KR20080055940A - 식물에서 스트레스 내성을 향상시키는 방법 및 이들의 방법 - Google Patents
식물에서 스트레스 내성을 향상시키는 방법 및 이들의 방법 Download PDFInfo
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Abstract
식물에서 비생물적 스트레스에 증가된 내성이 저온 자극유도 단백질, 예를 들어, 박테리아 저온 자극유도 단백질을 발현하는 DNA의 도입이 제공된다.
Description
본 발명은 식물에서 저온(cold), 가뭄, 염, 저온 발아(cold germination), 고온(heat) 및 다른 비생물적(abiotic) 스트레스 내성(tolerance) 및 식물에서 바이러스, 진균, 세균 및 다른 생물적(biotic) 스트레스 내성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 식물의 세포 내에서 저온 자극유도 단백질(들)(cold shock protein(s))을 발현하므로써, 식물의 생물적 및 비생물적 스트레스 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
관련된 출원들에 대한 상호 참조
이 출원은 2003년 9월 29일자로 출원된 미국 가특허출원 60/506,717과 2003년 12월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 60/530453의 35USC§119(e)하에서의 이익을 주장한다.
서열 목록의 통합
2004년 9월 28일자로 제작되었으며, 약 98메가바이트(MS-DOS로 측정됨)인 파일 명칭 CSP.ST25.txt를 CD-ROM 상에 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록으로서 2종의 서열 목록(서열 목록 사본 1 및 서열 목록 사본 2)은 참고 문헌으 로 본원에 통합된다.
종자 및 과일 생산은 수-십억 달러의 산업이며, 미국의 많은 주들과 전세계 많은 나라들의 수입의 중요한 원천이다. 상업적으로 가치있는 종자들은, 예를 들면, 캐놀라(canola), 목화씨(cottonseed) 및 해바라기씨(sunflower seed)를 포함하며, 이들은 종자로부터 압착될 수 있는 식물성 오일용으로 귀중하게 여겨진다. 또한, 완두콩(pea), 강낭콩(bean) 및 렌즈콩(lentil)과 같은 콩과식물(leguminous plant)들의 종자는, 예를 들어 40~45% 단백질 및 18% 지방 및 오일로 이루어지는 대두(soybean)와 함께 단백질이 풍부하므로 상업적으로 가치가 있다. 추가적으로, 커피는 Coffea arabica 식물의 종자를 건조하여 볶아서 생산되는 귀중한 곡물이며, 초콜릿은 카카오 종자 또는 완두콩으로부터 생산된다. 유사하게, 예를 들어 옥수수, 쌀, 밀, 보리 및 다른 곡물, 견과(nut), 콩과식물(legume), 토마토, 및 감귤류 과일을 포함하는 여러 가지 과일 및 종자는 상업적으로 귀중하다. 예를 들어, 옥수수 종자는 여러 가지 음식 재료 또는 따꼬 쉘(taco shell), 옥수수 오일, 또르띠야(tortilla), 콘 플레이크(cornflake), 옥수수 스프 등과 같은 요리에 사용되는 재료로 사용된다. 또한, 옥수수는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 음식 및 에탄올 생산을 포함하는 여러 가지 생산 공정에서 원료로서 사용된다.
종자 및 과일 생산은 생물적 및 비생물적 스트레스에 기인하여 기본적으로 제한을 받는다. 예를 들어, 대두(Glycine max)는 저장 과정에서 종자 발아 능력의 손실로부터 어려움을 겪으며, 토양 온도가 저온일 때, 발아하지 못하는 곡물 종이 다((Zhang et al ., Plant Soil 188: (1997)). 또한, 옥수수 및 다른 식물은 작물학에서 중요하다. 식물에서 비생물적 스트레스 내성의 개선은, 성장체가 저온, 가뭄, 홍수, 고온, UV 스트레스, 오존 증가, 산성비, 공해, 염 스트레스, 중금속, 미네랄화된 토양, 및 다른 비생물적 스트레스에서 성장 및/또는 발아가 증가되게 하여 작물학적으로 이점이 있을 것이다. 또한, 진균 및 바이러스 감염과 같은 생물적 스트레스는 전세계적으로 많은 곡물 손실의 원인이 된다.
(하나의 유전형(genotype)의 특정 대립유전자(alleles)를 다른 것으로 교차시키는) 종래의 육종방법(bleeding)은 생물적 스트레스 내성, 비생물적 스트레스 내성, 및 생산량을 증가시키기 위하여 수세기 동안 사용되어 왔다. 종래의 육종방법은 모(parental) 식물에 존재하는 제한된 수의 대립유전자에 기본적으로 제한된다. 이로 인해 이러한 방법으로 추가될 수 있는 유전적 다양성을 제한한다. 분자생물학은 본 발명의 발명자들이 식물에서 스트레스 내성을 증가시킬 유전자들에 대한 시야를 넓히는 것을 가능하게 하였다. 본 발명자들은 어떻게 다른 생물체들이 스트레스성 상태에 반응하고, 내성을 나타내는지를 결정하기 위해 연구하였다. 저온 자극유도 단백질들은 저온 및 스트레스성 상태에서 생존하기 위하여 세균 및 다른 생물체에 의하여 사용되는 시스템의 일부이다. 식물 내로 저온 자극유도 단백질 및 이와 관련된 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하고, 이들을 발현하는 것은 식물의 저온, 가뭄, 고온, 물, 및 다른 비생물적 스트레스 내성뿐만 아니라, 식물의 진균, 바이러스, 및 다른 생물적 스트레스 내성을 증가시킨다는 점이 본 발명자들에 의하여 제시되었다. 또한, 그들은 저온 자극유도 단백질과 상동성(homologous)이거나, 서열 유사성(similarity)을 가지는 유전자의 사용은 생물적 및 비생물적 스트레스 내성을 증가시킨다고 생각하였다
본 발명은 경작자가 생물적 및 비생물적 스트레스 내성에 기인한 생산량 손실을 제한하는데 유용한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 식물의 세포에서 저온 자극유도 단백질(Csp)을 발현하는 식물을 제공한다. 상기 Csp의 발현은 상기 식물에서 우수한 비생물적 스트레스 내성을 유도한다. 하나의 구체예에 있어서, Csp를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 식물에서 작용하는 작동 가능하게 연결된 프로모터(promoter), 및 식물에서 작용하는 작동가능하게 연결된 터미네이터(terminator)에 의하여 발현된다.
보다 바람직하게, 본 발명은, 5'에서 3' 방향으로, 식물에서 작용하는 프로모터를 포함하는 제1의 DNA 폴리뉴클레오티드, 여기에 작동 가능하게 연결된 저온 자극유도 단백질을 코딩하는 제2의 DNA 폴리뉴클레오티드, 여기에 작동 가능하게 연결된 폴리아데닐화(polyadenylation) 부위를 제공하는 3' 전사종결 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 제1의 DNA 폴리뉴클레오티드는 제2의 DNA 폴리뉴클레오티드와 이종(heterologous)인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 제1의 DNA 폴리뉴클레오티드 및 제2의 DNA 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입된 인트론(intron)을 가지는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 제2의 DNA 폴리뉴클레오티드가 서열 번호:3의 모티프(motif)를 포함하는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 본 발명의 재조합 DNA의 어떠한 구체예들에 있어서, 제2의 폴리뉴클레오티드는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질을 코딩한다:
(a) 그람 양성 세균(gram positive bacteria) 유래의 저온 자극유도 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(b) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 저온 자극유도 단백질,
(c) 바실러스 서브틸리스 저온 자극유도 단백질 B(CspB)의 상동체(homologue),
(d) 서열 번호:2와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(e) 그람 음성 세균(gram negative bacteria) 유래의 저온 자극유도 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(f) 대장균(Escherichia coli) 유래의 저온 자극유도 단백질을 포함하는 단백질,
(g) 대장균 저온 자극유도 단백질 A(CspA)의 상동체,
(h) 서열 번호:1과 실질적인 동일성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(i) 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 저온 자극유도 단백질, 및
(j) 서열 번호:5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 또는 65 중 어느 하나와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
또한, 본 발명은 유도성 프로모터(inducible promoter), 구성적 프로모터(constitutive promoter), 시간적으로 조절되는 프로모터(temporal-regulated promoter), 발생학적으로 조절되는 프로모터(developmentally-regulated promoter), 조직 선택성 프로모터(tissue-preferred promoter), 저온 내성이 향상된 프로모터(cold enhanced promoter), 저온 특이적 프로모터(cold-specific promoter), 스트레스 내성이 향상된 프로모터(stress enhanced promoter), 스트레스 특이적 프로모터(stress specific promoter), 가뭄 유도성 프로모터(drought inducible promoter), 수분결핍 유도성 프로모터(water deficit inducible promoter), 및 조직 특이적 프로모터(tissue-specific promoter)로 구성되는 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 게놈(genome)상에, 상기 설명된 바와 같은 재조합 DNA 분자들을 포함하는 식물 세포 및 식물 및 이들로부터 생산된 번식체(propagule) 및 자손을 제공한다. 식물은 농작물, 단자엽식물 및 쌍자엽식물을 포함하지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 이들은 대두, 옥수수, 캐놀라, 벼, 목화, 보리, 귀리, 잔디 및 밀을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 저온 자극유도 단백질을 발현하는 재조합 DNA 분자로 형질전환된 비생물적 스트레스 내성인 형질전환 식물을 제공한다. 이러한 식물 및 이들의 세포 및 종자와 같은 번식체는 이들의 게놈 내에서 저온 자극유도 단백질을 발현하는 재조합 DNA 분자를 포함한다. 이들 식물은 다음과 같은 하나 이상의 향상된 특성을 나타낸다:
동일한 종의 비형질전환된 식물에 대하여 성장이 제한될 수 있는 저온의 조건에서 높은 성장 속도,
(a) 동일한 종의 비형질전환된 식물에 대하여 성장이 제한될 수 있는 고온의 조건에서 높은 성장 속도,
(b) 동일한 종의 비형질전환된 식물에 대하여 성장이 제한될 수 있는 수분의 조건에서 높은 성장 속도,
(c) 동일한 종의 비형질전환된 식물에 대하여 성장이 제한될 수 있는 토양 및/또는 수분에서 증가된 염 또는 이온의 조건에서 높은 성장 속도,
(d) 저온 자극유도 후, 동일한 종의 비형질전환된 식물보다 증가된 식물 생존율,
(e) 동일한 종의 비형질전환된 식물과 비교할 때, 증가된 생산율, 또는
(f) 동일한 종의 비형질전환된 식물과 비교되는 가뭄에 대한 저항성.
본 발명의 방법은, 예를 들어 종자를 생산하기 위한 목적으로 토양에 이러한 종자를 간단히 심어서 본 발명의 식물을 번식시키고, 예를 들어 스트레스 상태에서 이들이 성장 가능하게 하는 것을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 생물적 스트레스 내성, 증가된 수득율 또는 증가된 뿌리 중량과 같은 향상된 특성을 갖는 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 상기의 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a) 식물세포 또는 세포들의 게놈으로 저온 자극유도 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 DNA 분자를 도입하는 단계,
b) 형질전환된 식물세포 또는 세포들을 획득하는 단계,
c) 상기 형질전환된 식물세포(들)로부터 식물을 재생산하는 단계, 및
d) 향상된 특성을 나타내는 식물을 선별하는 단계.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 식물들은 고온 내성, 염 내성, 가뭄 내성, 및 저온 자극유도 후 생존으로 구성되는 군으로부터 선택된 향상된 비생물적 스트레스 내성을 나타낸다.
또한, 본 발명은 서열 번호: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 40%의 동일성인 분리된 단백질을 제공한다. 어떠한 측면에 있어서, 비교될 수 있는 특성은 저온 자극유도 단백질을, 40%의 동일성보다 더 높은 상동성(homology)을 갖는 단백질, 예를 들어 본원에서 설명된 저온 자극유도 단백질과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95%가 동일한 단백질로 치환하므로써 달성될 수 있다. 유사하게, 또한 본 발명은 서열 번호:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 90 및 92을 포함하는 군으로부터 선택된 DNA 서열을 갖는 핵산들과 혼성화(hybridization)되는 저온 자극유도 단백질 모티프를 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 바람직하게는, 서열 번호: 5, 7, 9, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65로 구성되는 군으로부터의 서열과 실질적으로 동일한 DNA 서열을 갖는 저온 자극유도 단백질을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 분자를 포함하는 번식체 및 이들이 심어지거나, 발아되었을 때, 상기 번식체(예를 들어, 이러한 번식체는 종자이다)로부터 발아되는 식물군을 제공한다.
또한, 본 발명은 토양에 청구항 59의 종자를 심고,
b) 상기 식물로부터 종자를 수확하고,
c) 이들로부터 종자를 얻는 것을 포함하는 종자를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 형질전환 식물을 생산하는 방법이 제공되며, 이는 다음의 단계를 포함한다:
(ⅰ) 서열 번호: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 40%의 상동성이며, 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 전사종결 DNA 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA분자 또는 이것의 단편 또는 이것의 시스 엘레멘트(cis element)를 식물세포의 게놈 내로 도입시키는 단계,
(ⅱ) 상기 형질전환된 식물세포를 선별하는 단계, 및
(ⅲ) 형질전환된 식물에서 상기 형질전환 식물세포를 재생산하는 단계.
또한, 상기 방법에 의하여 제조되는 식물을 제공한다.
바람직한
구체예들의
상세한 설명
본 발명은 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 식물을 제공한다. 본 발명에 의하여 제공되는 식물은 상기 식물의 세포들 내에서 저온 자극유도 단백질의 발현으로 증가된 스트레스 내성을 갖는다. 본 발명은 몇 가지의 구체예들을 제공하며, 본 발명의 작용으로 기대되는 다른 구체예들을 포함한다.
다음의 정의들과 방법들은 본 발명을 더 잘 정의하고, 본 발명을 실시하는데 있어서 당업자들에게 도움을 제공하기 위한 것이다. 달리 지적되지 않는 한, 용어들은 당업자들에 의한 통상적인 용례로서 이해될 것이다. 예를 들면, 분자생물학과 분자유전학에서 사용되는 통상적인 용어들의 정의는 Lewin, Genes VII, Oxford Uniersity Press and Cell Press, New York, 2000; Buchanan et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Courier Companies, USA, 2000; Lodish 등, Molecular Cell Biology, W.H.Freeman and Co., New York 2000에서 찾아볼 수 있다. 유전학에서의 통상적 용어들은 Lynch et al., Genetics and Analysis of quantitative Traits, Sinauer and Associates, Sunderland. MA, 1998; Hartwell et al., Genetics ; From Genes to Genomes, McGraw-Hill Companies, Boston, MA, 2000; Hastl et al., Genetics ; Analysis of Genes and Genomes, Jones and Bautlett Publishers, Sudbury, MA, 1998; Strachau et al., Human Molecular Genetics, John wiley and Sons, New York, 1999뿐만 아니라 상기한 참고 문헌들로부터 발견될 수 있다.
DNA 염기들에 대한 명명법은 37CFR§1.822에서 설명된 바에 따라 사용된다.
아미노산 잔기들에 대하여는 표준의 1 및 3문자 명명법이 사용된다.
많은 작물학적 특성들은 "수율"에 영향을 끼칠 수 있다. 예를 들면, 이들은 제한 없이, 식물 높이, 꼬투리 수, 식물상의 꼬투리 위치, 마디 사이의 수, 꼬투리 파편의 영향, 낟알 크기, 마디 생김과 질소 고정의 효율, 영양분 동화작용의 효율, 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 저항성, 탄소동화작용, 식물 건축술, 도복(lodging)에 대한 저항성, 종자발아 백분율, 묘목 활기와 발육기 특성들을 포함한다.
예를 들면, 또한 이들은 제한 없이, 발아의 효율(스트레스 조건 내에서 성장 속도를 포함), 어떤 또는 모든 식물 부위들의 성장 속도(스트레스 조건 내에서의 성장 속도를 포함), 이삭의 수, 이삭당 종자 수, 종자 크기, 종자의 조성(녹말, 오일, 단백질), 종자 충전(seed fill) 특성들을 포함한다.
수율은 여러 가지 방법으로 측정가능하고, 이들은 테스트 중량, 종자 중량, 식물당 종자 수, 단위 면적당 종자수 또는 종자 중량(즉, 에이커 당 종자 또는 종자의 무게), 에이커 당 부셸(bushel), 에이커 당 톤, 헥타르 당 킬로를 포함한다. 하나의 구체예에 있어서, 본 발명의 식물은 구성 성분의 수득율이 향상된 특성을 나타낸다.
"핵산(서열)" 또는 "폴리뉴클레오티드(서열)"은 게놈성 또는 합성 기원의 단일 또는 이중 가닥의 DNA(데옥시리보핵산) 또는 RNA(리보핵산), 즉, 각각 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기들의 중합체를 나타내고, 5'(상류) 말단으로부터 3'(하류) 말단으로 읽는다. 핵산은 센스 또는 상보적(안티센스) 가닥을 나타낼 수 있다.
"천연의"는 자연적으로 발생하는 ("야생형") 핵산서열을 나타낸다.
"이종" 서열은 외래 기원 또는 외래종으로 유래되거나, 만약 동일 기원으로부터 유래한다면, 그것의 원래 형태로부터 수식된 서열을 나타낸다. 예를 들면, 천연의 프로모터는 동일한 종들로부터 또는 상이한 종들로부터 유래된 이종 유전자의 전사를 유발하기 위하여 사용될 수 있다.
식물의 "부분"은 제한을 하지는 않지만, 뿌리, 싹, 잎, 줄기, 꽃가루, 종자, 꽃, 수술, 암술, 난자, 배, 꽃잎, 필라멘트, (주두, 자방과 화주를 포함하는)꽃잎, 세포(들) 또는 상기 것들의 어떠한 조각을 포함하는 식물의 모든 부분 또는 조각을 포함한다.
"번식체"는 제한을 두지는 않지만, 새로운 식물을 번식시킬 수 있는 식물의 종자 및 부분을 포함하는 감수분열과 유사분열의 모든 생성물들을 포함한다.
예를 들면, 번식체는 새싹, 뿌리, 완전한 식물로 성장될 수 있는 다른 식물부분 등을 포함한다. 또한, 번식체는 식물의 한 부분이 다른 식물의 다른 부분으로 이식되어 살아있는 생물체를 만들어 내는 이식부분(graft)을 포함한다. 또한, 번식체는 클로닝 또는 (천연적으로 또는 인위적으로) 감수분열 생성물을 함께 모으거나, 또는 감소분열 생성물들을 함께 모아서 배아 또는 수정란을 형성하는 것을 가능하게 하므로써 생산된 모든 식물 및 종자를 포함한다.
"분리된" 핵산 서열은 핵산이 자연적으로 발생되는 생물체의 세포 내에서 상기 핵산과 일반적으로 관련되는 다른 핵산 서열들, 즉, 다른 염색체성 또는 염색체 외 DNA로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 것을 나타낸다. 상기 용어는 핵 산이 다른 세포 성분들과 섞이는 것을 실질적으로 제거시키기 위하여 생화학적으로 정제된 핵산들을 포함한다. 또한, 상기 용어는 재조합 핵산과 화학적으로 합성된 핵산을 포함한다.
본원에서 사용되는 것으로, "동일성" 또는 "동일한"은 단백질(들) 또는 핵산(들)을 비교할 때 98% 또는 그 이상의 동일성을 의미한다.
만약 다른 핵산(또는 그것의 상보적인 가닥) 또는 단백질 (비교되는 참고 서열의 총 20% 미만으로 삽입 또는 결실된 적절한 뉴클레오티드 또는 아미노산)과 최적으로 정렬(align)되었을 때, 제1의 핵산 또는 단백질의 적어도 20 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치들, 바람직하게는 적어도 50 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치들, 보다 바람직하게는 적어도 100 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치들, 및 가장 바람직하게는 제1의 핵산 또는 단백질의 전장과의 비교를 통하여 적어도 약 60%의 뉴클레오티드 서열 동일, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 동일, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 동일하다면, 상기 제1의 핵산 또는 단백질 서열은 참고 핵산 서열 또는 단백질과 "실질적 동일성" 또는 "실질적 유사성"을 나타내는 것이다. 비교창 정렬을 위한 서열의 최적 정렬은 국부적 상동성 알고리즘에 의해 실시될 수 있고, 바람직하게는 이들 알고리즘의 컴퓨터화 수행에 의해 실시 가능하다(예를 들면, Wisconsin Genetics software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI에서 발견될 수 있다). 참고 핵산은 전장 분자 또는 긴 분자의 일부분일 수 있다. 또는, 만약 하나가 엄격한(stringent) 조건 하에서 다른 것에 혼 성화되면, 두 핵산은 실질적인 동일성을 갖는다. 적절한 혼성화 조건은 경험적으로 결정될 수 있거나, 예를 들어, 프로브의 상대적 G+C 함량 및 만약 서열이 알려진 경우라면, 프로브와 표적 서열 사이의 잘못 짝지워지는 염기의 수에 기초하여 예측될 수 있다. 혼성화 조건은, 예를 들어 혼성화 온도 또는 염 농도를 변화시키므로써 원하는 것으로 조절될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989).
제1의 핵산 서열이 제2의 핵산 서열과 "작동 가능하게 연결된" 것은 제1의 핵산 서열이 제2의 핵산 서열의 기능에 영향을 주도록 상기 서열들이 배열된 경우이다. 바람직하게는, 두 개의 서열들은 단일의 근접한 핵산 분자의 부분이고, 더욱 바람직하게는, 인접한 것이다. 예를 들면, 프로모터가 세포에서 유전자의 전사를 조절 또는 중재한다면, 프로모터는 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들면, 전사종결영역(터미네이터)이 RNA 폴리머라아제로 하여금 터미네이터에서 또는 터미네이터 근처에서 상기 유전자를 포함하는 전사체의 전사를 종결하도록 유도할 때, 터미네이터는 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 인핸서(enhancer)는 일반적으로 동일한 핵산 분자 내에서 그것의 효과를 나타내지만, 일반적으로 프로모터에 인접하지는 않는다.
"재조합" 핵산 또는 DNA 또는 RNA 분자는, 두 개의 다른 분리된 서열 단편들의 인공적 조합에 의해, 예를 들면 화학적 합성에 의해, 또는 유전공학 기술들에 의한 분리된 핵산 단편들의 조작에 의해 제조된다. 핵산 조작을 위한 기술들은 잘 알려져 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular cloning ; A Laboratory manual, 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989 참고). 예를 들어, 핵산의 화학적 합성은 Beaucage and Carruthers, Tetra Letts, 22: 1859~1862, 1981 및 Matteucci et al., J. Am. chem. Soc. 103: 3185, 1981에서 설명된다. 예를 들어, 핵산의 화학적 합성은 상업적인 자동화 올리고뉴클레오티드 합성장치상에서 수행될 수 있다.
유전자의 "발현"은 상응하는 mRNA를 생산하기 위한 유전자의 전사 및 상응하는 유전자 생산물, 즉, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 생산하기 위한 상기 mRNA의 번역을 나타낸다. 유전자 발현은 프로모터와 같은 5' 조절 인자를 포함하는 조절인자에 의하여 조절 또는 조정된다.
용어 "재조합 DNA 구조체", "재조합 벡터", "발현 벡터" 또는 "발현 카셋트"는 하나 이상의 DNA 서열이 기능적으로 작동 가능한 방식으로 연결된 DNA 분자를 포함하는, 게놈 통합 또는 자가 복제할 수 있는, 어떤 기원으로부터 유래된 플라스미드, 코스미드, 바이러스, BAC(박테리아성 인공염색체), 자가복제서열(autonomously replicating sequence), 파아지, 또는 선상 또는 환상 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 서열과 같은 어떠한 작용물질(agent)을 나타낸다.
용어 "상보적인"은 염기쌍 형성에 의한 핵산 서열의 자연적인 연관을 나타낸다. 두 단일 가닥 분자들 사이의 상보성은, 만약 핵산 쌍의 일부가 상보적이라면 부분적일 수 있고, 만약 모든 염기 쌍이 상보적이라면 완전할 수 있다. 상보성의 정도는 혼성화 및 증폭 반응의 효율성 및 강도에 영향을 준다.
"상동성"은 뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성 또는 유사성, 즉, 각각 서열 동일성 또는 유사성의 관점에서 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 유사성의 정도를 나타낸다. 또한, "상동성", "상동체", 및 "상동의"는 다른 핵산 또는 단백질 사이의 유사한 작용 특성의 개념을 나타낸다. 상동체는 오르토(orthologous) 및 파라(paralogous)인 유전자를 포함한다. 유전자에 대한 상동체는 본원에서 설명된 유전자 또는 적절한 데이터베이스(NCBI 등과 같은)에서 발견되는 유전자를 코딩하는 서열을 사용하여 하나 이상의 다음의 방법들로 결정될 수 있다. 단백질 서열에 대하여, 상기 서열은 알고리즘을 사용하여 비교될 수 있다(예를 들면, "동일성" 및 "실질적 동일성"에 관한 내용 참고). 뉴클레오티드 서열에 대하여, 거의 동일한 방법으로 하나의 DNA 분자의 서열이 공지 또는 추정적 상동체의 서열과 비교될 수 있다. 상동체는 분자(DNA, RNA, 또는 단백질 분자)의 어떠한 실질적인 영역(25 뉴클레오티드 또는 아미노산, 바람직하게는 50 뉴클레오티드 또는 아미노산, 보다 바람직하게는 100 뉴클레오티드 또는 아미노산, 가장 바람직하게는 짧은 서열의 전장)에 대하여 적어도 20% 동일, 바람직하게는 30% 동일, 보다 바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 88%, 92% 동일, 가장 바람직하게는 95% 동일이다.
또한, 만약, 아미노산 서열을 코딩하는, 또는 코딩할 수 있는 두 서열, 또는 하나 또는 양 서열의 상보가닥이 엄격한 조건하에서 서로 혼성화되고, 유사한 기능을 나타낸다면, 상기 두 서열, 또는 DNA 또는 RNA 분자들은 상동성이거나, 상동체이거나, 또는 상동성 서열을 코딩한다. 따라서, 만약 두 단백질 서열이 상동성인지 여부를 결정하려고 하다면, 본원에서 설명된 컴퓨터 시험을 하고, 단백질을 코딩할 수 있는 모든 가능한 핵산 서열의 중첩적(degenerate) 코딩 서열을 제조하고, 이들이 엄격한 조건에서 혼성화될 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 엄격한 조건은 당업자에게 공지이고, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 발견되는데, 예를 들어 45℃에서 6.0 x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)를 가하고, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하는 것이다. 예를 들어, 세척 단계에서 염의 농도는 50℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성으로부터 50℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격성까지 선택될 수 있다. 추가적으로, 세척 단계의 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄격성 조건까지 증가될 수 있다. 다른 가변성 인자가 변화하는 동안, 온도와 염의 양쪽 모두 변화되거나, 또는 온도 또는 염의 농도가 일정하게 유지될 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에서 설명된 단백질을 코딩하는 핵산은, 예를 들어, 약 2.0 x SSC 및 약 65℃의 매우 높은 엄격성 조건에서 하나 이상의 핵산 분자 또는 이들의 상보가닥 또는 이들의 단편과 특이적으로 혼성화될 것이다. 프로브가 표적 DNA 분자에 혼성화되는 것은 당업자에게 공지된 몇 가지 방법으로 확인될 수 있는데, 이러한 것으로 제한 없이, 형광 태그, 방사성 태그, 항체 태그, 및 화학발광 태그를 포함한다.
"저온 자극유도 단백질(들)"(Csp(s) 또는 CSP(s))는 대장균 CspA단백질(서열 번호:1) 또는 바실러스 서브틸리스 CspB단백질(서열 번호:2)에 대해 40% 이상의 동일성을 갖는 단백질이거나, 또는, 저온 자극유도 단백질들은 문헌에서 결정된 바와 같이 보존된 도메인을 사용하여 찾아볼 수 있다.
예를 들면, 본원에서 사용되는 것으로, 저온 자극유도 단백질은 대장균 CspA 또는 바실러스 서브틸리스 CspB의 전장에 대하여, 대장균 CspA 또는 바실러스 서브틸리스 CspB와 40%의 동일성, 더욱 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%의 동일성을 갖는다. 몇 가지의 데이터베이스들은 당업자들에게 새로운 또는 현존하는 단백질이 저온 자극유도 도메인을 포함하는지 또는 저온자극유도 단백질인지를 결정하기 위하여 단백질 관련성의 결정 및/또는 관련된 단백질을 탐색하기 위하여 디자인된 단백질 데이터베이스인 유전자은행(Genbank)을 이용할 수 있다. 제한 없이, 대장균 CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH 및 CspI (U.S. Patent 6,610,533)를 포함하는 모든 공지된 저온 자극유도 단백질은 본원의 정의에 포함된다.
보존된 저온 자극유도 도메인은 서열 번호:3([FY]-G-F-I-x(6.7)-[DER]-[LIVM]-F-x-H-x-[STKR]-x[LIVMFY])(Prosite motif PS00352; Bucher and Bairoch, (In)ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Artman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53~61, AAAIPress, Menlo Park, 1994; Hofmann et al., Nucleic Acids Res. 27:215, 1999)에 나타난다. 대안으로, 저온 자극유도 단백질들은 스프린트 데이터베이스(sprint detabase)(관련된 단백질 핑거프린팅 데이터베이스)(Attwood et al., Nucleic Acids Res. 28(1):225, 2000; Attwood et al., Nucleic Acids Research, 30(1), in press, 2002)를 사용하여 검색할 수 있다. 대안으로, 저온 자 극유도 단백질들은 매트릭스 기초 설명 또는 Pfam을 사용하여 검색할 수 있다. Pfam은 다중 서열 정렬 및 많은 통상의 단백질 도메인들을 포함하는 숨겨진 Markov 모델의 광범위한 콜렉션이다(Bateman et al.,Nucleic Acids Research 28:263, 2000). 이 문서(2001년 11월; Pfam release 6)에는 3071 종이 있다. 저온 자극유도 단백질들은 PF00313으로서 포함된다. 계통수는 Pfam 데이터베이스에서 결정된 바와 같은 저온 자극유도 단백질의 분포를 보여준다.
또한, 본원에서 사용되는 것으로 "저온 자극유도 단백질"은 제한 없이, 국립생물공학정보센터(NCBI)에서 찾아볼 수 있는 "Blink"(Blast Link)를 사용하는 데이터베이스를, 검색 서열로서 저온 자극유도 단백질을 사용하여, 검색하므로써 발견되는 어떤 단백질을 포함한다. "Blink"는 유사한 서열들을 지닌 단백질들을 찾는데 사용되는 신속한 검색 도구이다. 이러한 "저온 자극유도 단백질" 또는 "저온 자극유도 도메인"의 정의는 상기한 정의에 추가되며, 상기 정의를 대체하지는 않는다. 저온 자극유도 단백질 또는 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질은, 제한되지는 않지만, Blast Link에서 근래에 사용되는(2001년 11월 1일) 표준 블라스트 검색 셋팅에 의해 "힛트(hits)"인 것으로 판명될 정도로, 청구된 단백질(예를 들면, 대장균 CspA와 바실러스 서브틸리스 CspB)과 충분히 유사한 것으로 밝혀진 것들뿐만 아니라, 공공 데이터베이스 또는 개인 데이터베이스에서 현재 알려진 모든 단백질들을 포함한다. 현재 Blast2가 운영되고 있고, Blast Link("Blink")는 단백질-단백질 블라스트 검색을 위한 디폴터(default) 변수를 운영한다. 현재 Blink에서 사용되는 디폴터 셋팅은 다음과 같은 것으로 보여진다: BLOSUM62 매트릭스는 "nr"데이 터베이스를 사용하여 운영되고, CD 검색은 구성에 기초한 통계로서, 복잡성은 "낮은 복잡성(low complexity)"으로서 선택되고, 기대값(expect)은 10, 글자크기(word size)는 3이고, 갭 코스트(gap costs)는 실재(existence) 11, 확장(extension) 1이다. 표 1의 목록은 이들 표준셋팅을 사용하여 검색된 대장균 CspA에 대한 처음 200힛트를 보여주지만, 처음 200힛트로 청구범위를 제한하는 것은 아니다. 당업자는 이와 같은 아주 엄격한 조건하에서 박테리아 기원의 167개의 단백질들이 검색되고, 또한 28개의 메타조안(Metazoan)과 5개의 식물 단백질이 검색되었음을 주목하여야 한다. 이러한 단백질들은 CspA와의 상동성으로 인하여 본 발명에서 작용할 것으로 기대되는 광범위한 단백질들을 포함한다. 목록에 포함된 것이 전부가 아니며, 다른 단백질들도 본 발명에서 작용할 것으로 기대된다.
표 20: 대장균 CspA에 유사한 것으로 검색된 몇 가지의 저온 자극유도 단백질들과 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질. 이 목록은 NCBI에서 표준 블라스트 링크 셋팅(standard Blast Link setting)을 사용하여 수집되었다. 유전자은행 ID와 각 단백질의 명칭이 나타나 있다. 주: 단백질이 명명된 방식에 따라서 어떤 단백질 및 서열은 단백질, cDNA, 대립유전자 등과 같은 여러 가지 항목으로 개시된다. 유전자은행 ID는 각 단백질에 대한 특정적 표시인 것으로 여겨질 수 있다. 목록은 검색 서열과 비교하여 가장 높은 동일성에서 가장 낮은 동일성으로의 대략적인 순서로 되어있다.
| 유전자은행 ID # | 유전자 명칭 | |
| 576191 | (대장균의) 주요 저온 자극유도 단백질 7.4 (Cspa (Cs 7.4)) | |
| 349561 | DNA-결합 단백질 [Salmonella typhimurium] | |
| 3891780 | 대장균 용액 Nm 유래의 주요 저온 자극유도 단백질, 사슬 A | |
| 479003 | 저온 자극유도 단백질 [Escherichia coli] | |
| 1778828 | 주요 저온 자극유도 단백질 CSPA2 [Yersinia enterocolitica] | |
| 6073870 | 주요 저온 자극유도 단백질 CSPA1 [Yersinia enterocolitica] | |
| 1468921 | 저온 자극유도 단백질 CspG [Escherichia coli] | |
| 2275140 | 가상(hypothetical) 단백질 [Yersinia pestis] | |
| 12514257 | 저온 자극유도 단백질 [Escherichia coli O157:H7 | |
| 15981565 | 주요 저온 자극유도 단백질 Cspa1 [Yersinia pestis] | |
| 3249024 | 저온 자극유도 단백질 CspB [Yersinia enterocolitica] | |
| 15979692 | 저온 자극유도 단백질 [Yersinia pestis] | |
| 1742550 | 저온 자극유도-유사 단백질 CspB. [Escherichia coli] | |
| 16419141 | RNA 샤페론, cspA 전사의 음성적 조절인자 [Salmonella] | |
| 10039151 | 저온 자극유도 단백질 cspE [Buchnera sp. APS] | |
| 9957540 | 저온 자극유도 단백질 B [Yersinia enterocolitica] | |
| 1778540 | 저온 자극유도-유사 단백질 [Escherichia coli] | |
| 471099 | CspE (MsmC) [Escherichia coli] | |
| 2961317 | cspB [Salmonella typhimurium] | |
| 16503235 | 저온 자극유도 단백질 [Salmonella enterica subsp. enterica serovar] | |
| 9658370 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Vibrio cholerae] | |
| 460698 | CspC (MsmB) [Escherichia coli] | |
| 15980582 | 추정 저온 자극유도 단백질 [Yersinia pestis] | |
| 10038996 | 저온 자극유도-유사 단백질 cspC [Buchnera sp. APS] | |
| 15979774 | 저온 자극유도 단백질 [Yersinia pestis] | |
| 9657556 | 저온 자극유도 전사 조절인자 CspA [Vibrio cholerae] | |
| 4454361 | 저온 자극유도 단백질, CSPA [Vibrio cholerae] | |
| 2970685 | 저온 자극유도 단백질 C [Salmonella typhimurium] | |
| 1402743 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Citrobacter freundii] | |
| 5869509 | CspG [Shewanella violacea] | |
| 5869504 | CspA [Shewanella violacea] | |
| 9968446 | 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus plantarum] | |
| 1405474 | CspC 단백질 [Bacillus cereus] | |
| 3850776 | 저온 자극유도 단백질 D [Lactococcus lactis] | |
| 10176234 | 저온 자극유도 단백질 [Bacillus halodurans] | |
| 1869948 | 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus plantarum] | |
| 729220 | 저온 자극유도 단백질 CSPC | |
| 7379745 | 추정 전사 조절인자 [Neisseria meningitidis Z2491] | |
| 1620431 | csp [Lactobacillus plantarum] | |
| 1405472 | CspB 단백질 [Bacillus cereus] | |
| 3892590 | 저온 자극유도 단백질 E [Lactococcus lactis] | |
| 7226073 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Neisseria meningitidis MC58] | |
| 2493766 | 저온 자극유-유사 단백질 CSPLA (CSPL) | |
| 1001878 | CspA 단백질 [Listeria monocytogenes] | |
| 13623066 | 추정(putative) 저온 자극유도 단백질 [Streptococcus pyogenes M1 GAS] | |
| 758663 | 저온 자극유도 단백질 [Arthrobacter globiformis] | |
| 4468119 | 저온 자극유도 단백질 A; CspA 단백질 [Bordetella pertussis] | |
| 2370256 | 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis] | |
| 1405470 | CspA 단백질 [Bacillus cereus] | |
| 2226349 | CspC [Staphylococcus aureus] | |
| 1405476 | CspD 단백질 [Bacillus cereus] | |
| 1513079 | 저온 순화 단백질 A [Pseudomonas fragi] | |
| 7242722 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] | |
| 2425105 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Micrococcus luteus] | |
| 2105046 | cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] | |
| 15023696 | 저온 자극유도 단백질 [Clostridium acetobutylicum] | |
| 12720931 | MsmB [Pasteurella multocida] | |
| 8101860 | 주요 저온 자극유도 단백질 CspA [Staphylococcus aureus] | |
| 1513081 | 저온 순응 단백질 B [Pseudomonas fragi] | |
| 3097243 | 작은 저온 자극유도 단백질 [Mycobacterium leprae] | |
| 9587215 | 저온 자극유도 단백질 CspA [Mycobacterium smegmatis] | |
| 9107526 | 저온 자극유도 단백질 [Xylella fastidiosa 9a5c] | |
| 1256629 | 저온 자극유도 단백질 [Bacillus subtilis] | |
| 12054789 | 저온 자극유도 단백질 (CspLB) [Listeria monocytogenes] | |
| 1864167 | 주요 저온 자극유도 단백질 유사체 CspB [Listeria monocytogenes] | |
| 1421212 | 주요 저온 자극유도 단백질 (Cspb) | |
| 297761 | 저온 자극유도 단백질 (CspB) [Bacillus subtilis] | |
| 13625473 | 저온 순응 단백질 CapB [Pseudomonas sp. 30/3] | |
| 9657576 | 저온 자극유도 DNA-결합 도메인 단백질 [Vibrio cholerae] | |
| 11933043 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Streptomyces nodosus] | |
| 11933034 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Streptomyces hygroscopicus] | |
| 8248794 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] | |
| 1778825 | 주요 저온 자극유도 단백질 CspA [Pseudomonas aeruginosa] | |
| 740006 | 저온 자극유도 단백질 | |
| 2226347 | CspB [Staphylococcus aureus] | |
| 1616777 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Stigmatella aurantiaca] | |
| 7210998 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] | |
| 729217 | 저온 자극유도 단백질 CSPB | |
| 1067201 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor] | |
| 7321274 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] | |
| 1402789 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Yersinia enterocolitica] | |
| 1513086 | 온도 순응 단백질 B [Pseudomonas fragi] | |
| 16411332 | 저온 자극유도 단백질과 유사 [Listeria monocytogenes] | |
| 5732895 | F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)] | |
| 4193390 | CspA [Myxococcus xanthus] | |
| 4193394 | CspC [Myxococcus xanthus] | |
| 1405478 | CspE protein [Bacillus cereus] | |
| 1402753 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Klebsiella pneumoniae] | |
| 2983729 | 저온 자극유도 단백질 [Aquifex aeolicus] | |
| 2815334 | 저온 자극유도 도메인 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] | |
| 4193398 | CspE [Myxococcus xanthus] | |
| 4193396 | CspD [Myxococcus xanthus] | |
| 2894098 | 저온 자극유도 단백질 [Thermotoga maritima] | |
| 15074838 | 추정 저온 자극유도-유사 전사 조절인자 단백질 | |
| 1402731 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Aeromonas hydrophila] | |
| 46789 | 7 kDa 저온 자극유도 유사 단백질 [Streptomyces clavuligerus] | |
| 9946316 | 저온 자극유도 단백질의 가능성 [Pseudomonas aeruginosa] | |
| 1402769 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Proteus vulgaris] | |
| 456240 | 주요 저온 자극유도 단백질 (CspB) [Sporosarcina globispora] | |
| 19743 | nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris] | |
| 15026046 | 저온 자극유도 단백질 [Clostridium acetobutylicum] | |
| 11493820 | 저온 자극유도 단백질 C [Yersinia enterocolitica] | |
| 4982460 | 저온 자극유도 단백질 [Thermotoga maritima] | |
| 15979415 | 저온 자극유도-유사 단백질 [Yersinia pestis] | |
| 16419455 | 저온 자극으로 유도되지 않는 CspA 유사 단백질 [Salmonella typhimurium | |
| 14523127 | 추정 저온 자극유도 단백질 [Sinorhizobium meliloti] | |
| 9107847 | 온도 순응 단백질 B [Xylella fastidiosa 9a5c] | |
| 3036806 | 글리신-강화 단백질 [Arabidopsis thaliana] | |
| 2182333 | Y4cH [Rhizobium sp. NGR234] | |
| 1402733 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Aeromonas salmonicida] | |
| 9655615 | 저온 자극유도 유사 단백질 CspD [Vibrio cholerae] | |
| 3831556 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Enterococcus faecalis] | |
| 3821915 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis subsp. cremoris] | |
| 15160284 | AGR_L_3376p [Agrobacterium tumefaciens] | |
| 6458627 | 저온 자극유도 단백질, CSD family [Deinococcus radiodurans] | |
| 3821923 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus helveticus] | |
| 3821911 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis subsp. lactis] | |
| 15157349 | AGR_C_4003p [Agrobacterium tumefaciens] | |
| 15154976 | AGR_C_161p [Agrobacterium tumefaciens] | |
| 3831558 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Pediococcus pentosaceus] | |
| 456238 | 저온 자극유도 단백질 [Bacillus subtilis] | |
| 117574 | 저온 자극유도 유사 단백질 CSPD (CSP-D) | |
| 12620649 | ID534 [Bradyrhizobium japonicum] | |
| 13424521 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Caulobacter crescentus] | |
| 3776223 | CspA [Sinorhizobium meliloti] | |
| 15075353 | 추정 저온 자극유도 전사 조절인자 단백질 [Sinorhizobium] | |
| 15075133 | 저온 자극유도 전사 조절인자 단백질의 가능성 [Sinorhizobium] | |
| 3821913 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis subsp. lactis] | |
| 13476765 | 저온 자극유도 단백질 [Mesorhizobium loti] | |
| 3821925 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Streptococcus thermophilus] | |
| 3821921 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus acidophilus] | |
| 729222 | 저온 자극유도 유사 단백질 CSPJ | |
| 15162334 | AGR_pAT_762p [Agrobacterium tumefaciens] | |
| 13475232 | 저온 자극유도 단백질 [Mesorhizobium loti] | |
| 9947082 | 저온 자극유도 단백질의 가능성 [Pseudomonas aeruginosa] | |
| 13424199 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Caulobacter crescentus] | |
| 9948689 | 저온 자극유도 단백질 CspD [Pseudomonas aeruginosa] | |
| 4193392 | CspB [Myxococcus xanthus] | |
| 13488430 | 저온 자극유도 단백질 [Mesorhizobium loti] | |
| 12720739 | CspD [Pasteurella multocida] | |
| 3831560 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Bifidobacterium animalis] | |
| 1513084 | 온도 순응 단백질 A [Pseudomonas fragi] | |
| 1169113 | 저온 자극유도 유사 단백질 CSPD | |
| 5714745 | 저온 자극유도 단백질 7.4 [Rhodococcus sp. 7/1] | |
| 1402767 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Photobacterium phosphoreum] | |
| 14523160 | CspA5 저온 자극유도 단백질 전사 조절인자의 가능성 | |
| 15979447 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Yersinia pestis] | |
| 13488214 | 저온 자극유도 단백질 [Mesorhizobium loti] | |
| 5714743 | 저온 자극유도 단백질 A [Rhodococcus sp. 5/14] | |
| 3861208 | 저온 자극유도 유사 단백질 (cspA) [Rickettsia prowazekii] | |
| 81624 | 글리신-강화 단백질 2 - Arabidopsis thaliana | |
| 15156913 | AGR_C_3315p [Agrobacterium tumefaciens] | |
| 15074652 | 추정 저온 자극유도 전사 조절인자 단백질 [Sinorhizobium] | |
| 7295442 | CG17334 유전자 산물 [Drosophila melanogaster] | |
| 3850772 | 저온 자극유도 단백질 A [Lactococcus lactis] | |
| 14334920 | 추정 글리신-강화 징크-핑거 DNA-결합 단백질 [Arabidopsis] | |
| 3892588 | 저온 자극유도 단백질 C [Lactococcus lactis] | |
| 2708747 | 추정 글리신-강화, 징크-핑거 DNA-결합 단백질 [Arabidopsis] | |
| 2739396 | Y-박스 단백질 [Drosophila melanogaster] | |
| 1402763 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Photobacterium mondopomensis] | |
| 15620137 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Rickettsia conorii] | |
| 1402755 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus casei] | |
| 409419 | Y-박스 인자 [Aplysia californica] | |
| 14039811 | Y-박스 결합 단백질 [Schistosoma japonicum] | |
| 9946868 | 저온 자극유도 단백질의 가능성 [Pseudomonas aeruginosa] | |
| 1483311 | Y-박스 단백질 [Dugesia japonica] | |
| 1477478 | Y-박스 결합 단백질 [Schistosoma mansoni] | |
| 1402759 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Listeria innocua] | |
| 15159048 | AGR_L_1288p [Agrobacterium tumefaciens] | |
| 2228815 | 주요 저온 자극유도 단백질 CspH [Salmonella typhimurium] | |
| 6911694 | 저온 자극유도 단백질 A [Streptococcus thermophilus] | |
| 2970679 | Y 박스 단백질 [Drosophila silvestris] | |
| 14602477 | 저온 자극유도 단백질 A와 유사 [Homo sapiens] | |
| 10727970 | yps 유전자 산물 [Drosophila melanogaster] | |
| 1402757 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Listeria grayi] | |
| 1402751 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Enterococcus faecalis] | |
| 1083796 | RYB-a 단백질 rat | |
| 505133 | RYB-a [Rattus norvegicus] | |
| 14523481 | CspA6 저온 자극유도 단백질 전사 조절인자의 가능성 | |
| 8100512 | Y-박스 단백질 ZONAB-B [Canis familiaris] | |
| 8100510 | Y-박스 단백질 ZONAB-A [Canis familiaris] | |
| 15306095 | 가상 단백질 XP_053028 [Homo sapiens] | |
| 10185725 | Y-박스 단백질 3 짧은 이소형태(short isoform) [Mus musculus] | |
| 10185723 | Y-박스 단백질 3 긴 이소형태(long isoform) [Mus musculus] | |
| 7385223 | RNA 결합 단백질 MSY4 [Mus musculus] | |
| 6166110 | DNA-결합 단백질 A (COLD SHOCK DOMAIN PROTEIN A) | |
| 1402783 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Streptococcus pyogenes] | |
| 1167838 | DNA-결합 단백질 [Homo sapiens] | |
| 1160331 | dbpA murine homologue [Mus musculus] | |
| 1101884 | YB2 [Rattus norvegicus] | |
| 950340 | DNA-결합 단백질 A [Homo sapiens] | |
| 532211 | Y-box 결합 단백질 [Mus musculus] | |
| 87332 | DNA-결합 단백질 A - human (fragment) | |
| 14742409 | 가상 단백질 XP_046353 [Homo sapiens] | |
| 14270385 | 저온 자극유도 도메인 단백질 [Takifugu rubripes] | |
| 9653686 | TSH 수용체 억제 인자-결합 단백질-1; TSEP-1 | |
| 8249978 | 저온 자극유도 단백질 B [Streptomyces coelicolor A3(2)] | |
| 3695368 | zfY1 [Danio rerio] |
바실러스 서브틸리스 CspB는 저온 자극유도의 응답으로 축적된 단백질이다(Willimsky et al., Journal of Bacteriology 174; 6326(1992)). 이것은 대장균 유래 CspA와 상동성이 있고(표1 참고), 단일가닥 핵산결합 도메인을 포함한다(Lopez et al., The Journal of Biological Chemistry 276; 15511(2001)). NCBI(Blink)에서 동일한 basic Blast 검색을 사용하여 다음의 단백질들이 "힛트"로 지정되었다. 여기에 나타낸 힛트의 수는 200에 한정되지만, 여러 가지 다른 단백질들이 본 발명에서 작용할 것으로 기대된다.
표 21: 바실러스 서브틸리스 CspB로 검색된 몇 가지의 저온 자극유도 단백질과 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질. 이 목록은 NCBI에서 표준 블라스트 링크(Blink) 셋팅(standard Blast Link setting)을 사용하여 수집되었다. 유전자은행 ID와 각 단백질의 명칭이 나타나 있다. 주: 단백질이 명명된 방식에 따라서 어떤 단백질 및 서열은 단백질, cDNA, 대립유전자 등과 같은 여러 가지 항목으로 개시된다. 유전자은행 ID는 각 단백질에 대한 특정적 표시인 것으로 여겨질 수 있다. 목록은 검색 서열과 비교하여 가장 높은 동일성에서 가장 낮은 동일성으로의 대략적인 순서로 되어있다.
| 유전자은행 ID # | 유전자 명칭 |
| 1421212 | 주요 저온 자극유도 단백질 (Cspb) |
| 1405476 | CspD 단백질 [Bacillus cereus] |
| 729217 | 저온 자극유도 단백질 CSPB |
| 456240 | 주요 저온 자극유도 단백질 (CspB) [Sporosarcina globispora] |
| 1256629 | 저온 자극유도 단백질 [Bacillus subtilis] |
| 740006 | 저온 자극유도 단백질 |
| 456238 | 저온 자극유도 단백질 [Bacillus subtilis] |
| 12054789 | 저온 자극유도 단백질 (CspLB) [Listeria monocytogenes] |
| 1864167 | 주요 저온 자극유도 단백질 유사체 CspB [Listeria monocytogenes] |
| 1405472 | CspB 단백질 [Bacillus cereus] |
| 8101860 | 주요 저온 자극유도 단백질 CspA [Staphylococcus aureus] |
| 16411332 | 저온 자극유도 단백질과 유사 [Listeria monocytogenes] |
| 10176234 | 저온 자극유도 단백질 [Bacillus halodurans] |
| 2493766 | 저온 자극유도 유사 단백질 CSPLA (CSPL) |
| 1001878 | CspA 단백질 [Listeria monocytogenes] |
| 1405470 | CspA 단백질 [Bacillus cereus] |
| 1405474 | CspC 단백질 [Bacillus cereus] |
| 13623066 | 추정 저온 자극유도 단백질 [Streptococcus pyogenes M1 GAS] |
| 729220 | 저온 자극유도 단백질 CSPC |
| 2226349 | CspC [Staphylococcus aureus] |
| 9968446 | 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus plantarum] |
| 1402739 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Bacillus subtilis] |
| 3892590 | 저온 자극유도 단백질 E [Lactococcus lactis] |
| 2226347 | CspB [Staphylococcus aureus] |
| 3850776 | 저온 자극유도 단백질 D [Lactococcus lactis] |
| 1402741 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Bacillus subtilis] |
| 15979774 | 저온 자극유도 단백질 [Yersinia pestis] |
| 10039151 | 저온 자극유도 유사 단백질 cspE [Buchnera sp. APS] |
| 8248794 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] |
| 460698 | CspC (MsmB) [Escherichia coli] |
| 11933043 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Streptomyces nodosus] |
| 11933034 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Streptomyces hygroscopicus] |
| 1620431 | csp [Lactobacillus plantarum] |
| 16419141 | RNA 샤페론, cspA 전사의 음성적 조절인자 [Salmonella typhimurium LT2] |
| 15979692 | 저온 자극유도 단백질 [Yersinia pestis] |
| 2894098 | 저온 자극유도 단백질 [Thermotoga maritima] |
| 1869948 | 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus plantarum] |
| 2370256 | 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis] |
| 2970685 | 저온 자극유도 단백질 C [Salmonella typhimurium] |
| 1778540 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Escherichia coli] |
| 471099 | CspE (MsmC) [Escherichia coli] |
| 10038996 | 저온 자극유도 유사 단백질 cspC [Buchnera sp. APS] |
| 7242722 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] |
| 15026046 | 저온 자극유도 단백질 [Clostridium acetobutylicum] |
| 15980582 | 추정 저온 자극유도 단백질 [Yersinia pestis] |
| 9657576 | 저온 자극유도 DNA-결합 도메인 단백질 [Vibrio cholerae] |
| 349561 | DNA-결합 단백질 [Salmonella typhimurium] |
| 4982460 | 저온 자극유도 단백질 [Thermotoga maritima] |
| 1405478 | CspE 단백질 [Bacillus cereus] |
| 9946316 | 저온 자극유도 단백질의 가능성 [Pseudomonas aeruginosa] |
| 9658370 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Vibrio cholerae] |
| 5869509 | CspG [Shewanella violacea] |
| 1067201 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor] |
| 9948689 | 저온 자극유도 단백질 CspD [Pseudomonas aeruginosa] |
| 3891780 | 대장균 용액 Nmr 구조로부터의 주요 저온 자극유도 단백질, 사슬 A |
| 576191 | 대장균의 주요 저온 자극유도 단백질 7.4 (Cspa (Cs 7.4)) |
| 72232 | 주요 저온 자극유도 단백질 cspA - Escherichia coli |
| 9657556 | 저온 자극유도 전사 조절인자 CspA [Vibrio cholerae] |
| 6458627 | 저온 자극유도 단백질, CSD family [Deinococcus radiodurans] |
| 3831556 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Enterococcus faecalis] |
| 15023696 | 저온 자극유도 단백질 [Clostridium acetobutylicum] |
| 2425105 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Micrococcus luteus] |
| 1402737 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Bacillus cereus] |
| 9587215 | 저온 자극유도 단백질 CspA [Mycobacterium smegmatis] |
| 7226073 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Neisseria meningitidis MC58] |
| 4454361 | 저온 자극유도 단백질, CSPA [Vibrio cholerae] |
| 479003 | 저온 자극유도 단백질 [Escherichia coli] |
| 3097243 | 작은 저온 자극유도 단백질 [Mycobacterium leprae] |
| 1778828 | 주요 저온 자극유도 단백질 CSPA2 [Yersinia enterocolitica] |
| 758663 | 저온 자극유도 단백질 [Arthrobacter globiformis] |
| 2105046 | cspA [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] |
| 7379745 | 추정 전사 조절인자 [Neisseria meningitidis Z2491] |
| 3249024 | 저온 자극유도 단백질 CspB [Yersinia enterocolitica] |
| 7210998 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] |
| 1513081 | 저온 순환 단백질 B [Pseudomonas fragi] |
| 5869504 | CspA [Shewanella violacea] |
| 1778825 | 주요 저온 자극유도 단백질 CspA [Pseudomonas aeruginosa] |
| 1513086 | 온도 순응 단백질 B [Pseudomonas fragi] |
| 12514257 | 살모넬라 저온 자극유도 단백질의 유사체 [Escherichia coli O157:H7 EDL933] |
| 5732895 | F40 [Streptomyces coelicolor A3(2)] |
| 3831558 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Pediococcus pentosaceus] |
| 1468921 | 저온 자극유도 단백질 CspG [Escherichia coli] |
| 13625473 | 저온 순환 단백질 CapB [Pseudomonas sp. 30/3] |
| 6073870 | 주요 저온 자극유도 단백질 CSPA1 [Yersinia enterocolitica] |
| 1402771 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Staphylococcus aureus] |
| 1402761 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis subsp. cremoris] |
| 15981565 | 주요 저온 자극유도 단백질 Cspa1 [Yersinia pestis] |
| 9107847 | 온도 순응 단백질 B [Xylella fastidiosa 9a5c] |
| 7321274 | 저온 자극유도 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] |
| 2815334 | 저온 자극유도 도메인 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] |
| 2275140 | 가상 단백질 [Yersinia pestis] |
| 9947082 | 저온 자극유도 단백질의 가능성 [Pseudomonas aeruginosa] |
| 2983729 | 저온 자극유도 단백질 [Aquifex aeolicus] |
| 2961317 | cspB [Salmonella typhimurium] |
| 46789 | 7 kDa 저온 자극유도 유사 단백질 [Streptomyces clavuligerus] |
| 9107526 | 저온 자극유도 단백질 [Xylella fastidiosa 9a5c] |
| 1513079 | 저온 순환 단백질 A [Pseudomonas fragi] |
| 4193394 | CspC [Myxococcus xanthus] |
| 4193392 | CspB [Myxococcus xanthus] |
| 3821911 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis subsp. lactis] |
| 16503235 | 저온 자극유도 단백질 [Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi] |
| 9957540 | 저온 자극유도 단백질 B [Yersinia enterocolitica] |
| 3821921 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus acidophilus] |
| 1616777 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Stigmatella aurantiaca] |
| 1402759 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Listeria innocua] |
| 4468119 | 저온 자극유도 단백질 A; CspA 단백질 [Bordetella pertussis] |
| 1742550 | 저온 자극유도 유사 단백질 CspB. [Escherichia coli] |
| 12720739 | CspD [Pasteurella multocida] |
| 3821915 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis subsp. cremoris] |
| 1402765 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Pediococcus pentosaceus] |
| 1513084 | 온도 순응 단백질 A [Pseudomonas fragi] |
| 4193396 | CspD [Myxococcus xanthus] |
| 4193398 | CspE [Myxococcus xanthus] |
| 3831560 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Bifidobacterium animalis] |
| 4193390 | CspA [Myxococcus xanthus] |
| 3821923 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus helveticus] |
| 12720931 | MsmB [Pasteurella multocida] |
| 3850772 | 저온 자극유도 단백질 A [Lactococcus lactis] |
| 9655615 | 저온 자극유도 유사 단백질 CspD [Vibrio cholerae] |
| 9946868 | 저온 자극유도 단백질의 가능성 [Pseudomonas aeruginosa] |
| 1402757 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Listeria grayi] |
| 3821913 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactococcus lactis subsp. lactis] |
| 1402735 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Bacillus atrophaeus] |
| 1402751 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Enterococcus faecalis] |
| 3892588 | 저온 자극유도 단백질 C [Lactococcus lactis] |
| 1169113 | 저온 자극유도 유사 단백질 CSPD |
| 15979415 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Yersinia pestis] |
| 117574 | 저온 자극유도 유사 단백질 CSPD (CSP-D) |
| 15075133 | 저온 자극유도 전사 조절인자 단백질의 가능성 [Sinorhizobium meliloti] |
| 16419455 | 저온 자극으로 유도되지 않는 CspA와 유사한 단백질 [Salmonella typhimurium LT2] |
| 11493820 | 저온 자극유도 단백질 C [Yersinia enterocolitica] |
| 1402783 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Streptococcus pyogenes] |
| 3821925 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Streptococcus thermophilus] |
| 1402775 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Streptococcus dysgalactiae] |
| 8249978 | 저온 자극유도 단백질 B [Streptomyces coelicolor A3(2)] |
| 15160284 | AGR_L_3376p [Agrobacterium tumefaciens] |
| 81624 | 글리신-강화 단백질 2 - Arabidopsis thaliana |
| 19743 | nsGRP-2 [Nicotiana sylvestris] |
| 2916930 | cspB [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] |
| 13475232 | 저온 자극유도 단백질 [Mesorhizobium loti] |
| 3861208 | 저온 자극유도 유사 단백질 (cspA) [Rickettsia prowazekii] |
| 2182333 | Y4cH [Rhizobium sp. NGR234] |
| 13476765 | 저온 자극유도 단백질 [Mesorhizobium loti] |
| 3776223 | CspA [Sinorhizobium meliloti] |
| 1402755 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Lactobacillus casei] |
| 15620137 | 저온 자극유도 유사 단백질 [Rickettsia conorii] |
| 15154976 | AGR_C_161p [Agrobacterium tumefaciens] |
| 15074838 | 추정 저온 자극유도-유사 전사 조절인자 단백질 [Sinorhizobium meliloti] |
| 14548150 | RNA-결합 저온 자극유도 단백질 [uncultured crenarchaeote 4B7] |
| 2440094 | 작은 저온 자극유도 단백질 [Mycobacterium leprae] |
| 14523127 | 추정 저온 자극유도 단백질 [Sinorhizobium meliloti] |
| 12620649 | ID534 [Bradyrhizobium japonicum] |
| 1063684 | AtGRP2b [Arabidopsis thaliana] |
| 13424521 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Caulobacter crescentus] |
| 3036806 | 글리신-강화 단백질 [Arabidopsis thaliana] |
| 1402731 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Aeromonas hydrophila] |
| 214642 | p54 [Xenopus laevis] |
| 15075353 | 추정 저온 자극유도 전사 조절인자 단백질 [Sinorhizobium meliloti] |
| 13424199 | 저온 자극유도 도메인 패밀리 단백질 [Caulobacter crescentus] |
| 14602477 | 저온 자극유도 도메인 단백질 A와 유사 [Homo sapiens] |
| 1175535 | 세포질 RNA-결합 단백질 P56 (Y BOX 결합 단백질-2) (Y-박스 전사인자) (MRNP4) |
| 104266 | Y 박스-결합 단백질 2 - African clawed frog |
| 15157349 | AGR_C_4003p [Agrobacterium tumefaciens] |
| 8100512 | Y-박스 단백질 ZONAB-B [Canis familiaris] |
| 8100510 | Y-박스 단백질 ZONAB-A [Canis familiaris] |
| 1483311 | Y-박스 단백질 [Dugesia japonica] |
| 1402767 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Photobacterium phosphoreum] |
| 1402733 | 주요 저온 자극유도 단백질 [Aeromonas salmonicida] |
| 15306095 | 가상 단백질 XP_053028 [Homo sapiens] |
| 14742409 | 가상 단백질 XP_046353 [Homo sapiens] |
| 14270385 | 저온 자극유도 도메인 단백질 [Takifugu rubripes] |
| 10185725 | Y-박스 단백질 3 짧은 이소형태 [Mus musculus] |
| 10185723 | Y-박스 단백질 3 긴 이소형태 [Mus musculus] |
| 9653686 | TSH 수용체 억제인자-결합 단백질-1; TSEP-1 [Rattus sp.] |
| 7385223 | RNA 결합 단백질 MSY4 [Mus musculus] |
| 6166110 | DNA-결합 단백질 A (저온 자극유도 단백질 A) (단일가닥 DNA 결합 단백질 NF-GMB) |
| 3695368 | zfY1 [Danio rerio] |
| 2745892 | Y 박스 전사인자 [Mus musculus] |
| 2073109 | Y 박스 단백질 1 [Carassius auratus] |
| 1353778 | Y-박스 결합 단백질 [Columba livia] |
| 1167838 | DNA-결합 단백질 [Homo sapiens] |
| 1160331 | dbpA 뮤린 상동체(murine homologue) [Mus musculus] |
| 1101884 | YB2 [Rattus norvegicus] |
| 1083796 | RYB-a 단백질 - rat |
| 988283 | mYB-1b [Mus musculus] |
| 988281 | mYB-1a [Mus musculus] |
| 950340 | DNA-결합 단백질 A [Homo sapiens] |
| 608518 | p50 [Oryctolagus cuniculus] |
| 532211 | Y-박스 결합 단백질 [Mus musculus] |
| 516701 | 마우스 dbpB/YB-1와 유사 [Gallus gallus] |
| 505133 | RYB-a [Rattus norvegicus] |
| 457262 | 뉴클레아제 감수성 인자 결합 단백질-1 [Homo sapiens] |
| 423015 | 뉴클레아제 감수성 인자 -결합 단백질 1 human |
| 289797 | YB-1 단백질 [Gallus gallus] |
| 203398 | 추정서열 [Rattus norvegicus] |
| 199821 | Y 박스 전사인자 [Mus musculus] |
| 189299 | DNA-결합 단백질 [Homo sapiens] |
| 162983 | 전사인자 EF1(A) [Bos taurus] |
| 115848 | Y 박스 결합 단백질-1 (Y-박스 전사인자) (YB-1) (CCAAT-결합 전사인자 I 서브유니트 A) (CBF-A) (인핸서 I 서브유니트 A)(EFI-A) (DNA-결합 단백질 B) (DBPB) |
| 112410 | Y 박스-결합 단백질 1 - rat |
CSP는 온도가 강하되거나 또는 다른 스트레스 적용시에 양적으로 증가될 수 있거나 또는 증가되지 않는 단백질들의 그룹이다. 사실상, 저온 자극유도 단백질에 관하여 가장 잘 연구된 생물체는 대장균인데, 몇몇 저온 자극유도 단백질들은 구성적으로 발현되는 반면에, 다른 것들은 저온에 의하여 유도되고, 또 다른 것들은 특 이적 스트레스 및/또는 성장 조건 또는 상태에 특이적인 것으로 여겨진다. 이에 대한 리뷰는 Yamanaka et al., Moleclar Microbiology, 27: 247(1988)이다. 이 리뷰에서, Yamanaka와 그의 동료들은 대장균에서 9개의 저온 자극유도 단백질(CspA~CspI)이 어떻게 발현되는지를 상세히 보고했다. CspA, CspB 및 CspG는 저온 유도성이다. CspD는 세포주기의 휴지기 및 기아(starvation) 상태에서 유도된다. CspC 및 CspE는 세포분열과 관계가 있다.
CspA는 대장균 유래의 주요 저온 자극유도 단백질이다(서열 번호:1). 또한, CspA는 주요 저온 자극유도 단백질 7.4로 명명된다. CspA는 저온 자극에 응답하여 고도로 유도된다(Goldstein et al., Proceedings of the national Academy of science(USA) 87:283(1990)). 느리게 성장하는 어떠한 조건에서, 리보솜들은 RNA 또는 DNA 2차구조 형성에 기인하여 느려지고, 이는 그들의 원 생물체에서의 CSPs의 증가된 합성을 위한 신호로서 작용할 수 있다. CSPs는 시험관 내(in vitro) 조건하에서 ssDNA와 RNA에 결합한다(Phadtare et al., Molecular Microbiology 33:1004(1999)). CSPs는 번역 동안에 대체로 비특이적 방법으로 RNA에 결합하고, 2차 구조 형성을 막고, RNA를 안정화시킨다고 생각된다(이 기능은 때로는 RNA 샤페론(chaperone)으로서 언급된다). 다음으로, 리보솜은 쉽게 CSPs를 대체할 수 있고, 선형 RNA 주형상에서 번역을 개시할 수 있다. 본 발명은 이 단백질들의 단일가닥 핵산 결합 기능에 관련되고, 이러한 기능은 예를 들어, 원핵성 저온 자극유도 단백질, 진핵성 Y-Box 함유 유전자, 어떠한 글리신 강화 단백질(GRP), 및 저온 자극유도 단백질을 함유하는 다른 단백질을 포함하는 어떠한 저온 자극유도 단백질 또는 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질로부터 유래할 수 있다고 생각된다. 이러한 단백질은 제한 없이, 도 4에서 설명된 것들을 포함한다(Trends in Biochemical science, 23(8):289(1998), 포함된 논문은 참고 문헌으로 본원에 통합된다). 상기 도면은 이들 단백질들 사이의 진화 관계를 분명히 보여준다. 이들 단백질의 기원은 현생의 박테리아 및 진핵세포가 분화되는 시점 이전인 것으로 여겨지고, 이러한 단백질들은 35억년 전에 단일세포 진화의 출현시에 존재하고 있었을 것으로 추측된다. 우리는 상기 언급된 도면에서 보여준 바와 같은 예로서, 식물을 형질전환시킬 두 개의 단백질들을 선택했고, 이들 단백질들은 많은 다른 진핵세포 대응물로부터보다 서로로부터 훨씬 더 크게 분화된다. 이들 단백질들의 전위적 발현(ectopic expression)은 제한되지는 않지만, 저온, 가뭄, 염 스트레스, 고온, 저온 자극유도 후 생존, 진균 감염, 바이러스 감염, 미생물 감염 및 저온 발아를 포함할 수 있는 다양한 스트레스성 조건하에서의 식물의 성장, 생장력, 수율 및 건강을 포함할 수 있는 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있는 것으로 기대된다.
스트레스 하에서의 식물들의 증가된 성장율에 대한 다른 가능한 설명은 CSPs의 발현에 의해 제공된 병원체-관련 분자 패턴(PAMP, pathogen-associated molecular patterns)의 유도일 수 있다. 이러한 모델에 있어서, 식물은 스트레스에 노출되기 전에 스트레스에 대하여 "준비된"것 일 수 있으므로, 식물은 조직계통 후천성 내성(SAR, systemic aquired resistance)과 다소 유사한(생물학적 스트레스들에 대해서는 SAR 작용과 아주 유사) 식물반응을 유도할 수 있는 PAMP 반응을 전개 한다. 이 모델을 작동시키기 위해서는 식물은 CSP가 존재한다는 신호를 받아야만 하고, 이 메카니즘은 CSP와 결합하는 식물 수용체를 통해서 이루어진다고 최근에 제안되었다(Felix et al., Journal of Biological Chemistry 278(8):6201-8(2003)). 이 메카니즘은 PAMP-타입의 반응을 유도하는 수용체와 결합하는 어떤 유전자도 본 발명에서 작용할 수 있음을 의미한다. PAMP-타입 반응의 유도는 대개 생물적 스트레스에 대하여 일반적으로 연구되었고, 작용물질들의 외부 투여를 통해서 종종 유도되었다. 본 발명자들은 CSP 형질전환 유전자로부터 생성된 CSP에 대한 PAMP-타입 반응을 유도할 수 있었다. 형질전환 유전자는 입자총 또는 아그로박테리움으로 매개된 형질전환을 통해서 재조합 DNA 구조체의 부분으로서 식물 세포 내로 형질전환된다. 이는 식물 내에서 조직계통 후천성 내성(SAR) 타입 반응을 일으켜서, 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시킬 수 있었다. 이 반응은 제한되지는 않지만, 옥수수, 콩, 밀, 벼, 아라비돕시스, 캐놀라 및 목화를 포함하는 단자엽식물 및 쌍자엽식물 모두에서 작동할 수 있다. 만일에 상기의 PAMP 방법이 CSPs에 대한 작용 방식이면, CSP는 비생물적 스트레스 보호뿐만 아니라 생물적 스트레스 보호를 제공할 것으로 기대할 수 있다. 이 메카니즘들에 제한되지는 않으며, 이들 메카니즘 중의 하나 또는 양쪽 모두, 또는 수많은 다른 메카니즘들이 명시된 표현형에 포함될 수 있다.
바실러스 튜린젠시스(Bacillus thuringensis)로부터의 Csp-유사 단백질인 MF2는 식물 내에서 바이러스 감염에 대한 다소의 보호를 제공하는 것으로 알려져 있다. 미국특허 6,528,480은 상기 단백질을 포함하는 추출물로써 식물의 잎들을 닦 아내고(rubbing), 식물을 바이러스로 감염시키므로써, 생물적 스트레스에 대한 이같은 내성을 보여주었다. 그들은 형질전환 식물을 고려하였으나, 그것을 제조하지는 않았다.
"동일한 종들의 비-형질전환된 식물"은 형질전환된 식물과 동일한 종들의 모든 식물들을 포함하는 것을 뜻한다. 하나의 구체예에서, 비형질전환된 식물들은 형질전환된 식물과 동일한 종 및 아종이다. 다른 구체예에서, 상기 식물은 형질전환된 식물과 가능한 한 동일한 것이다.
"저온 자극유도 도메인(CSD)"은 저온 자극유도 단백질들과 상동성인 단백질 서열이다. 본 발명의 목적을 위하여, 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질은 "저온 자극유도 단백질"이다. 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 아미노산 동일성이 대장균 CspA 또는 바실러스 서브틸리스 CspB와 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질의 저온 자극유도 도메인들 사이에서 나타난다(Wistow, Nature, 344:828(1990); Yamanaka et al., Mol . Micro ., 27:247, 특히, Yamanaka reference; Graumann et al., TIBS 23:286의 도 1B 참고).
본원에서 사용되는 것으로서, "효모"는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevissiae)를 나타내지만, 또한 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 다른 변종들(예를 들어, 피치아(Pichia) 종 유래)을 포함할 수도 있다. "옥수수"는 제아 마이스(Zea Mays) 및 이와 함께 번식할 수 있는 모든 종 및 변종들을 뜻한다. "밀"은 제한 없이, 봄, 겨울 및 모든 환경에서 생활할 수 있는 밀 변종들을 포함하여 모든 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum) 변종들을 뜻한다. 또한, "밀"은 제한되지는 않지만, 드룸밀(Triticum durum), 스펠트밀(Triticum spelta), 엠머밀(Triticum dicoccum), 야생밀(Triticum monococcum)을 포함하는 어떤 다른 밀 종들을 포함한다. 또한, "밀"은 상술한 밀 종들의 어느 것과 함께 번식될 수 있고, (라이밀(triticale), 밀과 호밀의 잡종을 포함하는) 상술한 교배들의 자손인 어떤 종들을 포함한다. "대두"는 글리신 맥스(Glycine max) 또는 글리신 소야(Glycine soja) 및 이들과 함께 번식될 수 있는 어떤 종들 또는 변종을 뜻한다. "쌀"은 오리자 사티바(Oryza sativa) 및 이와 함께 번식될 수 있는 어떤 종들 또는 변종을 뜻한다. "보리"는 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) 및 이와 함께 번식될 수 있는 어떤 종들 또는 변종을 뜻한다. "귀리"는 아베나 사티바(Avena Sativa) 및 이와 함께 번식될 수 있는 어떤 종들 또는 변종을 뜻한다. "캐놀라"는 유전학적으로 변형된 평지씨(rapeseed) 식물, 유지종자 평지(oilseed rape)(Brassica napus L.) 및 평지 순무(turnip rape)(B. Campestris L.)에 의해 생산된 종자, 오일, 및 곡물에 대해 최근에 명명된 것이고, 여기에서 캐놀라는 모든 평지씨 식물들과 그들과 함께 번식될 수 있는 생물체들을 모두 포함한다. 본원에서 사용되는 것으로 대장균은 대장균 종 및 이 생물체의 모든 변종들; 즉, 대장균 K12를 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 것으로서, 대장균은 하나는 F+ 또는 Hfr 종이고, 다른 것은 F+ 또는 Hfr 종이 아닌 경우, 어떠한 대장균 종과도 콘주게이션할 수 있는 어떠한 생물체도 포함한다. 바실러스 서브틸리스는 바실러스 속, 서브틸리스 종의 모든 생물체를 포함한다.
본원에서 사용되는 것으로서, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 모든 변종들과 이 종들의 유형을 포함한다. "잔디"는 제한되지는 않지만, 잔디밭, 게임을 위한 운동장(즉, 풋볼, 야구, 또는 축구), 및 모든 골프 코오스(즉, 티, 페어웨이, 그린, 러프 등)를 포함하는 잔디를 생산하기 위하여 파종되거나, 파종될 수 있는 풀의 모든 종들과 변종들을 포함한다. "목화"는 고시피움(Gossypium) 종의 모든 식물 및 이들과 함께 번식할 수 있는 모든 식물을 포함한다.
"고온 내성"은 동일한 종의 식물의 성장, 생장력, 수율, 크기에 불이익이 되는 고온 또는 높은 온도 조건하에서 성장을 위한 식물 능력의 척도를 나타낸다. 고온 내성 식물들은 동일한 종들의 고온에 내성이 없는 식물들보다 고온 스트레스 조건하에서 더욱 잘 자란다.
"염 내성"은 삼투 스트레스, 또는 물과 토양 내에서 염들 또는 이온들에 의해 야기되는 스트레스 하에서 성장하기 위한 어떠한 식물들의 능력을 뜻한다. 예를 들면, 동일한 종들의 다른 식물의 성장에 불이익이 되는 물과 이온의 혼합물을 포함하는 액체로 수분을 공급하거나, 또는 그러한 배지로 경작되었을 때, 동일한 종 및/또는 변종 식물과 비교하여 증가된 성장 속도를 갖는 식물은 염 내성이 있는 것이 된다. 몇 가지의 형질전환된 식물들은 동일한 종들의 비-형질전환된 식물 및 변종보다 이러한 유형의 조건하에서 더 큰 내성을 갖는다.
본원에서 사용된 모든 숫자들은 용어 "약"에 의하여 수식되어야만 하고, "약"은 숫자가 어느방향으로든지 10% 정도 변화될 수 있으나, 여전히 동일한 의미를 유지하고 있음을 의미한다. 예를 들면, 1M 용액은 1.1M 미만 및 0.9M 이상을 포함하는 형태의 모든 용액들을 포함한다. 예를 들면, 또한 백분율은 수식될 수 있으며, 10%는 9%로부터 11%에 이르는 모든 %를 포함하는 포괄적인 것이다. 형용사 "정확히"는 용어 "약"으로 정의되지 않는다.
"글리신 강화 단백질"은 진핵세포 내의 단백질로서, 또한 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일성을 가지거나, 상동체이다.
"저온 자극유도 후 생존"은 그 성장단계에서 그 종의 식물에 의해 정상적으로 직면하게 되는 온도 이하에 놓이게 된 후에 상당한 시간 동안 성장을 계속하기 위한 식물의 능력으로써 정의된다. 몇 가지 식물들은 비록 동일한 종일지라도, 저온 조건하에서 성장하기 위하여 선택되어야만 함을 주목해야 한다. 옥수수의 근친교배(inbred)된 Wigor 종은 저온 조건을 견디어낼 수가 있고, 미국 내에서 시판되는 가장 상업적인 계통들보다도 그러한 조건에 놓아둘 때 상당히 높은 생존율을 갖는다. Wigor는 폴랜드에서 상업적으로 시판되고 있다. 따라서, 형질전환 식물들에 대한 저온 내성은 의미있는 과학적 데이터를 얻기 위하여, 동일한 종들의 식물들과 마찬가지로, 동일한 상대적 나이에 있는 동일한 계통의 식물들과 비교되어야만 한다. 그 다음에 식물들은 충격 후 성장력, 성장속도, 및 다른 표현형들을 결정하기 위하여, 몇 일(들) 또는 몇 주(들) 후에 즉시 개수를 기록해야 할 것이다.
"가뭄" 또는 "성장을 위한 수분(물)이 제한되는"은 특히 지속되는 경우에, 곡물들에 손상을 야기하거나 또는 농작물들의 성공적인 성장을 막을 수도 있는 가뭄의 기간으로써 정의된다. 동일한 종들의 상이한 식물들과 동일한 종들의 상이한 계통들의 식물들은 가뭄, 건조 및/또는 물 부족에 대하여 상이한 내성을 가질 수 있다. 실험실에서, 가뭄은 대조군 식물보다 식물들에 95% 또는 그 이하의 물을 제공하고, 생장력, 성장, 크기, 뿌리길이 및 많은 다른 생리학적 및 물리적 척도에서 차이를 찾으므로써 모의실험이 가능하다. 또한, 가뭄은 다른 것과는 달리, 어떠한 식물들에 물을 주고, 그들의 성장속도, 특히 그 식물의 성장을 위하여 물이 심하게 제한되는 경우와 비교함으로써 필드에서도 모의실험이 가능하다.
비생물적 스트레스 내성은 제한되지는 않지만, 증가된 수율, 성장, 생체 중량, 건강, 또는 제한되지는 않지만, 고온 스트레스, 염 스트레스, 저온 스트레스(발아동안 저온 스트레스 포함), 물 스트레스(제한하지 않지만 가뭄 스트레스를 포함), 질소 스트레스(저질소 및 고질소를 포함하는)를 포함하는 스트레스에 대해 내성을 나타내는 다른 척도를 포함한다.
생물학적인 스트레스 내성은 제한을 하지는 않지만, 증가된 수율, 성장, 생체량, 건강, 또는 제한되지는 않지만, 식물의 진균 감염, 박테리아 감염 및 바이러스 감염을 포함하는 스트레스에 대해 내성을 나타내는 다른 척도를 포함한다.
본 발명의 일부분으로서 개시된 유전자 서열들 중의 어떤 것은 박테리아에 기원을 둔 것, 예를 들면, 어떤 원핵성 저온 자극유도 단백질이다. 수식되지 않은 세균성 유전자들은 형질전환 식물세포들 내에서 때로는 불충분하게 발현한다. 식물 코돈의 사용도(usage)는 세균과 같은 단세포 생물체들보다 인간 및 다른 고등 동물의 것과 더 밀접하게 닮았다. 몇 가지의 실험보고서들은 식물들에서 재조합 유전자들의 발현을 개선시키기 위한 방법들을 개시하였다. 이 보고서들은 식물 코돈 빈도 표에 기초한 코돈 제3 염기 위치의 바이어스(bias)의 개선으로 보다 효율적으로 번역되는 서열을 나타내는 코딩 서열을 설계하고, 의심되는 폴리아데닐레이션 또는 A/T 풍부 도메인 또는 인트론 스플라이싱 보존 서열을 피하는 재조합 서열을 사용하는 다양한 방법을 개시한다. 합성 유전자 구성을 위한 이들 방법들은 주목할 만하지만, 본 발명자들은 다른 방법들뿐만 아니라, 브라운 등(미국특허 5,689,052, 1997, 참고 문헌으로 전체로서 본원에 통합됨)에 의한 방법 및/또는 상기 인용된 방법에 따라서, 저온 자극유도 단백질 또는 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질에 대한 합성 유전자를 제조하는 것을 고려하였다. 따라서, 본 발명은 원하는 단백질 생산물을 인 플란타(in planta) 발현하는 합성 식물 유전자를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 요약하면, 브라운 등에 따르면, 원하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에서 드문 단자엽 코돈 및 어느 정도 드문 단자엽 코돈의 빈도는 감소되고, 더욱 바람직한 단자엽 코돈으로 대체된다. 단자엽식물에서 수식된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 원하는 폴리펩티드의 향상된 축적은 연속적인 6개 뉴클레오티드 단편들에서 코딩서열을 분석하고, 단자엽식물들에서 가장 드문 284, 484 및 664 6-량체(six-mers)의 출현빈도와 같은 6-량체의 출현빈도에 기초하여, 상기 서열을 변경함으로써 바람직한 코돈들의 빈도를 증가시킨 결과이다. 또한, 브라운 등은 뉴클레오티드 서열 내에서 폴리아데닐화 신호 및 인트론 스플라이싱 부위의 출현을 감소시키고, 뉴클레오티드 서열내에서 자기-상보적 서열을 제거하고, 그러한 서열을 폴리펩티드를 코딩하는 구조적 유전자를 유지하면서 비자기-상보적 서열로 대체하고, 뉴클레오티드 서열 내에서 5'-CG-3' 디뉴클레오티드 쌍의 발생 빈도를 감소시키는 방법으로 드문 코돈의 빈도를 감소시키는 방법을 적용하므로써 재조합 유전자의 증가된 발현을 개시하였다. 이들 단계들은 순차적으로 수행되며, 원하는 폴리펩티드 내에서 존재하는 대부분의 아미노산들에 대하여 단자엽식물들을 위한 더욱 바람직한 단자엽 코돈들의 바람직한 이용을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 얻는 누적 효과를 갖는다.
특히, 제한 없이, 대장균 CspA 및 바실러스 서브틸리스 CspB를 포함하는본원에서 언급된 모든 단백질은 상기에서 설명된 바와 같은 합성 유전자로 제조되거나, 유사한 방법들을 사용하여 제조되는 것이 고려된다.
여기에서 설명된 연구는 감수성 식물의 핵, 플라스미드 또는 엽록체 게놈 내로 도입 후 전위적으로 발현될 때, 제한됨이 없이, 저온, 고온, 가뭄, 염, 및 다른 스트레스, 또는 스트레스 관련 현상(저온 발아, 저온 스트레스 후 생존, 및 다른 비생물적 스트레스)를 포함할 수 있는 다양한 식물 스트레스 저항성을 부여할 수 있는 저온 자극유도 단백질 및 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질의 인 플라타 발현을 강화하는 방법을 확인하였다. 미국특허 제5,500,365호(참고 문헌으로 본원에 통합됨)는 단백질을 코딩하는 합성된 유전자의 발현량을 최적화하기 위하여 식물 유전자를 합성하는 방법을 설명한다. 이 방법은 외래성 형질전환유전자의 구조적 유전자 서열의 수식에 관련되며, 이들을 보다 "식물-유사"로 만들어서, 단자엽 또는 쌍자엽식물에 의하여 보다 유리하게 번역 또는 발현되게 하는 것과 관련된다. 그러나, 미국특허 제5,689,052에서 개시된 것과 같은 방법은 바람직하게 단자엽식물에서 형질전환유전자의 증가된 발현을 위하여 제공된다.
본 발명의 핵산 구조체들을 개발함에 있어서, 구조체들의 구성요소 또는 이들의 단편들은 종래의 클로닝 벡터, 예를 들어 세균성 숙주, 예를 들어 대장균에서 복제할 수 있는 플라스미드 내로 정상적으로 삽입될 것이다. 여러 가지 벡터들이 문헌에서 설명되며, 많은 벡터들은 상업적으로 이용가능하다. 각각의 클로닝 후에, 원하는 삽입물을 가진 클로닝 벡터는 분리되고, 원하는 서열의 구성요소를 만들기 위하여 제한 효소 절단, 새로운 단편 또는 뉴클레오티드의 삽입, 라이게이션, 결실, 변이, 절제 등과 같은 이후의 조작에 적용된다. 일단 구조체가 완성되면, 다음으로 숙주 세포의 형질전환 방식에 따라 이후의 조작을 위하여 적절한 벡터로 전달될 수 있다.
예를 들면, 발현 카셋트 내에 저온 자극유도 단백질을 포함하는 본 발명의 이중 가닥 DNA 분자는 어떠한 적당한 방법에 의해 식물의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 적당한 식물 형질전환 백터들은, 예를 들면, Herrera-Estrella 등(1983) Bevan(1984), Klee 등(1985)과 EPO 공보 120,516에 의해 개시된 것뿐만 아니라, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens )의 Ti 플라스미드로부터 유래된 것들을 포함한다. 아그로박테리움의 Ti 또는 뿌리-유도(Ri) 플라스미드들로부터 유래된 식물 형질전환 백터들 이외에, 다른 방법들이 식물세포들 내로 본 발명의 DNA 구조체들을 삽입시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 제한되지는 않지만, 예를 들면, 리포솜의 사용, 전기영동, 자유 DNA 소비를 증가시키는 화학물질들, 유전자총 충격을 통한 자유 DNA 전달 및 바이러스 또는 꽃가루를 사용하는 형질전환을 포함할 수 있다.
전기영동을 사용하여, 단자엽 내에 저온 자극유도 단백질 또는 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하기 위한 적합한 플라스미드 발현 벡터는, 식물 내에서 작용하는 프로모터; Hsp70 인트론과 같은, 유전자의 발현을 촉진시키는 스플라이스 부위를 제공하는 인트론(PCT 공보 WO 93/19189); 및 노파린 신타아제 3' 서열 (NOS3')과 같은 3' 폴리아데닐화 서열로 구성되어질 수 있다. 이 발현 카셋트는 다량의 DNA를 제조하기에 적합한 고카피(high copy) 레플리콘상 내에 조립될 수 있다.
식물 형질전환을 위한 유용한 Ti 플라스미드 카셋트 벡터의 예는 pMON17227이다. 이 벡터는 PCT 공보 WO 92/04449에 설명되어 있고, 많은 식물들에 대한 우수한 선택 마커 유전자인, 글리포세이트 저항성(CP4로 명명)을 제공하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 유전자는 아라비돕시스 EPSPS 엽록체 전달 펩티드(CTP2)에 결합되고, 본 명세서에서 설명된 바와 같이 FMⅤ 프로모터로부터 발현된다. 세도헵투로스-1,7-비스포스파타제 유전자 또는 cDNA를 포함하는 적절한 수의 세포들(또는 원형질체들)이 얻어질 때, 세포들(또는 원형질체들)은 전체식물들로 재생된다. 재생단계를 위한 방법론의 선택은 중요하지 않고, 꼬투리 콩과(자주 개나리, 대두, 클로버 등), 미나리과(당근, 샐러리, 양방풀나물), 십자화과(양배추, 무, 카놀라/평지씨 등), 박과(멜론과 오이), 벼과(밀, 보리, 벼, 옥수수 등), 감자과(감자, 담배, 토마토, 후추), 해바라기와 같은 여러 가지의 꽃 작물들, 및 아몬드, 캐슈, 호두 및 피칸과 같은 견과-생산 나무들로부터의 숙주들을 위해 적당한 프로토콜 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 실시에 의해 저온 자극유도 단백질들을 발현시킬 수 있는 식물들은, 제한되지는 않지만, 아카시아, 자주 개나리, 아니스(aneth), 사과, 살구, 아트초크, 아루굴라, 아스파라거스, 아보카도, 바나나, 보리, 콩, 사탕무, 검은 딸기, 월귤나무, 브로콜리, 싹이 긴 양배추, 양배추, 카놀라, 캔털루프, 당근, 카사바, 꽃양배추, 샐러리, 버찌, 고수의 잎, 감귤류, 클레멘타인, 커피, 옥수수, 목화, 오이, 더글라스전나무, 가지나무, 꽃 상치, 네덜란드 상치, 유칼립투스, 회양풀, 무화과, 호리병박, 포도, 그레이프 프루트, 감로, 지카마. 키위, 상치, 리크(부추 일종), 레몬, 라임나무, 테다소나무, 망고, 멜론, 버섯, 견과, 귀리, 오크라, 양파, 오렌지, 관상용 식물, 파파야, 파슬리, 완두콩, 복숭아, 땅콩, 배, 후추, 감, 소나무, 파인애플, 질경이, 서양 자두, 석류, 포플라, 감자, 호박, 마르멜로, 래디아타 소나무, 붉은 치커리, 무, 나우 딸기, 벼, 호밀, 수수, 남부지방 소나무, 대두, 시금치, 스쿼시, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 소합향, 귤, 차나무, 담배, 토마토, 잔디, 포도나무, 수박, 밀, 얌, 서양 호박 또는 어떤 다른 식물을 포함한다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제(및 종종 다른 전사 요소들)에 결합하고, 하류 DNA 서열의 전사를 촉진하는 DNA 서열을 뜻한다. 프로모터들은 다른 것들과 비교시에 다소의 조직들에서 발현을 향상시키거나 또는 감소시킨다.
프로모터의 선택, 특히 식물이 비생물적 스트레스를 받을 때 발현을 증가시키는 프로모터들을 선택하는 것은 본 발명에서 특히 유용할 수 있다.
다소의 스트레스 반응들은 식물에 대해 유사한 효과들을 가지고, 하나의 스트레스에 대한 저항성은 다른 스트레스에 대한 저항성을 제공할 수 있다는 것이 당 기술분야에서 관찰되었다. 예를 들면, 이는 탈수 및 저온에 대한 반응 사이에서 관찰된다(Shinozaki, et al., Current Opinions in Plant Biology 3(3):217, 2000). 많은 다른 논문들은 상이한 비생물적 스트레스들 사이의 일반적인 상관관계를 보여주고, 하나의 스트레스에 대한 내성은 몇 개의 다른 비생물적 스트레스들에 더 큰 내성을 초래한다는 것을 나타낼 수 있다(Pernas, et al., FEBS Lett 467(2-3):206, 2000; Knight, Int Rev Cytol 195:269, 2000; Didierjean, et al., Planta 199: 1, 1996; Jeong, et al., Mol Cells 12:185, 2001).
T-DNA 내에 포함된 식물 발현 요소들 외의 DNA 단편에서 발견되는 발현 카셋트와 조절 요소들은 많은 플라스미드 DNA 골격 내에서는 흔하며, 플라스미드 유지요소로서 작용하고, 이들은 제한되지는 않지만, 박테리아성 스펙티노마이신/스트렙토마이신 저항성을 위한 aad(Spc/Str)유전자, 대장균 내에서 유지를 위한 복제의 기원을 제공하는 pBR322 ori(ori322), 아그로박테리움 투메파시엔스 세포들 내로 접합 전이를 위한 봄(bom) 부위를 포함하고, DNA 단편은 RK2 플라스미드로부터의 복제의 기원을 포함하는 0.75kb oriⅤ이다. 더욱이, 이들 플라스미드들은 상기 요소들을 삽입하는 역할을 하도록, 아그로박테리움의 내생의 DNA 통합 단백질들을 위해 필요한 요소들을 포함하는 식물들 내로 형질전환되기 위한 것이다. 이들은 경계(오른쪽(RB)과 왼쪽(LB) 경계)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 재조합 DNA 기술에서의 실험 과정들은 당 기술분야에 서는 잘 알려져 있고, 통상적으로 이용되는 기술들이다. 표준기술들은 클로닝, DNA 및 RNA 분리, 증폭과 정제를 위해 사용된다. 일반적으로 DNA 리가아제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제 등을 포함하는 효소반응들은 제조자의 설명서에 따라서 실행된다. 이 기술들과 여러 가지의 다른 기술들은 통상적으로 Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)에 따라서 실시된다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물들과 발행된 특허서류들은 각 간행물 또는 특허출원이 참고문헌으로서 통합되는 것으로 특정적으로 그리고 개별적으로 지정된 바와 같이 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.
다음의 실시예들은 본 발명의 구체예들을 예시하기 위하여 포함되어 있다. 실시예들에서 개시된 기술들은 본 발명을 잘 실시하도록 하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기술들을 나타낸다는 것을 당업자들은 이해하여만 한다. 그러나, 본 발명의 개시를 고려하여, 개시된 특별한 구체예들에서도 본 발명의 사상과 범위를 벗어남이 없이, 많은 변화가 이루어질 수 있고, 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있으며, 따라서 여기에 첨부된 도면들과 실시예들에서 설명되거나 또는 보여준 모든 내용들은 예시적으로 설명된 것으로서, 제한의 의미는 없다는 것을 당업자는 이해해야만 한다.
본 발명에 의하면, 식물의 세포 내에서 저온 자극유도 단백질(들)(cold shock protein(s))을 발현하므로써, 식물의 생물적 및 비생물적 스트레스 내성을 증가시킬 수 있다.
[실시예]
실시예
1.
pMON57396(도 1)은 아라비돕시스 내에서의 대장균 CspA 유사 단백질(서열번호:56)의 아그로박테리움-매개 형질전환 및 구조적 발현을 위한 이성분 벡터이다. 대장균 유전자를 클론닝하기 위하여, 두 개의 유전자 특이적 프라이머인 MF1과 MF2는 국립건강연구원(NIH)의 소속기관인 국립의학도서관의 소속인 국립생물공학 정보센터(NCBI)로부터의 CspA 서열정보(Genbank M30139, GI: 409136)에 근거하여 디자인되었다.
MF1의 서열은 AGGTAATACACCATGGCCGGTAA(서열번호:66)이고, 이는 CspA의 번역개시 부위에서 어닐링되고, 5'-말단에 NcoI부위를 도입시키는 반면에, MF2의 서열은 TTAAGCAGAGAATTCAGGCTGGTT(서열번호:67)이고, 이는 CspA의 마지막 코돈에서 어닐링되고, 프라이머의 말단에서 EcoRI 부위를 도입시킨다. PCR은 대장균 CspA를 분리하기 위해 실시하였다. 특히, 대장균 DH5α세포들은 용해되고, 소량의 용해물은 Roche Molecular Biochemicals(인디아나폴리스, IN)로부터의 MF1 및 MF2 프라이머, Taq 폴리머라제 및 dNTPs를 사용하여 CspA 유전자를 증폭시키기 위한 주형으로서 사용됐다. 열순환조건들은 다음과 같다: 94℃에서 1분, 그 후 94℃, 16초의 30사이클; 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분. 증폭된 CspA DNA는 겔-전기영동에 의해 정제되 고, NcoI와 EcoRI로 절단되었고, NcoI 및 EcoRI에 의한 절단에 의해 이미 선형화된 이성분 벡터 pMON23450(도 2)와 라이게이션되었다. 라이게이션(Ligation)은 T4 리가아제 및 제조자(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)에 의해 추천된 다음의 과정들을 사용하여 수행하였다. 라이게이션 혼합물은 플라스미드 증식을 위하여 대장균 세포들 내로 형질전환되었다(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989). 형질전환된 세포들을 적절한 선택 배지상에 놓고(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989), 콜로니들의 수를 수시간 또는 수일후에 세었다. 플라스미드들은 개별 콜로니들로부터 제조되었고, 전체-삽입서열이 결정되었다.
결과의 플라스미드는 제한지도(예를 들면, Griffiths, et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6 th Edition pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York) 및 서열화에 의해 또한 확인되었다.
벡터 내의 선택된 NcoI-EcoRI 클로닝 부위의 상류(5')에 CaMV e35S 프로모터가 인접하였고(flanked), 하류(3')에 에피토프 태그(올리고펩티드 DYKDDDK(서열번호:68)를 코드하는 Flag, SIGMA, St Louis)가 인접하였으므로, 이러한 구조체 내에서의 대장균 CspA는 Flag 에피토프 태그에 의해 C-말단에서 태그되고, 아라비돕시스 내에서 형질전환시 CaMV e35S 프로모터에 의해 전사가 진행될 것이다. 상기 클로닝에 의해 서열번호:55에 유사한 단백질을 코딩하는 플라스미드가 생성된다. 결 과의 플라스미드는 pMON57396이라 칭한다.
실시예
2.
pMON57397(도 2)은 아라비돕시스 내에서 아그로박테리움-매개 형질전환 및 대장균 CspA 단백질과 유사한 단백질(서열번호:57)의 구조적 발현을 위한 이성분 벡터이다. pMON57397을 만들기 위하여 Flag 에피토프 태그에 의해 C-말단에서 태그된 대장균 CspA 유전자(상기 실시예 참고)를 포함하는 이성분 벡터 pMON57396을, 벡터 내의 XhoI와 SalI 부위들을 절단하여 Flag 에피토프 태그(Flag 태그는 올리고펩티드 DYKDDDK를 코드한다, SIGMA, St Louis)를 방출하기 위해 제한효소 XhoI과 SalI로 절단시켰다. 그후에 선형화된 플라스미드를 정제하고 다시 라이게이션했다. 라이게이션은 T4 리가제 및 제조자(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)에 의해 추천된 다음의 과정들을 이용하여 수행하였다. 라이게이션 혼합물을 플라스미드 증식을 위하여 대장균 세포들 내로 형질전환했다(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989). 형질전환된 세포들을 적절한 선택 배지(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) 상에 놓고, 콜로니들의 수를 수시간 또는 수일후에 세었다. 플라스미드들은 개별 콜로니들로부터 제조되었고, 전체-삽입 서열이 결정되었다. 상기의 클로닝은 서열번호:57과 유사한 단백질을 코딩하는 플라스미드의 생성을 초래한다.
또한, 결과의 플라스미드는 XhoI 및 SalI 부위들이 부재함을 확신시키는 제 한지도(예를 들면, Griffiths, et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6 th Edition pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York) 및 서열화에 의해 확인되었다. 이 구조체 내에서 대장균 CspA 유전자는 C-말단에서 태그되지 않고, CaMV e35S 프로모터에 의해서 전사가 진행된다.
실시예
3.
pMON57398(도 4)은 아리비돕시스 내에서 아그로박테리움-매개 형질전환 및 바실러스 서브틸리스 CspB와 같은 단백질(서열번호: 59)의 구조적 발현을 위한 이성분 벡터이다. 바실러스 서브틸리스 CspB 유전자를 클론시키기 위하여, 두개의 유전자-특이적 프라이머들인 MF3와 MF4a는 국립건강연구원(NIH)의 소속기관인 국립의학도서관의 소속인 국립생물공학정보센터(NCBI)로부터의 CspB 서열정보(Genbank U58859, gi:1336655)에 근거하여 디자인되었다. MF3의 서열은 AGGAGGAAATTCCATGGTAGAAG(서열번호:69)이고, 이는 CspB의 번역개시부위에서 어닐링되고, 5' 말단에 NcoI 부위를 도입시키는 반면에, MF4a의 서열은 TCAATTTATGAATTCGCTTCTTTAGT(서열번호:70)이고, 이는 CspB의 마지막 코돈에서 어닐링되고, 프라이머의 말단에 EcoRI 부위를 도입시킨다. PCR은 바실러스 서브틸리스 CspB를 분리하기 위해 수행하였다. 바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis ) 세포들은 Carolina Biological Supply(Burlington, NC)로부터 구입되었고, 상기 세포들은 용해되었고, 소량의 용해액은 Roche Molecular Biochemicals로부터 구입한 MF3 및 MF4a 프라이머들, Tag 폴리머라제 및 dNTPs를 사용하여 CspB 유전자를 증폭시키 기 위한 주형으로 사용되었다. 열순환 조건들은 다음과 같다: 94℃에서 1분, 그 후 94℃의 16초의 30사이클; 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분. 증폭된 CspB DNA는 겔-전기영동에 의해 정제되고, NcoI와 EcoRI로 절단되고, NcoI와 EcoRI로 절단되어 이미 선형화된 이성분 벡터 pMON23450(도 5)에 라이게이션되었다. 라이게이션은 T4리가제 및 제조자(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)에 의해 추천된 다음의 과정들을 사용하여 수행하였다. 라이게이션 혼합물은 플라스미드 증식을 위하여 대장균 세포들 내로 형질전환되었다. 형질전환된 세포들을 적절한 선택 배지상(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) 에 놓고, 콜로니들의 수를 수시간 또는 수일후에 세었다. 플라스미드들은 개별 콜로니들로부터 제조되었고, 전체-삽입서열이 결정되었다.
결과의 플라스미드는 제한지도(예를 들면, Griffiths, et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6 th Edition pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York 참고) 및 서열화에 의해 확인되었다. 벡터 내의 선택된 NcoI-EcoRI 클로닝 부위의 상류(5')에 CaMV e35S 프로모터가 인접하였고(flanked), 하류(3')에 에피토프 태그(올리고펩티드 DYKDDDK를 코드하는 Flag, (SIGMA, St Louis))가 인접하였으므로, 이러한 구조체 내의 유전자와 같은 바실러스 서브틸리스 CspB 유사 유전자는 Flag 에피토프 태그에 의해 C-말단에서 태그되고, 아라비돕시스 내에서 형질전환시 CaMV e35S 프로모터에 의해 전사가 진행될 것 이다. 상기 클로닝에 의해, 상기 플라스미드에 삽입되어 있는 서열번호:59에 유사한 단백질을 코딩하는 서열을 지닌 플라스미드의 생성을 초래한다.
실시예
4.
pMON57399(도 6)는 아라비돕시스 내에서 아그로박테리움 매개 형질전환 및 바실러스 서브틸러스 CspB 유전자와 같은 단백질(서열번호:61)의 구조적 발현을 위한 이성분 벡터이다. pMON57399를 만들기 위하여 Flag 에피토프 태그에 의해 C-말단에 태그된 바실러스 서브틸리스 CspB 유전자(상기 실시예 참조)를 포함하는 이성분 벡터 pMON57398을, 벡터 내의 XhoI와 SalI 부위들을 절단하여 Flag 에피토프 태그(Flag 태그는 올리고펩티드 DYKDDDK를 코드한다, SIGMA, St Louis)를 방출하기 위해 제한효소 XhoI 및 SalI로 절단시켰다. 그 후, 선형화된 플라스미드를 정제하고, 다시 라이게이션했다. 라이게이션은 T4리가제 및 제조자(BRL/Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)에 의해 추천된 다음의 과정을 사용하여 수행하였다. 라이게이션 혼합물은 플라스미드 증식을 위하여 대장균 세포들 내로 형질전환했다(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989). 형질전환된 세포들을 적절한 선택 배지(Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989) 상에 놓고, 콜로니들의 수를 수시간 또는 수일 후에 세었다. 플라스미드들은 개별 콜로니들로부터 제조되었고, 전체-삽입서열이 결정되었다. 상기 클로닝은 상기 플라스미드에 삽입된 서열번호:61에 유사한 단백질을 코 딩하는 서열을 지닌 플라스미드 생성을 초래한다.
또한, 결과의 플라스미드는 XhoI 및 SalI 부위들이 부재함을 확신시키는 제한지도(예를 들면, Griffiths, et al, An Introduction to Genetic Analysis, 6 th Edition pp449-451, ISBN 0-7167-2604-1, W.H. Freeman and Co., New York 참고) 및 서열화에 의해 확인되었다. 벡터 내에서의 선택된 NcoI-EcoRI 클로닝 부위는 상류(5')N-말단에 CaMV e35S 프로모터에 의해 측면을 공격당한 것과 같이, 이러한 구조체 내에서 바실러스 서브틸러스 CspB는 C-말단에서 태그되지 않고, 아라비돕시스 내에서 형질전환시 CaMV e35S 프로모터에 의해 전사가 진행된다. 상기의 플라스미드들은 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 형질전환되었다.
실시예
5.
아라비돕시스 식물들은 많은 이용가능한 방법들 중의 어느 한 방법에 의해 형질전환될 수 있다. 예를 들면, 아라비돕시스 식물들은 진공침투에 의한 In planta 형질전환법을 사용해 형질전환될 수 있다(Bechtold et al ., In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad. Sci. Paris Sciences de la vie/life sciences 316: 1194-1199 (1993) 참고). 상기 실시예는 아라비돕시스 식물들이 어떻게 형질전환될 수 있는지를 예시한다.
저장식물재료와 성장조건들
토양이 들어있는 2.5인치의 포트들을 준비하고, 토양이 너무 단단하게 채워 지지 않도록 하면서 메쉬스크린으로 그들을 덮고, 메쉬를 토양표면과 접촉되게 한다(이는 발아하는 묘목들이 메쉬를 통해 성장될 수 있도록 한다). 종자들을 뿌리고, 발아돔(dome)으로 덮어둔다. 3~4일동안 종자들을 발육촉진시킨다. 습도 70%, 온도 20~22℃에서, 16시간 광선/8시간 어둠의 조건하에서 식물을 성장시킨다. 물은 일주일에 2차례 주고, 1/2×(제조자에 의해 추천된 농도의 절반) 피터스 20-20-20 비료(Hummert International, Earth City, MO로 부터 구입)를 아래로부터 준다. 매주마다 미량 영양소(Hummert's Dyna-grain Soluble Trace Elements)(제조자에 의해 추천된 전체 농도)를 첨가한다. 약 1~2주일 후에, 돔(dome)을 걷어치우고, 포트 1개당 1개 또는 2개의 식물들을 포트에 속는다. 1차 볼트(bolt)가 성장하면, 더 많은 2차 볼트 형성을 조장하기 위해 1차 볼트를 잘라낸다. 5~7일 내에 식물들은 침투를 위한 준비가 될 것이다.
아그로박테리움 제조(소규모 및 대규모 배양)
아그로박테리움 균주 ABI를 스펙티노마이신 100mg/L, 스트렙토마이신 100mg/L, 클로람페니콜 25mg/L 및 카나마이신 50mg/L을 포함(SSCK로 표시)하는 LB플레이트에 줄무늬 형태로 접종하였다. 침투 2일 전에, 아그로박테리움 루프를 10ml LB/SSCK를 포함하는 튜브 내에 넣고, 성장시키기 위해 하룻밤 동안 28℃에서 어둠 속에서 진탕기에 올려놓았다. 다음날 아그로박테리움을 400ml의 YEP/SSCK 내에 1:50으로 희석시키고, 16~20시간동안 성장을 위해 28℃에서 진탕기에 올려놓았다(주: LB가 첫째날 하룻밤 동안의 성장을 위해 사용되고, YEP가 하룻밤 동안의 대량배양을 위하여 사용될 경우, 형질전환속도가 상당히 더 좋아짐을 알게 되었다).
침투(
Infiltration
)
500㎖의 원심분리용 병에 부어놓고 20~25분 동안 3500rpm으로 급회전시켜 아그로박테리움 세포들을 수확한다. 상등액을 흘려 붓는다. 펠렛(pellet)을 건조시킨 다음에, 25㎖의 침투 배지(MS 기본염 0.5%, Gamborg's B-5 비타민 1%, 수크로스 5%, MES 0.5 g/L, pH 5.7)내에 0.44nM 벤질아미노퓨린(BAP)(1ℓ당 DMSO중의 1.0mg/L 저장용액 10㎕) 및 Lehle Seeds(Round Rock, TX)로부터의 0.02%의 Vac-In-Stuff(Silwet L-77)와 함께 재현탁시킨다. BAP 및 SilwetL-77을 침투일에 새로 첨가한다. 200㎕의 Silwet L-77 및 20㎕의 BAP(0.5mg/L 저장용액)를 첨가한다. 블랭크(blank)로서 침투배지를 사용하여, 아그로박테리움 현탁액의 1:10 희석액의 OD600을 구한다. 진공침투를 위한 OD600=0.6이 되기 위해 필요한 400㎖의 아그로박테리움 현탁액/침투배지의 부피을 계산한다.
식:(최종부피)*(최종OD600)/OD600=0.6의 최종 OD600을 위해 필요한 부피.
진공 데시케이터 내에 있는 Rubbermaid 컨테이너 내에 재현탁된 배양액을 넣는다. 용액 내로 침투된 식물들을 포함하는 포트들을 거꾸로 하여, 식물의 좌엽들을 포함하여 전체 식물이 덮이도록 하되, 너무 많은 양의 토양이 물에 잠기지는 않도록 한다. 침투시키기 전에 최소한 30분 동안 물로 식물들을 흠뻑 적신다(이는 토양이 아그로박테리움 현탁액으로 흠뻑 적셔지는 것을 막아준다).
수은높이가 약 23~27인치가 되도록 진공을 10분 동안 끌어올린다. 진공을 빠르게 해제한다. 간단하게 포트를 배수시키고, 다이아퍼-라인 트레이에 그것들을 옆 으로 해서 올려놓고, 습도를 유지하기 위해 돔으로 트레이를 덮고, 다시 성장 챔버로 되돌린다. 다음날, 포트덮개를 벗기고, 그들을 똑바로 세우고, 다이아퍼를 제거한다. 5일 동안 식물들에 물을 주지 않는다. 5일 후에 식물들에 물을 주고, 앞에서와 동일한 조건하에서 성장을 계속시킨다(침투된 잎들은 퇴화될 수 있지만, 식물은 꽃이 필 때까지는 생존해야만 한다).
종자 수확과 살균소독
침투 후 약 2주일째 Lehle Aracons(Lehle Seeds, Round Rock, Tx)를 사용하여 개별적으로, 식물들을 원추형으로 만든다. 모든 종자가 성숙되고, 정착한 후에(침투 후 약 4주), 종자를 말리기 위해 물로부터 식물들을 제거한다. 약 2주일 후에 원추형 아래 가지들을 절단하여 종자들을 수확한다. 장각과(siligue)와 가지를 걸르고 종자는 통과하도록 하기 위해서 체를 사용하여 종자를 털어낸다. 종자를 봉투 또는 15㎖ 원추형 튜브에 넣는다.
살균 소독 전에 원하는 양의 종자들을 15㎖ 원추형 튜브에 옮긴다. 원추형 튜브의 뚜껑을 풀고, 400㎖의 표백용 클로락스(Clorox Company, Oakland, CA) 및 40㎖의 염산을 함유하는 비이커가 있는 진공 데시케이터내에 종자들을 옆으로 해서 놓는다(퓸 후드 내에서 클로락스에 HCl을 첨가한다). 데시케이터를 밀봉시키기 위해 진공을 뽑아내고, ~16시간 내에 흡인을 종결한다(진공은 바로 풀리지 않기 때문에 데시케이터는 여전히 진공상태이다). 살균소독 후에, 진공을 방출하고, 살균 후드 내에 종자를 포함하는 튜브를 놓는다(가스가 아직도 방출될 수 있으므로 뚜껑을 풀어 둔다).
카르베니실린 250㎖/L 및 세포탁심 100㎖/L와 함께, MS 기본염 4.3g/L, Gamborg'a B-5(500×) 2.0g/L, 수크로스 10g/L, MES 0.5g/L 및 8g/L 피트아가(phytagar)(Life Technologies, Inc., Rockville, MD)를 포함하는 선발 플레이트 상에 종자를 ("Sprinkle(뿌려서)") 펴놓는다. 선발 농도는 60mg/L의 카나마이신, 60μM의 글리포세이트 또는 10mg/L의 비알라포스일 것이다.
오염에 대한 체크를 위하여, 처음에 매우 소량의 종자가 뿌려질 수 있다. 만일에 오염이 되면, 종자를 ~4시간 이상 재살균소독하고, 오염에 대해 다시 체크를 한다. 2차 살균소독은 대개는 필요치 않지만 때로는 종자들의 균 오염이 드러나지 않으므로 살균소독을 반복할 필요가 있다(살균소독기간은, 24시간의 살균소독 기간에서는 발아속도가 상당히 감소되기 때문에, 일반적으로 16시간 보다 더 짧다.). 파라필림으로 플레이트를 밀봉하고, 2~4일 동안 발육촉진을 위하여 차가운 방에 둔다. 종자가 발육된 후에, 희미한 백색 등과 함께 퍼시발(percival) 내에 둔다.
토양으로 이전
~26℃ 및 16/8 광 사이클에서 5~10일 경과 후에, 형질전환체들은 녹색식물로 보여질 것이다. 추가의 1~2주일 후에, 식물들은 최소한 한 세트의 진짜 잎들을 가질 것이다. 식물들을 토양으로 옮기고, 발아용 돔으로 덮고, 정상적인 아라비돕시스 성장조건을 지닌 성장챔버내로 이동시킨다. 새로운 성장이 나타낼 때까지(대개 5~7일) 덮어둔다.
실시예
6.
야생형의 비-형질전환 식물들 및 CspA 또는 CspB 형질전환된 아라비돕시스 식물들의 성장을 비교하기 위하여 살균된 페트리디쉬 내에서 수직 성장을 하도록 했다: 다음의 방법을 사용하여 야생형 또는 형질전환된 식물의 종자들을 액체 살균처리했다;
·볼텍스 혼합시킨 다음에 70% 에탄올 내에서 5분간 배양,
·볼텍스 혼합시킨 다음에 30% 클로락스(6.15% 소듐하이포클로라이트)+0.01%트리톤×100 내에서 5분간 배양,
·5차례 연속적으로 살균소독수로 세척.
종자들을 플라스틱으로된 100×15mm 정방향의 페트리디쉬들(Becton Dickinson.Falcon #35-1112)에 넣었고, 각 디쉬들은 다음과 같이 만들어진 아가(agar) 배지 40㎖를 포함하고:
거대 영양소, 미량 영양소 및 비타민(Sigma # M5519)을 갖는 0.5×Murashige와 Skoog배지는 수산화암모늄으로 pH가 5.8로 조절되고, 상기 배지는 고체 서포트로서 1% Phytagel(Sigma #P8169)을 포함한다.
10개의 야생형 아라비돕시스 종자들을 페트리디쉬의 반에 걸쳐 가장자리로부터 약 1cm의 거리를 두고 균등하게 분포되도록 플레이팅한다. 이는 살균 팁(tip)을 사용하는 Gilson P-200 피펫맨으로 실시되었다. 10개의 CspA 또는 CspB 아라비돕시스 종자들도 유사하게 페트리디쉬의 반에 걸쳐서 균등하게 분포되도록 플레이팅했다. 플레이트의 절반에 형질전환된 종자들이 포함되어 있음을 표시하기 위하여, 플레이트들을 마킹펜으로 라벨링했다.
상기 종자들을 토양층 사이에 보존하기 위하여, 페트리디쉬들을 어둠 속에서 3일 동안 4℃에 두고, 그 다음에 24시간 마다 120 마이크로아인스타인/㎡의 일정한 광선을 쪼이면서 6주 동안 8℃에서 퍼시발 인큐베이터(모델 AR-36L) 내에 두었다. 이 배양이 끝난 때에, CspA와 CspB 좌엽의 크기를 야생형의 좌엽 크기와 비교하였고, CspA 및 Csp 좌엽의 크기가 더 크다는 것을 알게 되었다. 이는 도 16에서 볼 수 있다. 이것은 상기 분석이 적용된 첫번째, 두번째 및 마지막의 플레이트 사진에서 볼 수 있다. 도 16에서, 세번째 사진(CspB+Flag, pMON57399)은 식물들이 하기에 설명된 것과 유사한 저온 자극유도 분석을 마친 플레이트를 나타낸다.
형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 종자들의 저온 자극유도 묘목 생장력 평가: 수평 플레이트 검정.
서론;
이 평가는 수평 페트리플레이트 내의 아가(agar) 배지상에서 정상온도에서 발아된 형질전환 아라비돕시스 종자들의, 저온으로 변화시에도 성장을 계속하는 능력을 평가하기 위한 절차이다. 요약하면, 대조군 식물들로부터의 종자들과 시험용 형질전환 식물들로부터의 종자들을 살균소독하고, 종자들을 성층화하고, 페트리디쉬의 어느 한쪽 반에 6×8 그리드(grids)로 플레이팅했다. 플레이트를 일주일 동안 수평위치에서 실온에서 배양시키고, 그 다음에 플레이트의 수평위치를 유지한 상태에서, 추가로 2주일 동안 저온으로 변화시켰다. 묘목의 캐노피 면적(canopy area)을 디지털사진으로 찍어 기록하고, 영상 소프트웨어를 사용하여 정량화했다. 시험용 묘목의 전체 캐노피 면적 대 대조군 묘목의 전체 캐노피 면적의 비율은 형질전환된 시험 계통에서 여러 가지 유전자들의 저온 내성 가능성을 비교하기 위하여 정 량적인 매개변수로서 사용가능하다.
재료들; 다음은 표준 생명공학 실험실에서 이용될 수 있는 통상의 주요 장비를 사용한다. (오토클레이브, 천칭, 얇은 층류형 후드 등)
- 아라비돕시스 종자: 여기에서의 프로토콜은 아라비돕시스 탈리아나 cv. 콜럼비아에 대해 사용되었지만, 다른 아라비돕시스 종들에 대해서도 적합할 것이다.
- 페트리디쉬들: Falcon #35-1112(100mm2×15mm 깊이)
- 배지: 시그마 M5519=Murashige & Skoog Basal Media.
- Phytagel(시그마 #P-8169)
- 1ℓ- 유리병; 그 안에서 배지 아가를 오토클레이브하기 위한 것. 그리고 그 병으로부터 플레이트로 붓기 위한 것. 오렌지 스크류 캡을 갖는 코닝 유리병을 사용.
- 자석교반기들과 자석교반막대들,
- 50㎖ 플라스틱 피펫으로 사용할 수 있는 전기 피펫터.
- 종자들을 플레이팅하기 위한 플라스틱 확대렌즈를 지닌 작은 형광상자.
- P1000 길슨(Gilson) 피펫터(또는 대등물) 및 살균 팁들.
- P200 길슨 피펫터(또는 대등물) 및 살균 팁들.
- 70% 에탄올, 살균용.
- 30% 클로락스 표백제+0.1% Tween 20.
- 살균소독 여과된 탈이온수.
- 무균 마이크로원심분리기용 튜브들 및 튜브 래크(rack).
- 4℃ 저온실, 저온 상자 또는 냉장고, 바람직하게는 암상태.
- 22℃의 퍼시발 식물성장챔버 또는 ~ 150μE/㎡/sec 광원을 지닌 대등물.
- 8℃의 퍼시발 식물성장챔버 또는 ~ 150μE/㎡/sec 광원을 지닌 대등물.
- 반투성 외과용 테이프 3M 마이크로포어 테이프(3M#1530-1)
- 블랙(sharpie) 마커.
- 트랩이 있는 진공 흡인기.
- 글라신(Glassine) 천칭용 종이(VWR#12578-165)
- 계산기
- 노트
- IBM 호환형 컴퓨터
- 이미지-프로 플러스 소프트웨어, 버젼 4.1.0.0
- 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어.
프로토콜;
1 - 무균 마이크로원심분리기용 튜브들에 종자 저장용 바이알 또는 엔벨로프들을 분취한다.
2 - 종자들의 확인을 위해 튜브들을 sharpie로 라벨링한다.
3 - 다음의 용액들로 연속적으로 세척하고, 아래에 나타낸 시간 동안 기다림 으로써 튜브 내의 종자들을 표면 살균소독한다. 주(Note): 종자들 상에서 용액과의 양호한 표면 접촉을 보장하기 위하여 세척을 하는 동안에 최소한 2차례 튜브를 거꾸로 한다. 종자들은 튜브의 바닥으로 떨어질 것이고, 연질 펠렛(pellet)이 생성될 것이다:
a. 70% 에탄올로 살균소독, 3~5분.
b. 30% 클로락스 표백제+0.1% Tween 20, 3~5분.
c. 살균소독 여과된 탈이온수, 30초.
d. 상기 c를 4차례 반복하고, 마지막에는 종자 펠렛 위에 살균소독수 ~0.5㎖를 남겨둔다.
1 - 플레이팅(plating)하고, 더욱 균일한 발아를 위하여 종자들을 토양의 층 사이에 보존되도록 하기 위해 3일 동안 4℃의 어두운 곳에 마이크로원심분리기용 튜브를 놓아둔다. [또는, 종자들은 페트리디쉬상의 아가 배지 위로 직접 뿌려질 수 있고, 테이프로 밀봉되고, 페트리디쉬는 8℃ 저온 배양을 하기 전에 3일 동안 4℃의 어두운 곳에 놓여질 수 있다 - 아래 참고]
2 - 유리병 내에 1ℓ 분취량의 0.5×Murashige 및 Skoog 배지를 제조하여 플레이트를 만들고, 수산화암모늄으로 pH를 5.8로 조절하고, 그 다음에 Phytagel 10g을 첨가한다. pH 조절 및 Phytagel 내에서의 균일한 혼합시에는 자석교반기를 사용하고, 그 다음에 45분 동안 액체 세팅에 대해 오토클레이브 처리한다(서서히 진공으로 한다).
3 - 층류형 후드 내에서, 각각의 플레이트에 50㎖짜리 살균소독 피펫을 갖는 전기 피펫터를 사용하여 배지 40㎖씩을 붓고, 곧바로 덮개로 플레이트를 덮는다.
4 - 최소한 2시간 동안 송풍기를 사용하여 층류형 후드 내에서 플레이트들을 냉각시키고, 4℃에서 날짜가 적힌 플라스틱 백 내에 저장한다.
5 - 플레이트들과 플레이트 종자들을 라벨링한다.
1 - 플레이트의 4 모서리 모두를 반투성의 마이크로포어 테이프로 붙이고, 날짜를 라벨링하고, 22℃ 및 ~100μE/㎡초에서 16시간의 일광 사이클로 셋팅된 퍼시발 인큐베이터 내에 플레이트를 놓는다. 플레이트들을 단지 한 층 두께로 수평위치에 놓고, 7일 동안 배양한다. 디지털 카메라로 각각의 플레이트를 사진 찍고, 컴팩디스크에 데이터를 저장한다.
2 - 8℃ 및 ~100μE/㎡ 초에서 24시간의 일광 사이클로 셋팅된 퍼시발 인큐베이터 내로 플레이트를 옮긴다. 플레이트들을 단지 한 층 두께로 수평위치에 놓고, 3주 동안 추가적으로 배양한다. 디지털 카메라로 각각의 플레이트를 사진 찍고, 컴팩디스크에 데이터를 저장한다.
3 - 대조군들과 비교시에, 시험용 유전자원들이 어떻게 진행되는지를 확인하기 위하여 2~3일 마다 플레이트를 관찰하고, 유전자원들의 일반적인 성능을 대표하는 시점에서 디지털 카메라로 사진을 찍는다. 이는 8℃에서 배양시 2주 미만(최대 3주)에 이루어져야 한다. 차이를 보여주기 위해 더 긴 시간이 걸리는 그러한 유전자원들은 디지털 사진이 찍히는 시점에서 혼잡을 피하기 위하여 낮은 종자밀도로 플레이트될 필요가 있다.
4 - 디지털 카메라 사진 및 이미지-프로 플러스 소프트웨어를 사용하여 좌엽 캐노피 면적을 측정한다. 분석결과로부터 전혀 발아되지 않은 종자들을 제외하고, 대조군과 시험용 개체군에 대한 평균 묘목 캐노피를 계산한다. 대조군 묘목들과 시험용 묘목들에 대한 온도변화 후 평균 묘목 캐노피 면적 사이의 비율을 계산하고, 대조군과 시험용 묘목 세트에 대한 표준편차와 표준오차를 계산한다. 시험용 묘목들과 대조군 묘목들 사이에 통계적인 차이가 있는지를 확인한다. 노트에 결과들을 기록한다.
5 - 형질전환 식물재료들을 위한 적절한 폐기용 컨테이너(투명한 플라스틱 폐기물 백이 있는 저장 상자)에 플레이트들과 묘목들을 버린다.
실시예
7.
CspA 및 CspB 유전자들의 PCR 생성물들을 제조자의 프로토콜에 따라서 벡터 PCR-TOPO 2.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 라이게이션하였다. pCR-TOPO 2.1 유도체들의 NcoI/EcoRI 단편들을 pMON48421(도 7)내로 서브클로닝시키고, 동일한 제한효소들에 의해 선형화했다.
35S 프로모터, Csp 유전자들 및 e9 터미네이터를 포함하는 pMON48421 유도체의 NotI 단편들을, 각각 CspA 및 CspB 유전자를 포함하는 pMON56609(도 8) 및 pMON56610(도 9)을 만들기 위하여, NotI 부위에서 pMON42916(도 17)내로 서브클로닝시켰다. 상기 플라스미드들을 공지된 방법에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환시켰다. pMON56609는 서열번호:7과 유사한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 생각된다. pMON56610은 서열번호:9와 유사한 단백질 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 생각된다.
실시예
8.
아그로박테리움 제조;
아그로박테리움 균주 EHA 105는 카나마이신 50㎎/L과 하이그로마이신 50㎎/L(LB/KH로 지칭)를 포함하는 LB 플레이트 상에 도말하였다. 공동-배양 이틀 전에, 아그로박테리움 루프를 LB/KH 10㎖를 포함하는 튜브로 옮기고, 28℃에서 24시간 동안 어두운 곳에서 진탕기 위에서 배양했다. 이 배양액을 20㎖의 LB/KH내에 1:100으로 희석시키고, 28℃에서 밤새 어두운 곳에서 진탕기 상에서 배양시켰다. 다음날, 이 배양액의, 1:2 희석액 1㎖를 큐벳에 넣고, 블랭크로서 LB/KH를 사용하여 0D600을 구한다. 공동-배양을 위하여 O.D 1.0의 아그로박테리움 현탁액 5㎖에 대해 필요한 부피를 계산한다.
식 : (최종부피)*(최종OD600)/OD600=1.0의 최종OD600을 위해 필요한 부피.
40㎖의 원심분리기용 튜브 내에 아그로박테리움 배양액의 필요한 부피를 취하고, 7분 동안 7000rpm으로 교반시켰다. 상등액을 버리고, 펠렛을 건조한다. 20㎎/L의 아세토시린곤을 함유하는 공동-배양 배지(CC MEDIA-MS 기본염, 수크로스 20 g/L, 글루코스 10g/L, 티아민 HCl 0.5mg/L, L-프롤린 115mg/L, 2,4-D 2mg/L) 5㎖내에 펠렛을 재현탁시킨다.
벼 배(
rice
embryo
)의 형질전환:
온실에서 니폰바레(Nipponbare) 및 타이페이(Taipai) 309 벼 변종들로부터 성장한 원추화(panicle)를 수확했다. 원추화들을 10분 동안 50%의 상업용 표백제 용액에 담그고, 살균된 증류수로써 헹구었다. 원추화를 3분 동안 70% 알콜로 처리했다. 그 후에 원추화들로부터 종자들을 제거하고, 개별적으로 껍질을 벗기고, 0.1%의 tween 20 용액을 포함하는 falcon 튜브 내로 옮겼다. 그 후에, 종자들을 층류형 기류 챔버내에서 70% 알콜로써 처리했다. 그 다음에 종자들을 살균증류된 물로써 헹구었다. 이어서 50% 표백제 용액으로 45분 동안 처리하였다. 종자들을 5차례 살균증류수로써 헹구었다. 마지막으로 종자들을 5분간 0.1% 염화제2수은으로 처리했다. 종자들을 다시 살균증류수로써 8회 세척했다.
층류형 기류 챔버내에서 살균된 종자들로부터 배(embryos)를 무균절개하고, 고체 공동-배양 배지(2g/L phytagel을 함유하는 CC 배지)상에 놓았다. 아그로박테리움 현탁액 50㎕ 방울들을 살균된 페트리-플레이트상에 놓았다. 10개의 배를 각각의 방울로 옮겼다. 15분 동안 감염되게 했다. 아그로박테리움 현탁액을 살균된 피펫팁으로 제거했다. 감염된 배를 신선한 고체 CC 배지 플레이트로 옮기고, 2일 동안 어두운 곳에 보관했다. 3일째에 배를 세포탁심 500mg/L로 세척했다. 그 후, 배를 살균처리된 여과지상에서 건조시키고, 딜레이(Delay) 배지(MS 기본염, 티아민 HCl 1mg/L, 글루타민 500mg/L, 염산마그네슘 750mg/L, 카제인 가수분해물 100mg/L, 수크로스 20mg/L, 2,4-D 2mg/L, 피크로람(Pichloram) 2.2mg/L, 세포탁심 250mg/L)에 놓았다. 배를 7일 동안 어둠 속에서 딜레이 배지상에서 보관했다. 이 기간 동안에, 유합조직이 생성되었다. 유합조직을 선택배지(50mg/L 하이그로마이신을 함유하는 딜레이 배지)로 옮기고, 10일간 어둠 속에서 저장했다. 유합조직을 상기 10일의 기간이 지난 다음에 신선한 선택 배지에서 2차 배양하였다. 추가의 10일 경과 후에, 유합조직을 재생배지(MS 기본염, 수크로스 30mg/L, 키네틴 2mg/L, NAA 0.2 mg/L, 세포탁심 250mg/L, 하이그로마이신 25mg/L)로 옮기고, 7일 동안 어둠 속에서 보관했다. 그 다음에 유합조직을 신선한 재생 배지로 옮기고, 30℃에서 16시간 광주기(photoperiod)로 옮겼다. 상기 유합조직상에서 자란 싹들을 발근배지(1/2농도의 MS 기본염, 수크로스 15g/L, 세포탁심 250mg/L, 하이그로마이신 25mg/L)에 옮겼다. 뿌리가 생긴 싹들을 물을 포함하는 시험관 내로 옮기고, 단단해지도록 연무실 내에 두었다.
양성 식물들이 선택되었다. 이는, 예를 들면, 실시예 12~14와 26~29에서 기재된 바와 유사한 방법들을 사용하여 행해질 수 있다. 형질전환 식물들의 다음 세대를 만들기 위하여, 번식방법들을 포함하는 내용들을 개시하였다.
실시예
9
3개 잎 단계에서의 저온 스트레스 반응-
CspB
및
CspA
벼 형질전환 식물들
식물재료제조:
발아: 종자들을 3분 동안 0.01% 염화제2수은으로 처리하여 살균하고, 미량의 염화제2수은을 제거시키기 위하여 밀리큐수(milique water)에서 10차례 완전히 세척했다. 살균된 종자들을 밀리큐수 중에서 3시간 동안 흠뻑 적셔 침염(imbibition)될 수 있게 했다. 침염된 종자들은 종자발아기(Serwell Instruments Inc.)를 사용하여 30℃의 온도와 상대습도 60%에서 살균된 습윤 여과지상에서 발아시켰다.
3개 잎 단계 묘목들의 확립 : 3일간 발아된 묘목들을 광강도 800마이크로몰 /mt2/초 및 상대습도 60%를 갖는 온실내에서 포트레이(길이 52.5mm×깊이 26mm×직경 5.2mm)로 옮겼다. 묘목들을 붉은 모래가 많은 양토 토양을 포함하는 포트레이 내에서 3개-잎 단계로 될 때까지(약 12일 동안) 성장시켰다. 비료용액을 실험이 완결될 때까지 일주일에 한 차례씩 묘목들에 살포했다(N-75 PPM, P-32 PPM, K-32 PPM, Zn-8 PPM, Mo-2 PPM, Cu-0.04 PPM, B-0.4 PPM 및 Fe-3.00 PPM).
CspB
-
R2
식물 분석
프로토콜: 3개 잎 단계의 벼 묘목들(12일 경과)을 100마이크로몰/mt2/초의 광 및 70%의 상대습도(퍼시발 성장챔버) 존재하에서 4일 동안 10℃의 저온 스트레스로 처리했다. 스트레스 처리 후에, 식물들을 10일 동안 온실내에서 회복되게 하고, 10일째에 생존된 식물들에 대한 성장관찰과 사진 증거들을 기록했다. 각각의 처리는 라인당 10번 반복되었고, 이들은 완전히 무작위 처리되었다.
결과들; 저온 스트레스 내성에 대해 테스트된 8개의 다른 라인들 가운데서, 6개 라인들이 야생형과 비교시에 상당히 더 높은 저온내성을 나타냈다. R2-226-6-9-3, R2-226-29-1-1, R2-257-20-2-1, R2-238-1-1-3, R2-230-4-4-2 및 R2-257-3-1-3을 포함하는 라인들은 야생형(표-1, 플레이트-1)과 비교시에 성장에 있어서 높은 회복성장률과 낮은 성장감소율을 나타냄으로써 높은 저온내성을 보여주었다. 라인 R2-230-4-42는 굉장히 잘 견뎌냈고, 이는 100%의 생존율을 나타냈고, 회복기간 동안에도 양호한 성장을 유지했다(표 1).
표 1: CspB R2 형질전환된 라인들에 대한 3개 잎 단계에서 저온 스트레스 처 리후 회복 성장 관찰
(인덱스:WT=야생형)
CspB
-
R3
식물 분석
프로토콜: 3개 잎 단계 묘목들을 1000마이크로몰/mt2/초의 광의 존재하에서 1일 동안 8℃의 저온 스트레스에 노출시켰다. 그 후에, 묘목들을 15일 동안 온실내에서 28℃에서 회복되게 하고, 회복말기에 식물의 높이를 기록했다.
결과들: 8개 다른 라인들 모두가 야생형(비-형질전환) 식물들과 비교했을 때 개선된 내성을 보여주었다. 이 결과들은 개선된 저온내성을 보여주는 R2 분석 데이터를 확인시켜주었다(표 2).
표 2: CspB R3 형질전환된 라인들에 대한 3개 잎 단계에서 저온 스트레스 처리후 회복 성장 관찰
CspA
-
R2
식물 분석
프로토콜: 3개 잎 단계 벼 묘목들(12일 경과)을 성장챔버 내에서 1000마이크로몰/mt2/초 및 70%의 상대습도 하에서 3일동안 10℃의 저온 스트레스로 처리했다. 스트레스 처리 후에, 식물들을 온실내에서 15일 동안 회복되게 하고, 15일째 성장관찰(결과)을 기록했다. 각각의 값은 12회 관찰의 평균치이고, 실험은 완전히 무작위 처리(CRD)실험 디자인에 의해 실시되었다.
결과들: 테스트된 7개의 독립된 CspA 형질전환 라인들중에서 6개 라인들이 야생형과 비교시에 개선된 저온내성을 보여주었다. 이 실험에서, 식물 높이는, 비-스트레스 식물들과 비교시 저온처리 대조군 식물들에서, 50% 가까이 감소되었다. CspA 유전자를 갖는 형질전환된 식물에서와 같이 저온처리시에 식물의 높이 감소는 다른 독립 라인들 중에서 4.5%~22.50%로 다양하였다(성장율 감소가 47.09%인 하나의 라인 제외). 이 결과들은 CspA가 벼의 저온내성을 개선시킴을 나타낸다(표 3).
표 3: CspA R2 형질전환된 벼 라인들에 대한 3개 잎 단계에서 저온 스트레스 처리후 회복 성장 관찰
CspA
-
R3
식물 분석
실험 1.
프로토콜: 3개 잎 단계 묘목들을 1000마이크로몰의 광의 존재하에서 3일 동안 10℃의 저온 스트레스에 노출시켰다. 그 후에 묘목을 온실에서 30일 동안 28℃에서 회복되게 하고, 회복말기에 식물높이와 묘목생존율을 기록했다(이 실험에서 8번의 반복실험을 각각의 형질전환 라인에 대해 적용하였고, 야생형에 대해서는 10번의 반복실험을 적용하였다).
결과: 저온 스트레스에 노출된 6개의 형질전환 라인들은 저온 스트레스 하에서 야생형보다 더 나은 결과를 나타냈다. 이 결과들은 개선된 저온내성을 보여줌으로써 R2분석 데이타를 더 확인시켰다(표 4).
표 4: CspA R3 형질전환된 벼 라인들에 대한 3개 잎 단계에서 저온 스트레스 처리후 회복 성장 관찰
주: 식물 높이는 오직 생존된 식물만을 기록하였고, 그들의 평균값을 상기에 나타내었다.
실험 2.
프로토콜: 3개 잎 단계 묘목들을 1000마이크로몰의 광의 존재하에서 1일 동안 10℃의 저온 스트레스에 노출시켰다. 그 후에 묘목을 30일 동안 온실내에서 28℃에서 회복시키고, 회복말기에 식물높이와 묘목생존율을 기록했다.
결과: 저온 스트레스에 노출된 5개의 형질전환 라인들은 저온 스트레스 하에서 야생형보다 더 나은 결과를 나타냈다. 이러한 결과들은 개선된 저온내성을 보여줌으로써 R2분석을 더 확인시켰다(표 5).
표 5: CspA R3 형질전환된 벼 라인들에 대한 3개 잎 단계에서 저온 스트레스 처리후 회복 성장 관찰
3개 잎 단계에서의 열 스트레스 반응
식물재료제조:
발아: 종자들을 0.01% 염화제2수은으로 3분 동안 처리하여 살균하고, 미량의 염화제2수은을 제거시키기 위하여 완전히 세척했다(탈이온수로 10차례). 살균된 종자들을 3시간 동안 밀리큐수에 흠뻑 적셔 침염시켰다. 침염된 종자들을 종자발아기(Serwell Instruments Inc.)를 사용하여 30℃의 온도 및 60%의 상대습도에서 살균된 습윤 여과지상에서 발아시켰다.
3개 잎 단계 묘목들의 확립: 3일간 발아된 묘목들을 광강도 800마이크로몰/mt2/초 및 60%의 상대습도를 갖는 온실내에서 포트레이(길이 52.5mm×깊이 26mm×직경 5.2mm)에 옮겼다. 묘목들을 붉은 토양을 포함하는 포트레이 내에서 3개-잎 단계가 될 때까지(약 12일 동안) 성장시켰다. 비료액을 실험이 완결될 때까지 일주일에 한 차례씩 묘목들에 분무했다(N-75 PPM, P-32 PPM, K-32 PPM, Zn-8 PPM, Mo-2 PPM, Cu-0.04 PPM, B-0.4 PPM 및 Fe-3.00 PPM).
CspA
-
R2
식물 분석
프로토콜: 3개 잎 단계 벼 묘목들(12일 경과)을 70%의 상대습도 존재하에서 3시간 동안 50℃의 열 스트레스로 처리했다. 스트레스 처리 후에, 식물들을 온실내에서 15일간 회복되게 하고, 15일째 성장 관찰을 기록했다. 각각의 값은 12번 관찰한 평균치이다.
결과들: 테스트된 7개의 독립된 CspA 형질전환 라인들중에서, 6개 라인들은 야생형과 비교시에 개선된 열 내성을 보여주었다. 이 실험에서, 식물높이는 스트레스를 받지 않은 식물들과 비교시에 열-처리된 대조군 식물들(WT)에서 50% 이상으로 감소되었다. CspA 유전자를 갖는 형질전환 식물들에서와 같이, 열 처리시에 식물높이의 감소는 다른 독립된 라인들 중에서 9.5%로부터 35%까지 다양하였다. 이 결과들은 CspA가 벼의 열 내성을 개선시킴을 나타낸다(표 6).
표 6: CspA R2 형질전환된 벼 라인들에 대한 3개 잎 단계에서 식물 열(heat) 스트레스 처리후 회복 성장 관찰
CspB
-
R3
식물분석
프로토콜: 3개 잎 단계 묘목들을 2시간 동안 53℃의 고온 스트레스에 노출시키고 난 후, 온실에서 15일 동안 28℃에서 회복되도록 하고, 회복말기에 식물높이를 기록했다.
결과들: 테스트된 8개의 형질전환 라인들 중에서, 7개 라인들은 야생형에 비해서 고온 스트레스 하에서 더 나은 결과를 보였다. 이 결과들은 CspB가 벼의 열내성을 개선시킴을 나타낸다(표 7).
표 7 : CspB R3 형질전환 벼 라인들의 3개 잎 단계에서 고온 스트레스 처리 후 회복 성장 관찰
CspA
-
R3
식물분석
실험Ｉ
프로토콜: 3개 잎 단계 묘목들을 3시간 동안 53℃의 고온 스트레스에 노출시 킨 후, 온실에서 30일 동안 28℃에서 회복되도록 하고, 회복말기에 식물높이를 기록했다.
결과들: 이 결과들은 개선된 열내성을 보여줌으로써 R2 분석데이터를 확인시켰다(표 8).
표 8 : CspA R3 형질전환 벼 라인들의 3개 잎 단계에서 고온 스트레스 처리 후 회복 성장 관찰
실험Ⅱ
프로토콜: 3개 잎 단계 묘목들을 1000마이크로몰의 광의 존재하에서 1시간 동안 50℃에서 고온 스트레스에 노출시키고 난 후, 온실에서 30일 동안 28℃에서 회복되도록 하고, 회복말기에 식물높이를 기록했다.
결과들: 이 결과들은 개선된 열내성을 보여줌으로써 R2 분석데이터를 확인시켰다(표 9).
표 9: CspA R3 형질전환 벼 라인들의 3개 잎 단계에서 고온 스트레스 처리 후 회복 성장 관찰
물 스트레스 반응
식물 재료 제조:
발아 : 종자들을 0.01% 염화제2수은 용액으로 3분간 처리하여 살균소독시킨 다음에 밀리큐수(milique water)로 10회 완전히 세척하여 미량의 염화제2수은을 제거했다.
살균된 종자들을 밀리큐수에 3시간 동안 담궈서 침염시켰다. 종자발아기(Serwell Instruments Inc)를 사용하여 30℃의 온도와 60%의 상대습도에서, 살균된 습윤 여과지 상에서, 상기 침염된 종자들을 발아시켰다.
CspB
-
R2
식물분석
실험 프로토콜
발아된 묘목들(3일 경과)을 포장용수량(field capacity)으로 측정되는, 질석을 포함하는 PVC포트 내에 만들어진 두 개의 상이한 물 스트레스 수준으로 옮겼다.
FC-100%는 포화된 조건이다(즉, 100g의 질석은 물 350㎖를 필요로 한다) (Sharp 등, 1988. Plant physiol. 87:50-57). 상이한 수준의 물 스트레스(즉, 50% FC와 25% FC)는 필요한 양의 물을 첨가시킴으로써 질석을 포함하는 PVC 포트 내에서 만들어졌다.
실험을 하는 동안, 매일 증발로 인해 잃는 물의 양만큼을 첨가함으로써, 상이한 스트레스 수준의 물의 상태는 일정하게 유지되었다. 상기 묘목들을 15일간 물 스트레스 조건 하에서 800마이크로몰/mt2/초의 광강도와 60%의 상대습도를 갖는 온실 속에서 생장시켰다. 15일이 되는 날에 뿌리와 싹의 성장정도를 기록하였고, 사진을 찍었다. 각 라인당 각각의 처리를 10회 반복했고, 이들은 완전히 무작위 처리되었다.
성장감소율은 다음의 식을 채택함으로써 산출됐다.
결과들: 4개의 상이한 CspB 형질전환 라인들을 물 스트레스 내성에 대해 분석했다. 테스트된 모든 CspB 형질전환 라인들은 스트레스를 가하는 동안에 야생형들보다 상당히 더 높은 성장을 나타냈다.
R2-257-15-1-1, R2-238-1-1-3, R2-257-3-1-6 및 R2-226-6-9-3을 포함하는 형질전환 라인들은 뿌리와 싹에서 비스트레스 대조군(FC-100%)에 대해 최소의 성장 감소율(%)을 나타냈다. 이들 라인들에서 뿌리와 싹에서의 성장감소율의 범위는 11%~25% 범위였다. 반면에, 야생형들은 최대의 성장감소율을 나타냈는데, 이는 50%에 근접하였다.
이 결과들은 CspA가 벼의 물 스트레스 내성을 개선시킴을 나타낸다(표 10과 표 11).
표 10 : CspB 형질전환 라인들과 야생형의 물 스트레스 처리 종료시에 뿌리와 싹의 성장 비교
(WT=야생형, R:S=뿌리 대 싹의 비)
표 11 : CspB 형질전환 라인들과 야생형의 뿌리와 싹의 성장감소율(%) 비교
CpsA
-
R2
식물분석
a. 식물재료 제조:
발아 : 종자들을 0.01% 염화제2수은 용액으로 3분간 처리하여 살균소독하고 밀리큐수 내에서 10회 완전히 세척시켜서 미량의 염화제2수은도 제거시켰다.
살균된 종자들을 밀리큐수에 3분 동안 담궈서 침염시켰다. 종자발아기(Serwell Instruments Inc)를 사용하여 30℃의 온도와 60%의 상대습도에서, 살균된 습윤 여과지 상에서, 상기 침염된 종자들을 발아시켰다.
3개 잎 단계 묘목의 확립 : 3일간 발아된 묘목들을 800마이크로몰/mt2/초의 광강도와 60%의 상대습도를 갖는 온실 내에서 포트레이(길이 52.5mm×깊이 26mm×직경 5.2mm)에 옮겼다. 묘목들을 붉은 모래가 많은 양토 토양을 포함하는 포트레이에서 3개 잎 단계가 될 때(약 12일간)까지 성장시켰다. 비료용액(N-75PPM, P-32PPM, K-32PPM, Zn-8PPM, MO-2PPM, Cu-0.04PPM, B-0.4PPM 및 Fe-3.00PPM)을 실험이 종료될 때까지 일주일에 한 차례씩 묘목에 분무살포했다.
프로토콜: 한달된 묘목들을 800마이크로몰/mt2/초의 광강도와 60%의 상대습도를 갖는 온실 내에서 3일 동안 물 스트레스 처리를 했다. 물 스트레스가 물공급을 억제하는 것으로서 부과되었다. 3일 종료시에, 식물들은 시드는 징후를 보여주기 시작했다. 물 스트레스는 물을 식물들에게 공급함으로써 완화되었고, 24시간 후에 시드는 징후를 보이는 식물들의 관찰결과(%)가 기록되었다. 라인당 및 각 처리당 최소 12종의 식물들이 유지되었다.
결과들: 테스트된 7개의 독립된 CspA 형질전환 라인들 중에서 6 라인들이 야생형과 비교시에 개선된 물 스트레스 내성을 보여주었다.
대조군의 66%는 물공급 후에도 시듦으로부터 회복되지 못한 반면에, CspA 형질전환 식물들에서는 물공급 후에 시듦 징후를 보이는 식물의 %는 다른 독립된 라인들 중에서 5%에서 43%(시듦을 보이는 식물들의 %가 85%인 한 라인 제외)에 이르는 정도로 다양했다. 이 결과들은 CspA가 벼에서 물 스트레스 내성을 개선시킴을 나타낸다(표 12).
표 12: CspA R2 형질전환 벼 라인들의 물 스트레스 반응
염 스트레스 반응
CspB
-
R3
식물분석
프로토콜: 발아된 묘목들(48시간 경과)을 NaCl 200mM을 포함하는 질석이 있는 PVC 포트에 옮겨서 염 스트레스 하에 둔 후, 10일 동안 성장시켰다. 스트레스 하에서 10일 후에 묘목들을 물을 포함하는 질석이 있는 신선한 트레이로 옮겨서 15일 동안 회복시켰다. 식물높이와 같은 성장관찰을 회복말기에 기록했다. 이 실험은 완전 무작위 설계(CRD)에 의해 온실 내에서 실시되었고, 처리 당 8개의 복제 묘목들이 유지되었다.
결과들: 7개의 CspB 형질전환 라인들과 야생형들을 200mM NaCl의 스트레스 하에 두었다. 이 조건 하에서, 다섯 가지의 형질전환 라인들은 야생형에 비해서 더 크게 성장하였다. 이 결과들은 CspB가 벼의 염 스트레스에 대한 내성을 개선시킴을 나타낸다(표 13).
표 13 : CspA R2 형질전환 벼 라인들의 염 스트레스 후 회복 성장 관찰
R3
물 스트레스 시험
CspA의 4개의 독립적 형질전환 라인들(1,2,3,4)과 야생형(니폰바레-NO.5)으로부터의 발아된 묘목들(3일 경과)을 질석을 포함하는 포트 내로 이들을 옮김으로써 물 스트레스 하에 두었다. 세가지 수준의 물공급 체제가 유지됐고, 이들은 100% F.C.(field capacity)(FC-100=3.72㎖물/g질석), 25% F.C.(FC25=0.93㎖물/g질석), 15% F.C.(FC15=0.558㎖물/g질석)이다. 상기 묘목들을 800마이크로몰/mt2/초의 광강도와 60%의 상대습도를 갖는 온실 내에서 30일 동안 상이한 물공급 체제 내에서 성장시켰다. 실험을 하는 동안, 매일 증산으로 인해 잃는 물의 양만큼을 첨가함으로써, 상이한 스트레스 수준의 물의 상태는 일정하게 유지되었다. 30일 종료시에 FC100의 수준이 되는 물을 첨가함으로써 식물들을 회복시키고, 15일 동안 그 상태를 유지했다.
실험 동안에, 스트레스 처리 종료시에 성장관찰 결과들, 예를 들면, 식물높이, 뿌리 및 싹의 길이, 회복 기간 종료시의 건조중량 등을 기록했다.
묘목들에 대해 각 처리조건이 10회 동일하게 반복됐고, 이들은 완전히 무작위 처리되었다.
표 14 : 회복말기의 싹 및 뿌리의 평균 길이(cm)
표 15 : 회복말기의 싹 및 뿌리의 평균 건조중량(mg)
표 16 : 스트레트 처리 종료시의 싹의 평균 길이(cm)
실시예
10.
cspA
pMON73607
의 구성(도 10)
1. 벡터골격을 개환하여 CspA 유전자를 빼내기 위해 벡터 pMON61322는 NcoI과 ApaI로써 절단된다. 벡터골격 단편은 겔 정제에 의해 분리된다.
2. 대장균 cspA 유전자는 pMON56609(도 8) 벡터로부터 PCR증폭된다.
사용된 PCR 프라이머들은 유전자의 5'말단에 NcoI부위를 남기고, 3'말단에 SwaI와 ApaI부위를 만든다.
3. PCR 단편과 PMON61322(도 11) 골격을 라이게이션시킨다. 라이브러리 효율 DH5α세포들 내로 형질전환시킨다. 삽입체를 갖는 클론들을 확인하기 위해 ApaI와 NcoI를 사용하여 콜로니들을 스크린한다.
4. 플라스미드의 다른 선택된 영역들 및 CspA유전자의 적합도를 확인하기 위해 벡터를 서열화한다.
cspB
pMON73608
(도 12)의 구성
1. 벡터골격을 개환하여 HVAI 유전자를 빼내기 위해, 벡터 pMON61322는 NcoI와 ApaI로써 절단된다. 벡터골격 단편은 겔 정제에 의해 분리된다.
2. 바실러스 서브틸리스 cspB 유전자는 pMON56610 벡터로부터 PCR증폭된다. 사용된 PCR 프라이머들은 유전자의 5'말단에 NcoI 부위를 남기고, 3'말단에 SwaI와 ApaI 부위를 만든다.
3. PCR 단편과 pMON61322 골격을 라이게이션시킨다. 라이브러리 효율 DH5α세포들 내로 형질전환시킨다. 삽입체를 갖는 클론들을 확인하기 위해 ApaI와 NcoI를 사용하여 콜로니들을 스크린한다.
4. 플라스미드의 다른 선택된 영역들 및 CspB 유전자를 확인하기 위해 벡터를 서열화한다.
실시예 11. 옥수수 식물 형질전환
옥수수 식물들은 당 기술분야에서 공지된 방법들, 예를 들면 실시예 20~25에 의해 형질전환될 수 있다.
실시예
12.
카피수에 대한 형질전환 식물들의 분석은 다음의 방법에 따라서 실시될 수 있다. 잎 조직은 어린 잎에서, 잎의 한 측면으로부터 그리고 기부로부터 가능한 한 근접한 곳으로부터 채취된다. 시료들을 96-웰 플레이트에 넣고 밤새 냉동건조시켰다. 조직들을 각각의 웰 내에 3개의 3mm 금속구를 넣고, 메가-그라인더를 사용하여 1200rpm으로 2분 동안 진탕시켜서 균질화했다. DNA는 베타-머캅토에탄올, pH8로 완충처리된 트리스, EDTA, Nacl 및 소듐도데실설페이트를 포함하는 표준완충액을 사용하여 추출된다. 추출은 포타슘 아세테이트로 실시되고 이어서 클로로포름으로 실시하고, 침전은 이소프로판올로 실시됐다. 원심분리, 에탄올 용액으로 세척, 건조 후에, DNA는 분석을 더 하기 전에 트리스-EDTA 완충액 내에 재현탁된다.
DNA는 다수의 제한 엔도뉴클레아제로써 절단되고, 단편들은 비변성 아가로스겔 전기영동에 의해 분리된다. DNA는 NaOH용액에 의해 변성된다. 겔은 NaCl을 포함하는 트리스 완충액 내에서 중화되고, 모세관 작용에 의해 나일론 필터에 얼룩을 형성한다. 나일론 필터들은 방사능 또는 DIG-표지된 적절한 프로브(probes)를 첨가하기 전에 연어 정액 DNA를 포함하는 완충용액 내에서 예비-잡종교배된다. 잡종교 배 후에, 얼룩들(blots)은 세척되어, 안티-DIG-항체 접합물과 적절한 기질들과 함께 DIG의 감지 또는 방사선 자동사진 필름에 노출시켜서 감지된다.
실시예
13.
His-태그된 항원의 합성과 정제를 가능하게 하는 벡터들(Novagen, Merck KgaA의 지사, 다름슈타트, 독일)을 사용하여 대장균 발현을 위하여 CspA와 C spB의 전장 오픈리딩 프레임을 사용한다. 상업적 공급자, 예를 들면, Strategic Biosolutions를 통하여 얻은 정제된 항원은 폴리클론 항체들을 만드는데 사용될 수 있다. 생성된 항체들은 CSP단백질들의 발현을 위한 식물들을 테스트하는데 사용될 수 있다.
실시예
14.
형질전환 옥수수 라인 생장.
1차 형질전환체들은 CORN OF GERMPLASM A, CORN OF GERMPLASM C 및 CORN OF GERMPLASM D와 같은 유전자원 내에서 생성된다. 1차 형질전환체들은 동일한 근친교배 유전자형의 비형질전환 식물들과 역교배될 뿐만 아니라 자기교배된다. 자기교배된 식물들로부터 얻은 종자를 들에 심고, 선택된 동형접합체 추정 개체들, 선택된 이형접합체 추정 개체들 및 선택된 음성 개체들을 확인하기 위하여 Taqman 생식세포접합 분석으로써 실험했다. 선택된 이형접합체 추정 개체들은 적절한 시험용의 다수 식물들, 예를 들면, CORN OF GERMPLASM D 및 CORN OF GERMPLASM D의 옥수수들 과 이종교배시켰다. 잡종종자를 수확하고, 손으로 껍질을 벗기고, 선택에 의해 풀(pool)을 만들었다. 다른 육종방법들, 예를 들면 실시예 29 또한 적용가능하다.
실시예
15.
묘목들은 이용가능한 물을 차선(sub-optimal) 수준으로 제한하는 처리를 받을 수 있으며, 이러한 처리는 측정가능한 표현형 반응을 초래한다. 예를 들면, 이러한 처리는 물의 양을 수일동안 제한하여 연속적인 물 부족을 초래하는 형태를 취하거나, 또는 수경법이나 염처리로써 묘목들에게 삼투성의 스트레스를 주는 심각한 물 부족의 형태를 취할 수 있다. 형질전환 양성 식물들은 상기 처리에 대해 개선된 표현형 반응을 위해서 스크리닝 처리될 수 있다. 측정된 표현형 반응들은 처리기간 또는 처리 후 회복기간, 즉 시듦 또는 시듦 회복 후의 싹 성장속도 또는 누적 건조중량, 뿌리 성장속도 및 누적 건조중량을 포함할 수 있다. 개선된 반응을 나타내는 식물들은 포장효율시험에 적용될 수 있다. 스크린은 온실 또는 성장실 내와 같은 조절된 환경 내의 작은 포트 내에서 성장될 수 있는 다수의 형질전환 양성 및 형질전환 음성 식물들을 필요로 할 수 있다. 스크리닝 처리된 식물들의 수는 적용된 처리 및 측정된 표현형들과 연관된 변화에 의해 정해진다.
실시예
16.
들에서 성장된 식물들은 이용가능한 물을 차선의 수준으로 제한하는 처리를 받을 수 있고, 이러한 처리는 측정가능한 표현형 반응을 초래한다. 예를 들면, 이 러한 처리는 식물의 늦은 생장 또는 이른 생식 성장 동안에 이용가능한 물의 양을 수일동안 제한하여 연속적인 물부족을 초래하는 형태를 취할 수 있다. 형질전환 양성 식물들은 형질전환 음성 식물들과 관련된 처리에 대해 개선된 표현형 반응을 위해서 스크리닝 처리될 수 있다. 측정된 표현형 반응들은 처리 동안의 싹 성장속도, 잎 시듦, 낟알 수율 및 낟알 수와 낟알 중량과 같은 이삭 수율 성분들을 포함할 수 있다. 개선된 반응을 나타내는 식물들은 첫 해의 수율 측정시험에 적용될 수 있다. 스크린은 조절가능한 물공급과 함께 두 곳의 토양지역에서 전형적인 파종밀도에서 적용될 수 있다. 스크리닝 처리된 식물들의 수는 적용된 처리 및 측정된 표현형들과 연관된 변화에 의해 정해진다.
실시예
17.
설명된 몇 개의 유전자들은 클로닝될 수 있고, 식물들로 형질전환될 수 있고, 하기(실시예 17~30)에 유사한 방법으로 표현형으로 될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드와 서열 번호:4~53을 코딩하는 뉴클레오티드.
목적벡터의 구성
GATEWAYTM Destination(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 식물발현벡터(pMON65154, 도 13)는 당업자들에 알려진 방법들을 사용하여 구성되었다. 발현벡터의 요소들은 표 17에 요약되어 있다. 박테리아 복제기능과 대장균 내에서 발현된 암피실린 저항성 유전자를 포함하는 플라스미드 pMON65154의 골격은 플라스미 드 PSK-로부터 유도된다. pMON64154 내의 식물발현요소들은 당업자들도 이용가능한 것이고, 표 17에서 각각의 요소에 대해서 참조근거가 제공된다. 위치에 대한 표 17의 모든 참고내용들은 도 13에서 개시된 플라스미드 지도상에서 각각의 요소에 대한 염기쌍 좌표를 뜻한다. 일반적으로 pMON65154는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII)를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 Caluiflower Mosaic Virus 35S 프로모터를 포함하는 선택적 마커 발현 카셋트를 포함한다. 선택적 마커 발현 카셋트의 3'영역은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense) 노파린 신타제(nos) 유전자의 3'영역과 그에 이어진 감자 프로테이나제 억제제II(pinII) 유전자의 3'영역을 포함한다. 플라스미드 pMON65154는 GATE-WAYTM 클로닝 방법들을 사용하여 목적 유전자가 삽입될 수 있는 식물발현 카셋트를 더 포함한다. GATEWAYTM클로닝 카셋트는 벼 액틴 1 프로모터, 엑손 및 인트론에 의해 5'에 인접하고, 감자 pinII 유전자의 3'영역에 의해 3'에 인접한다. GATE-WAYTM 클로닝 방법들을 사용함으로써 클로닝 카셋트는 목적 유전자에 의해 대체되었다. 목적 유전자를 포함하는 벡터 pMON65154 및 이들의 유도체들은 유전자총 충격법과 같은 직접적 DNA 전달을 통한 식물 형질전환 방법들에서 특히 유용하다. 당업자는 당분야에서 공지된 방법들을 사용하여 유사한 특징들을 지닌 발현벡터를 구성할 수 있다. 더구나, 당업자는 다른 프로모터들과 3'영역이 목적 유전자의 발현에 유용할 수 있고, 다른 선택적 마커들이 사용될 수 있음을 인식할 수 있을 것이다.
표 17 : 플라스미드 pMON65154의 요소들
별도의 플라스미드 벡터(pMON72472, 도 14)는 식물 형질전환을 위한 아그로박테리움 매개 방법들에서 사용하기 위하여 구성되었다. 플라스미드 pRG76은 목적하는 식물발현 유전자, GATEWAYTM 클로닝 및 pMON65154 내에 존재하는 식물선택적 마커 발현 카셋트를 포함한다. 또한, 아그로박테리움의 T-DNA 왼쪽과 오른쪽 경계 서열들이 플라스미드에 첨가되었다. 오른쪽 경계 서열은 벼 액틴 1 프로모터에 대해 5'에 위치하고, 왼쪽 경계 서열은 nptII 유전자에 대해 3'에 위치된 pinII 3'서열에 대해 3'에 위치한다. 더구나, pMON65154의 pSK-골격은 대장균과 아그로박테리움 투메파시엔스 양쪽 모두에서 플라스미드의 복제를 촉진시키기 위해 플라스미드 골격으로 대체되었다.
상기 골격은 아그로박테리움 내에서 기능하는 DNA복제를 위한 광범위한 숙주 기원을 갖는 oriV, rop 서열, 대장균 내에서 기능하는 DNA복제의 pBR322 기원 및 대장균과 아그로박테리움 양쪽 모두에서 플라스미드의 존재여부를 선별하기 위한 스펙티노마이신/스트렙토마이신 저항성 유전자를 포함한다.
플라스미드 벡터 pRG81 내에 존재하는 요소들은 표 18에 설명되어 있다.
표 18 : 플라스미드 벡터 pRG81의 유전 요소들
실시예
18.
코딩서열들은 pMON65154(도 13)와 같은 GATEWAYTM 목적 식물 발현벡터 내에 삽입되기 전에 PCR에 의해 증폭되었다. 모든 코딩서열들은 cDNA라이브러리로부터 원하는 서열을 증폭시킬 수 있는 DNA 서열정보 또는 클로닝된 전장서열로서 구할 수 있다. PCR 증폭을 위한 프라이머들은 대부분의 5'와 3'의 미번역된 영역들을 없애기 위하여 코딩서열의 출발코돈과 정지코돈에서 또는 그 근처에서 디자인되었다. PCR 생성물들은 GATEWAYTM 벡터들(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 내로 재조합에 의한 클로닝이 가능하도록 attB1과 attB2서열들로 테일링(tailing)되었다.
목적하는 attB 인접 PCR 증폭 서열들을 만드는데 두 가지 방법들이 사용되었다. 두 가지 방법들 모두는 GATEWAYTM Cloning Technology Instruction Manual(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)에 상세히 설명되어 있다. 첫 번째 방법에서는, attB와 주형 특이적 서열들을 포함하는 단일 프라이머 세트가 사용되었다. 프라이머 서열들은 다음과 같다:
attB1 순방향 프라이머:
5'GGGCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN 주형 특이적 서열 3'(서열번호:71)
attB2 역방향 프라이머:
5'GGGGCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN 주형 특이적 서열 3'(서열번호:72)
선택적으로, attB 어댑터 PCR은 attB 인접 PCR 생성물들을 제조하는데 사용되었다. attB1 어댑터 PCR은 두 세트의 프라이머들, 즉 유전자 특이적 프라이머들 과 attB 서열들을 도입하는 프라이머들을 사용한다. 원하는 DNA 서열 프라이머들은 5' 말단에서 attB1 또는 attB2 서열들의 12개 염기쌍들을 포함하는 것으로 디자인되었다. 사용되는 프라이머들은 다음과 같다;
attB1 유전자 특이적 순방향 프라이머
5'CCTGCAGGACCATG 순방향 유전자 특이적 프라이머 3'(서열번호:73)
attB2 유전자 특이적 역방향 프라이머
5'CCTGCAGGCTCGAGCTA 역방향 유전자 특이적 프라이머 3'(서열번호:74)
프라이머들의 두번째 세트는 다음의 서열을 갖는 attB 어댑터 프라이머들이다:
attB1 어댑터 순방향 프라이머
5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCTGCAGGACCATG3'(서열번호:75)
attB2 어댑터 역방향 프라이머
5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCCTGCAGGCTCGAGCTA3'(서열번호:76)
attB1과 attB2 인접 서열들은 Invitrogen Life Technologies(Carlsbad, CA)에 의해 설명된 방법들을 따라 PCR에 의해 증폭되었다. 상기에서 설명된 바에 따라서 attB 인접 PCR 생성물들을 정제하고, 겔로부터 회수했다.
몇 가지 예들에서 attB 인접 서열들은 PCR로부터 회수되었지만, GATEWAYTM기술을 사용하여 도너 벡터(Donor Vector) 내로 삽입시킬 수는 없었다. 도너 벡터 내로의 GATEWAYTM 재조합이 실패한 경우에, 리가아제들을 사용하는 종래의 클로닝 방 법들이 엔트리 벡터(Entry Vector) 내로 DNA 서열을 삽입하는데 사용되었다(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). 엔트리 벡터의 선택은 엔트리 벡터내의 제한 엔도뉴클레아제 부위와 원하는 삽입서열의 적합성에 따라서 달라진다. 엔트리 벡터는 탈인산화되고 겔 정제된 ccdB 유전자를 제거하기 위하여 선택된 제한 엔도뉴클레아제로써 절단되었다. 선택된 제한 엔도뉴클레아제는 사용되는 엔트리 벡터와 원하는 삽입서열에 따라 달라진다. 예를 들면, ccdB 유전자는 EcoR1을 사용하거나, 또는 EcoRV와, XmaI 또는 NcoI 또는 XhoI와 같은 제한 엔도뉴클레아제와의 다른 조합물들을 사용하여 pENTR11(도 15)로부터 제거되었다. 다른 제한 뉴클레아제들은 GATEWAYTM 방법에서 사용하기 위해 다른 엔트리 벡터들과 함께 사용될 수 있다. 엔트리 벡터들을 절단하는데에 제한 엔도뉴클레아제를 사용하기 위해서는, 요구되는 PCR 생성물 상에 적합한 접착말단을 만들 필요가 있다. 접착말단들은 제한 엔도뉴클레아제 절단, 어댑터 라이게이션 또는 PCR 중에 제한부위들의 첨가와 같은 당업자들에게 알려진 다수의 방법들에 의해 제조될 수 있다.
몇 가지 예들에서는, PCR 단편과 엔트리 벡터상에 적합한 접착말단을 만들 수가 없었다. 선택적으로, 적합한 접착말단은 cDNA 클론의 제한효소 절단에 의해 직접적으로 제조될 수 있었다. 그러나 엔트리 벡터 내로 PCR 단편들을 평활말단 라이게이션 할 수 있었다. 이 방법을 사용하여, 엔트리 벡터는 제한 엔토뉴클레아제로 절단되어 ccdB 유전자를 제거했다. 겔 정제된 선형 엔트리 벡터는 T4DNA 폴리머라제로써 평활말단으로 되었다. 당업자는 Klenow DNA 폴리머라제의 사용과 같은, 평활말단을 갖는 DNA 분자들의 다른 제조법들을 알고 있다. PCR 생성물은 말단이 평활하게 만들어졌고, 바람직하게는, T4DNA 폴리머라제 또는 다른 적당한 폴리머라제, 즉 T4폴리뉴클레오티드 키나아제와 포스포타제 효소와 함께 배양되어 탈인산화 되었다. 엔트리 벡터와 PCR 생성물은 당기술분야에 공지된 방법들을 사용하여 평활말단 라이게이션되었다. 라이게이션 생성물들은 대장균 내로 형질전환되었고, 개별적 콜로니들로부터의 플라스미드들은 삽입 DNA의 존재와 엔트리 벡터 내의 attL 부위들에 대한 원하는 방향성에 대해 분석되었다. 오픈리딩프레임의 아미노 말단 다음에 attL1 서열을 갖는 클론들이 선택되었다.
바람직하게는, attB 인접 PCR 생성물들이 GATEWAYTM 방법들을 사용하여 플라스미드 내로 삽입될 수 없었을 때에는, PCR 생성물들을 클로닝하는 TA방법(Marchuk 등, 1991)이 사용되었다. TA방법은 Taq 폴리머라제 말단 전이효소 활성의 잇점을 지닌다. 엔트리 벡터는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되었고, 상기 설명된 방법들을 사용하여 평활말단으로 만들어졌다. 평활말단을 갖는 선형의 엔트리 벡터를 dTTP와 Taq 폴리머라제와 함께 항온처리시켜, 각각의 DNA 가닥의 3' 말단에 단일 티미딘 잔기를 부가하였다.
Taq 폴리머라제는 dATP에 대해 높은 선호도를 갖기 때문에, 3' 말단에 단일 아데노신이 첨가된 PCR 생성물들이 매우 빈번하게 생성된다. 따라서, 엔트리 벡터와 PCR 생성물은 상보적인 단일 염기 3' 오버행(overhang)들을 갖는다. 당업자들에 알려진 조건하에서 라이게이션 한 다음에, 플라스미드들은 대장균 내로 형질전환되 었다. 플라스미드들은 개별적인 콜로니들로부터 분리되고, 정확한 방향으로 삽입된 원하는 삽입체를 갖는 플라스미드들을 확인하기 위해 분석되었다. 선택적으로, attB 부위들로써 테일링된 PCR 생성물들은 pGEM-T EASY(Promega Corporation, Madison. WI)와 같은 상업용 TA 클로닝 벡터 내로 TA 클로닝 되었다.
모든 PCR 증폭 생성물들은 식물에 도입되기 전에 서열화되었다. GATEWAYTM 방법들에 의해 생성된 목적 발현벡터 내의 PCR 삽입체들은, 상기 삽입된 서열이기대되는 아미노산 서열을 코딩하였는지를 확인하기 위해 서열화되었다. 만일 엔트리 벡터들이 라이게이션방법을 사용하여 생성되었다면, 삽입된 서열은 GATEWAYTM 기술을 사용하는 목적 발현벡터의 생성 이전에 엔트리 벡터 내에서 서열화되었다. 아미노산 코딩 서열에 영향을 미치지 않는 점돌연변이, 즉 침묵 돌연변이는 허용되었다.
실시예
19. 발현 벡터들의 구성
GATEWAYTM 클로닝법들(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)이 옥수수 형질전환에 사용하기 위한 발현 벡터를 구성하는데 사용되었다. GATEWAYTM법들은 GATEWAYTM 클로닝 기술사용 설명서(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)에 모두 설명되어 있다. GATEWAYTM 시스템의 사용은 식물발현 벡터 내로 높은 처리율의 코딩서열들의 클로닝을 용이하게 한다. attB1 및 attB2 서열들에 인접한 유전자 서열들은 상기 설명된 바와 같이 PCR에 의해 생성되었다. 재조합 서열, 즉 attB1과 attB2가 코딩서열의 5'와 3'에 어디에 위치하는지에 따라, 센스 또는 안티센스 발현 벡터들이 생성되었다. 어떠한 코딩서열이 센스 또는 안티센스방향으로 삽입될 수 있는 식물발현 벡터, 즉 pMON65154(도 13)은 실시예 1에서 설명된 바에 따라 구성되었고, GATEWAYTM 클로닝 공정에서 목적 벡터로서 사용되었다.
두 개의 선택적 방법들이 PCR 증폭된 코딩서열을 식물발현 벡터 내로 삽입시키기 위해 사용되었다. 첫째 방법에서는, 5'와 3' 말단에서 attB1과 attB2가 인접한 목적하는 코딩서열을 포함하는 PCR 생성물을 BP CLONASETM의 존재하에서 도너 벡터(pDONR201TM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)와 함께 배양했다. GATEWAYTM 엔트리 클론들이 이 반응으로부터 생성되었고, 대장균 내로 형질전환되었다. 플라스미드 DNA는 엔트리 클론들로부터 분리되었다. 삽입된 코딩서열은 PCR 증폭의 신뢰성을 확인하기 위하여 엔트리 벡터로부터 서열화되었다. 엔트리 클론 대장균 콜로니들로부터 분리된 플라스미드 DNA는 목적하는 코딩서열을 포함하는 식물발현 벡터들을 만들기 위하여 LR CLONASETM의 존재하에서, 선형화된 목적 벡터, 바람직하게는 pMON65154와 함께 배양되었다. LR CLONASETM 반응으로부터 얻은 DNA는 대장균내로 형질전환되었다. 목적 발현 벡터로부터 플라스미드 DNA가 분리되었고, 식물 발현 벡터의 서열과 정확한 방향을 결정하기 위해 서열화되었다.
식물 발현 벡터를 제조하는 두번째 방법에서는, attB1과 attB2 서열의 인접한 PCR 생성물이 도너 벡터(pDONR201TM, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 및 상기 설명한 BP CLONASETM와 함께 배양되었다. 배양 후에, 반응혼합물의 일부를 선형화된 목적 벡터 및 LR CLONASETM와 함께 더 배양했다. 얻어진 DNA를 당분야에 공지된 PCR 또는 서던 블롯 분석기술을 사용하여 선택된 목적 코딩서열을 포함하는 식물 발현 벡터들 및 대장균 내로 형질전환시켰다. 목적 코딩서열을 포함하는 식물 발현 벡터들을 만드는 상기의 두 가지 방법들은 Invitrogen Life Technologies(GATEWAYTM Cloning Technology Instruction Manual)에 설명되어 있다.
선택적으로, 엔트리 벡터들은 제한 엔도뉴클레아제와 리가아제를 사용하여 제조되었다. 엔트리 벡터들은 Invitrogen Life Technologies(Carlsbad, CA)로부터 구입가능하다. 각각의 엔트리 벡터, 예를 들면, pENTR1A, pENTR2B, pENTR3C, pENTR4 및 pENTR11은 독특한 클로닝과 발현 특성들을 갖는다. pENTR11은 본 발명의 실시에서 바람직하게 사용되었다. 당업자들은 다른 엔트리 벡터들의 유용성을 인식할 것이다. 엔트리 벡터들 중의 하나 내로 원하는 서열을 삽입시키기 위하여 제한 엔도뉴클레아제들과 리가아제들을 사용하기 전에, ccdB 유전자의 각 측의 엔트리 벡터를 제한 절단하는 것이 필요하였다. 다수의 상이한 조합의 제한 엔도뉴클레아제들이 엔트리 벡터 내로 삽입될 DNA 서열 상에 존재하는 제한부위들에 따라서 사 용되었다. 바람직하게는, 제한절단 후에 엔트리 벡터는 탈인산화 되었고, 겔 정제되었다. 원하는 DNA 서열은 당업자들에 공지된 분자생물학의 종래 방법들을 사용하여 엔트리 벡터 내로 삽입되었다. TA 클로닝(미국특허 제5,827,657호)은 PCR 단편들을 엔트리 벡터 내로 클로닝시키는 바람직한 방법이다.
벡터(pMON과 5자리 수로써 지칭)들과 GATEWAYTM 클로닝 방법들을 사용해 만들어진 것들을 포함하는 코딩서열들은, 예를 들면, 서열번호:4~28이다. 본 발명의 코딩서열들 중의 몇 가지는 여기에서 설명된 방법들을 사용하여 식물발현 벡터들내로 클로닝될 수 있음이 기대된다.
실시예
20.
CORN OF GERMPLASM A 식물들을 온실 내에서 성장시켰다. 배들(embryos)이 1.5~2.0mm의 길이가 되었을 때, 즉, 수분(受粉) 후 보통은 10~15일, 매우 빈번하게는 11~12일에 식물들로부터 이삭을 수확했다. 이삭들을 80% 에탄올 용액 내에 담그거나 분무하여 표면을 살균처리한 후에 공기건조시켰다. 또는, 이삭들을 10% SDS를 포함하는 50% CLOROXTM용액에 20분간 침지시켜 표면살균한 후에 살균수로써 3차례 헹구었다.
미숙 배들(embryos)을 당분야에 공지된 방법들을 사용하여 각각의 낟알들로부터 분리했다. 미숙 배를 질산은 16.9mg/L를 포함하는 배지 211(N6 염들, 2% 수크로스, 1mg/L 2,4-D, 0.5mg/L 니아신, 1.0mg/L 티아민-HCl, 0.91g/L L-아스파라긴, 100mg/L 미오이노시티올, 0.5g/L MES, 100mg/L 카제인 가수분해물, 1.6g/L MgCl2, 0.69g/L L-프롤린, 2g/L GELGROTM, pH 5.8)(배지 211V로 지칭) 상에서 유전자총 충격 전 3~6일 동안, 바람직하게는 3~4일 동안 배양했다.
실시예
21.
옥수수 세포들과 다른 단자엽식물들의 아그로박테리움 매개 형질전환 방법들이 공지되어 있다(Hiei 등, 1997; 미국특허 제5,591,616호; 미국특허 제5,981,840호; 유럽특허출원공개공보 EP 0 672 752호). 아그로박테리움의 여러 가지 균주들이 사용될 수 있지만(상기 참고내용 참조), 바람직하게는 균주 ABI가 본 발명자들에 의해 사용된다. 아그로박테리움의 ABI균주는 C58 노파린형 균주인 균주 A208로부터 유래되고, 이를 37℃에서 배양하므로써 Ti 플라스미드가 제거되고, 변형된 Ti 플라스미드 pMP90RK(Koncz와 Schell, 1986)을 더 포함하도록 유도된다. 바람직하게는, 아그로박테리움 투메파시엔스 이성분 벡터 시스템(An 등, 1998)이 옥수수를 형질전환시키기 위해 사용된다. 선택적으로는, 이전부터 설명되었던 복합 Ti 플라스미드 벡터(Rogers 등, 1988)들이 옥수수를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다. 목적하는 하나 이상의 유전자들을 포함하는 이성분 벡터는 전기영동(Wen-jun과 Forde, 1989) 또는 세 어버이 교배(Ditta 등, 1980)를 사용하여 병원성이 제거된 아그로박테리움 균주 내로 도입될 수 있다. 이성분 벡터는 형질전환된 식물상에서 요구되는 표현형 특성을 제공하는 선택적 마커 유전자, 스크린가능한 마커 유전자 및/또는 하나 이상의 유전자들을 포함할 수 있다. 이성분 벡터의 예로서, pMON30113이 도 4에 개시되어 있다. 당업자들에게 공지된 다른 이성분 벡터들도 사용될 수 있다.
옥수수 세포들을 공동배양 하기 전에, 변형된 Ti 플라스미드와 이성분 벡터의 유지를 위하여 선택된 적절한 항생물질들을 포함하는 LB(DIFCO) 액체 배지 내에서 28℃의 온도로 아그로박테리움 세포들을 성장시킬 수 있다. 예를 들면, 이성분 벡터 pMON30113의 유지를 위해 선택된 100㎍/㎖ 스펙티노마이신 및, pMP90RK 변형 Ti 플라스미드의 유지를 위해 선택된 50㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 LB 배지 내에서 ABI/pMON30113를 성장시킬 수 있다. 숙주 아그로박테리움 균주 내에서 플라스미드들을 유지하기 위해서 적절히 선택된 물질들을 사용하는 것은 당업자들에게는 자명할 것이다. 옥수수 세포들을 접종하기 전에, 플라스미드 유지를 위한 적절한 항생물질들과 200μM 아세토시린곤을 포함하는 AB배지(Chilton 등, 1974) 내에서 실온 하에 아그로박테리움 세포들을 밤새 성장시킨다.
옥수수 세포들을 접종하기 바로 전에, 바람직하게는, 아그로박테리움은 원심분리에 의해 펠릿화되고, 200μM 아세토시린곤을 포함하는 1/2MSVI 배지(2.2g/L GIBCO(Carlsbad, CA) MS 염들, 2mg/L 글리신, 0.5g/L 니아신, 0.5g/L L-피리독신-HCl, 0.1mg/L 티아민, 115g/L L-프롤린, 10g/L D-글루코스 및 10g/L 수크로스, pH 5.4) 내에서 세척되고, 200μM 아세토시린곤을 포함하는 1/2MSPL 배지(2.2g/L GIBCO(Carlsbad, CA) MS 염들, 2mg/L 글리신, 0.5g/L 니아신, 0.5g/L L-피리독신-HCl, 0.1mg/L 티아민, 115g/L L-프롤린, 26g/L D-글루코스와 68.5g/L 수크로스, pH 5.4) 내에서 0.1~1.0×109 세포들/㎖로 재현탁된다. 당업자는 1/2 MSVI 또는 1/2 MSPL 대신에 다른 배지로 대체할 수 있다.
미숙 옥수수 배들(embryos)은 상기 설명된 바에 따라서 분리된다. 배들은 절개 후 0~7일, 바람직하게는 절개 후 곧바로 접종된다. 선택적으로는, 미숙 배들은 7일 이상의 기간 동안 배양될 수 있다. 예를 들면, 배발생 유합조직은 상기 설명된 바와 같이 개시될 수 있고, 아그로박테리움과 함께 공동배양될 수 있다. 바람직하게는, 미숙 옥수수 배들은 절개되고, 상기 설명된 바에 따라서 제조된 1/2 MSPL 배지 내의 아그로박테리움 현탁액 내에 담궈지고, 아그로박테리움과 함께 5~20분간 실온에서 배양된다.
접종 후에 배들을 3.0mg/L 2.4-디클로로페닐옥시아세트산(2,4-D), 1% D-글루코스, 2% 수크로스, 0.115g/L L-프롤린, 0.5mg/L 티아민-HCl, 200μM 아세토시린곤 및 20μM의 질산은 또는 티오황산은을 포함하는 1/2 농도의 MS 배지(Murashige와 Skoog, 1962)로 옮긴다. 미숙 배들은 아그로박테리움과 함께 1~3일간 23℃에서 어둠 속에서 공동배양된다. 당업자는 상기 설명한 배지 대신에 다른 배지로 대체할 수 있다.
공동배양된 배들을 배지 15AA(462mg/L 황산암모늄, 400mg/L KH2PO4, 186mg/L MgSO4-7H20, 166mg/L CaCl2-2H2O, 10mg/L MnSO4-H20, 3mg/L H3BO3, 2mg/L ZnSO4-7H2O, 0.25mg/L NaMoO4-2H2O, 0.025mg/L CuSO4-5H2O, 0.025mg/L CoCl2-6H2O, 0.75mg/L KI, 2.83g/L KNO3, 0.2mg/L 니아신, 0.1mg/L 티아민-HCl, 0.2mg/L 피리독신-HCl, 0.1mg/L D-비오틴, 0.1mg/L 염화콜린, 0.1mg/L 판토텐산칼슘, 0.05mg/L 엽산, 0.05mg/L P-아미노벤조산, 0.05mg/L 리보플라빈, 0.015mg/L 비타민 B12, 0.5g/L 카사미노산, 33.5mg/L Na2EDTA, 1.38g/L L-프롤린, 20g/L 수크로스, 10g/L D-글루코스), 또는 1.5mg/L 2,4-D, 500mg/L 카르베니실린, 3% 수크로스, 1.38g/L L-프롤린과 20μM 질산은 또는 티오황산은을 포함하는 MS 배지로 옮기고, 선택없이 27℃에서 0~8일 동안 어둠 속에서 배양했다. 형질전환체들의 선택 및 식물들의 재생을 위해 사용된 배지는 바람직하게는 500g/L 카르베니실린을 포함한다. 당업자는 아그로박테리움의 성장을 조절하는 다른 항생물질로 대체시킬 수 있다. 세포배양을 지지하는 다른 배지도 선택적으로 사용될 수 있다. 선택 지연의 부재(0 배양일)하에서, 선택은 25mg/L 파로모마이신 상에서 개시될 수 있다. 선택배지는 배지 211(상기 설명됨) 또는 배지 211의 N6염들이 MS염들로 대체된 변형배지이다. 2주 후에, 배생성 유합조직들은 100mg/L 파로모마이신을 포함하는 배지로 옮겨지고, 약 2주일 간격으로 2차 배양된다. 공동배양 후에 선택이 지연되는 때에는 배들(embryos)은 처음에는 50mg/L의 파로모마이신을 포함하는 배지 상에서 배양되고, 그 다음에 100~200mg/ℓ의 파로모마이신을 포함하는 배지 상에서 배생성 유합조직의 2차 배양이 이어진다. 당업자는 선택적 마커 유전자가 결핍된 세포들의 성장을 억제하는 파로모마이신 농도에서 조직을 배양할 수 있지만, 그 농도에서는 형질전환된 유합조직들은 증식될 수 있다. 선택적으로는, 형질전환된 세포들을 확인하기 위해서 다른 선택적 마커들을 사용할 수 있다. 25~50mg/L의 파로모마이신 상에서 약 2주일간의 최초배양에 이어서 50~200mg/L의 파로모마이신 상에서의 배양은 형질전환된 유합조직들을 회복시킬 것으로 믿어진다. 형질전환체들은 선택 개시 후 6~8주에 회복된다. 유전자총 충격 후에 회복된 형질전환체들에 대하여 상기 설명된 바와 같이, 식물들은 형질전환된 배생성 유합조직으로부터 재생된다.
실시예
22. 옥수수
유합조직의
아그로박테리움 매개 형질전환
이 실시예에서는 아그로박테리움을 사용하는 옥수수 유합조직의 형질전환에 관한 방법을 개시한다. 이 방법은 nptⅡ 선택적 마커 유전자와 파로모마이신 선택적 작용물질을 사용하여 예시된다. 당업자는 대안으로서 사용될 수 있는 다른 선택적 마커와 선택적으로 사용가능한 작용물질의 조합을 알 수 있을 것이다.
유합조직은 당업자들에 공지된 방법들을 사용하여 미숙 배들로부터 발생된다. 예를 들면, 1.5mm~2.0mm의 미숙 배들을 CORN OF GERMPLASM A와 같은 유전자형의 발육된 옥수수종자를 절개하여 얻고, 배지 211Ⅴ 상에서 측하방 배아축과 함께, 일반적으로 절개 후 8~21일 동안 배양했다. 선택적으로, 당업자들에 공지된 방법들에 의하여 확립된 유합조직 배양이 개시될 수 있고, 유지될 수가 있다.
아크로박테리움은 실시예 21에서 설명된 방법들에 따라서 식물의 조직에 접종하기 위하여 제조됐다. 0.1~1.0×109 cfu/㎖의 아그로박테리움 현탁액 약 15㎖를 포함하는 60mm×20mm 페트리디쉬에 유합조직 50~100조각을 옮겼다. 유합조직의 한 조각은 일반적으로 21일에 이르는 배양기간 내에 미숙 배에 의해 만들어진 유합조직 모두이거나 또는 직경이 2mm~8mm의 확립된 유합조직의 한 조각이다. 유합조직은 아그로박테리움 현탁액과 함께 실온에서 약 30분간 배양되었고, 그 후 액체를 흡인에 의해 제거시켰다.
약 50㎕의 살균소독된 증류수를 60mm×20mm의 페트리디쉬 내에서 와트만 #1 여과지에 첨가했다. 1~5분 후에, 유합조직 15~20 조각들을 각각의 여과지에 옮기고, 예를 들면 PARAFILM
을 사용하여 플레이트를 밀봉했다. 유합조직과 아그로박테리움을 어둠 속에서 23℃에서 약 3일 동안 공동배양했다.
유합조직들을 여과지로부터 20μM의 질산은 및 500㎎/L의 카르베니실린이 함유된 배지 211로 함께 옮기고, 어둠 속에서 27℃~28℃의 온도로 2~5일간, 바람직하게는 3일간 배양했다. 유합조직을 20μM 질산은, 500㎎/L 카르베니실린 및 25㎎/L 파로모마이신을 포함하고 있는 배지 211로 옮김으로써 선택이 개시되었다. 어둠 속에서 27℃~28℃의 온도로 2주간의 배양 후에, 유합조직을 20μM 질산은, 500㎎/L 카르베니실린 및 50㎎/L 파로모마이신이 함유된 배지 211(배지 211QRG)로 옮겼다. 유합조직들은 2주일 후에 신선한 배지 211QRG에서 2차 배양되고, 어둠 속에서 27℃~28℃에서 2주일간 더 배양됐다. 그 후에 유합조직을 20μM 질산은, 500㎎/L 카르베니실린 및 75㎎/L 파로모마이신과 함께 배지 211로 옮겼다. 어둠 속에서 27℃~28℃의 온도로 2~3주일 배양 후에 파로모마이신 저항성이 있는 유합조직을 확인했다. 당업자는 유합조직의 2차 배양들 사이의 시간은 근사적임을 알 수 있으며, 더 빈번한 간격, 예를 들면, 격주보다는 일주일마다 조직을 옮김으로써 선택공정을 가속화시킬 수 있음을 알 수 있을 것이다.
식물들은 형질전환된 유합조직으로부터 재생되고, 토양으로 옮겨지고, 실시예에서 설명된 바와 같이 온실 내에서 성장되었다. 아그로박테리움 매개 형질전환 후에, 배지 217(실시예 9 참조)은 500㎎/L의 카르베니실린을 더 포함하고, 배지 127T(실시예 9 참조)는 250㎎/L의 카르베니실린을 더 포함한다. 아그로박테리움 매개 형질전환을 사용하여 생성된 본 발명의 유전자들을 포함하는 형질 전환된 옥수수 식물들은 표Y에 요약되어 있다.
실시예
23.
유전자총
충격법(
Method
of
microprojectile
bombardment
)
유전자총 충격 약 4시간 전에 미숙 배들(embryos)을 배지 211SⅤ로 옮겼다(수크로스 12%를 첨가한 배지 211Ⅴ). 바람직하게는, 25개의 미숙 배들을 60×15mm의 페트리디쉬에 넣고, 20도 각도로 배지 내로 약하게 내리 눌러진 배반(scutellum)의 초엽 말단과 함께 5×5의 그리드로 배열되었다. 조직은 유전자총 충격 전에 어둠 속에서 유지됐다.
유전자총 충격 전에, 금 입자들의 현탁액을 제조하고, 그 위에 요구되는 DNA를 침전시켰다. 0.6㎛의 금 입자들(BioRad) 10㎎을 50㎕의 완충액(150mM NaCl 10mM 트리스 염산, pH 8.0) 내에 현탁시켰다. 원하는 DNA의 2.4nM 용액 25㎕를 금 입자들의 현탁액에 첨가하고, 약 5초 동안 천천히 휘저었다. 0.1M 스퍼미딘 75㎕를 첨가하고, 이 용액을 약 5초 동안 천천히 휘저었다. 폴리에틸렌 글리콜(분자량 3000~4000, American Type Culture Collection) 25% 용액 75㎕를 첨가하고, 이 용 액을 5초 동안 천천히 휘저었다. 2.5M CaCl2 75㎕를 첨가하고, 이 용액을 5초 동안 천천히 휘저었다. CaCl2를 첨가한 다음에, 상기 용액을 실온에서 10~15분 동안 배양했다. 현탁액을 12,000rpm으로 20초 동안 원심분리(Soral MC-12Ⅴ 원심분리기)시키고 상등액은 버렸다. 금입자/DNA 펠릿을 100% 에탄올로 2회 세척하고, 100% 에탄올 10mL에 재현탁시켰다. 금입자/DNA 조제물을 2주일에 이르는 기간 동안 -20℃에서 저장했다.
DNA를 방전입자가속 유전자전달장치(미국특허 제5,015,580호)를 사용하여 옥수수 세포들 내로 도입했다. Mylar 시트(Du Pont Mylar 폴리에스테르 필름타입 SMMC2, 한 면에 알루미늄이 코팅되고, 양면에 PVDC 공중합체가 오버코팅됨, 18mm2크기로 절단) 위에 금입자/DNA 현탁액 310~320㎕를 분산시켜서 상기 시트를 코팅했다. 금입자 현탁액이 1~3분 동안 정착된 후에 여분의 에탄올을 제거하고, 시트를 공기건조했다. 옥수수 조직의 유전자총 충격은 미국특허 제5,015,580호의 기재에 따라서 실시됐다. 방전입자전달장치에서 교류전압은 변할 수 있다. CORN OF GERMPLASM A의 미리 배양된 미숙 배들의 유전자총 충격을 위하여, 바람직하게는, 최대전압의 35%~45%가 사용된다. 유전자총 충격 후에, 조직을 어둠 속에서 27℃에서 배양했다.
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24. 형질전환된 세포들의 선택
형질전환체들은 형질전환 네오마이신 포스포트랜스퍼라제Ⅱ(nptⅡ)유전자의 발현에 근거하여, 파로모마이신을 포함하는 배지 상에서 선택됐다. DNA 전달 후 24시간 후에, 조직을 25㎎/L 파로모마이신(배지 211HⅤ)을 포함하는 배지 211Ⅴ로 옮겼다. 어둠 속에서 27℃의 온도로 3주일간 배양한 후에, 조직을 50㎎/L 파로모마이신을 포함하는 배지 211(배지 211G)로 옮겼다. 3주일 후에 조직을 75㎎/L 파로모마이신을 포함하는 배지 211(배지 211XX)로 옮겼다. 선택 후 9주일 후에 형질전환체들을 분리했다. 표Y는 여기에서 개시된 유전자총 충격법을 사용한 형질전환체 실험 결과들을 개시하고 있다.
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25.
임성의
(
fertile
) 형질전환 식물들의 재생
임성 형질전환 식물들은 형질전환된 옥수수 세포들로부터 생산됐다. 형질전환된 유합조직을 5~7일 동안 어둠 속에서 27℃의 온도에서 배지 217(N6 염들, 1㎎/L 티아민-HCl, 0.5㎎/L 니아신, 3.52㎎/L 벤질아미노푸린, 0.91㎎/L L-아스파라긴 일수화물, 100㎎/L 미오-이노시톨, 0.5g/L MES, 1.6g/L MgCl2-6H2O, 100㎎/L 카제인 가수분해물, 0.69g/L L-프롤린, 20g/L 수크로스, 2g/L GELGROTM, pH 5.8)로 옮겼다. 체세포 배들의 성숙과 싹 재생은 배지 217상에서 시작됐다. 싹 성장을 위하여 조직을 배지 127T(MS 염들, 0.65㎎/L 니아신, 0.125㎎/L 피리독신-HCl, 0.125㎎/L 티아민-HCl, 0.125㎎/L 판토텐산칼슘, 150㎎/L L-아스파라긴, 100㎎/L 미오-이노시톨, 10g/L 글루코스, 20g/L L-말토스, 100㎎/L 파로모마이신, 5.5g PHYTAGARTM, pH 5.8)로 옮겼다. 배지 127T 상에서 조직을 400~600 Lux의 광에서 26℃의 온도로 배양했 다. 묘목들이 크기가 약 3인치이고 뿌리가 생겼을 때, 127T 배지로 옮긴 후 약 4~6주 후에, 묘목들을 토양, 바람직하게는 3인치 포트로 옮긴다. 식물들을 성장실 내에서 26℃의 온도로 2주일간 유지시킨 다음에, 온실성장을 위하여 5갤론 포트로 이식을 하기 전에 온실 내의 번식상(mist bench)에서 2주일간 더 유지됐다. 식물들은 온실 내에서 성숙할 때까지 자랐고, 상호수분은 근친교배된 CORN OF GERMPLASM A를 이용하여 이루어졌다. 종자는 식물들로부터 모아졌고, 번식을 위해 더 사용됐다.
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26. 식물로부터 핵산들의 분리
묘목들을 토양으로 옮긴 후 0~2주일 후에 핵산들을 RO 식물들의 입조직으로부터 분리하여 모으고, 96웰 수집상자 내에서 급속 냉동됐다. 약 100㎎의 조직이 각각의 식물로부터 수집되어, 분석할 때까지 -80℃로 저장됐다.
변형된 Qiagen Rneasy 96TM 키트(Qiagen Inc., Valencia, CA)를 사용하여 DNA와 RNA가 단일조직 시료로부터 분리됐다. 냉동된 조직 100㎎을 700㎕의 RneasyTM RTL완충액(Qiagen Inc., Valencia, CA) 내에서 Bead BeaterTM(Biospec Products, Bartlesville, OK)를 사용하여 균질화했다. 시료들을 15분 동안 3200rpm으로 원심분리하고, 상등액 모두를 Promega WIZARDTM 투명플레이트(Promega Corporation, Madison, WI)의 웰로 옮겼다. 시료용액을 투명플레이트를 통한 진공여과에 의해 투명하게 했다. 투명한 상등액은 핵산추출을 위해 사용됐다.
DNA 추출을 위하여, 투명한 시료 70㎕를 접착용 호일로 덮힌 V-웰 PCR 플레이트로 옮기고, 8분 동안 95℃로 가열했다. 시료들을 0℃에서 5분간 배양한 다음에 3분간 원심분리시켜서 불용성 물질들을 제거했다. 세파덱스 G-50 겔 여과 상자(Edge Biosystems, Gaithersburg. MO)를 2000rpm에서 2분 동안 조절작동시켰다. 열처리된 상등액 40㎕를 각각의 웰에 넣고, 상자를 2500rpm에서 2분간 원심분리시켰다. 추가로 TE 완충액 20㎕를 컬럼 유출액에 첨가하고, 시료 플레이트를 분석할 때까지 -20℃에서 저장했다.
RNA 추출을 위하여, 투명한 용액 500㎕를 깨끗한 96웰 샘플박스에 옮겼다. 100% 에탄올 250㎕를 각각의 시료에 첨가하고, 시료를 완전히 혼합시켰다. 용액 약 750㎕ 모두를 Promega WIZARDTM 여과장치 내의 Qiagen RneasyTM 바인딩 플레이트의 웰 속에 넣었다. RW1완충액(Qiagen Inc., Valencia CA) 500㎕를 각 웰에 첨가하고, 완충액을 진공여과에 의해 제거했다. RNA분해효소(RNAase)가 존재하지 않는 DNA분해효소(DNAase)(Qiagen Inc., Valencia CA) 80㎕를 각 웰에 첨가하고, 15분간 실온에서 배양하고, 진공여과에 의해 웰을 통해 DNA분해효소 용액을 제거한다. 추가로 500㎕의 RWI완충액(Qiagen Inc., Valencia CA)을 웰에 첨가하고, 완충액을 진공여과로 제거시켰다. 시료들을 500㎕의 RPE 완충액 2X(Qiagen, Valencia CA)로 진공여과에 의해 더 세척했다. 추출 플레이트를 마이크로타이터 플레이트 상에 놓고, 3000rpm으로 3분간 원심분리시켜서 필터에 있는 모든 잔류 RPE 완충액을 제거했다. RNA 등급수(DNA분해효소 비존재) 80㎕를 각 웰에 첨가한 다음에, 실온에서 2분간 배양시켰다. 추출 플레이트와 마이크로타이터 플레이트를 3000rpm에서 3분 동안 원심분리시키고, RNA 조제물을 -80℃에서 수집플레이트 내에 냉동저장했다.
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27. 카피 수의 분석
R0 식물들에 있어서 형질전환 유전자의 카피 수는 TAQMAN® 방법들을 사용하여 결정되었다. pMON65154 및 pRG76 GATEWAYTM 목적 벡터들은 형질전환 유전자의 삽입 카피 수를 분석하기 위해 사용될 수 있는 감자 pinII 유전자의 3' 영역으로부터 유도된 서열로 구성되었다. pinII 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 다음과 같다:
순방향 프라이머 5' ccccaccctgcaatgtga 3' (서열번호: 77)
역방향 프라이머 5' tgtgcatccttttatttcatacattaattaa 3' (서열번호: 78)
pinII TAQMAN® 프로브 서열은 다음과 같다:
5' cctagacttgtccatcttctggattggcca 3' (서열번호: 79)
프로브는 형광 염료 FAM(6-카르복시플루오레세인)으로 5' 말단에 표지되었고, 퀀처 염료 TAMRA(6-카르복시-N,N,N',N'-테트라메틸로다민)는 프로브의 3' 말단에 링커를 통해 부착되었다. TAQMAN® 프로브는 Applied Biosystems(Foster City, CA)로부터 얻어졌다. ___ SAT, 단일 카피 옥수수 유전자는 TAQMAN® 카피 수 분석에 있어서 내부 대조구로서 사용되었다. SAT 프라이머들은 다음과 같다:
순방향 프라이머 5' gcctgccgcagaccaa 3' (서열번호: 80)
역방향 프라이머 5' atgcagagctcagcttcatc 3' (서열번호:81)
SAT TAQMAN® 프로브 서열은 다음과 같고:
5' tccagtacgtgcagtccctcctcc 3' (서열번호: 82)
상기 프로브는 형광 염료 VICTM(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 5' 말단에 표지되었고, 퀀처 염료 TAMRA로 3' 말단에 표지되었다.
TAQMAN® PCR이 제조자 설명서(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 따라서 수행되었다. 5~100 나노그램의 DNA가 각각의 분석에 사용되었다. PCR 증폭과 TAQMAN® 프로브 검출은 AmpliTaq Gold® DNA 폴리머라제, AmpErase® UNG, dNTPs 및 dUTP, Passive Reference 1, 및 최적화된 완충제를 포함하는 1X TAQMAN® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)로 수행되었다.
각각 800nM의 pinII 순방향 프라이머들과 역방향 프라이머들 및 150nM의 pinII TAQMAN® 프로브가 TAQMAN® 분석에 사용되었다. 각각 200nM의 Sat 순방향 프라이머와 역방향 프라이머들 및 150nM의 Sat TAQMAN® 프로브가 TAQMAN® 카피 수 분석에 사용되었다. TAQMAN® PCR은 50℃에서 2분 동안, 95℃에서 10분 동안 수행되었고, 이어서 95℃에서 15초, 그리고 60℃에서 1분의 40사이클이 수행되었다. 실시간 TAQMAN® 프로브 형광은 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템 또는 ABI7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 측정되었다. CT 값은 TAQMAN®EZ RT-PCR kit 사용 설명서(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 따라 계산되었다. ΔΔCT 값은 CT(내부 대조구 유전자(Sat)) - CT(형질전환 유전 자) - CT(형질전환되지 않은 식물내의 내부 대조구 유전자(Sat))로서 계산되었다. 카피 수는 표 12에 있는 표준에 따라 다음과 같이 나타내었다.
표 19
TAQMAN®에 의한 카피 수 결정을 위한 표준
본 발명의 유전자들을 포함하는 식물들은 TAQMAN® 방법들에 의해 카피 수가 분석될 것이다. 약 80%의 식물들에 있어서 TAQMAN® 카피 수 결정을 확인하기 위한 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)은 TAQMAN® 및 서던 블롯 혼성화에 의해 분석되었다.
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28. 유전자 발현에 대한 분석들
본 발명의 형질전환 유전자의 발현은 Applied Biosystems(Foster City, CA)의 TAQMAN® EZ RT-PCR 키트를 사용하는 TAQMAN® RT-PCR에 의해 분석되었다. RNA 발현은 pinII 3' 비번역 영역에 작동가능하게 연결된 바실러스 투린지엔시스(B. thuringiensis) cryIAI 유전자를 포함하는, 형질전환 표준인 DBT418로 지정된 형질전환 옥수수종에 있어서의 발현에 대하여 분석되었다. DBT418 종은 European Corn Borer와 같은 렙디옵테란 곤충에 대한 저항성의 상업적 수준을 제공하는 수준으로 cryIAI 유전자를 발현하고, 이는 DEKALBt®라는 상표명으로 DEKALB 유전자 회사에 의해 상업적으로 판매되었다. pMON65154 및 pRG76 GATEWAYTM 목적 벡터들은, 목적 벡터내로 삽입된 어떤 코딩 서열을 위한 형질전환 전사 수준을 분석하기 위해서 사용될 수 있는 감자 pinII 유전자의 3' 영역으로부터 유도된 서열로 구성되었다. pinII 프라이머들 및 프로브는 이전에 기술되었고, TAQMAN® RT-PCR을 위해 사용되었다. 유비퀴틴 융합 단백질(UBI) RNA는 모든 TAQMAN®RT-PCR 분석들에 있어서 내부 대조구로서 사용되었다. 사용된 UBI 프라이머들은 다음과 같다:
순방향 프라이머 5' cgtctacaatcagaaggcgtaatc 3' (서열번호: 83)
역방향 프라이머 5' ccaacaggtgaatgcttgatagg 3' (서열번호: 84)
UBI TAQMAN® 프로브의 서열은 다음과 같다:
5' catgcgccgctttgcttc 3' (서열번호: 85)
UBI TAQMAN® 프로브는 형광 염료 VICTM(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 5' 말단에 표지되었고, 퀀처 염료 TAMRA로 3' 말단에 표지되었다.
역전사, PCR 증폭 및 TAQMAN® 프로빙이 TAQMAN® EZ RT-PCR 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 기술된 1단계 공정에 따라서 수행되었다. 전체 RNA의 5~100나노그램이 각각의 분석에 사용되었다. 생체 외에서 전사된 DBT418 종으로부터의 대조구 RNA는 모든 플레이트상에서 대조구로서 포함되었고, 0.01~10피코그램의 농도범위에 있다. 유전자원(germplasma)인 DBT418 잎과 비-형질전환 근친 교배종 CORN OF GERMPLASM A로부터의 총 RNA는 각각 양성 대조구와 음성 대조구로서의 역할을 한다. RT-PCR은 3mM의 망간 아세테이트, 각각 300μM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP, 100유닛의 rTthTM(Applied Biosystems, Foster City, CA) DNA 폴리머라제, 및 25유닛의 AmpErase UNG(Applied Biosytems, Foster City, CA)을 포함하는 TAQMAN®EZ 완충용액(50mM Bicine, 115mM 포타슘아세테이트, 0.01mM EDTA, 60mM Passive Reference 1, 8% 글리세롤, pH8.2, Applied Biosystems, Foster City, CA)내에서 수행되었다. RT-PCR은 다음과 같이 수행되었다: 50℃에서 2분, 60℃에서 30분, 95℃에서 5분, 이어서 95℃에서 20초 및 60℃에서 1분간의 40싸이클. 각각 400nM의 순방향 프라이머와 역방향 프라이머가 pinII 서열의 증폭을 위해 사용되었고, 200nM TAQMAN® pinII 프로브가 검출을 위해 사용되었다. UBI RNA는 각각 400nM의 순방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 증폭되었고, 200nM의 UBI TAQMAN® 프로브가 검출을 위해 사용되었다. TAQMAN® 형광은 ABI 프리즘 7700 서열 검출 시스템 또는 ABI7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 검출되었다. 본 발명의 형질전환 유전자의 발현은 DBT418에서의 형질전환 유전자의 발현에 대해서 정량되었고, DBT418 발현, 즉, 2-(ΔΔ C T )(형질전환 유전자) /2-(ΔΔ C T )(DBT418)에 대한 형질전환 유전자의 발현의 비율로 보고되었 다.
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29. 식물 번식
역교배는 출발 식물을 개선하기 위해서 사용될 수 있다. 역교배는 특정 바람직한 형질을 하나의 기원으로부터 그러한 형질이 없는 근친교배 식물 또는 다른 식물로 전이시킨다. 이는, 예를 들어 목적 형질을 위한 적당한 유전자(들), 예를 들어 본 발명에 따라 제조된 구조체를 운반하는 우수한 근친교배종(A)(반복 양친)을 공여자 근친교배종(비-반복 양친)과 1차 교배시키므로써 수행될 수 있다.
이러한 1차 교배의 자손은 결과로 얻어진 자손 중에서 비-반복 양친으로부터 전달되어질 바람직한 형질을 기준으로 선택되고, 그 후 선택된 자손은 우수한 반복 양친(A)과 역교배된다. 바람직한 형질을 기준으로 선택하여 5세대 이상의 역교배 이후에, 자손은 전달되어질 특징을 조절하는 부위에 대해 반접합성(hemizygous)이지만, 대부분의 또는 거의 대부분의 다른 유전자들에 대해 우수한 양친과 유사하다. 마지막 역교배 세대는 전달되어질 유전자에 대해 순수 육종인, 즉 하나 이상의 형질전환종인 자손을 제공하기 위해서 자가수분될 것이다.
그러므로, 일련의 번식 조작을 통해서, 선택된 형질전환 유전자는 추가의 재조합 조작의 필요 없이 하나의 계통으로부터 완전히 다른 계통으로 전달될 수 있다. 형질전환 유전자는 전형적으로 어떤 다른 유전자와 같이 유전학적으로 작용한다는 점에 있어서 가치가 있고, 어떤 다른 옥수수 유전자와 동일한 방법으로 번식 기술에 의해 조작될 수 있다. 그러므로, 하나 이상의 형질전환 유전자들에 대해 순 수육종인 근친교배 식물들을 생산할 수 있다. 다른 근친교배 식물들을 교배하므로써, 형질전환 유전자의 다른 조합을 갖는 많은 다른 잡종들이 생산될 수 있다. 이러한 방법으로, 하나 이상의 형질전환 유전자(들)에 의해 부여된 바람직한 특징들 뿐만 아니라, 잡종들과 종종 관련된 바람직한 작물학적 특징("잡종 생장력")을 갖는 식물들을 생산할 수 있다.
형질전환 식물에 있는 각각의 유전자에 의해 제공된 표현형의 특징을 위하여 옥수수 잡종내로 본 발명의 유전자들을 유전자 이입하는 것이 바람직하다.
형질전환 유전자가 도입된 숙주 유전자형, 바람직하게는 CORN OF GERMPLASM A는 엘리트 근친교배종이고, 따라서 높은 수율의 옥수수 잡종을 생산하기 위해서 제한된 번식만이 필요하다. 유합조직으로부터 재생된 형질전환 식물이 교배되어 동일한 유전자형, 예컨대, CORN OF GERMPLASM A가 된다. 자손은 2번 자가수분되고, 형질전환 유전자에 대해 동형접합성인 식물들이 확인된다. 동형접합성 형질전환 식물들은 잡종을 생산하기 위한 검정교잡 양친과 교배된다. 검정교잡 양친은 이형강세(heterotic) 그룹에 속하는 동종교배종인데, 이는 형질전환 양친과 다르고, 높은 수율의 잡종들을 생산하는 것으로 알려져 있고, 예를 들어, 잡종들은 CORN OF GERMPLASM A와 CORN OF GERMPLASM E 또는 CORN OF GERMPLASM B와의 교배로부터 생산된다.
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30. 표현형의 평가방법
본 발명의 유전자들의 발현은 형질전환 세포들 및 식물들에서 본원에 기술된 바와 같은 여러가지 표현형을 만들어낸다. 표현형 데이터는 식물 및 자손에서 뿐만 아니라 식물이 재생되는 동안 유합조직에서의 형질전환 과정 동안에도 수집된다. 표현형 데이터는, 예컨대, 싹, 뿌리, 녹말질 및 유점액의, 비-배형성적 증가된 성장속도, 감소된 성장속도, 사망과 같은 유합조직의 형태학상의 외관 및 성장과 관련하여, 유합조직에서 수집된다. 당업자는 형질전환 유합조직에 있어서의 다른 표현형 특징들을 알 수 있을 것이다.
표현형 데이터는 또한 재생된 식물이 토양으로 이동되는 동안 뿐만 아니라 식물 재생과정 동안에도 수집된다. 표현형 데이터는 일반적인 식물들, 덤불 식물들, 좁은 잎, 줄무늬 잎, 매듭 표현형, 백화현상, 백변종, 안토시아닌 생성, 버기(buggy) 감김(최근에 자란 잎들이 가늘고 길거나 서로 휘감기는, 당업계에 공지된 현상), 또는 변형된 수염들, 이삭들 또는 뿌리들과 같은 특징들을 포함한다. 당업자는 형질전환 식물들 중에서의 다른 표현형 특징들을 알 수 있을 것이다.
광범위한 표현형들이 식물 번식의 과정 동안에, 그리고 근친교배종 및 잡종 식물들 모두의 테스트 과정 동안에 모니터된다. 예를 들어, R0 및 R1 식물들(유합 조직으로부터 직접 재생된 식물들 및 그러한 식물들의 직계)에 있어서, 식물 타입(묘목들에 있어서의 상기 기술된 바와 같은 일반적인 형태학상의 특징들)과 식물들에 의해 생산된 곡물의 영양학적 조성이 기록된다. 영양학적 조성 분석은 아미노산 조성, 단백질, 녹말 및 오일의 양, 단백질, 녹말 및 오일의 특징들, 섬유, 재, 광물 함량을 모두 측정하는 것을 포함할 수 있다. 당업자는 곡물의 다른 성분들을 분석하는 것을 포함시킬 수 있을 것이다. R2 및 R3 식물들에 있어서는, 꽃가루가 발 산된 날, 견모가 밀생한 날들 및 식물 타입이 관찰된다. 또한, R2 식물들의 대사산물 프로파일링이 수행된다. 당업자들이 이용가능한 방법들을 사용하여, 50~100 또는 그 이상의 대사산물들이 식물 내에서 분석될 수 있고, 이것에 의해 식물의 물질대사 핑거프린트가 수립된다. 또한, R3 식물들에 있어서, 잎의 신장속도가 현장 상태에서 측정된다. 다양한 표현형들이 본 발명의 형질전환 유전자를 포함하는 잡종에서 분석될 것이다. 예를 들어, 수율, 수분, 실험중량, 영양 조성, 엽록소 함량, 잎 온도, 입목, 묘목 생장력, 식물 높이, 잎의 수, 새싹(tillering), 곁뿌리, 스테이 그린(stay green), 줄기 도복, 뿌리 도복, 식물 건강, 불임/번식, 그린 스냅(green snap), 해충 저항성(질병, 바이러스 및 곤충들을 포함) 및 물질대사의 프로파일들이 기록될 것이다. 또한, 이삭의 열(row) 당 낟알들의 수, 이삭에 있어서 낟알들의 열 수, 낟알 미결실, 낟알중량, 낟알 사이즈, 낟알 밀도 및 물리적인 곡물 특성을 포함하여, 잡종으로부터 수확된 곡물들의 표현형 특징들이 기록될 것이다. 또한, 광합성, 잎의 면적, 껍질 구조, 낟알 건조 저하율 및 절간(internode) 길이와 같은 특징들이 잡종 또는 근친교배종에서 측정될 수 있다. 전사 프로파일링이 본 발명의 유전자들을 나타내는 형질전환 식물들상에서 수행될 수 있을 것이다.
본 발명의 유전자들을 나타내는 형질전환 식물들에 있어서의 잡종 수율을 결정하기 위해서, 통상적으로 옥수수가 성장하는 지리학적인 지역, 예컨대, 아이오와, 일리노이즈 또는 중서부 미합중국에 있는 다른 지역들에서 잡종은 많은 위치들에서 테스트되어야만 한다. 1년 이상의 수율 테스트가 옥수수 잡종의 개선에 기여하는 형질전환 유전자들을 확인하기 위해서 요구된다. 그러므로, 첫해째에 형질전 환 잡종은 대응되는 비-형질전환 잡종과 적어도 약 10%의 수율 차이가 있다는 것을 확인하기에 충분한 수의 위치들에서 평가가 이루어질 것이다. 수율 테스트들에 있어서, 2년 째에는 충분한 수의 위치들에서 충분한 반복을 통해 테스트가 수행되어, 두 잡종들 사이에 4~5% 수율 차이를 확인할 수 있다. 또한, 수율 테스트들의 2년째에 있어서, 잡종은 스트레스 조건들, 예컨대 수분 스트레스 또는 개체밀도 스트레스의 조건들 하에서 뿐만 아니라 정상적인 현장 조건들하에서 평가될 것이다. 당업자들은 두 잡종들 사이에서 통계적으로 상당한 수율 차이가 원하는 정확도로 검출될 수 있도록 수율 시험을 디자인하는 방법을 알고 있다.
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31. 표면 살균소독 및 옥수수 종자의 침염(
imbibition
)
각각의 형질전환 유전자의 로트(lot)에 대해서, 약 50개의 옥수수 종자를 0.01% triton X-100를 포함하는 30% 표백제(소듐 하이포클로라이트 용액 = 클로록스 또는 균등물) 용액 50ml가 들어있는 살균용 500ml Erlenmyer 플라스크에 넣고, 5분 동안 오비탈 교반기상에서 플라스크를 회전시키므로써 표면을 살균소독한다. 표백제 용액을 쏟아내고 나서, 100ml의 무균 탈이온수로 세척하고, 세척한 물을 쏟아낸다. 무균수로 4회 이상 반복하여 세척하고, 마지막 세척물은 종자와 함께 남겨둔다. 침염을 위해서, 공기 기포하(0.2μm 필터를 통과시키면서)에서 24시간 동안 실온에서 상기 물중에서 종자를 배양한다.
I. 식물트레이들(phytotray)내의 배지의 제조
몇가지 식물트레이용 물-한천 배지의 제조. 거꾸로 한 상태의 식물트레이 II(또는 플라스틱 상자: 60 x 30 x 15cm)를 사용하므로써, 용기의 큰 깊이 측면은 바닥에 위치하고, 작은 측면이 덮개로서 사용된다. 액체 사이클에 있어서, 45분 동안 탈이온수 중의 0.3% BactoAgar를 오토클레이브하므로써 식물트레이당 100ml의 충분한 물-한천 배지를 제조한다. 쉽게 취급할 수 있을 정도까지 배지를 냉각하고, 여전히 용해된 상태에서 식물트레이당 약 100ml를 붓는다.
Ⅱ. 저온에서의 옥수수 묘목 생장력 분석
ㆍ배지가 고형화되었을 때, 배지와 무균 종자를 층류형 후드로 옮긴다.
ㆍ무균 핀셋을 사용하여, 20개의 건강하고, 거의 균일한 종자를 선택하여, 분석에 사용된 각각의 식물트레이에 종자들을 균일한 간격으로 배치하여, 누구라도 나중에 쉽게 제거할 수 있게 한다.
ㆍ배(embryo) 측면이 아래쪽으로 대각선 방향으로 삽입되도록 하여, 종자를 한천의 표면 바로 아래에 위치시킨다. 이 위치에서, 출아하는 가지와 뿌리는 방해받지 않고 직접 연장될 수 있을 것이다.
ㆍ22℃에서, 일주일 동안 또는 대부분의 종자가 작은 뿌리를 내밀어서 한천 으로부터 나타나기 시작할 때까지 배지에서 종자를 배양한다.
ㆍ층류형 후드에서 10개의 거의 균일하게 성장한 묘목들을 제거한다.
ㆍ식물트레이들을 16시간의 1일 사이클을 갖는 10℃로 고정된 저온 식물 성장 챔버로 옮겨서, 2주 동안 배양한다.
ㆍ일주일 동안 식물트레이들을 22℃로 되돌린다.
ㆍ묘목들을 제거하고, 모든 묘목들에 대해서 뿌리의 길이와 새싹의 길이를 측정하고, 중량증가분 g/3개 묘목을 측정하고, 노트에 기록한다.
저온 발아에 대한 적응 및 출아 분석
다음의 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실시한다:
ㆍ상기 I.에서의 마지막 물세척 후에, 플라스크를 침염 단계에서 밤새도록 10℃에 둔다. 또한 10℃에서 고형화된 배지로 식물트레이를 예냉시킨다.
ㆍ냉각한 식물트레이에 저온 침염된 종자들을 파종한 후에, 바로 10℃의 챔버에 둔다.
ㆍ약 5일이 지난 후에, 작은 뿌리들이 거의 같은 길이인, 거의 균일하게 발아된 10개의 종자들을 제거한다. 1~2주 동안 10℃ 챔버에 식물 트레이를 되돌려 놓는다. 묘목들을 제거하고, 모든 묘목들에 대해서 뿌리 길이와 새싹의 길이를 측정하고, 모든 묘목들로부터의 중량증가분을 측정하고, 노트에 기록한다.
ㆍ2번째 세트의 식물트레이들을 1주일 동안 22℃에 둔다.
묘목들을 제거하고, 모든 묘목들에 대해서 뿌리 길이와 새싹의 길이를 측정 하고, 노트에 기록한다.
실시예 31. 대두의 형질전환용 플라스미드들의 제조
실시예(CspA 및 B 구조체들 - pMON73983 및 73984에 대하여)
pMON73983(도 18)은 아그로박테리움-매개 형질전환 및 대두에 있어서 바실러스 서브틸리스 CspA 유사 단백질(서열번호: 1)의 구조적 발현을 위한 이성분 벡터이다. 바실러스 서브틸리스 CspA 유전자를 클로닝하기 위해서, 두개의 유전자-특이성 프라이머들인, MSA452 및 MSA453는 국립 건강연구원(NIH)의 소속기관인 국립 의학 도서관의 소속인 NCBI의 CspA 서열 정보(Genbank # M30139)를 기초로 하여 디자인되었다. MSA452에 대한 서열은 GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAAATGG(서열번호: 86)이고, 이는 CspA의 번역 개시 부위에서 어닐링하고, 5' 말단에 StuI 및 BglII 부위를 도입하며, 반면에 MSA453의 서열은 CGCGAATTCGGATCCTTATTACAGGCTGGTTACGTTACCAGCTGCC (서열번호: 87)이고, 이는 CspA의 마지막 코돈에서 어닐링을 하고, 프라이머의 말단에 BamHI 및 EcoRI 부위를 도입한다. 역방향 프라이머 MSA453은 Genbank 유전자 서열의 3' 말단에 일치되도록 디자인되었다. PCR 반응은 프라이머들 MSA452 및 MSA453, 고적합도 Taq 폴리머라제(BRL) 및 주형으로서 pMON57397(도 3)을 사용하여 수행되었다. 이 주형은 유전자 CspA의 3' 말단이 GeneBank 서열의 것과 다르다. 증폭된 CspB DNA는 겔-전기영동에 의해 정제되었고, pCR-XL-TOPO 벡터(Invitrogen)에 라이 게이션되었다. 라이게이션 반응은 제조자의 프로코콜에 의해 대장균 Top10 세포들(Invitrogen)내로 형질전환되었다. 4개의 형질전환체 콜로니들을 집어서, Qiagen Miniprep Kit를 사용하여 미니프렙 DNA를 제조하였다. 삽입체들은 M13-특이성 순방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 서열화되었다. 정확한 서열을 갖는 클론은 pMON73981이라 명명되었고, 다음의 서브클로닝을 위하여 사용되었다.
PMON73881 DNA는 StuI 및 BamHI로 절단되어, CspA 유전자 단편을 분리시켰다. pMON73980 DNA는 StuI 및 BamHI로 연속적으로 절단되고 나서, 유전자 클린 II 키트에 의해서 정제되었다. CspB 단편과 상기 정제된 벡터 pMON73980은 라이게이션되었고, 라이게이션 반응물은 대장균 DH10 B 세포들 내로 전기형질전환되었다. 형질전환체들은 스펙티노마이신을 포함하는 배지상에서 선택되었다. 미니프렙 DNA는 형질전환체들로부터 제조되었고, DNA는 CaMV35S-프로모터-특이성 순방향 프라이머를 사용하여 삽입체의 존재에 대해 체크되었다. 이러한 삽입체를 포함하는 클론은 pMON73983으로 명명되었다. 큰 DNA 프렙이 만들어졌고, 일련의 확인 절단들이 수행되었는데, 이는 BglII, EcoRI, PstI, EcoRI+BamHI, StuI+XhoI에 의한 절단을 포함한다. 이들은 정확한 클로닝을 확인시켜 주었다.
pMON73984는 아라비돕시스(Arabidopsis)에서의 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CspB 유사 단백질(서열번호: 2)의 구조적 발현을 위한 이성분 벡터이다. 바실러스 서브틸리스 CspB 유전자를 클로닝하기 위해서, 두개의 유전자-특이성 프라이머들인, MSA454 및 MSA455는 국립 건강연구원(NIH)의 소속기관인 국립 의학 도서관의 소속인 NCBI로부터의 CspB 서열 정보(Genbank # X59715)를 기초로 하여 디자인되었다. MSA454의 서열은 GCGCAGGCCTAGATGTACCATGTTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTG (서열번호: 88)이고, 이는 CspB의 번역 개시 부위에 어닐링되고, 5' 말단에 StuI 및 BglII 부위를 도입하는 반면, MSA455의 서열은 CGCGAATTCGGATCCTTATTACGCTTCTTTAGTAACGTTAGCAGCTTGTGG(서열번호: 89)이고, 이는 CspB의 마지막 코돈에 어닐링되고, 프라이머의 말단에 BamHI 및 EcoRI 부위를 도입한다. 역방향 프라이머 MSA455는 Genbank 유전자 서열의 3' 말단에 일치되도록 디자인되었다. PCR 반응은 프라이머들 MSA454 및 MSA455, 고적합도 Taq 폴리머라제 (BRL) 및 주형으로서 pMON57399를 사용하여 수행되었다. 이 주형은 유전자 CspB의 3' 말단이 GeneBank 서열의 것과 다르다. 증폭된 CspB DNA는 겔-전기영동에 의해 정제되었고, pCR-XL-TOPO 벡터(Invitrogen)에 라이게이션되었다. 라이게이션 반응은 제조자의 프로토콜에 의해서, 대장균 Top10 세포들(Invitrogen)내로 형질전환되었다. 4개의 형질전환체 콜로니들을 집어서, Qiagen Miniprep Kit를 사용하여 미니프렙 DNA를 제조하였다. 삽입체들은 M13-특이성 순방향 프라이머와 역방향 프라이머를 사용하여 서열화되었다. 정확한 서열의 클론은 pMON73982로 명명되었고, 다음의 서브클로닝을 위해서 사용되었다.
PMON73882 DNA StuI 및 BamHI로 절단되어, CspB 유전자 단편을 분리시켰다. pMON73980 DNA가 StuI 및 BamHI로 연속하여 절단되고 나서, 유전자 클린 II 키트에 의해 정제되었다. CspB 단편과 상기 정제된 벡터 pMON73980은 라이게이션되었고, 라이게이션 반응물은 대장균 DH10 B 세포들 내로 전기형질전환되었다. 형질전환체 들은 스펙티노마이신을 포함하는 배지상에서 선택되었다. 미니프렙 DNA는 형질전환체들로부터 제조되었고, DNA는 CaMV35S-프로모터-특이성 순방향 프라이머를 사용하여, 삽입체의 존재에 대하여 체크되었다. 이러한 삽입체를 포함하는 클론은 pMON73984로서 명명되었다. 큰 DNA 프렙이 만들어졌고, 일련의 확인 절단들이 수행되었는데, 이는 BglII, EcoRI, PstI, EcoRI+BamHI, StuI+XhoI에 의한 절단을 포함한다. 이들은 클로닝이 정확하게 진행되었다는 사실을 확인시켜 주었다.
형질전환을 통해서 콩과 식물들의 게놈내로 안정하게 통합된 상기 pMON 구조체들을 갖는 콩과 식물들이 생성되었다.
실시예
32
상기 실시예 10 및 11로부터의 DNA 구조체들로 형질전환된 옥수수 식물이 연구되었다.
온실
ㆍ가뭄 저항성에 대하여, 10개의 cspA 결과물들에 대한 실험과 10개의 cspB 결과물들에 대한 시험의 두가지 시험들이 수행되었다.
ㆍ각각의 결과물로부터 24개의 형질전환 유전자 양성과 24개의 형질전환 유전자 음성의 잡종 묘목들이 시험되었다(모든 종자는 분리된 잡종 이삭들로부터 유래된 것이다).
ㆍ시험은 온실 내의 벤치 위에서 수행되었다.
ㆍ시험과정에서의 처리는, 물을 주지 않는 것 및 식물을 포함하고 있는 각각 의 포트의 총 포트 무게를 모니터하는 것으로 이루어진다. 물을 충분히 준 포트들의 무게는 각각 약 1000그램이었고, 각각의 포트의 무게가 400그램이 될때까지 물을 주지 않고나서, 포트들의 무게를 나머지 처리기간 동안 유지하였다.
ㆍ처리하는 동안, 식물의 높이는 포트에 있는 흙의 표면으로부터 "가장 높은" 잎의 끝까지의 거리를 측정하므로써 결정되었다. 이들 측정으로부터, LER(잎의 신장율)은 각각 측정된 높이들을 비교하므로써 결정되었다.
ㆍ가뭄 동안에, 결과물들 중에서 형질전환 음성 식물들과 형질전환 양성 식물들의 사이에서 LER 비교가 이루어졌다.
ㆍ테스트된 10개의 결과물들 중의 3개에 있어서, cspA 형질전환 식물들은 처리 동안에 LER이 상당히(p<0.10) 향상되었다.
ㆍ테스트된 10개의 결과물들 중의 3개에 있어서, cspB 형질전환 식물들은 처리동안에 LER이 상당히(p<0.10) 향상되었다.
포장 효율(field efficacy)
ㆍ말기 영양성장 단계 동안의 가뭄 내성에 대하여, 16개의 cspB 결과물들(CA)에 대한 시험, 21개의 cspB 결과물들(KS)에 대한 시험, 및 14개의 cspA 결과물들에 대한 시험(HI)의 세가지 시험들이 수행되었다.
ㆍCA 및 HI 시험에 대하여, 형질전환 유전자의 존재에 따라 분리되는 ~34개의 식물들을 포함하는 열들(rows)에는 각각 6개와 4개의 복제물들이 존재했다. 분 리 열들은 분리 이삭들로부터 유도되었다.
ㆍKS 시험을 위하여, 6개의 복제물들을 갖는, 형질전환 및 비-형질전환 쌍으로 이루어진 열들로서 ~34개의 식물들을 포함하는 열들이 시험되었다.
ㆍ말기 영양성장 단계 동안에 대략 10일 동안 물을 주지 않는 처리를 한다(식물들을 생육가능하게 유지하기 위해서 필요한 소량만을 준다). 10일 기간이 경과한 후 마지막에, 수확할때까지 식물들에게 물을 충분히 준다.
ㆍ처리하는 동안에 LER, 엽록소(SPAD미터에 의해서), 및 광합성율을 포함하는 많은 표현형들이 측정되었다. 다음의 처리에 있어서, 추가로 화분 발산일 및 옥수수 수염 발생일, 및 낟알들/이삭, 낟알들을 갖는 이삭들, 낟알중량 및 수율과 같은 이삭 성분들을 포함하는 표현형들이 측정되었다.
ㆍ결과물들 사이에서 그리고 구조체들에 대해서, 형질전환 유전자 양성 식물들과 음성 식물들의 사이에서 표현형 비교가 이루어졌다.
ㆍ구조체로서 cspB를 사용한 CA 시험에 있어서, 가뭄 처리 동안 또는 그 후에 형질전환 유전자 양성 식물들(영양생장 형질들에 대한 모든 결과물들에 대해서 그리고 재생 형질들에 대한 "가장 좋은" 6개의 결과물들에 대해서)은 LER, 잎 온도, 및 낟알들/이삭에 대해서 상당히(p<0.10) 개량되었다.
ㆍCA 시험에 있어서, 가뭄 처리 동안 또는 그 후에 각각의 결과물들은 LER, 평균 이삭 길이, 낟알 덩어리/이삭, 기공 유통성, 및 옥수수 수염 발생일수에 대해서 상당히(p<0.10) 개량되었다.
ㆍ구조체로서 cspB를 사용한 KS 시험에 있어서, 가뭄 처리 동안 또는 그 후 에 형질전환 유전자 양성 식물들(영양생장 형질들에 대한 모든 결과물들에 대해서 그리고 재생 형질들에 대한 "가장 좋은" 6개의 결과물들에 대해서)은 LER, 이삭을 갖는 낟알/열, 낟알들/이삭, 낟알들/식물, 껍질 중량 및 수율에 대해서 상당히(p<0.10) 개량되었다.
ㆍKS 시험에 있어서, 각각의 결과물들은 LER, 광합성율, 기공 유통성, 이삭들/열, 및 낟알들/식물에 대해서 상당히(p<0.10) 개량되었다.
ㆍHI 시험에 있어서, 세가지 결과물들은 LER(엽록소 함량은 HI에서만 측정된 다른 표현형이다)에 대해서 상당히(p<0.10) 개량되었다.
CA 및 KS 결과들의 요약:
cspB -KS 부위에 대한 포장 효율 결과들의 요약
1. 현장 디자인, 지역 균일성, 이식 및 샘플링의 실행은 모두 유익한 데이터 세트를 얻을 수 있는 고품질 실험에 적합하였다.
2. 물-제한 처리는 모든 측정된 표현형들, 특히 LER, 엽록소, 및 광합성율에 대해 상기 처리의 영향들이 초래되는 방식으로 적용되었다.
3. 영양생장 표현형 및 재생 표현형에 대한 처리의 영향들은 통계적으로 객관적이기에 충분했고, 형질전환 유전자-매개 개량이 통계적으로 상당한 수준에서 관찰될 수 있도록 하기에 충분했다.
4. 하나 이상의 결과물들이 LER, 엽록소, 광합성율, 기공 유통성, 잎 온도, 화분 발산일 수, 옥수수 수염 발생일 수, 개화기 옥수수 수염 간격, 이삭들/플롯, 낟알들/이삭, 낟알들/식물, 껍질 중량, 및 측정된 수율에 대해서 형질전환 유전자를 포함하는 식물들에서 통계적으로 개량되었다.
5. 구조체의 통계적인 개량 수준이 건조 처리시의 LER, 이삭들/플롯, 낟알들/이삭, 낟알들/식물, 껍질 중량, 및 측정된 수율, 및 습윤 처리시의 LER에 대해 p<0.10로 관찰되었다.
표 20
cspB - CS 부위(폰트 변화)에 대한 포장 효율 결과들의 요약
1. 현장 디자인, 지역 균일성, 이식 및 샘플링의 실행은 모두 유익한 데이터 세트를 얻을 수 있는 고품질 실험에 적합하였다.
2. 물-제한 처리는 측정된 모든 영양생장 표현형들, 특히 LER, 엽록소, 및 광합성율에 대한 처리의 영향들이 초래되는 방법으로 적용되었으나, 모든 재생 표현형들에는 적용되지 않았다.
3. 관심의 대상이 되는 영양생장 표현형에 대한 처리의 영향들은 통계적으로 객관적이기에 충분했고, 형질전환 유전자-매개 개량이 통계적으로 상당한 수준에서 관찰될 수 있도록 하기에 충분했다.
4. 하나 이상의 결과물들이 LER, 엽록소, 광합성율, 기공 유통성, 잎 온도, 화분 발산일 수, 옥수수 수염 발생일 수, 개화기 옥수수 수염 간격, 이삭들/플롯, 평균 이삭 길이, 및 낟알중량/이삭에 대해서 형질전환 유전자를 포함하는 식물들에서 통계적으로 개량되었다.
5. 구조체의 통계적인 개량 수준이 건조 처리시의 LER, 잎 온도, 화분 발산일 수 및 습윤처리시의 ASI에 대해 관찰되었다.
표 21
이들 결과물들 중의 많은 수가 저온의 조건하에서의 저온 발아 효능 및 묘목 성장의 개량에 관해서 연속적으로 테스트되었고, 효과적인 것으로 판명되지는 못했다. 따라서, 이 프로모터에 의해 유도된 유전자들은 저온 조건하에서의 저온 발아 또는 묘목 성장의 개량을 위해 옥수수에서 작용하는 것 같지는 않지만, 같은 유전자들 또는 다른 저온 자극유도 단백질들로부터 유도되는 다른 프로모터들은 이들 표현형들을 개량하기 위해서 옥수수에서 작용할 수 있다.
도 1은 pMON 57396의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 2는 pMON 23450의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 3은 pMON 57397의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 4는 pMON 57398의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 5는 pMON 23450의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 6은 pMON 57399의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 7은 pMON 48421의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 8은 pMON 56609의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 9는 pMON 56610의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 10은 pMON 73607의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 11은 pMON 61322의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 12는 pMON 73608의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 13은 pMON 65154의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 14는 pMON 72472의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 15는 pENTR1의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 16은 지시된 유전자를 발현하는 식물 및 대조군의 성장 패턴을 나타내며, 도입된 유전자는 비생물적 스트레스 내성을 제공한다.
도 17은 pMON 42916의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 18은 pMON 73983의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
도 19는 pMON 73984의 플라스미드 개열지도를 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> Monsanto Technology
<120> Methods for enhancing abiotic stress tolerance in plants and
compositions thereof
<130> Docket number (38-21)51768C
<160> 95
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 70
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<300>
<301> Goldstein, et al
<302> Major cold shock protein of Escherichia coli
<303> Proceedings of the National Academy of Sciences (USA)
<304> 87
<305> 1
<306> 283-287
<307> 1990-01-01
<308> M30139
<309> 1993-10-20
<313> (1)..(70)
<400> 1
Met Ser Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Asn Val Thr Ser Leu
65 70
<210> 2
<211> 67
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<300>
<308> X59715
<309> 1996-03-29
<313> (1)..(67)
<400> 2
Met Leu Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
Lys Glu Ala
65
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Prosite motif PS00352
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa= 6 to 7 amino acids (any amino acid)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa=any amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (22)..(22)
<223> Xaa=any amino acid
<400> 3
Phe Tyr Gly Phe Ile Xaa Asp Glu Arg Leu Ile Val Met Phe Xaa His
1 5 10 15
Xaa Ser Thr Lys Arg Xaa Leu Ile Val Met Phe Tyr
20 25
<210> 4
<211> 545
<212> DNA
<213> Glycine max
<220>
<221> CDS
<222> (61)..(354)
<400> 4
attcggctcg aggaccttag aaagagaagg aaaaaaaaaa cttgtgtttc ttgggaagcc 60
atg agc acc acc gag agt caa aga tat aag ggc aca gtg aaa tgg ttc 108
Met Ser Thr Thr Glu Ser Gln Arg Tyr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe
1 5 10 15
aac gag gag aag ggt ttc ggt ttc ata act ccc gaa gat ggt ggc tct 156
Asn Glu Glu Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Glu Asp Gly Gly Ser
20 25 30
gat ctc ttc gtt cac tac agt gcg atc caa acc gac ggc ggc ttc cgc 204
Asp Leu Phe Val His Tyr Ser Ala Ile Gln Thr Asp Gly Gly Phe Arg
35 40 45
acc ttg tcg gag ggt cag tca gta gag ttc ctc gtc act cag gac gac 252
Thr Leu Ser Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe Leu Val Thr Gln Asp Asp
50 55 60
agc ggg cga gcc gcg gcc gtc aac gtg acg acc acc acg gtt aaa tct 300
Ser Gly Arg Ala Ala Ala Val Asn Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Ser
65 70 75 80
agt gac agc ggt aac ggg gaa aac tct ggt ggt gat gct gcc aat gtt 348
Ser Asp Ser Gly Asn Gly Glu Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Asn Val
85 90 95
gag aaa taagtgagaa tgaattattg gagtttcctg aattgcgagt atgatattta 404
Glu Lys
tattgatagt tggacaatat actagtccat tggtatttta tattttatta tattatctct 464
ggttattggc atttggttcc aaacttgtaa tacatttatc atgtgtttaa cgtggttatg 524
tagtaagttg ttggatgtgt c 545
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 5
Met Ser Thr Thr Glu Ser Gln Arg Tyr Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe
1 5 10 15
Asn Glu Glu Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Glu Asp Gly Gly Ser
20 25 30
Asp Leu Phe Val His Tyr Ser Ala Ile Gln Thr Asp Gly Gly Phe Arg
35 40 45
Thr Leu Ser Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe Leu Val Thr Gln Asp Asp
50 55 60
Ser Gly Arg Ala Ala Ala Val Asn Val Thr Thr Thr Thr Val Lys Ser
65 70 75 80
Ser Asp Ser Gly Asn Gly Glu Asn Ser Gly Gly Asp Ala Ala Asn Val
85 90 95
Glu Lys
<210> 6
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial sequence somewhat similar to E. coli CspA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(252)
<400> 6
atg gcc ggt aaa atg act ggt atc gta aaa tgg ttc aac gct gac aaa 48
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
ggc ttc ggc ttc atc act cct gac gat ggc tct aaa gat gtg ttc gta 96
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
cac ttc tct gct atc cag aac gat ggt tac aaa tct ctg gac gaa ggt 144
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
cag aaa gtg tcc ttc acc atc gaa agc ggc gct aaa ggc ccg gca gct 192
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
ggt aac gta acc agc ctg aat tct cga gcg att aca agg atg atg ata 240
Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile
65 70 75 80
agt aag tcg acc tag 255
Ser Lys Ser Thr
<210> 7
<211> 84
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile
65 70 75 80
Ser Lys Ser Thr
<210> 8
<211> 246
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Somewhat similar to B. subtilis CspB
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(243)
<400> 8
atg gta gaa ggt aaa gta aaa tgg ttc aac tct gaa aaa ggt ttc gga 48
Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
ttc atc gaa gta gaa ggt caa gac gat gta ttc gtt cat ttc tct gct 96
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
att caa ggc gaa ggc ttc aaa act tta gaa gaa ggc caa gct gtt tct 144
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
ttt gaa atc gtt gaa gga aac cgc gga cca caa gct gct aac gtt act 192
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
aaa gaa gcg aat tct cga gcg att aca agg atg atg ata agt aag tcg 240
Lys Glu Ala Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile Ser Lys Ser
65 70 75 80
acc tag 246
Thr
<210> 9
<211> 81
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
Lys Glu Ala Asn Ser Arg Ala Ile Thr Arg Met Met Ile Ser Lys Ser
65 70 75 80
Thr
<210> 10
<211> 877
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (528)..(743)
<300>
<308> L28429
<309> 1994-05-04
<313> (1)..(877)
<400> 10
agctttaata tagctcatga aaggtaaaca ttggcagctg aagggccacg cagaccattt 60
atccggcaaa attccacgcg taatccggtg gtaatttctt ctgcatcgcg gagattgagc 120
gctgaaacat gaagctggac atcgatacga ccatcggatg gggtgataag acccttgccg 180
cttttgccgt caaaggtttt gacaattcct gtcattttac gggacaaaaa aattccttaa 240
tactgataac ttggcgcact atacacacgt tcctgaagaa agctatagtt ttttgatggg 300
gttgaagatg gctggatgtc taaaataaac attgcttcat atgttcaact atgcgttaat 360
gattgcgtcg gtttgaagaa cagacgatat acgaagtagt ttactaaagc agttctcatt 420
tcaggtgtta ttcacttatt ccttctttga gtctctccaa ttaagtacga agtcgtttct 480
gttatgcaaa ccatttatgc cgaaaggctc aagttaagga atgtaga atg tca aat 536
Met Ser Asn
1
aaa atg act ggt tta gta aaa tgg ttt aac gct gat aaa ggt ttc ggc 584
Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly
5 10 15
ttt att tct cct gtt gat ggt agt aaa gat gtg ttt gtg cat ttt tct 632
Phe Ile Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His Phe Ser
20 25 30 35
gcg att cag aat gat aat tat cga acc tta ttt gaa ggt caa aag gtt 680
Ala Ile Gln Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu Gly Gln Lys Val
40 45 50
acc ttc tct ata gag agt ggt gct aaa ggt cct gca gca gca aat gtc 728
Thr Phe Ser Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val
55 60 65
atc att act gat taa aattcatcgc tcgtctgtat acgataacga agaaggctga 783
Ile Ile Thr Asp
70
tgcctgagta gagatacgga cagagtagtg aatattggat ctctttaata aaaagtaagg 843
aggtccaata catgaaacaa tggctagcat attt 877
<210> 11
<211> 71
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 11
Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Val Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Asn Tyr Arg Thr Leu Phe Glu Gly
35 40 45
Gln Lys Val Thr Phe Ser Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Ala Asn Val Ile Ile Thr Asp
65 70
<210> 12
<211> 1601
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (243)..(452)
<300>
<308> D28496
<309> 1994-02-05
<313> (1)..(1601)
<400> 12
gatcgagaca tgtttaaaaa tggcttgcca taattaacgt tgtatgtgat aacagatttc 60
gggttaaacg aggtacagtt ctgtttatgt gtggcatttt cagtaaagaa gtcctgagta 120
aacacgttga cgttgaatac cgcttctctg ccgagcctta tattggtgcc tcatgcagta 180
atgtgtcagt tttatctatg ttatgcctgc gggcgaagaa aacaatctaa ggaatttttc 240
aa atg gca aag att aaa ggt cag gtt aag tgg ttc aac gag tct aaa 287
Met Ala Lys Ile Lys Gly Gln Val Lys Trp Phe Asn Glu Ser Lys
1 5 10 15
ggt ttt ggc ttc att act ccg gct gat ggc agc aaa gat gtg ttc gta 335
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Ala Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
cac ttc tcc gct atc cag ggt aat ggc ttc aaa act ctg gct gaa ggt 383
His Phe Ser Ala Ile Gln Gly Asn Gly Phe Lys Thr Leu Ala Glu Gly
35 40 45
cag aac gtt gag ttc gaa att cag gac ggc cag aaa ggt ccg gca gct 431
Gln Asn Val Glu Phe Glu Ile Gln Asp Gly Gln Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
gtt aac gta aca gct atc tga tcgaatccac tgatctgaag tgtgaatacg 482
Val Asn Val Thr Ala Ile
65
cttcaatctc gctataaagc ctcgtcgaat gcgaggcttt ttactatgct ttatcttcgc 542
tcctggcgtt cggatatttg cccgccgcgt gattcgcgtt acacttgcgg cctttagtat 602
cctgccggag ttgtcatgtc tttttcctgt ccactttgcc atcagcctct ttcgcgtgaa 662
aaaaacagct atatctgtcc ccagcgacat cagtttgata tggcgaaaga agggtatgtc 722
aatctgctgc ccgttcagca taaacggtct cgtgatccgg gcgacagcgc ggaaatgatg 782
caagcacgcc gcgcattctt agatgccgga cattatcagc cgctgcgtga tgcaattgtc 842
gcccaactga gggaacggct tgatgataag gccacggcgg tgctggatat tggctgtggt 902
gaagggtatt acacacacgc atttgccgat gcgttgcccg aaatcaccac gtttggtctg 962
gatgtttcga aggtagcgat aaaagcggcg gcgaaacgct atccgcaggt cactttttgt 1022
gtcgcttcca gccaccgttt gccgttttcc gataccagta tggacgccat aatacgtatt 1082
tacgcgccgt gtaaagcaga agaattagca cgagtagtga agcccggcgg ctgggtcatt 1142
actgccacgc cgggaccgcg acatttgatg gagctgaagg ggctgattta caatgaagta 1202
catcttcatg cacctcatgc agaacaactg gaaggtttta cattacagca gagtgcggag 1262
ttgtgttatc cgatgcgtct tcgcggtgat gaagccgtcg cattattgca gatgacgccg 1322
tttgcctggc gtgcgaagcc agaagtctgg caaacactgg cagcaaaaga agtgttcgac 1382
tgccagacgg actttaatat tcacctctgg cagcgttctt attaaccgtg gaagtgcgtc 1442
cagaggatct ggacgccgat gccgatcagc accagcccgc cgagaatttc cgcttttttc 1502
ccaataattg agccgataaa gcgaccaacc atcatcccta atgttgacat aatcaaggtt 1562
gcacaaccaa tggccaatgc ggtcgcgata atgttgacc 1601
<210> 13
<211> 69
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
Met Ala Lys Ile Lys Gly Gln Val Lys Trp Phe Asn Glu Ser Lys Gly
1 5 10 15
Phe Gly Phe Ile Thr Pro Ala Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val His
20 25 30
Phe Ser Ala Ile Gln Gly Asn Gly Phe Lys Thr Leu Ala Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Val Glu Phe Glu Ile Gln Asp Gly Gln Lys Gly Pro Ala Ala Val
50 55 60
Asn Val Thr Ala Ile
65
<210> 14
<211> 351
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (74)..(298)
<300>
<308> P24245
<309> 1992-03-01
<313> (1)..(351)
<400> 14
ttttgaacag ccccctctct gaccccggtt tattccatct tacttgtata agatttgcga 60
aggatgtcga agc atg gaa aag ggt act gtt aag tgg ttc aac aat gcc 109
Met Glu Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asn Ala
1 5 10
aaa ggg ttt ggt ttc atc tgc cct gaa ggc ggc ggc gaa gat att ttc 157
Lys Gly Phe Gly Phe Ile Cys Pro Glu Gly Gly Gly Glu Asp Ile Phe
15 20 25
gct cat tat tcc acc att cag atg gat ggt tac aga acg cta aaa gct 205
Ala His Tyr Ser Thr Ile Gln Met Asp Gly Tyr Arg Thr Leu Lys Ala
30 35 40
gga caa tcc gtt cag ttt gat gtc cac cag ggg cca aaa ggc aat cac 253
Gly Gln Ser Val Gln Phe Asp Val His Gln Gly Pro Lys Gly Asn His
45 50 55 60
gcc agt gtt att gtg ccc gtc gaa gta gaa gcg gca gtc gca tag 298
Ala Ser Val Ile Val Pro Val Glu Val Glu Ala Ala Val Ala
65 70
ctcttctgtc tcattgtgta catcctaaag gcaaaatgcc agcccgatcg gct 351
<210> 15
<211> 74
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 15
Met Glu Lys Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asn Ala Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Cys Pro Glu Gly Gly Gly Glu Asp Ile Phe Ala His Tyr Ser
20 25 30
Thr Ile Gln Met Asp Gly Tyr Arg Thr Leu Lys Ala Gly Gln Ser Val
35 40 45
Gln Phe Asp Val His Gln Gly Pro Lys Gly Asn His Ala Ser Val Ile
50 55 60
Val Pro Val Glu Val Glu Ala Ala Val Ala
65 70
<210> 16
<211> 301
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (62)..(259)
<300>
<308> P39819
<309> 1995-02-01
<313> (1)..(301)
<400> 16
tcaggaacgt gtgtatagtg cgccaagtta tcagtattaa ggaatttttt tgtcccgtaa 60
a atg aca gga att gtc aaa acc ttt gac ggc aaa agc ggc aag ggt ctt 109
Met Thr Gly Ile Val Lys Thr Phe Asp Gly Lys Ser Gly Lys Gly Leu
1 5 10 15
atc acc cca tcc gat ggt cgt atc gat gtc cag ctt cat gtt tca gcg 157
Ile Thr Pro Ser Asp Gly Arg Ile Asp Val Gln Leu His Val Ser Ala
20 25 30
ctc aat ctc cgc gat gca gaa gaa att acc acc gga tta cgc gtg gaa 205
Leu Asn Leu Arg Asp Ala Glu Glu Ile Thr Thr Gly Leu Arg Val Glu
35 40 45
ttt tgc cgg ata aat ggt ctg cgt ggc cct tca gct gcc aat gtt tac 253
Phe Cys Arg Ile Asn Gly Leu Arg Gly Pro Ser Ala Ala Asn Val Tyr
50 55 60
ctt tca tgagctatat taaagcttta atttcaggcc ccatcggatc ac 301
Leu Ser
65
<210> 17
<211> 66
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 17
Met Thr Gly Ile Val Lys Thr Phe Asp Gly Lys Ser Gly Lys Gly Leu
1 5 10 15
Ile Thr Pro Ser Asp Gly Arg Ile Asp Val Gln Leu His Val Ser Ala
20 25 30
Leu Asn Leu Arg Asp Ala Glu Glu Ile Thr Thr Gly Leu Arg Val Glu
35 40 45
Phe Cys Arg Ile Asn Gly Leu Arg Gly Pro Ser Ala Ala Asn Val Tyr
50 55 60
Leu Ser
65
<210> 18
<211> 994
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS
<222> (560)..(772)
<300>
<308> D63344
<309> 1999-02-13
<313> (1)..(994)
<400> 18
aaatgtatga tgtgactatt cactatccaa taaaccagtc agcttaaaca agcacgtcat 60
attaagagag ataaacattt gccgctgttg gtcctcgcag gccatttacg cggcaaaatt 120
ccacacgtaa tcctggtata agcacttctg cgtcgcgggg agtgaatgcg gaaatatgga 180
cctgaacttc tttacgaccg tcggagggga taatgaatcc tttgccgctt ttgcgatcaa 240
aggttttgac aattcctgtc attttacggg acaaacaaat tccttactga aaatactgcg 300
ctgcactata cggggttaat aaaataaagc cagcgatatt taagaccgcc ggacggctaa 360
aataaaattt gcttaatctc aattatcatg cgttaatagc tgcgtcggtt tgaaagacag 420
acagcataca aagtagttta ctaaagcagt tctcattatc aggcattatc cccttctttt 480
gagtctctct cctgaacact aagtagtttc tgtattaaag ccctgtttgc cgaaaggccc 540
aaaatgaagg aagtaaaat atg tct aat aaa atg act ggt tta gta aaa tgg 592
Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp
1 5 10
ttt aac gca gat aaa ggt ttt ggc ttt atc act cct gat gat ggc agc 640
Phe Asn Ala Asp Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser
15 20 25
aaa gac gtt ttc gtc cat ttc acc gcc atc cag agc aat gaa ttc cgc 688
Lys Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala Ile Gln Ser Asn Glu Phe Arg
30 35 40
acg ctg aac gaa aat cag aaa gtt gaa ttt tct att gag cag ggg caa 736
Thr Leu Asn Glu Asn Gln Lys Val Glu Phe Ser Ile Glu Gln Gly Gln
45 50 55
cgt ggc ccc gcg gca gcg aac gtt gtt acg ctc taa ggttgccatt 782
Arg Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val Val Thr Leu
60 65 70
attactcaac atctccattt ccgctgtcca tgttgtcatg gttcacagta ccgcacatcg 842
gcattcgatg tgacggagcg aaaccctttg gcgctaagtg tattttttgt aaatcgacga 902
tgatcacctt tgataacgtc gcgctgcaaa tacgcactga ccatgcgcgc tggatttcac 962
aaataatatc aggctcctcg tggagctttt tt 994
<210> 19
<211> 70
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 19
Met Ser Asn Lys Met Thr Gly Leu Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Thr Ala Ile Gln Ser Asn Glu Phe Arg Thr Leu Asn Glu Asn
35 40 45
Gln Lys Val Glu Phe Ser Ile Glu Gln Gly Gln Arg Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Ala Asn Val Val Thr Leu
65 70
<210> 20
<211> 351
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<220>
<221> CDS
<222> (125)..(334)
<300>
<308> AAK90623
<309> 2001-12-18
<313> (1)..(351)
<400> 20
catcgaccat tgcttgtgac gtcgttaccg gaacctcgtg ttccccgtcg gatttcctct 60
caaaaatcga tctaatcccg caaggtatcg cgggaaccac aacgattcta aaaaggagat 120
cgtt atg aac act ggt act gta aag tgg ttt aac gcc acc aag ggc ttc 169
Met Asn Thr Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Thr Lys Gly Phe
1 5 10 15
ggc ttc att cag cct gac aac ggc ggc acg gac gtt ttc gtt cac att 217
Gly Phe Ile Gln Pro Asp Asn Gly Gly Thr Asp Val Phe Val His Ile
20 25 30
tct gct gtt gag cgc gct ggc atg cgt tcg ctg aac gac ggc cag aag 265
Ser Ala Val Glu Arg Ala Gly Met Arg Ser Leu Asn Asp Gly Gln Lys
35 40 45
atc agc tat gag atc gtt cag gac cgc cgg tcc gga aaa agc tct gcc 313
Ile Ser Tyr Glu Ile Val Gln Asp Arg Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ala
50 55 60
gat aac ctt cag gca gct tga tattcgtcat tttggcc 351
Asp Asn Leu Gln Ala Ala
65
<210> 21
<211> 69
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 21
Met Asn Thr Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Thr Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Gln Pro Asp Asn Gly Gly Thr Asp Val Phe Val His Ile Ser
20 25 30
Ala Val Glu Arg Ala Gly Met Arg Ser Leu Asn Asp Gly Gln Lys Ile
35 40 45
Ser Tyr Glu Ile Val Gln Asp Arg Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ala Asp
50 55 60
Asn Leu Gln Ala Ala
65
<210> 22
<211> 301
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<220>
<221> CDS
<222> (59)..(262)
<300>
<308> AAK89225
<309> 2001-12-18
<313> (1)..(301)
<400> 22
cgtaccgatc aatgatcggt attgcgttga ggtgcactca gcaatcaacg aggacaag 58
atg gca act ggc act gta aaa ttc ttc gct cag gac aag ggc ttt ggc 106
Met Ala Thr Gly Thr Val Lys Phe Phe Ala Gln Asp Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
ttc att acc cct gac aat ggc ggt cct gac gta ttc gtt cac atc tcg 154
Phe Ile Thr Pro Asp Asn Gly Gly Pro Asp Val Phe Val His Ile Ser
20 25 30
gca gtc ggt ttc ggc ggc tct ctt cag gat ggt cag aag gtg agc tac 202
Ala Val Gly Phe Gly Gly Ser Leu Gln Asp Gly Gln Lys Val Ser Tyr
35 40 45
gag ttg gga caa gac cgc aag acc ggt aaa tcg aaa gcc gag aac gtc 250
Glu Leu Gly Gln Asp Arg Lys Thr Gly Lys Ser Lys Ala Glu Asn Val
50 55 60
act ctc ctt tga tggcagcgcc gcggcccaac gcacgatagc gcgtgagca 301
Thr Leu Leu
65
<210> 23
<211> 67
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 23
Met Ala Thr Gly Thr Val Lys Phe Phe Ala Gln Asp Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Thr Pro Asp Asn Gly Gly Pro Asp Val Phe Val His Ile Ser
20 25 30
Ala Val Gly Phe Gly Gly Ser Leu Gln Asp Gly Gln Lys Val Ser Tyr
35 40 45
Glu Leu Gly Gln Asp Arg Lys Thr Gly Lys Ser Lys Ala Glu Asn Val
50 55 60
Thr Leu Leu
65
<210> 24
<211> 251
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<220>
<221> CDS
<222> (27)..(242)
<300>
<308> AAK87945
<309> 2001-12-18
<313> (1)..(251)
<400> 24
cgggcagagc gaaaaggacc tgatgc atg gcc gaa act ggc acc gta aaa ttc 53
Met Ala Glu Thr Gly Thr Val Lys Phe
1 5
ttt aat acc gac aaa ggc ttc ggc ttc atc aag cca gac aat ggt ggc 101
Phe Asn Thr Asp Lys Gly Phe Gly Phe Ile Lys Pro Asp Asn Gly Gly
10 15 20 25
gct gat atc ttt gtt cac atc tct gcc gta cag gct tct ggc ctg tcc 149
Ala Asp Ile Phe Val His Ile Ser Ala Val Gln Ala Ser Gly Leu Ser
30 35 40
gga ctt tca gaa aat cag aaa gtg agc ttc gac acg gaa ccg gat cgt 197
Gly Leu Ser Glu Asn Gln Lys Val Ser Phe Asp Thr Glu Pro Asp Arg
45 50 55
cgc ggc aag ggc ccg aag gca gtc aat ctg cag att gct ggc tga 242
Arg Gly Lys Gly Pro Lys Ala Val Asn Leu Gln Ile Ala Gly
60 65 70
ccctaaaac 251
<210> 25
<211> 71
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 25
Met Ala Glu Thr Gly Thr Val Lys Phe Phe Asn Thr Asp Lys Gly Phe
1 5 10 15
Gly Phe Ile Lys Pro Asp Asn Gly Gly Ala Asp Ile Phe Val His Ile
20 25 30
Ser Ala Val Gln Ala Ser Gly Leu Ser Gly Leu Ser Glu Asn Gln Lys
35 40 45
Val Ser Phe Asp Thr Glu Pro Asp Arg Arg Gly Lys Gly Pro Lys Ala
50 55 60
Val Asn Leu Gln Ile Ala Gly
65 70
<210> 26
<211> 651
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<220>
<221> CDS
<222> (297)..(605)
<300>
<308> AAK87573
<309> 2001-12-18
<313> (1)..(651)
<400> 26
gcgcgtaatc gaggggttgg caggatatgg ctgataggat gtcatcgaaa acgatagtcg 60
atgtcgagga cctttcgggc gatgccgtcg acctgaccga aatcaccggc gtcgtgaaat 120
ggttcgacgt cgccaagggt ttcggcttca tcgtgcccga taacggtaca caggatgtgc 180
tgctgcacgt ctcgtgcctg cgccgcgacg gctaccagac catccttgaa ggcacgcgca 240
tcgtcgccct catccagcgg cgcgaccgcg gtttccaggt tttccgcatc ctgtcc atg 299
Met
1
gat cag tcg acc gcc gtt cac ccg tcg cag ctg ccg ccg gtg cgc acc 347
Asp Gln Ser Thr Ala Val His Pro Ser Gln Leu Pro Pro Val Arg Thr
5 10 15
cat gtg cag gtg acg ccg cat agc ggg ctt gag cgt gcc atc gtc aag 395
His Val Gln Val Thr Pro His Ser Gly Leu Glu Arg Ala Ile Val Lys
20 25 30
tgg ttc aac cgc acc aag ggt ttc ggt ttc ctg acg cgt ggc gaa gga 443
Trp Phe Asn Arg Thr Lys Gly Phe Gly Phe Leu Thr Arg Gly Glu Gly
35 40 45
acg gaa gat att ttc gtg cat atg gaa acg ctg cgc cgt ttc ggc ctg 491
Thr Glu Asp Ile Phe Val His Met Glu Thr Leu Arg Arg Phe Gly Leu
50 55 60 65
acg gaa ctg cgc ccc ggc cag gtg gtg ctc gtg cgt tac ggc gat ggc 539
Thr Glu Leu Arg Pro Gly Gln Val Val Leu Val Arg Tyr Gly Asp Gly
70 75 80
gac aag ggc ctg atg gca gcg gaa atc cat ccc gat aac ccg gtt tcc 587
Asp Lys Gly Leu Met Ala Ala Glu Ile His Pro Asp Asn Pro Val Ser
85 90 95
atc ggg atg tcg cat tga tgtccggcct gcgtcccatg ctgaaaggcg 635
Ile Gly Met Ser His
100
ccgtcatggc gcttgt 651
<210> 27
<211> 102
<212> PRT
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 27
Met Asp Gln Ser Thr Ala Val His Pro Ser Gln Leu Pro Pro Val Arg
1 5 10 15
Thr His Val Gln Val Thr Pro His Ser Gly Leu Glu Arg Ala Ile Val
20 25 30
Lys Trp Phe Asn Arg Thr Lys Gly Phe Gly Phe Leu Thr Arg Gly Glu
35 40 45
Gly Thr Glu Asp Ile Phe Val His Met Glu Thr Leu Arg Arg Phe Gly
50 55 60
Leu Thr Glu Leu Arg Pro Gly Gln Val Val Leu Val Arg Tyr Gly Asp
65 70 75 80
Gly Asp Lys Gly Leu Met Ala Ala Glu Ile His Pro Asp Asn Pro Val
85 90 95
Ser Ile Gly Met Ser His
100
<210> 28
<211> 301
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803
<220>
<221> CDS
<222> (22)..(273)
<400> 28
ctctggtttt ggagctaatt t atg tcc att tat gtc ggg aac ctt tct tac 51
Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu Ser Tyr
1 5 10
caa gcc acc gaa gat gac gtt ttg act gtc ttc tcc gag tat ggc act 99
Gln Ala Thr Glu Asp Asp Val Leu Thr Val Phe Ser Glu Tyr Gly Thr
15 20 25
gtt aag cgg gtt caa ctt ccc act gat cgg gag acc ggt cgt atg cgg 147
Val Lys Arg Val Gln Leu Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg
30 35 40
ggt ttt ggt ttc gtt gaa atg tct tcc gat aag gaa gaa gat gcc gcc 195
Gly Phe Gly Phe Val Glu Met Ser Ser Asp Lys Glu Glu Asp Ala Ala
45 50 55
att gaa gct ctg gat gga gcc gaa tgg atg ggg cgg gat ctc aaa gtt 243
Ile Glu Ala Leu Asp Gly Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val
60 65 70
aat aaa gca aga ccg aga acc cct cgt taa gtttttgcct aattacctga 293
Asn Lys Ala Arg Pro Arg Thr Pro Arg
75 80
atttaaga 301
<210> 29
<211> 83
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803
<400> 29
Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu Ser Tyr Gln Ala Thr Glu Asp Asp
1 5 10 15
Val Leu Thr Val Phe Ser Glu Tyr Gly Thr Val Lys Arg Val Gln Leu
20 25 30
Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu
35 40 45
Met Ser Ser Asp Lys Glu Glu Asp Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly
50 55 60
Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val Asn Lys Ala Arg Pro Arg
65 70 75 80
Thr Pro Arg
<210> 30
<211> 401
<212> DNA
<213> Synechocystis PCC6803
<220>
<221> CDS
<222> (91)..(396)
<400> 30
tctagtatta acggtttttc gcgtttttcc attgacaggc atttctccga aatcaccctc 60
tacatatccc tcagtttttg gagaaaatcc atg tca att tat gta ggc aac ctg 114
Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu
1 5
tcc tat gac gtt tca gaa gcc gat tta acc gcg gtt ttt gct gaa tac 162
Ser Tyr Asp Val Ser Glu Ala Asp Leu Thr Ala Val Phe Ala Glu Tyr
10 15 20
ggt tcc gta aag cgg gtt cag ctc ccc acc gac cgg gaa act ggt cgc 210
Gly Ser Val Lys Arg Val Gln Leu Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg
25 30 35 40
atg cgg ggc ttc ggt ttt gtc gag cta gaa gct gac gcc gaa gaa acg 258
Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu Leu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Thr
45 50 55
gct gcc att gaa gcc cta gac ggt gca gaa tgg atg ggt cgt gac ctt 306
Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu
60 65 70
aaa gtt aac aaa gcc aag ccc cgg gaa aat cgc agt ggc ggt ggt tcc 354
Lys Val Asn Lys Ala Lys Pro Arg Glu Asn Arg Ser Gly Gly Gly Ser
75 80 85
ttt ggt ggc ggt cgt aaa agc tat ggt ggt agc cgc tac tag ggctt 401
Phe Gly Gly Gly Arg Lys Ser Tyr Gly Gly Ser Arg Tyr
90 95 100
<210> 31
<211> 101
<212> PRT
<213> Synechocystis PCC6803
<400> 31
Met Ser Ile Tyr Val Gly Asn Leu Ser Tyr Asp Val Ser Glu Ala Asp
1 5 10 15
Leu Thr Ala Val Phe Ala Glu Tyr Gly Ser Val Lys Arg Val Gln Leu
20 25 30
Pro Thr Asp Arg Glu Thr Gly Arg Met Arg Gly Phe Gly Phe Val Glu
35 40 45
Leu Glu Ala Asp Ala Glu Glu Thr Ala Ala Ile Glu Ala Leu Asp Gly
50 55 60
Ala Glu Trp Met Gly Arg Asp Leu Lys Val Asn Lys Ala Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Asn Arg Ser Gly Gly Gly Ser Phe Gly Gly Gly Arg Lys Ser Tyr
85 90 95
Gly Gly Ser Arg Tyr
100
<210> 32
<211> 951
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> CDS
<222> (46)..(654)
<400> 32
aaagatttag agaaaaaagt gagttattaa gagattccaa tcaaa atg agc gga gac 57
Met Ser Gly Asp
1
aac ggc ggt ggt gag agg cgc aaa ggc tcc gtc aag tgg ttt gat acc 105
Asn Gly Gly Gly Glu Arg Arg Lys Gly Ser Val Lys Trp Phe Asp Thr
5 10 15 20
cag aag ggt ttc ggc ttc atc act cct gac gac ggt ggc gac gat ctc 153
Gln Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Gly Asp Asp Leu
25 30 35
ttc gtt cac cag tcc tcc atc aga tct gag ggt ttc cgt agc ctc gct 201
Phe Val His Gln Ser Ser Ile Arg Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala
40 45 50
gcc gaa gaa gcc gta gag ttc gag gtt gag atc gac aac aac aac cgt 249
Ala Glu Glu Ala Val Glu Phe Glu Val Glu Ile Asp Asn Asn Asn Arg
55 60 65
ccc aag gcc atc gat gtt tct gga ccc gac ggc gct ccc gtc caa gga 297
Pro Lys Ala Ile Asp Val Ser Gly Pro Asp Gly Ala Pro Val Gln Gly
70 75 80
aac agc ggt ggt ggt tca tct ggc gga cgc ggc ggt ttc ggt gga gga 345
Asn Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly
85 90 95 100
aga gga ggt gga cgc gga tct gga ggt gga tac ggc ggt ggc ggt ggt 393
Arg Gly Gly Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
105 110 115
gga tac gga gga aga gga ggt ggt ggt cga gga ggc agc gac tgc tac 441
Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Ser Asp Cys Tyr
120 125 130
aag tgt ggt gag ccc ggt cac atg gcg aga gac tgt tct gaa ggc ggt 489
Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Ser Glu Gly Gly
135 140 145
gga ggt tac gga gga ggc ggc ggt ggc tac gga ggt gga ggc gga tac 537
Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr
150 155 160
ggc gga gga ggt ggt ggt tac gga ggt ggt ggc cgt gga ggt ggt ggc 585
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly
165 170 175 180
ggc ggg gga agc tgc tac agc tgt ggc gag tcg gga cat ttc gcc agg 633
Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala Arg
185 190 195
gat tgc acc agc ggt gga cgt taaaaccaac gccggttacg cggtggagaa 684
Asp Cys Thr Ser Gly Gly Arg
200
gagtgagttg gttatctcac aagtgatcgg ttctttctcc cgccgccttc tatctctcta 744
ttatccactt tttgcttatt atgatggatc tctatctttg ttagttggtt ttttcttgat 804
ggtttcggat taggactctt cttttggttt tgctacttat ggttggtttt atttctggta 864
cttgtgatat gggtgaaatg ctctacttgt tgctctgttt caagtgttca taatatgcga 924
acaaatattc tgggttttgt ttcagtc 951
<210> 33
<211> 203
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 33
Met Ser Gly Asp Asn Gly Gly Gly Glu Arg Arg Lys Gly Ser Val Lys
1 5 10 15
Trp Phe Asp Thr Gln Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly
20 25 30
Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Arg Ser Glu Gly Phe
35 40 45
Arg Ser Leu Ala Ala Glu Glu Ala Val Glu Phe Glu Val Glu Ile Asp
50 55 60
Asn Asn Asn Arg Pro Lys Ala Ile Asp Val Ser Gly Pro Asp Gly Ala
65 70 75 80
Pro Val Gln Gly Asn Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg Gly Gly
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly
115 120 125
Ser Asp Cys Tyr Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys
130 135 140
Ser Glu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly
180 185 190
His Phe Ala Arg Asp Cys Thr Ser Gly Gly Arg
195 200
<210> 34
<211> 950
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<220>
<221> CDS
<222> (58)..(618)
<400> 34
cccacgcgtc cggagactta tttactttag gaattttcta gaaccttctc gaaggca 57
atg gct gag gcg acc agc acc gag aga tcc act ggc aca gtc aaa tgg 105
Met Ala Glu Ala Thr Ser Thr Glu Arg Ser Thr Gly Thr Val Lys Trp
1 5 10 15
ttc agc gcc cag aaa tgt ttt ggt ttc ata gct ccc gac gac gga ggc 153
Phe Ser Ala Gln Lys Cys Phe Gly Phe Ile Ala Pro Asp Asp Gly Gly
20 25 30
gac gac ctt ttc gtc cac caa acc tct att ctt tcc caa ggc ttt cgt 201
Asp Asp Leu Phe Val His Gln Thr Ser Ile Leu Ser Gln Gly Phe Arg
35 40 45
aca ctc tcc gat aac caa ccc gtc gag ttc ttc gtt gat gtc ggt gaa 249
Thr Leu Ser Asp Asn Gln Pro Val Glu Phe Phe Val Asp Val Gly Glu
50 55 60
gat ggc cga gct aag gcc gtt gat gta act cct atg cct cga cct cgc 297
Asp Gly Arg Ala Lys Ala Val Asp Val Thr Pro Met Pro Arg Pro Arg
65 70 75 80
cgt cct tcc cgc ggc ggt gga aga gga gga tat ttt ggc ggc aga ggt 345
Arg Pro Ser Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Gly Arg Gly
85 90 95
aga gga ggt ggt ggt tac agg aga gga ggt tat ggt ggt ggc ggt ggc 393
Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
ggt ggc gga ggt agt ggc gct tgt tat aat tgt ggg agg acg ggg cat 441
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Cys Tyr Asn Cys Gly Arg Thr Gly His
115 120 125
ata gcc agg gat tgt tat caa ggt ggt gga agt gga agt acg aga tac 489
Ile Ala Arg Asp Cys Tyr Gln Gly Gly Gly Ser Gly Ser Thr Arg Tyr
130 135 140
agt ggc ggc cgt gga gat ggt ggt gga aat aga aga tac ggt ggc gat 537
Ser Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Asn Arg Arg Tyr Gly Gly Asp
145 150 155 160
agc ggt gat gga cga gga gct ggg gga cga tgt ttt aat tgt gga gat 585
Ser Gly Asp Gly Arg Gly Ala Gly Gly Arg Cys Phe Asn Cys Gly Asp
165 170 175
gaa ggc cat ttt gca agg gat tgc cct aac aaa taattcagaa aacaaaaccg 638
Glu Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro Asn Lys
180 185
gacatttcct ataatatttt gtgagtataa gtttttcttt tacggtgttt tggaaagggg 698
tttatcagca aaagaagaag aaaccggaaa gttgtctatt ctttccgatc aggcttactt 758
ttcccgattc cgattgatct ggtaacatct ttaaaaaaaa ggtccattgt tttgtataat 818
gtgttgtaat tgttgttatt ctcttaattc ttatcgattc ttctttcttt aatcctctat 878
tcttagtctt tgcattgaca gtatgaacgg gcaatcattt gtcttccttg aagcagattt 938
cttttatttt tc 950
<210> 35
<211> 187
<212> PRT
<213> Gossypium hirsutum
<400> 35
Met Ala Glu Ala Thr Ser Thr Glu Arg Ser Thr Gly Thr Val Lys Trp
1 5 10 15
Phe Ser Ala Gln Lys Cys Phe Gly Phe Ile Ala Pro Asp Asp Gly Gly
20 25 30
Asp Asp Leu Phe Val His Gln Thr Ser Ile Leu Ser Gln Gly Phe Arg
35 40 45
Thr Leu Ser Asp Asn Gln Pro Val Glu Phe Phe Val Asp Val Gly Glu
50 55 60
Asp Gly Arg Ala Lys Ala Val Asp Val Thr Pro Met Pro Arg Pro Arg
65 70 75 80
Arg Pro Ser Arg Gly Gly Gly Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Gly Arg Gly
85 90 95
Arg Gly Gly Gly Gly Tyr Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Cys Tyr Asn Cys Gly Arg Thr Gly His
115 120 125
Ile Ala Arg Asp Cys Tyr Gln Gly Gly Gly Ser Gly Ser Thr Arg Tyr
130 135 140
Ser Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Asn Arg Arg Tyr Gly Gly Asp
145 150 155 160
Ser Gly Asp Gly Arg Gly Ala Gly Gly Arg Cys Phe Asn Cys Gly Asp
165 170 175
Glu Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro Asn Lys
180 185
<210> 36
<211> 516
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<220>
<221> CDS
<222> (42)..(377)
<220>
<221> misc_feature
<222> (388)..(388)
<223> n = A, G, T, or C
<400> 36
cggacgcgtg ggttgggatt ttaaagatgg gtgagaatag g atg acc ggc aag gtg 56
Met Thr Gly Lys Val
1 5
aag tgg ttc gat gac caa aag ggt tat ggc ttc ata tcc cct gac gac 104
Lys Trp Phe Asp Asp Gln Lys Gly Tyr Gly Phe Ile Ser Pro Asp Asp
10 15 20
ggc ggc gac gat ttg ttt gtt cac cag tct tcc atc cgt tcc gag ggt 152
Gly Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Arg Ser Glu Gly
25 30 35
ttc cgt agc ctt gct gat ggt gaa gag gtc gag tac gtt gtc gag tct 200
Phe Arg Ser Leu Ala Asp Gly Glu Glu Val Glu Tyr Val Val Glu Ser
40 45 50
tct gaa ggt cgc ccc aag gct gtt gag gtc act ggc ccc aac ggc aac 248
Ser Glu Gly Arg Pro Lys Ala Val Glu Val Thr Gly Pro Asn Gly Asn
55 60 65
cct gtt cgt gga tca tct aga tcc gga cgc ggc ggc ggc ggt ggt ggc 296
Pro Val Arg Gly Ser Ser Arg Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
70 75 80 85
ggt tat ggc ggt gga tcc ggt gga tat ggt gga ggg gga agg aga ggc 344
Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Arg Gly
90 95 100
ggt tat ggt gga gga att gga ggg gga ttt tag ttgcaaaatg ngcatgctta 397
Gly Tyr Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Phe
105 110
aaaatattat aagttgtaag cgtgcatgct aatgcagagt gtggttgact atgacgtatc 457
atactgccat actaattaat attattgagt aaaataaaaa acaatgcttt cttgtttcc 516
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> Gossypium hirsutum
<400> 37
Met Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asp Asp Gln Lys Gly Tyr Gly Phe
1 5 10 15
Ile Ser Pro Asp Asp Gly Gly Asp Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser
20 25 30
Ile Arg Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala Asp Gly Glu Glu Val Glu
35 40 45
Tyr Val Val Glu Ser Ser Glu Gly Arg Pro Lys Ala Val Glu Val Thr
50 55 60
Gly Pro Asn Gly Asn Pro Val Arg Gly Ser Ser Arg Ser Gly Arg Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ile Gly Gly Gly Phe
100 105 110
<210> 38
<211> 792
<212> DNA
<213> Glycine max
<220>
<221> CDS
<222> (17)..(556)
<400> 38
aaaaaagagg cgcaag atg agt ggt agg gtt tct ggg aag gtg aag tgg ttc 52
Met Ser Gly Arg Val Ser Gly Lys Val Lys Trp Phe
1 5 10
aac gat cag aag ggg ttt gga ttc ata acc cct gac gat ggc agc gag 100
Asn Asp Gln Lys Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Glu
15 20 25
gaa ctc ttc gtt cac caa tct cag atc aaa tct gac ggt ttc cga agc 148
Glu Leu Phe Val His Gln Ser Gln Ile Lys Ser Asp Gly Phe Arg Ser
30 35 40
cta gct gaa gga gag tcc gtt gag ttc gct att gaa tct gaa tct gac 196
Leu Ala Glu Gly Glu Ser Val Glu Phe Ala Ile Glu Ser Glu Ser Asp
45 50 55 60
gga cgc gcc aag gct gtt gat gtc act ggc ccc gac ggc gcc agc gtc 244
Gly Arg Ala Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ala Ser Val
65 70 75
cag gga acc aga cgc ggc ggt gat ggt ggc cga agc tat ggc ggg gga 292
Gln Gly Thr Arg Arg Gly Gly Asp Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Gly
80 85 90
cga gga ggt ggc tac ggt ggt ggt ggg cga ggc ggt ggt ggc ggg gct 340
Arg Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala
95 100 105
tgc tac aac tgc ggt gaa tcg gga cat ctg gct agg gac tgc agc caa 388
Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ser Gly His Leu Ala Arg Asp Cys Ser Gln
110 115 120
gga ggc ggt gga gac agg tac ggc gga ggc ggt ggt ggt ggt ggc agg 436
Gly Gly Gly Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg
125 130 135 140
tat gga ggc ggc ggt ggc ggc agg tac ggt ggt ggt gga gga ggt ggt 484
Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155
ggc ggc gga gga agc tgc tac agc tgt gga gag tct ggg cat ttc gcc 532
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala
160 165 170
aga gat tgc cca tca agt gct cgt tgaaattact gttatggtgg tttatgttat 586
Arg Asp Cys Pro Ser Ser Ala Arg
175 180
gcggattgtt ttaagttttt actttaacat gttgtaggga ttttaatggt ttctgtcaaa 646
gctgtggctt cttataagta gatgcgtgag atttttcttt tttttggtta tttaaatgaa 706
agtttctgtg ttatcgttac aatctgcaaa caaaatctgt ttggacctac attttgctat 766
aatgaattgg atgattgtta tcggtt 792
<210> 39
<211> 180
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 39
Met Ser Gly Arg Val Ser Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Asp Gln Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Glu Glu Leu Phe Val
20 25 30
His Gln Ser Gln Ile Lys Ser Asp Gly Phe Arg Ser Leu Ala Glu Gly
35 40 45
Glu Ser Val Glu Phe Ala Ile Glu Ser Glu Ser Asp Gly Arg Ala Lys
50 55 60
Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ala Ser Val Gln Gly Thr Arg
65 70 75 80
Arg Gly Gly Asp Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly
85 90 95
Tyr Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Tyr Asn Cys
100 105 110
Gly Glu Ser Gly His Leu Ala Arg Asp Cys Ser Gln Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Asp Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Arg Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Cys Tyr Ser Cys Gly Glu Ser Gly His Phe Ala Arg Asp Cys Pro
165 170 175
Ser Ser Ala Arg
180
<210> 40
<211> 1245
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> CDS
<222> (75)..(806)
<400> 40
gcgagagacg ggcaggggag aggaaaaaaa aaatctaacc ctagcatccg cagcgctagg 60
gttcgggggt tgcg atg gcg gcg gcg gcg aga cag cgg ggg acg gtg aag 110
Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys
1 5 10
tgg ttc aac gac acc aag ggc ttc ggg ttc atc tcc ccc gag gac ggc 158
Trp Phe Asn Asp Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly
15 20 25
agc gaa gat ctc ttc gtg cac cag tcg tcg atc aag tcg gag ggc ttc 206
Ser Glu Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe
30 35 40
cgc tcg ctc gcg gag ggc gag gag gtg gag ttt tcc gtc tcg gag ggt 254
Arg Ser Leu Ala Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly
45 50 55 60
gac gac ggc cgc act aag gcc gtc gac gtg acc ggc ccc gac gga tcc 302
Asp Asp Gly Arg Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser
65 70 75
ttc gtc agg ggc ggc gga ggc gga gga gga ggc ggc ggc ggc tac ggc 350
Phe Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly
80 85 90
tcc cgc ggc ggt ggc gga tct ggc ggc ggc ggt cgc agc tac ggt ggt 398
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly
95 100 105
agc tgg ggc ggc ggc cgg aga tcc ggc ggc ggg ggc ggt ccc ggc gcg 446
Ser Trp Gly Gly Gly Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ala
110 115 120
tgc tac aag tgc ggc gag ccc ggc cac atg gca agg gac tgc cct agc 494
Cys Tyr Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Pro Ser
125 130 135 140
gcc gac ggc gga ggc ggc tac ggc gga ggc ggc tac gga gga gga ggc 542
Ala Asp Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly
145 150 155
ggc ggc ggc ggt ggc tgc ttc aag tgt ggc gag cct ggc cac atg gcc 590
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Phe Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala
160 165 170
agg gac tgc tcc agc ggc ggc ggc ggc tac ggc ggt ggc ggc ggc ggc 638
Arg Asp Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
175 180 185
ggt gga ggc ggc tgc tac aac tgc ggc cag gcc ggc cac atg gcc agg 686
Gly Gly Gly Gly Cys Tyr Asn Cys Gly Gln Ala Gly His Met Ala Arg
190 195 200
gac tgc ccc agc ggt ggc ggc ggt ggc gga ggg agg ttc ggc ggc ggc 734
Asp Cys Pro Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Phe Gly Gly Gly
205 210 215 220
ggc ggg ggt ggc ggc gac cgc tcc tgc tac aac tgc ggc gag gcc ggc 782
Gly Gly Gly Gly Gly Asp Arg Ser Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ala Gly
225 230 235
cac atc gcc cgc gac tgc ccc acg tgaggtgtgt ccgcgtccgt ccgtccagcc 836
His Ile Ala Arg Asp Cys Pro Thr
240
agatcagatc ggatcgctcc accacctgct ggtctgatgg cgccgccccc ttctagatct 896
cgcttaaaaa aacacccccc tctcgctgtg tgtcggagta ccgctttagt tttgccgatc 956
cgggcacgag tgcccgctgc ctctttcctc tcatgcgtaa gaggaacccg tccgccgttt 1016
tcagatttcg ttcggtccgt agaagaactc tcaagttaag ttaagttatc atggtgtgtg 1076
cttggtcgtt gttcgtcgtc gtcgttaagg ttttaagaga tgatttggtc ctgtgttgcc 1136
gaggggaagt cgaatctgct tttttctttt tttgtggttt gttccaccag actgaggaag 1196
gagatgagat gattattctc ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1245
<210> 41
<211> 244
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 41
Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp
1 5 10 15
Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu
20 25 30
Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala
35 40 45
Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg
50 55 60
Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser Phe Val Arg Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Arg Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly Gly
100 105 110
Gly Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gly Ala Cys Tyr Lys Cys
115 120 125
Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Pro Ser Ala Asp Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Cys Phe Lys Cys Gly Glu Pro Gly His Met Ala Arg Asp Cys Ser
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Cys Tyr Asn Cys Gly Gln Ala Gly His Met Ala Arg Asp Cys Pro Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Asp Arg Ser Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Ala Gly His Ile Ala Arg
225 230 235 240
Asp Cys Pro Thr
<210> 42
<211> 1409
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> CDS
<222> (27)..(995)
<400> 42
cgcagcgcta gggttcgggg gttgcg atg gcg gcg gcg gcg agg cag cgg ggg 53
Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly
1 5
acg gtg aag tgg ttc aac gac acc aag ggc ttc ggg ttc atc tcc ccc 101
Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro
10 15 20 25
gag gac ggc agc gag gat ctc ttc gtg cac cag tcg tcg atc aag tcg 149
Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser
30 35 40
gag ggc ttc cgc tcg ctc gcg gag ggc gag gag gtg gag ttt tcc gtc 197
Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val
45 50 55
tcg gag ggt gac gac ggc cgc act aag gcc gtc gac gtg acc ggc ccc 245
Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro
60 65 70
gac gga tcc ttc gtc agg ggc ggc gga ggc gga gga ggc ggc ggc ggc 293
Asp Gly Ser Phe Val Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
75 80 85
ggc ggc tac ggc tcc cgc ggc ggt ggc gga tct ggc ggc ggc ggt cgc 341
Gly Gly Tyr Gly Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg
90 95 100 105
agc tac ggt ggt agc tgg ggc ggc ggc cgg aga tcc gcg ccc gac gcc 389
Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly Gly Gly Arg Arg Ser Ala Pro Asp Ala
110 115 120
gct ttc ggc tcc gtc ctc tcc ggc acc gcc ggc gac gcc gcc ccc agc 437
Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ser
125 130 135
gac cag tgg ttc gtc gac gcg ctc aac gcc ccc gcg ccg cac ccc atc 485
Asp Gln Trp Phe Val Asp Ala Leu Asn Ala Pro Ala Pro His Pro Ile
140 145 150
gag cgc gtc cga tcc gag tcc tcc tcg atc gtc tcc gac gtc ccc gac 533
Glu Arg Val Arg Ser Glu Ser Ser Ser Ile Val Ser Asp Val Pro Asp
155 160 165
tac ctc ttc agc ctc gac agc ccg tcc gac gac ccc agc ccc ggc ccc 581
Tyr Leu Phe Ser Leu Asp Ser Pro Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Pro
170 175 180 185
tcg gcg gct cgc gcc aag tcc gac ccc gcg gag act ccg cac cac cac 629
Ser Ala Ala Arg Ala Lys Ser Asp Pro Ala Glu Thr Pro His His His
190 195 200
ggc gac gac gtg ccg cct tcc gct cga cag ata ccg cac gtc gca gga 677
Gly Asp Asp Val Pro Pro Ser Ala Arg Gln Ile Pro His Val Ala Gly
205 210 215
gga gcg tca tcg tgg ccc gcc ccg ccg ccg ccg tac atg gcg cag cct 725
Gly Ala Ser Ser Trp Pro Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Met Ala Gln Pro
220 225 230
atg tac tac ttc ccc gtg ccg cca ccg gtc cac tac ctc gac cag tct 773
Met Tyr Tyr Phe Pro Val Pro Pro Pro Val His Tyr Leu Asp Gln Ser
235 240 245
gcg cag agt ggc tac atg cct cgc ccg atc tac cac att gtc ggt ggc 821
Ala Gln Ser Gly Tyr Met Pro Arg Pro Ile Tyr His Ile Val Gly Gly
250 255 260 265
gga gga agc gag gcg cct ggc gga gat ctt cac gcg gcc ggc gga gtc 869
Gly Gly Ser Glu Ala Pro Gly Gly Asp Leu His Ala Ala Gly Gly Val
270 275 280
tac ggc gtc tcg cac cac atg cag ggg ttc ccg ccg atg atg tac gcg 917
Tyr Gly Val Ser His His Met Gln Gly Phe Pro Pro Met Met Tyr Ala
285 290 295
ccg ccg cgc gcg gtc atc tac aac tac aag tcg gag ggg atg cca tcg 965
Pro Pro Arg Ala Val Ile Tyr Asn Tyr Lys Ser Glu Gly Met Pro Ser
300 305 310
ctg cct ccg gaa ggt ggg gca cac tct tcc taggtgcatc ggctacttca 1015
Leu Pro Pro Glu Gly Gly Ala His Ser Ser
315 320
catctctgaa tcctgattat tgttgcagat gcctaagcta aggagttttg cgtggtaatt 1075
tttttatcga ttcgtctaga gtcttgttcg ttgttttgta tagatggagg ggttgatggt 1135
gatggataga tattaatgca gttttcgtct agtggaaata tattcgtgaa atgtatatca 1195
tactaaatag tatagtattt ggtgtgatta attaatattc tagttaatgt aatgtgggat 1255
tcatataatc taggtggttc tggtcttata gaaaccattt ttgggcattt tatatttaca 1315
taaactggat gttgggtgaa tgttctaagc agtatgtgct gtgttgaacc tcaatcactt 1375
atgagtggtt actaaatttg aatttgatgt cttc 1409
<210> 43
<211> 323
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 43
Met Ala Ala Ala Ala Arg Gln Arg Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Asp
1 5 10 15
Thr Lys Gly Phe Gly Phe Ile Ser Pro Glu Asp Gly Ser Glu Asp Leu
20 25 30
Phe Val His Gln Ser Ser Ile Lys Ser Glu Gly Phe Arg Ser Leu Ala
35 40 45
Glu Gly Glu Glu Val Glu Phe Ser Val Ser Glu Gly Asp Asp Gly Arg
50 55 60
Thr Lys Ala Val Asp Val Thr Gly Pro Asp Gly Ser Phe Val Arg Gly
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Arg Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Arg Ser Tyr Gly Gly Ser Trp Gly
100 105 110
Gly Gly Arg Arg Ser Ala Pro Asp Ala Ala Phe Gly Ser Val Leu Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ser Asp Gln Trp Phe Val Asp Ala
130 135 140
Leu Asn Ala Pro Ala Pro His Pro Ile Glu Arg Val Arg Ser Glu Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ile Val Ser Asp Val Pro Asp Tyr Leu Phe Ser Leu Asp Ser
165 170 175
Pro Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Pro Ser Ala Ala Arg Ala Lys Ser
180 185 190
Asp Pro Ala Glu Thr Pro His His His Gly Asp Asp Val Pro Pro Ser
195 200 205
Ala Arg Gln Ile Pro His Val Ala Gly Gly Ala Ser Ser Trp Pro Ala
210 215 220
Pro Pro Pro Pro Tyr Met Ala Gln Pro Met Tyr Tyr Phe Pro Val Pro
225 230 235 240
Pro Pro Val His Tyr Leu Asp Gln Ser Ala Gln Ser Gly Tyr Met Pro
245 250 255
Arg Pro Ile Tyr His Ile Val Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Pro Gly
260 265 270
Gly Asp Leu His Ala Ala Gly Gly Val Tyr Gly Val Ser His His Met
275 280 285
Gln Gly Phe Pro Pro Met Met Tyr Ala Pro Pro Arg Ala Val Ile Tyr
290 295 300
Asn Tyr Lys Ser Glu Gly Met Pro Ser Leu Pro Pro Glu Gly Gly Ala
305 310 315 320
His Ser Ser
<210> 44
<211> 215
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (15)..(215)
<300>
<308> AB001488
<309> 1999-02-13
<313> (1)..(215)
<400> 44
aggaggcaac aaaa atg gaa caa ggt aca gtt aaa tgg ttt aat gca gaa 50
Met Glu Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu
1 5 10
aaa ggt ttt ggc ttt atc gaa cgc gaa aat gga gac gat gta ttc gta 98
Lys Gly Phe Gly Phe Ile Glu Arg Glu Asn Gly Asp Asp Val Phe Val
15 20 25
cac ttt tct gca atc caa agt gac gga ttc aaa tct tta gac gaa ggt 146
His Phe Ser Ala Ile Gln Ser Asp Gly Phe Lys Ser Leu Asp Glu Gly
30 35 40
caa aaa gta tcg ttt gac gtt gag caa ggt gct cgt gga gct caa gct 194
Gln Lys Val Ser Phe Asp Val Glu Gln Gly Ala Arg Gly Ala Gln Ala
45 50 55 60
gct aac gtt caa aaa gct taa 215
Ala Asn Val Gln Lys Ala
65
<210> 45
<211> 66
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 45
Met Glu Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Arg Glu Asn Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Ser Asp Gly Phe Lys Ser Leu Asp Glu Gly Gln Lys Val Ser
35 40 45
Phe Asp Val Glu Gln Gly Ala Arg Gly Ala Gln Ala Ala Asn Val Gln
50 55 60
Lys Ala
65
<210> 46
<211> 201
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(201)
<300>
<308> L77246
<309> 2001-12-14
<313> (1)..(201)
<400> 46
atg caa aac ggt aaa gta aaa tgg ttc aac aac gaa aaa gga ttc ggc 48
Met Gln Asn Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Asn Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
ttc att gaa gtt gaa ggc gga gac gat gta ttt gtt cac ttc aca gct 96
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala
20 25 30
atc gaa gga gat gga tac aaa tca tta gaa gaa gga caa gaa gtt tct 144
Ile Glu Gly Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser
35 40 45
ttt gaa att gtc gaa ggt aat cgt gga cct caa gct tct aat gtt gta 192
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ser Asn Val Val
50 55 60
aaa ctc taa 201
Lys Leu
65
<210> 47
<211> 66
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 47
Met Gln Asn Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Asn Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Thr Ala
20 25 30
Ile Glu Gly Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ser Asn Val Val
50 55 60
Lys Leu
65
<210> 48
<211> 198
<212> DNA
<213> Bacillus halodurans
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(198)
<300>
<308> AP001519
<309> 2001-01-10
<313> (1)..(198)
<400> 48
atg caa gga aaa gta aaa tgg ttt aac gca gaa aaa ggt ttc ggt ttt 48
Met Gln Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly Phe
1 5 10 15
atc gag cgc gaa gat ggt gac gat gta ttt gtt cat ttc tct gcc att 96
Ile Glu Arg Glu Asp Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala Ile
20 25 30
aac aca gac ggt ttc aaa aca tta gac gaa ggt caa tct gtt gag ttt 144
Asn Thr Asp Gly Phe Lys Thr Leu Asp Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe
35 40 45
gat atc gtt gaa gga gct cgc gga cct caa gct gcg aac gtc act aag 192
Asp Ile Val Glu Gly Ala Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr Lys
50 55 60
ctt taa 198
Leu
65
<210> 49
<211> 65
<212> PRT
<213> Bacillus halodurans
<400> 49
Met Gln Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly Phe
1 5 10 15
Ile Glu Arg Glu Asp Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala Ile
20 25 30
Asn Thr Asp Gly Phe Lys Thr Leu Asp Glu Gly Gln Ser Val Glu Phe
35 40 45
Asp Ile Val Glu Gly Ala Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr Lys
50 55 60
Leu
65
<210> 50
<211> 204
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(204)
<400> 50
atg gca cag ggt act gtg aaa tgg ttc aac ggc gaa aag gga ttt ggt 48
Met Ala Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Gly Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
ttc atc gct ccc aac gat ggc tcc gca gat ctc ttc gtc cac tac tct 96
Phe Ile Ala Pro Asn Asp Gly Ser Ala Asp Leu Phe Val His Tyr Ser
20 25 30
gag att cag ggc tcc ggt ttc cgt aat ctt gag gaa aac cag cca gtt 144
Glu Ile Gln Gly Ser Gly Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Gln Pro Val
35 40 45
gaa ttt gag gtc ggc gag ggc gcc aag ggc cca cag gct cag cag gtt 192
Glu Phe Glu Val Gly Glu Gly Ala Lys Gly Pro Gln Ala Gln Gln Val
50 55 60
cgt gct ctc taa 204
Arg Ala Leu
65
<210> 51
<211> 67
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 51
Met Ala Gln Gly Thr Val Lys Trp Phe Asn Gly Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Ala Pro Asn Asp Gly Ser Ala Asp Leu Phe Val His Tyr Ser
20 25 30
Glu Ile Gln Gly Ser Gly Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Gln Pro Val
35 40 45
Glu Phe Glu Val Gly Glu Gly Ala Lys Gly Pro Gln Ala Gln Gln Val
50 55 60
Arg Ala Leu
65
<210> 52
<211> 384
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(384)
<400> 52
atg cct gtc gga aca gtg aag tgg tac gac gcg gag cgt ggt ttc ggc 48
Met Pro Val Gly Thr Val Lys Trp Tyr Asp Ala Glu Arg Gly Phe Gly
1 5 10 15
ttt gtc tcc aat cca ggt ggt gaa gat tgc ttc gta ggt aag caa gta 96
Phe Val Ser Asn Pro Gly Gly Glu Asp Cys Phe Val Gly Lys Gln Val
20 25 30
ctt ccc aag gga gtc acc gaa ttg cac aag gga cag cga atc gat ttt 144
Leu Pro Lys Gly Val Thr Glu Leu His Lys Gly Gln Arg Ile Asp Phe
35 40 45
gac ttc gcc gca ggc cgt aag ggc cct caa gca ctt cga ata aag att 192
Asp Phe Ala Ala Gly Arg Lys Gly Pro Gln Ala Leu Arg Ile Lys Ile
50 55 60
ctt gaa act cca cgc agg cgt cca cag cac aaa tac aag cca gaa gag 240
Leu Glu Thr Pro Arg Arg Arg Pro Gln His Lys Tyr Lys Pro Glu Glu
65 70 75 80
ctc aac gga atg atc tct gac ctc atc acg ctt cta gaa agt gga gtg 288
Leu Asn Gly Met Ile Ser Asp Leu Ile Thr Leu Leu Glu Ser Gly Val
85 90 95
caa cca ggc ctt gcc aaa ggg caa tac ccg gag cac aaa gct gga gcg 336
Gln Pro Gly Leu Ala Lys Gly Gln Tyr Pro Glu His Lys Ala Gly Ala
100 105 110
cag gta gca gaa att ctt cgc gtt gtt gcg aag gag ctt gag tct taa 384
Gln Val Ala Glu Ile Leu Arg Val Val Ala Lys Glu Leu Glu Ser
115 120 125
<210> 53
<211> 127
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 53
Met Pro Val Gly Thr Val Lys Trp Tyr Asp Ala Glu Arg Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Val Ser Asn Pro Gly Gly Glu Asp Cys Phe Val Gly Lys Gln Val
20 25 30
Leu Pro Lys Gly Val Thr Glu Leu His Lys Gly Gln Arg Ile Asp Phe
35 40 45
Asp Phe Ala Ala Gly Arg Lys Gly Pro Gln Ala Leu Arg Ile Lys Ile
50 55 60
Leu Glu Thr Pro Arg Arg Arg Pro Gln His Lys Tyr Lys Pro Glu Glu
65 70 75 80
Leu Asn Gly Met Ile Ser Asp Leu Ile Thr Leu Leu Glu Ser Gly Val
85 90 95
Gln Pro Gly Leu Ala Lys Gly Gln Tyr Pro Glu His Lys Ala Gly Ala
100 105 110
Gln Val Ala Glu Ile Leu Arg Val Val Ala Lys Glu Leu Glu Ser
115 120 125
<210> 54
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Artificial seqquence, somewhat like E. coli CspA
<400> 54
atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc 60
atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat 120
ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa 180
ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg aattcctcga gcgattacaa ggatgatgat 240
gataagtaa 249
<210> 55
<211> 82
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli CspA-like
<400> 55
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
65 70 75 80
Asp Lys
<210> 56
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli CspA-like
<400> 56
atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc 60
atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat 120
ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa 180
ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg aattcctcga cctag 225
<210> 57
<211> 74
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli CspA-like protien
<400> 57
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Asn Val Thr Ser Leu Asn Ser Ser Thr
65 70
<210> 58
<211> 240
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. subtilis CspB-like
<400> 58
atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttcggatt catcgaagta 60
gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaaact 120
ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct 180
gctaacgtta ctaaagaagc gaattcctcg agcgattaca aggatgatga tgataagtaa 240
<210> 59
<211> 79
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> B. subtilis CspB-like
<400> 59
Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
Lys Glu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
65 70 75
<210> 60
<211> 216
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. subtilis CspB-like
<400> 60
atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttcggatt catcgaagta 60
gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaaact 120
ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct 180
gctaacgtta ctaaagaagc gaattcctcg acctag 216
<210> 61
<211> 71
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> B. subtilis CspB-like
<400> 61
Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
Lys Glu Ala Asn Ser Ser Thr
65 70
<210> 62
<211> 213
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli CspA-like
<400> 62
atggccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg ctgacaaagg cttcggcttc 60
atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact tctctgctat ccagaacgat 120
ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca ccatcgaaag cggcgctaaa 180
ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg tga 213
<210> 63
<211> 70
<212> PRT
<213> CspA-like protein
<400> 63
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Asn Val Thr Ser Leu
65 70
<210> 64
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B. subtilis CspB-like
<400> 64
atggtagaag gtaaagtaaa atggttcaac tctgaaaaag gtttcggatt catcgaagta 60
gaaggtcaag acgatgtatt cgttcatttc tctgctattc aaggcgaagg cttcaaaact 120
ttagaagaag gccaagctgt ttcttttgaa atcgttgaag gaaaccgcgg accacaagct 180
gctaacgtta ctaaagaagc gtga 204
<210> 65
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> B. subtilis CspB-like
<400> 65
Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
Lys Glu Ala
65
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer for PCR
<400> 66
aggtaataca ccatggccgg taa 23
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer for PCR
<400> 67
ttaagcagag aattcaggct ggtt 24
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Flag tag for epitope tagging
<400> 68
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 69
aggaggaaat tccatggtag aag 23
<210> 70
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 70
tcaatttatg aattcgcttc tttagt 26
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n=a,c,t, or g
<400> 71
gggcactttg tacaagaaag ctgggtn 27
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n=a,c,t, or g
<400> 72
ggggcacttt gtacaagaaa gctgggtn 28
<210> 73
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 73
cctgcaggac catg 14
<210> 74
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 74
cctgcaggct cgagcta 17
<210> 75
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 75
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 43
<210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 76
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc cctgcaggct cgagcta 47
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 77
ccccaccctg caatgtga 18
<210> 78
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 78
tgtgcatcct tttatttcat acattaatta a 31
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 79
cctagacttg tccatcttct ggattggcca 30
<210> 80
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 80
gcctgccgca gaccaa 16
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 81
atgcagagct cagcttcatc 20
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 82
tccagtacgt gcagtccctc ctcc 24
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 83
cgtctacaat cagaaggcgt aatc 24
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 84
ccaacaggtg aatgcttgat agg 23
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 85
catgcgccgc tttgcttc 18
<210> 86
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 86
gcgcaggcct agatgtacca tgtccggtaa aatgactggt atcgtaaaat gg 52
<210> 87
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 87
cgcgaattcg gatccttatt acaggctggt tacgttacca gctgcc 46
<210> 88
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 88
gcgcaggcct agatgtacca tgttagaagg taaagtaaaa tggttcaact ctg 53
<210> 89
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR primer
<400> 89
cgcgaattcg gatccttatt acgcttcttt agtaacgtta gcagcttgtg g 51
<210> 90
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic codons optimizing CspB for plant expression
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(204)
<400> 90
atg gtg gag ggc aag gtg aag tgg ttc aac tcc gag aag ggc ttc ggc 48
Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
ttc atc gag gtg gag ggt caa gac gat gtg ttc gtc cac ttc tcc gcc 96
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
atc cag ggc gaa ggg ttc aag acc ctg gaa gag ggg cag gcc gtc tcc 144
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
ttc gag atc gtc gag gga aac cgc ggt ccg cag gcc gcg aac gtc acg 192
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
aag gaa gcg tga 204
Lys Glu Ala
65
<210> 91
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 91
Met Val Glu Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gln Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Glu Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Ala Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
Lys Glu Ala
65
<210> 92
<211> 213
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic codons encoding CspA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(213)
<400> 92
atg gcc ggc aag atg acc ggc atc gtg aag tgg ttc aac gct gac aag 48
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
ggc ttc ggc ttc atc acg ccg gac gac ggc agc aag gat gtc ttc gtg 96
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
cac ttc tcc gcc atc cag aac gac ggc tac aag tcc ctc gac gag ggc 144
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
cag aag gtc agc ttc acc atc gag agc ggc gcc aaa ggc ccg gcc gcc 192
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
ggt aac gtc acg tcg ctg tga 213
Gly Asn Val Thr Ser Leu
65 70
<210> 93
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 93
Met Ala Gly Lys Met Thr Gly Ile Val Lys Trp Phe Asn Ala Asp Lys
1 5 10 15
Gly Phe Gly Phe Ile Thr Pro Asp Asp Gly Ser Lys Asp Val Phe Val
20 25 30
His Phe Ser Ala Ile Gln Asn Asp Gly Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Gly
35 40 45
Gln Lys Val Ser Phe Thr Ile Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Ala Ala
50 55 60
Gly Asn Val Thr Ser Leu
65 70
<210> 94
<211> 201
<212> DNA
<213> Bacillus thuringiensis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(201)
<400> 94
atg caa aca ggt aaa gtt aaa tgg ttc aac agc gaa aaa ggt ttc ggt 48
Met Gln Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
ttc atc gaa gtt gaa ggt gga gac gat gta ttc gtt cac ttc tca gct 96
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
atc caa ggt gac gga ttc aaa act tta gaa gaa ggt caa gaa gtt tct 144
Ile Gln Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser
35 40 45
ttc gaa atc gtt gaa ggt aac cgt gga cca caa gct gct aac gtt aca 192
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
aaa aac taa 201
Lys Asn
65
<210> 95
<211> 66
<212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 95
Met Gln Thr Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ser Glu Lys Gly Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Glu Val Glu Gly Gly Asp Asp Val Phe Val His Phe Ser Ala
20 25 30
Ile Gln Gly Asp Gly Phe Lys Thr Leu Glu Glu Gly Gln Glu Val Ser
35 40 45
Phe Glu Ile Val Glu Gly Asn Arg Gly Pro Gln Ala Ala Asn Val Thr
50 55 60
Lys Asn
65
Claims (34)
- 식물 세포들의 게놈내로 삽입된, 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA를 갖는 식물로서, 상기 단백질의 발현은 상기 식물에 비생물적 스트레스 내성을 제공하고, 상기 비생물적 스트레스 내성은 증가된 물사용 효율, 증가된 저온 발아 효율, 증가된 염 내성, 및/또는 증가된 물부족 내성인, 식물.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질은 상기 식물에 이종성인 것을 특징으로 하는 식물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단백질은 박테리아 저온 자극유도 단백질, 곰팡이 저온 자극유도 단백질, 또는 식물 저온 자극유도 단백질인 것을 특징으로 하는 식물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 Prosite motif PS00352의 보존된 저온 자극유도 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물,
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) CspB와 동일하거나 또는 바실러스 서브틸리스 CspB의 아미노 산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH 또는 CspI와 동일하거나 또는 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH 또는 CspI의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA와 동일하거나 또는 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 박테리아 저온 자극유도 단백질의 식물 단백질 상동체로 코딩되거나 또는 박테리아 저온 자극유도 단백질의 식물 단백질 상동체의 아미노산 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 옥수수인 것을 특 징으로 하는 식물.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 대두인 것을 특징으로 하는 식물.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 목화인 것을 특징으로 하는 식물.
- 게놈내로 삽입된 재조합 DNA를 갖는 식물 세포로서, 상기 재조합 DNA는 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하고, 상기 단백질의 발현은 상기 세포를 포함하는 식물에 비생물적 스트레스 내성을 제공하고, 상기 비생물적 스트레스 내성은 증가된 물사용 효율, 증가된 저온 발아 효율, 증가된 염 내성, 및/또는 증가된 물부족 내성인, 식물 세포.
- 제 12항에 있어서, 상기 단백질은 상기 식물에 이종성인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 단백질은 박테리아 저온 자극유도 단백질, 곰팡이 저온 자극유도 단백질, 또는 식물 저온 자극유도 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 Prosite motif PS00352의 보존된 저온 자극유도 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) CspB와 동일하거나 또는 바실러스 서브틸리스 CspB의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH 또는 CspI와 동일하거나 또는 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH 또는 CspI의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA와 동일하거나 또는 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 박테리아 저온 자극유도 단백질의 식물 단백질 상동체로 코딩되거나 또는 박테리아 저온 자극유도 단백질의 식물 단백질 상동체의 아미노산 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 옥수수 식물 세포인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 대두 식물 세포인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 제 12항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 목화 식물 세포인 것을 특징으로 하는 식물 세포.
- 다음의 단계들을 포함하는, 비생물적 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물들의 수확물을 생산하기 위해 사용될 수 있는 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA를 포함하는 형질전환 종자의 제조방법:(a) 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 재조합 DNA를 포함하는 제 1의 식물을 선택하는 단계;(b) 상기 재조합 DNA를 제 2의 식물 내로 유전자 이입시키는 단계;(c) 식물들의 개체군을 생산하기 위해서 상기 제 2의 식물로부터 종자를 성장시키는 단계;(d) 증가된 물 사용 효율, 증가된 저온 발아 효율, 증가된 염 내성, 및 증가된 물부족 내성으로부터 선택되는 적어도 하나의 비생물적 스트레스 내성 특성을 나타내는 식물들에 대한 식물 개체군을 스크리닝하는 단계;(e) 상기 개체군으로부터 상기 적어도 하나의 비생물적 스트레스 내성 특성을 나타내는 하나 이상의 식물들을 선택하는 단계;(f) 상기 선택된 식물들 내로 상기 재조합 DNA가 안정하게 통합된 것을 검증하는 단계;(g) 상기 선택된 식물이 저온 자극유도 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는지 여부를 결정하는 단계; 및(h) 선택된 식물로부터 종자를 수집하는 단계.
- 제 23항에 있어서, 상기 재조합 DNA는 동형접합체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 상기 단백질은 상기 식물에 이종성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 박테리아 저온 자극유도 단백질, 곰팡이 저온 자극유도 단백질, 또는 식물 저온 자극유도 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 Prosite motif PS00352의 보존된 저온 자극유도 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) CspB와 동일하거나 또는 바실러스 서브틸리스 CspB의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH 또는 CspI와 동일하거나 또는 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA, CspB, CspC, CspD, CspE, CspF, CspG, CspH 또는 CspI의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA와 동일하거나 또는 대장균 저온 자극유도 단백질 CspA의 아미노산 서열과 동일한 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 박테리아 저온 자극유도 단백질의 식물 단백질 상동체로 코딩되거나 또는 박테리아 저온 자극유도 단백질의 식물 단백질 상동체의 아미노산 서열에서 저온 자극유도 도메인을 포함하는 연속된 아미노산으로 구성되는 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 옥수수인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 대두인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 목화인 것을 특징으로 하는 방법.
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