CN117205299A - 一种重组载脂蛋白j在制备治疗眼科疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组载脂蛋白J在制备治疗眼科疾病药物中的应用，所述重组载脂蛋白J包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列中具有两个半胱氨酸且其形成的三级结构具有一对二硫键。本发明通过对重组载脂蛋白J氨基酸序列进行优化，使其能够工业化制备的同时对眼科疾病尤其是干眼症、青光眼和眼角结膜损伤症状具有良好甚至更优的治疗作用。

Description

一种重组载脂蛋白J在制备治疗眼科疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组载脂蛋白J在制备治疗眼科疾病药物中的应用。

背景技术

哺乳动物眼球的表面是直径约1-12mm、厚度约520μm的透明无血管的角膜组织，该组织上的各种生理、生化现象主要是为了维持其透明性而发挥作用，这一点对视功能有重要影响。由于眼球直接暴露于外界，在角膜外侧上会形成由油层、水层和粘蛋白层三层组成的泪液层以防止微生物和异物的侵入，其中粘蛋白层覆盖在疏水性的角膜上皮细胞表面并将其转变成亲水性，这对维持眼球的正常结构起着重要作用。由干眼症、角膜上皮脱落、角膜炎、角膜溃疡等疾病引起的角膜上皮缺损，通常会在几天内迅速自然修复；但若因某种原因而延迟或无法修复则会造成其透明性被破坏形成各种眼科疾病。

其中若泪液供应不足会导致表面泪液层成分的长期改变或不平衡，并触发上皮细胞中的应激途径改变眼表面的稳态，从而导致“干眼综合征(DES)”。DES会引起眼部损伤，头晕头痛并影响睡眠，非常痛苦和虚弱，严重时可导致失明。在所有形式的干眼症中，泪液流动减少和/或蒸发增加导致泪液高渗，引发干眼症病理的恶性循环。高渗诱导炎症级联激活，促进细胞凋亡，并刺激基质金属蛋白酶(MMPs)的表达和活性，导致眼表屏障破坏。

载脂蛋白J(Clusterin)，又称为凝集因子或丛集素，其经mRNA指导前体多肽链合成后，酶解去除分泌信号肽并断裂形成α、β链，两条链反向平行由5个二硫键联接，经过糖基化修饰形成异二聚体硫酸化糖蛋白，包括449个氨基酸，包括糖基，其分子量约75-80kDa。载脂蛋白J是人体中发现的第一个分泌型大分子伴侣，在泪液等体液中广泛存在，是泪液次要蛋白成分中的主要蛋白，对眼表组织有保护作用。在以严重干眼为表现的人类炎症性疾病中，载脂蛋白J在眼表上皮中的表达显著降低；而在干眼小鼠模型中发现，当干燥应激诱导时，眼表上皮载脂蛋白J蛋白和mRNA水平降低了约30％，表明干燥应激下眼表载脂蛋白J表达的下调是由于炎症级联反应的激活引起的。

某些因蛋白质代谢失调导致蛋白质沉积并造成导管堵塞的眼科疾病，例如开角型青光眼和干性眼底黄斑病变，可能会由于平衡蛋白质代谢的载脂蛋白J不足或载脂蛋白J功能失常而加重，通过补充重组载脂蛋白J，就可能改善和治疗这些眼科疾病。

虽然载脂蛋白J在人体内广泛存在，但提取至药用级别的成本极高。即使不考虑纯度等指标能否合格，仅提取单个药用剂量就可能需要几千公升的人血，显然无法实现规模化生产，因而载脂蛋白J的重组、体外表达成为国内外科学界的研究重点。为了确保其具备生物活性，现有的重组载脂蛋白J均可形成5对二硫键，如申请号202010644415.8、201580074616.6公开的多肽序列，在纯化时易发生错配和被还原而形成杂质，复性难度大且最终纯化收率极低；若利用蛋白标签进行分离纯化，最终得到的带有标签的重组蛋白难以符合药规要求而无法成药，这是实现其工业化生产的最大障碍之一。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为解决上述问题，本发明还提供了一种重组载脂蛋白J在制备治疗眼科疾病药物中的应用，所述重组载脂蛋白J包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列中具有两个半胱氨酸且其形成的三级结构具有一对二硫键。

泪液中载脂蛋白J的不足将使得泪液对眼表组织的保护能力下降，眼角结膜上皮细胞易于被破坏，导致眼科疾病的发生；在干眼症等眼科疾病的眼表组织采用滴眼的方式补充本申请所述重组载脂蛋白J，可改善和治疗干眼症等眼科疾病症状并修复眼表组织的损伤。所述重组载脂蛋白J仅保留一对二硫键使分离纯化工艺简单可靠，可重复性强，终产率高；不带有标签，可以纯化达到国家规定的药用纯度。

优选的，所述氨基酸一级序列中至少95％的序列与SEQ ID NO:1一致。优选的，所述氨基酸一级序列为SEQ ID NO:4-28中的任一项。

优选的，所述半胱氨酸位于SEQ ID NO:1的第107位和第263位氨基酸位点上，或者第99位和第273位氨基酸位点上，或者第94位和第280位氨基酸位点上，或者第91位和第283位氨基酸位点上，或者第80位和第291位氨基酸位点上。

优选的，所述SEQ ID NO:1第80位、第91位、第94位、第99位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点为甘氨酸或丙氨酸。

优选的，所述重组载脂蛋白J还包括包括与SEQ ID NO:1的N端相连的信号肽序列，所述信号肽序列中至少95％的序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3一致。优选的，所述信号肽为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。通过对二硫键位置及信号肽序列进行优化，可进一步改善其复性效果且表达量。

优选的，所述药物的剂型为滴眼剂或眼药膏剂。

优选的，所述眼科疾病为角膜障碍或角膜结膜损伤。优选的，所述角膜障碍为干眼症、角膜上皮脱落、角膜炎或角膜溃疡中的任一种。所述眼科疾病为各种类型干眼症、青光眼、眼角结膜损伤、睑板腺功能障碍中的任一种。所述干眼症可以是由泪液分泌减少、眼角结膜被破坏的引起的。优选的，所述眼科疾病为开角型青光眼和干性眼底黄斑病变。优选的，所述角膜障碍是由于泪液中天然载脂蛋白J(Clu)含量不足引起的。优选的，所述眼科疾病为变性蛋白沉积所导致的眼部疾病。

本发明通过对载脂蛋白J的分子结构进行优化，实现符合药规要求且对眼科疾病有治疗作用的重组载脂蛋白J的工业批量化生产。

本发明还提供了一种药物制剂，包括重组载脂蛋白J，所述重组载脂蛋白J包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列中具有两个半胱氨酸以使其空间结构形成一对二硫键。所述药物制剂能够填补目前国内外市场所缺乏的具有消炎作用的人工泪液以及专门针对眼角结膜损伤的药物的空白。

优选的，所述药物制剂为滴眼剂或眼药膏剂，所述滴眼剂为人工泪液或消炎剂。所述滴眼剂为具有消炎作用的人工泪液，所述滴眼剂可作为长期反复使用的消炎剂。

本发明还提供了一种制备高表达的重组载脂蛋白J的方法，包括：步骤1)、表达编码如上所述高表达重组载脂蛋白J的多聚核苷酸分子；步骤2)、从细胞中提取、纯化所表达的多肽。

优选的，步骤2)包括：S21、菌体破碎并分离包涵体；S22、包涵体洗涤、溶解；S23、离子交换层析；S23、稀释复性；S24、超滤浓缩并换液或硫酸铵沉淀并换热；S25、分子筛层析。

本发明提供一种重组载脂蛋白J，包括载脂蛋白J氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列与SEQ ID NO:1至少95％同源且具有两个半胱氨酸以使其形成的三级结构具有一对二硫键。

优选的，所述两个半胱氨酸中的一个位于SEQ ID NO:1的第80位、第91位、第94位、第99位、第107位氨基酸位点中的一个上，所述两个半胱氨酸中的另一个半胱氨酸位于SEQID NO:1的第263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点中的一个上。

优选的，所述SEQ ID NO:1的第80位、第91位、第94位、第99位、第107位、第263位、第273位、第280位、第283位、第291位氨基酸位点中的剩余氨基酸为甘氨酸或丙氨酸。

优选的，所述两个半胱氨酸分别位于SEQ ID NO:1的第107位和第263位氨基酸位点上。优选的，所述SEQ ID NO:1第91位、第94位、第99位、第107位、263位、第273位、第280位、第283位氨基酸位点为甘氨酸或丙氨酸。优选的，所述氨基酸一级序列包括SEQ ID NO:4-28。

优选的，所述氨基酸一级序列还包括与SEQ ID NO:1的N端相连的信号肽序列，所述信号肽序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。优选的，所述信号肽序列为SEQ ID NO:2。

附图说明

图1为本发明实施例2中重组载脂蛋白J在稀释复性前、后的电泳图；

图2为本发明实施例2中经纯化后不同重组载脂蛋白J样品的电泳图；

图3为本发明实施例4中人血清加入不同样品后的SDS-Page电泳图；

图4为本发明实施例5中经不同样品处理后的泪液分泌统计图；

图5为本发明实施例6中不同样品对应的角膜HE染色图；

图6为本发明实施例6中不同样品对应的结膜PAS染色图；

图7为本发明实施例7中不同样品对应的角膜上皮愈合率统计图；

图8为本发明实施例8中不同样品对应的角膜HE染色图；

图9为本发明实施例9中经不同样品处理后Ki67、E-cadherin、PMN、F4/80免疫荧光染色及统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。首先应说明的是，下述实验例中的数据是由发明人通过大量实验获得，限于篇幅，在说明书中只展示其中的一部分，且本领域普通技术人员可以在此数据下理解并实施本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些改动或修改同样落于本申请所保护的范围。

蛋白质的功能与其空间结构密切相关，而五对二硫键通常被认为是维持载脂蛋白J的空间结构所必需的，如申请号202010644415.8、201580074616.6中要求保护的氨基酸序列均还有10个半胱氨酸，其空间结构均形成五对二硫键使其提取、纯化难度极大，在原核表达时复性时易发生错配，而真核表达时二硫键易被还原存在产品一致性问题，尚无法实现工业化生产。目前市场上仅有带标签的高纯度载脂蛋白J，但因不符合药规而无法成药。

发明人意外的发现仅一对二硫键的重组载脂蛋白J(以下简称rClu)同样保留了天然载脂蛋白J的生物活性，同时能分离纯化至高纯度的药用级别(＞95％)并具备工业化生产的高产率(＞10％)特点。如本发明制备的仅存在一对二硫键的rClu在体外实验和动物实验中均表现出明显的功能和疗效，例如可抑制蛋白变性聚集沉淀以及抑制MMP9活性并在动物实验中表现出明显疗效，临床应用价值高。

具体的，将氨基酸序列SEQ ID NO:1中10个半胱氨酸通过点突变后仅保留2个半胱氨酸而成为rClu，对应形成二硫键的数量由5对变成1对，在真核表达时可避免二硫键被还原而形成混合物，而在原核表达时的复性率(＞50％)显著提高，同时降低了二硫键错配率。本申请所述的重组载脂蛋白J-rClu在真核表达时也将形成双亚基结构，但两个亚基之间将由一对链间二硫键联接；而在原核系统表达时形成单亚基，有一对链内二硫键形成环状结构。

实施例1重组载脂蛋白J的表达

根据SEQ ID NO:4-28及SEQ ID NO:2-3进行密码子优化后进行DNA序列合成并以粘性末端插入质粒pET-30a(+)中，将其导入宿主细胞BL21(DE3)中，利用IPTG进行诱导表达，菌体破碎后离心收集包涵体，经洗涤、抽提后跑电泳并进行灰度扫描以对其定量分析，并计算蛋白表达量，结果见表1。相关DNA合成、重组质粒构建及导入宿主细胞并表达均为现有技术，在此不进行赘述。

表1不同序列的表达量结果

序号	序列	蛋白表达量mg/L
			1	SEQ ID NO:24	1176.9
2	SEQ ID NO:2+SEQ ID NO:24	3980.6
			3	SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:24	2854.7
4	SEQ ID NO:4	1151.2
			5	SEQ ID NO:2+SEQ ID NO:4	3865.3
6	SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:4	2783.4
			7	SEQ ID NO:1	1317.6

由上表可知，在SEQ ID NO:4-28的N端添加SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，之后构建的重组质粒的表达量明显提高，且以同时含有SEQ ID NO:24及其N端连接SEQ ID NO:2的重组质粒，最终的蛋白表达量最高；根据其他序列构建的重组质粒导入宿主细胞进行表达时，具有类似结果。

实施例2重组载脂蛋白J的制备

一种重组载脂蛋白J的制备方法，包括:

S1、菌体破碎并分离包涵体

(1)将菌体(SEQ ID NO:2+SEQ ID NO:24)按照1g/10mL的50mM pH 8.0的Tris-HCl溶液充分重悬，低温(如4℃)环境下以8000rpm离心15min，弃上清；(2)再次以1g/10mL加入上述溶液进行重悬操作，之后将菌悬液置于超声破碎仪探头进行破碎操作15min，操作参数为：功率400W，超声3s，间歇6s，在低温(如4℃)环境下以15000rpm离心30min，收集沉淀。

S2、包涵体洗涤、溶解；

(1)向收集的沉淀中以1g/10ml加入洗涤溶液，所述洗涤液为：50mM Tris-HCl，2MNaCl，2mM EDTA，pH 8.0，低温(如4℃)下震荡孵育1h，之后以15000rpm离心30min，再次收集沉淀；(2)按照1g/10ml加入溶解液进行溶解变性40min，所述溶解液为8M尿素+20mM二硫代苏糖醇，之后以15000rpm离心20min，收集上清液。

S3、离子交换层析

采用色谱柱POROS HQ进行上柱层析，用缓冲液A(50mM Gly-NaOH，8M尿素，10mMDDT，pH 9.0)进行洗涤，再用缓冲液B(50mM Gly-NaOH，8M尿素，10mM DDT，1MNaCl，pH9.0)进行洗柱并收集流出液；收集液经脱盐换液后采用色谱柱POROS XS进行上柱层析，用缓冲液C(20mM醋酸钠，8M尿素，10mM DDT，pH 5.5)进行洗涤，再用缓冲液D(20mM醋酸钠，8M尿素，10mM DDT，1M NaCl，pH 5.5)进行洗柱并收集流出液。

S4、稀释复性；

取步骤S3获取的收集液，加入15倍(V/V)的稀释缓冲液后，在4℃下孵育24小时。所述稀释缓冲液为1％CHAPS+500mM NaCl+500mMArg+0.5％山梨醇+0.01mM GSSH+50mM Tris-HCl pH 9.0，或者为500mMArg+0.5％山梨醇+0.00001mM CuCl₂+20mM PB pH 7.4，或者为1％CHAPS+500mM NaCl+0.0001mM CuCl₂+20mM PB pH7.4。

原核表达蛋白复性后形成聚合体与单体，复性率用蛋白质电泳灰度扫描单体进行初步评判，再由第三方的二硫键定位分析和自由巯基分析结果来最终确定复性率。如图1所示，具有五对二硫键的rClu-即样品rAJ-1通过稀释复性的复性率约为8％，带有二对二硫键的rClu-即样品rAJ-3通过稀释复性的复性率约为10％，本申请制备rAJ-6-1样品通过稀释复性的复性率≥50％，复性率显著提高；具有两对以上二硫键的rClu通过稀释复性易发生错配，生物活性极低；若采用G25柱上复性，其收率更低。需要说明的是：其中还原处理就是加入大量巯基乙醇使蛋白样品二硫键完全打开，非还原处理则是不加巯基乙醇。

S24、换液后分子筛层析；

步骤S4得到的复性后溶液经过硫酸铵沉淀或超滤浓缩后置换为磷酸盐缓冲体系(pH7.4)并进行分子筛柱层析，分子筛凝胶填料采用GE Superdex S200，或博格隆Chromda200PG，得到样品rAJ-6-1。

经分析，样品rAJ-6-1的纯度＞95％，纯化总得率为10.2％；样品rAJ-6-2(SEQ IDNO:25)、AJ-6-3(SEQ ID NO:26)经上述步骤纯化后具有相类似的结果。需要说明的是：通过密码子优化得到含有两对二硫键的rClu-即rAJ-3以及含五对二硫键的的rClu(如SEQ IDNO:1)--即rAJ-1在表达后通过上述方法纯化最终样品的收率分别为0.55％、0.25％，纯度分别为61.6％、62.4％远低于本申请且为混合物，无法成药，电泳结果见图2。

真核表达蛋白无需进行复性，可直接由重组载脂蛋白J宿主细胞(例如CHO)培养液提纯，经由上述离子交换和分子筛柱层析纯化，得到分子量不均一的真核表达载脂蛋白J混合物。

实施例3二硫键位置对复性结果的影响

分别以SEQ ID NO:8、12、16、20、24构建重组质粒，表达后按照实施例2的方法进行稀释复性，结果见表2。

表2二硫键位置对复性率的影响

通常蛋白的空间结构能够影响其生物活性及免疫原性，而在上述位点形成的五对二硫键是天然rClu维持蛋白质空间结构发挥其生物活性所必需的；而本申请首次发现，通过将氨基酸序列中十个半胱氨酸中的八个突变成甘氨酸后，形成具有一对二硫键的rClu仍能够具有良好的生物活性；同时二硫键的位置能够显著影响稀释复性的复性率，当半胱氨酸在第107位、第263位时-即SEQ ID NO:24的rClu复性率最高，效果最好。

实施例4体外活性实验

人体内炎症反应可导致MMP9分泌量上升，对局部组织结构会产生破坏作用；MMP9也是角膜表面主要的基质降解酶之一，在眼表疾病如干眼症患者的泪液中观察到MMP-9的密度和活性增加，在小鼠和人类中被认为是干燥应激导致眼表屏障破坏的原因介质。而载脂蛋白J是MMP9的天然抑制剂，可抑制MMP9酶活性，因而载脂蛋白J是人体内应对炎症反应的天然措施之一。

采用酶谱法(Zymography)利用MMP9测试试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司)来测定MMP9酶活性来反映rClu的抑制作用，以人血清为对照，将加入rAJ-6-3、rAJ-1的人血清在含有明胶的SDS-Page凝胶中电泳，之后将凝胶与酶反应缓冲体系孵育，激活MMP9降解电泳胶上的明胶，再进行凝胶染色和脱色。有MMP9活性的条带由于明胶被降解而形成透亮区域，而分布于其它位置没有被降解的明胶形成深色背景，从而可对透亮条带进行扫描而换算出MMP9酶活性，结果见表3、图3。

具体实验方法同《优化明胶酶谱法检测自发性高血压大鼠血浆MMP-2和MMP-9活性》，李炳蔚等，2013，基础医学与临床，845-848页。

表3不同样品对MMP-9灰度峰面积的影响

由上表可知，本发明制备的样品rAJ-6-3对MMP9酶活性的抑制作用至少与样品rAJ-1相当，生物活性好甚至更优。

实施例5体内活性实验一-东莨菪碱诱发干眼症

选取6周龄雌性C57/BL6Shijh小鼠连续5天接受低湿环境联合皮下注射东莨菪碱(2次/天，0.75mg/mL，0.3mL/只/次)诱导进行干眼造模以模拟；泪液分泌减少形成的干眼症，首次造模当天记为D₁。依据双眼角膜荧光素钠染色评分均值选取25只并随机分为五组-即模型组、给药一组、给药二组、给药三组、给药四组，分别使用PB缓冲液、rAJ-6-1样品(20μg/ml)、rAJ-1样品(20μg/ml)、环孢霉素滴眼液(II)-沈阳兴齐眼药股份有限公司、玻璃酸钠滴眼液(参天制药(中国)有限公司)点眼治疗，每天4次，每次每眼1-2μL，所有动物在治疗同时继续接受造模处理，方法如前所述。

在治疗前(0d)与给药治疗后的第5d、10d、15d分别对各组小鼠用2ul 0.5％荧光素钠溶液滴眼后，并在眨眼后用生理盐水冲洗掉，通过裂隙灯拍照观察角膜荧光素钠的染色情况，每组取六只动物眼进行染色并求平均值，结果见表4。所述rClu样品利用PB缓冲液稀释rAJ-6-1、rAJ-1进行制备，相关实验及检测方法为现有技术，在此不进行赘述。

表5不同样品对荧光素钠染色评分的影响

载脂蛋白J是人泪液中的蛋白成分之一，对眼表组织有保护作用。当泪液分泌减少时，难以承担原有的保护作用而导致干眼症的发生。由上表可知，本发明制备的含1对二硫键的重组rClu(rAJ-6-1)可作为滴眼液补充眼表组织的天然载脂蛋白J，荧光染色评分下降幅度大于含5对二硫键的rAJ-1，并与市售环孢霉素滴眼液相当，对东莨菪碱联合低湿环境诱导的小鼠角膜荧光素钠染色评分升高的均表现出一定的抑制作用，能够改善和治疗泪液分泌减少引起的干眼症。

实施例6-体内活性实验二-苯扎氯氨诱发干眼症

取6周龄雌性C57/BL6小鼠20只作为受试小鼠，在IVC系统中适应环境3天，0.075％苯扎氯铵(in1％PBS)局部点眼，5uL/眼，每天2次，连续7天以模拟眼角结膜损伤引起的干眼症；持续造模第7天结束后，对所有受试小鼠进行裂隙灯拍照和荧光染色评估，筛选造模成功小鼠15只进入后期实验。

将造模成功的15只小鼠随机分成三组，于第8天开始给药，其中组1、组2、组3分别使用PB缓冲液、玻璃酸钠滴眼液、rAJ-6-1样品(60μg/ml，通过PB缓冲液稀释制备)。每天9：00，17：00继续点用0.075％BAC，每天9：30，12：30，15：30，18：30每只眼睛滴入供试品共4次，每次每只眼睛滴入供试品2微升，持续给药7天，至第14天结束后停止给药。

分别在第1天未造模之前、第7天、第14天结束后同一时间段采用酚红棉线法测试所有受试小鼠水性泪液分泌，结果见图4；实验第14天眼表检测结束后对实验小鼠实施安乐死，随即解剖取下右眼全眼并制备石蜡切片并进行HE染色、PAS染色，结果见图5、图6，所述HE染色为现有技术。

由图4可知，与造模前相比，苯扎氯铵点眼7天后小鼠泪液分泌均明显下降，表明苯扎氯铵点眼可以显著降低泪液分泌，验证了苯扎氯铵点眼诱导小鼠干眼模型构建成功。在点眼治疗7天后，组2和组3小鼠的泪液分泌量与用药之前相比较均有明显增加，且比组1显著增多，表明本发明制备的rAJ-6-1样品及玻璃酸钠滴眼液可以促进小鼠泪液分泌增多，但磷酸盐缓冲液则不会改变小鼠泪液分泌情况。

由图5可知，组1、2中角膜上皮厚度变薄，上皮细胞层数为2-3层，但组3中角膜上皮的层数仍然保持5-6层且厚度明显高于组1、组2，表明本发明制备的重组载脂蛋白J通过与泪膜粘蛋白结合，对粘蛋白层进行修补以显著可以促进损伤的小鼠角膜上皮恢复以治疗由此引发的干眼症。

结膜杯状细胞主要分泌黏蛋白MUC5Ac等，成为眼表泪膜的重要组成成分，使眼睑与眼球间保持一定润滑程度，减少眼睑结膜与眼球表面之间活动的摩擦力，维持结膜和角膜上皮湿润的微环境。由图6可知，与对照组相比，造模7天(D7)的杯状细胞数明显减少，在治疗7天(D14)后，组1、2、的杯状细胞数较对照组也有所下调，但与造模7天的杯状细胞数相比差异不大；组3的杯状细胞数与对照组相比差异没有统计学意义，但与造模7天(D7)相比明显增多；而在治疗第7天(D14)，组2、3与组1相比杯状细胞数有所增加，其中以组3增加最为明显，这些结果表明本发明制备的重组载脂蛋白J可显著的促进结膜杯状细胞生成。

实施例7角膜上皮损伤修复实验

7.1实验方法

受试小鼠共25只，造模前一天先进行荧光染色，裂隙灯观察，挑选20只角膜正常且荧光染色阴性小鼠，随机分成B1、B2、B3、B4、B5五组；将小鼠麻醉，小鼠侧卧位，暴露眼球。用碘伏在眼周消毒。托比卡胺滴眼液滴眼，进行散瞳。0.5％盐酸丙美卡因滴眼液点眼进行表面麻醉。在手术显微镜下用2.5mm环钻标记中央角膜，用角膜上皮刮刀刮除标记内的角膜上皮，避免损伤角膜基质层，进行造模。

造模后小鼠给药两天，每天每只眼睛滴入供试品4次，每天上午9点、12点、下午3点、6点给药，B1、B2、B3、B4、B5五组每次每只眼睛分别滴入供试品rAJ-1、rAJ-6-1、rAJ-3、玻璃酸钠滴眼液、PB缓冲液各2μl，各组rAJ浓度均为45μg/ml。

7.2检测与结果

7.2.1荧光素钠染色

分别在刮除后0h、12h、24h、36h用2μl 0.1％荧光素钠溶液滴眼后，并在眨眼后用生理盐水冲洗掉；通过裂隙灯拍照观察角膜荧光素钠的染色情况，采用ImageJ软件根据荧光素染色图像对伤口表面积进行定量测定，上皮创面愈合率计算为不同时间点创面闭合百分比，结果见图7。

由图7可知，与0h组相比，经过不同药物滴眼治疗12h后，五组小鼠角膜上皮创口愈合率分别为22.88％、30.17％、25.91％、26.68％、18.34％，B1-B4组小鼠角膜上皮创口愈合率无显著差异(P>0.05)，其中B2组小鼠角膜上皮创口愈合率最高，而B5组小鼠角膜上皮创口愈合率最低；治疗24h后，五组小鼠角膜上皮创口愈合率分别为81.26％、87.91％、81.89％、83.53％、69.47％，其中B5组小鼠角膜上皮创口愈合率最低，与其他组小鼠相比具有显著差异(P<0.05)；治疗36h后，五组小鼠角膜上皮创口基本完全愈合，B1-B4组小鼠角膜表面光滑，而B5组小鼠存在角膜表面粗糙，荧光素钠染色阳性的情况。上述结果表明，经治疗后，B1-B4供试品对角膜上皮损伤小鼠起到一定的修复作用，其中B2供试品治疗效果最佳。

7.2.2HE染色及免疫荧光染色

在实验第4天眼表检测结束后对小鼠实施安乐死，随即取下每组小鼠左右眼全眼球及附属组织制备冰冻切片并分别进行HE染色和免疫荧光染色，结果见图8、图9。

所述免疫荧光染色方法为：1)玻片从-80℃冰箱中取出晾干，置于冷丙酮中固定10min；2)用1×PBS冲洗三遍，每次5min；3)将0.2％TritonX-100滴加至玻片组织上，透膜20min；4)用1×PBS冲洗三遍，每次5min；5)将2％BSA滴加在玻片组织上，室温下封闭1h；6)用1％BSA稀释相应的一抗(Ki67、E-cadherin、PMN、F4/80)，待封闭结束后，滴加一抗，置于湿盒中4℃孵育过夜；7)用1×PBS冲洗三遍，每次10min；8)用1％BSA稀释相应的二抗，滴加二抗，置于湿盒中室温下避光孵育1h；9)用1×PBS冲洗三遍，每次10min；10)用DAPI复染封片。

由图8可知，与对照组相比，B2组小鼠角膜上皮完整，厚度与对照组相似，基质纤维排列整齐，无炎症细胞浸润情况；B1、B3、B4组小鼠上皮厚度相似，与对照组相比厚度变薄，B1、B3组小鼠角膜基质中存在少量炎症细胞浸润情况，而B4组小鼠角膜基质中存在大量炎症细胞浸润；B5组小鼠角膜上皮仅为单层结构，角膜上皮未完全愈合，角膜基质中存在炎症细胞浸润。

由图9可知，在滴眼治疗后，五组小鼠角膜上皮均出现了不同程度的Ki67、E-cadherin阳性表达，B4、B5组小某种蛋白类药物用于治疗小鼠角膜上皮损伤修复的初步研究鼠角膜上皮Ki67阳性细胞数量最少，与对照组相比E-cadherin表达下降；B1、B3组小鼠角膜上皮E-cadherin表达相似，与对照组相比有所下降，Ki67阳性细胞数量有所增加，但与对照组相比无显著性差异；B2组小鼠角膜上皮Ki67阳性细胞数量与对照组相比显著增加(P<0.005)，且与对照组相比E-cadherin表达一致。上述结果表明，B1、B2、B3供试品有促进小鼠角膜上皮细胞增殖的作用，且药物效果为B2>B1≈B3。

在滴眼治疗后，五组小鼠角膜基质中出现了不同程度的PMN、F4/80阳性表达，与对照组相比，五组小鼠角膜基质中PMN、F4/80阳性细胞数量均有所增加，其中B1、B3组小鼠角膜基质中存在少量PMN、F4/80阳性细胞；B2组小鼠角膜基质中PMN、F4/80阳性细胞数量最少且与对照组相比无显著性差异(P>0.05)；B4、B5组小鼠角膜基质中则存在大量的PMN、F4/80阳性细胞，说明B1、B2、B3供试品对角膜上皮损伤小鼠品具有促进角膜上皮细胞增殖、细胞间粘附及抑制炎症作用，药物效果为B2>B1≈B3。综上，本发明制备的重组载脂蛋白J可作为滴眼液补充眼表组织的天然载脂蛋白J，同时通过眼角结膜上皮细胞表面受体调节细胞凋亡和/或细胞增殖信号通路，促进眼角结膜上皮细胞增殖，并抑制炎症反应，进而改善和治疗白内障手术等机械损伤导致的眼角结膜被破坏的情况。

实施例8STZ诱导的糖尿病大鼠干眼症

取约7～9周龄的雄性SD大鼠(体重为240～320g/只)于国科赛赋(深圳)新药研发科技有限公司SPF动物房适应环境3天，饲养环境条件标准参照中华人民共和国国标GB14925-2010。

选择健康的大鼠禁食不禁水16小时，消毒注射部位皮肤，按60mg/kg体重单次快速腹腔注射STZ溶液。STZ造模后，予以5％葡萄糖饮水一晚，STZ给药1周后开始尾尖取血测定血糖，每周1次，凡连续两次随机血糖高于16.7mmol/L，且出现多饮、多食、多尿和消瘦症状的大鼠确定为糖尿病模型。

随时间推移部分糖尿病SD大鼠模型会并发糖尿病干眼并发症；造模4周后，测定体重、血糖值、泪液分泌量，以泪液分泌量、泪膜破裂时间与造模前比较明显缩短，表明模型成功。将模型小鼠分成3组-即实验1组、2组、3组，每组5只，其中实验1组、2组、3组分别以0.1mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸(pH＝4.5)缓冲液、市售玻璃酸钠滴眼液、rAJ-6-1为治疗药物滴眼(浓度为60μg/ml)，各组分别滴眼5μL/眼/只，每天09:00、12:00、15:00、18:00滴眼四次，连续给药14天，同时以正常动物作为对照组。在开始给药的第0天、7天测血糖、泪膜破裂时间、角膜上皮损失程度指数检测，结果见表6。

其中柠檬酸盐缓冲液：精密称定柠檬酸2.1g加入超纯水100mL配成A液；精密称定柠檬酸钠2.94g加入超纯水100mL配成B液，将A、B液按1:1.32(V:V)混合，配制成0.1mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH＝4.5)；STZ溶液：精密称定STZ粉剂0.2g装于干燥无菌离心管中并严格避光，溶于预冷的柠檬酸钠-柠檬酸盐缓冲液中，配制成11mg/ml的溶液，经0.22μm的微孔滤膜滤过除菌，要求5min内配制完成，配好后插冰上，10min内用完。STZ和柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液低温保存，现配现用。

其中泪膜破裂时间检测方法为：大鼠采用3～4％异氟烷浓度诱导麻醉，1～2％异氟烷浓度维持麻醉，气体流量：0.6L/min。泪液分泌量检测后用移液器吸取0.1％荧光素钠溶液10μL，滴入结膜囊内，手动瞬目3次，扒开睑裂，裂隙灯显微镜钴蓝光下观察。秒表计时，记录最后一次瞬目到角膜第1个黑斑出现的时间，重复3次，取平均值。未出现黑斑时间按60s计算。

角膜上皮损失程度指数检测方法为：大鼠采用3～4％异氟烷浓度诱导麻醉，1～2％异氟烷浓度维持麻醉，气体流量：0.6L/min。用移液器吸取1％荧光素钠溶液2μL，滴入结膜囊内，手动瞬目1min，用纯水冲洗结膜囊5次，每次1mL，吸去结膜囊内多余染料，并置于荧光体视镜下拍照，利用荧光强度分析软件(Image-Pro Plus 6.0)对拍摄图片进行荧光强度分析。

表6各组小鼠的体重、血糖数值统计

表7各组大鼠的泪膜破裂时间、荧光素染色结果统计

造模第一天记为M1，实验第一天记为D1。

由表6-7可知，本发明所述重组载脂蛋白J对糖尿病本身没有治疗作用，但对糖尿病引起的并发症-干眼症有明显的治疗作用。

实施例9对青光眼治疗作用

取约7～9周龄的雄性SD大鼠(体重为240～320g/只)于国科赛赋(深圳)新药研发科技有限公司SPF动物房适应环境3天，饲养环境条件标准参照中华人民共和国国标GB14925-2010。

取雄性SD大鼠55只，检疫合格后，取50只大鼠，使用异氟烷进行全身麻醉，给予实验眼(右眼)盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，撑开眼睑，沿上方角巩膜缘剪开球结膜，钝性分离筋膜，暴露巩膜上静脉，烙闭大鼠上直肌旁两条巩膜上静脉及颞侧一条巩膜上静脉。烙闭成功的标志：近角巩膜缘段血管怒张，远角巩膜缘段血流消失，无出血。手术后，以10-0不可吸收缝合线间断缝合结膜，缝合后给予左氧氟沙星滴眼液，待大鼠苏醒后放回笼内，术后左氧氟沙星滴眼液点眼，2次/天，连续用药一周。

造模后第3天，根据眼内压和体重，选取相对均匀的25只动物，随机分为实验1组、实验2组、实验3组，每组5只；分组后分别以0.1mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸(pH＝4.5)缓冲液、市售玻璃酸钠滴眼液、(浓度为60μg/ml)rAJ-6-1为治疗药物以5μL/次进行右眼滴眼，每天09:00、12:00、15:00、18:00滴眼四次，连续给药4周。造模前、造模后30min、分组前、给药后每周1次在大鼠清醒状态下，用回弹式眼压计测量眼压，测量3次取平均值，结果见表8。

表8不同组别的眼压数据统计

由表8可知，本发明所述重组载脂蛋白J对青光眼有显著的治疗作用。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (9)

1.一种重组载脂蛋白J在制备治疗眼科疾病药物中的应用，其特征在于，所述重组载脂蛋白J包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列中具有两个半胱氨酸且其形成的三级结构具有一对二硫键。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨基酸一级序列中至少95％的序列与SEQ ID NO:1一致。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述半胱氨酸位于SEQ ID NO:1的第107位和第263位氨基酸位点上，或者第99位和第273位氨基酸位点上，或者第94位和第280位氨基酸位点上，或者第91位和第283位氨基酸位点上，或者第80位和第291位氨基酸位点上。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组载脂蛋白J还包括包括与SEQ IDNO:1的N端相连的信号肽序列，所述信号肽序列中至少95％的序列与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3一致。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为滴眼剂或眼药膏剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述眼科疾病为干眼症、青光眼、眼角结膜损伤、睑板腺功能障碍中的任一种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述眼科疾病为开角型青光眼和干性眼底黄斑病变。

8.一种药物制剂，其特征在于，包括重组载脂蛋白J，所述重组载脂蛋白J包括编码载脂蛋白J的氨基酸一级序列，所述氨基酸一级序列中具有两个半胱氨酸以使其空间结构形成一对二硫键。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为滴眼剂或眼药膏剂，所述滴眼剂为人工泪液或消炎剂。