KR20090073659A - 신규2'-데옥시-2'-[18Ｆ]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는유전자 영상용 조영제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 유전자 영상용 조영제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물은 C-11보다 반감기가 상대적으로 긴 플루오린-18을 도입하여 PET 영상을 충분한 시간 동안 관찰할 수 있고, HSV1-TK 유전자가 발현된 세포주에 특정적으로 작용하여 고섭취율을 나타내며, 자연계에 존재하는 D form보다 HSV1-TK 유전자 유무에 따른 섭취비가 높아 HSV-TK 유전자 영상용 조영제로 유용하게 사용될 수 있다.

2'-데옥시-2'-[18F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실, L-18FAMU, PET, 영상, 리포터유전자, HSV1-TK

Description

신규 2'-데옥시-2'-[18Ｆ]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 유전자 영상용 조영제{Novel 2'-deoxy-2'-[18F]fluoro-5-methyl-1-β-L-arabinofuranosyluracil compound, preparation method thereof and contrast agent for imaging of gene expression containing the same}

본 발명은 신규 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 유전자 영상용 조영제에 관한 것이다.

의료용 영상 기기는 비침습적으로 생체 내부를 영상 형태로 나타내 정확한 질병진단에 필요한 정보를 제공한다. 현재 병원에서 널리 사용되는 단층영상 획득 기기는 X-선 전산화단층촬영(computed tomography, CT), 자기공명영상(magnetic resonance imaing, MRI)과 핵의학 영상 기기를 들 수 있다. CT와 MRI는 인체의 상 세한 해부학적 영상을 제공하는 반면, 방사성동위원소를 이용하는 핵의학 영상은 인체 내 생리학적 현상을 나타내는 영상을 제공한다.

핵의학 영상 기기 중, 양전자방출단층촬영기(positron emission tomography, PET)는 연구와 진단 대상이 되는 생체 내에 양전자를 방출하는 방사성의약품을 정맥주사 또는 흡입으로 주입한 후 이물질의 체내 분포를 영상화한다. PET은 여러 가지 생리적, 병리적 기본이 되는 생체 내 생화학적 현상을 비침습적으로 간단하고 정확하게 영상화하고 정량화할 수 있는 도구로써 사용된다. PET 영상을 이용하여 혈류량, 기저대사율 및 합성율과 같은 생화학적 현상을 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 신경수용체와 전달체 농도 그리고 더 나아가 유전자의 영상화도 가능하다. 이러한 생화학적 현상의 영상화로 PET 영상은 기능영상을 제공하며, 이것은 CT나 MRI로 얻어지는 형태학적 영상과 구별된다.

PET 스캐너를 이용하여 인체의 기능영상을 획득하기 위해서는 의료용 사이클로트론에서 생성된 양전자 방출체를 표지하여 합성한 방사성의약품을 환자에게 주입하고, 원형형태의 PET 스캐너에 움직임이 없도록 위치시킨다. 원형 스캐너는 양전자가 소멸되어 방출되는 감마선을 검출하는 검출기와 신호처리 시스템, 동시계수 회로(coincidence circuit) 등으로 구성되어 있으며, PET의 제어, 영상재구성, 분석, 표현은 컴퓨터를 사용하여 시행한다. PET 영상은 방사성동위원소를 특정한 생리 현상의 추적자로 사용하여 이들의 분포나 활동에 관한 정보를 시간에 대한 함수로 측정하여 인체의 생리학적, 생화학적 과정을 검사하는데 유용하게 사용된다.

PET을 이용한 임상응용 분야는 크게 신경학, 종양학, 심장학 등으로 분류할 수 있으며, 앞에서 서술한 것처럼 생체 내 생화학적 현상을 평가할 수 있으므로 질병의 생물학적 현상규명이나 난치성 뇌신경계 질환, 악성종양의 조기진단과 치료방법 결정 및 예후 평가, 심근 생존능 검사 등에 큰 도움을 주고 있다. 따라서 국내 뿐만 아니라 세계적으로 PET에 대한 관심과 필요성이 점차 증가하고 있으며 PET 도입과 이용도 활발하게 진행 중에 있다.

또한, 최근에는 분자(유전자) 영상법이 개발되고 있다. 상기 분자 영상법은 세포내 분자 유전자 수준의 변화를 영상화하는 방법으로, 흔히 사용하는 소위 리포터(reporter) 유전자 영상이 대표적이다.

리포터 유전자 영상은 외부로부터 세포 내로 옮겨 놓은 검출목적의 외인성(exogenous) 유전자가 발현하는 것을 영상화하는 것을 말한다. 리포터 유전자란, 일정한 염기서열을 가진 DNA로서 이를 세포에 넣으면 손쉽게 검출되는 단백질을 생성하는 유전자를 말한다. 상기 리포터 유전자는 발현정도를 쉽고 빠르고 정확하게 정량할 수 있어 유전자와 관련된 생명공학 연구에서 널리 활용되는 실험도구이다.

이러한 리포터 유전자 영상에 사용되는 유전자로서 단순헤르페스 바이러스 1티미딘키나제(Herpes simple virusl thymidine kinase:HSV1-TK) 유전자가 주로 연구되고 있다.

상기 HSV1-TK 유전자는 GCV(ganciclovir)를 CGV-TP(triphosphorylates GCV)로 변형시킴으로서 종양세포를 살상할 수 있는 자살 유전자로서, 상기 유전자를 종 양세포 내로 전달하여 종양을 치료할 수 있을 것으로 기대되는 치료 유전자 중의 하나이다. 유전자 치료를 위하여 대상 조직 또는 특이적인 장기에 유전자 전달할 때 임상에 적용할 수 있는 비침습적 방법으로 치료 유전자 발현 유무를 평가하는 것은 매우 중요하다. 전달된 치료 유전자를 비침습적 방법으로 평가할 수 있다면, 시간경과에 따른 치료 유전자의 발현 정도, 발현 위치, 그리고 발현 기간 등을 실제 임상에서 손쉽게 모니터링하여 새로운 유전자 치료법의 임상적 유용성을 평가하는 중요한 수단이 될 수 있을 것이다.

HSV1-TK 유전자에 적합한 리포터 기질(reporter substrate)은 바이러스 감염 치료제를 응용하여 개발되어 왔으며, 예를 들면 9-[(2-히드록시에톡시)메틸]구아닌(ACV; acyclovir,ACV), 9-[(1,3-디히드록시-2-프로폭시)메틸]구아닌(DHPG; ganciclovir), 1-(2-데옥시-2-플루오로-β-D-아라비노퓨라노실)-5-메틸 우라실(D-FMAU) 등이 단순 헤르페스 바이러스 감염치료에 효과적인 약물들로 알려져 있으며 동시에 유전자 치료에 사용할 수 있는 전구약물로서 연구되어 왔다.

HSV1-TK 효소가 있는 세포에 데옥시티미딘 유사물질 추적자를 투여하면 능동 섭취후 인산화됨으로써 상기 추적자가 세포를 빠져나오지 못하고 축적되는데, 이러한 현상을 이용하여 현재 각종 GCV 우라실(ganciclovir uracil) 유도체에 포지션 방출 핵종을 표지하여 HSV1-TK 유전자의 발현을 영상화하고 있다. 최근에는 보다 값비싸고 단순한 나트륨/요오드 심포터(sodium/iodide symporter)에 의한 분자 영상법이 개발되고 있다.

분자 유전자 영상법은 핵의학영상 의외에도 광영상(optical imaging), MRI 영상이 있다.

광영상으로 형광(fluorescence), 발광(luminescence)이 대표적이나, 투과력이 한계가 있어 인체에서 사용되기에는 어려움이 있다.

MRI 영상으로는 종양중에 트란스페린(transferrin) 수용체가 과잉발현된 경우가 많음에 착안하여 트란스페린 수용체 증가에 의해 축적된 철의 NMR신호를 영상화할 수 있다. 이들은 철이 트란스페린 수용체 수를 낮추는 음성 되먹임이 없도록 특수철을 뇌암세포와 섞고 NMR로 트란스페린 수용체 발현도를 측정하는데 성공하였다. 그러나 체내에서는 추적용 특수 철과 체내 철이 트란스페린에 경쟁하기 때문에 평가의 정확성이 문제된다.

최근에 합성적 L-배열의 뉴클레오사이드로서 HIV, B형 간염 바이러스(HBV) 및 확실한 암의 형태에 대응하는 효능 있는 화학 요법제들이 보고되고 있다. 표지된 피리미딘 뉴클레오사이드 유사체들은 항암과 항바이러스 약품으로 가능하다.

이중 C-11로 표지된 2'-데옥시-2'-플루오로-5-[¹¹C-메틸]-1-β-D-아라비노퓨라노실우라실([¹¹C]-FMAU)은 양전자 방출 단층 촬영술(positron emission tomography)에 의해 세포증식의 방사성 추적자로 개발되었다. 그러나, C-11 표지된 방사선 의약품은 짧은 반감기(t_{1 /2} = 20 분)를 가지므로 화합물의 의학적 적용에 한계를 보였다.

이에, 본 발명자들은 유전자 영상에 효과적으로 적용할 수 있도록 반감기가 길고, HSV-TK 유전자가 발현된 세포주에 특정적으로 작용하여 고섭취율을 나타내는 화합물을 제조하기 위하여 연구하던 중, 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 합성하고, 상기 화합물이 반감기가 길고, HSV-TK 유전자가 발현된 세포주에 특정적으로 작용하여 고섭취율을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 포함하는 유전자 영상용 조영제를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 포함하는 유전자 영상용 조영제를 제공한다.

본 발명에 따른 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물은 C-11보다 반감기가 상대적으로 긴 플루오린-18을 도입하여 PET 영상을 충분한 시간 동안 관찰할 수 있고, HSV-TK 유전자가 발현된 세포주에 특정적으로 작용하여 고섭취율을 나타내며, 자연계에 존재하는 D form보다 HSV-TK 유전자 유무에 따른 섭취비가 높아 HSV-TK 유전자 영상용 조영제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2'-데옥시-2'-[¹⁸Ｆ]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물을 제공한다.

본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU 화합물은 L-리보퓨라노즈 배열에 플루오린-18이 도 입되고 피리미딘 염기와 커플링된 뉴클레오사이드이다. 종래 C-11 표지된 방사선 의약품은 짧은 반감기(t_{1 /2}=20분)로 인하여 의학적 적용에 한계를 보였으나, 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU 화합물은 반감기가 긴 플루오린-18(t_{1 /2}=110분)을 도입시켜 세포 증식 영상화, 리포터 유전자 발현 등 의학적 적용에 효과적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 표시되는 바와 같이,

유기용매 하에서 화학식 2의 화합물에 무수 트리플루오로 메탄술포닐을 반응시켜 화학식 3의 트리벤조일 트리플레이트당 화합물을 제조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조된 화학식 3의 화합물에 플루오린-18을 도입시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 제조된 화학식 4의 화합물을 유기용매 하에서 HBr 및 무수초산과 반응시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 3);

상기 단계 3에서 제조된 화학식 5의 화합물을 실릴화된 티민(6)과 반응시켜 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 4); 및

상기 단계 4에서 제조된 화학식 7의 화합물을 가수분해시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계(단계 5)를 포함하는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.

먼저, 단계 1은 유기용매 하에서 화학식 2의 화합물에 무수 트리플루오로 메탄술포닐을 반응시켜 화학식 3의 트리벤조일 트리플레이트당 화합물을 제조하는 단계이다.

상기 단계에서 무수 트리플루오로 메탄술포닐은 이후 방사성 플루오린과의 결합시 이탈이 용이하도록 트리플레이트 이탈기를 제공한다.

이때, 사용되는 유기용매로는 건조 피리딘, 무수 트리플루오로 메탄술포닐, 메틸렌클로라이드 등을 사용할 수 있으며, 상기 화학식 2의 화합물과 무수 트리플루오로 메탄술포닐의 혼합비율은 1:1~1.5 mol, 더욱 바람직하게는 1:1.1 mol 인 것이 바람직하다.

다음으로 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 화학식 3의 화합물에 플루오린-18을 도입시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계이다.

상기 화학식 3의 화합물에 플루오린-18을 도입시키는 방법은 제한되지 않으나, 하기의 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 4% TBAHCO₃를 넣은 용액을 사용하여 F-18 플루오라이드를 QMA 카트리지에 전개시킨 후, 전개된 용매를 아세토니트릴을 사용하여 완전히 제거한다. 이후, 반응기에서 플루오린-18이 함유된 아세토니트릴과 트리플레이트 전구체를 반응시킨 후, 반응하지 않은 플루오린-18은 두 개의 실리카 Sep-pak에서 에틸 아세테이트를 전개용매로 사용하여 제거한다. 이러한 방법에 의해 생성된 플루오린-18이 도입된 화학식 4의 화합물을 일반적인 플루오린(플루오린-19)이 치환된 인증 화합물과 함께 역상 HPLC 분석 시스템에 넣어 분석함으로써 확인할 수 있다.

다음으로 단계 3은 상기 단계 2에서 제조된 화학식 4의 화합물을 유기용매 하에서 HBr 및 무수초산과 반응시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계이다.

구체적으로 상기 단계는 이후 티민과 커플링반응을 시키기 위하여 상기 화학식 4의 화합물에서 티민이 치환될 자리를 브롬화시키는 단계이다.

상기 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 브롬화 방법을 이용할 수 있다. 일례로 상기 화학식 4를 1,2-디클로로에탄 용매 하에서 HBr 및 무수초산과 반 응시켜 화학식 5의 브로모 당 중간체를 제조할 수 있다. 생성된 화합물은 플루오린-18 대신 플루오린-19가 치환된 인증 화합물과 함께 역상 HPLC 분석 시스템에 넣어 분석함으로써 확인할 수 있다.

다음으로 단계 4는 상기 단계 3에서 제조된 화학식 5의 화합물을 티민(6)과 반응시켜 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계이다.

구체적으로, 통상적인 유기화학 반응에 의해 상기 단계 3에서 제조된 화학식 5의 화합물을 용매로서 클로로포름을 사용하여 실릴화된 티민과 반응시켜 화학식 7의 화합물을 제조할 수 있다. 이때, 화학식 5의 화합물과 티민의 혼합비는 1:2~2.5 mol 인 것이 바람직하며, 1:2.2 mol인 것이 더욱 바람직하다. 만일, 화학식 5의 화합물과 티민의 혼합비가 1:2 mol 미만이면 생성물의 수율이 낮아지는 문제가 있고, 1:2.5 mol을 초과하면 티민이 남게 된다.

생성된 화합물은 플루오린-18 대신 플루오린-19가 치환된 인증 화합물과 함께 역상 HPLC 분석 시스템에 넣어 분석함으로써 확인할 수 있다.

다음으로 단계 5는 상기 단계 4에서 제조된 화학식 7의 화합물을 가수분해시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계이다.

상기 단계 4에서 제조된 화학식 7의 벤조일기는 NaOMe를 첨가하여 반응시킨 후 메탄올 중의 HCl로 중화시킴으로써 가수분해되어 히드록시기로 변환되고, 이로 써 본 발명에 따른 화학식 1의 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물을 제조할 수 있다.

생성된 화합물은 플루오린-18 대신 플루오린-19가 치환된 인증 화합물과 함께 역상 HPLC 분석 시스템에 넣어 분석함으로써 확인할 수 있다.

나아가, 본 발명은 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 포함하는 유전자 영상용 조영제를 제공한다.

이때, 사용되는 유전자는 HSV1-TK 유전자인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 야생 MCA 세포주와 HSV1-TK 유전자가 발현된 MCA-TK 세포주에 투여한 후, 시간에 따른 방사성 동위원소에 대한 세포 섭취율을 측정한 결과, HSV1-TK 유전자가 발현된 MCA-TK 세포주에서는 시간이 지남에 따라 섭취율이 증가하는 반면, 야생 MCA 세포주에서는 섭취율이 거의 없음을 확인하였다.

또한, PET 영상 실험에 있어서도 HSV1-TK가 발현된 세포주를 종양에 이식한 후, 2~3주 후에 본 발명에 따른 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 투여하고 PET 영상으로 측정한 결과, HSV1-TK가 발현된 세포주가 이식된 종양 부위는 강한 섭취영상을 보였으나, HSV1-TK가 발현되지 않은 종양 부위는 일반 조직과 비슷한 섭취를 나타내었다. 나아가, HSV1-TK의 발현 유 무에 따른 종양 부위의 섭취 비율(TK/MCA ratio)을 자연계에 나타나는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-D-아라비노퓨라노실우라실 화합물(D-¹⁸FMAU)과 비교하면, D-¹⁸FMAU는 3.28을 나타낸 반면, 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU는 이보다 1.27배 높은 수치인 4.16을 나타내었다.

따라서, 본 발명에 따른 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물은 HSV1-TK가 발현된 세포주에서 강한 섭취영상을 나타내므로 HSV-TK 유전자 영상용 조영제로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참고예 > 2'- 데옥시 -2'-[ ¹⁹ F] 플루오로 -5- 메틸 -1-β-L- 아라비노퓨라노실우라 실의 제조

본 발명에 따른 실시예 1의 화합물의 생성을 확인하기 위한 목적으로 ¹⁹F가 도입된 표제 화합물을 다음과 같은 방법으로 합성하였다.

하기 반응식 2에 표시되는 바와 같이, DMF(0.8 mL) 및 메틸렌클로라이드(4 mL) 하에서 1,3,5-트리-O-벤조일-α-L-리보퓨라노즈(2)(400 mg)에 설포닐클로라이드(0.14 mL) 를 넣고 3 시간 동안 교반한 후, 0 ℃에서 이미다졸(600 mg)을 천천히 넣고 20 시간 교반하여 이미다졸 유도체(3')를 제조하였다. 다음으로 상기 이미다졸 유도체(3')는 70 ℃에서 에틸아세테이트와 트리에틸아민-3하이드로플루오라이드 6~7 당량과 반응시켜 1,3,5-트리-O-벤조일-2-데옥시-2-플루오로-α-L-리보퓨라노즈(4')를 제조하였다. 이후, 상기 1,3,5-트리-O-벤조일-2-데옥시-2-플루오로-α-L-리보퓨라노즈(4')(1.14 g)를 상온에서 24시간 동안 33% HBr/AcOH(2.21 mL)과 반응시켜 1-α-브로모 당 중간체(5')를 제조하였으며, 상기 1-α-브로모 당 중간체(5')(1.03 mg)를 클로로포름(15 mL) 하에서 비스(O-트리메틸실릴)티민(1.32 g)과 80 ℃에서 24시간 동안 커플링 반응시켜 2'-데옥시-2'-[¹⁹F]플루오로-3',5'-디-O-벤조일-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실 화합물(7')을 얻었다(수율: 65%). 이 중 벤조일기를 메탄올 중의 암모니아 가스를 이용하여 가수분해하여, 그 결과 목적화합물인 2'-데옥시-2'-[¹⁹F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-[¹⁹F]FMAU) 화합물을 85%의 수율로 수득하였다[Du, J.; Choi, Y.; Lee, K.; Chun, B. K.; Hong, J. H.; Chu, C. K. Nucleosides & Nucleotides 1999, 18, 187-195].

(상기 반응식에서 R은 이미다졸이고, F는 [¹⁹F]를 나타낸다.)

< 실시예 > 2'- 데옥시 -2'-[ ¹⁸ Ｆ] 플루오로 -5- 메틸 -1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실(L- FMAU ) 화합물의 제조

단계 1: 2- O -[( 트리플루오로메틸 ) 술포닐 ]-1,3,5-트리- O - 벤조일 -α-L- 리보퓨라노즈의 제조

0 ℃에서 건조 피리딘(5 mL)에 1,3,5-트리-O-벤조일-α-L-리보퓨라노즈(100 mg, 0.216 mmol)가 용해된 용액에 무수 트리플루오로메탄술포닐(40 L, 0.237 mmol)을 적가하였다. 상기 혼합 용액을 상온에서 10시간 동안 교반하였고, 반응 혼합 용액을 0 ℃의 물에 부었다. 물 층에 메틸렌클로라이드(10 mL×2)를 첨가하여 추 출하였다. 상기 추출액을 물(10 mL×2), 3N H₂SO₄(20 mL), 포화 NaHCO₃(20 mL) 및 물(20 mL)로 세척하고, 건조하고, 여과하고, 증발하여 노란색의 시럽을 얻었다.

상기 시럽을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : 헥산 = 1 : 3)로 정제하여 노란 시럽인 2-O-[(트리플루오로메틸)술포닐]-1,3,5-트리-O-벤조일-α-L-리보퓨라노즈(수득률:85%)를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃): 4.70 (m, 2H, 5'-H), 4.87 (q, 1H, 4'-H), 5.55 (dd, 1H, 3'-H), 5.79 (q, 1H, 3'-H), 6.88 (d, 1H, 1'-H), 7.40-7.52 (m, 6H, Ar-H), 7.60-7.70 (m, 1H, Ar-H), 8.02-8.17 (m, 6H, Ar-H)

단계 2: 2- 데옥시 -2-[ ¹⁸ F] 플루오로 -1,3,5-트리- O - 벤조일 -α-L- 아라비노퓨라노즈의 제조

메탄올(1.0 mL)에 4% TBAHCO₃(50 L)를 넣은 용액을 사용하여 F-18 플루오라이드(11.0 GBq, 0.5 mL)를 QMA 카트리지(SPE 카트리지 Chromafix 30-PS-HCO3)에 전개시켰다. 이후 전개 용매를 아세토니트릴(0.5 mL×3)을 사용하여 공비증발에 의해 제거하였다.

반응기에 아세토니트릴(700 L)과 상기 단계 1에서 제조한 트리플레이트 전구체(2-O-[(트리플루오로메틸)술포닐]-1,3,5-트리-O-벤조일-α-L-리보퓨라노즈)(15 mg)을 넣고, 80 ℃에서 25분간 교반하였다. 이후 상기 반응 혼합 용액을 실온으로 냉각한 후 아세토니트릴은 제거하였다. 다음으로 에틸 아세테이트를 첨가하고 반응하지 않은 F-18은 두개의 실리카 Sep-pak(light)으로 제거하였다. 이후 용액을 아르곤으로 제거하여 2-데옥시-2-[¹⁸F]플루오로-1,3,5-트리-O-벤조일-α-L-아라비노퓨라노즈를 제조하였다. 상기 생성물은 도 1에 나타난 바와 같이 역상 HPLC 분석 시스템에 의해 종래 알려진 2-데옥시-2-[¹⁹F]플루오로-1,3,5-트리-O-벤조일-α-L-아라비노퓨라노즈와 비교함으로써 확인되었다(분석 조건: 컬럼: RP-18, 10 m, 3.9 mm×300 mm; 전개용매: CH₃CN/H₂O=60/40[v/v]; 유속: 1.0 mL/min; →: 인증화합물). 남은 생성물은 추가적인 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

단계 3: 2- 데옥시 -2-[ ¹⁸ F] 플루오로 -3,5-디- O - 벤조일 -α-L- 아라비노퓨라노실 브로마이드의 제조

상기 단계 2에서 제조된 2-데옥시-2-[¹⁸F]플루오로-1,3,5-트리-O-벤조일-α-L-아라비노퓨라노즈를 1,2-디클로로에탄(0.4 mL)에 33 중량% HBr 및 무수초산(0.1 mL)을 용해시킨 용액에 넣고 80 ℃에서 10분 동안 교반하였다. 이후, 상기 반응 용액을 실온으로 냉각한 후 무수초산을 톨루엔(1 mL)을 사용하여 공비 증발시켜 제거하여 2-데옥시-2-[¹⁸F]플루오로-3,5-디-O-벤조일-α-L-아라비노퓨라노실 브로마이드를 제조하였다. 남은 생성물은 추가적인 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

단계 4: 2'- 데옥시 -2'-[ ¹⁸ F] 플루오로 -3',5'-디- O - 벤조일 -5- 메틸 -1-β-L- 아라비노퓨라노실우라실의 제조

클로로포름(0.7 mL)에 용해된 실릴레이션 티민(75-85 mol, 8-9 equiv.) 용액에 상기 단계 3에서 제조한 2-데옥시-2-[¹⁸F]플루오로-3,5-디-O-벤조일-α-L-아라비노퓨라노실 브로마이드를 첨가하였다. 상기 혼합 용액을 110 ℃에서 45분 동안 교반시키고 난 후 실온으로 냉각시켰다. 이후, 0% 메탄올/메틸렌클로라이드(2.5 mL)를 이용하여 실리카 플러스 Sep-pak에 상기 용액을 전개시켰다. 전개된 용액을 아르곤 가스 하에서 증발시켜 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-3',5'-디-O-벤조일-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실을 제조하였다. 상기 생성물은 도 2에 나타난 바와 같이, 역상 HPLC 분석 시스템에 의해 종래 알려진 2'-데옥시-2'-[¹⁹F]플루오로-3',5'-디-O-벤조일-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실과 비교함으로써 확인되었다(분석 조건: 컬럼: RP-18, 10 m, 3.9 mm×300 mm; 전개용매: CH₃CN/H₂O=5/5(0분) ~ 7/3(20분)[v/v]; 유속: 1.0 mL/min; →: 인증화합물). 생성물은 추가적인 정제없이 다음 단계에 사용하였다.

단계 5: 2'- 데옥시 -2'-[ ¹⁸ F] 플루오로 -5- 메틸 -1-β-L- 아라비노퓨라노실우라실 의 제조

NaOMe 용액(0.5M NaOMe, 0.5 mL)에 상기 단계 4에서 제조한 2'-데옥시-2'- [¹⁸F]플루오로-3',5'-디-O-벤조일-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실을 첨가하였다. 상기 반응 용액을 80 ℃에서 10분간 교반한 후 실온으로 냉각시켰다. 메탄올 중의 2N HCl로 중화시키고 난 후 아르곤 가스를 이용해 용매를 증발하였다. 잔사를 5% 아세토니트릴/물로 희석하고 0.45m HPLC 필터로 정제하여 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실을 수득하였다. 상기 생성물은 도 3에 나타난 바와 같이, 역상 HPLC 분석 시스템에 의해 종래 알려진 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(제조예)과 비교함으로써 확인되었다(분석 조건: 컬럼: RP-18, 10 m, 3.9 mm×300 mm; 전개용매: CH₃CN/H₂O=8/92[v/v]; 유속: 1.0 mL/min; →: 인증화합물).

α와 β 아노머들을 포함하는 혼합물은 C18 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하였으며, 구체적으로는 Xterra-C18 컬럼(7.9×250 mm)을 사용하고, 5% 아세토니트릴/물 혼합용매를 전개용매로 이용하여 정제하였다(유속:3.0 mL/min).

이에 의해 목적화합물인 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(β form)은 도 4에 나타난 바와 같이, 12-14분에 수득하였으며, 이때, 방사능화합물의 순도는 98% 이상이었다(분석 조건: 컬럼: RP-18, 10 m, 3.9 mm×300 mm; 전개용매: CH₃CN/H₂O=5/95[v/v]; 유속: 1.0 mL/min).

<분석>

본 발명에 따라 실시예에서 제조된 L-[¹⁸F]FMAU 화합물과 제조예에 따라 제조된 L-[¹⁹F]FMAU 화합물을 역상 HPLC 분석 시스템에 넣고 비교분석하였다. 이는 방사성원소를 갖는 표지화합물은 동위원소 종류가 많으나 화학식의 차이가 거의 나타나지 않아 일반적 분석으로 확인이 어렵기 때문이다.

그 결과, 본 발명에 따른 L-[¹⁸F]FMAU 화합물은 제조예인 L-[¹⁹F]FMAU 화합물보다 검출시간이 더 짧으므로 L-[¹⁹F]FMAU 화합물과 구별됨을 알 수 있다.

< 비교예 >

2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-D-아라비노퓨라노실우라실(D-¹⁸FMAU)을 사용하였다.

< 실험예 1> 방사성 동위원소의 세포섭취율 측정

야생 MCA 세포주와 HSV1-TK 유전자가 발현된 MCA-TK 세포주를 6웰 플레이트의 각 웰 5×10⁵씩 접종하였다. 18 시간 후 각 웰에 실시예에서 제조한 L-¹⁸FMAU, 비교군으로서 D-¹⁸FMAU를 1 μCi씩 첨가한 후, 각 시간대별(15분, 30분, 60분, 120분, 240분)로 배양하여 각각 배양액을 제거하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포 는 감마 카운터(gamma counter)를 이용하여 방사성동위원소의 세포섭취율을 확인하였다. 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5는 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU를 첨가하여 배양한 MCA 세포주와 MCA-TK에서의 시간에 따른 L-¹⁸FMAU의 섭취율을 나타내며, 도 6은 비교예인 D-¹⁸FMAU를 첨가하여 배양한 MCA 세포주와 MCA-TK에서의 시간에 따른 D-¹⁸FMAU의 섭취율을 나타낸다.

도 5에 나타낸 바와 같이, L-¹⁸FMAU를 첨가하여 배양한 MCA-TK 세포주에서 시간에 따라 섭취율이 점점 증가함을 나타내었다. 반면에 야생형인 MCA 세포주에서는 매우 낮은 섭취율을 나타냈다.

도 6에 나타낸 바와 같이, D-¹⁸FMAU 처리한 MCA-TK 세포주에서도 섭취율이 증가하는 양상을 보인 반면, MCA 세포주에서는 매우 낮은 섭취율을 나타냈다.

실험군과 비교군의 MCA-TK/MCA 섭취비율(TK/MCA ratio)을 각 시간대별로 계산한 결과를 표 1에 나타내었다.

구분	시간(분)
	15	30	60	120	240
L-18FMAU	39.12	42.86	46.89	77.38	103.42
D-18FMAU	419.74	357.83	146.63	121.98	70.73

표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU는 시간이 지나감에 따라 TK/MCA 섭취비율이 증가하는 반면, 비교군인 D-¹⁸FMAU 투여시에는 처음에는 TK/MCA 섭취비율이 419.74로서 매우 높았으나, 시간이 지남에 따라 TK/MCA 섭취비율이 감소되는 것을 알 수 있으며, 240분 후에는 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU 투여군이 D-FMAU 투여군보다 더 높은 TK/MCA 섭취비율을 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물은 HSV1-TK가 발현된 세포주에서 높은 섭취비율을 나타내므로 HSV-TK 유전자 영상용 조영제로서 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 2> PET 영상측정

본 발명에 따른 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU)이 PET 영상 조영제로서 작용할 수 있는지 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저 종양을 발생시키기 위하여, HSV1-TK 발현 세포 1× 10⁶개를 Balb/c^{nu / nu} 마우스의 어깨피하에 접종하였다. 접종한 지 2~3주 후, 종양의 성장을 확인하고, 상기 마우스의 꼬리정맥으로 방사성동위원소가 표지된 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU 또는 비교군으로서 D-¹⁸FMAU를 250 μCi씩 투여하였다. 이후, 30분이 지난 후 20분 동안 microPET-R4를 이용하여 영상을 얻고 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, L-¹⁸FMAU, D-¹⁸FMAU 모두 MCA 종양부위에서는 일반조직과 비슷한 섭취가 보이고 MCA-TK 종양부위에서는 강한 섭취영상을 보임을 알 수 있다.

다음으로, microPET에서 얻은 영상의 MCA 종양부위와 MCA-TK 종양부위를 일정크기의 픽셀(pixel) 수로 정하여 종양부위별로 관심영역(ROI)을 각각 설정하여 관심영역 내의 픽셀들의 평균 수치를 구하고, 영상전에 얻은 실험동물의 몸무게 및 측정한 투여 방사능 농도를 이용하여 관심영역 내의 픽셀의 방사능 수치를 계산하여 MCA, MCA-TK의 %ID(injected dose/gram tissue)로 표현한 후, 두 부위의 비율(TK/MCA ratio)로써 표 2에 나타내었다.

구분	%ID/g		TK/MCA 비율	L-18FMAU/D-18FMAU비율
	MCA	MCA-TK
L-18FMAU	1.01	4.18	4.16	1.27
D-18FMAU	3.53	11.57	3.28

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU를 투여한 마우스에서 MCA 종양부위는 1.01%ID/g, MCA-TK 종양부위는 4.18%ID/g을 나타냈다. 또한 비교군인 D-¹⁸FMAU를 투여한 군에서는 MCA이 3.53%ID/g, MCA-TK가 11.57%ID/g의 값을 나타냄으로써 MCA 종양부위의 섭취와 MCA-TK 종양부위의 섭취 모두 D-FMAU에서 높게 나타남을 알 수 있다. 그러나, MCA, MCA-TK의 %ID/g을 비율(TK/MCA ratio)로써 계산한 결과, 비교군인 D-¹⁸FMAU는 3.28을 나타내었고, 본 발명에 따른 L-FMAU는 이보다 1.27배 높은 수치인 4.16을 보였다.

따라서, 본 발명에 따른 L-¹⁸FMAU은 종양 부위에 선택적으로 작용하고, 섭취량도 크기 때문에, HSV1-TK 발현 세포주를 이용한 동물영상을 얻는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 L-¹⁸FMAU를 제조하기 위해 제조된 중간체를 나타내는 HPLC 그래프이다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 L-¹⁸FMAU를 제조하기 위해 제조된 중간체를 나타내는 HPLC 그래프이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 L-¹⁸FMAU를 나타내는 HPLC 그래프이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 L-¹⁸FMAU(β form)를 나타내는 HPLC 그래프이다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 L-¹⁸FMAU를 첨가하여 배양한 MCA 세포주와 MCA-TK에서의 시간에 따른 L-¹⁸FMAU의 섭취율을 나타내는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일비교예에 따른 D-¹⁸FMAU를 첨가하여 배양한 MCA 세포주와 MCA-TK에서의 시간에 따른 D-¹⁸FMAU의 섭취율을 나타내는 그래프이다.

도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 L-¹⁸FMAU, D-¹⁸FMAU를 MCA 또는 MCA-TK 종양부위에 투여시 섭취율을 나타내는 PET 영상이다.

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 나타내는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물:

   [화학식 1]

   

   .
2. 하기 반응식 1에 표시되는 바와 같이,

   유기용매 하에서 화학식 2의 화합물에 무수 트리플루오로 메탄술포닐을 반응시켜 화학식 3의 트리벤조일 트리플레이트당 화합물을 제조하는 단계(단계 1);

   상기 단계 1에서 제조된 화학식 3의 화합물에 플루오린-18을 도입시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 2);

   상기 단계 2에서 제조된 화학식 4의 화합물을 유기용매 하에서 HBr 및 무수초산과 반응시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 3);

   상기 단계 3에서 제조된 화학식 5의 화합물을 실릴화된 티민과 반응시켜 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 4); 및

   상기 단계 4에서 제조된 화학식 7의 화합물을 가수분해시켜 화학식 1의 화합 물을 제조하는 단계(단계 5)를 포함하는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물의 제조방법:

   [반응식 1]

   

   .
3. 제2항에 있어서, 상기 단계 1의 유기용매로는 건조 피리딘, 무수 트리플루오로 메탄술포닐 또는 메틸렌클로라이드를 사용하는 것을 특징으로 하는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물의 제조방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 단계 1의 화학식 2의 화합물과 무수 트리플루오로 메탄술포닐의 혼합비율은 1:1~1.5 mol인 것을 특징으로 하는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물의 제조방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 단계 2의 플루오린-18의 도입은 TBAHCO₃를 넣은 용액을 사용하여 F-18 플루오라이드를 QMA 카트리지에 전개시킨 후, 전개된 용매를 아세토니트릴을 사용하여 완전히 제거하고, 반응기에 상기 플루오린-18이 함유된 아세토니트릴과 단계 1에서 제조된 트리플레이트 전구체를 반응시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물의 제조방법.
6. 제2항에 있어서, 상기 단계 4의 화학식 5의 화합물과 티민의 혼합비는 1:2~2.5 mol인 것을 특징으로 하는 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-L-아라비노퓨라노실우라실(L-¹⁸FMAU) 화합물의 제조방법.
7. 제1항의 2'-데옥시-2'-[¹⁸F]플루오로-5-메틸-1-β-Ｌ-아라비노퓨라노실우라실 화합물을 포함하는 유전자 영상용 조영제.
8. 제7항에 있어서, 상기 유전자는 HSV1-TK 유전자인 것을 특징으로 하는 조영제.

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