JP5551620B2 - コールドショックタンパク質組成物、並びにその使用のための方法及びキット - Google Patents

Description

優先権の主張
本願は２００８年２月２９日付けで出願された米国仮出願第６１／０６７，５９６号明細書、２００８年１０月９日付けで出願された米国仮出願第６１／１９５，７４７号明細書、及び２００８年５月１６日付けで出願された特願２００８−１２９７４５号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張するものである。

配列リスト
書面及びコンピュータ可読形式の配列リストをここに提出する。コンピュータ可読形式で記録された情報は、書面の配列リストと同一である。

ＤＮＡ合成は研究において様々な目的で使用される。そのうち、オリゴヌクレオチド等の短鎖ＤＮＡの化学合成を除く大抵のＤＮＡ合成は、ＤＮＡポリメラーゼを利用する酵素法によって行われる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の核酸断片を容易に増幅することが可能なＰＣＲは非常に有益であり、生物学、医学、農学、及び他の分野において必須のツールとなっている。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅においては、多くの場合、反応の高い特異性が必要とされる。非特異的増幅を低減するために新たなＤＮＡポリメラーゼの開発及び反応混合物の組成の最適化がされているが、それでも依然としてＰＣＲ増幅特異性の向上が必要とされている。

ＤＮＡは、ＤＮＡを鋳型として用いる従来のＰＣＲによる以外にも、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、即ち逆転写酵素を用いることにより合成することができる。生命現象を解明するためには、様々な遺伝子のｍＲＮＡ分子の解析が非常に重要である。逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成する逆転写反応が可能となり、ｍＲＮＡ分子の解析法は長足の進歩を遂げた。逆転写酵素を用いたｍＲＮＡ分子の解析法は現在、遺伝子に関する研究において必須の実験法となっている。更に該方法はクローニング技術やＰＣＲ技術にも応用され、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等、幅広い分野において不可欠の技術となっている。

逆転写反応の反応性を改善するための取組みも行われている。例えば、逆転写反応を高温で行う方法、逆転写酵素及び３´−５´エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いるｃＤＮＡの合成方法（特許文献１）、並びにＮｃｐ７、ｒｅｃＡ、ＳＳＢ、及びＴ４ｇｐ３２のような核酸結合タンパク質を利用する方法（特許文献２）等が検討されてきた。逆転写反応は、その反応性について改善がなされてきたが、現在においても、十分な鎖長を持ったｃＤＮＡを合成できない場合や十分な量のｃＤＮＡを合成することができない場合がある。従って、逆転写反応の更なる反応性の改善が望まれている。

上記の２つのＤＮＡ合成方法の改善に加えて、科学分野においてはエンドリボヌクレアーゼの切断部位特異性を決定する技法も必要とされている。例えば、ｍＲＮＡインターフェラーゼは、広範な細菌ゲノムに存在する毒素−抗毒素系によってコードされる配列特異的エンドリボヌクレアーゼである。これらのエンドリボヌクレアーゼは通常、一本鎖ＲＮＡ内に特異的切断部位を有する。大腸菌（E. coli）のＭａｚＦはＡＣＡ配列で、ＣｈｐＢＫはＡＣＹ配列（ＹはＵ、Ａ、又はＧである）で、プラスミドＲ１００に由来するＰｅｍＫはＵＡＨ配列（ＨはＣ、Ａ、又はＵである）で、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）に由来するＭａｚＦ−ｍｔ１及びＭａｚＦ−ｍｔ６はそれぞれＵＡＣ及びＵリッチ領域で特異的に切断を行う。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来するＭａｚＦホモローグが、ＶＵＵＶ’（Ｖ及びＶ’はＡ、Ｃ、又はＧであり、同一であっても、又は同一でなくてもよい）で切断を行うことが近年見出されている。しかしながら、ヒト型結核菌の幾つかのＭａｚＦホモローグの切断特異性を決定する従来の試みは失敗に終わっている。特に３塩基より長い特異的配列が認識される場合の切断特異性の決定に関しては、考え得る標的配列の全てをカバーするほど十分に長いＲＮＡ基質を使用することが重要である。しかしながら、長いＲＮＡを基質として用いる上で主要な問題は、それが一本鎖ＲＮＡではあるが、広範な安定した二次構造を形成することである。この又は任意の他の長いＲＮＡをエンドリボヌクレアーゼに対する基質として使用するためには、その二次構造は折り畳まれていない必要がある。したがって、ｍＲＮＡインターフェラーゼ等のエンドリボヌクレアーゼに関する切断部位特異性を決定する新たな技法を開発することが依然として必要とされている。

コールドショックタンパク質は、種々の微生物から見出されており、低温への生育温度シフトへの適応に関与するものと考えられている。このうち、Ｍａｊｏｒ Ｃｏｌｄ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎとして知られるＣｓｐＡは、その遺伝子が大腸菌（Escherichia coli）から単離され、組換え体が製造されている（特許文献３）。しかしながら、コールドショックタンパク質の用途として提案されているものは、農業分野において凍害や霜害を防ぐための抗凍結タンパク質としての利用に限られている。

本発明は、反応性が向上した、改善されたＤＮＡ合成反応のためのコールドショックタンパク質含有組成物、かかる組成物を用いてＤＮＡを合成する方法、かかる方法に使用されるキット、及びかかる方法によって得られる合成ＤＮＡ産物を提供する。本発明は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用のコールドショックタンパク質含有組成物、かかる組成物を用いてエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する方法、及びかかる方法に使用されるキットをさらに提供する。

特許３９１００１５号公報 国際公開第００／５５３０７号パンフレット 国際公開第９０／０９４４４号パンフレット

本発明によると、ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ合成に有用な組成物、かかる組成物を用いてＤＮＡを合成する方法、かかる方法に使用されるＤＮＡ合成用のキット、及びかかる方法によって合成されるＤＮＡ組成物が提供される。反応の反応性が向上した、ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ合成を可能にすることが本発明の一目的である。

本発明の実施の形態は、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ合成用の組成物に関する。本発明の或る特定の実施の形態では、該組成物は、コールドショックタンパク質としての、ＣｓｐＡ又はそのホモローグ、好ましくは大腸菌由来のＣｓｐＡ又はそのホモローグにより例示される。組成物は、組成物２５μＬ当たり０．５μｇ超のＣｓｐＡを含み得る。かかる実施の形態による組成物は、２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含み得る。さらに、かかる実施の形態による組成物は、少なくとも１種のプライマー及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチドを含み得る。かかる組成物は反応緩衝液等の液体媒体をさらに含み得る。

本発明のさらなる実施の形態は、Ａ）コールドショックタンパク質、Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びにＣ）液体媒体を含む。

本発明のさらなる実施の形態は、ＤＮＡを合成する方法であって、Ａ）コールドショックタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む、方法に関する。

本発明の別の実施の形態は、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ合成用のキットに関する。かかる実施の形態によるキットは、液体媒体、又はキットの利用に関する紙若しくは電子形式の説明書をさらに含み得る。かかるキットのコンポーネントは、個別に又は単独で存在し得る。

本発明は、Ａ）コールドショックタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含むプロセスによって合成されるＤＮＡ組成物にも関する。

本発明は、逆転写反応に有利に使用される組成物、該組成物を用いたｃＤＮＡ合成プロセス、逆転写反応に有利に使用されるキット、及びかかるプロセスによって合成されるｃＤＮＡ組成物にも関する。本発明によると、特異性、合成される鎖の長さ、合成量等の観点から反応性の優れた、有利な逆転写反応を実現することができる。

本発明の実施の形態は、コールドショックタンパク質又はそのホモローグ、及び逆転写酵素を含む逆転写反応用の組成物に関する。本発明によるかかる実施の形態では、コールドショックタンパク質の一例はＣｓｐＡ又はそのホモローグであり、ＣｓｐＡの一例は大腸菌由来ＣｓｐＡである。幾つかの実施の形態では、ＣｓｐＡは、組成物２０μＬ当たりＣｓｐＡ約０．５μｇ〜約２０μｇの量で存在し得る。逆転写酵素の例は、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素、及び／又はトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素、及び／又はそれらの組み合わせである。さらに、本発明によるこの実施の形態における組成物は、少なくとも１種のプライマー及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチドをさらに含み得る。組成物のさらなる実施の形態は、反応緩衝液等の液体媒体を含む。他の実施の形態はオリゴ（ｄＴ）プライマー、又はランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、又はそれらの組み合わせを含む。

本発明のさらなる実施の形態は、逆転写反応用の組成物であって、Ａ）コールドショックタンパク質、Ｂ）逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＲＮＡから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びにＣ）液体媒体を含む、組成物を含む。

本発明のさらなる実施の形態は、（Ａ）コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製する工程、及び（Ｂ）（Ａ）工程で調製した溶液をインキュベーションする工程を含む、ｃＤＮＡの合成方法に関する。

本発明のさらなる実施の形態は、逆転写反応用のキットであって、Ａ）コールドショックタンパク質、Ｂ）逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＲＮＡから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びにＣ）液体媒体を含む、キットに関する。かかる実施の形態によるキットは、液体媒体、又はキットの利用に関する紙若しくは電子形式の説明書をさらに含み得る。かかるキットのコンポーネントは、個別に又は単独で存在し得る。かかる実施の形態のキットは、遺伝子増幅反応を行うための試薬をさらに含み得る。

本発明は、Ａ）コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及びＲＮＡを含む溶液を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）で調製した溶液をインキュベートする工程を含むプロセスによって合成されるｃＤＮＡ組成物にさらに関する。

本発明は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用の組成物、かかる組成物を用いてエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する方法、及びかかる方法に使用されるキットにさらに関する。

本発明の実施の形態は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用の組成物であって、Ａ）コールドショックタンパク質、並びにＢ）ＲＮＡ基質及びエンドリボヌクレアーゼから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネントを含む、組成物に関する。本発明によるかかる実施の形態では、コールドショックタンパク質の一例はＣｓｐＡ又はそのホモローグであり、ＣｓｐＡの一例は大腸菌由来ＣｓｐＡである。好ましい実施の形態では、ＲＮＡ基質は１０２４塩基より長く、ほぼ等しい数の各々の塩基を含有する。かかるＲＮＡ基質の一例は、バクテリオファージＭＳ２のＲＮＡである。かかる実施の形態の組成物は、液体媒体をさらに含み得る。

本発明の別の実施の形態は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位を決定する方法であって、Ａ）コールドショックタンパク質、ＲＮＡ基質、及びエンドリボヌクレアーゼを含む混合物を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）の混合物をインキュベートする工程を含む、方法に関する。かかる方法は混合物を電気泳動によって解析することをさらに含み得る。

本発明のさらなる実施の形態は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の決定用のキットであって、コールドショックタンパク質及びＲＮＡ基質を含む、キットに関する。かかる実施の形態のキットは、反応緩衝液等の液体媒体をさらに含み得る。かかる実施の形態は、かかるキットの利用に関する紙若しくは電子形式の説明書をさらに含み得る。かかる実施の形態では、コールドショックタンパク質及びＲＮＡ基質は、個別に又は組み合わせて存在し得る。

本明細書中で使用される場合、コールドショックタンパク質とは、生物、特に微生物においてその生育温度が正常の温度から低下した際、コールドショックにさらされた際に発現誘導されるタンパク質の総称である。大腸菌の培養温度を３７℃から１５℃に低下させると、ＣｓｐＡというコールドショックタンパク質が一過性に高レベルで発現される。大腸菌にはＣｓｐＡとアミノ酸配列上の同一性があるＣｓｐＢ〜ＣｓｐＩの８種のタンパク質が知られているが、このうちのＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＩがコールドショックタンパク質である。さらに、これらのコールドショックタンパク質のホモローグがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＣｓｐＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＣｓｐＢ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（ＣｓｐＢ、ＣｓｐＬ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＣｓｐＬ）等の微生物にも存在していることが知られている。なお、本発明においてＣｓｐＡのホモローグとは、大腸菌由来ＣｓｐＡのアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するコールドショックタンパク質のことを言う。本発明には、これらのコールドショックタンパク質を使用することができる。本発明に使用されるコールドショックタンパク質としては、好ましくはＣｓｐＡが、より好ましくはグラム陰性菌由来のＣｓｐＡが、さらにより好ましくは大腸菌由来のＣｓｐＡが使用される。また、本発明に用いるＣｓｐＡは、ＤＮＡ組換技術によって生成されたものであっても微生物から単離されたものであっても良い。

ホモローグとは、対象のタンパク質と配列相同性を有し、好ましくは別のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を示し、構造特性又は生物学的機能において類似点を有する実体を意味する。

本明細書中で使用される場合、デオキシリボヌクレオチドとは、有機塩基に結合されているデオキシリボースにホスホエステル結合によって結合されたリン酸基からなる。天然型ＤＮＡは、４つの異なるヌクレオチドを含有する。アデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有するヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略される。デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。従って、デオキシリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）並びにそれらの誘導体を含む。デオキシリボヌクレオチド誘導体は、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ及び核酸分解に抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体は、例えば、３２Ｐ若しくは３５Ｓなどの放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分又は酵素で検出できるように標識されているデオキシリボヌクレオチドを含む。

本明細書中で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド三リン酸とは、その糖部分がデオキシリボースから成り、且つ三リン酸基を有するヌクレオチドのことを言う。天然型ＤＮＡは、各々が塩基部分としてアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンを有する４つの異なるヌクレオチドを含む。本発明の組成物中に含有されるデオキシリボヌクレオチド三リン酸は、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（deoxyribonucleotides triphosphate）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物である。本発明では、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の誘導体も同様に使用することができる。デオキシリボヌクレオチド三リン酸誘導体は、［・Ｓ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、及び核酸の消化に対して抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体はまた、例えば^３２Ｐ若しくは^３５Ｓ等の放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、又は酵素によって検出することができるように標識されているデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む。

本明細書中で使用される場合、反応緩衝液とは、緩衝剤又は緩衝剤混合物を含む溶液を意味し、二価陽イオン及び一価陽イオンをさらに含む場合もある。

「又は」という用語が本明細書中で使用される場合（例えばＡ又はＢ）、「Ａ又はＢ又はその両方」を意味することが意図される。本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」又は「the」という用語の使用は、量について限定することを意図しない。例えば、発明を実施するための形態における「コールドショックタンパク質」への言及は、「単一のコールドショックタンパク質」を意味することを意図せず、かかる言及は単一のコールドショックタンパク質又は複数のコールドショックタンパク質を包含し得る。

ＣｓｐＡの存在下又は非存在下で、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって増幅したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。ＨｉｎｄＩＩＩ消化λ ＤＮＡは「Ｍ」で印したレーンにおいて電気泳動されている。 ＣｓｐＡの存在下又は非存在下で、ＬＡ−ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ混合物によって増幅したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。ＨｉｎｄＩＩＩ消化λ ＤＮＡは「Ｍ」で印したレーンにおいて電気泳動されている。 ＣｓｐＡの存在下又は非存在下で、α型ＤＮＡポリメラーゼによって増幅したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。ＨｉｎｄＩＩＩ消化λ ＤＮＡは「Ｍ」で印したレーンにおいて電気泳動されている。 ＣｓｐＡの存在下又は非存在下で、様々な標的配列から増幅したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。１００ｂｐラダーマーカー（タカラバイオ社製）は「Ｍ」で印したレーンにおいて電気泳動されている。 熱処理ＣｓｐＡ又は非熱処理ＣｓｐＡの存在下で、ＬＡ−ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ混合物によって増幅したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。１００ｂｐラダーマーカーは「Ｍ」で印したレーンにおいて電気泳動されている。 非特異的な伸長産物のＣｓｐＡによる阻害効果を示す図である。 非特異的な伸長産物のＣｓｐＡによる阻害効果を示す図である。 非特異的な伸長産物のＣｓｐＡによる阻害効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。なお、図６〜図１２中のＭは、λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社）マーカー２．５μＬの電気泳動を行ったレーンであることを示す。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。なお、図１３中のＭは、λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社）マーカー２．５μＬの電気泳動を行ったレーンであることを示す。 ＭＳ２ ＲＮＡの二次構造及びＣｓｐＡのＭａｚＦ−ｍｔ３エンドリボヌクレアーゼ活性の増強を示す図である。図１４Ａは、ＭＦＯＬＤ（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html）によるＭＳ２ｓｓＲＮＡの予測二次構造を示す。３７℃での最小折り畳みエネルギーは−１４６０．６９ｋｃａｌ／モルである。矢印はプライマー伸長解析によって同定されたＭａｚＦ−ｍｔ３の切断部位を示し、青色の点線の矢印は、プライマー伸長解析によって検出されなかったＭａｚＦ−ｍｔ３の予測切断部位を示す。図１４Ｂは、ＲＮＡシャペロンＣｓｐＡによるエンドリボヌクレアーゼ活性の増強を示す。完全長ＭＳ２ ｍＲＮＡを、精製Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＭａｚＦ−ｍｔ３を用いて（レーン３、レーン４、レーン５、及びレーン６）又は用いずに（レーン１及びレーン２）、精製ＣｓｐＡタンパク質を用いて（レーン２及びレーン５、３２μｇ；レーン４、１６μｇ；レーン６、６４μｇ）又は用いずに（レーン１及びレーン３）、３７℃で部分的に消化した。消化反応混合物（１０μｌ）は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中、１．６μｇのＭＳ２ ＲＮＡ基質、１．６μｇのＭａｚＦ−ｍｔ３（Ｈｉｓ）_６、１６μｇ、３２μｇ又は６４μｇのＣｓｐＡ、及び０．５μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（Roche）から成っていた。反応産物は１．２％（１×ＴＢＥ）アガロースゲル上に流した。 ＭａｚＦ−ｍｔ３がＵＵＣＣＵ部位で特異的に切断を行うことを実証する、（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３によるＭＳ２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断を示す図である。レーン１はタンパク質を全く添加しなかった対照反応であり、レーン２はＣｓｐＡタンパク質のみを添加した対照反応であり、レーン３は（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３のみと共にインキュベートしたＭＳ２ ＲＮＡであり、レーン４は（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３及びＣｓｐＡタンパク質と共にインキュベートしたＭＳ２ ＲＮＡである。切断部位をＲＮＡ配列上の矢印で示すが、これらは右側に示すＲＮＡラダーを用いて決定した。図１５Ｈでは、ＲＮＡラダーはＣ残基（塩基３３９０）とＧ残基（塩基３３９４）との間で圧縮されていたが、配列を標準配列との上流領域及び下流領域の比較によって解明した。 ＭａｚＦ−ｍｔ３がＣＵＣＣＵ部位で特異的に切断を行うことを実証する、（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３を用いたＭＳ２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断を示す図である。レーン１は、タンパク質を全く添加しなかった対照反応であり、レーン２はＣｓｐＡタンパク質のみを添加した対照反応であり、レーン３は（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３のみと共にインキュベートしたＭＳ２ ＲＮＡであり、レーン４は（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３及びＣｓｐＡタンパク質と共にインキュベートしたＭＳ２ ＲＮＡである。強い切断部位及び弱い切断部位をＲＮＡ配列上の矢印で示すが、これらは右側に示すＲＮＡラダーを用いて決定した。 （Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ７を用いたＭＳ２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断を示す図である。レーン１は、酵素を全く添加しなかった対照反応であり、レーン２はＣｓｐＡタンパク質のみを添加した対照反応であり、レーン３は（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３のみと共にインキュベートしたＭＳ２ ＲＮＡであり、レーン４は（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３及びＣｓｐＡタンパク質と共にインキュベートしたＭＳ２ ＲＮＡである。強い切断部位及び弱い切断部位をＲＮＡ配列上の矢印で示すが、これらは右側に示すＲＮＡラダーを用いて決定した。

（１）本発明によるＤＮＡポリメラーゼを用いる改善されたＤＮＡ合成のための組成物
本発明の組成物は、コールドショックタンパク質又はそのホモローグ、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。驚くべきことに、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物を使用した場合に、コールドショックタンパク質の非存在下でのＤＮＡ合成反応と比較して、ＤＮＡ合成反応の反応性は向上していた。

本発明では、上記のＤＮＡ合成の反応性の向上とは、特に限定されるものではないが、非特異的増幅の減少、標的配列に由来する増幅産物の量の増大等を意味する。かかる向上は、反応混合物において合成される産物を従来の方法、例えばアガロースゲル上での電気泳動によって解析することにより定量化することができる。

本発明のＤＮＡ合成方法によると、ＤＮＡの非特異的合成が抑制される。従来、ＤＮＡ合成用の反応混合物は、非特異的反応の発生を防止するために反応開始まで低温下に維持しなければならないことが知られていた。本発明による組成物を使用することによって、室温に置いてある混合物を直接用いたＤＮＡ合成反応が可能となる。

本発明に使用することのできるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。本発明に利用可能なＤＮＡポリメラーゼとしては、真正細菌、例えばサーマス属又はバシラス属に属する細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼ（サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）、バシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）等に由来するＤＮＡポリメラーゼ）、古細菌、例えばパイロコッカス属又はサーモコッカス属に属するものに由来するＤＮＡポリメラーゼ（パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litralis）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）等に由来するＤＮＡポリメラーゼ）により例示される。本発明のＤＮＡ合成方法では、ＰＣＲにおいて使用することのできる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

２種以上のＤＮＡポリメラーゼが本発明の組成物に含まれる場合もある。例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない別のＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせを本発明において使用することができる。かかるＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを用いる技術は、ＬＡ−ＰＣＲ（長く正確な（Long and accurate）ＰＣＲ）として知られている。

本発明による組成物は、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼに加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び／又は反応緩衝液をさらに含み得る。

プライマーは、鋳型ＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。プライマーに関しては、本発明において使用される反応条件下で鋳型ＤＮＡに対してアニーリング可能であれば特に限定されない。

プライマーの長さは、特異的なアニーリングプロセスを行うため、少なくとも６ヌクレオチドであるのが好ましく、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドである。プライマーの長さは、オリゴヌクレオチド合成の観点から、好ましくは最大で１００ヌクレオチドであり、より好ましくは最大で３０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは既知の方法によって化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは天然源に由来するオリゴヌクレオチドであってもよく、例えば天然源から調製されたＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼによる消化によって調製され得る。

本発明の組成物は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のための混合物の調製に有用である。コールドショックタンパク質を含むＤＮＡ合成反応用の組成物、又はコールドショックタンパク質を含むＤＮＡ合成反応の促進剤も本発明の実施形態である。

（２）本発明によるＤＮＡポリメラーゼを用いる改善されたＤＮＡ合成のための方法
本発明のＤＮＡを合成する方法は、
Ａ）コールドショックタンパク質又はそのホモローグ、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び鋳型としてのＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びに
Ｂ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む。

本発明の方法によって、ＤＮＡ合成反応の反応性が、コールドショックタンパク質の非存在下でのＤＮＡ合成反応と比較して向上した。

鋳型としてのＤＮＡとは、プライマーがかかるＤＮＡにアニールする場合にＤＮＡ伸長のための鋳型として働くことのできるＤＮＡを意味する。本発明の方法のための混合物は単一の鋳型、又は異なる配列を有する複数の鋳型を含み得る。それぞれが特異的な鋳型に対するプライマー対を用いることで、各々の鋳型に対応する産物を同時に得ることができる。かかる複数の鋳型は、同じＤＮＡ分子に存在しても、又は異なるＤＮＡ分子中に存在してもよい。鋳型としてのＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。

本発明において使用されるコールドショックタンパク質の量は特に限定されず、反応混合物２５μｌ当たり０．５μｇ超、好ましくは２μｇ〜１５μｇ、より好ましくは５μｇ〜１２μｇであり得る。

本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼの量は特に限定されない。例えば、従来のＤＮＡ合成において使用されるのと同じ量であり得る。ＰＣＲに好ましいＤＮＡポリメラーゼの量は当業者に知られている。サーマス・アクアチクスに由来するＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲの場合、通常は反応混合物２５μｌ当たり０．１２５Ｕ〜５ＵのＤＮＡポリメラーゼが使用される。

本願において、市販のＤＮＡポリメラーゼの活性は、各々のＤＮＡポリメラーゼ製品に対する取扱説明書に示される単位に基づいて表される。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの活性は、２５ｍＭ ＴＡＰＳ（２５℃でのｐＨ９．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに１００μＭ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを含む５０μｌの最終容量を有する混合物を用いて決定される。１単位（以下「１Ｕ」と記載する）のＤＮＡポリメラーゼ活性は、「７４℃で３０分間に酸不溶性物質中に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを取り込むことの可能な酵素の量」として規定される。

本発明の方法において使用される各々のプライマーの量は特に限定されず、０．０５μＭ〜２μＭであり得る。

本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡ合成はＰＣＲ等のＤＮＡ増幅方法によって行われる。

（３）本発明によるＤＮＡポリメラーゼを用いる改善されたＤＮＡ合成のためのキット
本発明によるキットは、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明のキットに関しては、上記のＤＮＡ合成方法において使用可能であれば特に限定されない。本発明のキットは、核酸を標識化するためのキット、ＰＣＲのためのキット、核酸の評価のためのキット、部位特異的突然変異誘発のためのキット等であり得る。

本発明のキットは、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼに加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び／又は反応緩衝液をさらに含み得る。キットのコンポーネント（コールドショックタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び／又は反応緩衝液）としては、上記項目（１）に記載されるものを使用することができる。

キットは上記のコンポーネントを、各々のコンポーネントが独立したコンポーネントとして存在する状態、又は一部のコンポーネントが組み合わせられた状態で含み得る。一実施形態では、本発明のキットは上記（１）で記載される本発明の組成物を含む。

４）本発明による逆転写酵素を用いる改善されたｃＤＮＡ合成のための組成物
本発明の組成物は、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む。驚くべきことに、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む反応組成物を利用することにより、逆転写酵素のみを用いた場合に比べて逆転写反応の反応性が向上した。

逆転写反応の反応性の向上とは、特に限定するものではないが、例えば反応特異性の向上、核酸合成量の増大、及び合成鎖長の増大から選択される効果のことを言う。

特に本発明は、長鎖のｃＤＮＡの合成を目的とした逆転写反応の際に有用であり、目的とするｃＤＮＡの合成量が増加する。また、非特異的なｃＤＮＡの合成を抑えることもできる。従来、長鎖のｃＤＮＡ合成には、耐熱性の逆転写酵素を用いる高温での逆転写反応が効果的であると提唱されていた（例えば、国際公開第０１／９２５００号パンフレット）が、本発明によれば、逆転写反応を高温で行うことなく、長鎖のｃＤＮＡの合成を効率よく行うことができる。さらに、本発明は、高温での逆転写反応にも適用可能であり、種々の酵素を用いた逆転写反応を改善することが可能である。

本発明の組成物におけるＣｓｐＡの作用としては、低温時のミスプライミングの抑制による反応特異性の向上及び増幅量の増大や、ＲＮＡの２次構造の解消効果による伸長性の改善及び増幅量の増大が考えられる。

逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば本発明に使用でき、このような逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）やトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性の逆転写酵素が例示される。

本発明には、ウイルス由来の逆転写酵素が好適に使用され、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素がより好適に使用される。また、逆転写活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された逆転写酵素も本発明に使用できる。

本発明の組成物には、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素に加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド及び／又は反応緩衝液が含まれていても良い。

プライマーは、鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型となるＲＮＡに対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーはオリゴ（ｄＴ）等のオリゴヌクレオチドやランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（ランダムプライマー）であっても良い。

プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成出来る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等いかなる方法で合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。

なお、コールドショックタンパク質を含む逆転写反応用の組成物又はコールドショックタンパク質を含む逆転写反応の反応性促進剤も、本発明の態様の一つである。

５）本発明による逆転写酵素を用いる改善されたｃＤＮＡ合成の方法
本発明のｃＤＮＡの合成方法は、本発明の組成物を用いて、
Ａ）コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製する工程、及び
Ｂ）Ａ）工程で調製した溶液をインキュベートする工程を含む。

本発明のｃＤＮＡの合成方法により、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いた場合と比較して、逆転写反応の反応性が向上する。

逆転写反応の反応性向上は、例えばｃＤＮＡの合成量や合成鎖長を確認することにより、評価することができる。

逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの合成量は、例えば、逆転写反応後の反応液の一定量をリアルタイムＰＣＲに供し、目的とする核酸配列の合成量を定量することにより確認することができる。本発明の組成物を用いて逆転写反応を行なった場合、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いて逆転写反応を行なった場合と比較してｃＤＮＡの合成量が増大する。

逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの合成鎖長は、例えば、逆転写反応で用いたプライマーのプライミング領域下流近傍から増幅鎖長が異なる複数種類のプライマー対を設定し、各プライマー対を用いたＰＣＲに逆転写反応後の反応液の一定量をそれぞれ供し、その増幅産物量より確認することができる。本発明の組成物を用いて逆転写反応を行なった場合、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いて逆転写反応を行なった場合と比較して長鎖のｃＤＮＡの合成量が増大する。

鋳型となるＲＮＡは、プライマーがハイブリダイズした場合に、プライマーからの逆転写反応の鋳型として働くことができるＲＮＡである。本発明の組成物には、１種類の鋳型を含んでも、又は異なるヌクレオチド配列を有する複数種の鋳型が含まれていてもよい。特定の鋳型に特異的なプライマーを使用することによって、核酸混合物中の複数種の鋳型についてプライマー伸長産物を作製することができる。複数の鋳型は、異なる核酸内に存在しても、同一の核酸内に存在してもよい。

本発明に適用することができる鋳型となるＲＮＡとしては特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、又は特定のＲＮＡ分子群（例えば、共通の塩基配列モチーフを有するＲＮＡ分子群、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたＲＮＡ分子群）が挙げられ、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のＲＮＡが挙げられる。

本発明において、鋳型となるＲＮＡは、例えば細胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料に含有されたものであっても良く、該試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物に含有されたものであっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられる。

本発明の方法におけるコールドショックタンパク質の使用量は、特に限定はないが、反応液量２０μＬで逆転写反応を行う場合、好適には０．５〜２０μｇであり、より好適には１〜１０μｇであり、さらにより好適には２〜５μｇである。

本発明の方法における逆転写酵素の使用量は、特に限定はないが、例えば従来の逆転写反応において使用されていた量を使用すれば良い。例えばＭＭＬＶ由来逆転写酵素を用いて反応液量２０μＬで逆転写反応を行う場合、反応液中の該酵素量は１０Ｕ以上であり、ｃＤＮＡ合成効率の観点から、好ましくは１００Ｕ以上であり、更に好ましくは２００Ｕ以上である。従来の方法では、過剰量の逆転写酵素による反応阻害を避けるために鋳型ＲＮＡ量やｃＤＮＡ合成鎖長に応じて酵素量を調節する必要があったが、本発明の方法においてはその必要はない。

なお、本明細書に記載の逆転写酵素の活性は市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_{１２−１８}を鋳型／プライマーとし、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌの［^３Ｈ］ｄＴＴＰ を取り込む酵素活性を１Ｕとする。

本発明の方法におけるプライマーの濃度は、特に制限はないが、鋳型ＲＮＡからの最大限のｃＤＮＡ合成の観点から、特異的プライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは０．１μＭ以上、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは２．５μＭ以上、ランダムプライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは５μＭ以上の十分量のプライマー濃度で行えばよい。従来の方法では、過剰量のプライマーによる反応阻害を避けるために鋳型ＲＮＡ量やｃＤＮＡ合成鎖長に応じてプライマー量を調節する必要があったが、本発明の方法においてはその必要はない。

本発明のｃＤＮＡの合成方法は、好適には
Ａ）ＣｓｐＡ、逆転写酵素、少なくとも一種のリボヌクレオチド、少なくとも１種のプライマー、及び鋳型となるＲＮＡを混合し、反応組成物を調製する工程、及び
Ｂ）鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件でＡ）工程で調製した反応組成物をインキュベートする工程を含む。

鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件とは、特に限定するものではないが、温度条件としては３０℃〜６５℃が例示され、好適には３７℃〜５０℃であり、４２℃〜４５℃がより好適である。また、反応時間としては、５分〜１２０分が例示され、１５分〜６０分がより好適である。なお、本発明のｃＤＮＡの合成方法によれば、上記の温度条件に満たない温度に反応液を放置することに起因する、非特異的なプライマー伸長鎖の合成を抑制又は低減することができる。従って、本発明のｃＤＮＡの合成方法は、例えば、反応液の調製に長時間を要するような多検体を取り扱うｃＤＮＡの合成の際に、特に有用である。

なお、本発明の方法により得られたｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、ｃＤＮＡを増幅することが出来る。核酸増幅反応としては、特に限定するものではないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が例示される。

６）本発明による逆転写酵素を用いる改善されたｃＤＮＡ合成のためのキット
本発明のキットは、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む。本発明のキットにより、反応性が高い逆転写反応を行うことができる。本発明のキットとしては、逆転写反応に用いられるためのキットであれば特に限定されるものではなく、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での逆転写反応を行なうためのキットが挙げられる。具体的には、例えば、核酸標識用キット、ＲＴ−ＰＣＲ用キット、ｃＤＮＡ合成用キット、部位特異的変異導入用キット等が挙げられる。

本発明のキットには、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素に加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び／又は反応緩衝液が含まれていても良い。

コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び／又は反応緩衝液は、これらのうち一部又は全部が混合された状態でキットに包含されていても、それぞれが単独のコンポーネントの状態でキットに包含されていてもよい。

また、本発明のキットには、逆転写反応によって得られるｃＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応、例えばＰＣＲを行うための試薬がさらに含有されていても良い。このような試薬としては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、少なくとも一種のデオキシリボヌクレオチド、及び少なくとも一対のプライマー対が挙げられる。

本発明のキットに含まれるコールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び反応緩衝液としては、前記のものが例示される。

（７）本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用の組成物
本発明による組成物は、コールドショックタンパク質、ＲＮＡ基質、及びエンドリボヌクレアーゼを含む。３塩基より長い特異的配列を認識するエンドリボヌクレアーゼの切断特異性を決定する際には、考え得る標的配列の全てをカバーするほど十分に長いＲＮＡ基質を使用することが重要である。例えば、ＲＮＡが等しい数の各々の塩基を含有すると仮定すれば、ＲＮＡ基質は、考え得る５塩基切断部位の全てを含有するためには１０２４塩基（＝４^５）より長くなくてはならない。好ましくは、３５６９塩基から成り、極めて均等な塩基含量（２６％のＧ、２３％のＡ、２６％のＣ、及び２５％のＵ）を有するバクテリオファージＭＳ２ ＲＮＡが切断特異性を決定するための基質として使用され得る。

しかしながら、かかる長いＲＮＡを基質として用いる上で主要な問題は、それが一本鎖ＲＮＡではあるが、切断を妨げる可能性のある広範な安定した二次構造を形成することである（図１４Ａを参照されたい）。したがって、かかる長いＲＮＡを基質としてエンドリボヌクレアーゼに対して使用するためには、その二次構造は折り畳まれていない必要がある。

本発明は、これらの長いＲＮＡ基質の二次構造をほどくためにコールドショックタンパク質を利用する。コールドショックタンパク質は、これらの二次構造をほどくことによって切断が可能なＲＮＡの量を増大させ、したがってエンドリボヌクレアーゼ切断部位の決定に役立つ。好ましくは、コールドショックタンパク質の濃度は少なくとも０．４３ｍＭ、又はそうでなくともＲＮＡ基質を完全に飽和させるのに十分な濃度である。

ｍＲＮＡインターフェラーゼは、本発明において利用することのできるエンドリボヌクレアーゼの一例であるが、かかるエンドリボヌクレアーゼは一本鎖ＲＮＡを切断することが可能であれば特に限定されない。

（８）本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する方法
本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する別の方法は、
Ａ）コールドショックタンパク質、ＲＮＡ基質、及びエンドリボヌクレアーゼを含む混合物を調製する工程、並びに
Ｂ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む。

この本発明の方法によって、エンドリボヌクレアーゼの切断特異性を決定することができる。コールドショックタンパク質は、ＲＮＡにおける二次構造の形成を防止することによって、エンドリボヌクレアーゼによるＲＮＡ基質の切断を増強する。

好ましくは、混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。切断部位は、実施例１７に記載されるようにプライマー伸長解析によってｉｎ ｖｉｔｒｏで解析してもよい。

（９）本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用のキット
本発明によるキットは、コールドショックタンパク質及びＲＮＡ基質を含む。本発明のキットによると、エンドリボヌクレアーゼの切断部位は、対象のエンドリボヌクレアーゼをキットのコンポーネントと共にインキュベートすることによって決定され得る。本発明によるキットは、エンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定するために使用されるように設計されていれば特に限定されない。

以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。なお、下記実施例において各逆転写酵素の活性は、各逆転写酵素に添付の説明書の表示に基づいて示した。

調製例
ＣｓｐＡ溶液及び酵素保存バッファーの調製
ＣｓｐＡをＳ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）， １９９３， １１４， ６６３−６６９］に記載の方法に従って発現、精製した後、２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、及び１４．８μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（１４．８μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を調製した。

また、ＣｓｐＡを含まない酵素保存バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）についても調製した。

以下の実施例における酵素保存バッファーとしては、本調製例で調製したものを使用した。また、ＣｓｐＡ溶液としては、実施例６〜１１では本調製例において調製した２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用し、実施例１２〜１３では本調製例において調製した５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用し、実施例１〜５では本調製例において調製した１４．８μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用した。

菌株及びプラスミド
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を組み換えタンパク質発現に使用した。プラスミドｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ３及びｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ７を、ｐＥＴ−２８ａ（Novagen）からそれぞれ（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３及び（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ７を発現するように構築した。

大腸菌における（Ｈｉｓ）_６タグ付きＭａｚＦ−ｍｔ３及びＭａｚＦ−ｍｔ７の精製
Ｎ末端に（Ｈｉｓ）_６タグを付けたＭａｚＦ−ｍｔ３及びＭａｚＦ−ｍｔ７を、ｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ３及びｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ７を担持するＢＬ２１（ＤＥ３）株からＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Qiagen）を用いて精製した。

実施例１
５ｎｇ又は５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Clontech Laboratories, Inc.製）、ｐ５３遺伝子の２ｋｂＤＮＡ断片の増幅用のフォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）各々１０ｐｍｏｌ、０．６２５ＵのＴａＫａＲａ Ｔａｑ（Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、タカラバイオ社製）を含む、２５μｌの最終容量を有するＰＣＲ混合物を、ＴａＫａＲａ Ｔａｑに付属の反応バッファーを用いて、ＴａＫａＲａ Ｔａｑの取扱説明書に従って氷上調製した。上記の混合物に２μｇ、４μｇ、６μｇ、８μｇ、１０μｇ、１２μｇ、又は１４μｇのＣｓｐＡをそれぞれ添加した。また、ＣｓｐＡを含有しない混合物を対照として調製した。

このように調製した各々の混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＣＲを３０サイクル（１サイクルは９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間から成るプロセスを含む）で行った。反応終了後、各々３μｌの試料を１％アガロースゲル上で電気泳動し、各々の混合物中の増幅産物の長さ及び量を決定した。

図１に示すように、ＣｓｐＡを含有しない混合物においては長さ２ｋｂの産物は見られず、非特異的増幅による様々な長さの産物が観察された。これに対し、それぞれ４μｇ〜１４μｇのＣｓｐＡを含有する各々の混合物において、２ｋｂの産物がはっきりと観察された。６μｇ〜１０μｇのＣｓｐＡを含有する混合物中の産物の量は、他の混合物より多かった。この結果により、ＣｓｐＡが、混合物をＰＣＲ前に室温に放置することによって起こる非特異的増幅を低減することが明らかとなった。

実施例２
さらに、ＤＮＡポリメラーゼをＴａＫａＲａ ＴａｑからＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＬＡ−ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ混合物、タカラバイオ社製）に変更した以外は、実施例１に記載されるものと同じ実験を行った。ＬＡ−ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いても、本質的に同じ結果が得られた。６μｇ以上のＣｓｐＡを含有する混合物において、産物量の増加が観察された（図２を参照されたい）。

実施例３
５ｎｇ又は５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Clontech Laboratories, Inc.製）、ｐ５３遺伝子の２ｋｂＤＮＡ断片の増幅用のフォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）各々１０ｐｍｏｌ、０．６２５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（α型ＤＮＡポリメラーゼ、タカラバイオ社製）を含む、２５μｌの最終容量を有するＰＣＲ混合物を、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼに付属の反応バッファーを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの取扱説明書に従って氷上調製した。上記の混合物に０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、４μｇ、６μｇ、８μｇ、１０μｇ、１２μｇ、又は１４μｇのＣｓｐＡをそれぞれ添加した。また、ＣｓｐＡを含有しない混合物を対照として調製した。

このように調製した各々の混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＣＲを３０サイクル（１サイクルは９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間から成るプロセスを含む）で行った。反応終了後、各々３μｇの試料を１％アガロースゲル上で電気泳動し、各々の混合物中の増幅産物の長さ及び量を決定した。結果を図３に示す。

ＣｓｐＡを含有しない混合物において、長さ２ｋｂの産物に加えて、顕著な量の様々な長さの産物が観察された。ＣｓｐＡの非存在下で観察された非特異的増幅は減少し、２μｇ以上のＣｓｐＡを含有する混合物における２ｋｂ産物の量は増加した。

この結果により、ＣｓｐＡが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにおいても非特異的増幅を低減することが示された。

実施例４
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、０．６２５ＵのＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ、１０μｇのＣｓｐＡ、及びＴＰ５３遺伝子の５７５ｂｐ断片（配列番号３及び配列番号４）、Ｂｃ １２遺伝子の５９１ｂｐ断片（配列番号５及び配列番号６）、ＥＧＦＲ遺伝子の５２１ｂｐ断片（配列番号７及び配列番号８）、ＣＤＫ９遺伝子の３８０ｂｐ断片（配列番号９及び配列番号１０）、ＦＦＡＲ２遺伝子の１０１０ｂｐ断片（配列番号１１及び配列番号１２）、ＩＲＳ１遺伝子の５２０ｂｐ断片（配列番号１３及び配列番号１４）、又はＧＡＰ遺伝子の４６０ｂｐ断片（配列番号１５及び配列番号１６）の増幅用のプライマー対を含む、２５μｇの最終容量を有するＰＣＲ混合物をそれぞれ、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑに付属の反応バッファーを用いて、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑの取扱説明書に従って氷上調製した。ＣｓｐＡを含有しない混合物を同様に対照として調製した。

このように調製した各々の混合物を、２つの異なる条件下で３０サイクルのＰＣＲに供した。条件１では、１サイクルは９８℃で１０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で３０秒間から成るプロセスを含む。条件２では、１サイクルは９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間から成るプロセスを含む。反応終了後、各々３μｇの１０個の混合物を１％アガロースゲル上で電気泳動し、混合物中の増幅産物を解析した。

上記の反応において使用した全てのプライマーは、７０℃を超えるＴｍ値を有する。したがって、非特異的増幅を引き起こす傾向がある。実際に、条件１下での増幅特異性は、ＣｓｐＡの非存在下で顕著に低かった。しかしながら、ＣｓｐＡの存在下では、条件１及び条件２下で増幅した各々の混合物において、予想される産物のみが観察された（図４を参照されたい）。

この結果により、ＣｓｐＡがＰＣＲ増幅の特異性を増大させる能力を有し、核酸の特異的増幅に対するアニーリング温度の範囲を広げることができることが示される。

実施例５
１０μｇ／ｍｌのＣｓｐＡを含む溶液を２アリコート調製し、一方を９８℃で５分間処理した。実施例４に示すものと同じ組成を有するが、このように調製した熱処理ＣｓｐＡ又は非熱処理ＣｓｐＡを１０μｇ含むＰＣＲ混合物を調製した。このように調製した各々の混合物を、条件１下で３０サイクルのＰＣＲに供した。反応終了後、各々の混合物中の増幅産物を検査したところ、熱処理ＣｓｐＡと非熱処理ＣｓｐＡとで違いは観察されなかった。結果は図５に示す。この結果により、ＣｓｐＡの高い熱安定性が示唆される。

実施例６
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認
Ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇ（クロンテック社）を鋳型とし、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ（終濃度２．５μＭ）によりｃＤＮＡを合成するための逆転写反応液２０μＬをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて氷上調製した。その際、逆転写反応液の組成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに添付の説明書に記載の逆転写反応液の組成に加えて２μｇ ＣｓｐＡを含むものとした。また、対照として、ＣｓｐＡの代わりに酵素保存バッファー１μＬを加えたＣｓｐＡを含まない逆転写反応液についても調製した。次に、氷上調製したこれらの逆転写反応液について、０〜２０分間氷上放置した後、９５℃まで加熱して逆転写酵素を失活させた。続いて、０〜２０分間の氷上放置によりそれぞれの溶液に生成したｃＤＮＡ量を確認するため、これらの反応液のうちそれぞれ２μＬを、ディストロフィン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００４００６）のＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９塩基（６５２９−６６６７）、及びＰｏｌｙＡの近傍から６９３０塩基の鎖長（６５２９−１３４５８）をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲに供した。

上記１３９塩基をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲは、プライマーとして配列番号１７の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１８の塩基配列からなるプライマーを用い、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いて添付の説明書の推奨条件に従って行った。一方、上記６９３０塩基をターゲットとした長鎖のリアルタイムＰＣＲは、プライマーとして配列番号１７の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１９の塩基配列からなるプライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬ（タカラバイオ社）及びＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ（タカラバイオ社）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲの反応液は、最終濃度が×０．３３となるようにＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉを加えた点以外はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬに添付の説明書に記載の高速ＰＣＲプロトコールの反応液組成に従って調製した。また、リアルタイムＰＣＲは、９８℃で１０秒間のインキュベートの後、９８℃で５秒〜６８℃で２分を１サイクルとした４０サイクルの条件で実施した。なお、本明細書に記載のいずれの逆転写の実施例においても、リアルタイムＰＣＲにはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（タカラバイオ社）を使用した。また、検量線は、上記領域を含む１３５４２塩基（１７３−１３７１４）のｃＤＮＡをｐＵＣ１１８のＨｉｎｃ ＩＩサイトにクローン化したプラスミドの希釈系列を用いて作成した。

その結果、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は、逆転写反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。一方、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ量は、逆転写反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合には氷上放置時間が長くなるに従い増加した。これに対し、逆転写反応液中にＣｓｐＡが存在する場合は、同領域のｃＤＮＡ量がほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量は反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の４０分の１であった（図６）。ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は検出されないことから、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ合成産物は、ＰｏｌｙＡから伸長した産物ではなくＰｏｌｙＡ以外からの非特異的な伸長産物であることが分かる。このような非特異的な伸長産物は、完全長のｃＤＮＡを得る目的においてはバックグランドとなる。また、この非特異的な伸長産物は、ＰｏｌｙＡからＲＮＡの５′端までの伸長反応を阻害し、不完全長のｃＤＮＡ合成産物の増加をもたらす。

本実施例において、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるｐｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。

実施例７
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（インビトロジェン）を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅに添付の説明書に沿って２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ及び対照のＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は、実施例６と同様の方法で、ＣｓｐＡの効果を検討した。なお、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅはＭＭＬＶ由来逆転写酵素の変異体である。

その結果、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いた場合も、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。また、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ産物量は、反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合は氷上放置時間が長くなるに従い増加するのに対し、反応液中にＣｓｐＡが存在する場合はほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量が反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の８７分の１であった（図２）。以上のことより、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いても、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。

実施例８
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（タカラバイオ社）を用い、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社）１μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １．６μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２５Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） ０．８μＬ、及び２μｇ／μＬのＣｓｐＡ １μＬを含む逆転写反応液２０μＬを調製する点、並びにこの反応液の対照としてＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は、実施例６と同様の方法で、ＣｓｐＡの効果を検討した。なお、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）は、ＡＭＶ由来逆転写酵素である。

その結果、逆転写酵素にＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）を用いた場合も、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は、反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。また、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ産物量は、反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合は氷上放置時間が長くなるに従い増加するのに対し、反応液中にＣｓｐＡが存在する場合はほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量は反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の８４分の１であった（図８）。以上のことから、ＡＭＶ由来逆転写酵素を用いても、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。

実施例９
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ、及びＣｓｐＡを含まない対照の逆転写反応液２０μＬを、実施例１と同様の方法で調製した。氷上調製した反応液は、０〜２０分間氷上放置した後、４２℃で３０分の条件で逆転写反応を行ない、９５℃で５分間加熱し反応を中止した。この反応液のうち２μＬについて、ディストロフィン遺伝子のＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲを実施例６と同様の方法で行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ量を定量した。

その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの６９３０塩基の長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の５２％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では２０分氷上放置してもｃＤＮＡ合成量は全く減少しなかった（図９）。このＣｓｐＡの効果は、反応液中のＣｓｐＡによりＰｏｌｙＡ以外からの非特異的な伸長反応がほぼ完全に抑制され、ＰｏｌｙＡからの伸長反応阻害が起こらなかったことに起因すると考えられる。

以上の結果から、反応液中のＣｓｐＡにより、反応液調製後、逆転写反応するまでに要する時間を気にする必要がなく、ＰｏｌｙＡからのｃＤＮＡ合成において極めてバックグランドが少なく、完全長の割合が高い高品質なｃＤＮＡ合成反応が可能であることが分かった。

実施例１０
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害２
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（インビトロジェン社）を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅに添付の説明書に沿って２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ及び対照のＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点、並びに５０℃で３０分の条件で逆転写反応を行い、７０℃で１５分間加熱し反応を中止する点以外は実施例９と同様の方法で試験を行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ量を定量し、ＣｓｐＡの効果を確認した。

その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の１１％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では、２０分氷上放置しても氷上放置しない場合と比較して８０％のｃＤＮＡ合成量を保った（図１０）。本実施例により、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いた場合であっても、ＣｓｐＡが逆転写反応液調製や氷上放置によるＰｏｌｙＡからの長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害を抑制することが確認できた。

実施例１１
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（タカラバイオ社）を用い、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社） １μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １．６μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２５Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） ０．８μＬ、及び２μｇ／μＬのＣｓｐＡ １μＬを含む逆転写反応液２０μＬ、並びにこの反応液の対照としてＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は実施例９と同様の方法で試験を行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ合成量を定量し、ＣｓｐＡの効果を確認した。

その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の３３％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では、２０分氷上放置しても氷上放置しない場合と比較して７５％のｃＤＮＡ合成量を保った（図１１）。本実施例により、ＡＭＶ由来逆転写酵素を用いた場合であっても、ＣｓｐＡが逆転写反応液調製や氷上放置によるＰｏｌｙＡからの長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害を抑制することが確認できた。

実施例１２
未変性ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応に及ぼすＣｓｐＡの効果
調製例で調製した５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を酵素保存バッファーで希釈し、０．２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、１μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、及び２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を調製した。次に、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社） １μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各１０ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １μＬ、及び滅菌蒸留水６μＬに、酵素保存バッファーを１μＬ、及び０．２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、１μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、又は５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を１μＬ加えた計１０μＬの混合液をそれぞれ調製した。酵素保存バッファーを用いて調製したＣｓｐＡを含まない混合液については、６５℃で５分のＲＮＡ変性処理を行った場合と行わない場合の２種類の試料を調製し、ＣｓｐＡを含む各混合液についてはＲＮＡの変性処理を行わなかった。

これらの混合液各１０μＬに対し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）に含まれる５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２００Ｕ／μＬのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ ０．５μＬ、及び滅菌蒸留水５μＬを添加して計２０μＬの反応液を調製した後、４２℃で３０分の逆転写反応を行い、９５℃で５分の加熱により反応を中止した。次に、これらの反応液各２．５μＬを、ディストロフィン遺伝子の約８ｋｂの領域をターゲットとするＰＣＲに供した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（登録商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いて添付の説明書記載の反応組成により行った。プライマーとしては、配列番号２０の塩基配列からなるプライマーと配列番号２１の塩基配列からなるプライマーを用い、ＰＣＲ反応液中の各プライマーの濃度は、２００ｎＭとした。また、ＰＣＲは、９８℃で１０秒〜６８℃で８分を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ条件で、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）（タカラバイオ社）を用いて実施した。ＰＣＲ反応終了後、反応液のうち３μＬをアガロースゲル電気泳動に供して増幅鎖長と増幅量を確認し、各逆転写反応におけるｃＤＮＡ合成量と反応特異性を評価した（図１２）。

その結果、未変性のＲＮＡを鋳型とした逆転写反応において、反応液中にＣｓｐＡを添加することで、その後のＰＣＲにより確認できる約８ｋｂの長鎖のｃＤＮＡの増幅量が大きく増加するとともにターゲット以外のＤＮＡの増幅量が減少した（図１２）。以上のことより、ＲＮＡの変性操作を行わなくても反応液中にＣｓｐＡを加えることで効率よく、かつ高い特異性でｃＤＮＡ合成されることが示された。

実施例１３
１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲに及ぼすＣｓｐＡの効果
５ｎｇ又は５０ｎｇのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社）を鋳型として用い、ディストロフィン遺伝子の約２ｋｂの領域をターゲットとする１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲについて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて行った。プライマーとしては、配列番号２１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２２の塩基配列を有するプライマーを用いた。１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲの反応液の組成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔに添付の説明書に記載の組成に加えて、５μｇのＣｓｐＡを２５μＬの反応液に加えた。また、対照として、５μｇ ＣｓｐＡの代わりに酵素保存バッファー１μＬを加えたＣｓｐＡを含まない反応液と、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ）溶液（ＵＳＢ社）（５μｇ／μＬ ＳＳＢ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を１μＬ加えた反応液についても調製した。それぞれの反応液について、４２℃で３０分の逆転写反応、９４℃で２分の熱処理を行った後、９４℃で３０秒〜５５℃で３０秒〜７２℃で２分を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ反応をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）で行った。反応終了後、反応液のうち３μＬを１％アガロースゲル電気泳動に供して、反応産物を解析した（図１３）。

その結果、ＣｓｐＡを添加することにより約２ｋｂの目的サイズ以外の非特異的な増幅産物が著しく減少した。一方、ＳＳＢを添加した場合、目的サイズの増幅産物は得られなかった。

実施例１４
ＲＴ−ＰＣＲ反応における、反応の収率及び特異性を向上するＣｓｐＡの効果
ヒト心臓ＲＮＡを反応の鋳型として使用し、ＲＴ−ＰＣＲの標的はジストロフィン２とした。反応はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ、リボヌクレアーゼ阻害剤、ＥｘＴａｑ ＨＳ又はＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍａｘ、オリゴヌクレオチドの存在下で行った。ＣｓｐＡを用いて又は用いずに複製反応を行った。４２℃又は５０℃といった異なる温度でも試験した。ＣｓｐＡの存在下で非特異的産物が減少すると共に、ＣｓｐＡ量の増加（１０μｌの反応物当たり最大で２．５μｇのＣｓｐＡ）に伴って産物の収率が向上することが観察された。ＣｓｐＡは４２℃及び５０℃といったより高い温度でも活性であった。ＣｓｐＡを用いた結果は、ＲＮＡ中の二次構造を熱処理によって不安定化した反応と同等であることが見出された。

実施例１５
ｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ３によって発現された（Ｈｉｓ）_６ＭａｚＦ−ｍｔ３タンパク質を、Ｎｉ−ニトリロ三酢酸樹脂を用いて精製した。精製ＭａｚＦ−ｍｔ３をＣｓｐＡの非存在下でＭＳ２ ＲＮＡと共にインキュベートしたところ、ＲＮＡの部分的な切断が観察された（レーン３）（図１４Ｂ）。反応混合物に添加したＣｓｐＡタンパク質の量の増加に伴い、ＭＳ２ ＲＮＡ基質の切断が増強した（レーン４〜レーン６）。最高濃度のＣｓｐＡでは、完全長ＭＳ２ ＲＮＡは検出されなかった（レーン６）。この濃度（０．８６ｍＭ）は、ＲＮＡ結合に対するＣｓｐＡのＫｄ値よりも（that）３２倍高く、６塩基毎にＲＮＡに結合するＣｓｐＡによってＭＳ２ ＲＮＡがほぼ完全に飽和したことを示している。これらの結果により、ＭａｚＦ−ｍｔ３が、ＣｓｐＡがＭＳ２の二次構造をほどく際に生成する一本鎖ＲＮＡを切断可能なｍＲＮＡインターフェラーゼであることも実証される。

実施例１５
ＭａｚＦ−−ｍｔ３はＲＮＡをＣＵＣＣＵ及びＵＵＣＣＵで特異的に切断する
ＭＳ２ ＲＮＡにおけるＭａｚＦ−ｍｔ３の切断部位を決定するために、０．４３ｍＭ ＣｓｐＡの存在下で反応混合物を用いてプライマー伸長実験を行った。全ＭＳ２ ＲＮＡ配列をカバーするために、合計で２２種のプライマーをプライマー伸長実験のために合成した。図１５Ａ〜図１５Ｈに示すように、ＣｓｐＡの添加はほとんどの場合、ＲＮＡ切断を有意に増強した。特に、図１５Ｆに示す切断部位に関しては、ＲＮＡ切断はＣｓｐＡの存在下でしか検出可能でなかった。塩基１０２８（図１５Ｂ）でのＲＮＡ切断はＣｓｐＡの存在下で減少するようであるが、これはプライマー結合部位と上流の切断部位との間に位置する、塩基１０２８にある切断部位のすぐ下流の塩基１０７８にある部位の切断が増強したためである。このＣｓｐＡの存在下で高度に増強された塩基１０７８にある切断部位を、図１５Ｃに示す。これらの実験によって、表２に挙げるように８つの切断部位が同定された。これらの切断部位によるコンセンサス配列はＣＵＣＣＵであり、ここでＭａｚＦ−ｍｔ３は２番目のＵ残基と３番目のＣ残基との間で切断を行う。８つのＭａｚＦ−ｍｔ３切断部位を同定したが、公開されたＭＳ２配列（ＮＣＢＩのウェブサイト）によると、ＭＳ２ ＲＮＡには９つのＣＵＣＣＵ配列がある。したがって９番目のＣＵＣＣＵ配列を含有する領域のリシークエンシングを行い、該領域中にＣＵＣＣＵ配列がないことを見出した。これらの実験において使用したＭＳ２ ＲＮＡ（Roche）は、ＣＵＣＣＵの代わりにＣＣＵＣＵ（塩基２１５８〜塩基２１６２）を含有していた。したがって、ＭＳ２ ＲＮＡ中の全てのＣＵＣＣＵ配列はＭａｚＦ−ｍｔ３によって切断されていた。

図１６Ａ〜図１６Ｄに示されるように、図１５に見られるものとは異なる他の４つの切断部位が検出された。これらのプライマー伸長実験によるコンセンサス配列はＵＵＣＣＵであり、ここでＭａｚＦ−ｍｔ３は２番目のＵ残基と３番目のＣ残基との間で切断を行う。ＭＳ２ ＲＮＡには５つのＵＵＣＣＵ配列があり、その全てがＲＮＡシークエンシングによって確認された。ＭａｚＦ−ｍｔ３に関する全ての切断部位を図１Ａに矢印で示す。

実施例１６
ＭａｚＦ−ｍｔ７も配列特異的ｍＲＮＡインターフェラーゼである
本明細書中に記載されるＭＳ２ ＲＮＡ−ＣｓｐＡ系を使用して、ＭａｚＦ−ｍｔ７の特異的切断部位を同定した。精製Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＭａｚＦ−ｍｔ７を用いて、プライマー伸長実験を行ったが、その結果を図１７Ａ〜図１７Ｒに示し、表３に要約する。大半の切断部位がＵＣＧＣＵ配列を含有しており（図１７Ａ〜図１７Ｋ）、ここでＭａｚＦ−ｍｔ７は１番目のＵと２番目のＣとの間で切断を行う。一部の切断部位はコンセンサスＵＣＧＣＵとの１塩基ミスマッチを有し（図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｈ、及び図１７Ｌ〜図１７Ｐ）、幾つかの切断部位は２塩基ミスマッチを有する（図１７Ｇ、図１７Ｎ、図１７Ｑ、図１７Ｒ）。しかしながら、これらの切断部位は全て、中央のＧ残基を共通して有し、その大半が中央のＧ残基に続くＣ残基も有している。したがって、ＭａｚＦ−ｍｔ７は、５塩基Ｕ・ＣＧＣＵ配列を認識するｍＲＮＡインターフェラーゼであることが判明したが、ＭａｚＦ−ｍｔ３よりも厳密ではないようである。

実施例１７
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプライマー伸長解析
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡ切断部位のプライマー伸長解析のために、完全長ＭＳ２ ｍＲＮＡを精製毒素タンパク質（ＭａｚＦ−ｍｔ３又はＭａｚＦ−ｍｔ７）を用いて又は用いずに、また、精製ＣｓｐＡタンパク質を用いて又は用いずに、３７℃で１５分部分的に消化した。消化反応混合物（１０μｌ）は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中、０．８μｇのＭＳ２ ＲＮＡ基質、０．０６２５μｇのＭａｚＦ−ｍｔ３（Ｈｉｓ）_６又はＭａｚＦ−ｍｔ７（Ｈｉｓ）_６、３２１μｇのＣｓｐＡ、及び０．５μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（Roche）から成るものであった。プライマー伸長を２０μｌの反応混合物中、４７℃で１時間行った。１２μｌのシークエンシングローディングバッファー（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、及び０．０５％キシレンシアノールＥＦ）を添加することによって反応を停止した。試料を９０℃で５分間インキュベートした後、６％ポリアクリルアミド及び３６％尿素ゲル上で電気泳動を行った。ＭＳ２ ｍＲＮＡのプライマー伸長解析に使用したプライマーを表１に挙げる。プライマーは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［・−^３２Ｐ］ＡＴＰで５’標識した。

Claims (11)

1. ＤＮＡを合成する方法であって、
   Ａ）大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びに
   Ｂ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む、方法
   ただし室温に置いた混合物を直接、工程Ｂ）に供することを特徴とする。
2. ＤＮＡの合成はＰＣＲによって行われる、請求項１に記載の方法。
3. 請求項１に記載のＤＮＡを合成する方法に用いられるＤＮＡ合成用のキットであって、
   Ａ）大腸菌由来のＣｓｐＡ、
   Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸から成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びに
   Ｃ）反応緩衝液を含む、キット。
4. 各々のコンポーネントは個別に存在する、請求項３に記載のキット。
5. 少なくとも２つのコンポーネントが組み合わせてある、請求項３に記載のキット。
6. 請求項１に記載のＤＮＡを合成する方法に用いられるＤＮＡ合成用組成物であって、大腸菌由来のＣｓｐＡ、及びＤＮＡポリメラーゼを含む、組成物。
7. さらに、少なくとも１つのさらなるＤＮＡポリメラーゼを含む請求項６の組成物。
8. 少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、且つ少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しないことを特徴とする請求項７の組成物。
9. 少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸をさらに含む請求項６に記載の組成物。
10. 反応緩衝液をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
11. 組成物２５μＬ当たり０．５μｇ超のＣｓｐＡを含む、請求項６に記載の組成物。