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KR20120098403A - 혈액 성분의 분리 시스템, 분리재 - Google Patents

혈액 성분의 분리 시스템, 분리재 Download PDF

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KR20120098403A
KR20120098403A KR1020117030454A KR20117030454A KR20120098403A KR 20120098403 A KR20120098403 A KR 20120098403A KR 1020117030454 A KR1020117030454 A KR 1020117030454A KR 20117030454 A KR20117030454 A KR 20117030454A KR 20120098403 A KR20120098403 A KR 20120098403A
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아키라 고바야시
마사루 나카타니
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가부시키가이샤 가네카
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Abstract

본 발명은, 각 혈구 성분을 함유하는 체액으로부터, 원심 조작을 필요로 하지 않고, 신속하고 간편하게 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획으로 분리하는 시스템 및 분리재에 관한 것이다. 혈구 분리재에 체액을 접촉시켜, 백혈구와 혈소판을 포착시켜 적혈구 풍부 분획을 얻는 공정, 분리 용액을 사용하여 혈구 분리재로 포착된 백혈구 분획을 회수하는 공정을 실시함으로써, 체액으로부터 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획으로 분리할 수 있다.

Description

혈액 성분의 분리 시스템, 분리재{BLOOD COMPONENT SEPARATION SYSTEM AND SEPARATION MATERIAL}
본 발명은, 각 혈구 성분을 함유하는 체액으로부터, 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 및/또는 혈소판 풍부 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다. 또한, 백혈구 중에서도 특히 조혈 간세포(幹細胞)를 포함하는 단핵구 풍부 분획을 선택적으로 회수 가능한 분리 재료, 분리 방법에 관한 것이기도 하다.
근래, 혈액학이나 과학 테크놀로지의 급속한 진보에 수반하여, 전혈?골수?제대혈?조직 추출물을 비롯한 체액 중 치료에 따라 필요한 혈액 분획만을 분리하여 환자에 투여하고, 필요없는 분획은 투여하지 않아, 치료 효과를 보다 높여, 부작용을 보다 억제하는 치료 스타일이 널리 보급되고 있다.
예를 들면, 혈액 수혈도 그 하나이다. 적혈구 제제(製劑)는, 출혈 및 적혈구가 부족한 상태, 또는 적혈구의 기능 저하에 의해 산소가 결핍하여 있는 경우에 사용되는 혈액 제제이다. 그 때문에 이상한 면역 반응이나 이식편대숙주병(GVHD) 등의 부작용을 유도하는 백혈구는 불필요하여, 필터로 백혈구를 제거할 필요가 있다. 경우에 따라서는 백혈구에 더하여 혈소판도 제거하는 경우도 있다.
한편, 혈소판 제제는, 혈액 응고 인자의 결핍에 의한 출혈 내지 출혈 경향에 있는 환자에 사용되는 혈액 제제이다. 원심 분리에 의해, 혈소판 이외의 불필요한 세포나 성분은 제거되어, 필요로 되는 혈소판 성분만을 채취하고 있다.
더하여 근래, 백혈병이나 고형암 치료를 위한 조혈 간세포 이식이 빈번하게 행해지게 되어, 치료에 필요한 세포(백혈구, 특히 단핵구)를 분리하여 투여하게 되어 왔다. 이 조혈 간세포의 소스로서, 도너의 부담이 적고, 증식 능력이 뛰어나다는 등의 이점에서, 골수나 말초혈에 더하여 제대혈도 주목을 받고 있다. 또한 근래, 월경혈 중에도 간세포가 풍부하게 존재하는 것이 시사되어, 이제까지 폐기되었던 월경혈도 귀중한 간세포 소스로서 이용될 가능성이 있다.
골수나 말초혈에 관하여, 불필요한 세포를 제거하고 백혈구(특히 단핵구)를 분리?순화하여 투여하는 것이 요망되고 있는 한편, 제대혈에 대해서도 혈연자(血緣者)를 위한 뱅킹이 빈번하게 되어, 사용시까지 동결 보존할 필요성에서, 동결 보존에 의한 적혈구 용혈을 방지하는 것을 목적으로 백혈구는 분리?순화되고 있다.
분리 방법으로서는 피콜(ficoll)을 사용한 비중액에 의한 원심 분리법이나 적혈구 침강제인 히드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch)를 사용한 원심 분리법이 제안되어 있지만, 폐쇄계에서의 처리가 불가능하여 이물이나 균이 혼입하다는 문제를 갖고 있다. 원심 분리법을 사용하지 않는 세포 분리 방법으로서, 최근에는, 적혈구와 혈소판은 포착되지 않고 백혈구만을 포착하는 필터 재료를 사용하여 백혈구를 회수하는 방법(특허문헌 1, 특허문헌 2)도 보고되고 있지만, 이 방법으로는 적혈구와 혈소판을 분리하는 것은 불가능하다.
현재, 적혈구 제제는 분리 필터를 사용하여, 혈소판 제제는 원심 분리로, 백혈구 제제는 비중액이나 적혈구 침강제를 사용한 원심 분리로 하는 바와 같이, 목적으로 하는 성분에 따라 다른 분리 방법이 채용되어 있는 상황이다. 본래, 적혈구, 혈소판, 백혈구는 혈액?골수?제대혈 등 동일한 소스로부터 얻을 수 있기 때문에, 종래의 분리 방법으로는 필요한 세포가 낭비되고 있었다. 따라서, 동일한 소스로부터 적혈구, 백혈구, 혈소판을 분리하기 위한 번잡한 조작을 필요로 하지 않는, 신속하게 실현 가능한 분리 기술이 절실하다.
또한, 백혈구 중에서도 특히 조혈 간세포를 포함하는 단핵구 분획의 순도를 보다 향상시키는 것이 요망되고 있지만, 현재의 기술에 있어서는 과립구의 혼입률이 여전히 높아 지금 이상의 과립구 혼입률의 저감이 요구되고 있다(비특허문헌 1).
또한, 필터에 포착된 백혈구나 단핵구를 회수하는 용액으로서 덱스트란을 함유하는 고점도의 용액을 사용하면 백혈구나 단핵구 회수율이 향상하는 것이 알려져 있지만(특허문헌 2), 한편, 이 방법에서 사용되는 덱스트란 용액은 점도가 높기 때문에 시린지로 압출할 때의 수기(手技)가 곤란하다는 문제를 갖고 있어, 시린지에 의한 회수가 용이하고 또한, 고수율로 백혈구나 단핵구를 회수할 수 있는 분리 용액도 요망되고 있다.
일본 특표2001-518792 국제공개 번호 WO98/32840
TRANSFUSION, Vol.45, p1899-1908, 2005
본 발명의 목적은, 각 혈구 성분을 함유하는 체액으로부터 원심 조작을 필요로 하지 않고, 신속하고 간편하게 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획으로 분리하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 백혈구 중에서도 특히 과립구의 혼입률이 낮은 단핵구 풍부 분획을 얻을 수 있는 분리 재료와 분리 방법도 제공한다.
본 발명자들은, 종래에는 용이하게 실현하는 것이 곤란하였던, 원심 조작을 필요로 하지 않는 체액으로부터의 각 혈구 성분의 분리 방법에 관하여 예의 검토를 행한 결과, 어떤 종의 혈구 분리재를 사용함으로써, 우선 백혈구와 혈소판을 분리재로 포착시켜 적혈구 풍부 분획을 얻고, 이어서 분리 용액을 사용하여 혈구 분리재로 포착된 백혈구를 회수하여 백혈구 풍부 분획을 얻음으로써, 체액으로부터 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획으로 분리할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 백혈구와 혈소판이 포착 가능하고 또한 백혈구 풍부 분획을 분리 회수할 수 있는 혈구 분리재를 사용하여, 각 혈구 성분을 함유한 체액을 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획으로 분리 가능한 방법이며, 종래의 백혈구 제거 필터나 상기 특허문헌 1, 2에 기재되어 있는 바와 같은 혈소판이 실질적으로 통과하는 재료를 사용한 백혈구 포착 회수법과는 전혀 다른 방법이다.
또한, 본 발명자들은, 혈구 분리재로서 특정의 밀도 및 섬유경(纖維徑)을 갖는 부직포를 사용함으로써, 백혈구 중에서도 특히 단핵구를 많이 함유하는 단핵구 풍부 분획을 효율좋게 분리할 수 있는 것을 알아냈다.
즉, 본 발명은, 체액을 각 혈구 성분으로 분리하는 방법으로서,
(a) 체액을 혈구 분리재와 접촉시킴으로써 백혈구와 혈소판을 혈구 분리재로 포착하여,
적혈구 풍부 분획을 얻는 공정과,
(b) 분리 용액을 사용하여 혈구 분리재로부터 백혈구 풍부 분획을 분리하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 방법에 관한 것이다.
혈구 분리재가 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 충전되어, 체액을 당해 입구로부터 통액(通液)함으로써 혈구 분리재와 접촉시키는 것이 바람직하다.
(a) 공정에 있어서, 체액을 혈구 분리재와 접촉시킨 후에, 혈구 분리재에 잔존하는 적혈구를 세정액으로 세정하는 것이 바람직하다.
(b) 공정에 있어서, 체액의 출구측으로부터 분리 용액을 주입하여 백혈구를 분리 회수하는 것이 바람직하다.
분리 용액이 생리 식염수, 완충액, 덱스트란, 배지, 또는 수액을 함유하는 것이 바람직하다.
체액이 혈액, 골수, 제대혈, 월경혈, 또는 조직 추출물인 것이 바람직하다.
(a) 공정의 체액을 혈구 분리재와 접촉시키기 전에, 미리 용액을 혈구 분리재와 접촉시키는 것이 바람직하다.
미리 혈구 분리재와 접촉시키는 용액이 생리 식염수, 또는 완충액을 함유하는 것이 바람직하다.
혈액 분리재가 부직포로 이루어지는 것이 바람직하고, 부직포가 분할 섬유로 구성되는 것이 바람직하다.
부직포가 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 나일론 섬유, 또는 아크릴 섬유로 구성되는 것이 바람직하다. 또한, 폴리에스테르 섬유가 폴리에틸렌테레프탈레이트 섬유, 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트 섬유인 것이 바람직하다. 또한, 부직포가 나일론 섬유, 폴리프로필렌 섬유 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트 섬유인 것이 바람직하다.
부직포의 밀도 K가 2.0×104 이상 1.9×105 이하, 섬유경이 1㎛ 이상 15㎛ 이하이며, 백혈구 풍부 분획이 단핵구 풍부 분획인 것이 바람직하다.
분리 용액으로서, 점도가 1mPa?s 이상 5mPa?s 미만의 용액을 사용하는 것이 바람직하다.
백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의 혈소판 회수율이 백혈구 회수율 이하인 것이 바람직하고, 백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의 혈소판 회수율이 단핵구 회수율 이하인 것이 바람직하다.
백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의, 단핵구 회수율의 과립구 회수율에 대한 비가 1.0보다 큰 것이 바람직하다.
백혈구 풍부 분획 또는 단핵구 풍부 분획이 조혈 간세포, 간엽계 간세포, 또는 CD34 양성 세포를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 상기 방법에 의해 분리된 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 또는 혈소판 풍부 분획에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 밀도 K가 2.0×104 이상 1.9×105 이하, 섬유경이 1㎛ 이상 15㎛ 이하인, 체액으로부터 단핵구 풍부 분획을 분리 가능한 부직포로 이루어지는 혈구 분리재에 관한 것이다.
혈구 분리재는, 나일론 섬유, 폴리프로필렌 섬유 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트 섬유로 구성되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은, 상기 혈구 분리재가 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 적층 상태로 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 혈구 분리 디바이스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 상기 혈구 분리재가 적층 상태로 충전된 용기, 용기의 입구측의 상류에 설치된 유로 개폐 수단, 유로 개폐 수단에 연결된 백혈구 풍부 분획 회수 수단, 및 용기의 출구측의 하류에 설치된 분리 용액의 도입 수단을 갖는 혈구 분리 디바이스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 혈구 분리재 또는 부직포에 포착된 백혈구를 회수하기 위한 용액의 점도가 1mPa?s 이상 5mPa?s 미만인 분리 용액에 관한 것이다. 분리 용액은 덱스트란을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의하면, 전혈?골수?제대혈?월경혈?조직 추출물을 비롯한 체액으로부터 간편하고 신속하게 체액을 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획으로 분리하는 것이 가능하게 된다. 종래의 방법에서는, 체액에 함유되는 적혈구, 혈소판, 백혈구의 모두를 분리 회수할 수 없어, 어느 것은 회수 불능으로 되어 있었지만, 본 발명의 방법에서는 모두를 분리하여 회수할 수 있다. 또한 혈구 분리재로서 상기 본 발명의 부직포를 사용함으로써 단핵구 풍부 분획을 얻을 수 있다.
본 발명의 방법으로 회수된 적혈구 풍부 분획은 다른 혈구 혼입률이 극히 낮아 그대로 수혈에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법으로 얻어지는 백혈구 풍부 분획, 단핵구 풍부 분획은 적혈구의 혼입률이 극히 낮으므로, 사용시까지 동결 보존해도 적혈구의 용혈 등에 의한 악영향은 매우 적다. 또한, 본 발명의 분리재를 용기에 충전한 필터는 무균적인 폐쇄계에서 사용하는 것이 가능하므로, 무균적으로 회수한 분획을 그대로 증폭하여 세포를 제조할 수도 있다.
본 발명의 혈구 분리재는, 백혈병 치료, 심근 재생이나 혈관 재생 등의 재생 의료를 위한 치료 세포 제조용 필터로서 제공하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 혈구 분리재를 사용하여 얻어지는 백혈구 풍부 분획, 단핵구 풍부 분획은 조혈 간세포 풍부한 분획이므로, 수혈용 제제의 제조와 함께, 재생 의료용의 세포 소스를 제조하기 위한 필터로서도 매우 유용하며, 부작용이 적고 안전성이 높은 치료용 세포의 제조가 가능하게 된다.
[도 1] 밀도 K와 단핵구 회수율의 관계를 나타낸 도면.
[도 2] 섬유경과 단핵구 회수율의 관계를 나타낸 도면.
[도 3] 본 발명의 혈구 분리재를 사용한 혈구 성분 분리 시스템의 일례를 나타낸 도면.
이하에 본 발명에 대해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 설명에 한정되는 것은 아니다.
1. 체액을 각 혈구 성분으로 분리하는 방법
본 발명의, 체액을 각 혈구 성분으로 분리하는 방법은,
(a) 체액을 혈구 분리재와 접촉시킴으로써 백혈구와 혈소판을 혈구 분리재로 포착하여, 적혈구 풍부 분획을 얻는 공정과,
(b) 분리 용액을 사용하여 혈구 분리재로부터 백혈구 풍부 분획을 분리하는 공정
을 포함한다.
본 발명의 방법에서는, 혈구 분리재는 용기에 넣지 않고 사용해도 되고, 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 혈구 분리재를 넣어 사용해도 된다. 그러나, 실용성을 고려하면 용기에 넣어 사용하는 후자쪽이 바람직하다. 또한 혈구 분리재는 적당한 크기로 절단한 평판상으로 체액을 처리해도 되고, 또한 롤상으로 감은 형상으로 처리해도 된다. 혈구 분리재를 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 충전하는 경우, 체액을 입구로부터 통액함으로써 혈구 분리재와 접촉시킨다.
(a) 체액 송액 공정
이 공정에서는, 혈구 분리재가 충전된 용기에 체액을 입구측으로부터 주입하여, 백혈구와 혈소판을 포착시켜 적혈구 풍부 분획을 얻는다.
체액이란, 전혈, 골수, 제대혈, 월경혈, 조직 추출물을 의미하며, 그들을 조(粗)분리한 것이어도 상관없다. 또한 동물종에 관해서도 제한은 없고, 사람, 소, 마우스, 래트(rat), 돼지, 원숭이, 개, 고양이 등 포유동물이면 무엇이어도 상관없다. 이들 동물의 혈액 외에, 제대혈, 골수, 조직으로부터 채취할 수도 있다. 또한 체액의 항응고제의 종류도 불문하며, ACD(acid-citrate-dextrose)액, CPD(citrate-phosphate-dextrose)액, CPDA(citrate-phosphate-dextrose-adenine)액 등의 시트르산 항응고이어도 헤파린, 저분자 헤파린, 후탄(Futhan)(메실산나파모스타트(nafamostat mesilate)), EDTA로 항응고하여 있어도 된다. 각 분획을 사용하는 목적에 따라 영향이 없으면 체액의 보존 조건도 일절 불문한다.
혈구 분리재를 충전한 용기의 체액 입구측으로부터 체액을 통액할 때에는, 체액을 넣은 용기로부터 송액 회로를 통하여 자연 낙하로 송액해도, 펌프에 의해 송액해도 된다. 또한, 체액을 넣은 시린지를 직접, 당해 용기에 접속하고, 손으로 시린지를 눌러도 된다. 펌프에 의해 통액하는 경우에는, 송액 속도가 너무 빠르면 분리 효율이 떨어지고, 너무 느리면 처리 시간이 너무 걸리므로, 0.1mL/min?100mL/min을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한 체액 송액 공정의 전처리로서, 생리 식염수나 완충액으로 분리재를 침지시키는 공정을 실시해도 된다. 이 조작은 반드시 필요하지 않지만, 분리재의 상기 용액에의 침지가 분리 효율의 향상과 혈액 유로 확보에 영향을 준다고 생각되기 때문에, 경우에 따라서는 실시해도 된다. 이 전처리 용액은 이하의 세정 공정에 사용하는 용액과 동일할 필요도 없지만, 동일하면 용액 백를 공유할 수 있기 때문에, 회로 시스템의 단순화와 조작성의 관점에서 동일해도 된다. 전처리의 액량으로서는, 혈구 분리재가 충전되는 용기의 1배?100배 정도가 실용적이며 바람직하다.
백혈구와 혈소판을 혈구 분리재로 포착한 후, 혈구 분리재를 세정한다. 이 때, 세정액을 같은 방향으로부터 통액함으로써 용기 내에 머문 적혈구를 효율적으로 회수?분리한다. 세정액은 주로 적혈구만을 회수할 수 있기 때문에, 체액을 주입했을 때에 통과한 액과 혼합하여 적혈구 풍부 분획으로 해도 된다.
세정액의 유입측으로부터 체액 송액 공정과 같은 방향으로부터 세정액을 통액할 때에는, 세정액은 회로를 통하여, 자연 낙하로 송액해도, 펌프에 의해 송액해도 된다. 펌프에 의해 송액하는 경우의 유속은, 체액 송액 공정과 동 정도이며, 0.1mL/min?100mL/min을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 세정량은 용기의 용량에 따라 다르지만, 세정량이 너무 적으면 용기에 잔존하는 적혈구 성분이 많아지고, 세정량이 너무 많으면 분리 효율이 떨어짐과 함께 다대한 시간을 요하므로, 용기의 0.5배?100배 정도의 용량으로 세정하는 것이 바람직하다.
사용할 수 있는 세정액으로서는, 적혈구만을 씻겨 흘려보내는 것이 가능하며 백혈구 풍부 분획 중의 타 혈구의 혼입을 억제할 수 있고, 혈구의 포착 상태를 유지할 수 있으면, 어떠한 용액을 사용해도 상관없지만, 생리 식염수, 링겔액, 세포 배양에 사용하는 배지, 인산 완충액 등의 일반적인 완충액이 바람직하다.
(b) 백혈구 풍부 분획의 분리 공정
혈구 분리재를 충전한 용기에 체액의 통액과는 역방향(체액 출구측)으로부터 분리 용액을 주입하여, 백혈구 풍부 분획을 얻는다. 체액의 통액과는 역방향으로 분리 용액을 주입하는 이유는, 출구측으로부터 도입하는 쪽이, 백혈구 풍부 분획 중의 백혈구 회수율이 높아지기 때문이다. 분리 용액을 주입할 때에는, 분리 용액을 미리 시린지 등에 넣어 두고, 시린지의 플런저를 손이나 기기를 사용하여 세게 압출함으로써 실행할 수 있다. 회수액량이나 유속은, 용기의 용량이나 처리량에 따라 다르지만, 용기의 1배?100배 정도의 용량으로, 유속 0.5mL/sec?20mL/sec가 바람직하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
분리 용액은 저장액이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 생리적 식염수나 링겔액 등의 주사용제로서 사용 실적이 있는 것이나, 완충액, 세포 배양용 배지, 수액 등을 들 수 있다.
또한 포착된 세포의 회수율을 올리기 위해서 회수액의 점장도(粘張度)를 올려도 된다. 그 때문에 상기 분리 용액에 알부민, 피브리노겐, 글로불린, 덱스트란, 히드록시에틸 스타치, 히드록시에틸셀룰로오스, 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴 등을 첨가할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 단, 덱스트란 등을 고농도(약 10% 이상)로 함유하는 회수액의 점도는 5mPa?s 이상이며, 시린지를 사용하여 손으로 눌러 회수하는 것이 어려운 경우가 많기 때문에, 덱스트란을 함유하지 않는 분리 용액, 혹은, 점도가 1mPa?s 이상 5mPa?s 미만이 되도록 덱스트란 농도를 조정한 분리 용액을 사용하는 것이 바람직하다.
2. 혈구 성분
적혈구 풍부 분획이란 통과 분획 중의 적혈구 회수율이 타 혈구(백혈구 또는 혈소판)의 회수율보다도 높은 것이며, 적혈구 풍부 분획의 적혈구 회수율은 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상이다. 여기서 말하는 적혈구 회수율이란, 적혈구 풍부 분획 중의 총 적혈구수를 처리 전의 총 적혈구수로 나눈 비율로부터 구해진다.
적혈구 풍부 분획 중의 백혈구 함량에 대해, 적혈구 분획 중의 총 백혈구수를 처리 전의 총 백혈구수로 나눈 비율로부터 산출되는 회수율은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하이다. 적혈구 풍부 분획 중의 혈소판 함량에 대해, 적혈구 분획 중의 총 혈소판수를 처리 전의 총 혈소판수로 나눈 비율로부터 산출되는 회수율은 60% 미만, 바람직하게는 40% 이하, 보다 바람직하게는 20% 이하이다.
본 발명에서의 방법 및 혈구 분리재를 사용하여 분리 회수한 백혈구 풍부 분획이란, 회수한 분리 용액 중의 백혈구 회수율, 단핵구 회수율, 과립구 회수율 중 어느 것이 타 혈구(적혈구 또는 혈소판)의 회수율의 1/2배 이상인 것을 의미한다. 림프구의 회수율이 타 혈구(적혈구 또는 혈소판)의 회수율의 1/2 이상이어도 해당한다. 백혈구 회수율은 45% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상이다. 여기서 말하는 백혈구 회수율이란, 백혈구 풍부 분획 중의 총 백혈구수를 처리 전의 총 백혈구수로 나눈 비율로부터 구해진다. 단핵구 회수율, 과립구 회수율에 관해서도 같은 총수로부터 계산할 수 있는데, 단핵구수?과립구수는 플로우 사이토미터 등에 의해 구한 양성률과 백혈구수를 곱함으로써 산출된다.
백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의 혈소판 회수율은, 백혈구 회수율 이하인 것이 바람직하다. 또한, 백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의 혈소판 회수율은, 단핵구 회수율 이하인 것이 바람직하다. 백혈구 풍부 분획 또는 단핵구 풍부 분획은, 조혈 간세포, 간엽계 간세포, CD34 양성 세포를 포함하는 것이 바람직하다.
백혈구 풍부 분획 중의 적혈구 함량에 대해, 백혈구 풍부 분획 중의 총 적혈구수를 처리 전의 총 적혈구수로 나눈 비율로부터 산출되는 적혈구 회수율은 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하이다. 백혈구 분획 중의 혈소판 함량에 대해, 백혈구 풍부 분획 중의 총 혈소판수를 처리 전의 총 혈소판수로 나눈 비율로부터 산출되는 혈소판 회수율은 50% 이하, 바람직하게는 25% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 더욱 바람직하게는 5% 이하이다.
혈소판 풍부 분획이란, 분리 용액에 의한 백혈구 풍부 분획 취득 후에 분리재로 포착되어 있는 세포 분획이며, 분리재로 포착되어 있는 혈소판 회수율이 타 혈구(적혈구 또는 백혈구)의 회수율보다 높은 것을 의미한다.
본 발명에 기재한, 밀도 K가 2.0×104 이상 1.9×105 이하, 섬유경이 1㎛ 이상 15㎛ 이하인 부직포를 이용하면, 분리 용액에 의해 분리 회수한 분획 중의 백혈구 조성을 제어하는 것도 가능하다. 예를 들면, 단핵구(림프구+단구)와 과립구와의 분리에 이용할 수도 있어, 단핵구 풍부한 조성(단핵구 풍부 분획)이 얻어진다. 본 발명에 의한 단핵구 풍부 분획이란 분리 용액에 의해 분리 회수한 분획 중의 단핵구의 회수율이, 당해 분획 중의 과립구나 타 혈구 성분(적혈구 또는 혈소판)의 회수율보다도 높은 것을 가리키며, 구체적으로는 단핵구 회수율/과립구 회수율의 값이 1.0보다 크고, 바람직하게는 1.2배 이상, 보다 바람직하게는 1.5배 이상이다.
3. 혈구 분리재
혈구 분리재에 사용되는 재료는 특히 한정되지 않지만, 멸균 내성이나 세포에의 안전성의 관점에서는, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌, 고밀도 폴리에틸렌, 저밀도 폴리에틸렌, 폴리비닐알코올, 염화비닐리덴, 레이온, 비닐론, 폴리프로필렌, 아크릴(폴리메틸메타크릴레이트, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아크릴니트릴, 폴리아크릴산, 폴리아크릴레이트), 나일론, 폴리이미드, 아라미드(방향족 폴리아미드), 폴리아미드, 큐프로(cupro), 카본, 페놀, 폴리에스테르, 펄프, 마, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리카보네이트 등의 합성 고분자, 아가로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 키토산, 키틴 등의 천연 고분자, 유리 등의 무기 재료나 금속 등을 들 수 있다. 이 중, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리프로필렌, 아크릴, 나일론, 폴리우레탄, 유리인 것이 바람직하다. 이들의 재료는 1종류의 단독으로는 한정하지 않고, 필요에 따라 재료를 복합? 혼합?융합하여 사용해도 된다. 또한 필요하면, 단백질, 펩티드, 아미노산, 당류 등 특정의 세포에 친화성이 있는 분자를 고정해도 상관없다.
혈구 분리재의 형상으로서는 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 입자상, 부직포, 직포, 스폰지상, 다공체, 메시상 등을 들 수 있다. 이 중에서도, 섬유상인 것이 바람직하고, 용이하게 제작할 수 있고 입수할 수 있으므로 부직포가 보다 바람직하다.
혈구 분리재의 형상이 부직포인 경우, 부직포는 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 나일론 섬유, 아크릴 섬유의 적어도 하나로 이루어지는 것이 바람직하다. 폴리에스테르로서는, 적혈구나 백혈구의 분리 효율이 높아지기 때문에, 폴리에틸렌테레프탈레이트 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트가 바람직하다. 또한, 부직포는, 적혈구나 백혈구의 분리 효율이 높아지기 때문에, 나일론, 폴리프로필렌 및/또는 폴리부틸렌테레프탈레이트로 이루어지는 것이 보다 바람직하다.
부직포의 제조 방법으로서는, 크게 나누어 습식과 건식, 또한, 레진 본드, 써멀 본드, 스판 레이스, 니들 펀치, 스티치(stitch) 본드, 스판 본드, 멜트블로우 등을 들 수 있지만, 이들의 제법에 한정되는 것은 아니다. 단, 섬유경이 가는 경우에 혈구 분리 효율이 좋으므로 멜트블로우나 스판 레이스가 보다 바람직하다. 캘린더 가공이나 플라스마 처리하여 있는 재료이어도 된다.
부직포 섬유로서는, 복합단사를 복수로 분할한 이른바 분할 섬유도, 섬유가 복잡하게 얽혀 혈구 분리 효율이 좋으므로 적합하다.
분리재의 밀도 K, 즉, 평량(g/m2)/두께(m)는, 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획의 분리 효율로부터 1.0×104 이상 5.0×105 이하인 것이 바람직하다. 백혈구 중에서도, 특히 단핵구를 많이 함유하는 단핵구 풍부 분획을 회수할 때에는, 2.0×104 이상 1.9×105 이하인 것이 필요하다. 단핵구 회수율의 관점에서는, 4.0×104 이상 1.9×105 이하가 보다 바람직하고, 과립구의 혼입률을 낮게 억제하는 관점에서는, 5.0×104 이상 1.9×105 이하가 더욱 바람직하다.
밀도 K는, 평량(g/m2)/두께(m)를 나타내지만, 이것은 중량(g)/단위체적(m3)으로 나타낼 수도 있다. 그래서, 밀도 K는 분리재의 형태에 관계없이, 단위체적(m3)당의 중량(g)을 측정함으로써 구할 수도 있다. 측정시에는, 압력을 가하지 않도록 변형하지 않는 상태로 측정한다. 예를 들면, CCD 레이저 방위 센서((주)키엔스제, LK-035) 등을 사용함으로써 비접촉 상태에서의 두께가 측정 가능하다. 물론, 사용하는 재료의 카타로그 등에 평량이나 두께가 기재되어 있는 경우에는, 그 데이터에서 평량(g/m2)/두께(m)로부터 밀도 K를 구해도 상관없다.
분리재의 섬유경은, 1㎛ 이상 15㎛ 이하인 것이 필요하다. 1㎛보다 가늘면 눈막힘이 일어나기 쉬워지고, 15㎛보다 굵으면 백혈구 및/또는 혈소판이 분리재에 포착되지 않고, 적혈구 풍부 분획에의 백혈구 및/또는 혈소판에 혼입률이 높아지고, 또한, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획의 분리 효율이 현격하게 저하한다. 분리 효율 향상의 관점에서, 바람직하게는 1㎛ 이상 10㎛ 이하, 보다 바람직하게는 1㎛ 이상 7㎛ 이하, 특히 바람직하게는 1㎛ 이상 5㎛ 이하이다.
섬유경이란 섬유축에 대해 직각 방향의 섬유의 폭이며, 섬유경의 측정은, 부직포로 이루어지는 분리재를 주사형 전자 현미경으로 사진 촬영하여, 사진에 기재된 스케일로부터 구한 섬유경의 계산값을 평균함으로써 구할 수 있다. 즉, 본 발명에 기재된 섬유경이란, 상기와 같이 측정한 섬유경의 평균값을 의미하고 있고, 50개 이상, 바람직하게는 100개 이상의 평균값이다. 단, 섬유가 다수로 겹쳐진 경우, 타 섬유가 방해를 하여 그 폭을 측정할 수 없는 경우, 현저하게 직경이 다른 섬유가 혼재하여 있는 경우 등은, 그 데이터는 빼고 섬유경을 산출한다.
또한, 굵기가 크게 다른, 예를 들면 7㎛ 이상 섬유경이 다른 복수의 섬유로 구성되는 부직포의 경우에는, 섬유경이 가는 쪽이 분리 효율에의 영향이 크기 때문에, 따로따로 섬유경을 계산하여, 가는 섬유경을 그 부직포의 섬유경으로 한다. 2종의 섬유경이 달라도, 예를 들면 7㎛ 이하이면 같은 것으로서 취급하여 섬유경을 계산한다.
또, 본 발명의 분리 방법에 있어서는, 상술한 본 발명의 분리재를 2종 이상 병용해도 되고, 상기 본 발명의 분리재와 본 발명 이외의 분리재를 병용해도 된다. 즉, 상술한 재료, 밀도 K 및 섬유경을 갖는 분리재를 적어도 1종 사용하고 있는 한, 예를 들면 섬유경이 15?30㎛인 분리재를 동시에 사용하는 경우이어도, 본 발명의 분리 방법의 범주에 포함된다.
4. 혈구 분리 디바이스
본 발명의 혈구 분리 디바이스는, 혈구 분리재를, 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 충전하여 얻어진다.
혈구 분리 디바이스는, 세정 용액이나 분리 용액의 입구나 출구, 적혈구 풍부 분획 회수 수단, 백혈구 풍부 분획 회수 수단(또는 단핵구 풍부 분획 회수 수단) 등을 동시에 구비되어 있는 것이 실용적이며 바람직하다. 회수 수단은 백이어도 된다. 또한, 혈구 분리 디바이스는, 혈구 분리재가 적층 상태로 충전된 용기, 용기의 입구측의 상류에 설치된 유로 개폐 수단, 유로 개폐 수단에 연결된 백혈구 풍부 분획 회수 수단, 및 용기의 출구측의 하류에 설치된 분리 용액의 도입 수단을 갖는 것임이 바람직하다.
혈구 분리 디바이스는, 구체적으로는, 체액이 유입하는 입구와 유출하는 출구를 갖고 있고, 또한 체액의 입구 혹은 체액의 입구와는 독립하여, 용기 내에 머문 적혈구를 흘려보내는 세정 용액의 유입부를 갖고, 또한 체액의 출구 혹은 체액의 출구와는 독립하여 세정액의 유출부를 갖고, 또한 상기 체액 및 세정액의 유출부 혹은 유출부 이외에 독립하여 분리 용액을 도입하기 위한 입구도 구비되어 있는 것이 바람직하다. 용기에 부속하는 세정액의 입구 출구는 체액의 입구 출구를 공유하고 있어도 되고, 입구측의 회로를 삼방활전(三方活栓, three-way stopcock) 등의 유로 개폐 수단을 개재하여 혈액 백과 세정 용액 백를 접속한 상태이어도 상관없다. 분리 용액의 도입구는 체액의 출구, 분리 용액의 회수구는 체액의 입구와 공유하고 있어도 되고, 마찬가지로 회로를 삼방활전을 개재하여 각 백이나 시린지 등에 접속해도 된다. 도 3에 본 발명의 혈구 분리재를 사용한 혈구 성분 분리 시스템의 일례를 나타낸다.
또한 상기 용기에 체액의 보존 백, 백혈구 풍부 분획을 회수하기 위한 분리 용액 회수 백, 적혈구 풍부 분획 회수 백 등도 구비되어 있는 것이 바람직하다. 이들의 백이 상기 기재의 각 용액의 입구 출구에 접속됨으로써, 무균적인 폐쇄계에서 체액을 분리하는 것이 가능하게 된다. 또한 각 백은 사용 후에 절리(切離)하여 사용할 수 있는 것이 바람직하고, 일반적으로 사용되고 있는 혈액 백과 같은 형상을 하고 있어도 되지만, 평판상의 카트리지 방식 등이어도 된다. 백혈구 풍부 분획, 단핵구 풍부 분획의 회수 백은 목적에 따라 세포 배양 가능한 백, 동결 보존 내성을 갖는 백 등을 선택해도 된다.
혈구 분리재를 용기에 충전할 때에는, 압축하여 용기에 충전해도 되고, 압축하지 않고 용기 충전해도 된다. 혈구 분리재의 재질 등에 따라 적절히 선정하면 좋다. 혈구 분리재의 바람직한 사용예로서는, 부직포로 이루어지는 혈구 분리재를 적당한 크기로 절단하여, 두께 1mm?200mm 정도로, 단층 또는 적층 상태로 사용하는 것이 바람직하다. 각 분획의 분리 효율의 면에서 1.5mm?150mm가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2mm?100mm이다. 또한 용기에 충전했을 때의 두께는 1mm?50mm 정도로, 단층 또는 적층 상태로 사용하는 것이 바람직하다. 각 분획의 분리 효율의 면에서 1.5mm?40mm가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2mm?35mm이다.
또한 혈구 분리재를 롤상으로 감아, 용기에 충전해도 된다. 롤상으로 사용하는 경우, 당해 롤의 내측으로부터 외측을 향해 체액을 처리함으로써 혈구를 분리해도 되고, 혹은 그 역으로 당해 롤의 외측으로부터 내측을 향해 체액을 처리해도 된다.
혈구 분리재를 충전하는 용기의 형태, 크기, 재질은 특히 한정은 없다. 용기의 형태는, 구, 컨테이너, 카세트, 백, 튜브, 칼럼 등, 임의의 형태이어도 된다. 바람직한 구체예로서는, 예를 들면, 용기 약 0.1mL?400mL 정도, 직경 약 0.1cm?15cm 정도의 반투명의 통상 용기; 한쪽의 길이 0.1cm?20cm 정도의 장방형 또는 정방형이고, 두께가 0.1cm?5cm 정도의 사각기둥 용기 등을 들 수 있지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
용기는 임의의 구조 재료를 사용하여 제작할 수 있다. 구조 재료로서는 구체적으로는, 비반응성 폴리머, 생물 친화성 금속, 합금, 유리 등을 들 수 있다. 비반응성 폴리머로서는, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌 터폴리머 등의 아크릴로니트릴 폴리머; 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리클로로트리플루오로에틸렌, 테트라플루오로에틸렌과 헥사플루오로프로필렌의 코폴리머, 폴리염화비닐 등의 할로겐화 폴리머; 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리설폰, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리비닐클로리드아크릴 코폴리머, 폴리카보네이트아크릴로니트릴부타디엔스티렌, 폴리스티렌, 폴리메틸펜텐 등을 들 수 있다. 용기의 재료로서 유용한 금속 재료(생물 친화성 금속, 합금)에 대해, 스테인리스강, 티탄, 백금, 탄탈, 금, 및 그들의 합금, 및 금 도금 합금철, 백금 도금 합금철, 코발트크로뮴 합금, 질화티탄 피복 스테인리스강 등을 들 수 있다.
특히 바람직하게는 멸균 내성을 갖는 소재이지만, 구체적으로는 폴리프로필렌, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리이미드, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리메틸펜텐 등을 들 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예에 있어서 본 발명에 관하여 상세하게 기술하지만, 본 발명은 이하의 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
(실시예1)
두께 6mm 직경 18mm의 용기에, 폴리프로필렌제 부직포(섬유경 3.5㎛, 밀도 K 8.3×104g/m3) 28매를 적층 상태로 충전하고, 우선 생리 식염수 45mL를 입구측으로부터 시린지를 사용하여 손으로 눌러 통액했다. 다음으로 시트르산 항응고의 신선 소 혈액 10mL를 2.5mL/min으로 통액하고, 다음으로 같은 방향으로부터 생리 식염수 10mL를 통액했다. 그 후, 통액과는 역방향으로부터 10% FBS 첨가 MEM 배지 30mL를 시린지를 사용하여 손으로 눌러 회수했다. 처리 전 혈액의 혈산(血算), 적혈구 풍부 분획의 혈산, 백혈구 풍부 분획 중의 혈산을 혈구 카운터(시스멕스(주)제, K-4500)에 의해 측정하여, 각 분획 중의 각 혈구 회수율을 산출했다. 또한, 처리 전의 혈액, 회수한 분리 용액을 FACS Lysing Solution으로 용혈 후, 플로우 사이토미터(니혼 벡톤 디킨슨(주)제, FACSCanto)에 의해 단핵구 양성률(單核球 陽性率), 과립구 양성률(顆粒球 陽性率)을 구하고, 백혈구수와 각 양성률을 곱하여 총 단핵구수 및 총 과립구수를 산출했다. 회수한 분리 용액 중의 총 단핵구수 및 총 과립구수를 처리 전의 총 단핵구수 및 총 과립구수로 나눈 비율을 각각 단핵구 회수율 및 과립구 회수율로 했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예2)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(섬유경 2.5㎛, 밀도 K 1.0×105g/m3)를 28매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예3)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(섬유경 3.8㎛, 밀도 K 1.2×105g/m3)를 28매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예4)
폴리에틸렌테레프탈레이트제 부직포(섬유경 4.1㎛, 밀도 K 1.9×105g/m3)를 44매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예5)
아크릴제 부직포(섬유경 4.7㎛, 밀도 K 1.4×105g/m3)를 44매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예6)
폴리에틸렌테레프탈레이트와 폴리프로필렌의 분할 섬유로 이루어지는 부직포(섬유경 10㎛, 밀도 K 1.6×105g/m3)를 22매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예7)
폴리에틸렌테레프탈레이트와 나일론의 분할 섬유로 이루어지는 부직포(섬유경 10㎛, 밀도 K 1.4×105g/m3)를 22매 적층 상태로 충전한 것, 시트르산 항응고 대신에 ACD 항응고의 신선 소 혈액 10mL를 사용하는 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예8)
나일론제 부직포(섬유경 5.0㎛, 밀도 K 1.3×105g/m3)를 33매 적층 상태로 충전한 것, 시트르산 항응고의 신선 소 혈액 10mL 대신에 CPD 항응고 신선 사람 혈액 10mL를 사용하는 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예9)
폴리프로필렌제 부직포(섬유경 2.4㎛, 밀도 K 5.6×104g/m3)를 30매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예10)
폴리프로필렌제 부직포(섬유경 3.5㎛, 밀도 K 8.3×104g/m3)를 28매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예11)
폴리프로필렌제 부직포(섬유경 5.7㎛, 밀도 K 1.2×105g/m3)를 28매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예12)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(섬유경 1.8㎛, 밀도 K 9.1×104g/m3)를 84매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예13)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(섬유경 2.5㎛, 밀도 K 1.0×105g/m3)를 28매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예14)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(섬유경 3.8㎛, 밀도 K 1.2×105g/m3)를 28매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예15)
폴리부틸렌테레프탈레이트제 부직포(섬유경 5.3㎛, 밀도 K 1.1×105g/m3)를 28매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예16)
CPD 항응고 신선 사람 혈액 10mL 대신에 CPD 항응고 돼지 제대혈을 사용한 것 이외는 실시예13과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예17)
10% FBS 첨가 MEM 배지 대신에 10% 덱스트란 당주(糖注)를 사용하는 것 이외는 실시예13과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예18)
ACD 항응고 사람 혈액 대신에 시트르산 항응고 소 혈액을 사용하고, 10% FBS 첨가 MEM 배지 대신에 생리 식염수를 사용하는 것 이외는 실시예7과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(실시예19)
시트르산 항응고의 신선 소 혈액 10mL 대신에 CPD 항응고 돼지 골수 10mL를 사용하는 이외는 실시예3과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(비교예1)
폴리부틸렌테레프탈레이트 부직포(섬유경 16㎛, 밀도 K 5.1×104g/m3)를 40매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예8과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(비교예2)
유리와 폴리에틸렌테레프탈레이트로 이루어지는 부직포(섬유경 0.59㎛ 미만/9.3㎛, 밀도 K 2.0×105g/m3)를 36매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(비교예3)
유리와 폴리에틸렌테레프탈레이트로 이루어지는 부직포(섬유경 0.84㎛ 미만/8.4㎛, 밀도 K 2.2×105g/m3)를 24매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(비교예4)
비닐론으로 이루어지는 부직포(섬유경 30㎛, 밀도 K 3.2×105g/m3)를 56매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
(비교예5)
아크릴과 폴리에틸렌테레프탈레이트로 이루어지는 부직포(섬유경 22㎛, 밀도 K 2.1×105g/m3)를 6매 적층 상태로 충전한 것 이외는 실시예1과 같은 조작을 실시했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
[표 1]
Figure pct00001
(실시예20)
10% FBS 첨가 MEM 배지, 10% 덱스트란 당주, 및 생리 식염수의, 25℃에서의 점도를 측정했다. 점도는 각각 2.9mPa?s, 5.3mPa?s, 1.1mPa?s이었다.
부직포의 밀도 K와 단핵구 회수율과의 관계를 도 1에 나타냈다. 밀도 K는, 평량을 두께로 나눔으로써 산출했다. 또, 두께는, 다이얼 티크니스 게이지(dial thickness gauge)를 사용하여, 측정자 직경이 25mm, 압력이 0.7kPa의 게이지를 사용하여 측정했다. 평량은, 10cm사방으로 커트한 부직포의 중량을 측정함으로써 산출했다.
부직포의 섬유경과 단핵구 회수율과의 관계를 도 2에 나타냈다. 섬유경은, 부직포를 주사형 전자 현미경으로 사진 촬영하여, 사진에 기재된 스케일로부터 섬유경을 100개 측정하여, 그 평균값으로부터 산출했다.
이상의 결과에서, 본 발명에 기재된 분리재 및 분리 방법을 사용함으로써, 원심 조작을 필요로 하지 않고 신속하고 간편하게, 체액으로부터 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 혈소판 풍부 분획으로 분리 가능함을 알 수 있다. 또한 밀도 K가 2.0×104 이상 1.9×105 이하, 섬유경이 1㎛ 이상 15㎛ 이하인 부직포를 사용하면 단핵구 풍부 분획을 얻을 수 있고, 비교예에 나타낸 바와 같이 밀도 K가 범위 외의 부직포 또는 섬유경이 가는 섬유를 함유하는 부직포나 섬유경이 굵은 부직포는 분리 효율이 떨어짐도 알 수 있다.
1…챔버
2…혈구 분리재가 충전된 용기
3…체액 백
4…세정액 백
(겸(兼)프라이밍액 백)
5…적혈구 풍부 분획 회수 백
6…백혈구 풍부 분획 회수 백
(단핵구 풍부 분획 회수 백)
7…회수 포트
8, 9, 10…삼방활전(三方活栓)
11?17…회로

Claims (26)

  1. 체액을 각 혈구 성분으로 분리하는 방법으로서,
    (a) 체액을 혈구 분리재와 접촉시킴으로써 백혈구와 혈소판을 혈구 분리재로 포착하여,
    적혈구 풍부 분획을 얻는 공정과,
    (b) 분리 용액을 사용하여 혈구 분리재로부터 백혈구 풍부 분획을 분리하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    혈구 분리재가 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 충전되어, 체액을 당해 입구로부터 통액(通液)함으로써 혈구 분리재와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 공정에 있어서, 체액을 혈구 분리재와 접촉시킨 후에, 혈구 분리재에 잔존하는 적혈구를 세정액으로 세정하는 분리 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    (b) 공정에 있어서, 체액의 출구측으로부터 분리 용액을 주입하여 백혈구를 분리 회수하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    분리 용액이 생리 식염수, 완충액, 덱스트란, 배지, 또는 수액을 함유하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    체액이 혈액, 골수, 제대혈, 월경혈, 또는 조직 추출물인 분리 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 공정의 체액을 혈구 분리재와 접촉시키기 전에, 미리 용액을 혈구 분리재와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    미리 혈구 분리재와 접촉시키는 용액이 생리 식염수, 또는 완충액을 함유하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈액 분리재가 부직포로 이루어지는 분리 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    부직포가 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 나일론 섬유, 또는 아크릴 섬유로 구성되는 분리 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    폴리에스테르 섬유가 폴리에틸렌테레프탈레이트 섬유, 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트 섬유인 분리 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    부직포가 나일론 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트 섬유로 구성되는 분리 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    부직포가 분할 섬유로 구성되는 분리 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    부직포의 밀도 K가 2.0×104 이상 1.9×105 이하, 섬유경이 1㎛ 이상 15㎛ 이하이며, 백혈구 풍부 분획이 단핵구 풍부 분획인 분리 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    분리 용액으로서, 점도가 1mPa?s 이상 5mPa?s 미만의 용액을 사용하는 분리 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의 혈소판 회수율이 백혈구 회수율 이하인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의 혈소판 회수율이 단핵구 회수율 이하인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    백혈구 풍부 분획 중 또는 단핵구 풍부 분획 중의, 단핵구 회수율의 과립구 회수율에 대한 비가 1.0보다 큰 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    백혈구 풍부 분획 또는 단핵구 풍부 분획이, 조혈 간세포(幹細胞), 간엽계 간세포, 또는 CD34 양성 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 분리된 적혈구 풍부 분획, 백혈구 풍부 분획, 또는 혈소판 풍부 분획.
  21. 밀도 K가 2.0×104 이상 1.9×105 이하, 섬유경이 1㎛ 이상 15㎛ 이하인, 체액으로부터 단핵구 풍부 분획을 분리 가능한 부직포로 이루어지는 혈구 분리재.
  22. 제21항에 있어서,
    부직포가 나일론 섬유, 폴리프로필렌 섬유, 또는 폴리부틸렌테레프탈레이트 섬유로 구성되는 혈구 분리재.
  23. 제21항 또는 제22항에 기재된 혈구 분리재가 체액의 입구와 출구를 구비한 용기에 적층 상태로 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 혈구 분리 디바이스.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 용기의 입구측의 상류에 설치된 유로 개폐 수단,
    유로 개폐 수단에 연결된 백혈구 풍부 분획 회수 수단, 및
    상기 용기의 출구측의 하류에 설치된 분리 용액의 도입 수단
    을 더 갖는 혈구 분리 디바이스.
  25. 혈구 분리재 또는 부직포에 포착된 백혈구를 회수하기 위한 용액의 점도가 1mPa?s 이상 5mPa?s 미만인 분리 용액.
  26. 제25항에 있어서,
    덱스트란을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 분리 용액.
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