KR20080031195A

KR20080031195A - 각결막 질환의 예방 또는 치료제

Info

Publication number: KR20080031195A
Application number: KR1020077029841A
Authority: KR
Inventors: 마사나오 와타나베; 가즈오 쯔보따; 마사키 히라시마; 치카데루 노자키
Original assignee: 교와 가부시키가이샤; 가즈오 쯔보따; 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2005-06-22
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2008-04-08
Also published as: CN101203236A; BRPI0612005A2; US20100113338A1; AU2006260184A1; AU2006260184B2; EP1915998A8; JPWO2006137426A1; RU2008102249A; WO2006137426A1; CA2613247A1; EP1915998A1; EP1915998A4

Abstract

본 발명은 신규한 각결막 질환 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 셀레노프로테인 P를 유효성분으로 하는 각결막 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것으로, 더 상세하게는, 본 발명은 셀레노프로테인 P를 유효성분으로 하는, 드라이아이, 건성 각결막염, 점상표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환의 예방제 또는 치료제, 특히 각결막 상피장해을 동반하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환의 예방제 또는 치료제에 관한 것이다.

Description

각결막 질환의 예방 또는 치료제{PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC AGENT FOR CONRNEAL/CONJUNCTIVAL DISEASE}

본 발명은 셀레노프로테인 P를 유효성분으로 하는 각결막 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것으로, 특히, 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 예방제 또는 치료제에 관한 것이다.

각막은 두께가 약 1mm의 투명하고 혈관이 없는 얇은 조직이지만, 상피층, 보우만막, 실질층, 데스메막, 및 내피세포층으로 이루어지는 매우 규칙 바르고 미세한 구조를 가지고 있다. 이 각막은 안구의 최전면에 위치하여 외계로부터의 빛을 망막에 있는 광수용체로 인도하기 위한 투과성과 굴절력을 가지는 고도로 분화된 조직으로, 시각에 있어서 매우 중요함과 함께 외계와 직접 접촉하고 있기 때문에, 화학적인 침습이나 미생물 등의 생물학적인 침습 등에 대한 배리어로서도 기능하고 있다. 각막의 상피층 상에는 누액층이 있고, 이 누액층은 눈을 항상 젖은 상태로 유지하여 안검과 결막의 유착을 방지하는 동시에, 각막이나 결막의 생리적 상태를 유지시키고 있다. 각막 표피세포는 기저부는 원주상이지만, 표면으로 감에 따라서 편평하게 되어 있고, 기저부에서 분열된 표피세포는 차츰 상부로 이동하여 최후는 탈락하여 누액에 의해 운반되어 없어지게 된다. 각막 내피세포는 세포분열을 하지 않으므로, 탈락하여도 재생되지는 않는다. 드라이아이, 각막궤양, 각막상피박리, 각막염 등의 여러 가지의 각막질환에 의해 발생되는 각결막 장해가, 무엇인가의 이유에 의해, 수복이 지연되거나, 혹은 수복이 이루어지지 않고 천연화(遷延化)하면 각막상피뿐만 아니라, 실질이나 내피의 구조나 기능도 손상되어, 시각이나 배리어 기능에 중대한 영향을 끼치게 된다. 반복성 각막미란, 천연성 각막상피결핍 등의 각결막 상피질환 등은 그러한 질환이다. 각결막 상피장해의 수복 과정은 각결막 상피의 세포의 이동에 의한 상피 결핍부의 피복과 그것에 이어지는 세포의 분열, 분화에 의해 정상의 각결막이 재구축되어 가는 것으로, 각결막 상피의 수복에 관계되는 인자도 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조).

또, 예를 들면 셰그렌증후군, 스티븐스-죤슨 증후군, 마이봄선 기능부전, VDT(Visual Display Terminal)증후군 등의 일련의 질환에 수반되는 드라이아이나 안 수술(백내장 수술, 각막이식, 굴절 교정수술) 후의 드라이아이, 건성 각결막염, 또한 약제성 각막상피장해, 안신경 마비성 각막염, 당뇨병 각막증, 알러지성 결막염 등으로 보여지는 각막상피에 발생하는 미세한 점상의 다발성 상피결핍인 점상 표층 각막증(SPK) 등의 각막장해도, 시각이나 배리어 기능에 중대한 영향을 미친다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조). 게다가, 최근에는 콘택트렌즈 착용자 등에게도 점상 표층 각막증(SPK) 등의 각막상피장해가 발생하고 있는 것이 문제가 되고 있다(예를 들면, 비특허문헌 3 참조).

각막상피 창상의 치료제로서는 피브로넥틴, EGF(Epidermal Growth Factor), 히알우론산 등의 성분이 있다. 그러나, 피브로넥틴은 환자자신의 혈장때문에, 특수 한 정제 키트를 사용하여 정제해야만 하는 혈액제재로서 번거로운 동시에, 환자의 부담도 크기 때문에, 임상상 충분하게는 사용되고는 있지 않다. 또, EGF는 각막 표피세포의 분열 증식작용을 가지지만, 염증을 동반하는 경우나 당뇨병성 각막증에서는 혈관형성이 발생하는 부작용이 문제가 되어 임상상 거의 사용되고는 있지 않다.

히알우론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산을 구성당으로 하는 분자량이 수백만의 글루코사미노글리칸으로, 보수(保水)효과를 가지고 있기 때문에, 드라이아이 환자에 사용되고 있다. 히알우론산은 각막 표피세포의 접착, 이동에도 작용하지만, 표피세포의 증식효과는 약하다. 또, 고농도에서는 점도가 높게 되어 버리는 문제도 있다.

한편, 셀레노프로테인 P는 1977년에 글루타치온퍼옥시데이즈(gultathione peroxidase)와는 다른 셀렌 함유 단백질로 확인되고, 1982년에 셀렌이 셀레노시스테인(selenocystein)의 형태로 함유되어 있는 것이 밝혀졌다. 또한, 1991년에 랫트 셀레노프로테인 P의 cDNA의 클로닝에 의해 전장(全長)의 아미노산배열이 밝혀졌으며, 그 결과, 해당 단백질은 최대 10개의 셀레노시스테인을 포함할 가능성이 제시되었다(예를 들면, 비특허문헌 4 참조). 셀레노프로테인 P의 활성으로서는 뇌를 포함시킨 각 조직으로 미량 필수원소의 셀렌을 운반, 공급하는 셀렌ㆍ트랜스포터의 역할을 하고 있다고 생각된다(예를 들면, 비특허문헌 5 참조). 또, 글루타치온 등의 티올 존재하에 과산화 지방질을 환원, 제거하는 글루타치온퍼옥시데이즈 활성(예를 들면, 비특허문헌 6 참조)이나 peroxynitrite 소거활성(예를 들면, 비특허문헌 7 참조)이 보고되고 있다. 그리고, 최근, 셀레노프로테인 P나 그 단편이 세포사 억제활성(예를 들면, 특허문헌 1 참조)이나 신경세포의 초대배양에서의 생존 촉진인자로서의 작용(예를 들면, 비특허문헌 8 참조), 시냅스형성 촉진작용에 의거하는 신경전달 기능 이상질환 개선작용(예를 들면, 특허문헌 2 참조), 인터류킨6 생산 억제효과로 대표되는 염증질환 개선작용(예를 들면, 특허문헌 3 참조), 운동실조 개선효과에 의거하는 신경변성 질환 개선작용(예를 들면, 특허문헌 4 참조) 등의 작용을 가지고 있는 것도 발견되고 있다.

그러나, 상기의 어느 문헌에도, 셀레노프로테인 P를 상술한 바와 같은 각결막 질환에 적용하는 것은 전혀 기재되고 있지 않으며, 시사도 되어 있지 않다. 또, 본 발명에서 설명하는 바와 같은 셀레노프로테인 P의 안부 질환에 관계되는 듯한 작용을 유추하는 것은 어려우며, 실제로, 그러한 작용을 발견해낸 보고도 없다.

비특허문헌 1: Suzuki K et al. Progress in Retinal and Eye Research., 22, 113-133(2003)

비특허문헌 2: 오하시 유이치 「2. 점상 표층 각막증」마나베레이조, 미키시게루, 오하시 유이치 감수 「각막 클리닉 제2판」p36-43(2003) 의학서원

비특허문헌 3: 하마노 히카루 일본 콘택트렌즈 학회지 37, 1-6(1995)

비특허문헌 4: Hill K.E. and Burk R.F., Biorned. Environ. Sci., 10, p.198-208(1997)

비특허문헌 5: Richardson D.R. Biochem.J. 386, e5-e7(2005)

비특허문헌 6: Saito Y et al. Biol. Chem. 274, 2866-2871(1999)

비특허문헌 7: Arteel G.E. et al. J. Biol. Chem. 379, 1201-1205(1998)

비특허문헌 8: Yan J and Barrentt J.N. J.Neurosci., 18, 8682-8691(1998)

특허문헌 1: 국제공개 WOOO/31131호 팸플릿

특허문헌 2: 일본 공개특허공보 2004-182616

특허문헌 3: 일본 공개특허공보 2004-182683

특허문헌 4: 국제공개 W002/92121호 팸플릿

발명이 해결하려고 하는 과제

상기한 바와 같이, 종래의 각결막 질환치료 조성물에는 아직 만족할 수 있는 것은 알려지고 있지 않고, 더욱 뛰어난 조성물이 소망되고 있었다. 또한 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 각막궤양 등의 안과장해의 예방이나 치료제에 있어서도, 더욱 우수한 조성물이 소망되고 있었다.

본 발명은 신규한 각결막 질환 치료용 조성물을 제공한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 지금까지 각결막 질환에로의 치료효과가 검토되지 않고 있었던 생체유래 성분에 대해서 스크리닝을 실시한 결과, 인간 혈액 중에 존재하는 셀레노프로테인 P에 각결막 장해에 대한 우수한 치유 효과를 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 셀레노프로테인 P를 유효성분으로 하는 각결막 질환의 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 셀레노프로테인 P를 유효성분으로 하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환의 예방 또는 치료제, 바람직하게는 각결막 상피장해를 동반하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환의 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 셀레노프로테인 P를 유효성분으로 하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양의 예방 또는 치료제, 바람직하게는 각결막 상피장해를 동반하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양의 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다.

또, 본 발명은 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환을 예방 또는 치료하는 점안제 또는 안연고, 바람직하게는 각결막 상피장해를 동반하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환을 예방 또는 치료하는 점안제 또는 안연고를 제공하는 것이다. 본 발명은 셀레노프로테인 P 또는 그 단편, 및 안과용 제제에 허용되는 안과용 담체를 함유하여 이루어지는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환을 예방 또는 치료하기 위한 안과용 조성물에 관한 것이다.

또, 본 발명은 각결막 질환의 예방 또는 치료제의 유효성분으로서의 셀레노프로테인 P 또는 그 단편의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 셀레노프로테인 P 또는 그 단편의 각결막 질환의 예방 또는 치료제의 제조를 위한 사용에 관한 것이다.

또, 본 발명은 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환, 바람직하게는 각결막 상피장해를 동반하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등을 앓고 있는 환자 또는 이들 질환을 앓게 될 우려가 있는 환자에게, 유효량의 셀레노프로테인 P 또는 그 단편을 투여하는 것으로 이루어지는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환을 예방 또는 치료하는 점안제 또는 안연고, 바람직하게는 각결막 상피장해를 동반하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등을 예방ㆍ치료하는 방법에 관한 것이다.

발명의 효과

본 발명에 의하면, 각결막 질환, 예를 들면 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환, 특히 각결막 상피장해를 동반하는 이들의 질환의 뛰어난 예방 또는 치료제를 제공할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 사용하는 셀레노프로테인 P는 천연물일 수도, 재조합 단백(예를 들면, 일본 공개특허공보 2004-337090호 참조)일 수도 있고, 인간 셀레노프로테인 P가 바람직하다. 천연의 인간 셀레노프로테인 P는 후술하는 실시예와 같이, 인간 혈장으로부터 정제할 수 있다. 또, 본 발명의 셀레노프로테인 P는 전장의 것일 수도, 그 부분서열로 이루어지는 단편(예를 들면, 국제특허공개 제00/31131호 팸플릿 참조)일 수도 있다.

본 발명에 사용하는 셀레노프로테인 P는 후술하는 실시예에 나타나 있는 바와 같이 랫트 각막상피 장해 모델에 대해서 우수한 치료효과가 인정된다. 따라서 이것들을 함유하는 의약은 각막이나 결막에 있어서의 염증이나 결핍에 따른 질환, 예를 들면 각결막 질환, 더 구체적으로는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 예방 또는 치료제, 특히 각결막 상피장해를 동반하는 이것들의 질환의 예방 또는 치료제로서 유용하다.

본 명세서에 있어서의 「각결막」이라고 하는 것은 각막 및/또는 결막의 의미이고, 「각결막 질환」이라고 하는 것은 각막 및/또는 결막에 있어서의 질환이다. 본 발명에 있어서의 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 질환은 일반적으로는 각결막 질환에 포함되는 질환이지만, 반드시 각결막 질환에 기인하는 것일 필요는 없다. 따라서 본 발명에 있어서의 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등은 각결막 질환에 기인하지 않는 것도 포함하는 것이다.

또, 본 발명에 있어서의 「안과용 제제에 허용되는 안과용 담체」라고 하는 것은 점안제나 안연고 등의 안과용 제제를 제조하기 위해서 허용되고 있는 제제용 담체이다. 안과용 제제의 담체는 눈이라는 특수한 기관에 적용되는 제제를 위한 담체로서, 통상의 의약 조성물에 있어서 사용되는 정제 등의 경구투여용 제제, 첩부제 등의 경피투여용 제제, 또는 주사제 등의 혈관이나 근육 등에로의 투여용 제제를 위한 담체와 구별할 수도 있기 때문에, 본 발명의 안과용 조성물은 통상의 셀레노프로테인 P를 함유하여 이루어지는 의약 조성물과는 구별될 수 있는 것이다.

본 발명의 예방 또는 치료제는 유효성분으로서 셀레노프로테인 P 또는 그 단편 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물로서, 셀레노프로테인 P 또는 그 단편 이외의 유효성분을 함유할 수도 있다.

본 발명의 예방 또는 치료제는 안과용 제제로서 공지된 각종 제형으로 제제화한 것을 사용할 수 있다. 제제는 안과용 제제, 특히 점안용으로 사용하는 것이 바람직하며, 이러한 점안제는 수성 점안제, 비수성 점안제, 현탁성 점안제, 유탁성 점안제, 안연고 등의 어느 것일 수도 있다. 이러한 제제는 투여형태에 적합한 조성물로서 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면 등장화제, 킬레이트제, 안정화제, pH 조절제, 방부제, 항산화제, 용해 보조제, 점조화제 등을 배합하고, 당업자가 공지의 제제방법에 의해 제조할 수 있다.

등장화제로서는 글루코오스, 트레할로스, 락토오스, 프룩토오스, 만니톨, 크실리톨, 소르비톨 등의 당류, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올류, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등의 무기염류 등을 들 수 있고, 그 배합량은 조성물 전량에 대해서 0∼5중량%가 바람직하다.

킬레이트제로서는 에데트산 2나트륨, 에데트산칼슘 2나트륨, 에데트산 3나트륨, 에데트산 4나트륨, 에데트산칼슘 등의 에데트산 염류, 에틸렌디아민 4아세트산염, 니트릴로 3아세트산 또는 그 염, 헥사메타인산소다, 시트르산 등을 들 수 있고, 그 배합량은 조성물 전량에 대해서 0∼0.2중량%가 바람직하다.

안정화제로서는 아황산수소 나트륨 등을 들 수 있고, 그 배합량은 조성물 전량에 대해서 0∼1중량%가 바람직하다.

pH 조절제로서는 염산, 탄산, 아세트산, 시트르산 등의 산을 들 수 있고, 또, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알카리금속 수산화물, 탄산나트륨 등의 알칼리금속 카보네이트 또는 탄산수소염, 아세트산나트륨 등의 알카리금속 초산염, 시트르산나트륨 등의 알카리금속 시트르산염, 트로메타몰 등의 염기 등을 들 수 있고, 그 배합량은 조성물 전량에 대해서 0∼20중량%가 바람직하다.

방부제로서는 솔빈산, 솔빈산칼륨, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸, 파라옥시벤조산프로필, 파라옥시벤조산부틸 등의 파라옥시벤조산에스테르, 글루콘산클로르헥시딘, 염화벤즈알코니움, 염화벤즈에토니움, 염화세틸피리디늄 등의 제4급 암모늄염, 알킬폴리아미노에틸글리신, 클로로부탄올, 폴리쿼드, 폴리헥사메틸렌비구아니드, 클로르헥시딘 등을 들 수 있고, 그 배합량은 조성물 전량에 대해서 0∼0.2중량%가 바람직하다.

항산화제로서는 아황산수소 나트륨, 건조 아황산 나트륨, 피로 아황산 나트륨, 농축 혼합 토코페롤 등을 들 수 있고, 그 배합량은, 조성물 전량에 대해서 0∼0.4중량%가 바람직하다.

용해보조제로서는 벤조산나트륨, 글리세린, D-소르비톨, 포도당, 프로필렌글리콜, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 매크로골, D-만니톨 등을 들 수 있고, 그 배합량은 조성물 전량에 대해서 0∼3중량%가 바람직하다.

점조화제로서는 폴리에틸렌글리콜, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카멜로오스나트륨, 잔탄검, 콘드로이친황산나트륨, 히드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올 등을 들 수 있고, 그 배합량은 조성물 전량에 대해서 0∼70중량%가 바람직하다.

점안제를 조제할 경우, 예를 들면 소망하는 상기 성분을 멸균 정제수, 생리식염수 등의 수성용제, 또는 면실유, 대두유, 참기름, 낙화생유 등의 식물유 등의 비수성 용제에 용해 또는 현탁시키고, 소정의 침투압으로 조정하고, 여과 멸균 등의 멸균처리를 실시하는 것에 의해 수행할 수 있다. 그리고, 안 연고제를 조제하는 경우에는, 상기 각종 성분의 이외에, 연고 기제를 포함할 수 있다. 상기 연고 기제로서는 특별하게 한정되지는 않지만, 바셀린, 유동파라핀, 폴리에틸렌 등의 유성 기제; 오일상과 수상을 계면활성제 등에 의해 유화시킨 유제성 기제; 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜 등으로 이루어지는 수용성 기제 등이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 각결막 질환의 예방 또는 치료제를 투여하는 경우, 그 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상, 투여형태 및 투여횟수 등에 따라 다르지만, 통상은 성인에 대해서, 셀레노프로테인 P로 1일 0.25∼3000㎍, 바람직하게는 2.5∼300㎍을 1회, 또는, 수 차례로 나누어서 투여할 수 있고, 액체 점안제인 경우에는 1회에 1∼수 방울 점안할 수 있다.

도 1은 동물의 양눈을 사용해서 본 발명의 셀레노프로테인 P에 의한 각막상피의 장해방지를 시험한 결과를 나타내는 것으로서, (a)는 대조군, (b)는 셀레노프로테인 P 5㎍/㎖(PBS용액) 투여군, (c)는 셀레노프로테인 P 50㎍/㎖(PBS용액) 투여군, (d)는 정상그룹에 있어서의 각각의 결과를 나타낸다. 도면 중, 종축은 형광 스 코어값을 나타내고, 좌측의 칼럼이 컨트롤의 좌안의 결과를 나타내고, 우측의 칼럼이 약제투여((b) 및 (c))의 우안의 결과를 나타낸다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

셀레노프로테인 P의 조제

혈장으로부터의 셀레노프로테인 P의 정제는 기 보고(Saito Y.et a1., J. Bio1. Chem.,vol.274, p.2866-2871 , (1999))에 준거하여 아래와 같이 실시하였다.

인간 신선 동결 혈장 2리터를 온욕조내에서 완전하게 융해하고, 저온실에 두었다. 이것에 PEG4000의 100g을 소량씩 첨가하면서 교반하고, 전량 첨가후, 추가로 1시간 교반을 계속하였다. 이것을 10,000g에서 20분간 원심하였다. 상청액을 회수하고, AP25(밀리포어사)로 여과하였다. 헤파린세파로스 (아마샴팔마시아바이오테크사) 100㎖을 충전한 칼럼을 미리 20mM 인산완충액(20mM 인산(pH7.4), 0.15M NaC1, 0.2mM EDTA)으로 평형화하고, 이것에 수득된 여과액을 전량 어플라이 하였다. 20배량의 평형화 버퍼로 세정한 후, 염농도를 0.15M에서 0.6M까지의 농도구배를 제작하는 것에 의해서, 흡착 단백질을 그레이디언트 용출하였다. 용출분획은 5㎖ 씩 분취하고, 각 프랙션에 함유되는 셀레노프로테인 P의 양을 ELISA로 확인하고, 셀레노프로테인 P를 함유하는 프랙션을 풀(pool)하였다. 정제공정 중에 있어서의 셀레노프 로테인 P 단편화를 피하기 위해서, DFP(diisopropyl flurophosphate)을 최종농도 5mM이 되도록 첨가하였다.

이어서, 이 분획을 20mM 트리스 완충액(20mM Tris-HCl(pH8))으로 6배로 희석하였다. 이 단계에서 총량이 0.75∼1ℓ가 되었다. 이것을 동일 20mM 트리스 완충액으로 평형화한 40㎖의 Q세파로스(아마샴팔마시아바이오테크사)칼럼에 어플라이하였다. 250∼300㎖의 평형화 버퍼로 세정하고, 염농도 0.25M까지의 그레이디언트로 용출하였다. 그레이디언트에는 250㎖의 완충액을 사용하였다. 수득된 프랙션을 ELISA로 정량하고, 셀레노프로테인 P를 포함하는 프랙션을 풀(pool)하였다. 또, 이 풀분획에도 DFP를 최종농도 5mM이 되도록 첨가하였다.

이어서, 수득된 풀분획에, 최종농도 2mM이 되도록 이미다졸을 첨가하고, 4㎖의 Ni-NTA 아가로스겔(퀴아젠사)칼럼에 어플라이하였다. 이 칼럼은 미리 20mM 트리스 완충액(20mM Tris-HCl(pH8), 2mM 이미다졸, 1M NaCl)로 평형화하였다. 어플라이 종료후, 세정버퍼(20mM Tris-HCl(pH8), 20mM 이미다졸, 1M NaCl) 30㎖로 세정하고, 용출버퍼(20mM Tris-HCl(pH8), 150mM 이미다졸, 1M NaCl)로 용출하였다. 용출분획은 1㎖씩 분취하고, 280nm의 흡광도에서, 흡수의 관찰된 피크를 풀 하였다. 이 분획을 2.5㎖까지, SpeedVac(SARVANT)을 사용해서 원심 농축하였다. 이 농축분획에도 DFP를 최종농도 5mM이 되도록 첨가하였다. 마지막으로, 농축한 셀레노프로테인 P 분획은 인산완충액으로 평형화한 PD-10칼럼(아마샴팔마시아바이오테크사)에 어플라이하고, 탈염, 버퍼치환하였다. 이렇게 해서 수득된 셀레노프로테인 P는 SDS-PAGE에서, 분자량 약 67,000의 이동도를 나타내고, 그 대부분이 전장형(全長型)의 셀레 노프로테인 P로 생각되었다.

실시예 2

각결막 상피장해의 치유효력 시험

후지사와들의 방법(Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 42 , 96-100, 2001)을 참고로, 이하에 나타내는 방법으로 드라이아이에 의한 각결막 상피 장해 모델을 제작하고, 셀레노프로테인 P의 각결막 상피장해에 대한 치유효과를 평가하였다. 이 실험은 각 개체의 양눈을 이용하여, 한쪽 눈을 컨트롤로 하고, 다른 쪽 눈에 약액을 투여하는 것에 의해, 동일 개체에서의 비교가 가능하도록 하였다.

(시험방법)

웅성 SD 랫트(7주령)에 펜토바르비탈을 복강 내로 투여(35mg/kg)하고, 전신 마취 후, 양측의 안와외 눈물샘을 적출하여 드라이아이 모델을 제작하였다.

눈물샘 적출 다음날부터 모든 그룹에, 좌안에는 인산 완충식염수(PBS: phosphate buffered saline)을, 우안에는 PBS(Control그룹), 셀레노프로테인 P 5㎍/㎖(PBS용액), 또는 셀레노프로테인 P 50㎍/㎖(PBS용액)을, 각각 1회 5㎕로 1일 6번, 3주간 연일 점안하였다. 또한 정상그룹으로서 눈물샘 적출을 하지 않은 동물을 준비하고, 동일한 조건으로 양눈에 모두 PBS를 점안하였다(Normal그룹). 그리고, 동물은 각 그룹 전부 6∼7 마리 사용하였다.

3주간의 점안 종료 후, 각막상피의 장해부를 형광색소 플루오레세인으로 염색하였다.

각막상피의 장해 정도는 각막 전체를 상중하 및 좌중우 합쳐서 9개의 부분으로 분할하고, 각 부분별로 하기의 기준으로 장해를 스코어화하여 그 합계값을 산출하였다. 그 후에 각 그룹에 있어서, 좌안의 합계 스코어값과 우안의 합계 스코어값의 비교를 스튜던트-t 검정으로 실시하였다. 또, 공평한 평가를 실시하기 위해서, 점안 개시로부터 각막상피 장해의 스코어화까지, 각 그룹에 투여한 약액의 내용에 블라인드하고, 스코어화 후에 대조하였다.

(각막상피의 플루오레세인 염색 스코어 판단 기준)

0: 염색되지 않음(점상 형광 없음)

1: 약간, 점상 형광이 관찰됨

2: 비교적 많은 점상 형광이 관찰됨　

3: 조밀하게 점상 형광이 관찰됨

(결과)

결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은 각각, (a)는 Control그룹(이하, C그룹), (b)는 셀레노프로테인 P 5㎍/㎖(PBS용액) 투여군(이하, S5그룹), (c)는 셀레노프로테인 P 50㎍ /㎖(PBS용액) 투여군(이하, S50그룹), (d)는 Normal그룹(이하, N그룹)이다. 도면 중, 종축은 형광 스코어값을 나타내고, 좌측의 칼럼이 좌안, 즉 컨트롤의 PBS 점안측을, 우측의 칼럼이 우안, 즉 PBS((a) 및 (d)), 또는 셀레노프로테인 P(도면 중, SeP라고 표기)의 5 또는 50㎍/㎖(PBS용액)(각각 (b), (c))을 점안한 측을 나타낸다. 또, 각 형광 스코어값은 평균값±표준편차로 나타나 있다.

(a)∼(c)의 좌측 칼럼에 있어서, 형광 스코어의 평균값은 7.3∼8.3을 나타내 고 있으며, 눈물샘 적출 후, 3주간의 PBS점안에 의해 각막상피의 장해가 진행하고 있음이 분명하게 되었다. 또, 눈물샘 적출을 실시하지 않은 (d)의 N그룹에 있어서, 3주간의 PBS점안에 의해 형광 스코어의 평균값은 1.5(좌안), 및 2.0(우안)이 되었다.

한편, (a)∼(c)의 우측 칼럼에 보여지는 바와 같이, 형광 스코어의 평균값은 우선 (a)의 C그룹에서는 6.8을 나타내어, 좌안의 스코어와 비교해서 거의 변화가 없었다. 이에 대해서 (b)의 S5그룹에서는 형광 스코어의 평균값은 4.0, (c)의 S50그룹에서는 동일하게 2.4가 되어, 좌안과 비교해서 유의(도 1(b)에서는 P<0.01에서 유의차가 있고, 도 1(c)에서는 P<0.001에서 유의차가 있었다.)하며, 용량의존적으로 각막상피 장해의 진행을 억제하고 있음이 판명되었다. 특히 (c)의 S50그룹에 있어서는 (d)의 N그룹의 수치에 가까운 곳까지, 형광 스코어의 평균값이 내려가 있음을 알 수 있다.

상기의 약리시험의 결과로부터 분명하게 나타나 있는 바와 같이, 셀레노프로테인 P 점안 그룹에서는 플루오레세인 염색에 의해 확인되는 각막상피의 장해의 악화가 용량의존적으로 억제되어, 각막상피 장해의 진행을 억제시켰다. 따라서 셀레노프로테인 P는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양 등의 각결막 질환의 예방 또는 치료제, 특히 각결막 상피장해를 동반하는 이것들의 질환의 예방 또는 치료제로서 유용한 것임을 알 수 있었다.

본 발명은 각결막 질환에 대한 신규한 예방ㆍ치료용 안과제제로서의 의약 조 성물을 제공하는 것으로 산업상 유용한 것이다.

Claims

셀레노프로테인 P를 유효성분으로 하는 각결막 질환의 예방 또는 치료제.
제 1 항에 있어서, 각결막 질환이 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양인 예방 또는 치료제.
셀레노프로테인 P를 유효성분 하는 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양의 예방 또는 치료제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 점안제 또는 안연고인 예방 또는 치료제.
셀레노프로테인 P 및 안과용 제제에 허용되는 안과용 담체를 함유하여 이루어지는 안과용 조성물.
각결막 질환의 예방 또는 치료제를 제조하기 위한 셀레노프로테인 P의 용도.
제 6 항에 있어서, 각결막 질환이 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양인 예방 또는 치료제를 제조하기 위한 용도.
각결막 질환을 앓고 있는 환자 또는 그 우려가 있는 환자에게, 유효량의 셀레노프로테인 P를 투여하는 것으로 이루어지는 각결막 질환을 예방ㆍ치료하는 방법.
제 8 항에 있어서, 각결막 질환이 드라이아이, 건성 각결막염, 점상 표층 각막증, 각막미란, 또는 각막궤양인 방법.