믹, 마이크로기둥(micropillar)(예를 들면, Hitachi, Ltd.에 의해 제조된, Nanopillar Cell Culture Sheet), 부직포(nonwoven cloth), 및 벌집 막 필름(honeycomb membrane film)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 배양될 세포는 예를 들면, BDNF, PLGF, GDNF, 또는 IL-2 유전자와 같은, 성장 및 분화를 유도하는 유전자에 의해 미리 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 배양될 세포는 텔로머라아제 유전자와 같은 불멸화(immortalizing) 유전자에 의해 형질감염된 불멸화 세포일 수 있다. 그와 같은 유전자의 형질감염은 예를 들면, WO03/038075A1에 개시된다.
본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 용이하게, 배지, 스카폴드 물질, 보조제, 성장 인자, 및/또는 앞서 예시된 유전자 형질감염 중에서 원하는 증식 속도를 가져오고 및/또는 특정한 세포 종으로의 분화를 유도하는 조합을 선택할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증식된 세포들은 조직 복구/재생을 위해 직접 투여될 수 있다. 치료 효율성을 개선하기 위해, 세포들은 다양한 작용제로 임의로 보충된 조성물로서 또는 유전자 형질감염 후에 투여되거나 또는 이식될 수 있다. 이 목적을 위한 가능한 접근방법의 예는 조직에서 본 발명의 방법에 의해 증식된 세포의 증식 속도를 더 개선하는 물질, 그들의 원하는 세포로의 분화를 촉진하는 물질, 또는 조직에서 그들의 생존율을 개선하는 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염; 이식된 세포에 대한 생물학적 조직의 해로운 영향을 차단하는 효과를 갖는 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염; 공여 세포의 수명을 연장시키는 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염; 세포 주기를 조정하는 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염; 면역구를 저해하도록 의도된 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염; 에너지 대사를 활성화시키는 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염; 조직에서 공여 세포의 화학주성(chemotactic) 효과를 개선하는 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염; 및 혈류를 개선하는 물질의 첨가 및/또는 그와 같은 효과를 갖는 유전자에 의한 형질감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
세포 배양은 바람직하게는 GMP에 따른 세포 가공 센터(cell processing center, CPC)에서 수행된다. 개체에게 투여될 "임상 등급 세포(clinical grade of cells)"는 무균 상태에서 세포 조작을 위해 설계된 전문 시설, 보다 구체적으로, 에어 컨디셔닝, 챔버 압력의 제어, 온도 및 습도의 제어, 입자 카운터(particle counter), HEPA 필터 등을 이용하여 확보된 청정(cleanliness)을 갖는 CPC에서 제조되어야 한다. 또한, CPC 설비뿐 아니라, CPC 내의 모든 장비에 대한 검증에 의해 성능이 확보되어야 하고, 그들의 기능이 항상 모니터링되고 기록되는 것이 바람직하다. CPC 내의 모든 세포 가공 절차는 "표준 매뉴얼(standard manual)"에 의해 엄격하게 제어되고 기록되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제학적 제제는 세포 성분으로서, 중간엽 줄기 세포가 아닌 세포종을 포함할 수 있다. 그러나, 중간엽 세포가 세포 성분에 대해 높은 비율을 차지하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 약제학적 제제의 바람직한 양태에서, 약제학적 제제에 포함된 세포의 총 갯수 대비 중간엽 줄기 세포의 갯수의 비율은 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상이다. 가장 바람직하게는, 배지는 중간엽 줄기 세포가 아닌 세포종, 예를 들면, 조혈 줄기 세포를 실질적으로 포함하지 않는다. 세포 성분 중 중간엽 줄기 세포의 비율은 예를 들면, 약제학적 제제에 포함된 세포들을 중간엽 줄기 세포에 특이적인 하나 이상의 마커(예를 들면, CD105, CD73, CD166, CD9, 및 CD157과 같은 표면 항원)에 대한 표지 항체로 표지화하고 표지된 세포를 유동 세포측정기(flow cytometry)에 의해 분석하는 것에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제에 포함된 보다 많은 수의 중간엽 줄기 세포가 더 바람직하다. 그러나, 세포의 갯수는 개체에 대한 투여 시기 및 배양을 위해 요구되는 시간을 고려하여 실용적인 최소 유효량이다. 따라서, 본 발명의 약제학적 제제의 바람직한 양태에서, 중간엽 줄기 세포의 갯수는 107 개 이상의 세포, 바람직하게는, 5x107 개 이상의 세포, 보다 바람직하게는 108 개 이상의 세포, 훨씬 더 바람직하게는 5x108 개 이상의 세포이다.
신경 조직의 복구를 보조하도록 의도되는 경우, 중간엽 줄기 세포가 아닌 세포 종은 예를 들면, 골수, 제대혈, 말초 혈액, 또는 태아 간으로부터 분리에 의해 수득된 세포이고, 신경계의 세포로 분화될 수 있다. 이들의 예는 Lin-, Sca-1+, CD10+, CD11D+, CD44+, CD45+, CD71+, CD90+, CD105+, CDW123+, CD127+, CD164+, 피브로넥틴+, ALPH+, 및 콜라게나아제-1+를 특징으로 하는 간질 세포, 및 AC133+을 특징으로 하는 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 신경계의 세포로 분화될 수 있는 다른 세포종이 이용될 수 있다.
간질 세포는 예를 들면, 골수 세포 또는 제대혈 세포로부터 원심분리에 의해 수집된 세포 분획으로부터, CD45와 같은 세포 표면 마커를 갖는 세포를 선택하는 것에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 이 세포들은 또한 척추동물로부터 수득된 골수 세포 또는 제대혈 세포를 대상으로 중력에 따른 분리를 위해 충분한 시간 동안 용액 중에서 800 g에 의한 밀도 구배 원심분리를 수행하고, 상기 원심분리 후에, 1.07 내지 1.1 g/ml의 중력 범위 내에 속하는 특정 중력을 갖는 세포 분획을 수집하는 것에 의해 제조될 수 있다. 이때, 용어 "중력에 따른 분리를 위해 충분한 시간(time sufficient for separation according to the gravity)"은 밀도 구배 원심분리를 위한 용액에서, 세포들이 그들의 중력에 따라 위치를 차지하기에 충분한 시간을 의미하고 통상적으로 약 10분 내지 30분이다. 수집될 세포 분획의 중력은 바람직하게는 1.07 내지 1.08 g/ml의 범위, 예를 들면, 1.077 g/ml이다. 사용될 수 있는 밀도 구배 원심분리용 용액의 예는 Ficoll 용액 및 Percoll 용액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 척추동물로부터 수집된 골수액 또는 제대혈은 먼저 동일한 양의 용액(PBS+2% BSA+0.6% 소디움 시트레이트+1% 페니실린-스트렙토마이신)과 혼합된다. 그의 5 ml 분획을 Ficoll+Paque 용액(1.077 g/ml)과 혼합하고 단핵구 분획을 추출하기 위해 원심분리한다(800 g로 20분 동안 원심분리). 이 단핵구 분획을 세포 세척을 위해 배양 용액(αMEM, 12.5% FBS, 12.5% 마혈청, 0.2% i-이노시톨, 20 mM 폴산, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 μM 히드로코르티손, 및 1% 항생제-항진균제 용액)과 혼합하고 원심분리한다(2000 rpm으로 15분 동안 원심분리). 뒤이어, 원심분리 후 상층액을 제거하고, 그 후, 침전된 세포를 수집하고 배양한다(37℃, 5%CO2).
AC133+ 세포는 예를 들면, 골수 세포, 제대혈 세포, 또는 말초 혈액 세포로부터 원심분리에 의해 수득된 세포 분획으로부터 세포 표면 마커 AC133을 갖는 세포를 선택하는 것에 의해 수득될 수 있다. 또한, 대안적인 양태에서, 이 세포들은 또한 포유동물로부터 수집된 태아 간 세포에 대해 중력에 따른 분리를 위해 충분한 시간 동안 2000 rpm에서 용액 중 밀도 구배 원심분리를 수행하는 단계; 원심분리 후, 1.07 내지 1.1 g/ml 범위 내에 속하는 특정 밀도를 갖는 세포 분획을 수집하는 단계; 및 이 세포 분획으로부터 AC133+를 특징으로 하는 세포를 수집하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 이때, 용어 "중력에 따른 분리를 위해 충분한 시간(time sufficient for separation according to the gravity)"은 밀도 구배 원심분리를 위한 용액에서 세포들이 그들의 중력에 따른 위치를 차지하기에 충분한 시간을 의미하고, 통상적으로 약 10분 내지 30분이다. 사용될 수 있는 밀도 구배 원심분리를 위한 용액의 예는 Ficoll 용액 및 Percoll 용액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 척추동물로부터 수집된 간 조직을 먼저 L-15 용액으로 세척하고, 그 후, 효소로 처리하고(L-15+0.01% DNase I, 0.25% 트립신, 및 0.1% 콜라게나아제를 함유한 용액에서 37℃에서 30분 동안), 단일 세포들을 제조하기 위해 피펫팅한다. 태아 간 세포인 이 단일 세포들을 원심분리시킨다. 그에 의해 수득된 세포를 세척하고, 세척된 세포로부터, AC133 항체를 이용하여 AC133+ 세포를 수집한다. 결과로서, 신경계의 세포로 분화될 수 있는 세포들이 태아 간 세포로부터 제조될 수 있다. 항체를 이용한 AC133+ 세포의 수집은 자성 비드 또는 세포 분류기(cell sorter)(예를 들면, FACS)의 이용에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제는 바람직하게는 비경구 투여 제제, 보다 바람직하게는 비경구 전신 투여 제제, 특히, 정맥 투여 제제이다. 경구 투여를 위해 적합한 투여 제형의 예는 가용성 주사제, 현탁 주사제, 에멀션 주사제, 및 사용전 제조될 주사제와 같은 주사제; 및 이식(graft)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비경구 투여 제제는 수성 또는 비-수성 등장성 멸균 용액 또는 현탁액의 제형일 수 있다. 구체적으로, 제제는 적절하게, 예를 들면, 약리적으로 허용가능한 담체 또는 비히클, 구체적으로 멸균수 또는 염수, 배지, PBS와 같은 완충 염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 부형제, 비히클, 보존제, 결합제, 등을 조합하는 것에 의해 적절한 단위 투여 제형으로 제조될 수 있다.
주사용 수용액의 예는 염수, 배지, PBS와 같은 완충 염수, 글루코오스 또는 다른 아쥬반트, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 및 염화나트륨을 포함하는 장성 조절제(tonicity agent)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이 용액들은 적절한 가용화제, 예를 들면, 알코올, 특히, 에탄올 또는 폴리알코올(예를 들면, 프로필렌 알코올, 폴리에틸렌 글리콜) 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 80 또는 HC0-50과 조합되어 이용될 수 있다.
본 발명에서, 손상(injury)은 살아있는 개체가 내생 및/또는 외래 인자에 의해 유발된 특정한 전신 또는 국소 장애(damage)를 겪는다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 손상은 다양한 외상, 경색, 퇴행성 병변, 및 조직 파괴와 같은 다양한 상태를 포괄한다. 또한, 손상 부위는 전신의 다양한 조직, 예를 들면, 뇌, 신경, 신장, 췌장, 간, 심장, 피부, 뼈, 및 연골을 포괄한다. 손상 부위는 하나의 위치에 나타날 수 있거나, 또는 복수의 위치에 나타날 수 있다. 본 발명의 약제학적 제제는 다양한 조직에 대한 효과를 가지며 1회 투여로 복수 개의 손상 부위를 동시에 복구시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 제제는 복수 개의 손상 부위를 갖는 개체의 치료를 위해 특히 효과적이다. 손상을 유발하는 인자들의 예는 사고, 화상, 및 폭발과 같은 외래의 물리적 인자; 허혈성 신경 질환(뇌경색, 척수 경색, 등) 및 허혈성 심장 질환(예를 들면, 심근경색증)과 같은 다양한 허혈성 질환; 다양한 염증, 당뇨병, 다양한 감염, 자가면역 질환, 독에 대한 노출, 중추 및 말초 탈수초성 질환, 중추 및 말초 퇴행성 질환, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 뇌종양, 치매를 포함한 고등 기능장애, 정신 질환, 간질, 및 프리온 질환(예를 들면, 크로이츠펠트-야콥병, 쿠루병, 소 해면 양뇌증, 및 스크라피)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 손상은 통상적으로 조직 기능의 소실 및/또는 감소를 포함하는 것들을 의미한다.
조직 기능의 소실 및/또는 감소의 예는 신경 조직의 경우, 감각 장애(예를 들면, 통증, 무감각, 및 감각감퇴), 운동 장애(예를 들면, 마비, 경련, 편마비, 하지불안(shaky limbs), 보행 장애(difficulty in walking), 운동감소증, 및 신체적 장애(physical awkwardness)), 뇌 기능장애(예를 들면, 두통, 기억 장애, 의식 장애(disturbed consciousness), 언어 장애, 경련, 떨림, 치매, 환각, 및 비정상적 행동), 및 자율신경기능장애(예를 들면, 어지러움(lightheadedness), 현기증(vertigo), 실신, 배뇨장애, 및 발한 이상증); 신장의 경우, 배설 기능, 전해질/수분 균형과 같은 체액 균형의 조절 기능, 및 내분비 기능의 소실 및/또는 저하; 췌장의 경우, 외분비 기능 및 내분비 기능의 소실 및/또는 저하; 간의 경우, 대사 기능, 합성 기능, 및 외분비 기능의 소실 및/또는 저하; 및 심장의 경우, 혈액 박출(blood output) 기능 및 내분비 기능의 소실 및/또는 저하를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특정한 조직에서 손상에 의해 유발된 특정한 기능의 소실 및/또는 저하 및 그와 연관된 증상이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 알려져 있다.
또한, 손상 부위의 복구 및 재생은 기능의 복구 및 재생과 동의어이다. 치료적 효과, 예를 들면, 신경계의 조직의 복구/재생은 신경보호 효과(예를 들면, 액손의 재수초화), 향신경성(neurotrophic) 효과(예를 들면, 신경아교 세포의 보충), 뇌 혈관형성, 신경 재생 등을 포괄한다. 구체적으로, 본 발명의 약제학적 제제의 치료적 효과는 독립체(entity)로서 조직 복구/재생 및 현상으로서 조직의 기능장애의 복구/재생을 의미한다. 예를 들면, 뇌 손상에 대한 치료적 효과는 부종의 감소, 액손의 재수초화, 신경아교세포의 갯수의 증가, 혈관 형성, 신경 재생 등이 독립체로 나타나고, 뇌 혈류의 회복, 마비의 회복, 통증 또는 저림의 경감 등이 현상으로 나타난다. 이 효과들은 진찰, 예를 들면, 손상 조직에 대한 X-선 검사, CT 스캔, MRI 검사, 초음파 검사, 내시경 검사, 생검에 의해 확인될 수 있다. 또한, 상기 효과는 다양한 혈액학적 검사, 생화학적 검사, 내분비학적 검사, 운동 기능 검사, 뇌 기능 검사, 인지 기능 검사 등에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제가 손상 부위의 "복구를 보조한다(assists in the repair)"는 구는 통상적으로 본 발명의 약제학적 제제의 투여에 의해, 본 발명의 제제의 성분들이 살아있는 개체의 복구 메카니즘을 보조 또는 지원하고, 본 발명의 제제의 투여의 부재시 대비, 손상 부위의 복구를 촉진/강화한다는 것을 의미하나, 이에 한정되지 않는다. 이 구는 또한 손상 부위에서 손상이 확대되거나 또는 보다 악화되는 것을 예방하고, 손상의 진행을 차단하고, 손상으로부터 회복시키는 것을 포괄한다. 본 발명의 제제의 투여는 손상 부위에서, 살아있는 개체의 복구 메카니즘의 기능을 위해 적합한 환경을 구축한다. 구체적으로, 본 발명의 약제학적 제제에 의해 유발된 복구의 보조는 예를 들면, 사이토카인 분비, 혈관형성, 및/또는 조직 재생에 의해 유발될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(예를 들면, 도 9 참조).
또한, 본 발명의 약제학적 제제는 예를 들면, 신부전을 포함한 손상된 신장에 대해, BUN 및/또는 크레아틴 값과 같은 신장 기능 지표의 개선을 유발할 수 있고; 랑게르한스섬의 인슐린 분비 기능의 저하를 포함한 손상된 췌장에 대해, 인슐린 분비 또는 혈당 수준, 혈청 Glu A1 농도 및/또는 혈청 HbA1C 농도와 같은 당뇨병 지표의 개선을 유발할 수 있으며; 허혈성 심장 질환에서 기인된 손상된 심장에 대해, 혈청 프로스타글란딘 D 합성효소 농도 및/또는 혈청 호모시스테인 농도의 개선을 가져오고; 및 간 부전을 포함한 손상된 간에 대해, GOT, GPT, 및/또는 γ-GTP 값과 같은 간 기능에 대한 지표의 개선을 가져올 수 있다.
본 발명의 약제학적 제제의 바람직한 양태에서, 약제학적 제제는 손상 부위의 치료 후에 투여된다. 이때, 손상 부위의 치료는 통상적으로 초급성기(hyperacute) 또는 급성기에 있는 손상의 치료를 의미하고, 예를 들면, 손상이 확대되는 것을 예방하기 위한 치료 및 손상을 복구하기 위한 수술적 치료를 포괄한다. 또한, 또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 제제는 살아있는 개체에 의해 보유된 자발적인 복구력을 보조할 목적으로 투여된다.
또한, 본 발명의 약제학적 제제는 바람직하게는 손상의 아급성기 또는 그 이후에 투여된다. 아급성기(subacute phase)는 손상에 의해 유발된 증상의 악화기(초급성 또는 급성기)에 뒤이은 회복기를 의미하고, 예를 들면, 뇌경색의 발생 후 1 내지 2개월의 기간을 의미한다.
본 발명의 약제학적 제제 중의 중간엽 줄기 세포는 바람직하게는 손상 부위를 갖는 개체로부터 수집된 세포로부터 유래된 자가 중간엽 줄기 세포이다. 자가 세포의 이용은 거부 또는 감염 위험을 방지할 수 있다. 또한, 자가 중간엽 줄기 세포는 손상의 발생 전에 또는 손상의 발생 후에 수집될 수 있다. 세포가 손상의 발생 전에 수집된 경우, 수집된 세포는 증식의 임의적 둔화 또는 증식 후에 동결보존과 같은 방법에 의해 보관되어야 한다. 이는 손상의 발생은 통상적으로 예측하기 어렵기 때문이다. 세포가 손상의 발생 후에 수집되는 경우, 수집된 세포들은 증식의 임의적 둔화 또는 증식 후에 개체에 직접적으로 투여될 수 있거나 또는 그 후에 동결보존(예를 들면, 초저온 냉동기에서 -152℃에 보관)과 같은 방법에 의해 보관되고 선택된 시기에 적절하게 투여될 수 있다. 대안적으로, 모든 세포들이 동시에 투여될 수 있거나, 또는 그들 중 일부는 보관되고 필요한 경우에 추가적으로 투여될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "개체(subject)"는 임의의 개별적인 생물체를 의미하고 바람직하게는 동물, 보다 바람직하게는 포유동물이고, 가장 바람직하게는 개인이다. 본 발명에서, 개체는 특정 손상 부위를 갖는다.
본 발명은 엑스 비보로 배양된 세포들이 생물학적 조직 복구 및 재생에서 이용할 수 있는 세포인지 여부를 평가하는 평가 방법에서 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 평가 방법은 평가대상 세포에서 특정한 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 평가 방법은 평가대상 세포에서 표 1 내지 4에 기재된 유전자 중 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에 따른 평가 방법은 표 1 내지 4에 기재된 유전자들 중 하나 이상의 발현 수준을 대조군 세포에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 평가 대상 세포의 공급원과 동일한 공급원으로부터 제조되고 외래 인자를 이용하여 배양된 세포들이 대조군 세포이다. 대조군 세포에서 의도된 유전자의 발현 수준이 평가대상 세포에서의 발현 수준의 측정과 동시에 측정될 수 있거나 또는 미리 측정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 평가 방법은 대조군 세포에서 의도된 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명을 의도된 유전자로서 표 2 내지 4의 박스 B에 기재된 유전자에 적용하는 것에 의해, 평가대상 세포는 이 세포들에서 의도된 유전자의 발현 수준이 대조군 세포에서의 발현 수준보다 더 낮은 경우 생물학적 조직 복구 및 재생에서 이용할 수 있는 세포로 결정된다. 대안적으로, 본 발명을 의도된 유전자로서 표 2 내지 4의 박스 A에 기재된 유전자에 적용하는 것에 의해, 평가 대상 세포는 이 세포들에서 의도된 유전자의 발현 수준이 대조군 세포에서의 발현 수준보다 더 높은 경우, 생물학적 조직 복구 및 재생에서 이용가능한 세포로 결정된다.
본 발명에서, 유전자 발현 수준의 측정은 mRNA 수준 또는 단백질 수준에 근거하여 수행될 수 있다. 전술된 바와 같이, "표에 기재된 유전자(gene described in the table)"는 이 표에서 "프로브 세트 ID(Probe Set ID)"로 식별된 유전자를 의미하도록 의도된다(이 유전자는 상기 유전자의 기능을 보유한 변이체를 포함한다). 이는 표의 "유전자 명칭(Gene Title)"에 근거하여 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 이해된다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 mRNA 수준 측정을 위해 필요한 서열 도구(예를 들면, 프라이머 또는 프로브)를 용이하게 구축할 수 있고 단백질 수준 측정을 위해 필요한 항체를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 평가 방법은 본 명세서의 실시예에 기재된 시스템에서 기준과 실험 어레이 간의 유전자 발현 수준의 비가 4배 이상인 것인 지표에 근거하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 평가 방법은 동종 혈청의 존재시 평가 대상 세포의 증식 속도를 외래 혈청의 존재시 그의 증식 속도와 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 바람직하게는 인간-유래 세포에 적용가능하다. 이 경우, 외래 혈청은 바람직하게는 FBS이다. 인간 혈청은 이전에 FBS에 비해 성장-촉진 활성이 상당히 열등하고, 그 자체로 불충분한 세포 증식-촉진 활성을 보이는 것으로 알려졌다. 따라서, 세포가 생물학적 조직 복구 및 재생을 위해 이용가능한지 여부를 인간 혈청(특히, 자가 혈청)을 이용하여 수득된 세포 증식 속도를 FBS를 이용하여 수득된 세포 증식 속도와 비교하는 것에 의해 평가할 수 있다는 것은 예상치 못했다.
본 발명은 세포 증식을 위해 통상적으로 필수적이거나 또는 유용한 것으로 간주되는 항응고제가 미량으로 첨가되거나 또는 실질적으로 존재하지 않는 경우에도, 배양에서 외래 혈청(FBS) 대신 동종 혈청(예를 들면, 수집된 세포가 유래된 개체의 자가 혈청)을 이용하여 증식 속도의 상당한 개선을 달성한다. 또한, 본 발명에 따르면, 탁월한 증식 효율성을 갖는(빠르게 증식함) 세포가 수득된다. 이 놀라운 효과는 일반적 통념으로부터 전혀 예상되지 않았다. 자가혈청을 포함하지 않는 배양 방법에 의해 수득된 세포는 FBS를 이용하지 않는 통상적인 배양 방법에 의해 수득된 세포에 비해 안전성 및 분화능에 있어서 훨씬 더 탁월하다.
본 발명의 약제학적 제제는 투여에 대해 효과적이지 않은 것으로 간주되었던 질환의 아급성기 또는 그 이후에 투여되는 경우에도 치료적 효과를 갖는다. 따라서, 투여대상 세포가 질병의 발병 전에 준비되지 않아도 되고 발병 후에 개체로부터 수집되고 배양되면 된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 제제는 개체의 부담을 크게 경감시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 제제는 정맥내 주사에 의해 신체 내의 임의의 손상 부위의 복구를 보조할 수 있고, 따라서, 개체에게 덜 침습적이다. 또한, 본 발명의 약제학적 제제는 수술 없이, 통상적인 치료실 등에서 투여될 수 있고, 따라서, 의료 공여자(medical donor) 및 의료 비용의 부담을 경감시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 제제는 복수의 상이한 조직에 대해 복구-보조 효과(repair-assisting effect)를 가지며, 따라서, 보다 광범위하게 적용가능하다. 특히, 본 발명의 약제학적 제제는 개체에서 복수의 상이한 손상 부위를 동시에 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 골수액에 첨가된 헤파린의 양이 0.1 U/mL (◆) 또는 267 U/mL (■)인 경우, 인간 중간엽 줄기 세포의 증식을 보여주는 그래프이다;
도 2는 미량 (좌측) 또는 2 mL (우측)의 헤파린이 골수액에 첨가된 경우 4일의 배양 후 세포의 갯수를 보여주는 그래프이다. 세포의 갯수는 미량의 헤파린의 첨가시 약 40배 정도 더 높았다;
도 3은 첨가된 헤파린의 양이 0.1 U/mL인 경우 인간 성체 혈청 (◆) 또는 FBS (■)로 보충된 배지에서 중간엽 줄기 세포 증식을 보여주는 그래프이다;
도 4는 랫트 중간엽 줄기 세포가 다양한 양의 헤파린(상부부터 하부까지, 1 U/mL, 10 U/mL, 100 U/mL, 및 1000 U/mL의 순서)으로 보충된 10% FBS 함유 배지에서 배양된 경우 증식 속도를 보여주는 그래프이다;
도 5는 랫트 중간엽 줄기 세포가 헤파린으로 보충된 배지에서 배양되거나(◆) 또는 동일한 양의 헤파린이 골수액에 첨가되고, 뒤이어 배지에서 배양된 경우 (■), 증식 속도를 보여주는 그래프이다;
도 6은 첨가된 헤파린의 양이 0.1 U/mL인 경우, 인간 성체 자가혈청(실선) 또는 FBS (점선)로 보충된 αMEM 배지에서 인간 중간엽 줄기 세포의 증식을 보여주는 그래프이다;
도 7은 첨가된 헤파린의 양이 0.1 U/mL 미만인 경우, 글루타민의 첨가 (◆) 또는 글루타민의 부재(■)에 의해 수득된 인간 중간엽 줄기 세포의 증식을 보여주는 그래프이다;
도 8은 헤파린으로 미처리되거나(◆), 헤파린으로 처리되거나(■), 또는 헤파린+프로타민으로 처리된(▲) 랫트 중간엽 줄기 세포가 FBS-함유 배지에서 배양된 경우, 증식 속도를 보여주는 그래프이다;
도 9는 본 발명의 약제학적 제제의 치료 메카니즘을 보여주는 도면이다. 세로 좌표는 증상의 중증도를 나타낸다. 가로 좌표는 발병 후 소요된 시간을 나타낸다. 화살표는 본 발명의 약제학적 제제의 투여 시기를 나타낸다. 화살표 우측에 위치한 상부 곡선(upper curve)은 본 발명의 제제를 투여받은 개체의 증상의 변화를 나타낸다. 하부 곡선은 본 발명의 제제를 투여받지 않은 개체의 증상의 변화를 나타낸다;
도 10은 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전(좌측) 및 투여 2주 후(우측)에 허혈성 신경 질환 환자의 뇌의 MRI 이미지이다. 손상 부위는 백색 부분으로 표시된다;
도 11은 본 발명의 약제학적 제제의 투여를 중심으로 한 시기 동안 허혈성 신경 질환 환자의 뇌경색 수준(NIHSS: National Institutes of Health Stroke Scale (●), JSS: Japan Stroke Scale (■), 및 MRS: Modified Ranking Scale (▲))의 변화를 보여주는 그래프이다. 화살표는 세포의 투여 시기를 나타낸다;
도 12는 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전(좌측) 및 투여 1주 후(우측) 허혈성 신경 질환 환자의 체온 측정 이미지이다. 고온을 나타내는 진한 색의 영역이 투여 1주 후에 상당히 감소되었다;
도 13은 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전 및 후에 당뇨병 환자의 혈당 수준 (BS: ●), 혈청 Glu A1 농도 (■), 및 혈청 HbA1C 농도(▲)의 변화를 보여주는 그래프이다. 좌측과 우측의 세로축은 각각 mg/dl 및 %를 나타낸다. 가로축은 0일차를 투여일로 한 일자를 나타낸다. 화살표는 세포(본 발명의 약제학적 제제)의 투여 시기를 나타낸다;
도 14는 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전 및 후 양성 전립선 비대증 환자의 PSA 값의 변화를 보여주는 그래프이다. 화살표는 세포(본 발명의 약제학적 제제)의 투여 시기를 나타낸다;
도 15는 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전 및 후 간 손상 환자의 γ-GTP (좌측), GOT (우측: ◆), 및 GPT (우측: ■) 값의 변화를 보여주는 그래프이다. 화살표는 세포(본 발명의 약제학적 제제)의 투여 시기를 나타낸다;
도 16은 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전 및 후 신장 손상 환자의 β2-마이크로글로불린 값의 변화를 보여주는 그래프이다. 화살표는 세포(본 발명의 약제학적 제제)의 투여 시기를 나타낸다;
도 17은 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전 및 후 고지혈증 환자의 중성 지방의 변화를 보여주는 그래프이다. 화살표는 세포(본 발명의 약제학적 제제)의 투여 시기를 나타낸다;
도 18은 본 발명의 약제학적 제제의 투여 전 및 후 고등 뇌 기능장애 환자(치매 및 실어증)의 SLTA 및 WAIS-R 테스트 결과의 변화를 보여주는 그래프이다;
도 19는 랫트 뇌경색 모델에서 본 발명의 약제학적 제제의 투여에 의해 유발된 치료적 효과를 비교하는 결과를 보여주며, 상기에서, 비교는 MRI 및 혈관형성의 측면에 따라 그룹간에 수행되었다. 도표에서, 막대는 좌측부터 우측으로 (i) 비이식(untransplanted) 그룹, (ii) 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, (iii) 안기오포이에틴(angiopoietin)-유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, (iv) VEGF 유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, 및 (v) 안기오포이에틴/VEGF 유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹을 나타낸다:* p<0.05, ** p<0.01;
도 20은 랫트 뇌경색 모델에서 본 발명의 약제학적 제제의 투여에 의해 유발된 치료적 효과를 비교하는 결과를 보여주며, 상기에서, 비교는 행동 측면에 따라 그룹간에 수행되었다. 도표에서, 막대는 좌측부터 우측으로 (i) 비이식 그룹, (ii) 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, (iii) 안기오포이에틴-유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, (iv) VEGF 유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, 및 (v) 안기오포이에틴/VEGF 유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹을 나타낸다:* p<0.05, ** p<0.01;
도 21은 랫트 심폐 정지 모델(소생-후 뇌병증(post-resuscitation encephalopathy))에서 본 발명의 약제학적 제제의 투여에 의해 유발된 치료적 효과를 평가한 결과를 보여주며, 상기에서, 평가는 터널-양성(Tunnel-positive) 세포의 갯수(도 21A) 및 신경 세포의 갯수(도 21B)에 근거하여 수행되었다. 도표에서, 좌측 막대와 우측 막대는 각각 대조군과 세포-투여 군을 나타낸다: * p<0.05;
도 22는 랫트 심폐 정지 모델에서 본 발명의 약제학적 제제의 투여에 의해 유발된 치료적 효과를 평가한 결과를 보여주며, 상기에서, 평가는 모리스 수중 미로 테스트(Morris water maze test)에 따라 수행하였다 (* p<0.05); 및
도 23은 본 발명에 따른 인간 중간엽 줄기 세포가 이식된 척수 손상 모델 랫트의 운동 기능의 회복을 평가한 결과를 보여주고, 상기에서, 평가는 트레드밀 검사(Treadmill test)에 따라 수행하였다. 상기 도표에서, 막대는 좌측부터 우측으로, 이식 후 6시간, 1일, 3일, 7일 및 14일을 나타낸다.
하기의 실시예는 본 발명의 방법에 따른 세포 증식 및 본 발명의 방법에 의해 증식된 세포를 포함하는, 조직 복구/재생용 약제학적 제제를 보다 구체적으로 설명하기 위해 제시되며 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다. 세포 배양 및/또는 세포 치료법의 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 원리(spirit)를 벗어나지 않으면서 다양한 변형을 생성할 수 있다.
실시예 1
내벽이 미리 미량의 헤파린(골수액 mL 당 0.1 U)으로 적셔진 채혈 튜브를 이용하여 뇌 질환 환자로부터 60 mL의 골수액을 수집하였다. 수집된 골수액에 210 mL의 배지를 첨가하여 총량을 270 mL가 되게 하였다. 이 골수액-함유 배양 용액을 18개의 분량으로 나누고, 각 분량을 직경이 150 mm인 디쉬(IWAKI에 의해 제조된 조직 배양 디쉬 #3030-150)에 15 mL의 양으로 접종하였다. 배지 5 mL를 첨가하여 디쉬 당 총량이 20 mL가 되게 하였다. 접종 후에, 이 디쉬들을 별개의 인큐베이터(인큐베이터 당 9개의 디쉬) 내에 방치하고, 뒤이어 5% CO2 대기에서 37±0.5℃로 배양하였다. 말초 혈액 검사에 의해 미리 골수액이 HIV, ATL, HB, HC, 매독, 인간 파보바이러스 B19, 등에 의해 감염되지 않았다는 것을 확인했다.
자가 말초 혈액으로부터 유래된 혈청 56.8 mL, 항생제(10,000 U/mL 페니실린 및 10 mg/mL 스트렙토마이신으로 구성됨) 5.7 mL, 및 글루타민(292.3 mg/L) 5.7 mL를 500 mL의 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)에 첨가하여 배지를 제조하고, 여과에 의해 멸균하고 소량씩 분배하고, 4℃에서 냉각 박스에 보관하였다. 상기 배지를 미리 37℃에서 유지시키고 이용하였다.
4일차에, 배양 용기에 부착된 중간엽 줄기 세포를 세척하였다. 이 목적을 위해, 배지 및 상기 배지 중에 부유한 혈액 세포 성분들을 분리하고, 흡인에 의해 제거하고, 부착성 중간엽 줄기 세포의 표면을 뒤이어 5 mL의 인산염-완충 염수를 세척액으로 하여 6회 세척하였다.
8일 차에, 제1 계대 배양을 수행하였다. 이 목적을 위해, 5 mL의 인산염 완충 염수로 세척된 부착성 줄기 세포를 해리시키기 위해 4 mL의 분리 용액(0.25% 트립신-2.21 mM EDTA)을 디쉬에 첨가하고 해리를 확인하기 위해 37℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 디쉬로부터 분리된 세포들을 포함하는 분리 용액에, 동일한 양의 배지를 첨가하고, 용액의 총량을 따라내기(decantation)에 의해 수집하였다. 9개의 디쉬에 해당하는 세포들을 각각 9개의 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리기에서 800 rpm으로 5분 동안 원심분리시켰다. 원심분리 후에, 각 원심분리 튜브의 상층액을 제거하고, DMEM의 첨가에 의해 세포들을 수집하였다. 수집된 세포 용액을 800 rpm에서 5분 동안 다시 원심분리시켰다. 원심분리 후에, 각 원심분리 튜브의 상층액을 제거하고, 세포들을 300 mL의 배지의 첨가에 의해 수집하였다. 이 세포 용액을 15개의 디쉬에 해당하는 소량으로 나누고 일차 배양에서와 같이, 5%의 CO2 농도에서 37±0.5℃에서 계대 배양을 위해 인큐베이션시켰다. 전술된 바와 같은 동일한 계대 배양 절차를 남은 9개의 디쉬에 대해 수행하였다.
13일 차에, 세척, 해리, 및 원심분리를 전술된 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 각 소량 중의 세포의 갯수는 혈구계를 이용하여 측정하고 결론적으로 1.1x106 개의 세포에 도달한 것으로 결정하고, 따라서, 세포들을 더 계대 배양시켰다. 배양을 지속하고, 20일 차에, 전술된 바와 동일한 방식으로 세포의 갯수를 측정하고, 총 갯수가 1.0x108 개의 세포에 도달한 것으로 결정하였다. 따라서, 세척, 해리, 및 원심분리를 수행하고, 세포를 동결보존 용액(여과에 의해 멸균된 통상적인 RPMI 20.5 mL, 환자로부터 수집된 자가 혈청 20.5 mL, 덱스트란 5 mL, 및 DMSO 5 mL)에 현탁시키고 -150℃에서 동결시켰다. 세포 대비 중간엽 줄기 세포의 비율은 98% 이상이었다(CD105 양성(양성 비율=99.9%), CD34 음성 (음성 비율=98.8%), 및 CD45 음성 (음성 비율=98.5%).
비교예 1
시료 중의 헤파린 함량이 2 mL(267 U/mL)로 변경된 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 조건 하에 배양을 수행하였다. 결과가 도 1 및 2에 표시된다. 헤파린이 미량(0.1 U/mL)으로 첨가된 경우, 8x105 개의 세포까지의 증식이 배양 후 4일 차에 수득되었다. 대조적으로, 2 mL의 헤파린이 첨가된 경우, 2x104 개의 세포까지의 증식을 수득하였다. 따라서, 미량의 헤파린을 이용하여 수득된 증식 속도가 약 40배 더 높았다(도 1 및 2). 조건화 배양에서, 세포의 갯수가 미량의 헤파린 첨가에 의해 배양 후 12일 차에 1.4x107 개의 세포까지 증가되었고, 대조적으로, 2 mL의 헤파린 첨가에 의해 2.9x106 개의 세포까지 증가되었다(도 1). 이 결과는 헤파린의 첨가가 세포 증식에 대해 저해 효과를 갖는다는 것을 보여주고, 또한 본 발명의 방법은 항응고제가 미량으로 첨가되거나 또는 실질적으로 존재하지 않는 경우에도 세포들을 빠르게 증식시킬 수 있다는 것을 입증했다. 이 결과는 또한 증식 속도가 시료 중의 헤파린 함량을 미량으로 설정하는 것에 의해 유의성 있게 개선된다는 것을 더 보여주었다.
비교예 2
인간 말초 혈액으로부터 유래된 혈청 대신 FBS를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 조건 하에 8일 동안 배양을 수행하였다. 세포의 갯수의 측정에 근거한 중간엽 줄기 세포의 증식 속도의 비교가 도 3에 표시된다. 인간 중간엽 줄기 세포가 본 발명의 조건 하에 배양되는 경우, 인간 성체 혈청의 이용은 FBS를 이용하여 수득되는 증식 속도 대비 배양 5일 차에 약 2.6배, 및 배양 8일 차에 약 6배 더 높은 증식 속도를 가져왔다. 이 결과는 인간 골수 세포의 배양에서, 시료 중의 헤파린의 양을 미량으로 설정하는 것에 의해 인간 성체 혈청의 이용이 FBS를 이용하여 수득된 증식 속도보다 더 높은 속도를 가져온다는 것을 보여준다.
비교예 3
랫트 중간엽 줄기 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 두 개의 랫트 대퇴골로부터 수집된 골수 세포를 1 U/mL, 10 U/mL, 100 U, 또는 1000 U/mL 헤파린으로 보충된 실시예 1에서와 동일한 배지에서 배양하였다. 배양은 FBS가 인간 말초 혈액으로부터 유래된 혈청 대신에 이용된 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 조건 하에서 수행되었다. 결과가 도 4에 표시된다. 이 결과는 배지 중의 헤파린의 보다 높은 농도가 증식에 대해 보다 높은 저해 효과를 갖는다는 것을 보여주었다.
비교예 4
랫트 중간엽 세포를 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다: 제1 그룹의 경우, 4 mL의 DMEM을 이용하여 하나의 랫트 대퇴골로부터 골수액을 채취하여 4 mL를 약간 초과하는 양의 시료를 준비하였다. 이 시료를 160 U의 헤파린이 보충된 DMEM 36 mL에 첨가하고, 배양을 개시하였다. 배지 중의 헤파린의 농도는 4 U/mL였다. 제2 그룹의 경우, 160 U의 헤파린이 보충된 4 mL의 DMEM을 이용하여 하나의 랫트 대퇴골로부터 골수액을 채취하여 4 mL를 약간 초과하는 양의 시료를 준비하였다. 이 시료를 고농도의 헤파린에 노출된 이 상태로 5분 동안 실온에서 방치하였다. 그 후, 36 mL의 DMEM을 첨가하고, 배양을 개시하였다. 배지 중의 헤파린의 농도는 4 U/mL였다. 이 두 그룹에서 세포의 갯수의 변화가 도 5에 표시된다. 제2 그룹은 제1 그룹의 증식 속도보다 훨씬 더 낮은 증식 속도를 갖는 것으로 관찰되었다. 이 결과는 시료 채취 동안(또는 배양으로의 전환(shift) 동안)) 세포 시료로의 헤파린의 첨가는 배양시 배지로의 헤파린의 첨가에 의해 수득되는 것보다 더 낮은 세포 증식 효율성을 가져온다는 것을 시사했다.
실시예 2
표준 배지로서, DMEM 대신에 αMEM 배지를 이용한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 조건 하에 배양을 수행하였다. 결과가 도 6에 표시된다. 이 결과는 αMEM 배지가 이용되는 경우, 인간 혈청의 이용이 헤파린의 양도 감소시키는 것에 의해, FBS에 의해 수득되는 것보다 더 빠른 증식을 가져온다는 것을 입증했다.
비교예 5
배지에 글루타민이 존재하지 않는다는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방식으로 배양을 수행하였다. 세포의 갯수의 측정에 근거한 중간엽 줄기 세포의 증식 속도의 비교가 도 7에 표시된다. 글루타민의 이용은 글루타민의 부재시에 수득된 것보다 배양 후 1주일 차에 약 1.6배 더 높은 증식 속도를 가져왔다. 이 결과는 글루타민의 첨가가 중간엽 줄기 세포의 빠른 증식을 위해 요구된다는 것을 보여주었다.
실시예 3
[방법]
3개의 랫트 대퇴골을 수집하고, 각각의 대퇴골로부터 DMEM(5 ml)을 이용하여 골수 세포를 세척하여 채취하고(wash out) 3개의 시료 그룹을 제조하기 위해 하기의 작용제를 보충하였다:
(i) DMEM (5 ml)
(ii) DMEM (5 ml)+헤파린 (2 ㎕)
(iii) DMEM (5 ml)+헤파린 (2 ㎕)+프로타민 (2 ㎕)
각 시료를 DMEM으로 세척하고 10 ml의 배양 용액(DMEM+10% FBS+1% 페니실린/스트렙토마이신+2 mM L-글루타민)에 배치하고, 10 cm 디쉬에 접종하고, 14일 동안 배양시켰다. 세포 밀도가 5,500 개의 세포/cm2를 초과하는 시점에 계대 배양을 개시하였다.
[결과]
도 8에 도시된 바와 같이, 헤파린으로 처리되지 않은 세포들은 헤파린으로 처리된 세포들보다 더 큰 초기량 및 더 높은 증식 속도를 가졌고, 이는 배양 8일차 내지 11일차에 명확했다. 또한, 헤파린 활성을 저해하는 물질인 프로타민으로 보충된 세포들도 헤파린으로 처리된 세포들에서와 같이, 낮은 초기량 및 낮은 증식 속도를 가졌다.
실시예 4
세포가 헤파린과의 실질적인 접촉 없이 배양되는 조건, 즉, 낮은 헤파린 농도를 포함하는 조건 하에서, 자가혈청-배양된 중간엽 줄기 세포를 FBS-배양된 줄기 세포와 비교하였다.
[cDNA 합성 및 정제]
실시예 1의 방법에 따라 자가혈청 -함유 배지에서 배양된 중간엽 줄기 세포와 비교예 2의 방법에 따라 FBS-함유 배지에서 배양된 중간엽 줄기 세포를 각각 1x107 개의 세포/시료로 맞추었다. 각 시료에 대해, RNeasy Protect Min Kit (QIAGEN, Cat. No. 74124)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 세포 파쇄(disruption)를 위해, QIA 쉬레더(shredder)(QIAGEN, Cat. No. 79654)를 이용하였다. 수득된 RNA 용액을 0.5 ㎍/㎕로 맞추고, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.)를 이용하여 RNA의 품질을 확인하였다.
제1 가닥 cDNA를 GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit (AFFYMETRIX, Inc., P/N900433) 및 MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit (Ambion, Inc., Catalog# 1791)를 이용하여 합성하였다. 구체적으로, 반응 용액(II)를 70℃에서 10분 동안 반응시킨 반응 용액(I)에 첨가하고, 총 20 ㎕의 반응계를 42℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응 용액 (I)
성분 부피(㎕)
총 RNA(0.5 ㎍/㎕) 2
희석된 폴리-A RNA 대조군 2
T7-올리고(dT) 프라이머, 50 μM 1
RNase-불포함 물 7
총량 12
반응 용액 (II)
성분 부피(㎕)
10x 제1 가닥 완충액 2
dNTP 믹스 4
RNase 저해제 1
ArrayScript 1
총량 8
뒤이어, 제2 가닥 cDNA를 MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit (Ambion, Inc., Catalog# 1791)를 이용하여 합성하고 정제하였다. 구체적으로, 반응 용액 (III)을 상기와 같이 반응된 반응 용액(II)에 첨가하고 총 100 ㎕의 반응계를 16℃에서 2시간 동안 반응시켰다. cDNA 정제를 위해, 상기 키트에 들어있는 cDNA Filter Cartridge를 이용하고, 최종적으로 24 ㎕의 뉴클레아제-불포함 물(Nuclease-free Water)을 용리를 위해 필터에 두 개의 분량으로 첨가하였다.
반응 용액 (III)
성분 부피(㎕)
뉴클레아제-불포함 물 63
10x 제2 가닥 완충액 10
dNTP 믹스 4
DNA 중합효소 2
RNase H 1
총량 80
[IVT 반응]
MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit (Ambion, Inc., Catalog# 1791)를 이용하여 IVT 반응 및 aRNA 정제를 수행하였다. 구체적으로, 반응 용액 (IV)를 37℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 그 후, 반응을 60 ㎕의 뉴클레아제-불포함 물의 첨가에 의해 종료시켰다. aRNA 정제를 위해, 키트에 담긴 aRNA Filter Cartridge를 이용하고, 최종적으로 100 ㎕의 뉴클레아제-불포함 물을 용리를 위해 상기 필터에 첨가하였다. 수득된 RNA 용액을 20 ㎍/32 ㎕로 맞추고, RNA의 품질을 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.)를 이용하여 확인하였다.
반응 용액 (IV)
성분 부피(㎕)
이중-가닥 cDNA 20
비오틴-NTP 믹스 12
T7 10x 반응 완충액 4
T7 효소 믹스 4
총량 40
[혼성화 칵테일의 제조]
혼성화 칵테일을 제조하기 위해 MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit (Ambion, Inc., Catalog# 1791)를 이용하여 aRAN를 단편화시켰다. 구체적으로, 반응 용액 (V)를 94℃에서 35분 동안 반응시켰다. 그 후, GeneChip Expression 3'-Amplification Reagents Hybridization control kit (AFFYMETRIX, Inc., P/N900454)를 이용하여 혼성화 칵테일을 제조하고 99℃에서 5분 동안 반응시키고, 그 후, 45℃에서 5분 동안 반응시켰다.
반응 용액 (V)
성분 부피(㎕)
aRNA(20 ㎍/32 ㎕) 32
5x 어레이 단편화 완충액 8
총량 40
(혼성화 칵테일)
성분 부피(㎕)
단편화 cRNA 30
대조군 올리고뉴클레오티드 B2 5
20x 진핵세포 혼성화 대조군 15
hs(herring sperm) DNA(10 mg/ml) 3
BSA(50 mg/ml) 3
2x 혼성화 완충액* 150
DMSO 30
H2O 64
총량 300
* 혼성화 완충액(1x 농도: 100 mM MES, 0.1M[Na+], 20 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)
[혼성화]
GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array (AFFYMETRIX, Inc., P/N900466)에 1x 혼성화 완충액을 충진시키고, 뒤이어 45℃에서 60 rpm으로 10분 동안 예비 혼성화(prehybridization)를 수행하였다. 그 후, 1x 혼성화 용액을 제거하고, 어레이에 제조된 혼성화 칵테일을 충진시키고, 뒤이어 45℃에서 60 rpm으로 밤새 혼성화를 수행하였다.
[세척 및 염색]
세척 완충액 A (6xSPE, 0.01% Tween-20), 세척 완충액 B (100 mM MES, 0.1 M [Na+], 0.05% Tween-20), 및 물을 Fluidics Station에 적재하고, GCOS (GeneChip Operating Software) 프로그램에 따라 프라이밍(priming)을 수행하였다. 뒤이어, 혼성화 칵테일을 제거하고, 어레이에 세척 완충액 A를 충진시켰다. 이 어레이, SAPE Solution Mix (1xStain buffer, 2 mg/ml BSA, 10 ㎍/ml SAPE), 및 Antibody Solution Mix (1xStain buffer, 2 mg/ml BSA, 0.1 mg/ml Goat IgG Stock, 3 ㎍/ml 비오틴이 부착된 항체)를 Fluidics Station에 적재하였다. 그 후, GCOS의 프로그램에 따라 세척 및 염색을 수행하였다.
[스캔]
Gene Array Scanner에 어레이를 적재하고, 스캔 및 분석을 수행하였다. 분석 결과가 표 1 내지 5에 표시된다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
[결과]
표 1은 FBS-배양된 세포 및 자가혈청-배양된 세포를 포함하는 5개의 케이스에서 공통으로 증가된 또는 감소된 수준을 보이는 세포 표면 항원을 보여준다. 표 2는 상기 5개의 케이스에서 공통적으로 증가된 또는 감소된 발현을 보이는 성장 인자-관련 인자를 보여준다. 또한, 표 3은 상기 5개의 케이스에서 공통적으로 증가된 또는 감소된 발현을 보이는 사이토카인을 보여준다. 또한, 표 4는 상기 5개의 케이스에서 공통적으로 2배 이상의 차이나는 발현 수준을 갖는 유전자 그룹을 보여준다.
표 1에 도시된 바와 같이, FBS-배양 세포에서 발현된 분화 마커 CD24는 자가혈청-배양 세포에서는 발현되지 않아서, 자가혈청-배양 세포가 보다 미분화 상태로 유지된다는 것을 보여주었다. 또한, 표 2 내지 4에 표시된 바와 같이, 일련의 성장 인자들이 자가혈청-배양 세포에서 발현되고, 일부 성장 인자들은 FBS-배양 세포 대비, 증가된 발현을 보였다. 또한, 본 분석의 결과는 자가혈청-배양된 세포들이 일련의 암-관련 유전자들의 그룹의 낮은 발현을 가지며, 따라서 매우 안전하다는 것을 입증했다.
따라서, 자가혈청을 이용한 본 발명의 배양 방법은 FBS를 이용하지 않으면서 높은 증식 효율성으로 세포를 배양하고 보다 높은 안전성 및 보다 높은 분화능을 갖는 세포들을 생성할 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 5
허혈성 신경 질환(뇌경색: 우측 내부 경동맥 폐색)을 갖는 환자(52세 남성)가 2007년 2월 4일에 좌반신 마비를 일으켜서 2007년 2월 19일에 삿뽀로 의과대학 병원(Sapporo Medical University Hospital)으로 이송되었다. 치료 전에, 환자는 증상을 가졌다: 그는 좌반신 마비이고 특히, 우상지에 심한 마비를 가졌다; 그는 주먹을 전혀 쥐거나 펼 수 없었다; 그는 물체(예를 들면, 빌딩 블럭 등)를 잡고 놓을 수 없었다; 그는 어깨보다 높은 위치까지 팔을 들어올리지 못했다; 및 그는 손목을 굽히거나 펼 수 없었다. 이 환자로부터, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양시켰다. 세포의 총량에, 동결보존액(20.5 mL의 여과에 의해 멸균된 통상적인 RPMI, 20.5 mL의 환자로부터 수집된 자가혈청, 5 mL의 덱스트란, 및 5 mL의 DMSO)을 첨가하여 치료 약물을 생성하였다. 말초혈액 검사에 의해 미리 상기 환자로부터의 골수액이 HIV, ATL, HB, HC, 매독, 인간 파보바이러스 B19, 등에 의해 감염되지 않았다는 것을 확인했다. 이 치료 약물을 3월 19일에 환자에게 30분에 걸쳐 정맥 내로 투여하였다. 부작용은 관찰되지 않았다.
결과
이 환자는 세포 치료법 전에 왼손의 5개의 손가락 모두에 운동 기능장애를 가졌었으나, 세포 투여 후 다음날, 왼손의 전혀 움직일 수 없던 손가락을 움직이고, 주먹을 쥐었다 펼 수 있게 되었다. 1주 후에, 운동 기능의 개선을 관찰하였고, 그는 막대를 옮기는 신체적 활동을 수행할 수 있었다. 2주 후에, 뇌경색 크기의 명확한 감소를 MRI에 의해 확인하였다(도 10). 또한, 상기 환자는 주먹을 보다 빠르게 쥐었다 폈다 할 수 있게 되고 빌딩 블럭을 잡고 놓을 수 있게 되었다. 상기 환자는 또한 팔을 어깨보다 높은 수준까지 올릴 수 있고, "만세(banzai)" 자세(팔을 공중으로 들어올림)를 취할 수 있게 되었다. 상기 환자는 또한 그의 팔꿈치 및 손목을 굽혔다 폈다 할 수 있게 되었다. 세포 치료법을 중심으로 하는 기간 동안 이 환자의 뇌경색 수준의 변화가 뇌경색 평가의 잘 알려진 척도를 이용하여 도 11에 표시된다(NIHSS: National Institutes of Health Stroke Scale, JSS: Japan Stroke Scale, 및 MRS: Modified Ranking Scale).
도 10은 이 환자의 뇌의 MRI 이미지이다. 우뇌에서 뇌경색에 의해 손상된 부위(백색 부분)의 크기의 감소를 관찰했다. 또한, 도 12는 이 환자의 뇌혈류 이미지이고, 상기 이미지에서 치료 1주일 후에 손상 부위에서 뇌혈류의 회복을 관찰하였다. 전술된 운동 기능의 회복과 함께, 이 결과들은 본 발명의 제제의 투여가 아급성기 또는 그 이후에 유의성 있는 개선 효과를 보인다는 것을 입증했다. 운동 기능의 회복과 함께, 이 결과들은 본 발명의 약제학적 제제의 투여가 아급성기 또는 그 이후의 뇌경색에 대해 유의성 있는 개선 효과를 보인다는 것을 입증했다.
실시예 6
환자(50대 여성)는 장기간 동안 윌리스 환(circle of Willis)의 자발적 폐색(모야모야병)을 앓았고, 그에 의해 좌반신 마비를 가졌다. 이 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 발병 약 2개월 후에, 세포들을 이 환자에게 정맥내로 투여하였다. 투여후 수행된 MRI(PWI) 검사에 의해 뇌혈류의 개선을 확인했다.
실시예 7
환자(60대 남성)는 죽상혈전증(atherothrombosis)에서 기인된 좌반신 마비를 가졌다. 이 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 발병 4개월 후에, 세포들을 이 환자에게 정맥내로 투여하였다. 결과로서, 투여 다음 날 이후로, 경직의 완화 및 관절 운동 범위의 증가를 관찰했다. 이후에, 상기 환자는 근력을 상당히 회복하여 측정가능한 수준의 약력(grasping power)(4 kg)을 달성하였다. 또한, 투여 후 약 2.5개월 차에, 상기 환자는 스스로 걸을 수 있었고, 왼손 기능은 실제적으로 이용가능한 수준까지 회복되었다.
실시예 8
환자(50대 남성)는 죽상혈전증에서 기인된 좌반신 마비를 가졌다. 이 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 발병 6주 후에, 세포들을 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 투여 다음날 이후로, 손가락 운동이 개선되었다. 그 이후에, 상기 환자는 근력을 상당히 회복하여 측정가능한 수준의 약력(8 kg)을 달성하였다. 또한, 상기 환자는 보다 빠르게 손가락 작업(finer task)을 수행할 수 있게 되었고 또한 그의 손가락 끝의 힘을 예를 들면, 한 쌍의 젓가락을 분리시킬 수 있을 정도의 수준까지 회복하였다. 따라서, 상기 환자는 일상 생활에 도움이 되는 활동을 수행할 수 있게 되었다.
실시예 9
환자(60대 남성)는 죽상혈전증에서 기인된 좌반신 마비를 가졌다. 이 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 발병 5주 후에, 세포들을 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 상기 환자는 투여 당일 밤 이후로 하지(lower extremity)의 운동 개선을 느끼고 투여 다음날 손의 운동의 개선도 느꼈다. 그 이후, 운동 기능의 개선이 지속되었다.
실시예 10
*환자(70대 남성)는 죽상혈전증에서 기인된 좌반신 마비 및 구어 장애를 가졌다. 이 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 발병 8주 후에, 세포들을 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 투여 후 다음날 아침 이후로, 상기 환자는 그의 발가락을 움직일 수 있었고, 어깨 및 팔꿈치의 운동의 개선도 관찰되었다. 그 후, 투여 후 3일 차에, 상기 환자는 손가락을 움직일 수 있을 정도로 회복되었다.
실시예 11
만성 당뇨병 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하고 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 상기 환자의 투여 전 약 190 mg/dl였던 혈당 수준이 투여 후 약 1개월 내에 정상 수준까지 개선되었다. 또한, 당뇨병에 대한 다른 지표들에서도 명백한 개선을 관찰하였다(도 13).
*실시예 12
양성 전립선 비대증 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하고, 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 투여는 투여 전의 지표 대비, 양성 전립선 비대증에 대한 지표로 작용하는 PSA 값을 명확하게 개선시켰다(도 14).
실시예 13
간 손상 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하고, 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 투여는 투여 전의 지표 대비, 간 손상에 대한 지표로 작용하는 γ-GTP, GOT, 및 GPT 값을 명확하게 개선시켰다 (도 15).
실시예 14
신장 손상 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하고, 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 투여는 투여 전의 지표 대비, 신장 손상에 대한 지표로 작용하는 β2-마이크로글로불린 값을 명확하게 개선시키고, 또한 신장 손상에 따른 다른 지표들(BUN 및/또는 크레아틴 값)도 명확하게 개선시켰다 (도 16).
실시예 15
고지혈증 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하고, 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 결과로서, 투여는 투여 전의 지표 대비, 고지혈증에 대한 지표로 작용하는 중성 지방 값(neutral fat value)을 명확하게 개선시키고, 또한 고지혈증에 대한 다른 지표도 명확하게 개선시켰다 (도 17).
실시예 16
고등 뇌 기능장애/실어증 환자로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하고, 이 환자에게 정맥 내로 투여하였다. 투여 전 및 후에, 환자에게 SLTA(Standard Language Test of Aphasia) 및 WAIS-R(Wechsler Adult Intelligence Scale-Revised)을 수행하였다. 결과로서, 투여는 투여 전 값 대비, SLTA 및 WAIS-R 값을 유의성 있게 개선시켰다 (도 18).
실시예 17
건강한 인간으로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 상기 인간 중간엽 줄기 세포를 랫트 뇌경색 모델(중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion) 모델)을 위해 준비하였다. 뒤이어, 상기 랫트 모델을 (i) 비이식(untransplanted) 그룹, (ii) 세포(1.0x106)가 정맥 내로 주사된 그룹, (iii) 안기오포이에틴(angiopoietin) 유전자에 의해 형질감염된 세포 (1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, (iv) VEGF 유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹, 및 (v) 안기오포이에틴/VEGF 유전자에 의해 형질감염된 세포(1.0x106)가 정맥내로 주사된 그룹으로 나누고 처리하고, 비교에 의해 치료 효과를 연구하였다. MRI에 의한 치료 효과의 조사 결과(도 19A), 치료 효과가 그룹 (ii), (iii), 및 (v)에서 관찰되었고, 치료 효과의 강도는 (v)>(iii)>(ii)의 순서였다.
또한, 혈관 형성의 측면에서 치료 효과를 분석한 결과(도 19B), 치료 효과는 그룹 (ii), (iii), (iv), 및 (v)에서 관찰되었고, 치료 효과의 강도는 (v)>(iii)>(iv)>(ii)의 순서였다.
또한, 행동적 측면에서 트레드밀 스트레스 테스트(Treadmill stress test)를 이용하여 치료 효과를 분석한 결과, 치료 효과는 그룹 (ii), (iii), 및 (v)에서 관찰되었고, 치료 효과의 강도는 (v)>(iii)>(ii)의 순서였다.
실시예 18
건강한 인간으로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 인간 중간엽 줄기 세포 (1.0x106)를 랫트 심폐 정지 모델에 정맥내로 투여하고, 치료 효과를 결정하였다. 치료는 아폽토시스(apoptosis)를 억제하고(터널(Tunnel)-양성 세포의 갯수를 감소시킴)(도 21), 많은 수의 신경 세포들이 생존했다(도 22). 또한, 뇌의 고등 기능을 모리스 수중 미로 테스트(Morris water maze test)에 따라 평가하였다. 결과로서, 처리된 그룹에서 개선을 관찰하였다.
실시예 19
건강한 인간으로부터, 실시예 1에서와 동일한 방식으로 중간엽 줄기 세포를 수집하고 배양하였다. 척수 손상 모델을 준비하기 위해 척추후궁절제술(laminectomy)을 받은 랫트의 척수(Th11)에 대해 NYU 임팩터(impactor)를 이용하였다. 6시간, 1일, 3일, 7일, 또는 14일 후에, 인간 중간엽 줄기 세포(1.0x106)를 대퇴 정맥을 통해 랫트 모델에 이식하고, 그들의 활성을 트레드밀 테스트에 의해 시간의 경과에 따라 평가하였다. 구체적으로, 20 m/분의 속도로 가동되는 트레드 밀을 달리기를 정지하는 랫트에게 전기적 충격을 적용하도록 미리 설계하고, 뇌경색의 형성 전에, 랫트를 주당 2일 20분(매일) 세션 동안 달리도록 훈련시켰다. 회복의 시간-의존도를 각 그룹에 대해 시간을 가로축으로 하고, 최대 속도를 세로축으로 하여 도표로 작성하였다. 척수 손상의 발생 6시간 후 또는 1일 후에 이식을 받은 그룹에서 현저한 치료 효과를 관찰하였다 (도 23).
본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 특허, 및 특허출원은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
산업적 이용가능성
본 발명은 조직 복구/재생에 대해 유의성 있는 효과를 보이는 치료 약물의 신속한 제공을 달성한다. 이 치료 약물의 신속한 제공은 특히, 조기 세포 치료법이 효과적인 질병, 예를 들면, 손상된 뇌 신경을 갖는 환자를 위한 뇌 신경 재생에서 큰 효과를 갖는다. 또한, 본 발명은 세포 공여자의 부족을 완화하고 그들의 신체적 부담을 경감시킨다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 약제학적 제제는 물론, 치료 약물로서 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 약제학적 제제는 신속한 제공에 의해 강화된 치료적 효과에 의해 환자의 QOL을 유의성 있게 개선시키고 관리자의 부담 및 관리 비용을 경감시켜서, 사회적 부담의 경감을 가져온다. 따라서, 본 발명은 노령화 사회에 대한 해답을 제공한다.

Claims (17)

  1. 인간 혈청을 포함하는 배지에서, 세포 수집부터 전체 배양 기간 동안 항응고제와의 실질적인 접촉 없이 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하고,
    살아있는 개체로부터 수집된 시료에 첨가된 항응고제의 양은 상기 시료의 부피에 대해 0.2 U/ml 미만이고,
    상기 항응고제는 헤파린, 헤파린 유도체, 또는 그의 염인 것인 단리된 인간 중간엽 줄기 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 살아있는 개체로부터 수집된 시료 중 세포의 배양 동안 상기 배지에 존재하는 항응고제의 양은 상기 배지의 부피에 대해 0.02 U/ml 미만인 것인 중간엽 줄기 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 혈청은 혈청 종양 마커 및/또는 감염 인자(infectious factor)에 대해 음성으로 결정된 것인 중간엽 줄기 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 혈청 종양 마커는 페리틴, CEA, AFP, BFP, CA125, CA15-3, CA19-9, CA72-4, STN, DUPAN-2, SLX, ST-439, SPAN-1, SCC, PSA, G-세미노프로테인(seminoprotein), TPA, CYFRA, PAP, NSE, C-펩티드, PIVKA, Pro-GRP, HCGβ, 엘라스타아제, β2 마이크로글로불린, S-NTX, 항-p53 항체, 및 HER2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 중간엽 줄기 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 혈청은 자가 혈청(autoserum)인 것인 중간엽 줄기 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 헤파린 유도체는 헤파린을 구성하는 D-글리코사민의 6번 위치에서 탈황화에 의해 수득가능한 글리코사미노글리칸인 것인 중간엽 줄기 세포.
  7. 청구항 1 내지 6에 있어서, 상기 배지는 1 내지 20 부피%의 혈청 함량을 갖는 것인 중간엽 줄기 세포.
  8. 청구항 7에 있어서, CD24 음성인 것인 중간엽 줄기 세포.
  9. 하기 표에 열거된 양성 CD 세포 표면 항원을 발현하고, 음성 세포 표면 항원을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 인간 중간엽 줄기 세포:
    Figure pat00005
  10. 청구항 9에 있어서, 인간 골수액으로부터 유래될 수 있는 것인 중간엽 줄기 세포.
  11. 청구항 6 내지 10 중 어느 한 항에 따른 중간엽 줄기 세포 및 환자로부터 수집된 자가 혈청, 덱스트란, 및 DMSO를 포함하는 동결보존 용액을 포함하는 조성물.
  12. 청구항 6 내지 10 중 어느 한 항에 따른 중간엽 줄기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 복구/재생 방법에서 사용하기 위한 약제학적 제제.
  13. 청구항 12에 있어서, 손상 부위의 복구를 보조하거나 또는 노화에서 기인된 노화 부위의 복구를 보조하기 위한 것으로서, 상기 약제학적 제제는 정맥내로, 요막 천자(lumbar puncture)를 통해, 뇌내로, 뇌실내로, 국소로, 또는 동맥내로 투여되는 것인 약제학적 제제.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 약제학적 제제는 질병 또는 질환의 아급성기 또는 그 이후에 투여되고, 상기 질병 또는 질환은 신장 손상, 간 손상, 췌장 장애, 양성 전립선 비대증, 고지혈증, 고등 뇌 기능장애(higher brain dysfunction), 소생-후 뇌병증(post-resuscitation encephalopathy), 심장병, 및 척수 손상으로부터 선택되는 것인 약제학적 제제
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 약제학적 제제는 사이토카인 분비에 의한 손상 부위의 복구, 혈관형성에 의한 손상 부위의 복구, 및 신경 재생에 의한 손상 부위의 복구로부터 선택된 하나 이상을 보조하는 것인 약제학적 제제.
  16. 환자로부터 수집된 자가 혈청, 덱스트란 및 DMSO를 포함하는 단리된 인간 중간엽 줄기 세포를 위한 동결보존 용액.
  17. 청구항 16의 용액에 세포를 현탁시키고, 상기 세포를 동결 온도에서 보관하는 것을 특징으로 하는, 인간 중간엽 줄기 세포를 동결보존하는 방법.
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