KR20080072761A - 프로테아좀 억제제와 함께 ｉｌ-6 길항제를 이용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-6 길항제와 함께 프로테아좀 억제제를 공동-투여하는 것을 포함하여, 그러한 치료를 필요로 하는 포유 동물에서 암 장애 또는 증상 또는 IL-6 관련 장애 또는 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

프로테아좀 억제제와 함께 ＩＬ-6 길항제를 이용하는 방법{METHOD OF USING IL-6 ANTAGONISTS WITH PROTEASOME INHIBITORS}

본 발명은 질환, 이를 테면 암에 대하여 치료될 대상의 치료 반응을 증진시키기 위한, 인터류킨-6 길항제와 배합된 프로테아좀 억제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유효량의 프로테아좀 억제제 및 유효량의 인터류킨-6-길항제를 대상에 투여하여 대상에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 인터류킨-6(인터페론 β2로도 알려진 IL-6) 단백질에 대하여 특이적인 항체, 이를 테면, 특정 부분 또는 변이체에 관한 것이다.

사이토카인 IL -6

IL-6 (인터류킨 6)는 단핵구-유래 인간 B-세포 성장 인자, B-세포 자극 인자 2, BSF-2, 인터페론 베타-2 및 하이브리도마 성장 인자로도 이전에 알려진 22-27 kDa의 분비된 당단백질이며, 성장 자극 및 전염증 활성을 갖는다(Hirano et al. Nature 324: 73-76, 1986).

IL-6는 백혈병 억제 인자 (LIF), 온코스타틴 M (OSM), 섬모 신경 친화성 인자 (CNTF), 카디오트로핀-1 (CT-I), IL-1 및 IL-11를 포함하는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 및 골수단핵세포성 성장 인자 (MGF) 패밀리에 속한다. IL-6는 배열된 세포 타입, 대부분 특히 항원 제시 세포, T 세포 및 B 세포에 의하여 생산된다. IL-6-형 사이토카인은 모두 공통의 신호 전달 단백질, gp130 (이전에 IL-6R베타)을 포함하는 수용체 복합체를 통하여 작용한다. 그러나 IL-6, IL-11, CT-1 및 CNTF가 특정 수용체 단백질에 먼저 결합한 후에 pg130과 실질적으로 회합되는 반면, LIF 및 OSM은 LIF-R 및 gp130의 혼합물에 직접적으로 결합한다. 특정 IL-6 수용체 (IL-6R 또는 IL- 6알파, gp80 또는 CD126)는 막 결합 또는 가용성 형태(sIL-6R, 55 kD 형태)로 존재하며, 이는 둘다 gp130을 활성화할 수 있다.

일부 제제가 IL-6, 이를 테면, IL-1, IL-2, TNFa, IL-4, IFNa, 온코스타틴 및 LPS의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. IL-6는 다양한 활성, 이를 테면, B 및 T 세포 활성화, 조혈 작용, 파골 활성, 각질형성세포 성장, 급성기 단백질 합성, 신경 성장 및 간세포 활성화에 관여한다(Hirano et al. Int. Rev. Immunol; 16(3 -4) :249- 84,1998).

IL-6가 많은 경로에 수반되지만, IL-6 낙아웃(knockout) 마우스는 정상의 표현을 가지며, 그들은 생존가능하고, 번식할 수 있으며, 조직 손상에 대하여 약간의 감소된 수의 T 세포 및 감소된 급성기 단백질 반응을 보인다(Kopf M et al. Nature: 368:339-42, 1994). 반대로, 대뇌 IL-6를 과-발현하는 트랜스제닉 마우스에서 신경 질환, 이를 테면, 신경퇴행, 별아교세포 결핍증(astrocytosis), 대뇌 혈관신생이 발달되며, 이들 마우스에는 혈액뇌장벽이 발달되지 않는다(Campbell et al. PNAS 90: 10061-10065, 1993).

암에서 IL -6의 역할

IL-6는 다양한 기작에 의하여 일부 악성 질환의 병태생리학에서 관련된다. IL-6는 암-관련 병의 상태, 이를 테면 무력증/카켁시아 및 골흡수의 원인이 되는 요소일 것으로 가정된다. 종양-유도된 카켁시아(Cahlin et al. (2000) Cancer Res; 60(19):5488-9), 골흡수 및 관련 고칼슘혈증은 IL-6 낙아웃 마우스에서 감소되는 것으로 관찰된다(Sandhu et al. 1999). 뇌 종양에 이차적인 대뇌 부종 및 암-관련 우울증은 높은 수준의 IL-6와 관련된다 (Musselman et al. Am J Psychiatry.;158(8):1252-7, 2001).

다양한 인간 암의 수많은 시험관 내 및 생체 내 모델로부터의 실험 결과는 IL-6가 억제에 대한 치료 표적인 것을 나타낸다. IL-6는 종양 세포의 증식, 분화 및 생존을 유도하고, 아포토시스(apoptosis)를 증진시키고(Jee et al. Oncogene 20: 198-208,2001), 화학 요법에 대한 저항성을 유도할 수 있다(Conze et al. Cancer Res 61: 8851- 8858, 2001).

다발 골수종은 혈장 세포에 속하는 악성이다. IL-6는 악성 세포의 아포토시스의 억제에 관여하며, 자가분비 또는 주변분해 기작을 통하여 다발 골수종(MM)에서 악성 혈장 세포의 증식, 분화 및 생존을 증진시키는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, IL-6의 차단이 효율적인 요법이리라 가정된다(Anderson et al. Hematology: 147- 165, 2000). 시험관 내 실험(Tassone, P. et al. Int. J. Oncol. 21(4): 867-873, 2002) 및 임상 시도 둘 모두를 수행하였으며(Bataille et al. (1995) Blood; 86(2):685-91 and Van Zaanen, et al. (1996) J Clin Invest 98: 1441-1448), 결과는 IL-6 차단이 암 세포 성장에서 명백한 효과를 갖는 것을 나타내었다.

치료 표적으로서 프로테아좀 ( proteasome ) 경로

최근 실험 증거로, 프로테아좀 억제제가 특정 병리, 이를 테면, 암, 천식, 뇌경색 및 자가면역 뇌척수염에서 실제로 유익할 수 있는 것으로 강하게 제안된다. 악성에서, 약물은 다른 세포 사이클 억제제 퇴화의 억제를 통하여, 또는 항-아포토시스 전사 조절제 NF-κB의 억제를 통하여 작용할 수 있으나, 신경 보호에서 그들은 NF-κB 활성화의 억제를 통하여 작용할 수 있으며, 이 경우 염증 반응이 유도된다. 자가 면역 질환에서, 그들은 "자기" 펩티드의 제시를 억제하여, 또한 세포 면역 캐스케이드에 따른 신호 전달을 방해하는 것에 의하여 작용할 수 있다.

보론산 디펩티드 프로테아좀 억제제 PS-341, 보르테조미브(VELCADE®)는 유력하고 특별한 프로테아좀 억제제로서 작용하는 것으로 알려진 최초로 승인된 치료제이다. 보르테조미브는 골수종의 치료에서 중요한 진전이나, 불응성 또는 재발 질환을 지닌 환자 중 오직 27%가 부분적인 반응을 갖거나 그의 FDA 승인을 이끈 초기 II상 임상 시도에서 더 나았다 (Richardson PG et al, N Engl J Med 2003, 348: 2609-17). 전-임상 연구는 프로테아좀 억제제에 대한 노출에 따라 상향 조절되며 이에 따라 그의 항-종양 효능을 감쇠시키는 항-아포토시스 경로를 포함하는 유도가능한 화학 저항성의 중요한 매개자를 확인하였다(Saleh A et al, Nat Cell Biol 2000, 2: 476-83에서 리뷰).

프로테아좀 억제제에 대한 화학 저항성의 한 기작은 아포토시스의 중요한 억제제인 HSP-70 발현의 유도이다. 프로테아좀의 억제로 미스폴딩(misfolded) 단백질의 축적 및 전사 인자, HSF- 1.5-8의 활성화를 통하여, 대부분 현저하게 HSP-70인 열 충격 단백질 패밀리의 구성원의 상당한 상향-조절이 유발된다. HSP-70의 유도를 없애는 치료는 프로테아좀 억제제의 활성을 유력하게 할 수 있을 것으로 가정된다. 다른 연구에서, siRNA 또는 항-센스 기술을 통한 HSP-70 발현을 하향-조절하여 암의 다른 전-임상 모델에서 프로테아좀 억제제의 전-아포토시스 활성을 유력하게 하였다(Robertson JD et al, Biochem J 1999, 344: 477-85; Gabai VL et al, Oncogene 2005, 24: 3328-38).

유도가능한 화학저항성의 두번째 예는 프로테아좀 억제제에 의하여 전사적으로 상향-조절되는 MKP-1 포스파타아제이다(Orlowski RZ et al, J Biol Chem 2002, 277: 27864-71). MKP-1 포스파타아제는 스트레스 반응 단백질이며, 이는 또한 c-Jun-N-말단 키나아제의 불활성화에 의하여 작용하는 항-아포토시스이다. MKP-1의 하향-조절은 프로테아좀 억제제의 항-종양 효능을 증진시키는 것으로 보인다(Small GW et al, MoI Pharmacol 2004, 66: 1478-90).

IL-6는 골 형성 미세환경에서 골수종 세포에 대한 성장 및 생존 인자로서 작용하는 및 다양한 화학 요법에 대하여 민감성을 감소시키는 항-아포토시스 프로그램을 활성화 시키는 그의 능력에 의하여 나타난 바와 같이 골수종의 발병기전에서 중추적인 역할을 수행한다. IL-6는 몇몇 모델 시스템에서 HSP-70의 발현을 상향- 조절하는 것으로 보인다. 두번째로, IL-6 신호에 의해 활성화된 중요한 다운스트림 전사 인자인 STAT-1은 HSF-1과 상호작용하여, 열 충격 반응의 구성원의 전사를 증진시킨다.

이에 따라, 더욱 효율적이며, 덜 독성이고 더욱 영속적인 임상 반응에 대한 탐색에서, 특정 암 및 관련되거나 관련되지 않은 근육 소모, 뿐 아니라 신경 또는 비신경 기원의 자기 면역 질환 또는 특정 염증을 치료하는 데 가치있는 제제의 배합물을 입증하는 것이 중요할 것이다. IL-6 억제제의 사이토카인과 프로테아좀 억제제를 배합하는 것에 대한 유익한 효과는 이전에 입증된 적이 없다.

발명의 요약

본 발명은 유효량의 프로테아좀 억제제 및 유효량의 인터류킨-6 길항제를 대상에 투여하여, 대상에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 연속하여, 순차적으로 또는 동시에, 보르테조미브(bortezomib) 또는 관련 프로테아좀 억제제와 함께 항-IL-6 길항제의 투여를 포함한다. 일 구체예에서, IL-6 길항제는 고 친화성 항-IL-6 항체이다. 또다른 구체예에서, IL-6 길항제는 항-IL-6R 항체이다.

본 발명의 방법에 따른 질환은 암, 천식, 염증 질환 및 신경 질환을 포함한다. 일 구체예에서, 본 질환은 암 질환 또는 증상이다.

본 발명은 적어도 하나의 IL-6 길항제 및 적어도 하나의 프로테아좀 억제제의 배합물의 유용성을 예측하는 방법을 제공한다.

도 1은 제시된 시간에 대하여 치료된 다발 골수종에서 CNTO328의 농도 증가의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 2 A-D는 항체, F105 및 비관련 대조군 Mab 또는 CNTO328 및 제시된 농도의 보르테조미브와 인큐베이션시킨 제시된 세포의 상대 생존력 퍼센트를 나타내는 컬럼 그래프이다: A) 항체로 전-인큐베이션된 다음, 제시된 농도의 보르테조미브로 처리된 ANBL-6 다발 골수종 세포, B) 항체로 전-인큐베이션된 다음, 제시된 농도의 보르테조미브로 처리된 KAS-6 다발 골수종 세포, c) RPMI8226 IL-6 독립적 골수종 세포 및 D) CNTO 328 및 보르테조미브로 동시에 처리된 ANBL-6 다발 골수종 세포.

도 3A-B는 F105가 대조군 Mab인 경우, 항체 및 보르테조미브 배합물로 처리된 IL-6 의존 세포주 ANBL-6 (A) 및 KAS-6 (B)에서 측정된 아포토시스에서의 상대 배수 증가를 나타내는 컬럼 그래프이다.

도 4는 CNTO328 또는 대조군 Mab 및 HSC-70 및 MKP-1에 대하여 표지된 증가된 농도의 보르테조미브로의 처리 후 ANBL-6 세포 샘플 단백질 겔의 웨스턴 블롯이다.

도 5는 담체 대조군(DMSO) 또는 두 농도의 보르테조미브 및 열 충격 단백질 감쇠자 KNK437의 증가하는 농도로 인큐베이션된 ANBL-6 세포에서 측정된 아포토시스에서의 상대 배수 증가를 나타내는 컬럼 그래프이다.

도 6은 담체 대조군(DMSO) 또는 두 농도의 보르테조미브 및 열 충격 단백질 감쇠자 KNK437의 증가하는 농도로 인큐베이션된 HSF-결함 (-/-) 또는 정상 (+/+)인 MEF 세포에서 측정된 아포토시스에서의 상대 배수 증가를 나타내는 컬럼 그래프이다.

약어

Ig 면역글로블린, IgG 면역글로블린 G, IL 인터류킨, IL-6 인터류킨-6, IL-6R 인터류킨-6 수용체, sIL-6R 가용성 인터류킨-6 수용체, HSF-1 열 충격 전사 인자, HSP 열 충격 단백질, MAPK 미토겐 활성화된 단백질 키나아제, MPK-1 MAPK 포스파타아제, Mab 단일 클론 항체, STAT 신호 전달 활성화

정의

본원의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 특별히 그들이 목적하는 생물학적 활성을 갖는 한 단일 클론 항체(전장 단일 클론 항체 포함), 다중 클론 항체, 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다. "항체 단편"은 전장 항체, 일반적으로 항원 결합 또는 이의 가변 도메인의 부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 다이아바디(diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다

"키메라 항체"는 한 종으로부터의 독특한 도메인, 통상 가변 도메인 및 또다른 종으로부터의 나머지; 예를 들어, 마우스-인간 키메라를 보유한 항체이다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식 계열 면역 글로블린 서열로부터 유래되거나 이와 밀접하게 매칭되는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식 계열 면역 글로블린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 인간 중쇄의 V, D 및 J 구획을 재조합하는 동안과 같은 시험관내 임의의 또는 부위-특이적 돌연변이 형성 또는 생체 내 신체 돌연변이에 의하여 도입되는 돌연변이). 이에 따라, 본원에 이용된 용어 "인간 항체"는 실질적으로 모든 부분의 단백질(예를 들어, CDR, 프레임워크, C_L, C_H 도메인 (예를 들어, C_H1, C_H2, C_H3), 힌지, (V_L, V_H))이 인간 생식 계열 항체 유전자에 의해 암호화되는 것과 실질적으로 유사한 항체를 말한다. 인간 항체는 그의 아미노산 서열 유사성에 기초하여 그룹으로 분류되었으며, 예를 들어, http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/를 참조한다. 이에 따라, 서열 유사성 검색을 이용하여, 유사 선형 서열을 갖는 항체가 인간 또는 인간화 항체를 선택하거나 생산하기 위한 주형으로 선택될 수 있다.

본원에 이용된 항체에 대한 용어 "고 친화성"은 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게 10^-9 M 이하 및 가장 바람직하게 10^-10 M 이하의 K_D를 갖는 항체를 말한다. 본원에 이용된 용어 "Kdis" 또는 "K_D" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리율을 말하는 것으로 의도된다. "K_D"는 회합 속도(k₁) 또는 "온-속도(k_on)"의 속도에 대한 오프-속도(k_off)로도 불리는 해리 속도(k₂)의 비율이다. 이에 따라, K_D는 k2/k1 또는 k_off/k_on과 동일하며, 몰 농도(M)로 표시된다. 더 작은 Kd는 더 큰 결합을 수반한다. 따라서, 10^-9 M (또는 1nM)과 비교하여 10^-6M (또는 1mM)은 약한 결합을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "유비퀴틴-프로테아좀 시스템"은 원치 않는 단백질을 확인하고 절단하는 다중-성분 시스템이다. 상기 시스템은 그들의 손상, 미스폴딩 또는 단명 세포 본성으로 원치 않는 단백질을 인지하는 데 요구되며, 핵과 세포질 둘 다에서 발견되는 다중 서브유닛 복합체인 프로테아좀 구조를 포함하는 절단 효소 및 원치 않는 단백질의 유비퀴티닐화에 관련되는 효소를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "프로테아좀 억제제"는 프로테아좀의 펩티다아제 억제제를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱 자세하게, 프로테아좀의 펩티다아제의 이들 억제제는 티올 및 세린 프로테아제 외에 키모트립신-유사 및 트립신-유사 프로테아제의 억제제를 포함한다.

암 세포에 대하여 언급될 때 본원에 사용된 용어 치료제에 대한 "저항성"은 정상 또는 비저항성 세포가 치료제의 농도 또는 동일한 수준으로 접촉될 때와 비교하여, 치료제의 수준과 접촉한 결과로서, 매우 낮은 수준으로 억제되거나, 증식을 억제하거나 약화시키는 제제의 농도 또는 주위의 수준의 노출에 의하여 정상적으로 유발되는 제제의 효과에 대한 저항성을 세포가 성취한 것을 의미한다. 치료제에 대한 저항성의 특징은 다른 조건 하에서 주어진 치료제에 대하여 다른 수준의 "저항성"을 보유하는 다른 암 세포와 함께 매우 가변적인 것이다.

프로테아좀 억제제 보르테조미브는 다발 골수종의 치료에서 유의적인 진전을 나타내나, 수많은 저항성 기작에 의하여 그 효능이 한정된다. 가장 중요한 것 중 하나는 열 충격 단백질(HSP) 및 스트레스 반응 경로이며, 이는 HSP-70 및 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK) 포스파타아제 (MKP)-1과 같은 구성원을 통하여 보르테조미브의 전-아포토시스 활성을 방해한다. 인터류킨 (IL)-6 신호는 열 충격 전사 인자 (HSF)-1 및 전사 (STAT)-1의 활성자 및 신호 전달자를 통하여 열 충격 반응을 증대시키기 때문에, 출원인은 IL-6 신호의 하향 조절이 보르테조미브에 의한 HSP 유도를 약화시켜, 그의 항-골수종 활성을 증진시키는 것으로 가정하였다.

IL-6 의존적 다발 골수종 세포주 KAS-6 및 ANBL-6를 보르테조미브 및 CNTO 328의 배합물로 처리하면, 키메라 단일 클론 IL-6 중화 항체는 시간- 및 농도-의존적 방식으로 약물을 단독 처리한 것보다 세포 생존력의 더 큰 감소가 유발된다. 이는 일부 조건 하에서 단독의 두 개의 각각의 제제의 합보다 더 큰 아포토시스의 증진된 유도와 관련되어, 상승적 상호 작용을 제안한다. IL-6 독립적 RPMI 8226 골수종 세포주의 연구에서 및 이소 타입 대조군 항체를 이용할 때 유사 발견이 관찰되지 않았다. 세포를 보르테조미브로 처리한 다음 CNTO 328로 처리한 것과 비교하여, 동시에 두 제제로 처리할 때, 또는 세포를 CNTO 328로 전-처리한 다음 보르테조미브로 처리할 때 증가된 활성이 관찰되었다. STAT-3 및 p44/42 MAPK 인산화의 강력한 차단으로 설명된 바와 같이, CNTO 328로 처리하면, IL-6 매개의 다운스트림 신호 경로가 강력하게 억제된다. CNTO328은 HSP70 및 MKP-1 발현의 보르테조미브-매개 유도를 각각 45% 및 90%로 감소시킨다. 현저하게, CNTO 328은 전사적으로 활성이 있는 포스포-STAT-1의 수준을 현저하게 감소시키고 HSF-1의 과인산화를 감소시킨다. 약리학적 억제제 KNK437의 이용을 포함하는, 열 충격 반응을 억제하기 위한 다른 전략은 또한 보르테조미브와 배합되어 상승적 항-골수종 효과에 대한 증거를 만들어 내는 것이다. KNK437 및 보르테조미브의 상승적 활성은 정상 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)에서 재생산되나, HSF-1 낙아웃 MEF에서는 둔감하다. 함께 취하여, 출원인은 IL-6 신호의 억제가 보르테조미브의 항-골수종 활성을 증진시키는 것을 설명하였다. 그들은 또한 이는 전사적으로 활성이 있는 STAT-1 및 HSF-1의 하향-조절을 통하여 열 충격 반응의 프로테아좀 억제제-매개의 유도를 억제하여 적어도 부분적으로 발생한다는 가설을 지지한다. 본 발명의 교시는 보르테조미브 또는 관련 프로테아좀 억제제와 연속하여, 순차적으로 또는 동시에 항-IL-6 항체로 그를 필요로 하는 대상을 처리하는 방법의 합리성을 제공한다.

본 발명의 IL-6 길항제

본 발명에서 이용된 IL-6 길항제는 그것이 IL-6에 의한 신호 전달을 차단하고, IL-6의 생물학적 활성을 억제하는 한 임의의 기원의 것일 수 있다. IL-6 길항제의 예는 IL-6 항체, IL-6R 항체, gp130 항체, IL-6 돌연변이, IL-6R 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 IL-6 또는 IL-6R의 부분 펩티드를 포함한다. 본원에서 사용된 IL-6 돌연변이의 예는 Brakenhoff, et al., J. Biol. Chem., 269, 86-93, 1994 또는 Savino, et al., EMBO J., 13, 1357-1367, 1994에 개시되었다. IL-6 돌연변이 폴리펩티드 또는 이의 단편은 IL-6의 신호 전달 효과를 보유하지 않으나, IL-6R과의 결합 활성을 보유하며, IL-6의 아미노산 서열에 치환, 결실 또는 삽입의 형태로 돌연변이를 도입하여 생산된다. 이용된 동물의 종에는 제한이 없으나, 인간 기원의 IL-6를 이용하는 것이 바람직하다. 유사하게, 본 발명에서 그들은 신호 전달에 영향을 미치는 것으로부터 IL-6 또는 IL-6R(gp80) 또는 gp130을 예방하고, 이에 따라 IL-6 관련 생물학적 활성을 예방하는 한, 임의의 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6R 부분 펩티드가 이용된다(미국 특허 제 5,210,075호; IL-6 부분 펩티드에 관한 상세한 설명을 위한 EP617126). 또다른 구체예에서, 안티센스 기작, 또는 IL-6 또는 IL-6R RNA를 침묵시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다(IL-6R 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 상세한 설명을 위한 JP5-300338).

본 발명의 항체

본 발명에서 유용한 항체는 IL-6의 생물학적 작용을 억제할 수 있는 적어도 하나의 항원 결합 영역을 갖는 분리된 키메라, 인간화 및/또는 CDR-그래프트(grafted) 또는 인간 항체를 포함한다. 본 발명의 항체의 예는 IL-6 결합 항체, IL-6R (gp80) 결합 항체, gp130-결합 항체를 포함한다. 적합한 항원 결합 영역을 지닌 IL-6R 항체의 예는 PM-1 항체 (Hirata, et al., J. Immunol., 143, 2900-2906, 1989), 및 AUK12- 20, AUK64-7 또는 AUK146-15 항체 (WO92-19759)를 포함한다. 또다른 구체예에서, 항-IL-6R 항체는 미국 특허 제 5888510호 및 제 6121423호에서 개시된 MRA로 알려진 재성형된(reshaped) 항체이다.

일 구체예에서, 항원 결합 영역은 고 친화성 CLB-8 항-IL-6 항체로부터 유래된다. CLB-6로부터 유래된 본 발명의 예시적인 항체는 그 내용이 본원에 참조로 인용된 함께 계류중인 미국 가특허 출원 10/280716호에 개시된 바와 같은 CNTO328이다. 대안적 구체예에서, 항체는 함께 계류중인 미국 가출원 제 60/677,319호에 개시된 것과 같이 고 친화성으로 IL-6와 결합하는 인간 항체이다. 본 발명의 항체는 고 친화성으로 인간 IL-6를 특이적으로 중화시킨다.

본 발명에 따른 방법에서 이용될 수 있는 항-IL-6 항체는 본 발명의 항체에 도입될 수 있는 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 이의 프레임워크 영역 또는 임의의 부분과 배합된, 뮤린 CLB-8 단일 클론 항체로부터 유래된 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합 부위의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄를 포함하는 항-IL-6 키메라 항체에 관한 것이며, 각각의 쇄는 인간 IL-6에 특이성을 갖는 뮤린 c-CLB8 단일 클론 항체로부터 유래된 적어도 일부의 인간 불변 영역 및 적어도 일부의 가변 영역(v)를 포함하며, 상기 항체는 인간 IL-6, 이를 테면, 항체 cCLB-8의 억제 및/또는 중화 에피토프에 대하여 고 친화성으로 결합한다. 본 발명은 또한 그러한 항체의 단편 또는 유도체, 이를 테면, 항체 쇄의 하나 이상의 부위, 이를 테면, 중쇄 불변, 접합(joining), 다양성 또는 가변 영역 또는 경쇄 불변, 접합 또는 가변 영역을 포함한다.

본 발명의 바람직한 항체는 키메라, 인간화 및/또는 CDR 그래프트 또는 인간 항체를 포함하며, 이는 생체 내에서 항-IL-6 뮤린 CLB-8, 키메라 항-IL-6 CLB-8 또는 실질적으로 동일한 결합 특성을 갖는 항체, 뿐 아니라 이의 단편 및 영역의 인간 IL-6에 대한 결합을 경쟁적으로 억제할 것이다.

본 발명의 항체는 바람직하게 적어도 10^-9M, 바람직하게 적어도 10^-10M의 친화성으로 항-IL-6 또는 항-IL-6R에 결합하고/거나, 적어도 하나의 IL-6 단백질의 적어도 하나의 활성을 실질적으로 중화시킨다. 바람직한 구체예에서, 항체는 적어도 1 X 10^-11M, 바람직하게 5 X 10^-11M의 친화성(Kd)으로 IL-6에 결합하고, 인간 IL-6를 중화시킨다. 바람직하게, 항체는 다른 IL-6 슈퍼패밀리 구성원에 결합하지 않고, GP130의 트랜스-신호를 차단한다.

프로테아좀 억제제

프로테아좀은 고도로 보존된 다중 촉매 단백질 분해 효소(proteinase)인 세포내 구조이다. 프로테아좀은 중요한 조절 세포 공정에 속하는 많은 단백질의 ATP-의존적 단백질 가수 분해를 초래한다. 이에 따라, 프로테아좀은 세포 성장 및 분화에서의 조절 요소이다. 평균 인간 세포는 약 30,000 프로테아좀을 함유하며, 이들 각각은 몇몇 단백질-소화(digesting) 프로테아제를 함유한다. 이들 복합체는 전사, 세포 사이클 조정, 스트레스 반응, 리보좀 생물 발생 및 비정상 단백질 분해 작용을 포함하는 무수한 세포 작용에 있다. 그러므로 그들은 면역 및 염증 반응(WO 95/25533), 바이러스 감염, 종양 형성, 신경 및 근육 퇴화(미국 특허 제 5,340,736호), 항원 처리(WO 94/17816), DNA 수선 및 세포 분화와 같은 공정에서 역할을 수행한다. 분해될 단백질의 특정 타입 및 비율에 대한 엄격한 관리를 유지하기 위하여 프로테아좀 활성은 훌륭하게 조정된다.

몇몇 단계는 "유비퀴틴-프로테아좀" 경로 또는 프로테아좀을 통하여 단백질 분해에 관여한다. 초기에, 단백질은 유비퀴틴으로 알려진 작은 폴리펩티드의 쇄로의 파괴에 대하여 표적이 있다. 유비퀴티닐화는 단백질을 프로테오좀의 둘러싸인 단백질 가수 분해의 챔버로 가이드한다. 세 효소 활성, E1, E2 및 E3는 유비퀴닐화에 요구된다. ATP-의존적 E1 효소는 유비퀴틴을 활성화시키며, 그것을 유비퀴틴-결합 효소, E2에 연결시킨다. 그 다음, 유비퀴틴 리가아제(ligase)인, E3 효소는 유비퀴틴 분자를 단백질에 연결시킨다. 명시된 폴리펩티드가 유비퀴틴 부분의 장쇄를 추적하고, 프로테아좀이 최종적으로 단백질을 작은 단편으로 분해시킬 때까지, 이러한 공정은 반복된다. 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 세포에서 90%의 모든 비정상, 미스폴딩 단백질 및 모든 단명 조절 단백질의 분해를 유발한다. 그의 반감기가 3 시간 미만인 이들 단명 단백질은 모든 세포 단백질 중 10% 내지 20%를 차지한다. 이러한 경로는 또한 더 길게 생존하는 세포 단백질을 많이 파괴한다. 이에 따라, 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 모든 세포내 단백질 중 80% 내지 90%의 분해를 유발한다.

초기 보고된 프로테아좀 억제제는 펩티딜 알데히드를 포함한다. 이들의 예비 최적화로, P1 위치에서 류신 및 P2 또는 P3 위치에서 큰 소수성 잔기, 이를 테면, 나프틸알라닌에 대한 선호도가 제안된다. 또한, 펩티딜 알데히드가 티올 프로테아제(예를 들어, 칼페인(calpain), 카텝신(cathepsin))의 유력한 억제를 나타내고 알파-위치에서 양성자의 산성에 기인하여 배열상 안정하지 못하기 때문에, 알데히드기에 대한 치환이 연구되었다.

원래 방선균류에서 분리된 항생 물질 억제제 외에, 다양한 펩티드 알데히드, 이를 테면, Siman et al. (WO91/13904)에 의해 기술된 키모트립신-유사 프로테아제의 억제제가 합성되었다. 예를 들어, Dick, et al., Biochem. 30: 2725 (1991); Goldberg, et al., Nature 357: 375 (1992); Goldberg, Eur. J. Biochem. 203: 9 (1992); Orlowski, Biochem. 29: 10289 (1989); Rivett, et al., Archs. Biochem. Biophys. 218: 1 (1989); Rivett, et al., J. Biol. Chem. 264: 12, 215 (1989); Tanaka, et al., New Biol. 4: 1 (1992)에서 다양한 프로테아좀 복합체의 억제제가 기록되었다. 프로테아좀 억제제는 또한 그 개시물이 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제 5,693,617호에도 개시되었다.

바람직한 프로테아좀 억제제는 보론산 디펩티드 프로테아좀 억제제 보르테조미브 (MLN-341, LDP-341 및 PS-341; N-(모폴리노)카보닐)-베타-(1-나프틸)-L-알라닌-L-류신 보론산) 제품명 VELCADE®로 판매, WO96/013266)로 언급되는 "PS-341"이다. PS-341은 전사 인자 NF-κB의 활성화를 억제한다. PS-341은 또한 몇몇 아포토시스 억제제의 발현을 하향-조절하고, 약물 저항성 다발 골수종 (MM) 세포주 및 환자 세포의 캐스파아제(caspase)-의존적 아포토시스를 유도하고, 골수 기질 세포(BMSC)에 대한 MM 세포 결합을 억제하고, 골수 주위에서 생존 인자 및 MM 성장의 생산을 억제한다.

프로테아좀 및 시스테인 프로테아제 둘 다의 활성을 억제하는 펩티드 알데히드와 반대로, 보르테조미브는 프로테아좀의 훨씬 더 효력이 있고, 선택적인 억제제이다. 그것은 인간 백혈구 엘라스타아제, 카텝신 G, 키모트립신 및 트롬빈을 포함하는 다른 세린 프로테아제 중 프로테아좀(> 500-배)에 대하여 매우 큰 선택성을 갖는다. 보르테조미브는 최근 재발성 및 불응 다발 골수종을 치료하는 용도로 승인되었다. 다양한 종양 배양 모델에서 보르테조미브에 의한 종양 세포 프로테아좀 활성의 억제는 아포토시스의 유도와 관련된다.

특정 프로테아좀 억제제는 프로테아좀에서 활성 부위 트레오닌과 상호 작용하는 약물작용 발생단에 의해 구별되는 다섯 부류로 나뉜다: 펩티드 알데히드, 이를 테면 CEP1612 및 MG132, 펩티드 보로네이트, 이를 테면 보르테조미브, 펩티드 비닐 설폰, 펩티드 에폭시케톤 및 β-락톤 억제제, 이를 테면 락토시스틴. 다음 화합물, 또는 이의 유사체도 본 발명에서 프로테아좀 억제제로서 이용될 것으로 고려된다: PS-519 (IR-[1S,4R,5S]]-1-(1-하이드록시-2-메틸프로필)-4-프로필-6-옥사-2-아자비사이클로[3.2.1.]헵탄-3,7-디온); 클라스토-락타시스틴 베타-락톤; 락타시스틴, 에폭소마이신, CVT634 (-5-메톡시-1-인다논-3-아세틸-류실-D-류실-1-인다닐아미드), TMC96 ((3-메틸부타노일-L-트레오닌 N-(1-(2-(하이드록시메틸)-옥시란-2-일카보닐)-3-메틸부트-3에닐)아미드), MG-115, CEP1612 및 MG132.

프로테아좀 프로테아제 억제제 외에, 유비퀴틴-프로테아좀 경로는 촉진하는 효소, 유비퀴틴-활성화 효소 (E1), 유비퀴틴-결합 효소 (E2) 및 유비퀴틴-리가아제 (E3 효소)의 억제제에 의해 차단될 수 있다. E1 억제제는 히메익산 A(himeic acid A)와 같이 확인되었다(Tsukamoto, et al. 2005, Bioorgan Med Chem Lett 15(1) :191-194. 특정 유비퀴티닐화-관련 효소의 활성을 줄이거나 제거하기 위하여, 본 분야에 알려진 다른 방법, 이를 테면, RNA 침묵이 이용될 수도 있다.

프로테아좀 억제 활성의 관찰

포유 동물에서 프로테아좀 억제제의 약력학 약물 활동을 관찰하는 방법은 미국 특허 제 6613541호에 교시되었으며, 발명자들은 생물학적 샘플 중에서 약물 농도보다, 프로테아좀 활동의 세포 외 분석이 프로테아좀 억제제의 약력학적 약물 활동을 관찰하는 유용한 방법을 제공하는 것을 놀랍게도 발견하였고, 이러한 데이터는 장래에 투여될 프로테아좀 억제제의 앞으로의 투여량 및 투여 빈도를 선택하는 지침을 제공한다.

본 발명은 프로테아좀 억제제를 포유 동물에 투여하고; 프로테아좀 억제제를 투여한 후 한번 이상의 특정 시간에 포유 동물로부터 하나 이상의 테스트 생물학적 샘플을 수득하며; 테스트 생물학적 샘플(들)에서 프로테아좀 활성을 측정하고; 테스트 생물학적 샘플(들)에서 프로테아좀 활성의 양을 결정하며; 프로테아좀 억제제가 투여되지 않은 포유 동물에서 수득된 기준 생물학적 샘플에서의 것에 대하여 테스트 생물학적 샘플에서 프로테아좀 활성의 양을 비교하는 것을 포함한다.

미국 특허 제 6613541호는 프로테아좀 억제제에 대한 투여 요법을 결정하는 방법, 인간을 포함하는 포유 동물에서 기준선 프로테아좀 활성을 결정하는 방법을 추가로 제공하며, 포유 동물에서의 생물학적 샘플에서 프로테아좀 활성을 측정하기 위한 키트를 제공한다. 미국 특허 제 6,613,541호의 방법은 혈액, 소변 및 조직 생검 샘플에서 선택된 생물학적 샘플에서 실행될 수 있다.

IL -6의 측정

IL-6는 IL-6 반응성 세포주를 사용하는 생물분석에서 검출될 수 있다(참조: 7TD1 ; B9 ; CESS , KPMM2 , KT-3 ; M1 , MH60-BSF-2 , MO7E ; Mono Mac 6 ; NFS-60 ; PIL-6 ; SKW6-C14 ; Tl165 ; XG-1). IL-6는 하이브리도마 성장 인자로서 그의 활성에 의해서도 분석될 수 있다(참조: HGF). 민감성 면역 분석 및 비색 테스트도 이용할 수 있다. 대안적 검출법은 사이토카인의 RT-PCR 정량이다. ELISA 분석은 수용체-관련 gp130 단백질을 검출하기 위하여 존재한다(이러한 시약은 예를 들어, R&D System으로부터 입수가능하다).

CNTO328에 결합된 IL-6를 검출하기 위하여, 항-ID(미국 동시계속출원 제 10/280716호에 개시된 항-가변 영역 항체)는 임의의 표준 면역분석 형식, 이를 테면 ELISA-타입 분석으로 검출하기 위하여 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 치료를 받을 수 있는 질환

IL-6의 탈조절된 발현은 아마도 수많은 질환의 발병기전에 참여하는 주요한 인자 중 하나일 것이다. IL-6(및 다른 B-세포 분화 인자)의 지나친 과생산이 다양한 병리 증상, 이를 테면 류마티스 관절염, 다발 골수종, 레너트 증후군 (Lennert syndrome, 조직구 림프종), 캐슬만씨 질환(혈장 세포의 대량 침윤, 감마-과글로블린혈증, 빈혈 및 증가된 농도의 급성기 단백질을 지닌 림프절병증), 심장점액종 및 간 경화증에서 관찰되었다. 아교모세포종에 의한 IL-6의 구조적 합성 및 뇌척수액으로 IL-6의 분비가 관찰되었다.

면역 매개의 염증 질환 (IMID)에 관하여, 과도한 농도의 IL-6가 윤활액에서 발견되기 때문에, IL-6는 만성 다발관절염(IL-1 및 IL-8와 함께)의 발병기전에 관여한다. 염증성 장 질환에서, 증진된 혈장 수준의 IL-6는 질환 상태의 지시자일 수 있다. 혈관사이질증식사구체신염을 지닌 환자에서, IL-6의 증진된 소변 수준도 질환 상태의 지시자이다. IL-6는 I형 및 II형 당뇨병의 면역 매개의 발병 기전에서 역할을 수행할 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 IL-6 항체를 이용하여 본 분야에 알려지거나 본원에 개시된 바와 같이, 예를 들어, 프로테아좀 억제제의 투여와 함께 IL-6 항체의 치료적 유효량을 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에 투여하거나 이와 접촉시켜, 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 IL-6 관련 질환을 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 비제한적으로 적어도 하나의 비만, 면역 관련 질환, 심혈관 질환, 감염성 질환, 악성 질환 또는 신경 질환을 포함하는 적어도 하나의 IL-6 관련 질환을 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 비제한적으로 적어도 하나의 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 전신 발병 소아 류마티스 관절염, 건선 관절염, 강직척추염, 위궤양, 혈청반응음성 관절병증, 골관절염, 뼈용해, 정형 외과 주입의 무균 이완, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 전신 홍반성 낭창, 항인지질증후군, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 특발성 폐섬유증, 전신 혈관염/베게너육아종증, 유육종증, 고환염/정관 절제술 역전 과정, 알레르기성/아토피성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 습진, 알레르기 접촉피부염, 알레르기 결막염, 과민성 폐렴, 이식, 기관이식거부반응, 이식편대숙주병, 전신 염증성 반응 증후군, 폐혈증 증후군, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양 음성 패혈증, 진균성 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성패혈증, 수막구균혈증, 외상/출혈, 화상, 전리방사선 노출, 급성 췌장염, 성인성 호흡곤란증후군, 류마티스(성) 관절염, 알코올-유도성 간염, 만성 염증성 병, 유육종증, 크론병, 겸상적혈구성 빈혈, 당뇨, 신증, 아토피성 질환, 과민 반응, 알레르기성 비염, 고초열, 다년성 비염, 결막염, 자궁내막증, 천식, 담마진, 전신성 아나필락시스(systemic anaphalaxis), 피부염, 악성빈혈, 용혈성 질환, 혈소판감소증, 기관 또는 조직의 이식편거부반응, 신장 이식거부반응, 심장 이식거부반응, 간이식거부반응, 췌장이식거부반응, 폐이식거부반응, 골수이식(BMT) 거부반응, 피부동종이식거부반응, 연골이식거부반응, 뼈이식거부반응, 소장이식거부반응, 태아 흉선 주입 거부반응, 부갑상선이식거부반응, 기관 또는 조직의 이종이식거부반응, 동종이식거부반응, 항-수용체 과민반응, 그레이브스 질환, 레이노 질환, B형 인슐린-내성 당뇨병, 천식, 중증 근무력증, 항체 관련성 세포독성, III형 과민반응, POEMS 증후군(폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일 클론 감마병증, 및 피부변성 증후군), 폴리신경병증, 장기거대증, 내분비병증, 단일 클론 감마병증, 및 피부변성 증후군, 항인지질증후군, 천포창, 피부경화증, 혼재성 결합조직 질환, 특발성 애디슨병, 당뇨병, 만성 활성 당뇨, 원발성 담낭 경변증, 백반, 혈관염, MI 심장절개 증후군, IV형 거부반응, 접속성 피부염, 과민성 폐렴, 동종이식거부반응, 세포내 유기체에 의한 흑색종, 약물 과민증, 대사성/특발성, 윌슨병, 혈색(소)증, 알파-1-항트립신 결핍증, 당뇨병(성) 망막병증, 하시모토 갑상선염, 골다공증, 시상하부하수체부신계 평가, 원발성 담낭 경변증, 갑상선염, 뇌척수염, 악액질, 낭성섬유증, 신생아 만성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 가족성 적혈구잠식성 림프조직구증, 피부이상, 건선, 탈모증, 신증후군, 신장염, 사구체신염, 급성 신부전증, 혈액투석, 요독증, 독성, 자간전증, okt3 치료법, 항-cd3 치료법, 사이토카인 치료법, 화학요법, 방사선 요법(예: 제한하는 것은 아니지만, 천식, 빈혈, 카켁시아 등), 만성 살리실산 중독 등을 포함하는 적어도 하나의 IL-6 관련 면역 관련 질환을 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 인용된 문헌[the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000)]를 참조한다.

본 발명은 또한, 비제한적으로 적어도 하나의 심인성 졸도 증후군, 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌졸증, 허혈성 뇌졸증, 출혈, 동맥경화(증), 죽상경화, 재협착, 당뇨성 죽상경화증 질환, 고혈압, 동맥(성) 고혈압, 신혈관성 고혈압, 실신, 쇼크, 심혈관계 매독, 심부전증, 폐성심, 원발성 폐 고혈압, 심부정맥, 심방이소성 박동, 심방조동, 심방세동(지효성 또는 발작성), 관류후증후군, 심폐회로 염증 반응, 혼동 또는 다소성 심방 빈맥, 정상협착 QRS 빈맥, 특이 부정맥, 심실세동, 히스속부정맥, 방실차단, 각차단, 심근허혈 질환, 관(상)동맥질환, 협심증, 심근경색, 심근증, 확장형 울혈성 심근증, 제한성 심근병증, 판막성 심장질환, 심내막염, 심낭(심막)질환, 심장암, 대동맥 및 말초동맥류, 대동맥박리, 대동맥 염증, 배대동맥 및 그의 가지 폐색, 초혈관질환, 폐색성 동맥 질환, 말초 아테롬성 동맥 경화성 질환, 폐쇄성 혈전혈관염, 기능성 말초 동맥 질환, 레이노 현상 및 질환, 말단청색증, 지단홍통증, 정맥질환, 정맥혈전증, 정맥류성 정맥, 동정맥류, 림프부종, 지방(성) 부종, 불안정형협심증, 재관류 손상, 펌프후 증후군, 허혈성 재관류 손상 등을 포함하는 적어도 하나의 심혈관 질환을 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로는, 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 항-IL-6 항체를 함유하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 비제한적으로, 적어도 하나의 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 또는 만성 기생충성 또는 감염성 발생과정, 예로서 박테리아, 바이러스 및 진균 감염, HIV 감염/HIV 신경병증, 수막염, 간염(A, B 또는 C 등), 화농성관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, E. coli 0157:h7, 용혈성 요독증 증후군/혈전성 혈소판감소성 자반증, 말라리아, 뎅구 출혈성열, 리슈마니아증, 나병, 독 쇼크 증후군, 연쇄구균 근염, 가스괴저, 마이코박테리움(mycobacterium) 결핵증, 마이코박테리움(mycobacterium) 아븀 인트라셀룰라, 뉴모시스티스 카리니 폐렴, 골반염증성 질환, 고환염/부고환염, 라지오넬라(Lagionella) 감염, 라임 질환, 인플루엔자 a, 엡스타인 바 바이러스, 바이러스-관련 혈액 식세포성 증후군, 바이러스 뇌염/무균성 뇌막염 등을 포함하는 IL-6 관련 감염 질환을 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 조절 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 비제한적으로, 적어도 하나의 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), 급성 림프성 백혈병, B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 골수 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프모세포성 백혈병(CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome)(MDS), 림프종, 호지킨 질환, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버키트림프종, 다발 골수종, 카포시육종, 결장직장암종, 췌장암종, 비인강 암종, 악성조직구증식, 악성종양의 종양부수증후군/과칼슘혈증, 고형 종양(solid tumors), 방광암, 유방암, 직장암, 자궁내막암, 두부암, 목암(neck cancer), 유전 비폴립성 암, 호지킨 림프종, 간암, 폐암, 비소세포폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암종, 고환암, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암관련 골통, 선암종, 비늘상 세포 암종, 육종, 악성 흑색종, 특히, 전이 흑색종, 혈관종, 전이 질환, 암 관련 뼈의 재흡수, 암관련 골통 등을 포함하는 적어도 하나의 IL-6 관련 악성 질환을 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 비제한적으로, 적어도 하나의 신경퇴행성 질환, 다발성 경화증, 편두통, AIDS 치매 컴플렉스, 탈수초(성) 질환, 예로서 다발성 경화증 및 급성 횡단성 척수염; 추체외로 및 소뇌성 질환 예로서 피질척수계 병변; 기저핵 장애; 과다운동성질환 예로서 헝틴통 무도병 및 노인성 무도병; 약물-유도성 운동 질환, 예로서 CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 것; 과소운동성 질환, 예로서 파킨슨 질환; 진행성 핵상 마비(Progressive supranucleo Palsy); 소뇌의 구조상 병변; 척수소뇌변성, 예로서 척수성 운동실조증, 프리이드라이히 운동실조(증), 소뇌 피질변성, 다중계 변성(Mencel, Dejerine-Thomas, Shi Drager, and Machado-Joseph) ; 전신 질환(레프섬병, 아베타리포프로테미아, 운동실조, 모세혈관확장증, 및 미토콘드리아 다중계 질환); 탈수초 중심성 질환, 예로서 다발성 경화증, 급성 횡단성 척수염; 및 운동 단위 질환 예로서 신경성 근육 위축증(앞뿔 세포 변성, 예로서 근위축성 측삭 경화증, 영아 척수성 근육 위축증 및 연소성 척수성 근육 위축증); 알츠하이머 질환; 다운증후군; 산재성 루이소체 질환; 루리소페형 노인성 치매; 베르니케-코르사코프증후군; 만성 알콜중독; 크로이츠펠트야콥병; 아급성 경화성 범뇌염, Hallerrorden-Spatz 질환; 권투선수치매; 신경외상성 손상(예를 들어, 척수 손상, 뇌진탕, 반복 뇌진탕); 고통; 염증성 고통; 자폐증; 우울증, 뇌졸증, 인지 장애; 간질 등을 포함하는 적어도 하나의 IL-6 관련 신경 질환을 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 조절하거나 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로는, 적어도 하나의 TNF 항체, 또는 특정 부위 또는 변이체를 함유하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 상기 조절, 치료 또는 요법이 필요한 세포, 조직, 동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 문헌[the Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992) 등]을 참조한다.

투여 방법

본 발명의 방법은 프로테아좀 억제제의 투여를 포함하는 치료와 함께 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 하나의 항-IL-6 항체를 포함하는 조성물 또는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 적어도 하나의 IL-6 길항제의 투여가 지시된 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 IL-6 길항제를 적어도 하나의 프로테아좀 억제제와 이전에, 동시에 및/또는 이후에 공동 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, IL-6 길항제는 항-IL-6R 항체 또는 IL-6 항체를 중화시키는 것과 같이, IL-6의 생물학적 작용을 예방하거나 억제하는 항체이며, 프로테아좀 억제제는 PS-314 (보르테조미브), PS-519; 클라스토-락타시스틴 베타-락톤; 락타시스틴, 에폭소마이신, CVT634, TMC96, MG-115, CEP1612 및 MG132로 구성된 군에서 선택된다.

전형적으로, 병리학적 증상의 치료는 유효량 또는 투여량의 항-IL-6 항체 조성물을 투여하는 것에 의해 달성되며, 항-IL-6 항체 조성물의 유효량 또는 투여량은 총, 평균적으로 적어도 약 0.01 내지 500 밀리그램 범위의 적어도 하나의 항-IL-6 항체/환자의 킬로그램/투여, 및 바람직하게는 적어도 약 0.1 내지 100 밀리그램의 항체/환자의 킬로그램/단일 또는 다중 투여이며, 이것은 조성물에 함유된 활성 제제의 특정 활성에 따라 다르다. 다르게는, 효과적인 혈청 농도는 단일 또는 다중 투여 당 0.1-5000 ㎍/ml 혈청 농도를 포함할 수 있다. 적합한 용량이 의사들에게 공지되어 있으며, 물론 특정 질환 상태, 투여되는 조성물의 특이 활성 및 치료할 특정 환자에 따라 달라질 것이다. 일부의 경우, 목적하는 치료량을 달성하기 위해, 목적하는 일일 용량 또는 효과가 달성될 때까지 개별적인 투여를 반복하는 경우, 반복 투여하는 것, 즉 특정의 모니터링 또는 계량 용량 개별 투여를 반복하는 것이 필요할 수 있다.

비경구 투여의 경우, 항체 또는 프로테아좀 억제제는 약제학적으로 허용되는 비경구적 비히클과 함께 또는 별도로, 용액, 현탁액, 유제, 입자, 분말 또는 동결 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 그러한 비히클의 예로는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 1-10% 인간 혈청 알부민이 있다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대 고정유(fixed oil)가 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결 건조 분말은 등장성(예, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성(예, 완충액 및 보존제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제제를 공지된 기술 또는 적합한 기술에 의해 멸균시킨다.

적합한 약제학적 담체가 이 분야에 있어서 표준 참고서인 레밍톤(Remington)의 Pharmaceutical Sciences, A. Osol의 최신판에 개시되어 있다.

투여

본 발명에 따른 IL-6 길항제 및 프로테아좀 억제제의 약제학적 유효량을 투여하는 것에 대해 많은 공지되고 개발된 방식이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 비경구 투여가 전형적이나, 다른 형식의 투여가 적합한 결과와 함께 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 흡입 또는 여기에서 기술되거나 당업계에 공지된 다른 방식에 의해 투여에 적합한 다양한 장치 및 방법 중 임의의 것을 이용하여, 용액, 유액, 콜로이드, 현탁액 또는 건조 분말로서 담체 중에서 운반될 수 있다.

투여의 대안적 경로는 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골 내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌혈관내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립샘내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 윤활내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질내, 직장, 구강내, 설하, 비강내, 또는 경피 전달 수단을 포함한다.

실시예 1: 프로테아좀 억제제와 배합된 항- IL -6 항체의 활성

키메라, 단일 클론 IL-6-중화 항체, CNTO 328으로 IL-6를 억제하면, HSP-70의 보르테조미브-매개 상향-조절을 감쇠시켜, 프로테아좀 억제제, 보르테조미브의 항-골수종 활성을 강하게 한다는 가설에 기초하여, 다음 연구를 설계하고 수행하였다.

A. 단일 클론 항체, CNTO 328로 IL-6 신호를 억제하면, IL-6-의존성 다발 골수종 세포주, ANBL-6 및 KAS-6의 세포 생존력이 감소된다.

24 및 48 시간 동안 ANBL-6 및 KAS-6 세포 (Dr. Diane Jelinek, Mayo Clinic, Rochester, MN)를 이소타입 대조군 항체, F105 또는 CNTO 328의 증가하는 농도와 함께 인큐베이션하였다. 마지막 4 시간 동안, WST-1 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)의 존재 하에 세포를 인큐베이션하였다. 생존가능한 세포에 의한 수용성 포르마잔 염으로의 WST-1의 환원을 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 450nM의 흡광도에서 측정하였다. 처리되지 않는 세포에 대한 퍼센트 생존력으로 생존력을 측정하였다. 10% FBS 및 1 ng/mL의 IL-6를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 모든 세포를 처리하였다.

결과를 도 1에 그래프로 나타내었다(값은 5중 배양의 평균이다; 바, SEM). ANBL-6 및 KAS-6 세포를 CNTO 328로 처리하면, 세포 생존력에서 용량- 및 시간-의존성 감소가 유발된다. KAS-6 세포는 ANBL-6 세포보다 IL-6 억제 효과에 대하여 유의적으로 더 민감하다.

B. CNTO 328은 IL-6-의존성 골수종 세포에서 보르테조미브의 항-골수종 활성을 강력하게 한다.

ANBL-6, KAS-6, 또는 IL-6-독립적 RPMI 8226 골수종 세포주를 대조군 항체의 10 mcg/ml (ANBL-6 및 RPMI 8226) 또는 0.1 mcg/ml (KAS-6), F105 또는 CNTO 328와 함께 24 시간 동안 전-인큐베이션한 다음, 또 다른 24 시간 동안 F105 또는 CNTO 328의 지속적인 존재 하에, DMSO 대조군 또는 증가하는 농도의 보르테조미브와 함께 공동-인큐베이션하였다. 순차적인 실험을 위하여, ANBL-6 세포를 다음으로 처리하였다: 1) 24 시간 동안 F105 또는 CNTO 328 후, 또다른 24 시간 동안 F105 또 는 CNTO 328 및 보르테조미브 5nM(항체 → 보르테조미브); 2) 24 시간 동안 F 105 또는 CNTO 328 및 보르테조미브 5 nM을 동시에 (항체 + 보르테조미브), 또는 12 시간 동안 5 nM에서 보르테조미브 후, 24 시간 동안 F105 또는 CNTO 328(보르테조미브 → 항체). 상기 개시된 바와 같이 세포 생존력을 분석하고, 미처리된 세포에 대한 퍼센트 생존력으로 측정하였다. 10% FBS 및 1 ng/mL의 IL-6를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 모든 세포를 처리하였다. 컬럼, 5중 배양의 평균; 바, SEM.

대조군 항체, F105로 전-처리된 세포와 비교하여 세포 생존력에서 유의적인 감소에 의하여 설명된 바와 같이(도 12A 및 B), ANBL-6 및 KAS-6 세포를 CNTO 328로 전-인큐베이션하면, 보르테조미브의 세포 독성이 강력하게 된다. CNTO 328은 IL-6-독립적 골수종 세포주, RPMI 8226 (패널 C)에서 보르테조미브의 활성을 증진시키지 않는다. ANBL-6 세포를 CNTO 328로 전-처리한 다음, 보르테조미브로 처리하거나, CNTO 328 및 보르테조미브를 동시에 처리할 때 CNTO 328은 보르테조미브의 세포 독성을 증진시킨다. 반면, 세포를 보르테조미브로 전-처리할 때(패널 D), CNTO 328은 추가의 효과를 거의 갖지 않는다.

C. CNTO 328로 IL-6 신호를 억제하면, IL-6-의존성 다발 골수종 세포주, ANBL-6 및 KAS-6의 보르테조미브-매개의 아포토시스가 증진된다.

ANBL-6 및 KAS-6 세포를 10 mcg/ml (ANBL-6) 또는 1 mcg/ml (KAS-6)의 CNTO 328 또는 대조군 항체, F105와 함께 8 시간(ANBL-6) 내지 12시간(KAS-6) 동안 인큐베이션하였다. 모노- 및 올리고-뉴클레오좀(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)의 존재를 측정하며, DMSO 및 F105-처리된 대조군에 대하여 아포토시스에서의 배수 증가로서 나타내는 ELISA-기초의 분석을 이용하여 아포토시스를 결정하였다. 10% FBS 및 1 ng/mL의 IL-6를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 세포를 처리하였다(도 3 A 및 B, 컬럼 높이는 3중 배양의 평균을 나타낸다; 바, SEM).

ANBL-6 및 KAS-6 세포를 CNTO 328 및 보르테조미브로 처리하면, 약물을 단독으로 처리한 세포와 비교하여 아포토시스의 유도가 증진된다. IL-6-독립적 골수종 세포주 RPMI 8226에서 CNTO 328은 아포토시스를 강력하게 할 수 없었다(데이터는 나타내지 않음).

D. CNTO 328은 ANBL-6 세포에서 인터류킨-6 신호를 하향-조절하고, 항-아포토시스 MKP-1 및 HSP-70의 보르테조미브-매개의 유도를 약화시킨다.

ANBL-6 세포를 10 mcg/ml의 CNTO 328 또는 대조군 항체, F 105와 함께, 증가하는 농도의 보르테조미브와 함께 또는 이것 없이, 8 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물을 제조하고, 면역블롯 분석을 하였다. 레인(lane) 당 동일한 단백질 로딩을 확실히 하기 위하여, 블롯을 떼어내고, HSC-70에 대하여 프로빙하였다. HSP-70 및 MKP-1 면역블롯 상에서 농도계를 수행하였다.

ANBL-6 세포를 CNTO 328로 처리하면, 포스포-p42/44 MAPK 및 포스포-STAT-3의 수준의 감소에 의하여 나타낸 바와 같은 IL-6 신호의 다운스트림 매개자에서 상당한 감소가 유발된다(도 4). 명백하게, 증가하는 투여량의 보르테조미브는 또한 포스포-STAT-3 및 포스포-p42/44 MAPK의 수준을 감소시켰다. 이들 데이터는 보르 테조미브가 IL-6 신호를 방해하는 것을 나타낸다(Hideshima T et al, Oncogene 2003, 22: 8386-93에도 기록). 게다가, CNTO 328은 각각 45 및 90%로 HSP-70 및 MKP-1의 보르테조미브-매개의 유도를 방해하며, 이는 전사적으로 활성이 있는 포스포-STAT-1 및 과인산화 HSF-1의 감소된 수준과 관련된다.

E. KNK437는 ANBL-6 및 HSF-1 +/+ MEF 세포의 보르테조미브-매개의 아포토시스를 증진시킨다.

12 시간(ANBL-6) 내지 24 시간 (MEFs) 동안 ANBL-6 또는 MEF 세포 (대조군 및 HSF-1 -/-)을 DMSO 대조군 또는 증가하는 농도의 보르테조미브 및 KNK437와 함께 인큐베이션하였다. 상기 개시된 바와 같이 아포토시스를 결정하고, DMSO-처리된 대조군에 대하여 아포토시스에서 배수 증가로 나타내었다. 10% FBS 및 1 ng/mL의 IL-6를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에 ANBL-6 세포를 처리하였다(도 5, 컬럼, 3중 배양의 평균; 바, SEM).

ANBL-6 세포를 KNK437로 처리하면, 대조군 처리된 세포와 비교하여, 보르테조미브-매개의 아포토시스에서 유의적인 증가가 유발되었다. 대조군 MEF와 비교하여 HSF-1 -/- MEF에서 보르테조미브-매개의 아포토시스의 증진이 무디어졌으며(도 6), 이는 배합물의 증가된 활성이 열 충격 단백질 반응의 하향-조절 때문인 것으로 제안된다.

보르테조미브와 CNTO328 배합물의 결과 요약

IL-6 중화 항체 CNTO 328은 용량- 및 시간-의존적 방식으로 다발 골수종 세포주 ANBL-6 및 KAS-6의 생존력을 감소시킨다.

대조군 항체 및 보르테조미브와 비교된 배합물과 함께, 세포 생존력 감소 및 아포토시스 증진에 의해 나타낸 바와 같이, ANBL-6 및 KAS-6 세포를 CNTO 328로 처리하면, 보르테조미브의 항-골수종 활성이 강력하게 된다. 열 충격 단백질 반응의 구성원의 초기의 상향-조절에 의하여, 또는 아마도, IL-6 신호의 중요한 다운스트림 매개자를 하향-조절하는 보르테조미브의 능력 때문에, 역순 보다는 보르테조미브 다음 CNTO 328로 순차적으로 세포가 처리될 때, CNTO 328의 항-골수종 효과가 감소되었다.

포스포-STAT-3 및 포스포-p42/44 MAPK 수준에서 상당한 감소로 나타낸 바와 같이, ANBL-6 및 KAS-6 세포를 CNTO 328로 처리하면, IL-6 신호의 하향-조절이 유발된다. 보르테조미브는 또한 농도-의존적 방식으로 포스포-STAT-3 및 포스포-p42/44 MAPK 수준을 하향-조절한다.

CNTO 328 및 보르테조미브의 배합물의 증가된 활성은 항-아포토시스 HSP-70 및 MKP-1의 감소된 보르테조미브-매개의 축적과 관련된다. 감소된 HSP-70 유도는 포스포-STAT-1 및 과인산화 HSF-1의 감소된 수준과 관련된다.

증가된 아포토시스 효과가 HSF-1-음성 마우스 배아 섬유아세포에서 상당히 무뎌지는 사실에서 나타낸 바와 같이, ANBL-6 및 KAS-6 세포를 KNK437로 처리하면, 보르테조미브의 아포토시스 활성이 증진되었으며, 이는 부분적으로 열 충격 단백질 반응의 유도를 방해하는 그의 능력에 기인한다.

함께 취하여, 상기 데이터는 보르테조미브/CNTO 328 배합물을 임상 시도로 옮기고, 보르테조미브에 대한 저항성을 하향-조절하는 것에 목적을 둔 다른 신규한 전략을 고안하기 위한 합리성을 제공한다(예를 들어, HSP-70, MKP-1의 억제제).

Claims (19)

1. IL-6 길항제와 함께 프로테아좀 억제제를 공동-투여하는 것을 포함하여, 치료를 필요로 하는 포유동물에서 암 질환 또는 증상을 치료하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, IL-6 길항제가 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 항체가 단일 클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 항체 또는 단편이 IL-6에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2항에 있어서, 항체 또는 단편이 IL-6 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab' 또는 F(ab')₂ 단편 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 3항에 있어서, 단일 클론 항체가 인간 IL-6와의 결합을 위하여 단일 클론 항체 cCLB8과 경쟁하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 3항에 있어서, 단일 클론 항체가 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 3항에 있어서, 단일 클론 항체가 0.01 mg/kg(체중) 내지 12.0 mg/kg(체중)의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 3항에 있어서, 단일 클론 항체가 볼루스 투여 후, 항체의 주입으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 포유 동물이 인간 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에 있어서, 프로테아좀 억제제가 보론산 디펩티드 프로테아좀 억제제 보르테조미브, PS-519 (1R-[1S,4R,5S]]-1-(1-하이드록시-2-메틸프로필)-4-프로필-6-옥사-2-아자비사이클로[3.2.1.]헵탄-3,7-디온); 클라스토-락타시스틴 베타-락톤; 락타시스틴, 에폭소마이신, CVT634 (-5-메톡시-1-인다논-3-아세틸-류실-D-류실-1-인다닐아미드), TMC96 ((3-메틸부타노일-L-트레오닌 N-(1-(2-(하이드록시메틸)-옥시란-2-일카보닐)-3-메틸부트-3에닐)아미드), MG-115, CEP1612 및 MG132으로 구성 된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항에 있어서, 프로테아좀 억제제가 보론산 디펩티드 프로테아좀 억제제 보르테조미브인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1항에 있어서, 암 질환 또는 증상이 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프모세포성 백혈병(CLL), 모발상세포 백혈병, 골수이형성 증후군(myelodyplastic syndrome)(MDS), 림프종, 호지킨 질환, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버키트림프종, 다발 골수종, 카포시육종, 결장직장암종, 췌장암종, 신세포암종, 전립선 세포 암종, 비인강 암종, 악성조직구증식, 악성종양의 종양부수증후군/과칼슘혈증, 고형 종양, 선암종(adenocarcinomas), 육종 및 악성 흑색종에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항에 있어서, 항-IL-6 길항제가 프로테오좀 억제제와 연속하여, 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 종양의 성장을 억제하기 위한 유효량으로, 막 결합 수용체를 통한 IL-6 활성화의 신호를 예방하는 단일 클론 항체 또는 이의 단편을 프로테아좀 억제제와 함께 포유 동물에 투여하는 것을 포함하여, 그를 필요로 하는 포유 동물에서 종양 성장 을 억제하는 방법.
17. 포유 동물에서 전이를 예방하기 위한 유효량으로, 막 결합 수용체를 통한 IL-6 활성화의 신호를 예방하는 단일 클론 항체 또는 이의 단편을 프로테아좀 억제제와 함께 포유 동물에 투여하는 것을 포함하여, 포유 동물에서 전이를 예방하는 방법.
18. 제 3항, 제 16항 또는 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 cCLB8 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
19. IL-6 길항제와 함께 프로테아좀 억제제를 공동-투여하는 것을 포함하여, 치료를 필요로 하는 포유 동물에서 IL-6 관련 질환 또는 증상을 치료하는 방법.

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