JP6707031B2 - 細胞分離材および細胞分離方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞分離材およびこれを利用した細胞分離方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、液体中に存在する希少細胞（腫瘍細胞、幹細胞、内皮細胞、胎児細胞など）と夾雑細胞とを分離し、希少細胞を回収・濃縮するのに適した細胞分離材およびこれを利用した細胞分離方法に関する。

血液中の細胞成分の主成分は、赤血球、白血球、血小板であるが、血液中にこれら以外の細胞が存在することが知られている。例えば、血中循環腫瘍細胞、循環幹細胞、循環内皮細胞など（まとめて以下「希少細胞」ともいう。）は、全血中に極めて稀に存在する細胞である。そして、これら希少細胞の検出は臨床的に有用であると考えられている。

例えば、血中循環腫瘍細胞は、がん患者の血中に低濃度で認められ、転移がんの原因とも考えられている。この腫瘍細胞を早期に発見することができれば、原発性腫瘍の存在や腫瘍の転移、あるいは治療後の腫瘍の再発を早期に発見でき、初期段階から効果的な治療の導入が可能となる。
しかしながら、血液中には赤血球が約５×１０⁹（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、白血球が約５×１０⁶（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、血小板が約３×１０⁸（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）あり、癌患者の白血球数の数十万から数千万に一個の割合でしか存在しないような腫瘍細胞を検出することは極めて難しいのが現状であり、腫瘍細胞を診断に利用することには限界がある。そこで、腫瘍細胞の定量分析を行う前に、夾雑している細胞を除去して、腫瘍細胞を濃縮することにより検出感度や測定精度を向上させる方法が現在開発され用いられている。

例えば、現在用いられている血中循環腫瘍細胞を回収・濃縮する方法としては、表面抗原が明らかになっている夾雑細胞の抗原に対する抗体を固定化した磁気ビーズによるネガティブセレクション法や、腫瘍細胞の特定の抗原に対する抗体を固定化した磁気ビーズによるポジティブセレクション法などが挙げられる。また蛍光抗体を用いたセルソーティングなどの細胞選別法もあるが、大量に存在する夾雑細胞と、微量に存在する腫瘍細胞とを選別するには、いずれの方法も大量の抗体や処理時間が必要になり、処理が非常に高コストになるとともに作業効率も悪い。一方で抗体を使用しないで腫瘍細胞を回収・濃縮する方法として、フィコール分離法やパーコール分離法などの密度勾配遠心法がある。本方法は細胞の比重差を利用して分離する方法であるが、比重で分離するために、腫瘍細胞と同じ比重の夾雑細胞とを分離することは不可能である。また、分離後に遠心分離機を使用してフィコール液やパーコール液を洗浄する操作を数回繰り返すために、細胞のロスが発生し、最悪の場合、数が非常に少ない血中循環腫瘍細胞もロスした結果、誤った診断を下す可能性がある。血液の中で最も数が多いのが赤血球であり、この大量の赤血球の混在が腫瘍細胞の検出の大きな阻害要因となっている。赤血球を予め除去する方法として上記以外に、赤血球を溶血処理する方法がある（例えば塩化アンモニウム法や高浸透圧破壊法）。該方法は効率的に赤血球を溶血して除去するものの、他の細胞へのダメージが大きいため、腫瘍細胞を生きたまま分析することや培養することが困難となる。他にも、血液などの体液中に含まれている腫瘍細胞などの希少細胞を回収する技術がいくつか報告されている（特許文献１、２）が、全血サンプルから目的の希少細胞を選択的に分離・回収する技術として十分であるとは言い難い。さらに、上記方法はいずれも、閉鎖系での処理が不可能であり異物の混入や感染などの安全上の課題も有している。

本件出願人も、腫瘍細胞を含む体液を各血球成分に分離する方法として、（ａ）腫瘍細胞を含む体液を血球分離材と接触させることにより腫瘍細胞と白血球および血小板を血球分離材に捕捉し、赤血球豊富分画を除去する工程、（ｂ）分離溶液を用いて血球分離材から腫瘍細胞濃縮分画を分離する工程、上記（ａ）と（ｂ）の工程より得られた回収液に含まれる赤血球の除去率／腫瘍細胞の回収率の比で示す値が１．２５以下、１．００以上であることを特徴とする細胞分離方法を提案している（特許文献３）。この手法は、血液、骨髄、臍帯血、月経血、腹膜液、胸膜液、リンパ液または組織抽出物をはじめとする体液から簡便かつ迅速に赤血球豊富分画を除去し、腫瘍細胞濃縮分画を回収することを可能としているが、腫瘍細胞を含む分画が白血球および血小板を含む状態で回収されており、腫瘍細胞を選択的に回収する方法ではない。したがって、血中循環腫瘍細胞などの希少細胞をより選択的に回収できる技術が求められていた。

特許第５３４８３５７号公報 特開２０１４−２５９１８号公報 特開２０１３−３６８１８号公報

上記のような事情に鑑み、本発明の目的は、血中循環腫瘍細胞などの希少細胞と、赤血球、血小板、白血球などの夾雑細胞とが混合されている液体から、希少細胞を選択的に高い回収率で回収できる細胞分離材を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記細胞分離材を用いて、希少細胞を選択的に高い回収率で回収できる細胞分離方法を提供することにある。

本発明者らは、かかる課題を解決すべく、鋭意検討を進めた。その結果、希少細胞の選択的な回収には、細胞分離材の平均繊維径に加えて、通気度および圧縮エネルギーが影響することを見出した。これらが特定の範囲にある細胞分離材を用いることで、希少細胞の回収率が有意に向上し、しかも赤血球、血小板、白血球などの夾雑細胞の除去率を向上することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕希少細胞用の細胞分離フィルターであって、平均繊維径３μｍ以上、１５μｍ以下の繊維から構成され、且つ通気度が２５ｃｃ／ｃｍ ^２ ／ｓｅｃ以上、３５０ｃｃ／ｃｍ ^２ ／ｓｅｃ以下および圧縮エネルギーＷＣが２．７Ｊ／ｍ ^２ 以下である細胞分離材が、入口と出口を供えた容器に複数枚積層して充填されており、
前記細胞分離材の充填率（充填前の細胞分離材全体の厚み／充填後の細胞分離材全体の厚み）が１．５以上、１０以下であり、
前記希少細胞が前立腺がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞または幹細胞であることを特徴とする細胞分離フィルター。
〔２〕前記細胞分離材の密度が６．５×１０ ^４ ｇ／ｍ ^３ 以上、１．５×１０ ^５ ｇ／ｍ ^３ 以下である前記〔１〕に記載の細胞分離フィルター。
〔３〕前記細胞分離材の通気度（ｃｃ／ｃｍ ^２ ／ｓｅｃ）と前記細胞分離材の厚み（ｍｍ）との積である通気度係数Ｍが３６以上、３００以下である前記〔１〕または〔２〕に記載の細胞分離フィルター。
〔４〕前記細胞分離材の厚みが０．１ｍｍ以上、３．５ｍｍ以下である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の細胞分離フィルター。
〔５〕前記細胞分離材の圧縮エネルギーＷＣが０．０５Ｊ／ｍ ^２ 以上、１．２Ｊ／ｍ ^２ 以下である前記〔１〕〜〔４〕に記載の細胞分離フィルター。
〔６〕前記細胞分離材が不織布である前記〔１〕〜〔５〕に記載の細胞分離フィルター。
〔７〕前記不織布がスパンレース不織布、スパンボンド不織布またはメルトブローン不織布である前記〔６〕に記載の細胞分離フィルター。
〔８〕前記細胞分離材を構成する繊維が、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル、ナイロンおよびポリウレタンからなる群より選ばれる少なくとも１種の合成高分子からなる前記〔１〕〜〔７〕に記載の細胞分離フィルター。
〔９〕前記細胞分離材を構成する繊維が、ポリエステルおよびポリオレフィン;レーヨンおよびポリオレフィン;ポリエステルおよびレーヨン；またはポリエステル、レーヨンおよびビニロンの合成高分子の組み合わせからなる前記〔８〕に記載の細胞分離フィルター。
〔１０〕前記細胞分離材が、圧縮された状態で充填されている前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の細胞分離フィルター。
〔１１〕前記細胞分離材の充填密度（充填されている細胞分離材全体の重量／充填されている細胞分離材全体の体積）が１．０×１０^５ｇ／ｍ^３以上、１．０×１０^６ｇ／ｍ^３以下である前記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞分離フィルター。
〔１２〕充填されている前記細胞分離材全体の平均孔径が１μｍ以上、７０μｍ以下である前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の細胞分離フィルター。
〔１３〕液体が流れる方向に対する、充填されている前記細胞分離材全体の厚みが１ｍｍ以上、３０ｍｍ以下である前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
〔１４〕希少細胞を含む液体を通液させることにより、希少細胞を捕捉し、且つ赤血球、白血球および血小板を除去するための細胞分離フィルターであって、前記希少細胞が前立腺がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞または幹細胞である、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
〔１５〕前記〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の細胞分離フィルターに希少細胞を含む液体を通液させて、前記細胞分離材に希少細胞を豊富に含み、かつ前記希少細胞が前立腺がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞または幹細胞である分画を捕捉させる工程を含む細胞分離方法。
〔１６〕前記液体が血液、骨髄、臍帯血、月経血、腹膜液、胸膜液、リンパ液、尿、唾液または組織抽出物である前記〔１５〕に記載の細胞分離方法。
〔１７〕前記液体が血液、臍帯血または月経血であり、下記（ａ）〜（ｃ）工程を含有する前記〔１５〕または〔１６〕に記載の細胞分離方法。
（ａ）希少細胞を含む液体を前記細胞分離フィルターの入口から通液させる工程
（ｂ）前記（ａ）工程後に洗浄溶液を前記細胞分離フィルターの入口から通液させる洗浄工程
（ｃ）前記（ｂ）工程後に回収溶液を前記細胞分離フィルターの出口から通液させて、前記細胞分離フィルターの入口から希少細胞豊富分画を回収する希少細胞回収工程
〔１８〕前記（ａ）工程および（ｂ）工程において前記細胞分離フィルターの出口から通過させた細胞分画（通過細胞分画）を、前記細胞分離フィルターの入口から複数回通液し、さらに前記（ｃ）工程を実施することにより、通過細胞分画中に混入した希少細胞を含む分画を再回収する工程を有する前記〔１７〕に記載の細胞分離方法。
〔１９〕前記（ｃ）工程において回収した希少細胞が培養可能である前記〔１７〕または〔１８〕に記載の細胞分離方法。
〔２０〕前記〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の細胞分離フィルター、もしくは前記〔１５〕〜〔１９〕のいずれかに記載の細胞分離方法によって回収した希少細胞豊富分画であって、前記希少細胞が前立腺がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞または幹細胞であり、赤血球および血小板が６０％以上除去されており、かつ白血球が５０％以上除去されており、かつ希少細胞が培養可能である希少細胞豊富分画。

本発明の細胞分離材を用いることにより、例えば、血液、骨髄、臍帯血、月経血、腹膜液、胸膜液、リンパ液、尿、唾液または組織抽出物をはじめとする体液や、培養液などの液体に含まれる希少細胞を、赤血球、血小板、白血球などの他に混在する細胞から分離して効率よく回収することができる。

また、本発明で得られる希少細胞豊富分画は、赤血球、血小板、白血球の混入率が低く、使用時まで凍結保存しても溶血などせず、希少細胞への影響は非常に少ない。また、無菌的に回収することが可能であり、かつ細胞回収時の回収液に培養液を使用すれば、そのまま回収した細胞の培養が可能である。また、希少細胞の混入率が極端に少なくこれまで希少細胞が検出されていなかった液体においても、希少細胞を培養で増幅させた後に本発明の細胞分離方法に供することにより、希少細胞を回収することができるため、検出感度を向上させることが可能となる。以上より、本発明の細胞分離材、細胞分離フィルターおよび細胞分離方法は、各種の液体中から希少細胞を選択的に回収する技術として非常に有用であり、検査等に有用な希少細胞豊富分画を得ることができる。

本発明の細胞分離材を用いた細胞分離フィルター１の一例を示す概略図である。 図１に示す細胞分離フィルター１の概略断面図である。 図１に示す細胞分離フィルター１を備えた細胞分離システム１３の一例を示す概略図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

（細胞分離材）
本発明の細胞分離材は、平均繊維径１．０μｍ以上、５０μｍ以下の繊維から構成され、且つ通気度が１０ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以上、４００ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以下および圧縮エネルギーＷＣが３．５Ｊ／ｍ^２以下であることを特徴とする。

細胞分離材を構成する繊維は、平均繊維径１．０μｍ以上、５０μｍ以下であることが好ましい。平均繊維径が１．０μｍより細いと目詰まりが起こり易くなり、５０μｍより太いと希少細胞が細胞分離材へ捕捉されずに通過するため、希少細胞の回収率が大幅に低下する。
繊維径とは繊維軸に対して直角方向の繊維の幅である。平均繊維径の測定は、例えば、細胞分離材を走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、写真に記載されたスケールから求めた繊維径の計算値を平均することにより求めることができる。つまり、本発明における平均繊維径とは、上記のように測定した繊維径の平均値を意味しており、測定した繊維５０個以上、望ましくは１００個以上の繊維径の平均値である。但し、繊維が多数に重なりあった場合や、他繊維が邪魔をしてその幅が測定できない場合、著しく直径の異なる繊維が混在している場合などは、そのデータは除いて繊維径を算出する。

本発明では、前記細胞分離材の平均繊維径を前記範囲に限定することで、希少細胞を効率よく捕捉し、夾雑細胞（赤血球、血小板、白血球等）を効率よく除去することができる。また、前記平均繊維径は、希少細胞と夾雑細胞との分離効率の観点から、好ましくは３μｍ以上、より好ましくは７μｍ以上、さらに好ましくは１０μｍ以上である。また、前記平均繊維径は好ましくは４０μｍ以下、より好ましくは３０μｍ以下、より好ましくは２５μｍ以下、さらに好ましくは２０μｍ以下、特に好ましくは１５μｍ以下である。

前記繊維の材質としては、材料は特に制限されないが、滅菌耐性や細胞への安全性の観点からは、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートなど）、レーヨン、ポリオレフィン（ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、ビニロン、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレートなど）、ナイロン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニリデン、ポリイミド、アラミド（芳香族ポリアミド）、ポリアミド、キュプラ、カーボン、フェノール、パルプ、麻、ポリカーボネートなどの合成高分子、アガロース、セルロース、セルロースアセテート、キトサン、キチンなどの天然高分子、ガラスなどの無機材料や金属等が挙げられる。
中でも、細胞分離効率の観点から、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル、ナイロンおよびポリウレタンが好ましい。また、これらの材料は一種類単独とは限らず、必要に応じて材料を複合・混合・融合して用いてもよい。２種以上の材料を組み合わせる場合、その組み合わせは特に限定されないが、ポリエステルおよびポリオレフィン;レーヨンおよびポリオレフィン;ポリエステルおよびレーヨン；またはポリエステル、レーヨンおよびビニロンからなる合成高分子の組み合わせ等が好ましく挙げられる。さらに必要ならば、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、糖類など、特定の細胞に親和性を有する分子を材料に固定してもよい。

前記繊維からなる細胞分離材の形状としては、不織布、織布、スポンジ状、多孔体、メッシュ状等が挙げられるが、容易に作製でき入手できることから不織布が好ましい。

不織布の製造方法としては、大きく分けて湿式法と乾式法、さらには、レジンボンド法、サーマルボンド法、スパンレース法、ニードルパンチ法、ステッチボンド法、スパンボンド法、メルトブローン法などが挙げられる。
中でも、希少細胞を捕捉しやすい観点から、スパンレース法、スパンボンド法またはメルトブローン法で製造された不織布であるスパンレース不織布、スパンポンド不織布またはメルトブローン不織布が好ましい。
また、前記不織布は、カレンダー加工やプラズマ処理等による加工を施していてもよい。
繊維が複雑に絡み合って血球分離効率が良いことから、前記不織布の繊維としては、複合単糸を複数に分割した、いわゆる分割繊維も適している。

前記細胞分離材は、さらに通気度が１０ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以上、４００ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以下である。通気度を前記範囲に限定することで、希少細胞が選択的に細胞分離材に捕捉され、希少細胞と夾雑細胞との分離効率を高めることができる。前記通気度は、希少細胞と夾雑細胞との分離効率の観点から、好ましくは２５ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以上、より好ましくは４０ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以上、さらに好ましくは４５ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以上、とりわけ好ましくは４７ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以上である。また、前記通気度は、好ましくは３５０ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以下、より好ましくは３３０ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以下、さらに好ましくは３００ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以下、とりわけ好ましくは２７５ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ以下である。
前記通気度は種々の方法で測定可能であるが、例えば、ＪＩＳ Ｌ１０９６−２０１０に記載されたフラジール形法に則り、または準拠し、容易に測定することが可能である。

前記細胞分離材は、さらに圧縮エネルギーＷＣが３．５Ｊ／ｍ^２以下である。平均繊維径及び通気度を前記範囲に限定し、さらに圧縮エネルギーＷＣを前記範囲に限定することによってはじめて希少細胞の捕捉効率を格段に向上させることができる。前記圧縮エネルギーＷＣは、希少細胞の捕捉効率をさらに向上させる観点から、好ましくは２．０Ｊ／ｍ^２以下、より好ましくは１．５Ｊ／ｍ^２以下、さらに好ましくは１．２Ｊ／ｍ^２以下、とりわけ好ましくは０．６Ｊ／ｍ^２以下である。また前記圧縮エネルギーＷＣは、０．０５Ｊ／ｍ^２以上であることが好ましく、０．１Ｊ／ｍ^２以上であることがより好ましく、０．２Ｊ／ｍ^２以上であることがさらに好ましい。
中でも、本発明では、細胞分離フィルターへの充填がしやすい圧縮特性を有し、かつ目的の希少細胞の分離能に優れるという観点から、前記圧縮エネルギーＷＣは、０．０５Ｊ／ｍ^２以上、１．２Ｊ／ｍ^２以下に調整されている細胞分離材が好ましい。
圧縮エネルギーＷＣとは、細胞分離材の圧縮特性を表すパラメーターである。細胞分離材に荷重をかけると、細胞分離材は荷重方向に圧縮されて変形するが、その圧縮されやすさは、細胞分離材が受けた荷重による変形量、すなわち荷重×変位＝エネルギーとして表すことができることから、圧縮エネルギーＷＣは細胞分離材の圧縮されやすさを表すパラメーターといえる。圧縮エネルギーＷＣの数値が大きいほど細胞分離材は圧縮されやすく、前記数値が小さいほど細胞分離材は圧縮されにくい。
なお、前記圧縮エネルギーＷＣは、例えば、カトーテック社製ＫＥＳ圧縮試験機（ＫＥＳ−Ｇ５）を用いて、圧縮速度２０μｍ／ｓｅｃ、圧縮最大荷重５０ｇｆ／ｃｍ^２の条件で試料３点を測定し、その平均値として算出することができる。

前記細胞分離材の密度、つまり目付（ｇ／ｍ^２）／厚み（ｍ）は、２．０×１０^４ｇ／ｍ^３以上、１．５×１０^５ｇ／ｍ^３以下であればよいが、中でも、希少細胞と夾雑細胞との分離効率から、６．５×１０^４ｇ／ｍ^３以上、１．５×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることが好ましい。さらに希少細胞を高い回収率で回収するためには、前記密度が７．０×１０^４ｇ／ｍ^３以上がより好ましく、８．０×１０^４ｇ／ｍ^３以上がさらに好ましい。また前記細胞分離材の密度は、１．３×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることが好ましく、１．２×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることがより好ましく、１．１×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることがさらに好ましく、１．０×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることが特に好ましい。

前記密度は、目付（ｇ／ｍ^２）／厚み（ｍ）を示すが、これは重量（ｇ）／単位体積（ｍ^３）と表すこともできる。つまり、密度は細胞分離材の形態に関わらず、単位体積（ｍ^３）あたりの重量（ｇ）を測定することにより求めることもできる。勿論、用いる材料のカタログ等に目付や厚みが記載されている場合には、そのデータに基づき目付（ｇ／ｍ^２）／厚み（ｍ）から密度を求めても構わない。
なお、前記密度を算出する際の細胞分離材の厚みは、非圧縮状態における厚みをいう。前記非圧縮状態での厚みの測定方法としては、例えば、ＫＥＳ圧縮試験機（カトーテック、ＫＥＳ−Ｇ５）を使用して細胞分離材に圧力を加え、取得した圧縮曲線における低荷重での厚みを非圧縮状態での厚みとすることができる。
また、前記目付については、例えば、１ｍ四方の細胞分離材の重量を天秤で測定することにより算出できる。

また、前記細胞分離材の前記非圧縮状態における１枚の厚みは０．１ｍｍ以上、３．５ｍｍ以下であることが好ましい。前記厚みは、希少細胞と夾雑細胞との分離効率の観点から、好ましくは０．２ｍｍ以上、より好ましくは０．３ｍｍ以上であり、さらに希少細胞を細胞分離材に効率よく捕捉させるためには、より好ましくは２．５ｍｍ以下、さらに好ましくは２．０ｍｍ以下、とりわけ好ましくは１．２ｍｍ以下である。

また、前記細胞分離材の通気度（ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ）と前記細胞分離材の厚み（ｍｍ）との積である通気度係数Ｍは３６以上、３００以下の範囲に限定されていることが好ましい。通気度係数Ｍが３６より小さい場合、赤血球、白血球等の夾雑細胞の除去効率が低下する傾向があり、通気度係数Ｍが３００より大きい場合、希少細胞を細胞分離材に捕捉させる効率が低下する傾向がある。さらに、希少細胞と夾雑細胞との分離効率を向上させる観点から、通気度係数Ｍは、３７以上が好ましく、７２以上がより好ましく、８０以上がさらに好ましい。また、前記細胞分離材の通気度係数Ｍは、２５０以下が好ましく、２００以下がより好ましく、１５０以下がさらに好ましい。
前記通気度係数Ｍは、細胞分離材の通気度（ｃｃ／ｃｍ^２／ｓｅｃ）と厚み（ｍｍ）の積で定義される値である。通気度は細胞分離材の孔径の大きさに依存するパラメーターであるが、同じ通気度であっても細胞分離材の厚みが小さいほど本質的な通気度はより小さく、同じ厚み相当に換算すると通気度は小さくなる。そこで通気度と厚みを掛け合わせることにより、細胞分離材の本質的な孔径を表すパラメーターとなる。

（細胞分離フィルター）
本発明の細胞分離フィルターは、前記細胞分離材が、入口と出口を供えた容器に複数枚積層して充填されていることを特徴とする。

前記細胞分離材を充填する容器の形態、大きさ、材質は特に限定されない。容器の形態は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態であってよい。好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１ｍＬから４００ｍＬ程度、直径約０．１ｃｍから１５ｃｍ程度の半透明の筒状容器が挙げられる。また、一片の長さ０．１ｃｍから２０ｃｍ程度の長方形または正方形で、厚みが０．１ｃｍから５ｃｍ程度の四角柱容器等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

前記容器の型としては、クロスフロータイプ、カラムタイプ等が挙げられる。クロスフロータイプまたはカラムタイプのどちらでも使用することができ、特に容器のタイプは限定されないが、回収液を均一に導入できるという観点からカラムタイプがより好ましい。

カラムタイプとは、例えばフィルター面に対して面の中心付近に液の入口と出口が付いている容器、またはフィルター面に対して垂直に入口部と出口部が位置している容器、またはフィルター面に対して垂直方向に液が流れることを特徴とする容器、または分離材の圧縮方向に対して平行に液が流れることを特徴とするような容器のことをいう。

一方、クロスフロータイプとは、白血球除去フィルター（旭化成メディカル株式会社製「セパセル」、ポール社製「ピュアセルＲＣ」）に代表されるように、フィルター面に対して液の入口と出口の位置が面の中心から外れており、フィルター面に対して平行に入口部と出口部が位置している容器を指す。

前記容器は、任意の構造材料を使用して作製することができる。構造材料としては具体的には、非反応性ポリマー、生物親和性金属、合金、ガラス等が挙げられる。非反応性ポリマーとしては、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。前記容器の材料として有用な金属材料（生物親和性金属、合金）については、ステンレス鋼、チタン、白金、タンタル、金、およびそれらの合金、並びに金メッキ合金鉄、白金メッキ合金鉄、コバルトクロミウム合金、窒化チタン被覆ステンレス鋼等が挙げられる。
これらの構造材料のうち、滅菌耐性を有する構造材料が好ましく、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン等が挙げられる。

前記容器に前記細胞分離材を充填した細胞分離フィルターの具体例としては、図１、２に示す構造の細胞分離フィルター１が挙げられる。前記細胞分離フィルター１では、上下に開口部が設けられた円筒状の容器本体２、前記容器本体２の内空部分であって上下の開口部付近に配置するノズル付き押え部材３、前記ノズル付き押え部材３同士の間で充填されている細胞分離材４および前記ノズル付き押え部材３を前記開口部付近に固定することができる蓋５から構成されている。
前記ノズル付き押え部材３のノズル口６は、前記細胞分離フィルター１へ液体を導入するための入口または出口になる。
また、前記蓋５は容器本体２にネジ止めできるようにしておいてもよい。
さらに前記蓋５またはノズル付き押え部材３と容器本体２とが接触する部分には、場所は特定されないが、シール材７を配置することで、前記細胞分離フィルター１内部に導入された液体が漏出することを防ぐようにしてもよい。

前記容器に前記細胞分離材を充填する際には、必要に応じて細胞分離材を適当な大きさに切断し、希少細胞を含む液体が流れる方向に、複数枚積層した状態で使用することができる。中でも、図２に示すように、充填させる細胞分離材４全体の厚みＴは、液体が流れる方向Ｄに対して１ｍｍ以上、３０ｍｍ以下であることが好ましい。なお、前記方向Ｄは、細胞分離フィルター１の液体の出入口であるノズル口６同士を結ぶ方向である。前記充填した細胞分離材４全体の厚みＴは、夾雑細胞を効率よく除去する観点から、好ましくは２５ｍｍ以下、より好ましくは２０ｍｍ以下、さらに好ましくは１５ｍｍ以下である。また、希少細胞のロスを減らす観点から、３ｍｍ以上であることが好ましく、５ｍｍ以上であることがより好ましい。
なお、前記充填した細胞分離材４全体の厚みＴは、例えば、前記容器が透明な容器であれば、外部からノギスを用いて目視で測定することができる。また、不透明な容器であっても、容器の各部の構造のうち、細胞分離材４を充填する部分の長さを測定することで算出することができる。

また、前記容器に前記細胞分離材を充填する方法としては、平板上に積層して充填するだけでなく、ロール状に巻いて充填してもよい。ロール状で使用する場合、該ロールの内側から外側に向けて液体を処理することにより細胞を分離してもよいし、或いはその逆に該ロールの外側から内側に向けて液体を処理してもよい。

前記細胞分離材を前記容器に充填する際には、液体の流れる方向に圧縮して容器に充填することが好ましいが、細胞分離材の材質等によっては圧縮せずに容器充填してもよい。圧縮の程度は、細胞分離材の材質等に応じて適宜選定することができる。

前記細胞分離材を前記容器に充填した前記細胞分離フィルターは、材質、形状などが相違した２種以上の細胞分離材を併用して作製してもよい。

前記細胞分離フィルターにおいて、前記容器に前記細胞分離材を充填する際、細胞分離材の充填率（充填前の細胞分離材全体の厚み／充填後の細胞分離材全体の厚み）を１以上、１０以下とすることが好ましい。前記充填率が１より小さい場合には、フィルター内に生じた空隙から希少細胞をロスする可能性があり、前記充填率が１０より大きい場合には、フィルターに細胞分離材を充填することが困難となる。さらに、希少細胞の捕捉効率を高めると同時に夾雑細胞の除去効率を高めるために、前記充填率は１．２以上がより好ましく、１．５以上がさらに好ましい。また前記充填率は、９以下がより好ましく、８以下がさらに好ましく、７．７以下がとりわけ好ましい。
なお、前記容器に充填する前の細胞分離材全体の厚みは、前記非圧縮状態における細胞分離材１枚の厚みの総和から算出し、充填後の細胞分離材全体の厚みは、前記ノギスを用いた方法により測定することができる。

本発明の細胞分離フィルターでは、前記容器に充填する細胞分離材の充填密度（充填されている細胞分離材全体の重量／充填されている細胞分離材全体の体積）が１．０×１０^５ｇ／ｍ^３以上、１．０×１０^６ｇ／ｍ^３以下であることが好ましい。前記充填密度が１．０×１０^５ｇ／ｍ^３を下回る場合、希少細胞がフィルターを通過しやすくなるため、希少細胞の回収率は著しく低下する傾向がある。一方、前記充填密度が１．０×１０^６ｇ／ｍ^３を上回る場合、充填された細胞分離材中に希少細胞が強固に捕捉された状態となり、回収を行うことが困難となる。さらに、希少細胞の回収率を向上させる観点から、前記充填密度は、１．２×１０^５ｇ／ｍ^３以上が好ましく、１．４×１０^５ｇ／ｍ^３以上がより好ましい。また前記充填密度は、９．０×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることが好ましく、８．０×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることがより好ましく、７．６×１０^５ｇ／ｍ^３以下であることがさらに好ましい。
なお、前記充填されている細胞分離材全体の体積は、例えば、前記充填した細胞分離材全体の厚みと細胞分離材の面積との積で算出すればよい。

また、前記細胞分離フィルターに充填されている前記細胞分離材全体の平均孔径は、１μｍ以上、７０μｍ以下であることが好ましい。前記平均孔径が１μｍを下回る場合、希少細胞だけでなく赤血球や白血球等の夾雑細胞もフィルターを通過することができず、夾雑細胞を除去することが困難となる。一方、７０μｍを上回る場合、夾雑細胞だけでなく希少細胞もフィルターを通過する可能性が高く、希少細胞の回収率が著しく低下すると考えられる。さらに、希少細胞の回収率を向上させる観点から、好ましくは６６μｍ以下、より好ましくは５７μｍ以下、さらに好ましくは４３μｍ以下、とりわけ好ましくは３３μｍ以下である。また、前記細胞分離フィルターの平均孔径は、好ましくは３μｍ以上、より好ましくは６μｍ以上、さらに好ましくは９μｍ以上である。
なお、前記平均孔径は、例えば、パームポロメータ（Ｐｏｒｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）等を用いて測定することができる。

本発明の細胞分離フィルターは、希少細胞を含む液体を通液させることにより、希少細胞を捕捉し、且つ赤血球、血小板、白血球などの夾雑細胞を除去することができる。
ここで、希少細胞を捕捉するとは、細胞分離材と接触した液体または細胞分離フィルターに通液した液体に含まれる希少細胞のうち、３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、とりわけ好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上、もっとも好ましくは９０％以上が細胞分離材または細胞分離フィルターに捕捉されることを意味する。

また、本発明の細胞分離フィルターが赤血球、血小板および白血球などの夾雑細胞を除去するとは、例えば、細胞分離材および細胞分離フィルターと接触した液体に含まれる赤血球および血小板の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、とりわけ好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、もっとも好ましくは９９％以上が除去でき、かつ白血球の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０以上、とりわけ好ましくは９０％以上、とくに好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９７％以上が除去できることを意味する。

また、本発明の細胞分離フィルターは、充填する細胞分離材の種類や充填方法などを変えることにより、フィルターの性能を自在に制御することが可能である。つまり、希少細胞回収率が特に高いフィルターとして設計することもできるし、夾雑細胞除去率が特に高いフィルターとして設計することもできる。

（細胞分離方法）
本発明は、前記細胞分離フィルターに希少細胞を含む液体を通液させて、前記細胞分離材に希少細胞を豊富に含む分画（希少細胞豊富分画）を捕捉させる工程を含む細胞分離方法に関する。

具体的には、細胞分離材が充填された容器に希少細胞を含む液体を入口側より注入し、希少細胞を豊富に含む分画を前記細胞分離材に捕捉させる。

前記入口と出口を有する容器に、液体を流す際は、液体の入口を液体の出口よりも高くなるようにセットし、重力と同方向に液体を流してもよいが、液体の入口を液体の出口よりも低くなるようにセットし、重力と逆方向に液体を流してもよい。重力と逆方向に液体を流すことにより、液体が容器内に均一に流れるとともに気泡が抜けやすくなることから、分離効率をさらに向上させることができる。他にも、液体を流す方向は重力と垂直方向であってもよく、液体を流す方向は上記に限定されない。

本発明の細胞分離方法に用いられる希少細胞を含む液体としては、希少細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、血液、骨髄、臍帯血、月経血、腹膜液、胸膜液、リンパ液、尿、唾液または組織抽出物などが挙げられる。
また、希少細胞を生体外で培養した培養液や、生理食塩水などの液体に懸濁させた懸濁液であってもよい。

また、前記の希少細胞を含む液体の通液後に、必要に応じて、入口側から洗浄溶液を通液することで希少細胞以外の成分を前記細胞分離フィルターから除去してもよい。
使用できる洗浄溶液としては、希少細胞を損傷したりしなければ特に限定はないが、生理食塩水、リンゲル液、細胞培養に用いる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が好ましい。

次いで、前記容器の出口方向から、すなわち、希少細胞を含む液体や洗浄溶液の通液方向とは逆方向から、回収溶液を流すことにより、細胞分離材に捕捉された希少細胞を豊富に含む分画を回収することができる。

前記回収溶液としては、等張液であれば特に限定されないが、生理食塩水、リンゲル液、デキストラン糖注、ヒドロキシエチルスターチなどの注射用剤として使用実績があるものや、緩衝液、細胞培養用培地等が挙げられる。

また捕捉された希少細胞の回収率を上げるために回収溶液の粘度を上げてもよい。そのために前記回収溶液にアルブミン、フィブリノゲン、グロブリン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシエチルセルロース、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン等を添加できるが、添加物はこれらに限定されるものではない。回収溶液の粘度は特に限定されないが、粘度が高すぎると回収操作を行いにくくなる傾向があることから、２０ｍＰａ・ｓ以下がより好ましい。カラムタイプの容器であれば低粘度の回収溶液を使用しても回収性能は低下しないことから１０ｍＰａ・ｓ以下でも使用することができる。更には５ｍＰａ・ｓ以下の回収溶液でも使用することが可能である。

また、前記のように希少細胞を豊富に含む分画を細胞分離材に捕捉させる工程の前処理として、生理食塩水、緩衝液などの前処理溶液に細胞分離材を浸漬させる工程を実施してもよい。この操作は必ずしも必要ではないが、細胞分離材を前記前処理溶液へ浸漬させることで、希少細胞を含む液体を細胞分離材全体に均一に通液させることができ、分離効率の向上が期待される。この前処理溶液は、前記洗浄溶液と同一である必要はないが、同一であれば処理の際に前記細胞分離フィルターに接続する溶液バッグ等を共有できるため、回路システムの単純化と操作性の観点から同一であることが好ましい。前処理の液量としては、フィルター容量の１倍から１００倍程度が実用的であり好ましい。使用できる緩衝液としては、特に限定されないが、生理食塩水、リンゲル液、細胞培養に用いる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が好ましい。

また、希少細胞以外に、赤血球、血小板、白血球などの夾雑細胞を含む液体、例えば、血液、臍帯血または月経血を用いた場合には、下記（ａ）〜（ｃ）工程を行うことで、希少細胞をより高い効率で回収し、夾雑細胞をより高い効率で除去することができる。
（ａ）希少細胞を含む液体を前記細胞分離フィルターの入口から通液させる工程
（ｂ）前記（ａ）工程後に洗浄溶液を前記細胞分離フィルターの入口から通液させる洗浄工程
（ｃ）前記（ｂ）工程後に回収溶液を前記細胞分離フィルターの出口から通液させて、前記細胞分離フィルターの入口から希少細胞豊富分画を回収する希少細胞回収工程

前記（ａ）工程では、希少細胞を含む液体を前記細胞分離フィルターに通液し、前記細胞分離材に捕捉されずに通過した赤血球を豊富に含む分画を前記細胞分離フィルターから除去することができる。本工程では、細胞分離材を充填した容器の液体入口側より液体を通液する際には、液体を入れた容器から送液回路を通じて自然落下で送液してもよいし、ポンプを用いて送液してもよい。また、希少細胞を含む液体を入れたシリンジを直接容器に接続し、シリンジのプランジャーを手で押してもよい。ポンプにより通液する場合には、送液速度が速過ぎると分離効率が落ち、遅過ぎると処理時間がかかる傾向がある。送液速度としては、例えば０．１ｍＬ／ｍｉｎから１００ｍＬ／ｍｉｎの速度が挙げられるが、これに限定されるものではない。

前記（ｂ）工程では、洗浄溶液をフィルターに通液することで、白血球、血小板を豊富に含む分画をフィルターから通過させて除去することができる。洗浄溶液は、前記と同じものを使用すればよい。
洗浄溶液を通液する際には、自然落下で送液しても、ポンプにより送液してもよい。ポンプにより送液する場合の流速は、希少細胞を含む液体を送液する場合と同程度であり、０．１〜１００ｍＬ／ｍｉｎの速度が挙げられるが、これに限定されるものではない。洗浄溶液の量は、使用する容器の容量によって異なるが、洗浄溶液の量が少なすぎるとフィルターに残存する白血球や血小板の量が多くなり、洗浄溶液の量が多すぎると希少細胞がフィルターから通過する可能性が高くなるとともに、工程に多大な時間を要することから、フィルター容量の０．５倍から１００倍程度の液量で洗浄することが好ましい。

また、本発明では、前記（ａ）工程および（ｂ）工程において前記細胞分離フィルターの出口から通過させた細胞分画（通過細胞分画）を、前記細胞分離フィルターの入口から複数回通液し、さらに前記（ｃ）工程を実施することにより、通過細胞分画中に混入した希少細胞を含む分画を再回収する工程を有する。

前記（ｃ）工程では、細胞分離材に捕捉されている希少細胞を細胞分離材から分離して回収する。具体的には、細胞分離材を充填したフィルターに対して、（ａ）工程および（ｂ）工程における出口側から回収溶液を注入し、（ａ）工程および（ｂ）工程における入口側から希少細胞を回収する。すなわち、（ｃ）工程における通液方向は、（ａ）工程および（ｂ）工程とは逆方向となる。回収溶液を注入する際には、回収溶液を予めシリンジ等に入れておき、シリンジのプランジャーを手や機器を用いて押し出すことにより実行できる。回収溶液の量や流速は、使用する容器の容量や処理量により異なるが、フィルター容量の１倍から１００倍程度の液量で、流速０．５〜２０ｍＬ／ｓｅｃに調整することが好ましいが、これに限定されるものではない。

本発明の細胞分離方法では、希少細胞回収率が特に高い方法を選択することもできるし、夾雑細胞除去率が特に高い方法を選択することもできる。例えば、前記（ａ）工程における通液速度や、前記（ｂ）工程における洗浄液量および通液速度、さらに前記（ｃ）工程における回収液量や通液速度をコントロールすることで、上記細胞分離効率をコントロールすることが可能である。

また、本発明の細胞分離方法として、前記細胞分離フィルターを使用した細胞分離システムを構成してもよい。細胞分離システムは、細胞分離フィルターの他に、希少細胞を含む液体や洗浄溶液及び回収溶液の入口や出口、希少細胞を含む液体を収容するバッグ、フィルターを通過した夾雑細胞を含む液体を収容する廃液バッグ、フィルターから回収した希少細胞を収容するバッグ等を同時に備えていることが実用的であり好ましい。この場合、細胞分離フィルターは、希少細胞を含む液体が流入する入口と流出する出口を有しており、さらに赤血球などの夾雑細胞を除去するために用いる洗浄溶液の流入部および流出部を有し、尚且つ、上記流出部とは独立して、回収溶液を導入するための入口も備えていることが好ましい。フィルターに接続する洗浄溶液や回収溶液の入口は、それぞれ夾雑細胞洗浄後や希少細胞回収後の液体の出口として機能してもよく、さらに三方活栓等を介して各バッグやシリンジ等が接続されていてもよい。

例えば、図３に示すような細胞分離システム１３を用いることができる。前記細胞分離システム１３において、細胞分離フィルター１は、その液体の入口８が鉛直方向下側、液体の出口９が鉛直方向上側になるようにセットされているため、前記入口８から導入された液体は、前記細胞フィルター１内を鉛直方向上側の出口９から排出される。
前記細胞分離フィルター１の入口８には、三方活栓１０ａを介して、希少細胞を含有する液体を収容しているバッグ１１および洗浄溶液を収容しているバッグ１２（図中、右側）と、細胞分離フィルター１から回収した液体を収容するバッグ（回収バッグ）２０及び回収バッグ等に回収された液体を回収する手段２１（図中、下側）とがチューブで接続されている。
前記三方活栓１０ａの下側には、三方活栓１０ｃを介して、回収バッグ２０及び回収バッグ等に回収された液体を回収する手段２１がチューブで接続されている。
また、前記細胞分離フィルター１の出口９には、三方活栓１０ｄを介して、細胞分離フィルター１を通過した液体を収容するバッグ（廃液バッグ）２３及び回収溶液を収容しているバッグ２４が接続されている。

前記細胞分離システム１３では、前記バッグ１１、１２は前記細胞分離フィルター１および前記出口９よりも鉛直方向上側になるように配置されているため、バッグ１１またはバッグ１２に収容されている液体はいずれも重力を利用して前記細胞分離フィルター１内に導入することができ、導入された液体はいずれも前記出口９から排出されて廃液バッグ２３に収容される。なお、バッグ１１またはバッグ１２からの通液の切り替えは、三方活栓１０ｂにより行うことができる。
以上のようにして、前記細胞分離フィルター１内の細胞分離材に希少細胞を捕捉させることができる。

次に、前記細胞分離フィルター１内の細胞分離材に捕捉された希少細胞を回収する際には、バッグ２４から回収溶液を、前記出口９を経て細胞分離フィルター１に導入し、希少細胞を前記細胞分離材から分離させて懸濁液として前記回収バッグ２０に回収する。
また、前記懸濁液の液量が多い場合には、例えば、回収バッグ２０を前記細胞分離システム１３から取り外して遠心分離処理することで希少細胞を沈降させてから、再度前記細胞分離システム１３に取り付け、回収バッグ２０内の上清の液体を前記回収バッグ等に回収された液体を回収する手段２１から排出してもよい。

前記細胞分離システムにおいて、前記細胞回収バッグは上記記載の各溶液の入口や出口に接続されることで、無菌的かつ閉鎖系で細胞を分離することが可能となる。また各バッグは使用後に切り離して使えることが好ましく、一般的に使用されている血液バッグのような形状をしていてもよいが、平板状のカートリッジ方式等でもよい。各バッグの形態としては、必要に応じて細胞培養可能なバッグ、凍結保存耐性を有するバッグ等を選択してもよい。

以上の細胞分離方法は、従来の遠心分離法に比して希少細胞に与えるストレスが非常に低いため、回収液に含まれる希少細胞はそのまま培養可能な状態となっている。

また、前記希少細胞は、凍結保存用チューブ等に入れた状態で、液体窒素やディープフリーザーなどの極低温下で凍結保存してもよい。
希少細胞を凍結保存する際は、凍結によるダメージから希少細胞を保護する目的で、前記回収液に凍結保護剤が添加される。添加される凍結保護剤の種類は特に制限されないが、ジメチルスルホキシド、デキストラン、アルブミン、ヒドロキシエチルスターチ等が使用できる。前記凍結保護剤は単独で使用してもよいが数種を組み合わせて使用してもよい。

前記凍結保存方法において、保存時の温度は特に限定されないが、希少細胞の活性の低下を防ぐために−１９６℃から−３０℃であることが好ましく、−１９６℃から−５０℃であることがより好ましく、−１９６℃から−８０℃であることがさらに好ましい。

凍結保存後の希少細胞の生存率は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましい。

本発明において回収される希少細胞としては、腫瘍細胞、幹細胞、内皮細胞、胎児細胞などが挙げられる。

以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１〜２７、比較例１〜４）
図１、２に示すように、内径２６ｍｍの円筒形の容器本体（２）に、直径２６ｍｍの丸型にカットした不織布（４）を充填し、前記容器本体（２）の上下の開口部にノズル付き押え部材（３）を差し込み、その上からキャップ（５）でネジ止めして細胞分離フィルター（１）を作製した。
なお、各実施例および比較例において使用した不織布については、樹脂の種類、不織布の製法、平均繊維径、圧縮エネルギーＷＣ、通気度、厚み、密度、通気度係数Ｍを表１に示す。また、細胞分離フィルターに充填した細胞分離材全体の厚み、充填密度、充填率、平均孔径を表１に示す。

次に、前記細胞分離フィルターを用いて、希少細胞と希少細胞以外の他の細胞（赤血球、血小板および白血球）（以下、夾雑細胞と表記する）の分離検討を行った。希少細胞は、モデル細胞として、ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ３、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９、ヒト脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＡＳＣ）を用いた。なお、希少細胞の回収率および夾雑細胞の除去率を明確に区別するため、希少細胞の回収率の検討では夾雑細胞が含まれない実験系とし、夾雑細胞の除去率の検討では希少細胞が含まれない実験系とした。

希少細胞の回収率の検討では、以下の手順で希少細胞を含む液体から希少細胞を回収した。
（１）希少細胞を懸濁した液体を、前記細胞分離フィルターの入口から通液させた。表２に、通液した希少細胞の種類と細胞数、細胞を懸濁させた溶液の種類と液量、細胞懸濁液の通液速度を示す。
（２）前記工程後に、洗浄溶液を前記細胞分離フィルターの入口から通液させた。表２に、洗浄溶液の種類と液量、洗浄溶液の通液速度を示す。
（３）前記工程後に、回収溶液を前記細胞分離フィルターの出口から通液させて、前記細胞分離フィルターの入口から希少細胞豊富分画を回収した。表２に、回収溶液の種類と液量を示す。
（４）前記工程で得られた希少細胞豊富分画中の希少細胞数を、細胞自動計測装置（ＧＥヘルスケア、ＣＹＴＯＲＥＣＯＮ）により計測した。

夾雑細胞の除去率の検討では、以下の手順で夾雑細胞を含む液体から夾雑細胞を除去した。
（１）ヒト末梢血を前記細胞分離フィルターの入口から通液させた。表２に、通液したヒト末梢血の液量と通液速度を示す。
（２）前記工程後に、洗浄溶液を前記細胞分離フィルターの入口から通液させた。表２に、洗浄溶液の種類と液量、洗浄溶液の通液速度を示す。
（３）前記工程後に、回収溶液を前記細胞分離フィルターの出口から通液させて、フィルター内に残存していた夾雑細胞を前記細胞分離フィルターの入口から回収し、夾雑細胞分画とした。表２に、回収溶液の種類と液量を示す。
（４）フィルターに通液する前の末梢血中の血球系細胞数、および前記工程で得られた夾雑細胞分画中の血球系細胞数を、血球計数装置（シスメックス、Ｋ−４５００）により計測した。ここで、血球系細胞とは、赤血球、白血球、血小板を表す。

希少細胞の回収率および夾雑細胞の除去率を表３に示す。希少細胞の回収率は、細胞分離フィルターから回収した細胞数をフィルターに通液した細胞数で割ることにより算出した。夾雑細胞の除去率は、細胞分離フィルターから回収した細胞数をフィルターに通液した細胞数で割った値（夾雑細胞回収率）を、１から引くことにより算出した。

表３に示す結果より、実施例１〜２７の細胞分離フィルターは、希少細胞の種類によらず、いずれも希少細胞の回収率が３５％以上と、比較例１〜４に比べて高くなっている。また、実施例１〜１７の結果から、白血球の除去率が５１％以上、赤血球の除去率が９８％以上、血小板の除去率が７９％以上と夾雑細胞も除去できていることがわかる。

実施例の中でも、細胞分離フィルターに充填されている細胞分離材の充填密度が１．０×１０^５ｇ/ｍ^３以上である実施例１〜４、６〜２３、２６、２７の細胞分離フィルターは、希少細胞回収率が４３％以上と高くなっており、加えて細胞分離材の通気度係数Ｍが３００以下となっている実施例１〜４、６〜１２、１５〜２３、２６、２７の細胞分離フィルターは希少細胞回収率が５１％以上とさらに高くなっていることがわかる。

さらに、希少細胞の一種である前立腺がん細胞株ＰＣ３の回収率の結果では、実施例１〜４、６、９、１１は、希少細胞の回収率が７０％以上と顕著に高く、かつ白血球の除去率が９０％以上、赤血球の除去率が９９％以上、血小板の除去率が９５％以上と高くなっており、希少細胞の濃縮効率が優れた細胞分離フィルターとなっている。

また、実施例２６、２７の細胞分離フィルターでは、がん細胞の種類によらず、回収率が６８％以上と高くなっていることから、様々ながん種のがん患者の検査診断に利用できる細胞分離フィルターであると考えられる。

一方、同じ不織布を使用している実施例１、２、実施例３、４、実施例５、６、実施例７、８、実施例９、１０、実施例１６、１７、実施例２０、２１のそれぞれの結果を比べると、いずれも細胞分離フィルターの充填密度、充填率を高く調整し、且つ細胞分離フィルターの平均孔径を小さくすることで、希少細胞の回収率が向上することがわかる。
また、実施例２３、２４、２５の結果から、圧縮エネルギーが１．２Ｊ／ｍ^２以下、密度が６．５×１０^４ｇ／ｍ^３以上、通気度係数Ｍが３００以下の不織布を用いて、充填密度を１．０×１０^５ｇ／ｍ^３以上に調整した実施例２３では、他の実施例２４、２５に比べて、希少細胞の回収率が有意に向上することがわかる。

一方、圧縮エネルギーＷＣが３．６Ｊ／ｍ^２である細胞分離材を用いた比較例１〜４の細胞分離フィルターでは、赤血球、血小板、白血球の除去率が高くなっているものの、希少細胞の回収率が１５．１％以下と顕著に低くなっている。

したがって、本発明の細胞分離材を充填した細胞分離フィルターを用いることで、腫瘍細胞や幹細胞などの希少細胞を選択的に効率よく回収することができることがわかる。

１ 細胞分離フィルター
２ 容器本体
３ ノズル付き押え部材
４ 細胞分離材
５ 蓋
６ ノズル口
７ シール材
８ 入口
９ 出口
１０ 三方活栓
１１ 希少細胞を含有する液体を収容しているバッグ
１２ 洗浄溶液を収容しているバッグ
１３ 細胞分離システム
２０ 細胞分離フィルター１から回収した液体を収容するバッグ（回収バッグ）
２１ 回収バッグ等に回収された液体を回収する手段（シリンジ等）
２３ 細胞分離フィルター１を通過した液体を収容するバッグ（廃液バッグ）
２４ 回収溶液を収容しているバッグ
Ｔ 細胞分離フィルター１に充填されている細胞分離材４全体の厚み
Ｄ 細胞分離フィルター１に導入された液体が流れる方向

Claims (18)

1. 希少細胞用の細胞分離フィルターであって、平均繊維径３μｍ以上、１５μｍ以下の繊維から構成され、且つ通気度が２５ｃｃ／ｃｍ²／ｓｅｃ以上、３５０ｃｃ／ｃｍ²／ｓｅｃ以下および圧縮エネルギーＷＣが０．０５Ｊ／ｍ ² 以上、２．７Ｊ／ｍ²以下である細胞分離材が、入口と出口を供えた容器に複数枚積層して充填されており、
   前記細胞分離材が不織布であり、
   前記細胞分離材の充填率（充填前の細胞分離材全体の厚み／充填後の細胞分離材全体の厚み）が１．５以上、１０以下であり、
   前記希少細胞が前立腺がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞または幹細胞であることを特徴とする細胞分離フィルター。
2. 前記細胞分離材の密度が６．５×１０⁴ｇ／ｍ³以上、１．５×１０⁵ｇ／ｍ³以下である請求項１に記載の細胞分離フィルター。
3. 前記細胞分離材の通気度（ｃｃ／ｃｍ²／ｓｅｃ）と前記細胞分離材の厚み（ｍｍ）との積である通気度係数Ｍが３６以上、３００以下である請求項１または２に記載の細胞分離フィルター。
4. 前記細胞分離材の厚みが０．１ｍｍ以上、３．５ｍｍ以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
5. 前記細胞分離材の圧縮エネルギーＷＣが０．０５Ｊ／ｍ²以上、１．２Ｊ／ｍ²以下である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
6. 前記不織布がスパンレース不織布、スパンボンド不織布またはメルトブローン不織布である請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
7. 前記細胞分離材を構成する繊維が、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル、ナイロンおよびポリウレタンからなる群より選ばれる少なくとも１種の合成高分子からなる請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
8. 前記細胞分離材を構成する繊維が、ポリエステルおよびポリオレフィン;レーヨンおよびポリオレフィン;ポリエステルおよびレーヨン；またはポリエステル、レーヨンおよびビニロンの合成高分子の組み合わせからなる請求項７に記載の細胞分離フィルター。
9. 前記細胞分離材が、圧縮された状態で充填されている請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
10. 前記細胞分離材の充填密度（充填されている細胞分離材全体の重量／充填されている細胞分離材全体の体積）が１．０×１０⁵ｇ／ｍ³以上、１．０×１０⁶ｇ／ｍ³以下である請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
11. 充填されている前記細胞分離材全体の平均孔径が１μｍ以上、７０μｍ以下である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター 。
12. 液体が流れる方向に対する、充填されている前記細胞分離材全体の厚みが１ｍｍ以上、３０ｍｍ以下である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
13. 希少細胞を含む液体を通液させることにより、希少細胞を捕捉し、且つ赤血球、白血球および血小板を除去するための請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞分離フィルター。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞分離フィルターに希少細胞を含む液体を通液させて、前記細胞分離材に希少細胞を豊富に含む分画を捕捉させる工程を含み、かつ前記希少細胞が前立腺がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞または幹細胞である細胞分離方法。
15. 前記液体が血液、骨髄、臍帯血、月経血、腹膜液、胸膜液、リンパ液、尿、唾液または組織抽出物である請求項１４に記載の細胞分離方法。
16. 前記液体が血液、臍帯血または月経血であり、下記（ａ）〜（ｃ）工程を含有する請求項１４または１５に記載の細胞分離方法。
    （ａ）希少細胞を含む液体を前記細胞分離フィルターの入口から通液させる工程
    （ｂ）前記（ａ）工程後に洗浄溶液を前記細胞分離フィルターの入口から通液させる洗浄工程
    （ｃ）前記（ｂ）工程後に回収溶液を前記細胞分離フィルターの出口から通液させて、前記細胞分離フィルターの入口から希少細胞豊富分画を回収する希少細胞回収工程
17. 前記（ａ）工程および（ｂ）工程において前記細胞分離フィルターの出口から通過させた細胞分画（通過細胞分画）を、前記細胞分離フィルターの入口から複数回通液し、さらに前記（ｃ）工程を実施することにより、通過細胞分画中に混入した希少細胞を含む分画を再回収する工程を有する請求項１６に記載の細胞分離方法。
18. 前記（ｃ）工程において回収した希少細胞が培養可能である請求項１６または１７に記載の細胞分離方法。
    

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