KR20080049733A - 미소구체 현탁 혼성화의 정량 및 이의 용도 - Google Patents
미소구체 현탁 혼성화의 정량 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20080049733A KR20080049733A KR1020087005624A KR20087005624A KR20080049733A KR 20080049733 A KR20080049733 A KR 20080049733A KR 1020087005624 A KR1020087005624 A KR 1020087005624A KR 20087005624 A KR20087005624 A KR 20087005624A KR 20080049733 A KR20080049733 A KR 20080049733A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- probe
- nucleic acid
- target
- probes
- hybridization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 206
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 148
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 title abstract description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 457
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 135
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 97
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims abstract description 46
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 102
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 79
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 79
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 65
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 49
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 47
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 34
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 33
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 25
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 20
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 18
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 claims description 16
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 14
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 claims description 13
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 13
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 11
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 10
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 5
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 3
- LLFSWQMTYLRPFY-UHFFFAOYSA-N [6-[(2-chloroacetyl)amino]hexylamino]phosphonous acid Chemical compound C(CCCNP(O)O)CCNC(=O)CCl LLFSWQMTYLRPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 claims description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 claims description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 claims description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 claims description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 66
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 59
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 42
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 36
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 25
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 abstract description 16
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 abstract description 15
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 abstract description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 11
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 abstract 1
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 abstract 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 97
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 43
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 24
- 102100034889 Homeobox protein Hox-B1 Human genes 0.000 description 21
- 101001019745 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B1 Proteins 0.000 description 21
- 208000009575 Angelman syndrome Diseases 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 13
- 101000655322 Homo sapiens Tektin-3 Proteins 0.000 description 12
- 102100032941 Tektin-3 Human genes 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 201000009009 Charcot-Marie-Tooth disease type 1A Diseases 0.000 description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 10
- 101000823316 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 description 9
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102100033432 Gamma-tubulin complex component 5 Human genes 0.000 description 8
- 101000926904 Homo sapiens Gamma-tubulin complex component 5 Proteins 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 101001000631 Homo sapiens Peripheral myelin protein 22 Proteins 0.000 description 7
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102100035917 Peripheral myelin protein 22 Human genes 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001082860 Homo sapiens Peroxisomal membrane protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical group O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 5
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010092552 carbodiimide binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 4
- 238000003491 array Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 4
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 3
- ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;methanol Chemical compound OC.CC(O)=O ZCHPKWUIAASXPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 2
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010068052 Mosaicism Diseases 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001165050 Ocala Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 2
- 208000037280 Trisomy Diseases 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091029845 Aminoallyl nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000031639 Chromosome Deletion Diseases 0.000 description 1
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000029767 Congenital, Hereditary, and Neonatal Diseases and Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001503513 Helicobacter bilis Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100268646 Homo sapiens ABL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100071843 Mus musculus Hoxb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101100384865 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cot-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 1
- 108010041758 cleavase Proteins 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000000661 isochromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 1
- 230000037435 normal mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 102000015380 snRNP Core Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010039827 snRNP Core Proteins Proteins 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/157—A reaction step characterised by the number of molecules incorporated or released
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2545/00—Reactions characterised by their quantitative nature
- C12Q2545/10—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis
- C12Q2545/114—Reactions characterised by their quantitative nature the purpose being quantitative analysis involving a quantitation step
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/155—Particles of a defined size, e.g. nanoparticles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/626—Detection means characterised by use of a special device being a flow cytometer
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
유세포분석법으로 핵산 사본 수를 결정하는데 신규한 현탁 혼성화 측정검사가 이용되었다. 이러한 측정검사는 스펙트럼 상이한 폴리스티렌 미소구체에 공액된 100 내지 2304 bp 범위의 적은 사본(Ic) 산물로 확인되었다. 본 명세서에 제공된 실시예에서, 이들 공액된 미소구체는 세포유전학적 세포 덩어리로부터 추출되고 비오틴-dUTP로 표지된 게놈 DNA 내에서 상동성 서열을 탐지하는 복합 혼성화 프로브로서 이용되었다. 혼성화는 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘으로 탐지하고 유세포분석법으로 분석하였다. 사본 수 차이는 검사 프로브의 평균 형광 강도를 환자 샘플과 비정상적 세포주의 게놈 DNA 내에서 이배체 참고 프로브와 비교함으로써 구별할 수 있었다. 상기 측정검사는 염색체 배경에 상관없이, 검사 좌위에서 단일 대립유전자와 3개의 대립유전자를 이대립형질(biallelic) 참고 서열과 구별할 수 있다. 상기 측정검사는 좌위-특이적 표적 DNA의 사전 증폭을 필요로 하는 기존 방법에서 향상된 것인데, 그 이유는 Ic 프로브가 상동성 표적의 정확한 사본 수 결정을 위한 적절한 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)을 제공하기 때문이다. 높은 민감성과 정확성으로 인하여, 이러한 측정검사는 인간, 동물 질병 모형, 용액에서 게놈 사본 수의 결정, 전사체 수준의 측정, 법의학적 DNA 분석, 농업에서 품질 관리 분석을 비롯한 다양한 목적으로 핵산 사본 수의 결정에 유용하다.
현탁 혼성화
Description
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2005년 8월 16일자 제출된 U.S. 가출원 No. 60/708,734에 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 명세서에 참조로서 편입되는 인쇄된 서열 목록은 본 출원에 동반되고, 플로피 디스켓에 담긴 컴퓨터-판독가능 ASCII 파일 형태로 동일한 내용이 제출되었다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 적은 사본 핵산 혼성화 프로브를 이용한 염색체 비정상의 탐지를 위한 재료와 방법에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 미소구체-공액된, 적은 사본 핵산 프로브의 표지된 표적 핵산에 혼성화(hybridization)를 통하여 핵산 서열 내에서 염색체 비정상의 정량에 관계한다. 이보다 더욱 구체적으로, 본 발명은 스펙트럼 인코딩된 미소구체를 적은 사본 또는 단일 사본 핵산 프로브에 공액하고, 상기 프로브를 개체-유래된 핵산으로부터 직접적으로 제조된 형광색소-표지된 표적에 혼성화시키고, 혼성화 반응의 산물을 탐지하고, 탐지된 반응을 유사하게 혼성화 된 참고 프로브에 의해 산출된 탐지된 반응과 비교함으로써 상기 탐지된 반응을 정량하는 단계를 포함하는 방법에 관계한다.
인간 질환의 진단이나 소인(predisposition)은 종종, 게놈 또는 전사체(transcriptome) 내에서 특이적 핵산 서열의 정량에 의존한다. 수치적, 구조적 염색체 비정상을 탐지하는 현재의 방법에는 염색체 밴딩(chromosomal banding), 형광 in situ 혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH), 어레이 비교 게놈 혼성화(array comparative genomic hybridization, aCGH)와 다른 마이크로어레이 기술, 복합 증폭가능 프로브 혼성화(multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH), 복합 결찰-의존성 혼성화(multiplex ligation-dependent hybridization, MLPA), 서던 분석(Southern analysis), 정량적 중합효소 연쇄 반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)이 포함된다. cDNA의 혼성화에 의한 유전자 발현(gene expression)의 정량은 전형적으로, 마이크로어레이 분석으로 수행된다(Brown et al Science 270:467-70, 1995).
수치적 비정상은 염색체 밴딩으로 용이하게 탐지되지만 구조적 비정상, 예를 들면, 결실 또는 중복은 염색체 밴딩으로 신뢰성 있게 탐지하려면 대규모(~3-5Mb)의 실질적으로 파괴된 밴딩 패턴(banding pattern)이 존재해야 한다. FISH와 서던 분석은 대량의 환자 재료를 필요로 하고, 시간-소모적 실험 절차를 수반하며, 달성되는 탐지 수준이 ~20kb 내지 650kb이다. aCGH의 분해능은 클론된 프로브의 크기와 밀도(서열 정렬의 경우 ~ 40kb 및 결실의 경우 70-130kb)(Shaffer and Bejjani, Hum. Reprod Update, 10(3):221-6 (2004))에 제한되고, 형광 신호의 변이성(variability)은 해석의 정확도에 영향을 줄 수 있다(Oostlander et al., Clin. Genet, 66(6):448-95 (2004)). MAPH는 대략 50kb의 분해능을 보유하고(Armour et al., Nucleic Acid Res., 28(2):605-09 (2000)), MLPA는 다른 기술보다 높은 분해능을 보유하긴 하지만 시간 소모가 많고 결찰 부위(ligation site) 주변에서 단일 뉴클레오티드 다형성에 민감한데, 이는 가음성(false negative) 결과를 초래할 수 있다. qPCR과 유사하게, 오염을 예방하기 위하여 주의가 요구되고(Schouten et al., Nucleic Acid Res., 30(12):e57 (2002)), 이들 중에서 어떤 기술도 용이하게 복합되지 않는다(즉, 단일 반응에서 복수 프로브 세트 통합).
합성 DNA 서열에 결합된, 스펙트럼 인코딩된 폴리스티렌 미소구체의 현탁액은 U.S. Patent No. 5,736,330, 5,981,180, 6,057,107에 기술된 바와 같이, 핵산 표적 서열에 혼성화되고 통상적인 유세포분석법으로 탐지될 수 있다. 이들 측정검사에서는 표적 DNA에 혼성화를 위한 10-50개의 뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 미소구체-기초된 측정검사의 유세포분석을 위한 다른 복합된 데이터 획득과 분석 플랫폼은 공지되었다(Fulton et al., Clin. Chem., 43(9):1749-56 (1997)). 표준 핵산 혼성화 측정검사 역시 당분야에 널리 공지되어 있고, 표지된 핵산 프로브를 이용하여 표지되지 않은 핵산 분자의 복합 혼합물 내에서 관련된 표적 DNA 또는 RNA 분자를 확인하는 단계를 수반한다. 미소구체 혼성화는 환경 샘플(environmental sample) 내에서 미생물로부터 증폭된 리보좀 서열의 존재비(abundance)를 정량하는데 정확할 뿐만 아니라 민감하다(Spiro et al. Applied and Environmental Microbiology, 2000, p.4258-4265, Vol. 66, No. 10). 하지만, 현재의 측정검사는 프로브와의 혼성화에 앞서 표적 DNA의 증폭을 필요로 하고, 현재의 프로브는 환자 DNA 샘플로부터 직접적으로 게놈 사본 수를 정확하게 정량하는데 적절한 특이성과 민감성을 제공하지 못한다. 측정검사에 앞서 표적 DNA의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭은 탐지되는 각 서열에서 완결까지 최대 5시간이 소요될 수 있고, FISH 분석이 이용되는 경우에, 혼성화, 탐지, 분석 절차는 각 샘플에서 프로브당 최대 2일이 소요될 수 있다. 부가적으로, 필수 증폭 단계는 표적 서열의 염색체 사본 수 추정을 어렵게 할 수 있는데, 그 이유는 이러한 증폭이 내재적으로 대수적(logarithmic)이고 통제하기 어렵기 때문이다. 하지만, 증폭되지 않은 게놈 DNA를 직접적으로 분석하는 기존의 시도는 성공적이지 못했다(Borucki et al., J. CHn. Microbiol, 43(7):3255-59 (2005)).
아래의 선행 기술은 본 발명과 구별되는데, 그 이유는 하기의 모든 방법에서, 표적 샘플의 사전 증폭이 요구되고, 미소구체에 결합된 프로브가 모든 사례에서 단일 사본 또는 적은 사본으로 정의되지 않는 올리고뉴클레오티드이었기 때문이다. 게놈 또는 전사체 내에서 고도로 반복되는 서열은 신뢰성 있는 탐지를 위하여 증폭을 반드시 필요로 하지는 않지만, 대형의 복합적인 게놈 내에서 단일 사본 또는 적은 사본 수 서열은 탐지를 위한 적절한 민감성을 확보하기 위하여 이러한 조작을 필요로 한다. 아래는 미소구체 현탁 혼성화와 관련된 공개된 문헌과 특허된 문헌의 목록이다. 아래에 기재된 특허는 본 발명과 구별되는데, 그 이유는 이들 특허가 핵산 표적 내에서 서열의 사본 수의 직접적인 정량의 측면에서 불가능하기 때 문이다.
a. 스펙트럼 인코딩된 미소구체-공액된 분석물 분석: US Pat 6,649,414, 6,449,562, 6,395,470
b. 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR과 DNA의 탐지: US Pat 6,057,107, 6,060,240, 5,981,180, 5,736,330, 6,916,661, 5,981,18
c. PCR-증폭된 DNA에 올리고뉴클레오티드 서열의 혼성화를 수반하는 미소구체 현탁 어레이 혼성화 기술: US Pat 5,736,330 & 6,057,107 및 Fulton et al. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system, Clin Chem 1997 Sep; 43(9): 1749-56.
d. U.S. Pat. No. 5,981,180에서는 복합된 생물학적 측정검사를 수행하기 위하여 유세포분석법과 공동으로, 색-분류된 비드를 이용하는 방법을 기술한다.
e. 미소구체에 부착된 DNA 단편의 복합된 분석 및 표적 핵산에 부착된 광활성가능 라벨을 이용한 핵산의 정량을 위한 방법: Dattagupta and Nanibhushan, 2001; US Pat. 6,620,586.
f. 미소구체에 올리고뉴클레오티드의 부착 및 혼성화 측정검사에서 PCR 산물, 다형성(polymorphism) 또는 메틸화(methylation)의 탐지에 관련된 특허. 아래의 기술이 본 발명의 기술과 함께 이용될 수 있긴 하지만 본 발명의 기술과는 상이하다. "Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor" US Pat. 6,903,207, 6,902,895, 6,878,814, 6,861,221, 6,828,432, 6,818,753, 6,812,334, 6,777,186, 6,773,884, 6,767,702, 6,759,199, 6,750,016, 6,740,491, 6,730,269, 6,720,411, 6,720,147, 6,709,825, 6,682,895, 6,677,122, 6,673,548, 6,645,721, 6,610,491, 6,506,564, 6,495,324, 6,417,340, 6,361,944,
g. 특정 올리고뉴클레오티드 서열의 탐지를 위한 다른 미소구체 공액된 프로브 어레이: US Pat. 6,890,741, 6,858,394, 6,919,206.
h. 표적 증폭을 위한 PCR을 이용한 돌연변이 스크리닝(mutation screening): US Pat. 6,528,261, 6,340,566
i. 프라이머 신장(primer extension)을 이용한 돌연변이 스크리닝: US Pat. 6,537,748
j. 증폭된 표적을 이용한 미소구체를 이용한 병원균의 탐지: US Pat. 6,858,387, 6,620,586, 6,821,754, 6,821,519, 6,818,397
따라서, 당분야에는 소량의 샘플 또는 환자 재료를 이용하여 이수체(aneuploid) 또는 몸세포염색체 도메인(aneusomic domain)의 서열을 신속하게 결정하는 방법이 요구된다. 또한, 현재의 방법보다 정확하고, 복잡하고 많은 시간이 소모되는 단계를 필요로 하지 않는, 이들 서열을 결정하는 방법이 요구된다. 더 나아가, 프로브와의 혼성화에 앞서 표적 DNA의 증폭을 필요로 하지 않는, 염색체 또는 게놈 핵산 서열의 수치적 비정상을 결정하는 방법이 요구된다.
본 발명의 요약
본 발명에서는 앞서 언급된 문제점을 극복하고, 게놈 사본 수의 측정에 기초한 염색체 비정상을 확인하는 신규한 방법을 제시한다. 본 발명은 또한, 용액의 DNA(또는 RNA) 농도를 결정하거나, 또는 핵산의 복합 혼합물 내에서 하나이상의 전사체(transcript)의 수준을 결정하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 참고 서열 또는 표준 곡선과 비교하여 특이적 서열의 사본 수를 결정하는, 적은 사본 게놈 혼성화 프로브를 이용한 미소구체 현탁 혼성화 측정검사를 포함한다. 반접함성(hemizygosity), 또는 3개 또는 그 이상의 대립유전자로부터 상염색체(autosome)에 대하여 통상적으로 2개인 정형적인 사본 수를 구별할 만큼 충분한 정확도가 달성된다. 이러한 측정검사는 유세포분석법을 이용한 전체 게놈 DNA(또는 RNA)의 직접적인 분석을 가능하게 하고, 필요한 경우에, 대량의 환자 샘플, 추가적인 채혈(blood draw), 좌위(locus)-특이적 증폭 또는 시간-소모적 게놈 정제 방법을 필요로 하지 않으면서 통상적인 세포유전학적 분석을 추종할 수 있다. 이런 이유로, 단일 좌위에서 사본 수 결정은 완전 게놈으로 구성되는 서열의 복합 배경 내에서 수행될 수 있다. 이러한 예민한 구별 수준은 완전 전사체의 배경에서 드물게 나타나는 전사체의 사본 수를 결정하거나, 또는 핵산의 이질성 용액 내에서 극히 약하거나 낮은 농도의 특이적 핵산 서열을 탐지하는 데에도 이용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 현재의 혼성화 측정검사와 달리, 좌위-특이적 표적 DNA의 사전 증폭이 필요하지 않은데, 그 이유는 본 발명의 더욱 긴 적은 사본 혼성화 프로브가 상동성하고 독특한 게놈 표적 서열의 직접적인 탐지에 요구되는 증가된 특이성을 제공하기 때문이다. 가령, 본 발명은 샘플에 대해 각 반응에 존재하는 프로브의 총수에 상관없이, 90분 이내에, 더욱 바람직하게는, 1시간 이내에, 이보다 더욱 바람직하게는, 50분 이내에, 이보 더욱 바람직하게는, 45분 이내에, 이보다 더욱 바람직하게는, 40분 이내에, 이보다 더욱 바람직하게는, 35분 이내에, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 30분 이내의 수동 실험 시간(hands-on laboratory time)으로, 환자 게놈 샘플 내에서 사본 수의 증가 또는 감소를 탐지하는데 이용될 수 있다. 부가적으로, 복수 사본 수 변화를 독립적으로 측정하기 위하여 동일한 혼성화 측정검사에서 복수의 독립된 적은 사본 프로브-공액된 미소구체 세트를 통합할 수 있다. 복합된 분석은 FISH에 비하여 각 측정검사에서 요구되는 샘플의 양을 감소시킬 뿐만 아니라 검사되는 샘플당 분석 시간과 전체 비용을 감소시킨다.
바람직한 형태에서, 본 발명에서는 높은 특이성으로 반수체 게놈 서열 내에서 독특한 좌위에 혼성화되도록 특수하게 설계된 적은 또는 단일 사본 혼성화 프로브를 이용한다. 프로브 선별과 합성을 위한 방법은 US Patent No. 6,828,097 및 계류중인 U.S. 출원 No. 09/854,867(U.S. 특허 출원 No. 2005/0064449)에서 기술된다. 인지하는 바와 같이, 이들 초기 단계는 표적과 게놈 반복(repeat) 모두의 서열에 관한 지식, 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)에 기인한 더욱 가용한 정보 및 관련된 생물학적 연구(bioinformatic study)를 필요로 한다. 더 나아가, 필요한 적은 사본 서열을 유도하는데 용이하게 가용한 컴퓨터 소프트웨어가 이용된다.
적절하게는, 최소한 2개의 상이한 프로브 서열이 선택되고 합성된다. 프로브의 최소한 한 세트는 비정상이 존재하는 특정 핵산 서열의 인식을 위하여 선택되고 합성되며(검사 프로브), 프로브의 다른 세트는 참고 서열의 인식을 위하여 선택되고 합성된다(참고 프로브). 이들 적은 사본 프로브는 최소한 대략 60개 염기쌍, 일반적으로, 2500개 이하의 염기쌍 크기를 갖는다. 적절하게는, 프로브는 60개 내지 1000개 염기쌍, 더욱 바람직하게는, 대략 80개 내지 500개 염기쌍, 가장 바람직하게는, 대략 90개 내지 110개 염기쌍이다. 대략 100개 염기쌍의 적은 사본 프로브에 공액된 미소구체는 충분히 한정된 평균 형광 분포(mean fluorescence distribution) 및 일관되게 더욱 높은 2차 형광색소 평균 형광 강도(fluorochrome mean fluorescence intensity) 수치를 나타내고, 따라서, 실제 사본 수를 더욱 정확하게 반영하였다. 또한, 더욱 짧은 프로브 공액체는 더욱 안정하고, 가급적 어둠 하에 대략 4℃에서 적절하게 보관되는 경우에 공액(conjugation)후 2개월 이상동안 혼성화 반응에 이용될 수 있다. 이는 표지된 미소구체 근원(stock)에서 감소된 로트간 변이(lot-to-lot variation)를 결과하고, 따라서 프로브-공액된 미소구체를 공액하고 정량하고 정성하는데 요구되는 노력을 감소시킨다. 더욱 긴 공액된 프로브는 공액후 2주 이내에 혼성화 효율이 감소하였다.
합성 동안, 프로브는 스펙트럼 상이한 미소구에 공액을 위한 특정 공액 반응에 따라 아민-표식될 수 있다. 적절하게는, 프로브는 변형된 카르보디이미드 반응(실시예 1)을 통하여 미소구체에 공액되고, 여기서 미소구체는 카르복실화된다. 범위에서 본 발명에 필적하는, 미소구체에 핵산을 결합시키는 다른 방법이 개발되었다. 미소구체에 DNA를 공액하는 다른 통상적인 방법은 5' 말단에 비오틴 모이어티가 존재하는 변형된 뉴클레오티드를 보유하는 프로브에 스트렙타비딘-코팅된 비드를 결합시키는 것이다. US 6361944에서 금 나노입자가 티올-변형된 핵산에 공액되었다. US 6,468,546, 6,838,243, 6,833,246, 6,828,146, 6,828,142에서 단백질-핵산이 비드에 공액되었다. 미소구체에 올리고뉴클레오티드의 공액은 또한, 친전자성 사슬, 다시 말하면, N-클로로아세트아미도헥실 포스포라미디트 반응물을 통하여 수행되었다(Guzaev, et al Bioorg Med Chem Lett. 1998 Dec 15;8(24):3671-6). DNA는 또한, 반도체 나노결정성 입자에 공액되었다(Taylor, J.R., Fang, M.M., & Nie, S. M. Probing specific sequences on single DNA molecules with bioconjugated fluorescent nanoparticles. Anal. Chem. 72, 1979-1986, 2000; W. Z. Guo, J. J. Li, Y. A. Wang, X. G. Peng, Conjugation chemistry and bioapplications of semiconductor box nanocrystals prepared via dendrimer bridging. Chem. Mater. 15, 3125-3133 (2003); U.S. PatentNo. 6,630,307). 바람직한 구체예에서, 미소구체는 다양한 스펙트럼 어드레스(spectral address)를 보유하는 내부 염색된, 형광, 폴리스티렌 비드이고, 적은 사본 프로브에 공액되며, 따라서 적은 사본 프로브-공액된 비드의 다양한 조합이 산출되는데, 여기서 참고 프로브는 별개의 스펙트럼 어드레스를 보유하도록 설계된다. 상이한 스펙트럼 어드레스는 유세포분석기(flow cytometer)에 의해 인식되고, 상이한 미소구체 세트에 부착된 다양한 적은 사본 프로브와의 복합된 반응을 가능하게 한다.
이후, 혼성화를 위한 표적 핵산 서열이 제조된다. 다른 방법과 달리, 표적 서열은 미리 선택되거나 증폭되지 않고, 따라서, 본 발명에서 게놈(또는 전사체)의 전체 사본이 분석을 위하여 혼성화될 수 있다. 샘플의 출처와 상태에 따라, DNA(또는 RNA)가 세포로부터 추출되고, 필요한 경우에, 임의의 통상적인 방법을 이용하여 시험관내 복제될 수 있다. 적절하게는, 핵산은 1 ng 이하의 샘플 핵산을 이용하고 20분 이하의 수동 시간(hands-on time)을 필요로 하는 GenomiPhi 키트(Qiagen, Valencia CA)를 이용하여 시험관내 복제된다. 이후, DNA는 임의의 통상적인 수단, 바람직하게는, 시험관내 복제 동안 직접적인 표지(labeling) 단계, 또는 라벨 및 상기 라벨에 친화성을 갖는 리포터 분자로 구성되는 간접적인 표지 시스템에 의해 표지된다. 핵산 표적은 확인 라벨(identifying label), 예를 들면, 형광단, 효소 공액체(enzymatic conjugate), 또는 비오틴 또는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 특이적 항체에 의해 인식되는 모이어티(moiety)에서 선택되는 라벨로 표지된다. 여러 유형의 비-동위원소 확인가능 라벨이 존재한다. 한 가지 유형은 핵산 표적에 화학적으로 결합하고 직접적인 확인의 수단으로서 기능하는 라벨이다. 이의 실례는 형광색소 모이어티인데, 이는 적절한 파장의 방사선의 적용이후, 높은 에너지 상태로 여기되고 형광을 방출한다. 직접적으로 표지된 형광 뉴클레오티드, 예를 들면, Cy3-dUTP는 당분야에 공지되어 있고, 본 발명에 이용하기 적합한 표적 DNA의 표지 형태이다. DNA의 직접적인 표지의 다른 방법 역시 적합하지만(한 가지 실례는 Ulysses 방법(Kreatech, Netherlands)으로, 시판되는 아미노-알릴(amino-allyl) 표지이다), 이런 경우에, 게놈 DNA는 프로브 공액된 미소구체에 표지된 표적의 추가에 앞서 혼성화에 적합한 크기로 단편화된다(DNAse I, 전단(shearing), 또는 다른 효소 절단(enzymatic digestion)에 의해). 바람직한 구체예에서, 핵산 표적은 가급적, 뉴클레오티드, 예를 들면, dUTP 또는 dATP에 공액된 선택된 확인 라벨(하지만, 이에 한정되지 않음)을 포함하는 반응물을 이용한 통상적인 방식으로, 변형되거나 직접적으로 표지된 뉴클레오티드를 이용한 새김눈 번역(ick translation)으로 표지된다(Rigby et al., J. MoL Biol., 113:237-251, 1977). 이들 단편은 형광단-표식된 뉴클레오티드로 직접적으로 표지되거나, 또는 아래에 기술된 바와 같이 단편 내로 편입된 변형된 뉴클레오티드를 인식하는 형광-표지된 항체에 표지된 이중나선을 결합시킴으로써 간접적으로 표지된다. 새김눈 번역(100 ㎕)에는 엔도뉴클레아제(endonuclease)-없는 DNA 중합효소 I(Roche Molecular Biochemicals)과 DNase I(Worthington Chemical)이 이용된다. 각 단편은 DNA 중합효소 I(4 unit/㎍ DNA), DNase(0.01-3 ㎍/100 ㎕ 반응), 표지된 뉴클레오티드(0.05 ㎜ 최종), 새김눈 번역 완충액과 합쳐진다. 반응은 15℃에서 60분간 수행되고, ~300 내지 1000 bp 크기 범위의 상이한 뉴클레오티드 크기의 다양한 표지된 프로브를 산출한다. 대안으로, 비오틴-dUTP 또는 디곡시제닌-dUTP는 시험관내 복제 절차 동안 편입될 수 있고, 생성된 표지된 샘플은 DNAse I로 처리되거나, 또는 일부 다른 방법으로 전단되어 ~300bp 내지 lkb 길이의 단편을 산출할 수 있다. 핵산을 표지하고 탐지하는데 통상적으로 이용되는 다른 방법이 본 발명의 적은 사본 DNA 공액된 미소구체의 탐지에 적용될 수도 있다. 이들에는 형광색소 표지와 형광 조성물, 예를 들면, 에너지 전달 기(energy transfer group), 공액된 단백질, 항체, 또는 항원이 포함된다.
혼성화 반응을 위한 조건은 특정 뉴클레오티드 조성 및 각 적은 사본 프로브의 길이에 좌우되고, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 혼성화를 위하여, 샘플 서열은 적은 사본 프로브-공액된 미소구체를 포함하는 혼성화 완충액 내에서 희석된다. 이용되는 프로브-공액된 미소구체의 양은 검사된 샘플의 양에 좌우된다. 적절하게는, 대략 5 pg 내지 1 ㎍의 샘플, 더욱 바람직하게는, 대략 25-100 ng의 샘플, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 30-70 ng, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 40-60 ng의 샘플, 가장 바람직하게는, 대략 50 ng의 샘플이 각 혼성화 반응물에서 분석된다. 따라서, 완충액은 혼성화되는 각 세트에 대해 바람직하게는, 대략 2,000-10,000개의 프로브-공액된 미소구체, 더욱 바람직하게는, 2,000-6,000개의 프로브-공액된 미소구체, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 4,500-5,500개의 프로브-공액된 미소구체, 가장 바람직하게는, 대략 5,000개의 프로브-공액된 미소구체를 포함한다. 희석된 혼성화 반응물은 가급적, 대략 95℃에서 열 변성되고, 이후 프로브 뉴클레오티드 조성과 길이에 따라 적절한 혼성화 온도, 바람직하게는, 대략 45 내지 51℃에서 하룻밤동안 혼성화된다. 혼성화된 미소구체는 혼성화되지 않은 표적 서열을 제거하기 위하여 세척되고 원심분리된다.
상층액은 제거되고, 혼성화된 샘플은 적은 사본 프로브- 공액된 미소구체에 혼성화된 표지된 샘플을 탐지하기 위하여 일정량의 변형된 리포터 분자 또는 다른 적절한 라벨, 바람직하게는, 이차 형광색소로서 기능하는 라벨로 염색되거나 표지된다. 바람직한 리포터 분자는 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘 또는 항-디곡시제닌 플루오레세인(anti-digoxigenin fluorescein)인데, 이는 선호되는 표적 서열 라벨: 각각, 비오틴과 디곡시제닌을 탐지하고 이들에 결합한다. 혼성화되고 표지된/염색된 샘플은 리포터 분자가 표지된 표적 서열을 탐지하고 상기 서열에 결합할 만큼 충분한 기간 동안 혼성화 반응에 이용된 동일한 온도에서 배양된다. 이후, 샘플은 잔류 염료를 제거하기 위하여 세척된다. 이들 샘플은 원심분리되고, 상층액은 제거되고, 염색된 혼성화된 미소구체는 일정량의 혼성화 완충액에 재현탁된다.
유세포분석법에 의한 분석에 앞서, 혼성화된 샘플은 유세포분석기 제조업체의 사용설명서에 따라 희석될 수 있다. 적절하게는, 각 세트에서 대략 2,000-6,000개의 미소구체, 더욱 바람직하게는, 대략 4,500-5,500개의 미소구체, 가장 바람직하게는, 대략 5,000개의 미소구체가 반응마다 분석된다. 하지만, 분석되는 샘플의 양은 분석에 이용되는 특정 유세포분석기에 좌우된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 유세포분석기에 대한 교정(calibration)과 작동 설정(operating setting)은 특정 혼성화 검사물을 측정하기 위한 최적 범위를 결정하기 위하여 과도한 실험 없이, 당업자에 의해 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 이들 파라미터는 분석에 이용되는 소프트웨어에도 좌우된다. 형광 비드 기준은 폭넓게 입수가능하고, 유세포분석기의 상이한 형광색소 탐지 채널의 강도를 교정하는데 이용될 수 있다. 상기 장치는 등가의 가용성 형광색소 분자(equivalent soluble fluorochrome, MESF) 단위에서 교정된 표면-표지된 비드에 기초한 형광 참고 기준으로 교정될 수도 있다. 전방 산란(forward scatter), 측면 산란(side scatter), 유속(flow rate), 다양한 탐지 채널에 대한 광전증폭관(photomultiplier) 관전압(tube voltage) 설정과 역치(threshold)는 정상적인 유전형(genotype)을 갖는 단일 환자 샘플에 혼성화된 2가지 상이한 프로브의 형광 강도(fluorescence intensity) 사이에 차이를 최소화하기 위하여 가급적 최적화되어야 한다. 비-최적 전압 파라미터는 용이하게 식별되고 광범위한 형광 피크(fluorescence peak) 또는 비-선형 데이터(non-linear data)를 결과하는 반면, 최적 파라미터는 측면 산란 플롯(side scatter plot)을 이용하여 시각화되는 경우에 상이한 스펙트럼 어드레스를 보유하는 조밀하게 밀집된 미소구체를 결과한다. 적절하게는, 이들 설정은 산술 평균(arithmetic mean), 기하 평균(geometric mean), 중간과 피크 채널의 유래된 형광 치수로부터 결정된다.
본 발명의 적은 사본 프로브 대부분은 조성에 대한 별다른 최적화(optimization)를 요구하지 않는데, 그 이유는 프로브 특성(probe quality)이 프로브를 설계하는데 이용되는 서열의 적은 사본 성격에 주로 좌우되기 때문이다. US #6,828,097에 기술된 적은 사본 프로브 설계의 방법과 별개로, 참고와 검사 프로브 쌍은 각 프로브의 혼성화 온도 인근에서 2차 구조 형성을 감소시키기 위하여 유사한 길이 및 가능하면, 유사한 조성(특히, G와 C 뉴클레오티드의 비율)의 서열을 정합함으로써 동등한 열 안정성(thermal stability)을 갖도록 최적화되었다. 다른 게놈 좌위에 파라로거스(paralogous)인 서열은 공지된 유전형에 대한 확립된 신뢰 구간(confidence interval)을 초과하는 형광 강도 비율을 산출한다. 본 발명에서는 다른 게놈 조각(segment)에 엄격하게 상동성이 아닌 적은 사본 프로브의 이용으로 이러한 한계를 극복한다.
이후, 혼성화된 샘플은 가급적 이중 레이저 탐지(dual laser detection)를 이용한 유세포분석법으로 분석되는데, 여기서 세포분석기(cytometer)는 혼성화된 프로브를 확인하고 정량하기 위하여 미소구체 및 샘플 서열에 결합된 이차 형광색소의 스펙트럼 어드레스를 동시-선택한다. 사본 수 차이는 검사 프로브의 평균 형광 강도를 2염색체성 참고 프로브의 형광 강도와 비교함으로써 구별가능하다. 구체적으로, 상보성 프로브-공액된 미소구체에 혼성화된 각 샘플 서열의 신호는 샘플 서열에 부착된 2차 형광색소의 형광 강도를 정량함으로써 결정된다. 가령, 참고 프로브는 1개의 사본(결실)이 2개의 사본(정상)으로부터 구별될 수 있는 내부 참고(internal reference)로서 기능하고, 2개의 사본은 형광 강도에서 차이에 기초하여 3개의 사본(중복)으로부터 구별될 수 있다. 결합되지 않은 2차 형광색소(리포터 분자)의 방출 파장(emission wavelength)과의 중복을 최소화시키기 위하여 조화성 미소구체 스펙트럼 어드레스가 선택된다. 이는 동일한 공액되지 않고 혼성화되지 않은 미소구체로부터 획득된 결과를 비교하여 확증될 수 있다. 2차 형광색소 탐지 채널에서 배경 형광(background fluorescence)을 결정하기 위하여 샘플 핵산을 제외하고 모든 성분을 포함하는 반응 튜브를 이용하여 음성 대조(negative control) 역시 유지될 수 있다. 적절하게는, 상기 시스템은 임의의 잔류하는 미소구체를 제거하기 위하여 작업(run) 사이에 증류수로 세척된다.
적절하게는, 본 발명의 혼성화 측정검사에서 사본 수를 측정하기 위하여 기하 평균 또는 중간 형광 비율(median fluorescence ratio)이 이용되는데, 그 이유는 이러한 비율이 유전형 사이에 중복 없이 모든 유전형에 대한 최소 신뢰 구간(confidence interval)(95%)과 잔차(residual)를 제공하기 때문이다. 결실을 포함하는 서열에서, 참고 프로브 강도에 대한 검사 프로브 강도의 기하 평균 또는 중간 형광 비율에 대한 예상 수치는 대략 0.5인데, 이는 1 vs. 2의 게놈 사본 수 차이를 반영한다. 중복(또는 삽입)을 포함하는 서열에서, 상기 비율은 대략 1.5일 것으로 예상되는데, 이는 3 vs. 2의 게놈 사본 수 차이를 반영한다. 1.7 이상의 비율은 전형적으로, 사본 수에서 서열의 최대 5개 추가적인 사본의 증가를 지시한다. 정상적인 서열에서, 상기 비율은 대략 1.0일 것으로 예상되는데, 이는 양쪽 유전형에 대한 정상적인 이배체 사본 수를 반영한다. 본 발명의 실시에서, 이들 예상된 비율로부터 이탈은 가급적 최소화되고, 따라서, 이들 비율은 대략 80%, 더욱 바람직하게는, 대략 85%, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 90%의 신뢰 구간 내에 존재한다. 바람직한 구체예에서, 이들 비율은 사본 수의 더욱 정확한 결정이 가능하도록 최소한 95% 신뢰 구간이어야 하고 유전형 사이에 중복이 없어야 한다. 적절하게는, 결실을 반영하는 비율은 대략 0.25-0.75, 더욱 바람직하게는, 대략 0.40-0.60, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.45-0.55, 가장 바람직하게는, 대략 0.49-0.51이다. 삽입 또는 중복을 반영하는 비율은 바람직하게는, 대략 1.25-1.75, 더욱 바람직하게는, 대략 1.40-1.60, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.45-1.55, 가장 바람직하게는, 대략 1.49-1.51이다. 정상적인 유전형을 반영하는 비율은 바람직하게는, 대략 0.75-1.25, 더욱 바람직하게는, 대략 0.90-1.10, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.95-1.05, 가장 바람직하게는, 대략 0.99-1.01이다.
본 발명은 이배체 참고 서열과 염색체 결실(단일 대립유전자), 삽입, 삼배체(trisomy) 또는 중복(3개의 대립유전자) 사이에 사본 수 차이 및 최대 5개의 부가적인 사본(5개의 대립유전자)까지 사본 수 증가를 일관되게 구별하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 측정검사는 특정의 검사 서열이 반수체 게놈당 1개의 사본에만 존재하는 경우에도 매우 적은 사본 또는 드물게 나타나는 서열을 탐지할 수 있다. 핵산 재정렬(nucleic acid rearrangement)의 정도는 62 bp 내에서 한정될 수 있는데, 이는 어레이 CGH, 서던 분석보다 훨씬 정확하고 MLPA의 정밀도에 필적하다. 본 발명의 미소구체 비드 혼성화 측정검사는 분해능을 개선하고, 신호 대 잡음 비율(signal to noise ratio)을 증가시키고, 복합이 용이하여, 고속 처리 방식으로 적합하다. 프로브를 복합하는 능력은 이용가능 샘플 또는 환자 재료를 보존하고, 진단에 필요한 시간을 감소시킨다. 더 나아가, 이질성 게놈 서열의 오염이 이러한 측정검사에서 혼성화 효율에 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 이러한 미소구체 혼성화 플랫폼은 FISH, 어레이 CGH(aCGH), 발현 또는 타일 마이크로어레이, 서던 분석, 복합 증폭가능 프로브 혼성화 (MAPH), 복합 결찰 프로브 혼성화 (MLPA), 정량적 PCR(qPCR) 대신에, 일부 진단 상황에서 더욱 적합하다.
이러한 측정검사는 고속 처리 분야에 용이하게 적용된다. 가령, 적은 사본 미소구체-공액된 현탁 혼성화 프로브의 게놈 어레이로, 사본 수가 상이한 개체 간에 본질적으로 불변하는 하나이상의 보존된 참고 좌위와 비교하여, 사본 수 차이에 기초하여 비정상적 염색체 서열을 신속하게 결정 및/또는 정의하는 것이 가능하다. 염색체 영역에 걸쳐있는 적은 사본 프로브의 조밀한 세트의 혼성화는 몸세포염색체 도메인의 경계를 초기에 구분하는데 이용될 수 있다. 차후의 FISH 연구는 이들 유전자 변이에 대한 염색체 배경(chromosomal context)을 제공할 수 있다. 고속 처리 분야에 적용이 고려될 수 있는데, 그 이유는 대략 3840개의 상이한 산물이 각 웰 내에서 10개의 상이한 스펙트럼 인코딩된 비드의 세트를 이용하여 단일 고밀도 마이크로역가 평판에서 분석될 수 있기 때문이다. 가용한 유세포분석기로, 20kb의 최소 프로브 분해능을 가정하면, 단일 평판은 90분의 데이터 획득 시간(data acquisition time) 이내에 20Mb 도메인에 대한 높은-분해능 사본 수 결정을 제공할 수 있다.
본 발명은 다른 관련된 공지의 기술보다 더욱 민감하고 더욱 정확하기 때문에, 기존에는 고도로 반복되는 프로브 또는 사전 표적 증폭을 요구하는 프로브가 필요했던 다른 진단 분야(본 명세서에 제공된 실시예 1과 2에 제시된 것들에 추가하여)에도 이용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서는 염색체 불균형(chromosomal imbalance)의 탐지를 제시한다. 환자 결실(및 가능하면, 삼대립형질 유전(triallelic inheritance))의 탐지의 가장 중요한 함의 중의 하나는 관찰되는 대립유전자의 결과적인 불균형이다. 다시 말하면, 전사된 게놈 서열의 반수체기능부전(haploinsufficiency) 또는 과다 발현이 질병의 원인이 되긴 하지만, 야생형 대립유전자의 결실에 의해 정체가 노출된 단일 돌연변이 대립유전자의 존재(또는 돌연변이체 대 야생형 대립유전자의 2:1 비율)가 일부 비정상적인 임상적 표현형의 더욱 중요한 결정인자(determinant)이다. 적은 사본 간격의 현명한 선택은 이들 염색체 영역 불균형을 탐지할 뿐만 아니라, 이들 도메인 내에서 발견되는 돌연변이 또는 SNP의 탐지를 가능하게 할 것이다. 일배체형 지도작성 컨소시엄(haplotype mapping consortium)의 노력으로, 수백만 개 SNP의 상세한 게놈 위치와 population frequency가 현재 가용하다. 본 출원의 일부 발명자의 연구에 기초하여, 이들 중에서 일부는 다양한 선천성 질환(congenital disorder)과 분명하게 연관된다.
이러한 미소구체 측정검사를 이용하여 염색체 불균형을 탐지하는데 이용되는 Ic(적은 사본) 프로브는 공개된 다형성 서열 또는 돌연변이의 위치에 관한 기존 지식에 기초하여 선택될 수 있다. 상기 측정검사를 이용하여 염색체 비정상이 탐지된 이후, 혼성화된 미소구체는 회수되고, 환자-유래된 서열은 공액된 서열로부터 소산되고, 비드는 원심분리되고, 소산된 가닥을 포함하는 상층액은 다음 단계에 이용된다. 상기 서열은 이후, 직접적으로, 다시 말하면, 형광 PCR 측정검사, 예를 들면, Taqman(Applied Biosystems)으로 또는 분자 비컨(molecular beacon) 측정검사로 분석되거나, 또는 혼성화된 대립유전자의 유전형을 결정하기 위하여 증폭되고 직접적으로 서열화될 수 있다. 공액된 Ic 프로브에 어닐링된 환자 샘플로 구성되는 이중나선은 뉴클레아제(nuclease)(가령, S1 또는 엑소뉴클레아제 I)를 이용하여 평활 말단(blunt end)으로 절단되고, 이후 Cleavase(Third Wave Technologies)로 처리하여 미스매치된 부위에서 DNA를 절단될 수 있고, 단편은 dHPLC(Wave System 이용, Transgenomic) 또는 전기영동(electrophoresis)에 의해 분리될 수 있다. 길이가 프로브 길이에 불과한 2개의 더욱 짧은 단편이 예상된다(이는 프로브 합성을 위한 주형의 현재 공급원인 게놈 DNA의 혼합물로부터가 아닌 SNP에 대한 공지된 동형접합체(homozygote)로부터 유래되는 Ic 프로브에 비드의 공액을 요구한다).
다른 대안적 유전형확인(genotyping) 절차 역시 미소구체 혼성화가 이용될 수 있는데, 여기서 회수된 단편은 차후의 미소구체 혼성화 측정검사에서 표적으로 이용될 수 있다. 카르복실화된 미소구체는 SNP가 서열의 중간에 위치하는 5' 아미노 표지된 프로브(50-70개 뉴클레오티드)에 결합된다. 이들 프로브의 서열이 SNP의 위치에 의해 결정되기 때문에, 이들의 서열은 반드시 적은 또는 단일 사본일 필요가 없다. 2개의 별개의 미소구체가 이용되는데, 하나는 야생형 서열(참고 프로브)에 결합되고, 다른 하나는 변이체 SNP 서열(검사 프로브)을 보유한다. 혼성화는 표적 서열의 감소된 복잡성으로 인하여 혼성화 시간이 15 내지 30분으로 감소된다는 점을 제외하고, 앞서 기술된 바와 동일하게 수행된다. 염기 미스매치(base mismatch)를 보유하는 프로브는 혼성화이후 엄격한 세척(stringent wash)에 의해 불안정화되고 분리된다. 정확한 서열 매치를 보유하는 미소구체는 더욱 강한 평균 형광 강도를 나타내게 된다. US Pat. 6,355,431 및 관련된 특허에서 미소구체-기초된 혼성화가 유전형확인을 시작하는데 이용될 수 있다고 기술하고 있긴 하지만, 이들 특허에서는 혼성화에 의해 포획되는 DNA가 표적 증폭에 의해 미리 획득되었을 것으로 예상한다. 본 발명은 혼성화에 앞서 표적 증폭이 불필요하다.
최소한, 결실의 경우에, 동일한 표지된 핵산 내에서 단단하게 연결된 SNP의 일배체형(상기 단계)은 이러한 측정검사로 결정될 수 있다. 여기서 놀라운 사실은 돌연변이와 결실이 단일 측정검사에서 효과적으로 탐지된다는 점이다.
본 발명의 다른 측면은 가축 검사에 이용될 수 있다. 중복되거나 결실된 영역이 양적 형질 좌위(Quantitative Trait Loci, QTLs)와 연관될 수 있다(Montaldo et al. Use of molecular markers and major genes in the genetic improvement of livestock. Animal Biotechnology Volume 1. No 2. August 15, 1998, 83-89), 이는 소와 양에 대한 PCR and qPCR 측정검사와 같은 방법에 의해 현재 분석되고 있다. 고속 처리 특성으로 인하여, 본 발명을 이용한 QTL 결실 또는 중복 마커에 대한 미소구체 측정검사는 qPCR 또는 PCR 검사보다 대규모 가축 무리에 이용하기 더욱 적합하다. 일련의 QTL 좌위에 특이적인 검사 프로브는 스펙트럼으로 별개의 미소구체에 공액될 수 있고, 이들 프로브의 혼성화 효율은 각각, QTLs의 중복 또는 결실을 지시하는 1 초과 또는 1 미만의 비율을 구별하기 위하여, 표준 참고 프로브, 가축 종의 경우에 HOXB 1과 비교할 수 있다. 분석 방법은 앞서 기술된 것들에 따른다.
본 발명의 다른 측면에서, 유전자도입(transgenic) 또는 적중(knockout) 생쥐(또는 다른 생물체)는 본 발명을 이용하여 유전자도입 코어(transgenics core) 내에서 신속하게 서열의 성공적인 삽입/결실을 검사할 수 있다. 현재의 방법은 Nature Genetics 21 , 249-251, Modeling cancer in the mouse (1999)에 기술된 것들과 같은 PCR 또는 qPCR을 수반한다. 유전자도입 또는 적중 서열에 특이적인 검사 프로브(검사 프로브)는 스펙트럼으로 별개의 미소구체 및 유전자도입 또는 적중 서열에 인접한 게놈 내에서 서열(참고 프로브)에 공액될 수 있다. 이후, 유전자도입 또는 적중 동물로부터 게놈 DNA 또는 상보성 DNA가 앞서 기술된 바와 같이 추출되고 표지된다. 검사 프로브와 참고 프로브의 혼성화와 탐지 역시 앞서 기술된 바와 같이 수행된다. 참고 프로브에 대한 검사 프로브의 MFI 비율이 1 이상이면, 검사 프로브 서열은 유전자도입 동물 내로 성공적으로 삽입되었다. MFI 비율이 0.5이면, 검사 프로브 서열 중에서 하나의 사본이 동물 게놈으로부터 성공적으로 적중되거나 결실되었다. 검사 프로브가 혼성화되지 않으면, 이는 검사 프로브 서열의 양쪽 사본이 검사된 적중 동물로부터 결실되었음을 암시한다.
본 발명의 다른 측면에서는 유전자 변형된 농작물의 수준의 탐지를 제시한다. PCR 기초된 방법은 농작물 내에서 유전자 변형된 물질(GMO) 내용물을 정량하는 표준 방법 중의 하나이긴 하지만(참조: Zimmermann A., Hemmer W., Liniger M., Luthy J., Pauli U. Lebensmittel-Wissenschafi. und - Technologies 31(7): 664-667, 1998; Studer E., Rhyner C, Luthy J., Hubner P. Zeitschnft fur Lebensmitteluntersuchung und-Forschung A.207(3): 207-213, 1998; Hoist- Jensen, Sissel B. Ronning, Astrid Lovseth, Knut G. Berdal. Analytical and Bioanalytical Chemistry. Volume 375, Number 8, 985 - 993, 2003), 이들 방법은 일부 단점이 있다. 이들 방법은 특히, 낮은 수준의 오염에서 가양성(false positive) 결과에 취약하고, 민감성이 한정되며(<2%), 가음성 결과를 비롯한 가변적 결과를 제공할 수 있다(Ahmed F., Trends in Biotech.20:215-223, 2002). USDA가 이용하는 기존의 qPCR 측정검사는 특히, 1% 탐지 역치(threshold of detection)에서 가변적이다. 상기 역치에서 GMO 측정검사의 신뢰성에서 상업적 개선은 매우 유익한데, 그 이유는 유럽 연합(European Union)이 상기 수치를 농산물 수입품에 대한 상한선으로 설정하고 있기 때문이다. 특정의 유전자 변형에 특이적인 검사 프로브는 스펙트럼으로 별개의 미소구체에 공액될 수 있다. 조사되는 특정의 농작물 게놈 내에서 공지된 사본 수의 참고 프로브 역시 스펙트럼으로 별개의 미소구체에 공액될 수 있다. 모든 실험 절차는 앞서 기술된 바와 같이 수행된다. 참고 프로브에 대한 검사 프로브의 0.5 MFI 비율은 유전자 삽입된 물질이 하나의 사본에 삽입되었음을 지시하고, 1의 비율은 2개의 사본을 지시하고, 1.5 또는 그 이상의 비율은 3개 또는 그 이상의 GMO 사본을 지시한다. 검사 프로브가 혼성화되지 않으면, 이는 농작물 게놈 내에서 GMO의 부재를 지시할 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면, 인간 게놈 DNA 내에서 적은 사본 서열의 정량에서 달성되는 민감도는 GMO 내용물의 낮은 수준 탐지를 위한 PCR을 이용하여 현재 획득되는 민감도보다 훨씬 우수하다. 더 나아가, 본 발명의 방법은 낮은 수준 오염에 기인한 가양성 탐지에 취약하지 않은데, 그 이유는 표적 서열의 증폭이 불필요하기 때문이다. 본 발명으로 증명되는, 낮은 수준 사본 수 차이를 구별하는 능력으로 인하여, 당업자는 본 발명의 미소구체 현탁 혼성화 측정검사가 GMO 오염에 대한 우수한 검사법임을 인지할 것이다.
본 발명의 다른 측면에서는 표준 전사체 등가물 또는 내부 하우스키핑(housekeeping) 참고 유전자와 비교하여 cDNA 또는 라이브러리 내에서 전사체 수준을 측정하는 방법을 제시한다. cDNA 또는 라이브러리 내에서 특이적 전사체의 존재를 탐지하는 현재의 방법은 전형적으로, qPCR(Physiol Genomics. 2003; 16(l):90-8), 또는 PCR(Development. 1992; 116(3):555-61), 또는 미소구체 혼성화 (US Patent 6,875,568)를 이용하여 수행된다. 현재의 PCR과 미소구체 혼성화 방법은 전사체 수준을 정량하지 않고, 전사체의 존재 또는 부재만을 탐지한다. 본 발명은 cDNA 내에서 적은 사본 또는 드물게 나타나는 mRNA 서열(각 혼성화 반응물에 대하여 ~5개 사본)의 탐지와 정량을 가능하게 한다(주의: 5개의 사본은 이질성 게놈 환경 내에서 서열의 탐지 동안 실시예 1에서 실험적으로 결정된 수이다). 이용된 방법은 앞서 기술된 방법에 따른다.
본 발명의 다른 측면에서는 자극(환경적 또는 화학적 동요)에 대한 반응으로 또는 시간의 흐름에서 전사체 수준의 변화를 측정하는 방법을 제시한다. 다시 말하지만, 현재의 방법은 PCR(J. Immunol. 2001. Mar 15: 166(6):3663-71), 또는 RTPCR(Biomaterials. 2003 Jul;24(15):2561-73)에 기초한다. 목적 전사체에 특이적인 프로브는 미소구체에 공액될 수 있고, 이의 형광 강도는 공지된 발현 수준의 전사체, 예를 들면, 하우스키핑 유전자와 비교될 수 있다. 전사체 수준이 자극이후 증가하면, 참고 프로브에 대한 검사 프로브의 MFI 비율은 1 이상이다. 전사체 수준이 감소하면, 상기 비율은 1 이하이다. 이러한 혼성화와 탐지에 표준 프로토콜이 이용된다.
본 발명의 다른 측면에서는 샘플에서 혼합된 세포 집단 내에서 키메리즘(chimerism) 또는 모자이크형(mosaicism)을 탐지하는 방법을 제시한다. 키메리즘은 2개의 유전적으로 상이한 접합체(zygote)로부터 유래된 세포로 구성되는 개별 샘플 또는 조직 샘플로서 정의된다. 모자이크형은 단일 접합체로부터 유래되는 유전형 또는 염색체 보체에서 구별되는 최소한 2개 또는 그 이상의 세포주를 포함하는 개별 샘플 또는 조직 샘플로서 정의된다. 가령, 비위상염색체 영역(nonpseudoautosomal region)으로부터 X 또는 Y 염색체 특이적 프로브는 키메리즘을 탐지하는데 이용될 수 있고, 모자이크형은 상반되는 성(가령, XX vs XY) 또는 상이한 성염색체 보체(즉, 45,X vs 46,XX)의 2개의 분화된 세포주로부터 세포로 구성된다. 이들 프로브는 비모자이크(nonmosaic) 또는 비키메라(nonchimeric)인 참고 세포주와 비교하여 사본 수 차이를 증명한다. 상염색체 참고 프로브를 이용하면, 예로써, 45,X 개체는 ~0.5의 평균 형광 비율을 나타내고, 46,XX 개체는 ~1.0의 비율을 나타낼 것이다. 모자이크 또는 키메라 구성을 갖는 개체는 키메라가 반대 성별로 구성되거나, 또는 모자이크가 상이한 성염색체 보체로 구성되면 0.5 내지 1.0의 비율을 나타낼 것이다. 인간에서 키메리즘의 실례는 자궁 내에서 이란성 쌍둥이(dizygotic twin)에 의한 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell)의 교환; 자궁 내에서 2개의 접합체의 한 개체로의 융합; 조직 또는 기관 이식 등이다. 현재, 키메리즘은 특정 암(Bernasconi P, Cavigliano PM, Genini E, Alessandrino EP, Colombo A, Klersy C, Malcovati L, Biaggi G, Martinelli G, Calatroni S, Caresana M, Boni M, Astori C, Beraasconi C, Leukemia. 1997 Nov;l 1(11): 1989-90; Smith A, RobsonLG, SharmaP, ShawPJ. Pathology. 1999 Feb;31(l):25-8.; NgIO, ChanKL, Shek WH, Lee JM, Fong DY, Lo CM, Fan ST. Hepatology. 2003 Oct;38(4):989-98)에서 또는 임신(O'Donoghue K, Chan J, de Ia Fuente J, KenneaN, Sandison A, Anderson JR, Roberts IA, Fisk NM. Lancet. 2004 Jul 10-16;364(9429):179-82)으로부터 유래하는 이성간 세포 이식(sex-mismatched cell transplant)의 사례에서 분열간기(interphase) FISH와 세포유전학과 같은 방법에 의해, 그리고 단일 세포 내에서 마이크로위성 탐지(microsatellite detection)와 같은 DNA 다형성 연구(Yu N, Kruskall MS, Yunis JJ, Knoll JH, UhI L, Alosco S, Ohashi M, Clavijo O, Husain Z, Yunis EJ, Yunis JJ, Yunis EJ. N Engl J Med. 2002 May 16;346(20):1545-52.)에 의해 탐지된다. 모자이크형은 FISH와 세포유전학과 같은 방법에 의해 주로 탐지되지만, 이러한 유전형은 다른 DNA 기초된 방법으로 탐지될 수도 있다(Lomax et al., Hum Genet. 1994 Mar;93(3):243-7; Krishnamoorthy et al, J Perinatol. 1995 Jan-Feb;15(l):47-50; Chen et al., Prenat Diagn. 2004 Oct;24(10):767-73).
본 발명의 다른 측면에서, 참고 서열과의 비교에 의한 조직 또는 혈장 내에서 바이러스 또는 세균 하중(load)의 정량이 가능하다. 현재의 방법은 ELISA, PCR, 또는 qPCR로 이런 세균 또는 바이러스 오염물질의 존재 또는 부재만을 탐지한다(Comp Med 2001 Oct:51(5): 406-12. Evaluation of diagnostic methods for Helicobacter bilis infection in laboratory mice., Hodzic, E et al.., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Nov 20;98(24):13687-92; J Clin Microbiol. 2005 Feb;43(2):716-20; Arch Dermatol Res. 2005 Feb;296(8):345-52. Epub 2005 Jan 4; J Virol Methods. JuI 7, 2005). 병원균 탐지를 위한 한 가지 방법은 현탁 어레이를 수반하지만(J Microbiol Methods. 2005 Jun 24 및 US Pats 6,821,754, 6,821,519, 6,818,397, 6,790,611, 6,709,812, 6,632,607, 6,627,198), 이들 각 사례에서, 혼성화에 앞서 특이적 병원균의 PCR 증폭이 요구된다. 현탁 어레이 분석을 이용하면, 목적하는 바이러스 또는 세균에 특이적인 검사 프로브는 미소구체에 공액될 수 있고 참고 프로브, 예를 들면, HOXB1로 조사될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 앞서 기술된 방법을 이용한 혼성화와 공지된 농도에서 샘플과의 비교로, 용액 내에서 DNA 이외의 핵산을 비롯한 핵산의 농도를 직접적으로 측정하는 방법을 제시한다. RNA 농도 측정을 위한 일부 현재의 방법은 고형 표면 서포트에 부착된 비드에 혼성화(Genome Research 14:2347-2356, 2004), PCR, qPCR에 의존한다. 결합된 핵산을 정량하도록 설계된 특허된 미소구체 현탁 어레이 방법은 산물의 사전 증폭을 필요로 한다(US 특허 6,620,586, 6,812,005, 6,355,431, 6,858,387).
본 발명의 다른 측면은 법의학적 또는 유전학적 소인 연구를 위한 관련성(relatedness)을 확립하기 위한 다형성 게놈 좌위에서 사본 수 차이의 결정을 가능하게 한다. 게놈 서열의 단편적 중복의 불안정성(instability)은 인간 게놈 내에서 일반적이다. 이러한 현상은 이들 중복과 측면에서 접하는 영역 내에서 유전자의 반수체기능부전(haploinsufficiency) 또는 증가된 사본 수를 유발하는 질병(통상적으로, 선천성)을 초래할 수 있다. 본 발명의 CMTlA 실례는 질병을 초래하는 사본 수 불안정성의 가장 먼저 공지된 실례 중의 하나였다.
일부 불안정한 단편적 중복은 엄격하게 병원성은 아니다. 개체(n=119) 사이에 사본 수 차이의 부분집합은 게놈 내에서 정상적인 변이 또는 다형성과 연관된다(Segmental duplications and copy-number variation in the human genome: Sharp AJ, Locke DP, McGrath SD, Cheng Z, Bailey JA, Vallente RU, Pertz LM, Clark RA, Schwartz S, Segraves R, Oseroff VV, Albertson DG, Pinkel D, Eichler EE.. Am J Hum Genet.2005 Jul;77(l):78-88.2005). 이들 다형성 좌위에서 사본 변이는 단일 집단에 국한되지 않는데, 이는 이들이 재발성 유전자 현상이거나, 복수 창시자(founder)에서 독립적으로 발생하거나, 또는 아프리카로부터 인류 이동(human migration) 이전에 존재하였음을 암시한다.
단편적으로 중복된 구간으로부터 게놈 프로브의 적절한 선택으로, 본 발명에서는 개체 사이에 사본 수 유전형이 어떻게 변하는 지를 결정할 수 있다. 개체의 DNA 지문(fingerprint)은 스펙트럼으로 별개의 미소구체에 공액된 충분한 많은 수의 이와 같은 프로브로 사본 수 결정을 수행함으로써 획득될 수 있다. 이들 프로브에 대한 사본 수 다형성 빈도는 상대적으로 높은데, 이는 이들 게놈 마커가 유전자 실체(genetic identity)의 법의학적 적용을 위하여 충분히 유익할 것임을 암시한다.
이들 동일한 단편적 중복은 일부 개체에서 감수분열(meiosis) 동안 생식체 재정렬(gametic rearrangement)이 발생하도록 하는 염색체 아키텍처(chromosomal architecture)를 대표한다. 이들 개체 자신은 영향을 받지 않지만, 소인성(predisposing) 염색체 배열을 갖는 영역 내에 단편적 2상염색체(aneusomy)를 보유하는 후손을 출생할 가능성이 더욱 높다. 다른 염색체 재정렬, 예를 들면, 상호(reciprocal) 전좌, 로버트슨(Robertsonian) 전좌와 점핑(jumping) 전좌, 역위, 동위염색체(isochromosome), 소형 마커 염색체(small marker chromosome)는 게놈 구조 또는 아키텍처에 관련된 재정렬에 취약하다. 단편적 두플리콘(duplicon), AT-풍부한 팔린드롬(palindrome)(Gotter AL, Shaikh TH, Budarf ML, Rhodes CH, Emanuel BS. Hum MoI Genet. 2004 Jan l ;13(l):103-15), 페리센트로미어 반복(pericentromeric repeat)은 이들 재정렬 중단점(rearrangement breakpoint)으로 국지화된다. 재정렬의 접점에서 재조합 산물의 분석은 상동성 재조합(homologous recombination)과 비-상동성 말단 결합(non-homologous end joining) 모두를 보였다(Shaw CJ and Lupski JR, Hum MoI Genet. 2004 Apr 1 ; 13 Spec No 1 :R57-64). 염색체의 단편적 중복된 영역 내에서 또는 이러한 영역에 인접하여 프로브의 적절한 선택으로, 비정상적 후손의 위험을 부수적으로 증가시키는 생식 염색체 재정렬(gametic chromosome rearrangement)의 위험이 어떤 개체에서 증가하는 지를 결정할 수 있다.
더 나아가, 사본 수에서 감소 또는 증가를 수반하지 않는 게놈 재정렬, 예를 들면, 역위 또는 전좌는 앞서 기술된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 역위된 또는 전좌된 서열의 5' 또는 3' 말단에 특이적인 프로브는 미소구체에 공액되고, 염색체 비정상을 보유하는 표지된 게놈 DNA(가령, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia)을 유발하는 ABL/BCR 전좌의 경우에 ABL)에 혼성화된다. 이후, 혼성화된 미소구체는 회수되고, 환자-유래된 서열은 공액된 서열로부터 소산되고, 비드는 원심분리되고, 소산된 가닥을 포함하는 상층액은 다음 단계에 이용된다. 그 다음, 회수된 단편은 접하지만 역위 또는 전좌에 관여하지 않는 서열(가령, 염색체 22 상에서 BCR)에 특이적인 검사 프로브를 이용한 차후 미소구체 혼성화 측정검사에서 표적으로서 이용된다. 혼성화와 탐지는 혼성화 반응이 기존의 혼성화(ABL)로부터 검사 프로브뿐만 아니라 새로운 검사 프로브(BCR)를 수반한다는 점을 제외하고, 앞서 기술된 바와 같이 수행된다. 이들 2개의 검사 프로브의 MFI 비율이 1에 필적하면, 이는 전좌 또는 역위가 성공적으로 확인되었음을 지시한다. 두 번째 검사 프로브가 혼성화되지 않으면, 어떤 비정상도 탐지되지 않았다. 첫 번째 검사 프로브와 비교하여 두 번째 검사 프로브의 MFI 비율은 1 이상의 비율이 되지 않는다. 현탁 어레이를 이용하는 선행 기술의 어떤 게놈 측정검사도 전좌 또는 역위의 존재를 탐지할 수 없다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서는 게놈 내에서 표적 핵산 서열의 사본 수를 정량하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 일반적으로, 개체로부터 표적 핵산 서열을 포함하는 핵산을 추출하고, 표적 핵산에 라벨을 부착하고, 표적 핵산 서열을 보충하도록 선택되는 미립자(particulate)-공액된, 적은 사본, 핵산 프로브를 제조하고, 프로브를 표적 핵산에 혼성화시켜 혼성화 반응 산물을 형성하고, 미립자의 탐지를 통하여 산물을 확인하고, 산물 상에서 라벨의 탐지를 통하여 표적 핵산 서열의 사본 수를 정량하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 미립자는 나노결정성 입자(nanocrystalline particle)를 포함하고, 더욱 적절하게는, 미립자는 나노구(nanosphere)를 포함하고, 이보다 더욱 적절하게는, 미립자는 미소구체(microsphere)를 포함하고, 가장 적절하게는, 미립자는 스펙트럼 상이한 중합체 미소구체를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 미소구체는 폴리스티렌을 포함하고, 더욱 적절하게는, 미립자는 결정된 스펙트럼 어드레스(spectral address)를 보유하는 내부-염색된 형광 폴리스티렌 비드를 포함한다. 일부 적용에서, 상기 방법은 미소구체 표면 상에서 생물학적 모이어티(biological moiety)에 형광색소를 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 적용에서, 상기 방법은 미소구체가 카르복실화되는 변형된 카르보디이미드 반응(carbodiimide reaction)을 통하여 미소구체에 프로브를 공액하거나, 또는 친전자성 사슬(electrophilic tether)을 이용하여 프로브에 미소구체를 공액하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 사슬은 N-클로로아세트아미도헥실 포스포라미디트(N-chloroacetamidohexyl phosphoramidite)를 포함한다. 추출된 표적 핵산은 게놈 DNA와 상보성 DNA에서 선택되는 DNA를 포함한다. 표지(labelling)는 시험관내 핵산 복제 반응 동안 직접적으로 표지된 확인가능 라벨로 새김눈 번역(nick translation)을 통한 표지(labeling), 말단 표지(end labeling), 무작위 프라이밍(random priming)을 비롯한 임의의 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 라벨은 형광단, 효소 공액체, 형광단-표식된 뉴클레오티드, 항원-보유 뉴클레오티드에 결합된 형광-표지된 항체, 비오틴-dUTP, 디곡시제닌-dUTP, 이들의 조합을 비롯한 임의의 통상적인 라벨일 수 있다. 적절하게는, 프로브의 핵산 서열은 개체의 게놈 내에서 적은 사본 또는 단일 사본 서열에 상보성이다. 하나이상의 염기쌍의 결실을 포함하는 표적 핵산의 전형적인 반응 비율(response ratio)은 상기 표적 핵산 서열의 정상적인 보체를 포함하는 참고 프로브와 비교하여 대략 0.1 내지 대략 0.75이다. 하나이상의 염기쌍의 삽입 또는 중복을 포함하는 표적 핵산의 전형적인 반응 비율은 표적 핵산 서열의 정상적인 보체를 포함하는 참고 프로브와 비교하여 대략 1.25 내지 대략 1.65이다. 유익하게는, 상기 방법은 별개의 핵산 서열을 포함하는 복수 프로브가 하나이상의 별개의 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미립자에 공액되고 표적 핵산에 혼성화되도록 개조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 미립자는 핵산 프로브의 3' 또는 5' 말단에서 비오틴 또는 아미노 모이어티에 결합된 스트렙타비딘-코팅된 또는 카르복실화된 비드를 포함하고, 50 nm 내지 1 ㎛의 직경을 보유한다. 부가적으로, 1 ㎍의 이질성 게놈 핵산 서열당 탐지되는 표적 서열의 양은 50 pg 내지 5 ng의 범위 내에 존재하고, 사본 수(copy number) 차이는 60 bp의 게놈 분해능(genomic resolution)으로 탐지된다. 적절하게는, 정량 단계는 유세포분석법을 이용하여 산물의 스펙트럼 어드레스를 탐지하는 단계를 포함한다. 프로브는 바람직하게는, 50 내지 2500개 염기, 더욱 바람직하게는, 70개 내지 대략 2500개 염기, 이보다 더욱 바람직하게는, 60개 내지 대략 1000개 염기, 이보다 더욱 바람직하게는, 80개 내지 800개 염기, 이보다 더욱 바람직하게는, 90개 내지 대략 110개 염기, 가장 바람직하게는, 대략 100개 염기의 길이를 갖는다.
다른 바람직한 구체예에서는 개체-유래된 게놈 또는 상보성 핵산 내에서 의심되는 염색체 비정상을 탐지하는 방법을 제시한다. 전반적으로, 상기 방법은 첫 번째 스펙트럼 어드레스를 보유하는 스펙트럼 인코딩된, 형광 미소구체를 제조하고, 비정상이 존재하는 것으로 의심되는 표적 핵산 서열을 뉴클레오티드 서열 별로 조사함으로써 표적 게놈 핵산 프로브 서열을 확인하고, 확인된 표적 게놈 핵산 프로브 서열에 따라 적은 사본 표적 프로브를 합성하고, 첫 번째 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미소구체에 표적 프로브를 공액하고, 표적 핵산 서열의 공지된 사본 수를 포함하는 참고 핵산 서열에 혼성화되도록 선택된 참고 프로브를 합성하고, 두 번째 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미소구체에 참고 프로브를 공액하고, 비정상을 보유하는 염색체 표적 서열과 표적 프로브를 반응시켜 상기 표적 프로브가 상기 표적 서열에 혼성화되도록 하고, 염색체 표적 서열을 포함하는 염색체 참고 서열과 참고 프로브를 반응시켜 상기 참고 프로브가 상기 참고 서열에 혼성화되도록 하고, 혼성화된 표적 프로브를 탐지하여 염색체 비정상의 존재를 조사하고, 혼성화된 참고 프로브를 탐지하고, 탐지된 혼성화된 표적 프로브의 반응을 탐지된 혼성화된 참고 프로브의 반응과 비교함으로써 탐지된 혼성화된 표적 프로브를 정량하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 비정상은 게놈 또는 상보성 핵산 내에서 서열의 사본 수 차이, 중복(duplication), 결실(deletion), 역위(inversion), 전위(transposition), 전좌(translocation), 이들의 조합에서 선택된다. 바람직한 형태에서, 상기 방법은 60 bp의 게놈 분해능으로 비정상을 탐지하는데 효과적이다. 이러한 바람직한 방법은 유세포분석법을 이용한다. 적절하게는, 적은 사본 프로브는 적용 또는 표적 핵산 서열에 따라, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개의 사본 수를 보유한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 미소구체-공액된 적은 사본 게놈 또는 상보성 핵산 프로브에 혼성화된 표지된 표적 핵산 서열의 유세포분석 탐지를 통한 염색체 비정상의 직접적인 게놈 정량 방법을 제시한다. 전반적으로, 상기 방법은 50 nm 내지 5.8 ㎛의 직경을 갖는 스펙트럼 인코딩된 형광 미소구체를 제조하고, 비정상이 존재하는 것으로 의심되는 표적 내에서 특정 핵산 서열에 혼성화되도록 선택된 적은 사본 표적 프로브를 합성하고, 표적 프로브를 미소구체에 공액하고, 표적 프로브를 표적 핵산 서열에 혼성화시키고, 유세포분석법으로 혼성화된 표적 프로브를 탐지하고, 유세포분석법의 결과에 기초하여 비정상을 정량하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 프로브의 핵산 서열은 앞서 정의된 바와 동일한 길이를 갖는다. 이런 방법은 게놈 또는 상보성 핵산 내에서 서열의 사본 수 차이, 중복, 결실, 역위, 전위, 전좌, 이들의 조합에서 선택되는 비정상을 탐지하고 정량하는데 특히 적합하다. 다른 바람직한 방법에서처럼, 상기 방법은 60 bp의 게놈 분해능으로 비정상을 탐지한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 염색체 비정상을 탐지하는 방법을 제시한다. 전반적으로, 상기 방법은 스펙트럼 인코딩된, 폴리스티렌 미소구체를 합성 DNA 서열에 결합함으로써 혼성화 프로브를 제조하고, 상기 프로브를 게놈 DNA에 혼성화시키고, 유세포분석법으로 혼성화 산물을 탐지하는 단계를 포함한다. 탐지가능 비정성과 분해능은 앞서 기술된 바와 동일하다. 이러한 구체예의 바람직한 형태에서, 상기 유세포분석 결과를 비정상에 상응하는 공지된 사본 수를 보유하는 혼성화 산물로부터 유세포분석 결과와 비교하는 단계가 더욱 포함된다. 적절하게는, 프로브는 적은 사본 또는 단일 사본이다. 유익하게는, 이들 바람직한 구체예에서 DNA는 증폭되지 않는다.
정의
달리 명시하지 않는 경우에, 본 명세서에 이용되는 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에 평균적인 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용되는 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원과 다른 출원 및 GenBank와 다른 데이터베이스로부터 서열은 순전히 참조로서 편입된다. 본 섹션에서 열거된 정의가 본 명세서에서 인용되는 출원, 공개된 출원과 다른 출원 및 GenBank와 다른 데이터베이스로부터 서열에서 열거된 정의와 상반되거나 불일치하는 경우에, 본 섹션에서 열거된 정의가 본 명세서에 참조로서 편입되는 정의보다 우선한다.
본 명세서에서, "하나"는 표현은 "최소한 하나" 또는 "하나이상"을 의미한다.
본 명세서에서, "핵산"은 특히, 단일-가닥, 이중나선, 삼중나선, 선형과 원형 형태를 비롯한 임의 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 및/또는 리보핵산(RNA)을 지칭한다.
본 명세서에서, "참고 프로브"는 2개 이외의 다른 사본 수에서 매우 해롭고 치명적인, 게놈 내에서 가급적 상염색체 서열로부터 좌위에 특이적인 프로브를 의미한다. 이러한 참고 프로브는 환자 샘플 내에서 정상적인 염색체 보체를 포함한다면, 낮은 또는 단일 사본 염색체 좌위로부터 유래될 수 있다. 선천성 질환의 진단을 위한 게놈 사본 수의 결정에서, 참고 프로브는 전형적으로, 정상적인 발달 동안 2개의 대립유전자로부터 발현되어야 하는 하나이상의 유전자로부터 상염색체 기원일 것이다. 신생물 질환의 진단을 위한 게놈 사본 수의 결정에서, 참고 프로브는 종양유전자가 없고 정상적인 염색체 보체를 포함하는 염색체 도메인으로부터 선택된다.
본 명세서에서, "라벨"은 탐지가능한 물리적 특성을 갖는 화학적 기 또는 모이어티, 또는 화학적 기 또는 모이어티가 탐지가능한 물리적 특성을 나타내도록 할 수 있는 임의의 화합물, 예를 들면, 기질의 탐지가능 산물로의 전환을 촉매하는 효소를 지칭한다. "라벨"은 또한, 특정한 물리적 특성의 발현을 저해하는 화합물을 포괄한다. "라벨"은 결합 쌍의 한 구성원인 화합물일 수도 있는데, 이의 다른 구성원은 탐지가능한 물리적 특성을 갖는다. 전형적인 라벨에는 질량 기(mass group), 금속, 형광 기, 발광 기, 화학발광 기, 광학 기, 전하 기(charge group), 극성 기, 물감(colors), 합텐(hapten), 단백질 결합 리간드, 뉴클레오티드 서열, 방사성 기, 효소, 미립자 입자, 이들의 조합이 포함된다.
본 명세서에서, "샘플"은 분석되는 표적 핵산을 포함하는 존재를 지칭한다. 샘플은 생물학적 샘플, 예를 들면, 생물학적 유체 또는 생물학적 조직일 수 있다. 생물학적 유체의 실례에는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액(cerebral spinal fluid), 눈물, 점액, 양수(amniotic fluid) 등이 포함된다. 생물학적 조직은 연결 조직, 상피 조직, 피부 조직, 근육 조직, 신경 조직을 비롯하여, 인간, 동물, 식물, 세균, 진균, 또는 바이러스 구조의 구조적 재료 중에서 하나를 형성하는 세포내 물질(intercellular substance)과 함께, 통상적으로 특정 종류의 세포 집합체이다. 생물학적 조직의 실례에는 장기, 종양, 림프절, 동맥 및 예로써, 혈장, 혈액 또는 소변으로부터 분리되거나, 또는 고형 조직(solid tissue)의 콜라게나아제(collagenase) 처리에 의한 개별 세포의 집합 역시 포함된다.
본 명세서에서, "증폭"은 측정검사 민감성을 개선하기 위하여 샘플 내에서 표적 분석물 핵산을 기하급수적으로 복제하는 방법을 지칭한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 핵산을 증폭하는 여러 상이한 방법이 당분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서, "세트"는 단일 Ic 프로브 또는 Ic 프로브의 집합으로 공액된 동일한 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미소구체의 집합을 지칭한다.
본 명세서에서, "적은 사본" 또는 "Ic"는 게놈 내에 표적 핵산 또는 위치에서 10개 또는 그 이하의 서열 구간에 혼성화되는 서열을 지칭한다. 사본 수는 바람직하게는, 10개 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는, 7개 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는, 5개 또는 그 이하, 가장 바람직하게는, 3개 또는 그 이하다.
본 명세서에서, "단일 사본" 또는 "sc"는 게놈 내에 표적 핵산 또는 위치에서 3개 또는 그 이하의 서열 구간에 혼성화되는 핵산 서열을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 엄격하게 유일한 서열(즉, 상응하는 게놈 내에서 하나의 서열에만 상보성인 서열) 및 두플리콘(duplicon)과 트리플리콘(triplicon)을 포괄한다.
본 명세서에서, "고도로 반복되는"은 10개 이상의 사본이 존재한다는 것을 의미한다.
도 1은 적은 사본 프로브-결합된 미소구체 혼성화 측정검사의 개요다;
도 2에서는 170개의 반응물로부터 수집된 참고 프로브(HOXB1c)에 대한 적은 사본 검사 프로브의 쌍(16-1b, 16-2b, PMP22, TEKT3)의 기하 평균 비율(geometric mean ratio)(x-축)의 비교를 도시한다.
도 3에서는 HOXB1을 각 샘플에 대한 내부 게놈 참고 프로브로서 이용하여, 샘플; A) 16-2b가 변화되지 않음(샘플 47, 16-2b:HOXB1 비율 = 0.86, 표 2), B) TEKT3이 중복됨(CMT1A-1, TEKT3:HOXB1 비율 = 1.40, 표 2), C) 16-1b가 결실됨(샘플 33, 16-1b:HOXB1 비율 = 0.49)에 혼성화된 복합된 적은 사본 프로브-미소구체의 형광 탐지(fluorescence detection)의 막대그래프를 도시한다.
도 4에서는 염색체 15q11-13 상에서 PWS/AS 영역의 지도를 도시한다.
도 5는 실시예 2에서 획득된 모든 QMH MFI 비율의 요약이다.
아래의 실시예에서는 본 발명의 바람직한 구체예를 열거한다. 본 실시예에서는 인간 게놈 내에서 반접합성(hemizygosity), 삼배체, 중복, 삽입의 탐지 및 용액 내에서 핵산의 정량을 설명한다. 하지만, 상기 실시예는 예시를 목적으로 하고, 본 발명의 범위를 결코 한정하지 않는다.
실시예 1
재료와 방법
미소구체-공액된 프로브의 선택, 결합과 혼성화
프로브 선택. 5개의 Ic 프로브를 개발하고(Rogan et al, 2001; Knoll and Rogan, 2004) 환자 샘플에서 게놈 사본 수 차이를 구별하는 연구에 이용하였다. 이들은 다음과 같다: (i/ii) 만성 골수성 백혈병(CML) 환자의 부분집합에서 결실되는, ABL1의 인트론 Ib 내로부터 염색체 9q34 프로브(16-1과 16-2), (iii/iv) CMTlA 중복된 영역 내에 존재하는 TEKT3과 PMP22를 인식하는 염색체 17pl2 프로브(Inoue et al, 2001), (v) HOXB1을 인식하는 참고 염색체 7p15 프로브(이배체 게놈당 2개의 사본). 프로브 길이, 혼성화 온도, 게놈 좌표(coordinate)는 표 1에 기재된다. 각 프로브는 게놈 내에서 관찰되는 프로브의 전장에 대하여 결정된 사본 수를 보유하였다; 하지만, 일부 상동성 적은 사본 서열은 이들 프로브의 작은(<200개 염기) 단편 내에서 관찰되었다.
적은 사본(Ic) 프로브 합성. 각 Ic 프로브-특이적 쌍의 단일 프라이머(22-24개 뉴클레오티드 길이)는 미소구체에 결합을 위하여 5' 아미노-변경유전자 C-12(Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa)로 합성하였다. 대조 인간 게놈 DNA(Promega, Madison, Wisconsin)를 Ic 프로브 합성을 위한 주형으로 하여, Pfx(Invitrogen, Carlsbad, California)를 이용한 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 각 프라이머 쌍(변형된 프라이머와 변형되지 않은 프라이머)으로 수행하였다. PCR 산물은 낮은 EEO 아가로스(Seakera, FMC Bioproducts, Rockland, Maine)에서 전기영동으로 분리하고 마이크로-스핀 칼럼 원심분리(micro-spin column centrifugation)(Qiagen, Valencia, California)로 추출하였다. 산물은 분광계(spectrophotometer)를 이용하여 정량하고, 이후 각 미소구체에 결합된 평균 120,000개의 DNA 분자를 보유하는 미소구체에 공액하였다.
미소구체에 프로브의 결합. 각각, 별개의 스펙트럼 어드레스(R1-R9; Molecular Probes, Eugene, Oregon)를 보유하고 대략 200,000개의 카르복시-부위로 코팅된 형광 미소구체는 상이한 Ic 프로브에 개별적으로 공액하였다. 정제된 아미노-변형된 Ic 프로브는 변형된 카르보디이미드 결합 절차(Dunbar et al, 2003; Fulton et al, 1997)를 통하여 카르복실화된 미소구체에 결합시켰다. 각 프로브는 먼저 열 변성하고, 이후 얼음 위에서 순간 냉각시켰다. 동일한 스펙트럼 특성을 갖는 대략 3.125 x 105개 미소구체는 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 튜브(USA Scientific, Ocala, Florida) 내로 피펫으로 옮기고, 10,000 g에서 2분간 원심분리하고, 상층액을 배출하였다. 150 ㎕의 0.1 M MES 완충액(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) pH 4.5를 각 튜브에 추가하고, 미소구체는 짧게 와동(vortexing)시키고, 이후 10,00O g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 미소구체는 80 ㎕의 0.1M MES 내에서 와동으로 재현탁하였다. 단일 Ic 프로브(0.5 nmol)를 각 튜브에 추가하고, 와동으로 혼합하였다. 1.25 ㎕ 부피의 새로운 10 ㎎/㎖ 1-에틸-3-3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드염산염(EDC) 용액을 추가하고, 반응물은 짧게 와동시키고 수시로 혼합하면서 어둠 하에 30분간 배양하였다. EDC의 혼합과 배양은 각각 1.25 ㎕의 새로 제조된 EDC 용액을 이용하여 2회 반복하였다. 반응은 500 ㎕ 0.02% Tween20의 추가로 중단시키고, 이후 와동시키고 10,000 g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액의 제거이후, 250 ㎕의 0.1% SDS를 각 튜브에 추가하고, 와동시키고, 10,000에서 2분간 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 25 ㎕의 0.1M MES pH 4.5를 추가하고, 튜브를 와동시키고 어둠 하에 4℃에서 보관하였다. 결합된 미소구체 농도는 100 ㎕의 1X PBS에 1 ㎕의 각 미소구체를 추가하고, 아래에 제시된 조건을 이용하여 FACSCalibur 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, California)에서 분석함으로써 정량하였다.
게놈 DNA 주형 제조
게놈 DNA 주형은 임상적 세포유전학적 특성화이후 남아있는 환자 샘플로부터 또는 NIGMS-Coriell Cell Repository(Camden, New Jersey)로부터 획득된 세포주로부터 유래된 메탄올-아세트산 고정된 세포 덩어리로부터 제조하였다. 고정된 세포는 1X PBS로 2회 세척하고, 이들의 농도는 혈구계(hemocytometer)로 결정하였다. 게놈 DNA 주형은 샘플당 ~600개의 고정된 세포로부터 추출하였다. 상기 DNA는 GenomiPhi 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 시험관내에서 복제하고, 이후 15℃에서 60분간 비오틴-16 dUTP로 새김눈-번역하여(1 ㎍) 300 bp 내지 1 kb 길이의 표지된 산물을 획득하였다(Knoll and Lichter, 1994). 50 ng의 새김눈-번역된 환자 샘플은 각 혼성화 측정검사에서 분석하였다.
상기 방법을 검증하는데 이용되는 샘플은 통상적인 세포유전학적 분석 및/또는 형광 in situ 혼성화(FISH)에 기초하여, 염색체 9q34와 염색체 17p12에 대한 사 본 수 차이를 나타내는 것으로 공지되었다. 이들 검사 샘플에 대한 세포유전학적 조사결과는 표 2에 기재된다.
이들 샘플은 CML 환자로부터 5개 샘플을 포함하는데, 이들 중에서 2개(샘플 33, 81)는 특징적인 염색체 9;22 전좌 이외에, 일치된 염색체 9q34 ABL1 결실(10%의 환자에서 관찰됨; Sinclair et al, 2000)을 보유하고, 3개의 샘플(샘플 38, 47, 86)은 결실 없이, 염색체 9;22 전좌만을 보유하였다; 완전 삼배체 9를 보유하는 세포주로부터 2개의 샘플(GM09286과 GM10186); 염색체 9q34 중복을 보유하는 세포주로부터 1개의 샘플(GM06074); 염색체 17pl2 중복을 보유하는 샤르코-마리-투스 병(Charcot-Marie-Tooth Disease) 타입 1A 환자로부터 5개의 샘플(CMT1A-1 내지 4 및 GM12214). 남아있는 고정된 세포의 이용에 대하여 임상시험 심사 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았다.
혼성화 반응. 혼성화를 위하여, 50 ng의 각 샘플은 5,000개의 Ic 프로브-결합된 미소구체를 포함하는 40 ㎕ TMAC 혼성화 완충액(3-mol/ℓ 테트라메틸암모늄 염화물, 50mmol/ℓ Tris-HCl, pH 8,0, 1g/ℓ 사르코실(sarkosyl))에서 희석하였다. 혼성화 반응물은 95℃에서 3분간 열 변성하고, 이후 프로브 뉴클레오티드 조성과 길이에 따라 45℃ 내지 51℃에서 하룻밤동안 혼성화시켰다(Lewin, 1980)(표 1). 혼성화된 미소구체는 25O ㎕의 1.5X TMAC(Dunbar et al, 2003)으로 세척하고, 이후 10,000 g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 1.5X TMAC에 담긴 12 ㎕의 1:50 희석된 리포터 분자, 스트렙타비딘- 피코에리트린(SPE; Molecular Probes)를 추가하여 비오틴을 보유하는 게놈 표적을 탐지하였다. 반응물은 혼성화 온도에 서 12분간 배양하였다. 표지(labeling)후, 250 ㎕의 1.5X TMAC를 각 반응물에 추가하고, 혼합하고, 10,000 g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 혼성화된 미소구체는 70 ㎕의 1.5X TMAC에 재현탁하였다.
혼성화된 미소구체-결합된 적은 사본 프로브의 유세포분석 탐지. 혼성화 반응물은 FACSCalibur 유세포분석기에서 분석에 앞서 300 ㎕ 1X PBS에 희석하였다. 반응물당 대략 5,000개 미소구체의 각 세트를 분석하였다. 미소구체에 결합된 상보성 프로브에 혼성화된 각 표적의 신호는 SPE의 형광 강도로부터 결정하였다. 피코에리트린(PE)의 방출 파장과의 중복을 최소화도록 선택된 조화성 미소구체 스펙트럼 어드레스는 동일한 공액되지 않고 혼성화된 미소구체로부터 획득된 결과를 비교함으로써 확증하였다. 각 반응물에서, 표적 DNA를 제외하고 모든 성분을 포함하는 반응 튜브는 FL2(PE) 탐지 채널에서 배경 형광(background fluorescence)을 결정하기 위한 음성 대조로서 이용하였다. 유세포분석기의 상이한 형광색소 탐지 채널의 강도 교정(intensity calibration)에 형광 비드 기준(LinearFlow Flow Cytometry Intensity Calibration Kit; Molecular Probes)이 이용되었다. 상기 장치는 또한, 등가의 가용성 형광색소(MESF) 단위의 분자에서 교정된 표면-표지된 비드에 기초하여, 형광 참고 기준(Quantum R-PE MESF Medium Level Kit; Bangs Laboratories, Fishers, Indiana)로 교정하였다.
최적 광전증폭관 관전압(tube voltage) 설정은 정상적인 유전형을 나타내는 단일 환자 DNA 샘플에 혼성화된 2개의 상이한 프로브의 형광 강도 사이에 차이를 최소화하는 광전증폭관 관전압 설정을 선택함으로써 결정하였다. 이들 설정은 산술 평균(arithmetic mean), 기하 평균(geometric mean), 중간과 피크 채널의 장치-유래된 형광 치수(CellQuest; Becton Dickinson)로부터 결정하였다. FACSCalibur 장치에 대한 전형적인 광전증폭관 관전압 설정은 FSC(전방 산란) = EOO(신호 증폭 없음), SSC(측면 산란) = 344 V, FLl= 727 V, FL2 = 640 V, FL3 = 300 V, FL4 = 500 V. FSC, FL1, FL2, FL3에 대한 역치는 52 V의 디폴트(default)로 설정되었다. FSC 역치는 일차 파라미터로서 선택되고 52 V의 수치를 보유하고, 이차 파라미터는 SSC로 설정되고 125 V의 수치를 보유하였다. 유속은 낮게 설정되고, 이용된 외피 유체(sheath fluid)는 FACsFlow(Becton Dickinson)이었다. 상기 시스템은 임의의 잔류하는 미소구체를 제거하기 위하여 2-5 ㎖의 증류수로 작업(run) 사이에 세척하였다. CellQuest가 데이터 수집과 분석에 이용되었다. 데이터 분석은 WinMDI2.8 유세포분석법 패키지(WinMDI; J. Trotter, SaIk Institute, La JoIIa, California)를 이용하여 수행하였다.
조사된 프로브의 대부분은 조성에 대한 별다른 최적화(optimization)를 요구하지 않았는데, 그 이유는 프로브 특성이 프로브를 설계하는데 이용되는 서열의 적은 사본 성격에 주로 좌우되기 때문이었다. 다른 게놈 좌위에 파라로거스인 서열에 대한 형광 강도 비율은 확립된 신뢰 수준 또는 공지된 유전형을 벗어났다(데이터 제시하지 않음). 이는 다른 게놈 단편에 엄격하게 상동성인 Ic 프로브를 이용함으로써 회피되었다. 이들 최적 전압 설정은 측면산란기(sidescatter, SSC) 플롯을 이용한 CellQuest로 가시화되는 바와 같이, 상이한 스펙트럼 어드레스를 보유하는 조밀하게 밀집된 미소구체를 결과하였다. 비-최적 전압 파라미터는 폭넓은 FL2 피크 또는 비-선형 데이터를 결과하였다(Bagwell et al, 1989; Brown et al, 1994).
먼저, 모든 프로브가 혼성화 반응물 내에서 상응하는 PCR 산물을 탐지할 수 있음을 확인하고, 프로브 공액 및 미소구체에 혼성화가 유효함을 확립하였다. 정제된 ABL1(16-1, 16-2), TEKT3, PMP22, HOXB1 산물은 단일 5' 비오틴화된 프라이머를 이용하여 정상적인 게놈 DNA(Promega)로부터 증폭하였다. 비오틴화된 PCR 산물은 상보성 미소구체-공액된 프로브에 혼성화시키고 SPE로 탐지하였다. 혼성화된 미소구체 총수와 평균 형광 강도는 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 측정하였다. 일단의 미소구체에 대한 혼성화된 Ic 산물의 밀도는 단일 비드의 양(출입 통제된 측면 산란기 비드 총수로부터)을 혼성화된 비드의 수(출입 통제된 비드 신호 총수와 평균 형광 강도 수준)와 비교함으로써 산정하였는데, 이는 카르보디이미드 결합 절차의 공액 효율을 결정하였다. 미소구체-공액된 Ic 프로브의 표적 서열에 대한 특이성은 상동성 프로브 vs. 이질성 프로브로 독립된 혼성화 측정검사의 반복된 유세포분석 작업의 평균 형광 강도를 비교함으로써 결정하였다. 각 프로브의 혼성화는 일정한 범위의 어닐링 온도(annealing temperature)(45℃ 내지 6O℃)에서 최적화되었다.
프로브 특이성과 민감성의 확인
게놈 재구성 실험. 복잡한 게놈 환경 내에서 Ic 프로브의 특이성을 조사하기 위하여, Ic 프로브-결합된 미소구체는 과량의 전단된 소 흉선 DNA(Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey)의 존재에서, 상응하는 정제된 PCR 산물에 혼성화시켰다. 16-1a, 16-2a, HOXB1a에 대한 독립적인 혼성화 반응은 각 프로브에 대한 10,000개의 미소구체, 5 ng의 상응하는 PCR 산물, 50 ng의 새김눈-번역된 소 흉선 게놈 DNA로 수행하였다. 혼성화된 산물의 탐지가능한 최소량을 산정하기 위하여, 일련의 희석된 PCR 산물(각 혼성화 반응물에 대하여 5-150개의 게놈 등가체)을 ~1:300 내지 1:10 몰 비율의 PCR 산물:소 흉선 DNA로 10 ng의 전단된 소 흉선 DNA에 추가하였다.
16-1a, 16-2a, HOXB1a에 대한 Ic 프로브-공액된 미소구체 및 각각 5 ng의 이들의 상응하는 PCR 산물로 복합 혼성화 역시 1O ng의 전단된 소 흉선 게놈 DNA의 존재 또는 부재에서 수행하였다. 부가적으로, 미소구체 교환 실험을 수행하였는데, 여기서 Ic 프로브 16-1a는 상이한 스펙트럼 어드레스를 보유하는 2개의 미소구체 세트(R2와 R9)에 공액되고, 복합 반응물 내에서 상응하는 PCR 산물에 혼성화시키고, 평균 형광 강도 수준은 각 미소구체 세트에서 비교하였다.
통계학적 분석은 MATLAB(MATHWORKS, Natick, Massachusetts)을 이용하여 수행하였다. 검사 프로브와 참고 프로브 사이에 평균 형광 비율은 산술 평균을 이용하여 보고된다(Coder et al, 1994). 잔류물은 평균 형광 비율과 피크 채널 수치를 공지된 유전형에 기초한 예상 수치에 일치시킴으로써 산정하였다.
결과
혼성화 측정검사의 특이성
미소구체에 결합된 Ic 프로브에 상동성인 PCR 산물은 카르보디이미드 결합 절차의 표지 효율(labeling efficiency)을 조사하기 위하여 혼성화 반응에서 표적 DNA로서 이용하였다. 배경 형광 초과의 SPE 평균 신호(FL2 채널)(>10') 및 반응물 내에 존재하는 PCR 산물에 혼성화된 미소구체의 수에 기초하여, 98%(+/-0.4%)의 미소구체가 표적 PCR 산물에 혼성화되었다(데이터 제시하지 않음).
게놈 재구성 실험은 Ic 프로브 16-1a, 16-2a, TEKT3이 소(Bos taurus) 게놈 내에서 어떤 서열에도 상동성이 아님을 증명하였다(>75%). 서열 분석에 기초하여, 긴뿔소(Bos taurus) 게놈은 프로브 16-1, 16-2, TEKT3, PMP22에 밀접하게 관련된 서열을 포함하지 않았다. 이들 SPE 신호에 대한 배경 수준 미만의 평균 형광 강도가 일관되게 관찰되었다. 대조적으로, HOXB1a는 혼성화 측정검사에서 12.81의 평균 형광 강도를 나타내는데, 이는 상기 프로브가 긴뿔소(Bos taurus) 게놈 내에서 HOXB1 서열에 90% 상동하다는 점에서 예상됐던 것이다.
공액된 Ic 프로브 16-1a와 16-2a는 이질성 게놈 배경 내로 주입된 탐지된 상동성 서열을 탐지하였다. 탐지 민감성은 산물 농축으로 SPE 평균 형광 강도의 증가에 기초하여, 존재하는 프로브의 양에 선형으로 관련되었다(데이터 제시하지 않음. 미소구체 교환 실험은 이들 결과가 미소구체의 스펙트럼 어드레스와 무관하다는 것을 증명하였다. 동일한 프로브에 공액된 상이한 미소구체 강도에 대한 평균 혼성화 신호 강도는 신호 강도(signal intensity)에서 매우 유사한 수치를 제공한다. 가령, 샘플 47의 경우에, 미소구체 R2에 공액된 프로브 16-1a의 복합 혼성화는 32.8의 평균 형광 강도를 산출하고, 미소구체 R9는 32.02의 평균 형광 신호를 제공하여, ~2%의 차이가 존재한다. 샘플 33의 경우에, 이러한 동일한 프로브의 평균 형광이 상이한 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미소구체에 대하여 ~13% 변화되었다(41.88 vs. 36.16).
프로브 길이의 최적화
혼성화 신호에 대한 프로브 길이의 효과를 조사하기 위하여, 변하는 길이의 프로브를 미소구체에 공액하였다. 프로브 16-2의 부분집합인 Lc 프로브 16-2a(1381개 염기)와 16-2b(101개 염기)는 스펙트럼으로 별개의 미소구체의 표면에 결합시키고, 단일 혼성화 반응물 내에서 샘플 47(이는 16-2 좌위에서 정상적인 유전형을 보유한다)에 복합시켰다. 놀랍게도, HOXB1c에 대한 더욱 짧은 16-2b 프로브의 평균 형광 신호 비율은 상응하는 16-2a 비율에 대략 2배였다. 염색체 9 결실 환자로부터 DNA(샘플 33)로 복합 실험은 16-2a와 16-2b 프로브가 HOXB1c 참고보다 낮은 신호 - 각각, 52%와 66%를 나타낸다는 것을 증명하였다. 결실 환자가 HOXB1c와 비교하여 절반 사본 수의 16-2를 보유하기 때문에, 더욱 짧은 16-2b 프로브로 획득된 신호는 이들 개체 내에서 실제 사본 수를 더욱 정확하게 반영하는 것으로 보인다. 상응하는 PCR 산물과 대조 게놈 DNA에 독립적으로 혼성화되는 경우에, 미소구체에 공액된 프로브 16-1의 부분집합(16-1a[2304bp]와 16-1b[100 bp])으로 유사한 결과가 획득되었다. 양쪽 프로브는 PCR 산물과 대조 게놈 DNA 모두에 성공적으로 혼성화되긴 하지만, 16-1a 반응물에 대한 SPE 형광 분포(fluorescence distribution)가 16-1b에 대한 SPE 형광 분포보다 훨씬 넓었다. 더욱 짧은 프로브(~100 염기)에 공액된 미소구체는 완전히 한정된 평균 형광 분포와 일관되게 높은 PE 수치를 산출하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 공액체는 제조후 2주일 이내에 감퇴된 혼성화 효율을 나타내는 더욱 긴 공액된 프로브와 달리, 어둠 하에 4℃에서 보관될 때 공액후 2개월 이상 동안 혼성화 반응에 이용될 수 있다
더욱 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브(HOXB1e와 16-1c)는 공지된 샘플의 유전형을 특성화하는데 적합한 것으로 입증되었다. 이들 프로브는 사본 수를 구별할 수 있는, 참고 프로브에 대한 검사 프로브의 MFI 비율을 산출하였다. 가령, 삼배체 9 세포주, GM09286로부터 DNA는 검사 프로브 16-1c(62개 염기)와 참고 프로브 HOXB1e(62개 염기)와 혼성화되어 1.28의 MFI 비율을 산출하였다. 이러한 MFI 비율은 16-1c 서열의 3개 사본의 존재와 일치한다.
9q34가 결실된 샘플에서 감소된 게놈 사본 수의 탐지
염색체 9q34 결실과 정상적인 대조 샘플의 유전형은 형광 강도의 비교에 기초하여 구분가능하였다. 맹검 연구(blind study)에서, 16-2b와 HOXB1c에 공액된 미소구체는 개별 반응물 내에서 샘플 33과 샘플 47 게놈 DNA에 혼성화되었다(도 3). 도 3의 막대그래프에서, 각 샘플에서 검사 프로브와 참고 프로브에 대한 형광 강도 신호(FL2 피코에리트린, x-축) vs. 미소구체 총수(y-축)를 좌표로서 기입한다. HOXB1c 참고 프로브에 대한 16-2b 프로브의 평균 형광의 비율(표 2)은 샘플 33(비율 = 0.67)에서 16-2b에 대한 더욱 적은 사본 수를 지시하고, 이는 상기 좌위의 1개 사본의 결실과 일치하는데, 이는 프로브 16-2a를 이용한 scFISH에 의해 앞서 증명되었다. 샘플 47(비율 = 0.96)에서 양쪽 프로브에 대한 유사한 신호 강도가 관찰되었는데, 이는 정상적인 유전형과 일치한다. 샘플 33과 81에서 HOXB1c에 대한 프로브 16-1b의 평균 형광 비율 역시 FISH 결과와 일치하였는데, 이는 양쪽 환자에서 16-1a의 1개 사본의 결실을 증명한다.
샘플 33과 38은 이후, 별개의 복합된 반응물 내에서 프로브 16-1b, 16-2b, HOXB1c와 혼성화되었다. HOXB1c 프로브와 비교하여, 샘플 33은 16-1b의 경우에 61% 및 16-2b의 경우에 51%의 평균 형광을 보였다. 샘플 38 혼성화는 유사한 HOXB1c, 16-1b(87%), 16-2b(89%) 평균 형광 수준을 보였다. 이들 결과는 FISH 데이터와 일치하는데, 이는 샘플 33이 ABL1에 대한 반접합성 결실을 보유하는 반면, 샘플 38이 이러한 결실을 보유하지 않는다는 것을 증명한다.
5'ABL1 결실을 보유하는 샘플과 이러한 결실을 보유하지 않는 샘플에 대한 16-1 대 HOXB1 및 16-2 대 HOXB1의 신호 강도 비율은 도 2에 그래픽으로 도시된다. 도 2에서, 샘플은 검사 프로브(y-축)에 의해 분류된다. 상자(점선)가 각각의 상이한 유전형 군 주변으로 그려진다(왼쪽 = 염색체 결실, 중앙 = 정상, 왼쪽 = 염색체 중복). 수직선은 각 유전형에 대한 이론적 MFI 비율(결실 샘플, 정상 샘플, 중복 샘플에 대하여 각각, 0.5, 1.0, 1.5)을 지시한다. 지시된 바와 같이, 각 유전형 내에서 모든 샘플에 대한 MFI 비율은 다른 유전형과 겹쳐지지 않는다. 일반적으로, 2염색체성(disomic) 보체로 조사된 모든 샘플은 16-1 또는 16-2 유래된 프로브에 대하여, 1에 근접한 HOXB1 평균 형광 강도에 비례하는 비율을 보유하고, 5'ABL1 결실을 보유하는 샘플은 0.5에 근접하는 비율을 보유한다(표 5). 이러한 기하 평균과 중앙값은 본 발명의 혼성화 측정검사에서 신호에 대한 형광 강도의 가장 정확한 척도를 제공하는데, 그 이유는 이들 계량치가 조사된 모든 유전형에서 예상 비율에 대한 회귀(regression)에서 최소의 잔차 분산(residual variance)(0.10)을 나타내기 때문이다.
3염색체성 9개 세포주에서 염색체 9q34의 증가된 사본 수의 탐지
삼대립형질(triallelic) 사본 수를 이대립형질 사본 수로부터 구별할 수 있는 지를 조사하기 위하여, 프로브 16-1b는 9q34에 대한 3염색체성 세포주로부터 DNA에 혼성화시키고, 상기 영역에서 2염색체성인 샘플 47과 비교하였다(표 2). HOXB1c와 16-1b 둘 모두 단일 혼성화 반응물 내에서 복합되었다. 세포주 GM09286(비율 = 1.34), GM10186(비율 = 1.40), GM06074(비율 = 1.26)는 각각, HOXB1c와 비교하여 16-1b에 대한 현저하게 높은 평균 형광을 보이는 반면, 양쪽 프로브는 샘플 47(비율 = 0.96)에 대한 유사한 평균 형광 신호를 보였다. 1.5의 예상된 비율로부터 편차는 Ic 프로브 16-1b의 안정성, 다시 말하면, 낮은 구아닌-시토신(GC) 함량, 또는 조사된 게놈 영역의 2차 구조에 기인하고, 더욱 적은 미소구체-결합된 표적을 유발하는 것으로 생각된다. 이러한 측정검사는 3개의 세포주 모두에서 염색체 9q34 서열의 부가적인 사본 및 샘플 47에서 상기 서열의 정상적인 사본 수를 증명하는 기존의 세포유전학적 결과와 FISH 결과를 뒷받침한다(표 5).
CMT1A 환자에서 염색체 17p12 영역의 증가된 사본 수의 탐지
FISH-확증된 염색체 17p12 중복을 보유하는 5명의 CMT1A 환자 및 상기 염색체 영역 내에서 정상적인 핵형(karyotype)을 보유하는 샘플 86으로부터 게놈 DNA는 미소구체에 공액된 TEKT3 또는 PMP22 및 HOXB1c Ic 프로브와 혼성화시켰다. 모든 CMTlA 환자 샘플은 TEKT3에 대한 혼성화에서 평균 형광 강도 신호의 유사한 편차(HOXB1c보다 28-40% 높은 범위)를 나타내는데, 이는 상기 좌위의 3개 사본의 존재를 반영한다(도 3). 샘플 86은 2개의 프로브에 대한 평균 형광 신호 강도에서 2% 차이만을 보였다(표 2). PMP22와 HOXB1로 조사된 동일한 CMT1A 샘플의 복합 분석에 서 유사한 결과가 획득되었다(HOXB1c와 비교하여 28.5 내지 54% 높은 범위; 표 2 참조). CMT1A-1과 CMT1A-2에 혼성화된 미소구체-결합된 TEKT3과 HOXB1과의 독립적인 복합 혼성화는 이들 결과가 재현가능함을 증명하고, CMT1A-2의 경우에 2% 이하 및 CMT1A-1의 경우에 16% 변화되는 평균 형광 강도 비율을 산출하였다(표 2). 이들 비율은 17p12 중복을 보유하는 샘플에 대한 1.5의 예상치 인근에서 밀집화(clustering)(1.26 - 1.85)를 지시한다(도 2)(표 5).
이러한 기하 평균 또는 중간 형광 비율은 혼성화 측정검사를 위한 최적의 척도인 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 상기 비율이 유전형 사이에 중복 없이 모든 유전형에 대한 최소의 신뢰 수준과 잔차를 제공하였다(도 2). 모든 유전형에서 예상 비율에 대한 각 비율 범주에서 데이터의 복수 선형 회귀는 산술 평균의 경우 0.86, 기하 평균과 중앙 값의 경우 0.89, 피크 채널 비율의 경우 0.42의 상관 계수(correlation coefficient)를 제공하였다. 참고 샘플 강도에 대한 검사 샘플 강도의 기하 평균 형광 비율에서 95% 신뢰 수준은 정상적인 이배체 유전형을 보유하는 시료에서 0.97 내지 1.03이고, 반접합성 결실을 보유하는 샘플에서 0.5 내지 0.64이고, 중복을 보유하는 샘플에서 1.44 내지 1.56이었다. 이러한 산술 평균은 약간 더 높은 신뢰 수준(잔차 분산 = 0.13)을 산출하고, 피크 채널 형광은 사본 수의 최적하(suboptimal) 척도인 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 여러 혼성화 반응물이 이들 유전형에 대한 훨씬 큰 잔차를 유발했기 때문이다.
맹검 연구에서, 22개의 코딩된 게놈 샘플(20개의 정상 샘플 및 미리 확인된 중복을 보유하는 2개의 CMTlA 환자 샘플)의 삼중 반응물은 TEKT3과 HOXB1c 프로브 에 혼성화시켰다. 이들 각 샘플의 삼중 작업에서 재현성(reproducibility)은 우수하였고, MFI 비율에서 분산 범위는 6.5x1O-6 내지 1x1O-3이었다. CMTlA 중복을 보유하는 환자 샘플은 이들 군에 대한 개별 TEKT3:HOXB1c 혼성화 MFI 비율에 기초하여, 정상 대조로부터 용이하게 구별되었다(표 5에 요약됨). 이들 결과는 비-맹검 분석에서 이들 유전형 사이에 중복 없음을 증명하는 기존의 결과와 일치한다(도 2).
사본 수 유전형 결정
MFI 비율은 분석되는 좌위에 상관없이, 게놈 사본 수를 결정하기 위한 확실한 계량이다. 참고 프로브에 대한 검사 프로브의 MFI 비율의 평균은 본 연구 동안 모든 정상 개체에서 1.O±O.06(n=21)이었다(표 2). 상기 비율은 반접합성 결실을 보유하는 모든 샘플에서 0.57±0.08(n=8)이고, 삼대립형질 샘플에서 1.50±0.15(n=26)이었다. 여러 프로브가 MFI 비율의 완만한 구부러짐(skewing)을 보이긴 하지만, 모든 Ic 프로브의 경우에 95% 신뢰 수준에서, 그리고 정상 유전형 vs. 결실된 유전형의 경우에 98% 신뢰 수준에서, 비정상은 정상적인 유전형으로부터 분명하게 구별되었다.
고찰
합성 DNA 서열에 결합된 스펙트럼 인코딩된 폴리스티렌 미소구체의 현탁액은 게놈 DNA에 혼성화되고, 통상적인 유세포분석 장치에 의해 탐지될 수 있다. 이러한 방식은 단일 뉴클레오티드의 고속 유전형확인(high throughput genotyping)을 용이하게 하였다(Vignali, 2000). 하지만, 선행 방법에서는 미소구체에 결합된 10-50개 의 뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드 프로브에 표적 DNA를 혼성화하기에 앞서 표적 DNA의 증폭을 필요로 하였다(Hadd et al, 2004; Rockenbauer et al, 2005). 올리고뉴클레오티드 프로브는 불충분한 민감성과 특이성으로 인하여, 환자 DNA 샘플로부터 직접적으로 게놈 사본 수를 정확하게 정량할 수 없다(Earley et al, 2002; Sekar et al, 2005; Vignali, 2000). 표적 서열의 사본 수 산정 역시, 필수적인 증폭 단계가 본질적으로 대수(logarithmic)이기 때문에 이런 단계를 통제하기 어렵다는 사실로 인하여 복잡하다. 게놈 사본 수는 직접적으로-표지된 게놈 DNA가 사전 증폭 없이 혼성화될 때 명백하게 결정될 수 있다(Southern, 1975; White et al, 2004).
미소구체에 결합된 더욱 긴 프로브에 환자-유래된 DNA의 직접적인 혼성화가 사본 수를 정량적으로 측정할 수 있는 지를 조사하였다(도 1). 상기 도면의 단계 1에서, 각 Ic 프로브는 아미노-변형된 정방향 프라이머를 이용한 PCR로 합성하고 스펙트럼으로 별개의 카르복실화된 미소구체에 공액한다. 단계 2)에서, 샘플 DNA는 고정된 세포유전학적 세포 덩어리로부터 추출하고 새김눈-번역하여 비오틴 dUTP를 편입한다. 단계 3)에서, Ic 프로브-결합된 미소구체는 제조된 게놈 DNA에 혼성화시키고, 스트렙타비딘-피코에리트린(SPE)으로 염색하고, 잔류 SPE를 제거하기 위하여 세척한다. 단계 4)에서, 샘플은 미소구체의 별개의 스펙트럼 어드레스의 탐지 및 단계 5)에서 각 미소구체-결합된 프로브에 의해 결합된 표적의 정량을 위하여 유세포분석기(이중 레이저 탐지)에서 이동시킨다. 사전에, 여러 상이한 염색체 영역에 대한 형광 in situ 혼성화(FISH)로 다양한 염색체 비정상을 탐지하기 위하여 컴퓨 터조작으로 도출된 적은 사본(Ic) 프로브를 확인하였다(Knoll and Rogan, 2003; Rogan et al, 2001). 본 연구에서, 몸세포염색체 조건과 연관된 3가지 상이한 염색체 영역으로부터 Ic 프로브와의 미소구체 현탁 혼성화를 개발하고, 메탄올-아세트산 고정된 세포유전학적 시료에서 사본 수 증가 또는 감소를 탐지하는 상기 방법의 효용을 증명하였다.
본 발명으로, 적은 사본(Ic) 게놈 프로브를 이용하여 게놈 사본 수 차이를 탐지하는 미소구체 현탁 혼성화 측정검사법이 개발되었다. 좌위-특이적 표적 DNA의 사전 증폭이 필요하지 않았는데, 그 이유는 Ic 프로브가 높은 특이성을 갖는 반수체 게놈 서열 내에서 유일한 좌위에 혼성화되도록 설계되기 때문이다. 적은 사본 서열의 감소 또는 증가는 환자 게놈 DNA 내에서 직접적으로 탐지될 수 있다. 이러한 측정검사는 대량의 환자 샘플, 추가적인 채혈(blood draw), 좌위(locus)-특이적 게놈 증폭 또는 시간-소모적 게놈 DNA 정제 방법을 필요로 하지 않으면서 통상적인 세포유전학적 분석을 추종할 수 있다. 이들 연구는 세포유전학적 분석이후 남아있는 고정된 세포 제조물을 이용하여 수행하였다.
혼성화 실험은 게놈 서열의 1개 사본 vs. 2개 사본 및 2개 사본 vs. 3개 사본의 존재를 구별하는 충분한 민감성을 증명하였다. 별개의 스펙트럼 서명(spectral signature)을 보유하는 미소구체에 공액된 복수의 독립적인 Ic 프로브의 이용은 동일한 혼성화 측정검사에서 사본 수 변화를 독립적으로 측정할 수 있다. 염색체 결실이 2명의 CML 환자에서 ABL1 유전자에서 확인되었고, 염색체 9q34의 삼배체가 3개의 배양된 세포주에서 확인되었고, 염색체 17p12의 중복이 하나의 세포주를 비롯한, 5명의 CMTlA 환자의 세포에서 확인되었다. 반접합성 염색체 9q34 결실을 탐지하는데 이용되는 동일한 프로브가 상기 좌위에서 삼배체를 보유하는 세포주 내에서 3개의 대립유전자 역시 탐지하였다. 프로브 평균 또는 중간 형광 강도의 비율은 동일한 유전형을 갖는 환자에서 일치하였고, 검사 프로브의 염색체 기원에 상관없이, 예상치 인근에서 밀집하였다.
측정검사 개발 동안 여러 파라미터가 최적화되었다: (i) 미소구체에 공액된 Ic 프로브는 이질성 복합 게놈 환경에서 조사하는 경우에 상동성 서열에 대한 특이성을 보였다, 다시 말하면, 1 ㎍의 이질성 게놈 서열 내에 존재하는 5ng 정도의 표적 서열이 성공적으로 탐지되었다; (ii) 상이한 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미소구체 세트에 공액된 Ic 프로브는 어떤 미소구체가 프로브에 공액되는 지에 상관없이, 평균 형광 강도에서 미미한 차이를 보였다; (iii) 미소구체 표면에 부착된 Ic 프로브의 길이는 혼성화 효율에 영향을 주었는데, 더욱 짧은 프로브(~100 bp)는 더욱 긴 프로브(1 내지 2 kb)보다 높은 평균 형광 강도를 보였다. 더욱 짧은 프로브는 표지된 미소구체 근원(stock)에서 더욱 적은 로트간 변이(lot-to-lot variation)로 인하여 더욱 안정하였다(더욱 긴 저장 수명(shelf life)); (iv) 이로 인하여, DNA-결합된 미소구체를 공액하고, 정량하고, 정성하는데 요구되는 노력이 감소하였다.
실시예 2
본 실시예에서는 염색체 15q11-13 상에서 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome, PWS)과 안젤만 증후군(Angelman syndrome, AS) 영역을 조사하기 위하여 정량적 미소구체 혼성화의 임상적 적용을 기술한다. ~3.2Mb의 PWS/AS 영역에 걸쳐있는 17개의 적은 사본과 단일 사본 검사 프로브(각각, 80개 뉴클레오티드) 및 2염색체성 참고 프로브(HQXB1, 염색체 17q21)는 각각, 10개의 스펙트럼으로 별개의 폴리스티렌 미소구체 수준 중에서 하나에 공액하였다. 모든 프로브는 복합 QMH 반응물 내에서 비오틴-표지된 게놈 환자 DNA에 혼성화시키고, 혼성화는 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘을 이용하여 탐지하고 이중-레이저 유세포분석법으로 분석하였다. 사본 수 차이는 참고 프로브에 대한 검사 프로브의 평균 형광 강도(MFI)를 비교함으로써 구별하였다. 탐지된 좌위에 대한 MFI 비율은 정상적인 좌위에 대한 MFI 비율, 0.98±0.075(n=186)와 비교하여 0.58±0.072(n=80)이었다.
염색체 15q11-13의 게놈 재정렬은 자폐증(autism), 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome, PWS), 안겔만 증후군(Angelman syndrome, AS)을 비롯한 다양한 표현형(phenotype)을 유발하였다. 상기 염색체 영역은 게놈 각인(genomic imprinting)에 종속되고, 적은 사본 반복 요소(repeat element)의 복합적인 조합으로 특성화된다. PWS와 AS는 전형적으로, 결실 환자의 분류(클래스 I과 II)를 가능하게 하는, 2개의 근위 부위(BP1과 BP2)와 1개의 원위 부위(BP3)에서 밀집된 중단점(BP)을 보유하는 부계 또는 모계 염색체 15ql1-13 영역(Nichols 1998) 내에서 ~4Mb 결실에 기인한다(Knoll et al. 1990). 클래스 I 결실 환자는 BP1 내지 BP3에 걸쳐있는 영역이 결실되고, 클래스 II 결실 환자는 BP2와 BP3에 걸쳐있는 영역이 결실된다(Knoll et al. 1990). 부가적으로, 상기 영역에서 이부 각인 센터(bipartite imprinting center, IC) 내에 돌연변이는 질병을 유발할 수 있다. 이 러한 IC의 한 영역이 부계 또는 모계 흔적(imprint)을 확립하고 유지하는데 필요한데, 연구를 통하여 PWS-IC(PWS-SRO)와 AS-IC(AS-SRO)를 한정하는 가장 짧은 중복 영역(SRO)이 확인되었다(Mapendano et al. 2006). 더 나아가, PWS와 AS 둘 모두 PWS 환자(모계 2염색체(maternal disomy))에서 모계 기원하는, 또는 AS 환자(부계 2염색체(paternal disomy))에서 부계 기원하는 염색체 15 편부 2염색체(uniparental disomy, UPD)로 인하여 발병할 수 있다.
재료와 방법
프로브 선택, 합성과 미소구체 공액. 염색체 15q11-13에 특이적인 17개의 상이한 검사 Ic 프로브 및 염색체 17q21 상에서 HOXB1로부터 2염색체성 참고 프로브를 설계하였다. 각 프로브는 표 3에 열거된 바와 같이 80 염기 길이이었다. 각 프로브의 전체 80개 염기에서 하나의 게놈 매치만 존재하였다; 하지만, 프로브의 소형 단편은 다른 게놈 영역에 매치될 수도 있다.
프로브는 적은 사본 서열 조성, GC 함량(48-55%), MFoId 소프트웨어(The Bioinformatics Center at Rensselaer and Wadsworth, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY)에 의해 예측된 잠재적인 안정한 2차 서열 형태의 부재, 길이(80개 뉴클레오티드)에 기초하여 선택하였다. 각 프로브는 정상적인 인간 게놈 대조 DNA(Promega)를 주형으로 이용한 PCR(Promega RedTaq Ready Mix, Madison, WI)로, 카르복실화된 미소구체에 결합을 위한 5'-C6-아미노-표지된 정방향 프라이머(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) 및 변형되지 않은 역방향 프라이머를 이용하여 합성하였다. PCR 산물은 겔 전기영동(Seakem; FMC Bioproducts, Rockland, ME)으로 분리하고 마이크로스핀 칼럼 원심분리(microspin column centrifugation)(QiaQuik; Qiagen, Valencia, CA)로 추출하였다. 프로브는 카르보디이미드 결합 절차(Dunbar et al, 2003; Fulton et al, 1997)를 통하여, 10개의 스펙트럼으로 별개의 미소구체 수준(CytoPlex; Duke Scientific, Palo Alto, CA) 중에서 하나에 공액하였다.
각 프로브는 먼저 열 변성하고, 이후 얼음 위에서 순간 냉각시켰다. 동일한 스펙트럼 특성을 갖는 대략 3.125 x 105개 미소구체는 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 튜브(USA Scientific, Ocala, Florida) 내로 피펫으로 옮기고, 10,000 g에서 2분간 원심분리하고, 상층액을 배출하였다. 150 ㎕의 0.1 M MES 완충액(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) pH 4.5를 각 튜브에 추가하고, 미소구체는 짧게 와동(vortexing)시키고, 이후 10,00O g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 미소구체는 80 ㎕의 0.1M MES 내에서 와동으로 재현탁하였다. 단일 Ic 프로브(0.5 nmol)를 각 튜브에 추가하고, 와동으로 혼합하였다. 1.25 ㎕ 부피의 새로운 10 ㎎/㎖ 1-에틸-3-3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드염산염(EDC) 용액을 추가하고, 반응물은 짧게 와동시키고 수시로 혼합하면서 어둠 하에 30분간 배양하였다. EDC의 혼합과 배양은 각각 1.25 ㎕의 새로 제조된 EDC 용액을 이용하여 2회 반복하였다. 반응은 500 ㎕ 0.02% Tween20의 추가로 중단시키고, 이후 와동시키고 10,000 g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액의 제거이후, 250 ㎕의 0.1% SDS를 각 튜브에 추가하고, 와동시키고, 10,000에서 2분간 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 25 ㎕의 0.1M MES pH 4.5를 추가하고, 튜브를 와동시키고 어둠 하에 4℃에서 보관하였다. 결합된 미소구체 농도는 100 ㎕의 1X PBS에 1 ㎕의 각 미소구체를 추가하고, 아래에 제시된 조건을 이용하여 FACSCalibur 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, California)에서 분석함으로써 정량하였다.
각 미소구체-공액된 프로브에 대한 품질 관리 절차는 미소구체에 프로브의 적절한 부착을 담보하기 위하여 수행하였다. 먼저, 모든 프로브가 혼성화 반응물 내에서 상응하는 PCR 산물을 탐지할 수 있음을 확인하고, 프로브 공액 및 미소구체에 혼성화가 유효함을 확립하였다. 본 연구에 이용되는 각 QMH 프로브에 특이적인 정제된 PCR 산물(표 3)은 단일 5' 비오틴화된 프라이머를 이용하여 정상적인 게놈 DNA(Promega)로부터 증폭하였다. 비오틴화된 PCR 산물은 상보성 미소구체-공액된 프로브에 혼성화시키고 SPE로 탐지하였다. 혼성화된 미소구체 총수와 평균 형광 강도는 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 측정하였다. 일단의 미소구체에 대한 혼성화된 Ic 산물의 밀도는 단일 비드의 양(출입 통제된 측면 산란기 비드 총수로부터)을 혼성화된 비드의 수(출입 통제된 비드 신호 총수와 평균 형광 강도 수준)와 비교함으로써 산정하였는데, 이는 카르보디이미드 결합 절차의 공액 효율을 결정하였다. 미소구체-공액된 Ic 프로브의 표적 서열에 대한 특이성은 상동성 프로브 vs. 이질성 프로브로 독립된 혼성화 측정검사의 반복된 유세포분석 작업의 평균 형광 강도를 비교함으로써 결정하였다. 각 프로브의 혼성화는 일정한 범위의 어닐링 온도(annealing temperature)(45℃ 내지 6O℃)에서 최적화되었다.
부가적으로, MFI 수치가 공액에 이용된 미소구체의 수준과 무관한지를 확인 하기 위하여 미소구체-교환 실험을 수행하였는데, 이의 상세는 기존 문헌(Newkirk et al. 2006)에서 보고되었다. 이들 실험은 상이한 스펙트럼 어드레스를 보유하는 2개의 미소구체 세트(L2와 L9)에 공액된 Ic 프로브 D15S63을 이용하여 수행하였다. 양쪽 미소구체 세트는 복합 반응물 내에서 상응하는 PCR 산물에 혼성화시키고, 평균 형광 강도 수준은 각 미소구체 세트에서 비교하였다. 양쪽 반응물은 동일한 프로브에 대하여 유사한 MFI 수치를 보였다. 상기 실험은 Ic 프로브 IC에 대하여 반복하였는데 유사한 결과가 획득되었다.
환자 샘플과 게놈 표적 제조. 게놈 DNA 주형은 보관된 환자 DNA 샘플(n=21)을 이용하여, 또는 골수 샘플(n=10)의 세포유전학적 제조물로부터 유래된 메탄올-아세트산 고정된 세포 덩어리를 이용하여 제조하였다. 환자로부터 고정된 세포 덩어리는 메탄올과 아세트산 내에서 2년 내지 8년 동안 보관되었다. 일부 샘플에 대한 유전형은 기존의 세포유전학 연구, 마이크로위성 연구 및/또는 서던 혼성화 연구로부터 공지되었고, 일부는 불명하였다(표 4-7). 이들 고정된 세포는 1X PBS로 2회 세척하고, 이들의 농도는 혈구계(hemocytometer)로 결정하였다. 게놈 DNA 주형은 샘플당 ~600개의 고정된 세포로부터 추출하였다.
보관된 DNA 샘플의 경우에, 증폭에 앞서 처리가 불필요하였다. 전체 게놈 DNA는 GenomiPhi 키트(GE Healthcare, Piscataway, NJ)의 변형된 프로토콜을 이용하여 시험관내 복제하여 비오틴을 주형 DNA 내로 직접적으로 편입시켰다. 먼저, 1 ㎕의 각 DNA 샘플은 9 ㎕의 샘플 완충액(GE Healthcare)과 혼합하고 95℃에서 3분간 열 변성하였다. 샘플은 얼음 위에서 2분간 순간 냉각시키고, 이후 4 ㎕의 50nmol 비오틴-16-dUTP(Roche, Indianapolis, IN), 9 ㎕의 반응 완충액(GE Healthcare), 1 ㎕의 Enzyme Mix(GE Healthcare)를 추가하였다. 반응물은 24-36 시간 동안 30℃에서 배양하였다. 환자 DNA의 성공적인 복제는 HOXB1과 PWS-SRO 프로브의 PCR 증폭으로 확인하였다(표 3). 이러한 초기 품질 관리 단계에서 PCR 산물을 산출하지 않는 샘플은 QMH에 이용하지 않았다. PCR 산물을 성공적으로 증폭하지 못한 샘플은 정확한 QMH 결과를 산출하지 못하는 것으로 밝혀졌다(데이터 제시하지 않음). 고정된 세포 덩어리의 노화는 변형된 GenomiPhi 절차에 따른 PCR 증폭의 부재에 대한 가능한 기여 인자(contributing factor)이다. PCR과 겔 전기영동에 의한 이들 샘플의 분석은 추출된 DNA가 고도로 변성되고 전단된다는 것을 지시하였는데, 이는 결과적으로, 본래의 프로브가 QMH에서 결실되게 보이도록 한다. PCR 품질 관리를 통과한 게놈 DNA는 오래된 세포 덩어리(>6 년)에 비하여 최근에 보관된 고정된 세포 덩어리(~2-5 년)로부터 획득되었다. 품질 관리 PCR 측정검사를 통과한 DNA 샘플은 초음파처리(B-300, Bransonic, Danbury, CT)로 ~300-800bp까지 전단하였는데, 이는 겔 전기영동(Seakem)으로 모니터하였다. 각 QMH 반응물마다 25 ng의 각각 표지되고 단편화된 게놈 DNA 샘플이 이용되었다.
혼성화 반응과 유세포분석법. 제조된 게놈 DNA는 ~7,500개의 프로브-결합된 미소구체를 포함하는 4O ㎕의 1.5XTMAC 혼성화 완충액(3-mol/ℓ 테트라메틸암모늄 염화물, 50mmol/ℓ Tris-HCl, pH 8.0, 1 g/ℓ 사르코실)에서 희석하였다. QMH에 대한 프로브에 공액된 미소구체의 2개 내지 10개의 상이한 수준의 복합 분석이 CytoPlex 미소구체(Duke Scientific; Palo Alto, CA)를 이용하여 단일 반응물 내에 서 가능하였다. 혼성화 반응물에 포함되는 프로브는 사전에 특성화된 각 환자 또는 가족에서 가용한 유전형 증거에 기초하여 선택하고, 클래스 I, 클래스 II, IC 결실(표 3)을 나타내기 위하여 미지의 샘플을 초기에, chrl5Cen, GCP5, D15S11, D15S63, PWS-SRO, OCA2와 혼성화시켰다. 차후 혼성화 반응에 이용되는 QMH 프로브는 결실 구간을 정확하게 특성화하기 위하여 첫 번째 QMH 반응물에서 탐지된 결실된 영역 내외에서 선택하였다(도 4). 반응물은 95℃에서 5분간 열 변성하고 50℃에서 하룻밤동안 혼성화시켰다. 반응물은 10,000 g에서 2분간 원심분리하고, 상층액은 제거하고, 비오틴을 보유하는 게놈 표적을 탐지하기 위하여 1.5X TMAC에 담긴 12 ㎕의 1:50 희석된 리포터 분자, 스트렙타비딘-피코에리트린(SPE; Molecular Probes, Eugene, OR)을 추가하였다. 반응물은 혼성화 온도에서 12분간 배양하였다. 표지(labeling)후, 250 ㎕의 1.5X TMAC를 각 반응물에 추가하고, 혼합하고, 10,000 g에서 2분간 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 혼성화된 미소구체는 70 ㎕의 1.5X TMAC에 재현탁하였다.
샘플은 FACSCalibur(Becton Dickenson, San Jose, CA)를 이용한 유세포분석법으로 평가하였는데, 반응물당 대략 20,000개의 사건(event)이 분석되었다. FACSCalibur 장치에 대한 전형적인 PMT 전압 설정은 FSC(전방 산란) = 로그 방식(Log Mode)에서 EOO(신호 증폭 없음), SSC (측면 산란기) = 선형 방식(Linear Mode)에서 344V, FLl = 로그 방식에서 628V, FL2 = 로그 방식에서 620V, FL3 = 로그 방식에서 710V, FL4 = 로그 방식에서 500V. FLl, FL2, FL3에 대한 역치는 52V의 디폴트(default)로 설정되었다. FSC 역치는 50V의 수치를 갖는 일차 파라미터이고, 이차 파라미터는 SSC이고 130V로 설정된다. 유속은 낮게 설정되었다. 색상 보정(color compensation)은 아래와 같이 설정되었다: FL1=1.9% FL2, FL2=21% FLl, FL2=0% FL3, FL3=10% FL2, FL3=4.7% FL4, FL4=3.6% FL3. 색상 보정 수치는 유세포분석기의 상이한 채널에서 측정된 MFI 수치의 스펙트럼 중복을 최소화시켰다. 이들 설정은 SSC 플롯 vs. 비드 신호 플롯에서 표지되지 않은 미소구체의 10가지 상이한 수준 각각에 대한 별개의 클러스터(cluster)에 기초하여 최적으로 결정되었다. 형광 비드 기준(LinearFlow Flow Cytometry Intensity Calibration Kit; Molecular Probes)이 유세포분석기의 상이한 형광색소 탐지 채널의 강도 교정(intensity calibration)에 이용되었다. 상기 장치는 또한, 등가의 가용성 형광색소 분자(equivalent soluble fluorochrome, MESF) 단위에서 교정된 표면-표지된 비드에 기초한 형광 참고 기준(Quantum R-PE MESF Medium Level Kit; Bangs Laboratories, Fishers, Indiana)으로 교정될 수도 있다. 유세포분석법으로 각 샘플의 분석후, 참고 프로브에 대한 검사 프로브의 기하 평균 형광 강도(MFI)의 비율을 산정하고, 표 4-1 내지 4-9(총체적으로, 표 4)에 기재된 바와 같이 MS Excel을 이용하여 통계치(가령, 평균, 95% 신뢰 수준, 표준 편차)를 산출하였다. 표 4-1 내지 4-9는 각각, 가장 왼쪽 칼럼에 프로브 식별자(probe identifier)를 나타내고, 한 쌍의 칼럼에 평균 형광 강도 및 평균 형광 강도 비율을 비롯한 샘플 결과를 나타낸다. 결실을 입증하는 데이터는 짙은 경계로 표시된다. 기하 MFI 수치는 QMH 측정검사로부터 데이터를 사정하는데 가장 중요한 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 데이터가 유세포분석기 상에서 로그 방식으로 수집되기 때문이다(Kirkwood 1979; Coder et al. 1994; Newkirk et al., 2006).
결과
PWS/AS 환자에서 대형 결실의 탐지
염색체 15q11-ql3에 걸쳐있는 일련의 미소구체-공액된 Ic 프로브는 PWS/AS 영역에서 대형 결실을 포함하는 환자로부터 표지된 게놈 DNA에 혼성화시켰다. 일부 사례에서, 결실은 사전 분석(방법 참조)(n=8; WJK18, 35, 29, 36, 48, C93-49-PWS, R92-161-PWS, R92-144-PWS)으로 결정되었고, 다른 환자에서 PWS 또는 AS의 임상적 진단이 확정되었지만 이들 유전형은 불명하였다(n=3; 불명 1, 2, 3).
프로브를 포함하는 PWS 영역의 지도는 도 4에 제공된다. 상기 도면에서, 미소구체에 공액된 Ic 프로브에 대한 염색체 좌표(강조됨) 및 다른 마이크로위성과 유전자가 표시된다. AS-SRO와 PWS-SRO는 큰 별로 표시된다. 미소구체에 공액된 프로브는 공액에 이용되는 미소구체의 수준(1- 10)을 나타내는 원에 인접한 수직의 점선으로 표시된다. 클래스 I과 클래스 II 결실 구간 및 이들의 중단점 구간(BP)이 묘사된다. 작은 별들은 클래스 I 결실 환자를 클래스 II 결실 환자로부터 구별하기 위한 초기 QMH 측정검사에 어떤 프로브-공액된 미소구체가 이용되었는 지를 표시한다. QMH 결과는 본 연구에서 조사된 환자에서 관찰되는 결실된 영역을 예증한다. 결실 구간에 놓인 삼각형은 기존의 연구에서 결실 구간을 한정하기 위하여 각 군에서 검사된 마이크로위성 마커를 표시한다. 각 유형의 결실 구간을 보유하는 것으로 밝혀진 환자의 수는 괄호 안에 표시되고, 짙은 "*"는 이들 개체가 관련되는 지를 표시한다.
모든 대형 결실 환자(n=l1)에서 클래스 I 결실을 클래스 II 결실로부터 구별하는 초기 복합 혼성화 반응물은 Chrl5Cen, GCP5, D15S11, PWS-SRO와 OCA2에 특이적인 검사 프로브 및 HOXB1 참고 프로브를 포함하였다. 모든 프로브에 대한 사본 수는 각 환자에서 MFI 비율에 기초하여 용이하게 구별가능하였다(표 4-4, 4-5, 4-6). 이러한 환자 군에서 MFI 비율 범위는 결실된 영역의 경우에 0.44-0.67이고, 본래의 게놈 단편의 경우에 0.83-1.06이었다(표 4-4, 4-5, 4-6). 이러한 초기 QMH 반응물로부터 결과를 이용하여, 차후 프로브는 각 결실 구간을 더욱 한정하도록 선택하였다. 가령, 환자 WJK-29, WJK-36, R92-144-PWS에서, Chrl5Cen은 본래 형태이지만, GCP5, D15S11, PWS-SRO, OCA2는 결실되는 것으로 밝혀졌다(표 4-5와 4-6). 이들 결실 구간을 더욱 구별하기 위하여, Chr15Cen과 GCP5 사이에 D15S541에 특이적인 QMH 프로브를 두 번째 반응물에 이용하였다. 이러한 혼성화 반응으로부터 결과는 WJK-29, WJK-36, R92-144-PWS 역시 D15S541에서 결실된다는 것을 증명하는데, 이는 ~5.66Mb 결실 구간을 구성하고, 이들 두 명의 환자를 클래스 I로 분류한다(Amos-Landgraf et al. 1999). 환자 WJK-18, 35, 48 및 R92-161-PWS에서, 초기 QMH 결과는 Chrl5cen과 GCP5가 본래 형태이지만, D15S11, PWS-SRO, OCA2가 결실된다는 것을 지시하였다(표 4-4와 4-6). 두 번째 QMH 반응후, 통합된 결과는 AC006596-94501에서 OCA2까지 결실(~4.6Mb)을 보였는데, 이는 클래스 II 결실로 간주된다(Knoll et al. 1990).
한 환자에 대한 QMH 결과는 클래스 I 환자와 클래스 II 환자에 대한 전형적인 결실된 단편과 비교하여 비-고전적인 결실을 나타냈다(표 4). 환자 C93-49-PWS 에서, D15S63, IC, U41384, AC004600, 0CA2에 대한 프로브는 각각 1개의 사본에 존재하는 반면, Chrl5Cen, GCP5, AC006596-94501, AC006596-76610, D15S11, AC004737- 13740은 2염색체성이었다(표 4-4). 상기 결실 구간은 ~3.36Mb에 걸쳐있고, 클래스 II 결실의 하위클래스를 대표할 수 있다.
PWS 환자에서 IC 결실의 탐지
마이크로위성 분석에 의해 IC 결실을 보유하는 것으로 앞서 밝혀진 총 6명의 PWS 환자(R93-001-MOD, R93-002-MOD, R93-013-MOD, R90-035-PWS, R92-166-PWS, R92-167-PWS)를 QMH에 이용하였다(표 4-1, 4-2, 4-3). 첫 번째 가족의 경우에, AC006596-75658, AC004737-13740, D15S63, chr15:22736805, PWS-SRO, U41384, AC004600에 특이적인 검사 프로브 및 참고 프로브, HOXB1을 각 가족 구성원으로부터 표지된 게놈 DNA에 혼성화시켰다(표 3). R92-166-PWS와 R92-167-PWS에서, D15S63에서부터 PWS-SRO까지 결실이 확인되었다(~93kb). 기존의 마이크로위성 결과는 D15S63과 Dl5Sl28에서 결실을 지시하고, 따라서, 이들 QMH 결과는 마이크로위성 유전형확인(microsatellite genotyping)으로 확인된 결실을 ~70kb 정도 확장하였다. 영향을 받지 않은 가족 구성원(R92-168-PWS)은 모든 검사된 좌위에서 정상인 것으로 밝혀졌다(표 4-1).
서던 혼성화와 마이크로위성 분석에 의해 공지의 PWS IC 돌연변이가 앞서 확인된 다른 가족(R93-001-MOD, R93-002-MOD, R93-013-MOD, R93-014-MOD)을 QMH로 분석하였다(표 4-2와 4-3)(Ohta et al., 1999; Rogan and Knoll, 2003). 초기 혼성화 반응물은 AC006596-94501, IC, PWS-SRO, AC004600에 대한 검사 프로브 및 HOXB1 참 고 프로브를 포함하였다. 결과는 분석된 모든 샘플에서 AC006596-94501과 AC004600이 원형 상태이지만 IC와 PWS-SRO가 R93-001-MOD, R93-002-MOD, R93-013-MOD에서 결실된다는 것을 증명한다. 이러한 결실 구간을 한정하는 검사 프로브를 포함하는 차후의 QMH 반응물은 IC 결실의 경계를 AS-SRO에서부터 PWS-SRO (~50kb)까지 한정하였는데, 이는 기존의 결과를 ~45kb 정도 확장한다(Buiting et al 1995; Ohta et al. 1999).
QMH를 이용하여 현재까지 보고된 최소의 PWS-SRO 결실 구간(~4.3kb), R90-035-PWS를 분석하였다(표 4-3)(Ohta et al. 1999). 초기 혼성화 반응물은 D15S63, AS-SRO, IC, PWS-SRO, chrl5:22736805, U41384에 특이적인 프로브 및 참고 HOXB1 프로브를 포함하였다(표 3). MFI 비율은 모든 검사 프로브가 본래 상태임을 지시하고, 따라서, AS-SRO와 PWS-SRO를 분리하는 영역, PWS-SR02 내에서 다른 프로브를 설계하고 상기 환자에 혼성화시켰다. PWS-SRO2 프로브는 AS-SRO 프로브의 14.5kb 3'(말단소립(telomeric)) 및 최초 PWS-SRO QMH 프로브의 11.7kb 5'(동원체(centromeric))에 위치한다. 0.68의 MFI 비율은 상기 좌위가 1개의 사본 내에 존재한다는 것을 나타낸다(표 4-3). PWS-SRO2 프로브 역시 본 연구에서 다른 IC 결실 환자(R92-166-PWS, R93-013-MOD, R93-002-MOD, and R93-001-MOD)에 혼성화되고, 0.51 내지 0.67 범위의 MFI 비율로 예상된 바와 같이 결실되는 것으로 밝혀졌다(표 4-1과 4-2).
임상적으로 진단된 AS 환자, 불명 1은 FISH 분석과 UPD에서 정상이지만 SNRPN 메틸화 검사에서 비정상으로 밝혀졌다(표 4-7). 불명 1의 어머니와 아버지로 부터 샘플은 각각, 불명 2와 불명 3으로 지정하였다(표 4-7). 검사 결과의 이러한 조합으로, 상기 환자는 본 발명의 새로운 측정검사에 이상적인 후보였다. QMH를 이용하여, 상기 불명 환자(불명 1) 및 이의 부모(불명 2와 불명 3)는 먼저, Chrl5Cen, GCP5, Dl5Sl1, PWS-SRO, OCA2 및 HOXB1 참고 프로브로 조사하였다. 결과는 PWS-SRO를 제외한 모든 프로브가 본래 상태임을 지시하였다(표 4). 두 번째 QMH 분석은 AS-SRO와 IC 프로브로 IC 영역에 집중하였다. MFI 비율은 이들 프로브가 상기 환자와 그의 어머니에서 결실된다는 것을 지시하였는데, 이는 AS-SRO 영역 인근에 ~19kb 결실을 구성한다(Table 4). 이러한 결과는 IC와 PWS-SRO 프로브에 의해 둘러싸인 PWS-SRO2 프로브로 세 번째 QMH 혼성화에 의해 확증되고, 환자와 그의 어머니 모두에서 결실이 관찰되었고(표 4), 또한, AS-SRO 프로브로 scFISH 분석에 의해 확증되었다.
근위 결실된 염색체 15q의 탐지
공지된 근위 염색체 15q 결실을 보유하는 환자, B2002-00905는 먼저, 통상적인 세포유전학적 분석으로 특성화하고, 이후 QMH를 이용하여 분석하였다. 복합 QMH 측정검사는 Chrl5Cen, D15S541, GCP5, D15S11, D15S63, AC004600, OCA2에 특이적인 검사 프로브 및 참고 프로브를 포함하였다. 결과는 모든 검사 프로브가 결실된다는 것을 지시하고, 이런 결실은 >6.6Mb에 이르는 결실을 구성하지만, 상기 영역 내에서 반복으로 밀집된 이질염색성(heterochromatic) 서열로 인하여 프로브 Chrl5Cen의 적은 사본 프로브 서열 5'(동원체)를 확인할 수 없었고, 따라서, 이러한 역위에서 동원체 브레이크(centromeric break)를 한정할 수 없었다.
모계 2염색체 PWS 환자 가족에서 비동기화 복제 시점(asynchronous replication timing)의 평가
염색체 15q11-13 내에서 대립유전자 특이적 복제(allele specific replication, ASR) 시점을 조사하는 기존 연구(Knoll et al. 1990)에서 D15S11과 D15S63에서 부계 전기/모계 후기 복제 시점 패턴을 확인하였다. 이들 2개의 좌위에 특이적인 QMH 프로브를 이용하여, 염색체 15 모계 2염색체를 보유하는 4명의 PWS 환자(R89-007-PWS, R89-008-PWS, R90-019-PWS, R90-041-PWS) 및 이들의 가족 구성원은 영향을 받은 개체(n=10)에서 ASR가 QMH 비율에 영향을 주는 지를 조사하였다(표 4-8과 4-9). HOXB1 참고 프로브는 동기화 복제 시점(synchronous replication timing)을 확인하는 FISH 혼성화 연구에 이용하였다. 모계 2염색체성 개체에 대한 QMH 결과는 정상적인 부모와 비교하여 MFI 비율에서 구별가능한 차이가 존재하지 않음을 지시한다. 가령, R90-041-PWS에서 D15S11과 D15S63에 대한 MFI 비율은 각각, 0.95와 1.01이었는데(표 4-9), 이는 아버지, R90-059-PWS(0.93과 0.94)에 비하여 실질적으로 높지만 어머니, R90-060-PWS(0.97과 1.08)에 비하여 약간 낮다(표 4-8). 조사된 다른 두 가족(R90-059-PWS, R90-041-PWS, R89-008-PWS, R89-010-PWS, R89-009-PWS)에 대한 QMH 결과는 상기 가족에 대한 결과와 유사하였다.
정상적인 좌위와 결실된 좌위에 대한 QMH 결과의 통계학적 분석
도 5에서, MFI 비율은 y-축에 좌표로서 기입하고, QMH 혼성화의 수는 x-축을 따라 좌표에 기입한다. 정상적인 프로브와 결실된 프로브에 대한 MFI 비율에서 중복은 존재하지 않았고, 따라서, 각 좌위에서 사본 수는 용이하게 구별가능하였다. 정상적인 좌위와 결실된 좌위에 대한 평균, 표준 편차, 95% 신뢰 수준은 도 5에 지시된다.
QMH로 조사된 모든 정상적인 좌위에 대한 MFI 수치(n=191)의 분석은 0.011의 95% 신뢰 수준에서 0.98±0.075의 평균을 나타내고(도 5), 모든 결실된 좌위에 대한 MFI 수치(n=80)는 0.016의 95% 신뢰 수준에서 0.58±0.072의 평균을 보인다(도 5). 정상적인 좌위와 결실된 좌위에 대한 MFI 수치(n=271) 사이에 중복은 관찰되지 않았고, 유전형은 초기 PCR 품질 관리 단계를 통과한 모든 환자에서 용이하게 구별가능하였다(도 5). DNA 추출에 앞서 더욱 짧은 기간(-2-5 년) 동안 메탄올:아세트산에 보관된 환자 샘플에 대한 QMH 측정검사는 더욱 오랜 기간(>5 년) 동안 보관된 샘플에 비하여, 정상적인 좌위와 결실된 좌위에 대하여 각각, 1.0과 0.5에 일관되게 근접하는 MFI 비율을 산출하는 것으로 관찰되었다. 이는 과도한 기간 동안 보관된 고정된 세포 덩어리로부터 획득된 DNA의 악화된 품질(즉, 변성되고 전단된 상태)에 기인할 가능성이 높다. >6 년 동안 보관된 어떤 환자 샘플도 초기 PCR 품질 관리 단계를 통과하지 못하고, 따라서 QMH 분석에 이용할 수 없었다.
고찰
본 연구에서는 염색체 15q11-13 상에서 PWS/AS 영역 내에 사본 수 변화의 탐지를 위하여, 기존에 개발된 정량적 미소구체 혼성화(QMH) 측정검사를 적용한다. QMH를 이용하면, 클래스 I 결실과 클래스 II 결실이 단일 측정검사에서 용이하게 구별되고, 두 번째 QMH 측정검사에서 더욱 정확하게 한정된다. AS-SRO 내에서 ~19kb에 이르는 더욱 작은 결실 및 PWS-SRO 영역 내에서 4.3kb 정도의 결실이 한 정되었다. 한 환자는 D15S63에서부터 OCA2까지 독특한 결실 구간(~3.36Mb)을 나타내는데, 이는 결실의 새로운 클래스 또는 하위클래스를 대표할 수 있다. 혼성화 실험은 대형 결실된 영역과 소형 결실된 영역에서 게놈 서열의 1개 vs. 2개 사본을 구별하는 충분한 민감성을 예증하였다. 하지만, QMH는 모계 2염색체에 기인한 PWS 환자에서 비동기화 복제(ASR) 시점 패턴을 구별할 수 없었다. 앞으로의 연구는 QMH의 이러한 잠재적인 적용을 더욱 조사하기 위하여 표적 DNA 추출에 앞서 세포 동기화(cell synchronization)를 포함할 것이다. 별개의 스펙트럼 인코딩된 미소구체의 이용은 단일 튜브 내에서 최대 9개의 검사 프로브 및 1개의 참고 프로브의 정확한 분석을 가능하게 하였다.
PWS/AS 영역에 관한 이러한 연구는 QMH 측정검사의 첫 번째 임상적 적용이고, 이러한 측정검사가 환경-의존성 서열 확인을 필요로 하지 않는 다른 사본 수 결정 방법에 대한 적절한 진단적 대안임을 확인한다. 동일한 영역 내에서 사본 수를 사정하는 다른 기술에는 FISH, 서던 혼성화, 마이크로어레이, aCGH, MLPA, MAPH가 포함된다. QMH는 ≥80bp의 게놈 분해능에서 사본 수 차이를 신뢰성 있게 탐지하였는데, 이는 FISH, 서던 혼성화, aCGH(이는 클론된 프로브의 크기와 밀도에 의해 제한된다)에 의해 달성가능한 분해능을 초과하고, 프로브 밀도에서 MAPH와 MLPA에 유사하다. Ic 프로브를 이용한 QMH는 표적 DNA 증폭, 또는 경쟁 서열의 억제를 위한 경쟁자 DNA(즉, Cot-1 DNA)의 추가를 필요로 하지 않는다. 경쟁자 DNA의 추가는 게놈 혼성화 측정검사의 정확성과 재현성을 악화시키고(Newkirk et al. 2005), 따라서 임상적 진단 검사에 이상적이지 못한 것으로 밝혀졌다.
QMH는 둘러싸는 반복 서열의 높은 밀도 및 프로브 설계에 가용한 적은 사본 영역의 제한된 수에도 불구하고, PWS/AS 영역에 쉽게 적용가능하였다. 측정검사 최적화는 최소이었고(방법 참조), 결과는 MFI 비율(도 5; 본래 상태의 좌위의 경우에 0.98±0.075; 결실된 좌위의 경우에 0.58±0.072) 사이에 차이가 미미한 유사한 유전형을 보유하는 샘플 사이에 일관되게 재현가능하였다. 변성된 게놈 표적 DNA를 제외하고, 이러한 연구에서 분석된 샘플에서 가양성 또는 가음성 결과는 획득되지 않았다. 이는 정확한 결과를 담보하기 위하여 QMH에 의한 분석에 앞서 품질 관리 실험의 필요성을 예증한다. 본 발명의 QMH 측정검사는 PWS와 AS 환자의 고속 스크리닝(high-throughput screening)을 위한 이상적인 초기 진단 검사이다. 이러한 검사는 차후의 QMH 측정검사를 이용한 PWS/AS 결실 구간의 한정을 가능하게 하고, QMH에 의해 탐지된 결실의 염색체 배경을 확증하는데 FISH가 이용될 수 있다.
이러한 미소구체 혼성화 플랫폼은 FISH, 어레이 비교 게놈 혼성화(aCGH), 서던 분석, 복합 증폭가능 프로브 혼성화(MAPH), 복합 결찰 프로브 혼성화(MLPA), 정량적 PCR(qPCR) 대신에, 일부 진단 상황에서 더욱 적합하다. 본 발명의 미소구체 측정검사는 분해능을 개선하고, 신호 대 잡음 비율을 증가시키고, 복합이 용이하여, 고속 처리 방식으로 적합하다. 프로브를 복합하는 능력은 이용가능 환자 재료를 보존하고, 진단에 필요한 시간을 감소시킨다. 더 나아가, 이질성 게놈 서열의 오염이 이러한 측정검사에서 혼성화 효율에 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다.
QMH 측정검사에서, 사본 수 차이는 각 혼성화 반응물에 대하여 5개 이하 게놈 등가체(genomic equivalent) 수준에서 100 bp 정도의 게놈 분해능으로 탐지되었 다. 통상적인 FISH와 서던 혼성화로 달성된 분해능의 수준은 ~20 kb 내지 650 kb이다. aCGH의 경우에, 분해능이 클론된 프로브의 크기와 밀도에 제한되고, 형광 신호의 수준에서 변이성(variability)이 해석의 정확성에 영향을 줄 수 있다. MAPH는 대략 50kb의 분해능을 보유하고, MLPA는 다른 기술보다 높은 분해능을 보유하긴 하지만, 결찰 부위 인근에서 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)에 민감한데, 이는 가음성 결과를 유발할 수 있다. qPCR과 유사하게, 오염을 예방하기 위하여 주의가 요구되고, 이들 중에서 어떤 기술도 쉽게 복합되지 않는다.
Ic 미소구체-공액된 현탁 혼성화 프로브의 게놈 어레이로, 정상적인 사본 수를 변화시키는 염색체 비정상의 정도를 신속하게 확인할 수 있다. 한 염색체 영역에 걸쳐있는 Ic 프로브의 밀집된 세트의 혼성화는 몸세포염색체 도메인의 경계를 초기에 조사하는데 이용될 수 있다. 이후, FISH 연구가 이들 유전자 변형에 대한 염색체 배경을 제공할 수 있다. 본 발명은 고속 처리 분야에 적합한데, 그 이유는 이론적으로, 각 웰 내에서 10개의 스펙트럼으로 별개의 인코딩된 비드의 세트를 이용하여 단일 고밀도 마이크로역가 평판 상에서 3840개의 상이한 산물을 분석할 수 있기 때문이다. 현재의 장치로, 20kb의 최소 프로브 분해능을 가정하면, 단일 평판은 90분 이내에 20Mb 도메인에 대한 높은-분해능 사본 수 결정을 제공할 수 있다. 이러한 방법의 증명된 민감성과 정확성에 기초하여, 미소구체 현탁 혼성화는 다른 분야, 예를 들면, cDNA 내에서 적은 사본 또는 드물게 나타나는 mRNA 서열(각 혼성화 반응물에 대하여 ~5개의 게놈 등가체)의 탐지와 정량에 자연스럽게 확장될 수 있다.
실시예 1에 대한 참고문헌:
이들 참고문헌은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
Armour JAL, Sismani C, Patsalis PC, Cross G. 2000. Measurement of locus copy number by hybridisation with amplifiable probes. Nucleic Acids Res. 28(2):605-609.
Bagwell CB, Baker D, Whetstone S, Munson M, Hitchcox S, AuIt KA, Lovett EJ. 1989. A simple and rapid method for determining the linearity of a flow cytometer amplification system. Cytometry 10(6):689-94.
Brown RD, Zarbo RJ, Linden MD, Torres FX, Nakleh RE, Schultz D, Mackowiak PG. 1994. Two-color multiparametric method for flow cytometric DNA analysis. Standardization of spectral compensation. American Journal of Clinical Pathology 101(5):630-637.
Coder DM, Redelman D, Vogt RF. 1994. Computing the central location of immunofluorescence distributions: logarithmic data transformations are not always appropriate. Cytometry 18(2):75-8.
Dunbar S, Godbout R, Newkirk H, Hetzel J.2003. Microsphere suspension array technology for SNP detection in cattle. IEEE Eng Med Biol Mag 22(4): 158-62.
Earley M, Vogt RJ, Shapiro H, Mandy F, Kellar K, Bellisario R, Pass K, Marti G, Stewart C, Hannon W. 2002. Report from a workshop on multianalyte microsphere. Cytometry 50(5):239- 42. Fulton RJ, McDade RL, Smith PL, Kienker LJ, Kettman JR, Jr. 1997. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clin Chem 43(9): 1749-56.
Hadd AG, Laosinchai-Wolf W, Novak CR, Badgett MR, Isgur LA, Goldrick M, Walkerpeach CR. 2004. Microsphere bead arrays and sequence validation of 5/7/9T genotypes for multiplex screening of cystic fibrosis polymorphisms. J MoI Diagn 6(4):348-55.
Inoue K, Dewar K, Katsanis N, Reiter LT, Lander ES, Devon KL, Wyman DW, Lupski JR, Birren B. 2001. The 1.4-Mb CMTlA Duplication/HNPP Deletion Genomic Region Reveals Unique Genome Architectural Features and Provides Insights into the Recent Evolution of New Genes. Genome Research 11(6):1018-1033.
Knoll JH, Lichter P. 1994. In situ hybridization to metaphase chromosomes and interphase nuclei. In Dracopoli NC, Haines JL, Korf BR, Moir DT, Morton CC, Seidman CE, Seidman JG, Smith DR (eds): "Current protocols in Human Genetics Volume 1 " Unit 4.3, Green- Wiley, New York. (Revised 2005, in press).
Knoll JH, Rogan PK. 2003. Sequence-based, in situ detection of chromosomal abnormalities at high resolution. American Journal of Medical Genetics 121(3):245-257. Knoll JHM, Rogan PK. 2004. Single Copy Genomic Hybridization Probes and Method of Generating Same. US Patent No. 6,828,097.
Lewin B. 1980. DNA sequence organization: nonrepetitive and repetitive DNA. In "Gene Expression 2 - Eucaryotic Chromosomes", Chapter 18, pp 503-530, 2nd edition, Wiley- Interscience Publication.
Lupski JR, Oca-Luna RMd, Slaugenhaupt S, Pentao L, Guzzetta V, Trask BJ, Saucedo-Cardenas O, Barker DF, Killian JM, Garcia CA et al. 1991. DNA duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Cell 66(2):219-32.
Oostlander AE, Meijer GA, Ylstra B. 2004. Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics. Clin Genet 66(6):488-95.
Rockenbauer E, Petersen K, Vogel U, Bolund L, Kolvraa S, Nielsen KV, Nexo BA. 2005. SNP genotyping using microsphere-linked PNA and flow cytometric detection. Cytometry A 64(2):80-6.
Rogan PK, Cazcarro PM, Knoll JH. 2001. Sequence-based design of single-copy genomic DNA probes for fluorescence in situ hybridization. Genome Res 11(6): 1086-94.
Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. 2002. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 30(12):e57.
Sekar M, Bloch W, John PS. 2005. Comparative study of sequence-dependent hybridization kinetics in solution and on microspheres. Nucleic Acids Res. 33(l):366-75.
Shaffer, LG, Bejjani, BA. 2004. A cytogeneticist's perspective on genomic microarrays. Hum Reprod Update. 10(3):221-26.
Sinclair P, Nacheva E, Leversha M, Telford N, Chang J, Reid A, Bench A, Champion K, Huntly B, Green A. 2000. Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis subgroup of patients with chronic myeloid leukemia. Blood 95(3):738-43.
Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J MoI Biol 98:503-518.
Vignali D. 2000. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods.243(1-2):243-55.
White SJ, Breuning MH, den Dunnen JT. 2004. Detecting copy number changes in genomic DNA: MAPH and MLPA. Methods Cell Biol. 75:751-768.
실시예 2에 대한 참고문헌:
이들 참고문헌은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
Amos-Landgraf JM, Ji Y, Gottlieb W, Depinet T, Wandstrat AE, Cassidy SB, Driscoll DJ, Rogan PK, Schwartz S, Nicholls RD (1999) Chromosome breakage in the Prader-Willi and Angelman syndromes involves recombination between large, transcribed repeats at proximal and distal breakpoints. Am J Hum Genet 65:370-386.
Bejjani BA, Shaffer LG (2004) A cytogeneticist's perspective on genomic microarrays. Hum Reprod Update 10:221-226
Bittel DC, Butler MG (2005) Prader-Willi syndrome: clinical genetics, cytogenetics and molecular biology. Expert Reviews in Molecular Medicine 7:1-20.
Bittel DC, Kibiryeva N, Talebizadeh Z, Butler MG (2003) Microarray analysis of gene/transcript expression in Prader-Willi syndrome: deletion versus UPD. J Med Genet 40:568-574.
Bittel DC, KibiryevaN, Talebizadeh Z, Driscoll DJ, Butler MG (2005) Microarray analysis of gene/transcript expression in Angelman syndrome: deletion versus UPD. Genomics 85:85-91.
Buiting K, Saitoh S, Gross S, Dittrich B, Schwartz S, Nicholls RD, Horsthemke B (1995) Inherited microdeletions in the Angelman and Prader-Willi syndromes define an imprinting centre on human chromosome 15. Nature Genetics 9:395-400 Knoll J, Rogan P (2004) Single Copy Genomic Hybridization Probes and Method of Generating Same.US 6,828,097
Knoll JH, Rogan PK (2003) Sequence-based, in situ detection of chromosomal abnormalities at high resolution. American Journal of Medical Genetics 121:245-257
Knoll JHM, Nicholls RD, Magenis RE, Glatt K, J.M. Graham J, Kaplan L, Lalande M (1990) Angelman syndrome: three molecular classes identified with chromosome 15ql Iql3-specific DNA markers. Am J Hum Genet 47: 149-155
Mapendano CK, Kishino T, Miyazaki K, Kondo S, Yoshiura K-I, Hishikawa Y, Koji T, Niikawa N, Ohta T (2006) Expression of the Snurf-Snrpn IC transcript in the oocyte and its putative role in the imprinting establishment of the mouse 7C imprinting domain. J Hum Genet 51:236-243
Newkirk H, Knoll JHM1 Rogan P (2005) Distortion of quantitative genomic and expression hybridization by Cot-1 DNA: mitigation of this effect. Nucleic Acids Research 33:el91
Newkirk H, Miralles M, Rogan P, Knoll JHM (2006) Determination of genomic copy number with quantitative microsphere hybridization. Human Mutation 27:376-386
Nygren AOH, Ameziane N, Duarte HMB, Vijzelaar RNCP, Waisfisz Q, Hess CJ, Schouten JP, Errami A (2005) Methylation-specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research 33:el28
Ohta T, Gray TA, Rogan PK, Buiting K, Gabriel JM, Saitoh S, Muralidhar B, Bilienska B, Krajewska-Walasek M, Driscoll DJ, Horsthemke B, Butler MG, Nicholls RD (1999) Imprinting- mutation mechanisms in Prader-Willi syndrome. Am J Hum Genet 64:397-413
Sahoo T, Shaw CA, Young AS, Whitehouse NL, Schroer RJ, Stevenson RE, Beaudet AL (2005) Array-based comparative genomic hybridization analysis of recurrent chromosome 15q rearrangements, Am J Med Genet 139A: 106-113
Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification, Nucleic Acids Res 30:e57
SEQUENCE LISTING
<110> Children's Mercy Hospital
Newkirk, Heather
Rogan, Peter
Knoll, Joan
<120> QUANTIFICATION OF MICROSPHERE SUSPENSION HYBRIDIZATION AND USES
THEREOF
<130> 36401-PCT
<150> 60/708,734
<151> 2005-08-16
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2287
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aatagatgca atgggggtga gagagaatgt tcacttgcca agggaatgag ggcagacaag 60
agaaaggaaa attgagatgg gaggaggtga cctgcagagg aattgaagag aaagaaatta 120
ttgaggtaag agcaagctta tttctttcta ttttactttt tcggggagaa gatttgcaga 180
tgcttcatcc tttcatttta agatgtcttc cacagacgct aagaataact tgtctggagg 240
aatctagggc ttgtcttcta accccaaatt tgaacaaggc ctgtatctga tctggcagcc 300
ctgcttctga gagacttgag acttgttcac cttccacctt ttcctcatcc cggggagaat 360
cttctcaccc catcctttgc cttcataatt aagggaacaa tttgaggtct aaaggaagaa 420
gtgaatttca aatcagttta ataaaacagc acaaatctgg gaattgagga atgcattccc 480
tttataacag ctgaagtcac caacaatcta ttattcatga cagcaagcaa agactgaggc 540
aaaagtgccc taagttggct gggtgcagtc ccagcacttt ggaaggccaa ggcaagagga 600
tcacttgagc ccaggacttc gagaccagcc tgggcaagat ggtgagacca catctctaca 660
aaaataaata aatacaaaaa ttagctgggt gtggtggtgc ctccctgaag tcccagctgc 720
tcagaaggga ggatggcttg agcccaggag ttcaaggctg caatgagcta tgaccacacc 780
actgcactct agcctgggtg acagagaacc tgtctctatt taaaaaaaaa aaaaaagtgc 840
ctcaagttat actgtcaatt gcagtgattg cctcagcttt ccaaattcac tatgctcccc 900
aattcatccc tgagtcatgc caccttctct tgtgttagca gggacattaa aacttgccca 960
aattcctgct ggctctccca gccccagcag aaaagactgg gagaaccaag caactttgct 1020
ccctaggttc ccaatctcct cctcctccct aaaagaagct tcgctgactg gaataaccta 1080
tggcccatag gatttttggt ggaccaaatt aaactcacca gagagggtct gggtggaccc 1140
aacaccaaaa tgaaataaag ttgatgtcct agtttgtatg atctgcttgt acataaaaga 1200
gagcaaggag aacatagaca tgtttggaac tgaagttatc tttgacagtt ttcactcctt 1260
atcacactga gaatgcaggc aaggaaacta tctaaccaga atggggatat attagaagtt 1320
taacctcaga ttctggtcct ttctgtgaag gaagctgctt cagctggggg cttggcagga 1380
gcaatctaaa ttctctcatt agaccttaaa tgtctctatc tgctctcccc agcccaaatc 1440
tagggaggcc aaacccaaga tcaaaggttg gggctaggcc agtgaggtgg ctcatgcctg 1500
taatcccagc actttgggag gccaaggagg gcagatcacc tgaggtcggg agttcaagac 1560
cagcctgacc aacatggtga aacccccatc tctactaaaa aatacaaaaa ttagccgggt 1620
gtggtggcag gcacctataa tcccagctac tcaagaggct gaagcaggag aatcgcttga 1680
acccgggagg cggaggttgc agtgagctga gatcgcacca ttgcactcca gcctgggcga 1740
cagagcaaga ctcaaaaaaa aaaaaaaaaa gttggggctt aggaagtaaa gaatattcat 1800
aattttttcc ttctttcttt cttttttttt caggcagggt ttcgctctgt tgccccaggc 1860
tagagtgcaa tggtgtaatc acggctccct acagctttga cctcctgggc tcaagcgatc 1920
ctcccacctc agcctcctga gtaggtagga ctacaagcat gcaccaccac aagtttttca 1980
ctatgagatg aattgttttt gttgctgtta gagaaaggat atttctttta atgcaagcta 2040
attaaactgt cataaatctg gttgagaacc ttagactgta tgtagtacat attgtaatgg 2100
gattagtgct agctatgtgg gccagaatag ttgggttcaa gcccttgctt ggccattttt 2160
tttttttttt tttaatacag ggtctcactt tgtcacccag gctggagtgc agtggcgcaa 2220
tctcggcccg ctgcaacctc tgcctcccag gcccaagcaa tcctcccacc tcaacctccc 2280
aagtagc 2287
<210> 2
<211> 1344
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
cggttctgga accaaatctt gacctgtgtt tcattgagct ccagggtggc ggcaatctcc 60
accctccggg cccggctcag gtacttgttg aaatggaact ccttttccag ttctgtcagc 120
tgccttgtgg tgaagttggt gcggaggcca ctgggcgagc ccaggcctgg ctctgacacc 180
ttcgctaggg gcggggcagg gagaaaggcc aggtcaattc tctcacctct ttctccttcc 240
gcttccctcc tcccggggct ggctctggac ctccatttgc cattctgccc aagtacagtt 300
gtcaaagttc ccagggacca ccaggtaccc ccatggtgat caccaagtct ggagcagcct 360
tccccatact tccatccccc atgcacacca ggtcctgggt ctgtgctggg tgcacagatc 420
aggaagtggg gtgtgtatgg aaacttactc ctggggtgac cggttacata ctgggtgggg 480
agacctcacc tgacctgaga cgtaggttgt gctcttacct gtgtctacca gagccgctga 540
aagagaagaa cccagcccag acccaggaca tgtcactgca ggggaagcag agatgctttg 600
ggccccggag aaggggtggc cacatctgag ccctacctgt cttgggtggg tttctcttaa 660
ccttcatcca gtcgaaggtc cgggccgtgg gggtgttagg ttctgaaggg cagggtgttt 720
ccttgtcctc ggagaggaga tcagcatagg ccggtgcaaa gctcgcggtc tgctcgttcc 780
cataaggggg atgctgcgga ggatatggcc ccggaccggc tccacctgct ccgtagccat 840
cggacaagcc ccctagctgg gccccgtagc tcgagggatg aaaatagcct ccgtctcctt 900
ctgattgacc cagagggtag tactgagaag gcccgtagct ggggctgcag gcggcaggag 960
cataccccga gggcgcggag ctggggaagg gcacccccag ggtcgaaggc ggctgctggg 1020
cgggatagcc ggagttctgc tgaaacgcag ggctggacag ccccccaccg tagcggccct 1080
cgcttgcata gctgtcaacc gcctgagccg agcttggggg aaaggaggtt ggggcgctgt 1140
gggcgctgta ggcgctgggt ccccggttac agagtgggta ctctaagaag gagttcatcc 1200
tattatagtc catgcgtcaa ggccgcagga gggtcggccc gtttggggga gacaccctct 1260
tgccctacaa cctttcggca gtatgtcaca gcgctggggc tcgaatccat ggcctgaccc 1320
gctcgcctgg gcaagcgctt ccct 1344
<210> 3
<211> 94
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ttatcctctc tctagccatc catagctgta gctggctcac tcactcagac ttaaataact 60
ccctatatct ctctagagag ccacaatgag caca 94
<210> 4
<211> 2304
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gtggcttatg cctgtaattt cacactttgg gaggccaaag gcaggtggat tgcttgagcc 60
caggagttca agatcatcct gggcaacata agaagaccct gtctctacaa caagaacaaa 120
agaaattagc cagacgtgtt atcacacctg tgttcccagc tacttgagtg gctgaggtgg 180
gagggtcact tgagctcggg aggccaatgc tgcagtgagc catgatcacg ccactgcact 240
gcagcctggg taacagagca agaccccatc tcaaaacaaa gtttgagaac tgttgctatg 300
gaaagtctat caagaaggca catagggatg tttgttgctg aagtactaac actgaatgat 360
gtctgtgttg tggtgagtag aaaaaaagca atttgaaaat cattatttat ggtatggccc 420
catttttgta aaacaaaaat atctgtttat ttgtgtatgt ccaggaaaaa aaagtatgga 480
aggattttac accgaaattt ttatctctag ggacttggag ctttaggtgg aatcggagaa 540
aactttctct ttttggtttg tgtgatgttc caagtgtctt tttacaacaa acttgggtta 600
tcttataata cgaaaaattc gaagatttaa aaactgaggc caggcacggt ggctcatgcc 660
tataatccca gcactttggg aggttgacac atgtggatca cctgaggtca ggagtttgag 720
accagcttga ccaagaaggt aaaaccctgt ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggc 780
gtggttgcag gtgcctgtag tcccagctac tcgggaggct gagacaggag agttgcttag 840
acccaggagg tcgaggttgc aacgagctga gattgcacgc cactgcactc ccagcctggg 900
cgacggagtg agactccatc tcaaaataaa taaataaata aaaataaaaa ctgaattgat 960
gacagcccaa cctgtcactt ttttcagatc cctttttatg aaagaatttg cttaagttgt 1020
gtctgaagac aaaccaattt ctttggaccc tgggtattct ttttctaagg gaataccatg 1080
ttattttgtg ttacagattg tttgcgatct ttcataggct gatctttcta gagttggtta 1140
atatccatgt aggttagatt gaaaaacttg aattcagaaa tgtacggtgt tggagcagac 1200
atggatctgg aagccaagaa tagcgttggt gttgttgttg atggtgaatc tgaaagagtg 1260
ggcagatggc aactttttgc cagaatcatt cagggtcaaa gggctagtca tatttacaag 1320
ggaaaagagg aaaccatgtt attaaatatt tcatgcacca tatgttcctt tcaaatttca 1380
gtggcttgac taagaaaatt cacttttggg agagttggta caacaattga aagcacttag 1440
tagtcaactt tttccttagt gtttccttct tccttcaaca aacatttatt ttattgagca 1500
cagactatga caggtcgtgt tgtagtcact gatgatatat ttgtaaacaa aacaatccct 1560
gccctcctag aacttacatt ctagtgggag gagacacatc ataaataagc taagtaaata 1620
aaatacagat atgttagtga tatgtgctga ggagaagaat aacatagaga aggggacagg 1680
gaatggggta ggaggtgtaa ttttagttag ggtggctaga gaggcctgac tgagagggcg 1740
gcatttgatt aaagacccga aggaggaaga tgagcagcag gccctgttga aatatgtgaa 1800
agaatttcag gccgagggaa ccaggatgca gaaacctgag gcagagcttg ctagtttcaa 1860
ggagcagcct agaggccact gcaccagagc aaagagcaaa aggagagatg caggaggtaa 1920
aatggagggt gggaagagaa tggctgaagg agagggtggc cttattggcc catttcaagg 1980
attttgactt tgattcatat gatgtgggaa ggccttggag aattttccga ggggactata 2040
ctatctgatg tatgtttcag tatgaaatag aatctctctg gctgctatga tctgaaggag 2100
gacaagggag cagggattcc acgggggcat tgattgcaca gagccaggta agagtgatga 2160
tgcttggacc aaagtggtgg cactgggtgg agggtcagaa ccgacaagat ttgctctcgg 2220
attagatgtg ggatatgggg gtgtgagagg ggccaagtgt gactctcagg ttttcgaact 2280
gaataactgg aagaatagag ttgc 2304
<210> 5
<211> 101
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gatctttcta gagttggtta atatccatgt aggttagatt gaaaaacttg aattcagaaa 60
tgtacggtgt tggagcagac atggatctgg aagccaagaa t 101
<210> 6
<211> 1383
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
atttggaaag attatatcca tctacttaat gctagggatt ggattgtggc acgtggactg 60
tgaaaatgca aaattggagg tatgtacttt attttagaga cagggtcttg ctttgtcacc 120
caggctggag tgtagtggca cagtcatagc tcactgcagc cttgaactcc tgggctccag 180
tgatcctctt gccttagcct cccaaagcaa tgggatcgta caggtgagcc attgcacctg 240
gccatgtatg tacatttttt ataagcattc agttgtttcc aatagtctaa tacattttgt 300
atggccttct tatttttcat gaaaccttac tacccatttt aagaaatttg taatatagaa 360
gaaaacagaa gtttcaattg tggggtaagt aaagaaagat gatcaaagat gatttgacca 420
aaagagtttt acttcattta aatgaagcat gttgtcaaag aaaatgaaag tgggaaaaaa 480
tgtgaaatca ttttgtatca gttcaggaca gaaccgtgct tgtgcttcag atctccaagt 540
gtgaacacac tgatgtgttg tgaagtgtgt tgcaaataga agcatttttt gaatgggagg 600
gagagggatg tgttaacatg atttagctgg gaattaaacc cataggaatg tgtcgggcat 660
attttctgtg actagggggt aaaaagatta aaatggctac tgaggatggg cttcagtaag 720
aggaggtctc ccgaaggcct tctctgccct gtgcctctgc agttccctga ctccttgctg 780
tgttcgtccc tgcctttttg gtagttgtgc ccctgatgtc actcccctgt gtgttcagat 840
cctacctgct ggccaggtgc agtggctcac acctgtaatc ccagcacttt gggaacccaa 900
ggtgggacgg tcctctgaga ccaggagttt gagagagtgg cctggacaac atagcaacac 960
cctattagta ctaaaaataa aaaagttagc taggcataat aatgtcctgt gcttgtctag 1020
ctacttggga ggctgaggca gaaggattac ttgagtccag gagttcgagg ctgaagcaaa 1080
ctgtgatcat atcattgtac tccagcctgt gtgataaagc aagaccctat cctttaaaag 1140
taaaaaacaa acaaacaaac aaaaaacaaa cctgcttaac ctttcaacac tctcttccag 1200
tcccccctcc cttctgaaac catattttac atctctggtc ctcattaaat tttctgtaac 1260
ttctgccctt gtaactcttc tgcaacacaa atgaatacat aatcatatac ttcctagtag 1320
tatttcctaa tagttttatg tgagtttcat ggaagagagt gttgaaacgt aggtaggttt 1380
gtt 1383
<210> 7
<211> 102
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atttggaaag attatatcca tctacttaat gctagggatt ggattgtggc acgtggactg 60
tgaaaatgca aaattggagg tatgtacttt attttagaga ca 102
<210> 8
<211> 99
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
accaactttc atgccctagg tgaaacggag gacgtcttgg gaggtagaga gttgcccaag 60
gtctgaatcc atgggatcta ctaagaacaa gacccagac 99
<210> 9
<211> 102
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
agggcagctc atgacatgcc tccatgtttt ccatgtgggt catcaaacaa cagagcacca 60
gagagggttg aactaaatga atactcaagt gccttccagt cc 102
<210> 10
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
aaaggcgatc tcctcctgct cctgctagag cgcagcgagc gcacggcgtt tccgcagtaa 60
tcctgagcac ggcaaggacc c 81
<210> 11
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
attcatacca gcaacagcag tggcatgatg cgggcaggat tgccagtgtc cgtgcatgcg 60
tttgcactgg tgattgcagt g 81
<210> 12
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
gcaatagtgg tggacaagtt ggcacctcga ttgtctcagc tcaaggttct gcacaaagtg 60
tttagtactg gagtagcaga a 81
<210> 13
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
tacccaccac cctctaacca ccaaatggtc tatcctagat ggtgaagttg ggttaattgt 60
tagacacggt ggaatcttta t 81
<210> 14
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
cggcagctag gggcaggagt gcaagaatga tgtatccttt caagtatcat gaccatcggg 60
gtgaattgct gagttctggg g 81
<210> 15
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
taagtccttg gcattactta aagaaggcca ttagatatat gtcacgtgtg agagtgaggt 60
ttgcagctgg gaagtaagcc t 81
<210> 16
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gaaacagtca tcgagtggga tgacaacttg gaaaggcttt gtgggccttt gtgacctcat 60
ggtatgcatc ccctcagggt g 81
<210> 17
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
tggcgtctgc taggagtctc ctatccggcg tttgtgccgc agaaaacctt taacctgcgt 60
tttacccgta aacattttcc t 81
<210> 18
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
aaaagcataa gttttagtca catcaaaata taaacaatct tgaaattaat tcataagtaa 60
atcaatagat atcttgaaat t 81
<210> 19
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
ttcggagagt tacccaggtg tagtaccctt ccaagtagat aatgattgaa agagtatgtg 60
ctggaggtgt atgatatttt c 81
<210> 20
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
ggttttgatt ttgatatact ccagtttatc tatttttgtg tttccttagc ttttggtgtt 60
gtagtcaaga aatcattgcc a 81
<210> 21
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
tgcattcttt ttaaaaaata tttttagtct ttacatttca gaatcagtat ttcaaatgtg 60
acttgtagga ctacgtgcag t 81
<210> 22
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
cttgctgttg tgccgttctg ccccgatggt atcctgtccg ctcgcattgg ggcgcgtccc 60
ccatccgccc ccaactgtgg t 81
<210> 23
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
ggttactgat tcataggggt atgtcgaggg cttttgtctg gaattccctg cttaccagta 60
gatgattggt ttacatattt t 81
<210> 24
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 24
ggccgcagag gcaggctggc gcgcatgctc aggcggggat gtgtgcgaag cctgccgctg 60
ctgcagcgag tctggcgcag a 81
<210> 25
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
agtatttcaa atgtgacttg taggactacg tgcagtgagg aagattgtta atcatcctat 60
tctgaccagg agttctgaca a 81
<210> 26
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
caaacactgg gacccagaat agtaccctgt ggtcatagtg cccacagttc actaagcacc 60
ctcacaggtc tttgacagaa c 81
<210> 27
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
tttacctgcg cacttgcaga tctttctcca ggagtgagtt taaggtccgc acctccgctc 60
tggatggtga gcggagcaca g 81
<210> 28
<211> 81
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
aagacacttc aatcacccgc agcccatcca tctgagagcg acatggaagc gtcaaaaaca 60
tctttcttca aagacttttg g 81
Claims (38)
- 게놈 내에서 표적 핵산 서열의 사본 수를 정량하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법:개체로부터 표적 핵산 서열을 포함하는 핵산을 추출하고,표적 핵산에 라벨을 부착하고,표적 핵산 서열을 보충하도록 선택되는 미립자-공액된, 적은 사본, 핵산 프로브를 제조하고,프로브를 표적 핵산에 혼성화시켜 혼성화 반응 산물을 형성하고,미립자의 탐지를 통하여 산물을 확인하고,산물 상에서 라벨의 탐지를 통하여 표적 핵산 서열의 사본 수를 정량한다.
- 청구항 1에 있어서, 미립자는 나노결정성 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 미립자는 나노구를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 미립자는 미소구체를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 미립자는 스펙트럼 상이한 중합체 미소구체를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 2에 있어서, 미소구체는 폴리스티렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 2에 있어서, 미소구체 표면 상에서 생물학적 모이어티에 형광색소를 결합시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 2에 있어서, 미소구체가 카르복실화되는 변형된 카르보디이미드 반응을 통하여 미소구체에 프로브를 공액하거나, 또는 친전자성 사슬을 이용하여 프로브에 미소구체를 공액하는 단계가 추가로 포함되고, 상기 사슬은 N-클로로아세트아미도헥실 포스포라미디트를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 미립자는 결정된 스펙트럼 어드레스(spectral address)를 보유하는 내부-염색된 형광 폴리스티렌 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 추출된 표적 핵산은 게놈 DNA와 상보성 DNA에서 선택되 는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 표적 핵산은 시험관내 핵산 복제 반응 동안 직접적으로 표지된 확인가능 라벨로 새김눈 번역(nick translation)을 통한 표지(labeling), 말단 표지(end labeling), 무작위 프라이밍(random priming)에서 선택되는 과정으로 표지되는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 라벨은 형광단, 효소 공액체, 형광단-표식된 뉴클레오티드, 항원-보유 뉴클레오티드에 결합된 형광-표지된 항체, 비오틴-dUTP, 디곡시제닌-dUTP, 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 적은 사본 프로브는 10개 이하의 사본 수를 보유하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 프로브의 핵산 서열은 개체의 게놈 내에서 단일 사본 서열에 상보성인 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 하나이상의 염기쌍의 결실을 포함하는 표적 핵산은 상기 표적 핵산 서열의 정상적인 보체를 포함하는 참고 프로브와 비교하여 대략 0.1 내지 대략 0.75의 반응 비율(response ratio)을 나타내는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 하나이상의 염기쌍의 삽입 또는 중복을 포함하는 표적 핵산은 표적 핵산 서열의 정상적인 보체를 포함하는 참고 프로브와 비교하여 대략 1.25 내지 대략 1.65의 반응 비율을 나타내는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 하나이상의 별개의 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미립자에 공액된 별개의 핵산 서열을 포함하는 복수 프로브가 표적 핵산에 혼성화되는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 미립자는 핵산 프로브의 3' 또는 5' 말단에서 비오틴 모이어티에 결합된 스트렙타비딘-코팅된 또는 카르복실화된 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 1 ㎍의 이질성 게놈 핵산 서열당 탐지되는 표적 서열의 양은 50 pg 내지 5 ng의 범위 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 사본 수(copy number) 차이는 60 bp의 게놈 분해능(genomic resolution)으로 탐지되는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 정량 단계는 유세포분석법을 이용하여 산물의 스펙트럼 어드레스를 탐지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 프로브는 50 내지 2500개 염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 1에 있어서, 미립자는 50 nm 내지 1 ㎛의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 개체-유래된 게놈 또는 상보성 핵산 내에서 의심되는 염색체 비정상을 탐지하는 방법에 있어서, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법:첫 번째 스펙트럼 어드레스를 보유하는 스펙트럼 인코딩된, 형광 미소구체를 제조하고,비정상이 존재하는 것으로 의심되는 표적 핵산 서열을 뉴클레오티드 서열 별로 조사함으로써 표적 게놈 핵산 프로브 서열을 확인하고,확인된 표적 게놈 핵산 프로브 서열에 따라 적은 사본 표적 프로브를 합성하고,첫 번째 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미소구체에 표적 프로브를 공액하고,표적 핵산 서열의 공지된 사본 수를 보유하는 참고 핵산 서열에 혼성화되도 록 선택된 참고 프로브를 합성하고,두 번째 스펙트럼 어드레스를 보유하는 미소구체에 참고 프로브를 공액하고,비정상을 보유하는 염색체 표적 서열과 표적 프로브를 반응시켜 상기 표적 프로브가 상기 표적 서열에 혼성화되도록 하고,염색체 표적 서열을 포함하는 염색체 참고 서열과 참고 프로브를 반응시켜 상기 참고 프로브가 상기 참고 서열에 혼성화되도록 하고,혼성화된 표적 프로브를 탐지하여 염색체 비정상의 존재를 조사하고,혼성화된 참고 프로브를 탐지하고,탐지된 혼성화된 표적 프로브의 반응을 탐지된 혼성화된 참고 프로브의 반응과 비교함으로써 탐지된 혼성화된 표적 프로브를 정량한다.
- 청구항 24에 있어서, 비정상은 게놈 또는 상보성 핵산 내에서 서열의 사본 수 차이, 중복(duplication), 결실(deletion), 역위(inversion), 전위(transposition), 전좌(translocation), 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 청구항 24에 있어서, 60 bp의 게놈 분해능으로 비정상을 탐지하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 청구항 24에 있어서, 탐지 단계는 유세포분석법을 이용하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 청구항 24에 있어서, 적은 사본 프로브는 10개 이하의 사본 수를 보유하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 미소구체-공액된 적은 사본 게놈 또는 상보성 핵산 프로브에 혼성화된 표지된 표적 핵산 서열의 유세포분석 탐지를 통한 염색체 비정상의 직접적인 게놈 정량 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량 방법:50 nm 내지 1 ㎛의 직경을 갖는 스펙트럼 인코딩된 형광 미소구체를 제조하고,비정상이 존재하는 것으로 의심되는 표적 내에서 특정 핵산 서열에 혼성화되도록 선택된 적은 사본 표적 프로브를 합성하고,표적 프로브를 미소구체에 공액하고,표적 프로브를 표적 핵산 서열에 혼성화시키고,유세포분석법으로 혼성화된 표적 프로브를 탐지하고,유세포분석법의 결과에 기초하여 비정상을 정량한다.
- 청구항 29에 있어서, 프로브의 핵산 서열은 50 내지 2500개 염기의 정의된 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 29에 있어서, 비정상은 게놈 또는 상보성 핵산 내에서 서열의 사본 수 차이, 중복, 결실, 역위, 전위, 전좌, 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 청구항 29에 있어서, 60 bp의 게놈 분해능으로 비정상을 탐지하는 것을 특징으로 하는 정량 방법.
- 염색체 비정상을 탐지하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법:스펙트럼 인코딩된, 폴리스티렌 미소구체를 합성 DNA 서열에 결합함으로써 혼성화 프로브를 제조하고,상기 프로브를 게놈 DNA에 혼성화시키고,유세포분석법으로 혼성화 산물을 탐지한다.
- 청구항 33에 있어서, 비정상은 게놈 또는 상보성 핵산 내에서 서열의 사본 수 차이, 중복, 결실, 역위, 전위, 전좌, 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 청구항 33에 있어서, 60 bp의 게놈 분해능으로 비정상을 탐지하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 청구항 33에 있어서, 유세포분석 결과를 비정상에 상응하는 공지된 사본 수를 보유하는 혼성화 산물로부터 유세포분석 결과와 비교하는 단계가 더욱 포함되는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 청구항 33에 있어서, 프로브는 게놈 DNA 내에서 10개 이하의 위치에 상보성인 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
- 청구항 33에 있어서, DNA는 증폭되지 않은 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70873405P | 2005-08-16 | 2005-08-16 | |
| US60/708,734 | 2005-08-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20080049733A true KR20080049733A (ko) | 2008-06-04 |
Family
ID=37758506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020087005624A Withdrawn KR20080049733A (ko) | 2005-08-16 | 2006-08-16 | 미소구체 현탁 혼성화의 정량 및 이의 용도 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090136918A1 (ko) |
| EP (1) | EP1945809B1 (ko) |
| JP (1) | JP2009507472A (ko) |
| KR (1) | KR20080049733A (ko) |
| AU (2) | AU2006272462A1 (ko) |
| BR (1) | BRPI0614994A2 (ko) |
| IL (1) | IL189558A0 (ko) |
| WO (1) | WO2007022530A2 (ko) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7734424B1 (en) * | 2005-06-07 | 2010-06-08 | Rogan Peter K | Ab initio generation of single copy genomic probes |
| BRPI0620420B1 (pt) * | 2005-12-23 | 2016-08-09 | Perkinelmer Las Inc | método para avaliar dna genômico |
| US7932037B2 (en) * | 2007-12-05 | 2011-04-26 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | DNA assays using amplicon probes on encoded particles |
| AU2013201151B2 (en) * | 2005-12-23 | 2016-03-31 | Revvity Health Sciences, Inc. | Comparative genomic hybridization on encoded multiplex particles |
| CA2692844C (en) * | 2007-06-07 | 2019-02-12 | Simons Haplomics Limited | In situ methods for gene mapping and haplotyping |
| JP5530185B2 (ja) * | 2008-02-05 | 2014-06-25 | オリンパス株式会社 | 核酸検出方法及び核酸検出用キット |
| US9652585B2 (en) | 2010-03-16 | 2017-05-16 | Bluegnome Limited | Comparative genomic hybridization array method for preimplantation genetic screening |
| WO2013006195A1 (en) | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Methods of detecting gene fusions |
| CN107111692B (zh) | 2014-10-10 | 2021-10-29 | 生命科技股份有限公司 | 用于计算经校正扩增子覆盖度的方法、系统及计算机可读媒体 |
| CN107202903B (zh) | 2016-03-18 | 2020-04-10 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 样本分析仪及其样本分析方法 |
| CN106771168A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-05-31 | 武汉纽康度生物科技股份有限公司 | 荧光免疫层析检测卡及其制备方法和应用 |
| AU2019321683B2 (en) * | 2018-08-17 | 2025-04-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | DNA amplification method for probe generation |
| CN110554178A (zh) * | 2019-04-23 | 2019-12-10 | 杭州深度生物科技有限公司 | 一种悬浮式液态生物芯片检测方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5460831A (en) * | 1990-06-22 | 1995-10-24 | The Regents Of The University Of California | Targeted transfection nanoparticles |
| US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
| US6303294B1 (en) * | 1991-10-04 | 2001-10-16 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Methods of detecting genetic deletions and mutations associated with Digeorge syndrome, Velocardiofacial syndrome, CHARGE association, conotruncal cardiac defect, and cleft palate and probes useful therefore |
| US5981180A (en) | 1995-10-11 | 1999-11-09 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods |
| US5736330A (en) | 1995-10-11 | 1998-04-07 | Luminex Corporation | Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences |
| US6589940B1 (en) * | 1997-06-06 | 2003-07-08 | Dynavax Technologies Corporation | Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof |
| US7433035B2 (en) * | 1998-06-29 | 2008-10-07 | San Diego State University Research Foundation | Detection of carbon halogen bonds |
| US6828097B1 (en) * | 2000-05-16 | 2004-12-07 | The Childrens Mercy Hospital | Single copy genomic hybridization probes and method of generating same |
| US6677606B1 (en) * | 2000-06-28 | 2004-01-13 | University Of Chicago | Dopa and dopamine modification of metal oxide semiconductors, method for attaching biological molecules to semiconductors |
| US20030165865A1 (en) * | 2001-01-29 | 2003-09-04 | Hinkel Christopher A. | Methods of analysis of nucleic acids |
| US7169610B2 (en) * | 2002-01-25 | 2007-01-30 | Genzyme Corporation | Serum-free media for chondrocytes and methods of use thereof |
| US20040101843A1 (en) * | 2002-11-22 | 2004-05-27 | Gerald Zon | Detection of methylated DNA sites |
| US20050003521A1 (en) * | 2003-03-11 | 2005-01-06 | O'connor David | Addressable microarray device, methods of making, and uses thereof |
| US7413868B2 (en) * | 2003-11-05 | 2008-08-19 | Trellis Bioscience, Inc. | Use of particulate labels in bioanalyte detection methods |
-
2006
- 2006-08-16 EP EP06813631A patent/EP1945809B1/en not_active Not-in-force
- 2006-08-16 WO PCT/US2006/032693 patent/WO2007022530A2/en not_active Ceased
- 2006-08-16 JP JP2008527221A patent/JP2009507472A/ja active Pending
- 2006-08-16 US US11/465,108 patent/US20090136918A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-16 AU AU2006272462A patent/AU2006272462A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-16 KR KR1020087005624A patent/KR20080049733A/ko not_active Withdrawn
- 2006-08-16 BR BRPI0614994-4A patent/BRPI0614994A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-11-16 AU AU2006236031A patent/AU2006236031A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-02-17 IL IL189558A patent/IL189558A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2006236031A1 (en) | 2007-03-08 |
| JP2009507472A (ja) | 2009-02-26 |
| WO2007022530A3 (en) | 2007-10-18 |
| WO2007022530A2 (en) | 2007-02-22 |
| IL189558A0 (en) | 2008-08-07 |
| AU2006272462A1 (en) | 2007-03-08 |
| BRPI0614994A2 (pt) | 2011-05-10 |
| EP1945809B1 (en) | 2012-06-27 |
| US20090136918A1 (en) | 2009-05-28 |
| EP1945809A4 (en) | 2009-10-21 |
| EP1945809A2 (en) | 2008-07-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10538759B2 (en) | Compounds and method for representational selection of nucleic acids from complex mixtures using hybridization | |
| EP3036545B1 (en) | Assays for single molecule detection and use thereof | |
| AU2002311761B2 (en) | Mutation detection using MutS and RecA | |
| AU2016219943A1 (en) | Assays for single molecule detection and use thereof | |
| AU2008216998A1 (en) | Method of detecting aneuploidy | |
| AU2002311761A1 (en) | Mutation detection using MutS and RecA | |
| KR20080049733A (ko) | 미소구체 현탁 혼성화의 정량 및 이의 용도 | |
| Fors et al. | Large-scale SNP scoring from unamplified genomic DNA | |
| US20180073063A1 (en) | Reusable microarray compositions and methods | |
| US20140349879A1 (en) | Method for detecting nucleotide mutation, and detection kit | |
| HK40071484A (en) | Assays for single molecule detection and use thereof | |
| HK1222449B (en) | Assays for single molecule detection and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20080307 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |