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KR20070120607A - Ｈｉｖ 백신 - Google Patents

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KR20070120607A
KR20070120607A KR1020077026343A KR20077026343A KR20070120607A KR 20070120607 A KR20070120607 A KR 20070120607A KR 1020077026343 A KR1020077026343 A KR 1020077026343A KR 20077026343 A KR20077026343 A KR 20077026343A KR 20070120607 A KR20070120607 A KR 20070120607A
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hiv
recombinant
vaccine
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칠-용 강
얀 리
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더 유니버시티 오브 웨스턴 온타리오
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Abstract

본 발명은 비병원성이고 비세포용해성인 재조합 HIV를 포함하는 신규한 HIV 백신에 관한 것이다.

Description

ＨＩＶ 백신 {HIV VACCINE}
1. 관련 출원
본 출원은 1998년 8월 12일에 출원된 미국 가출원 제 60/096,235호의 출원일을 향유하는, 1999년 8월 12일에 출원된 국제 출원 제 PCT/CA99/00746호의 출원일을 향유하는, 2001년 4월 2일에 출원된 계류중인 미국 출원 일련 번호 제 09/762,294호의 일부 계속 출원인, 2005년 4월 15일에 출원된 미국 출원 일련 번호 제 11/107,364호를 우선권으로 주장한다.
2. 발명의 분야
본 발명은 AIDS의 예방 및/또는 치료에 사용되는 신규한 백신 뿐만 아니라 이의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 비세포용해성이고 비병원성인 HIV/AIDS 백신의 제형화를 위해 AIDS 바이러스를 대량으로 생성시키는 것에 관한 것이다.
3. 발명의 배경
항바이러스 요법의 최근 진보에도 불구하고, AIDS 또는 HIV 감염에 대한 영구 치료제는 존재하지 않는다. 약물 요법은 효과적인 요법을 제공한다는 점에서 유망한 연구 분야이지만, 부작용, 순응성 및 비용으로 인해 진척속도가 빠르지 않 았다. 상기 어려움을 가중시키는 것은 대다수의 신규 HIV 감염이 일어나는 것으로 추정되는 개발도상국에서 이러한 약물의 이용가능성이 제한적이라는 사실이다.
전염병에 대한 백신, 가장 주목할 만하게는 천연두 및 소아마비에 대한 백신이 거두어 온 성공으로 인하여, AIDS에 대한 효과적인 백신의 탐색이 계속되고 있다. 다양한 방법이 시도되었다. 실제로, 대부분의 HIV-1 백신 개발은 서브유닛(subunit) 백신에 집중되어 왔다. 서브유닛 백신 방법과 관련된 난점은 최적 면역성을 생성시키는 능력이었다. 현재, HIV 항원(들) 및 면역계의 어느 성분들이 자연 감염으로부터의 보호를 위해 필요한 지 정확하게 알려져 있지 않다.
일반적으로 백신을 개발하기 위한 바람직한 경로는 비활성화되거나 약독된 전(whole) 바이러스, 예를 들어 비활성화된 소아마비 바이러스 백신, 또는 약독된 생 바이러스 백신, 예를 들어 경구용 소아마비 백신을 사용하는 것이다. 불운하게도, 이러한 방법은 소아마비 백신의 부적절한 비활성화가 임상 소아마비의 백신 매개된 전파를 초래한다는 "커터 사건 (Cutter incident)"에 의해 밝혀진 바와 같이 문제가 있을 수 있다.
초기 백신 실험은 재조합 서브유닛 단백질 기재 면역원, 예를 들어 HIV-1 외피(envelope) 당단백질 120 (gp10)을 주시하였다. 이러한 방법으로부터의 대부분의 결과는 실망스러웠지만, 생 재조합 바이러스 및 서브유닛 단백질 둘 모두를 사용하는 면역화 방법은 일부 개체에서 외피 특이적 CD8+ CTL 및 HIV-1 외피에 대한 중화 항체 둘 모두를 유도해내었다 (Cooney, E. L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 1882-86 (1993); McElrath, M. J. et al. J. Infect. Dis. 169 : 41-47 (1994); Graham, B. S. et al. J. Infect. Dis. 166 : 244-52 (1992); 및 Graham, B.S. et al. J. Infect. Dis. 167 : 533-37 (1993)).
흥미롭게도, NSS (천연 신호 서열)로서 일컬어지는 HIV-1 gp120의 신호 서열이 gp120의 분비 정도와 관련된 것으로 밝혀졌다. NSS를 꿀벌 멜리틴(mellitin) 또는 뮤린(murine) 인터류킨-3 (IL-3) 신호 서열로 치환하면 gp120의 고수준 생성 및 효율적 분비가 이루어지는 것으로 밝혀졌다 (Li, Y. et al. Virology 204 : 266-278 (1994); 및 Li, Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93 : 9606-9611 (1996)). 그러나, HIV-1 gp120의 신호 서열이 바이러스의 병원성에서 어떤 역할을 하는 지의 여부는 알려져 있지 않다.
HIV 백신과 관련하여, HIV nef 유전자의 결실이 바이러스를 약독시키는 것으로 밝혀졌다. 데스로시어즈(Desrosiers)와 그의 동료들은 붉은털 원숭이 (Rhesus macaque)가 nef 결실된 SIV로 백신접종되면 야생형 SIV 공격을 방어함을 입증하였고 (Daniels, M. D. et al. Science 258 : 1938 (1992); Desrosiers, R. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 6353 (1989)), 다른 연구자들은 nef 유전자가 SIV 및 HIV 복제에서 중요치 않은 것임을 입증하였다 (Daniels, M. D. et al. Science 258 : 1938 (1992); Gibbs, J. S., et al. AIDS Res. and Human Retroviruses 10 : 343 (1994); Igarashi, T. et al. J. Gen. Virol.78 : 985 (1997); Kestler III, H. W. et al. Cell 65 : 651 (1991)). 또한, nef 유전자의 결실은 정상적으로 감수성인 숙주에서 바이러스가 비병원성이 되게 하는 것으로 밝혀졌다 (Daniels, M. D. et al. Science 258 : 1938 (1992)). 그러나, 이러한 결 실은 대량으로 생성될 수 있는 바이러스의 형태를 제공하는 것으로 밝혀져 있지 않다.
결과적으로, 비병원성이고 대량으로 생성될 수 있는 백신이 필요하다.
4. 발명의 개요
본 발명의 한 가지 일면은 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1) 외피 당단백질 120 (gp120)의 신호 서열이 SEQ ID NO 3, 4, 5 또는 6으로 제시된 폴리펩티드 서열, 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체인 재조합 HIV-1에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 상기 기능적 단편 또는 변이체는 1개 이하의 양하전된 아미노산을 함유한다. 다른 구체예에서, 신호 서열은 양하전된 아미노산을 함유하지 않는다. 다른 구체예에서, 바이러스는 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성이 된다.
본 발명의 또 다른 일면은 재조합 인간 면역결핍 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 백신은 애쥬번트를 추가로 포함한다. 또한, 본 발명은 렌티바이러스 감염의 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 유효량의 상기 언급된 백신 중의 어느 하나를 투여하는 것을 포함하여 상기 환자에서 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 특징 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
5. 도면의 간단한 설명
도 1은 야생형 및 재조합 바큘로바이러스 감염된 에스. 프루기페르다 (S. frugiperda) 곤충 세포 (SF21)를 위상차 현미경 검사한 사진을 도시한다. 패널 A는 야생형 오토그래피카 캘리포르니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 (Autographica californica Nuclear Polyhedrosis) 바이러스 (AcNPV)로 감염된 세포를 도시하는데, 여기서 무손상 세포가 관찰되고; 패널 B는 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1) 외피 당단백질 120을 이의 천연 신호 서열과 함께 발현하는 재조합 AcNPV로 감염된 세포 (vAc-gp120-NS)를 도시하는데, 여기서 세포 용해가 관찰되고; 패널 C는 HIV-1 외피 gp120을 이의 천연 신호 서열없이 발현하는 재조합 AcNPV로 감염된 세포 (vAc-gp120-ΔS)를 도시하는데, 여기서 무손상 세포가 관찰되고; 패널 D는 천연 신호 서열이 멜리틴 신호 서열로 치환된 HIV-1 외피 gp120을 발현하는 재조합 AcNPV로 감염된 세포 (vAc-gp120-MS)를 도시하는데 ,여기서 무손상 세포가 관찰되고; 패널 E는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G를 발현하는 재조합 AcNPV로 감염된 세포 (vAc-VSV-G)를 도시하는데, 여기서 무손상 세포가 관찰되고; 패널 F는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G (VSV-G)를 HIV-1 당단백질 120의 천연 신호 서열과 함께 발현하는 재조합 AcNPV로 감염된 세포 (vAcVSV-G-NS)를 도시하는데, 여기서 세포 용해가 관찰된다.
도 2는 세포 사멸에 대한 HIV-1 외피 당단백질 120 (gp120) 신호 서열의 효과를 나타내는 그래프를 도시한다. 도 2A는 재조합 당단백질 (rgp120) 또는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G (VSV-G) 단백질을 상이한 신호 서열과 함께 발현한 후의 트립판 블루에 의해 침투된 세포 (사멸 세포)의 비율을 도시한다. 도 2B는 락테이트 탈수소효소 (LDH) 방출 검정 (Boehringer Mannheim's Cytotoxicity Detection Kit)의 결과를 도시한다. rgp120 또는 VSV-G를 상이한 신호 서열과 함께 발현하는 재조합 바이러스로 감염된 SF21 세포로부터 방출된 LDH의 양은 490nm에서 판독되는 ELISA 플레이트 내에 형성된 포르마잔(formazan) 염료를 정량함으로써 측정되었다.
도 3은 HIV-1 외피 당단백질 120을 상이한 신호 서열과 함께 발현하는 오토그래피카 캘리포르니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)로 감염된 에스. 프루기페르다 곤충 세포 (SF21)의 DNA 단편화 분석을 제공하는 아가로오스 겔 전기영동 결과를 도시한다. 전체 세포 DNA (A) 또는 저분자량 DNA (B)를 감염후 48시간째에 추출하고, 에티듐 브로마이드의 존재하에서 1.2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다: 레인 M: DNA 마커; 레인 WT: AcNPV로 감염된 세포; 레인 ΔS: 천연 신호 서열이 제거된 HIV-1 외피 당단백질 120을 발현하는 AcNPV 재조합체로 감염된 세포 (vAc-gp120-ΔS); 레인 NS: 천연 신호 서열이 온전한 HIV-1 외피 당단백질 120을 발현하는 AcNPV 재조합체로 감염된 세포 (vAc-gp120-NS); 레인 MS: 천연 신호 서열이 꿀벌 멜리틴 신호 서열에 의해 치환된 HIV-1 외피 당단백질 120을 발현하는 AcNPV 재조합체로 감염된 세포 (vAc-gp120-MS).
도 4는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G (VSV-G)를 HIV-1 외피 당단백질 120 (gp120) 천연 신호 서열과 함께 또는 이러한 신호 서열없이 발현하는 재조합 오토그래피카 캘리포르니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)로 감염된 에스. 프루기페르다 곤충 세포 (SF21)의 DNA 단편화 분석을 제공하는 아가로오스 겔 전기영동을 도시한다. 전체 세포 DNA (A) 또는 저분자량 DNA (B)를 감염 후 48시간째에 추출하고, 에티듐 브로마이드의 존재하에서 1.2% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분석하였다: 레인 M: DNA 마커; 레인 VSV-G: 변형되지 않은 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G를 발현하는 AcNPV 재조합체로 감염된 세포; 레인 VSV-G-NS: HIV-1 외피 gp120 천연 신호 서열을 함유하도록 변형된 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G를 발현하는 AcNPV 재조합체로 감염된 세포 (vAcVSV-G-NS).
도 5는 유전적으로 변형된 HIV-1 프로바이러스(proviral) 클론의 구성과정을 도시한다. 골격 벡터로서 HIV-1 클레이드(clade) B 프로바이러스인 pNL4-3을 사용하여, 유전적으로 변형된 3가지 형태의 바이러스를 준비하였다. 이들 바이러스로는 nef 유전자의 표적화된 결실을 함유하는 pNL4-3nef-, 천연 Env 당단백질 신호 서열이 꿀벌 멜리틴 신호 서열로 치환된 pNL4-3SSR, nef 결실 및 신호 서열 치환 변이 둘 모두의 조합을 함유하는 pNL4-3nef-/SSR이 있다. pNL4-3WT 플라스미드는 야생형 모(parental) 프로바이러스를 나타낸다.
도 6은 장기간의 세포 생존이 A3.01 세포에서 바이러스 수율 증가를 초래함을 보여주는 그래프를 도시한다. 유전적으로 변형된 HIV-1 클레이드 B 바이러스로는 nef 유전자의 표적화된 결실을 함유하는 NL4-3nef-, 천연 Env 당단백질 신호 서열이 꿀벌 멜리틴 신호 서열로 치환된 NL4-3SSR, nef 결실 및 신호 서열 치환 변이 둘 모두의 조합을 함유하는 NL4-3nef-/SSR, 및 야생형 모 프로바이러스를 나타내는 NL4-3WT 가 있다.
도 7은 MAG1 검정을 이용한 A3.01 및 H9 세포에서의 HIV-1 NL4-3 변이체의 감염성을 도시한다. 유전적으로 변형된 HIV-1 클레이드 B 바이러스로는 nef 유전자의 표적화된 결실을 함유하는 NL4-3nef-, 천연 Env 당단백질 신호 서열이 꿀벌 멜리틴 신호 서열로 치환된 NL4-3SSR, nef 결실 및 신호 서열 치환 변이 둘 모두의 조합을 함유하는 NL4-3nef-/SSR, 및 야생형 모 프로바이러스를 나타내는 NL4-3WT 가 있다.
도 8은 H9 감염된 세포에서 HIV-1NL4-3에 의한 세포병변 효과 (합포체 형성)의 유도를 도시한다. 유전적으로 변형된 HIV-1 클레이드 B 바이러스로는 nef 유전자의 표적화된 결실을 함유하는 NL4-3nef-, 천연 Env 당단백질 신호 서열이 꿀벌 멜리틴 신호 서열로 치환된 NL4-3SSR, nef 결실 및 신호 서열 치환 변이 둘 모두의 조합을 함유하는 NL4-3nef-/SSR, 및 야생형 모 프로바이러스를 나타내는 NL4-3WT 가 있다.
도 9는 주요 HIV-1 클레이드의 보존된 중화 에피토프와 함께 또는 이러한 에피토프없이 수개의 독특한 V3 코딩 서열을 지닌 HIV gag 유전자를 함유하는 gag-NE 키메라 유전자의 구성과정을 도시한다. 도 9a는 HIV-2 gag 유전자와 HIV-1 클레이 드 B, C 및 E로부터의 V3 도메인으로 구성되고, 도 9b는 HIV-2 gag 유전자와 HIV-1 클레이드 A, D, F 및 G로부터의 V3 도메인으로 구성된다. 도 9c의 경우, 클레이드 B, C 및 E로부터의 불변 영역 C3를 나타내는 gp120로부터의 에피토프 뿐만 아니라 6개의 아미노산으로 표현되는 보존된 중화 에피토프 (CNE) (Muster, et al., J. Virol. 67:6642, 1993)가 대부분의 HIV-1 단리물과 교차반응하는 중화 항체를 생성시키도록 선택되었다.
도 10은 HIV-1 클레이드 B의 gp41, Nef, gp120, 역전사효소 (RT), Tat 및 Rev 단백질로부터의 다수의 세포독성 T-세포 에피토프 (TCE)를 지닌 gag-TCE 키메라 유전자의 구성과정을 도시한다.
6. 발명의 상세한 설명
1. 정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 청구의 범위에 사용된 특정 용어 및 구문의 의미가 하기 제공된다. 달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 전문가에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 지닌다.
지시하고자 하는 대상이 단수 형태로 표현되어 있다고 하더라도, 이는 대상의 수가 하나 이상임을 의미한다.
"아미노산"이라는 용어는 당 분야에 알려져 있다. 일반적으로, 아미노산 및 보호기를 표시하기 위해 본원에 사용된 약어는 IUPAC-IUB 커미션 온 바이오케미컬 노멘클러쳐 (IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)의 권고를 토대로 한다 (참조: Biochemistry (1972) 11:1726-1732). 특정 구체예에서, 본원에 사용된 아미노산은 단백질에서 발견되는 천연 아미노산, 또는 아미노기 및 카르복실기를 함유하는 이러한 아미노산의 천연 동화 또는 이화 생성물이다. 특히 적합한 아미노산 측쇄로는 글리신, 알라닌, 발린, 시스테인, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 메티오닌, 글루탐산, 아스파르트산, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 아르기닌, 프롤린, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판의 측쇄로부터 선택된 측쇄가 있다.
"아미노산"이란 용어는 본원에 언급된 임의의 특정 아미노산의 유사체, 유도체 및 동종체(congener) 뿐만 아니라 C-말단 또는 N-말단 보호된 아미노산 유도체 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 보호기로 변형된 것)를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 측쇄가 늘어나거나 줄어들었지만 고리화를 위해 여전히 카르복실, 아미노 또는 다른 반응성 전구체 작용기를 제공하는 아미노산 유사체 뿐만 아니라 적절한 작용기를 지닌 이형(variant) 측쇄를 지닌 아미노산 유사체를 사용하는 것을 고려한다. 예를 들어, 이러한 화합물은 아미노산 유사체, 예를 들어 시아노알라닌, 카나바닌, 디엔콜산(djenkolic acid), 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 디히드록시-페닐알라닌, 5-히드록시트립토판, 1 메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 디아미노피멜산, 오르니틴 또는 디아미노부티르산을 포함할 수 있다. 본원에 적합한 측쇄를 지닌 그 밖의 천연 아미노산 대사물 또는 전구체는 당업자에 의해 인식될 것이고, 본 발명의 범위에 포함된다.
아미노산의 구조가 입체이성질체 형태를 허용하는 경우 상기 아미노산의 (d) 및 (l) 입체이성질체가 또한 포함된다. 아미노산 및 아미노산 잔기의 배치는 본원에서 적절한 기호 (d), (l) 또는 (dl)로 표시되고, 또한 배치가 표시되지 않은 경우 아미노산 또는 잔기는 (d), (l) 또는 (dl) 배치를 지닐 수 있다. 따라서, 이러한 비대칭으로부터 초래되는 이성질체는 본 발명의 범위내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 이성질체는 통상적인 분리 기술 및 입체 제어 합성에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있다. 본원의 목적상, 명백히 달리 언급되지 않는 한, 지명된 아미노산은 (d) 또는 (l) 입체이성질체 둘 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 폴리클로날, 모노클로날, 재조합 및 인간화된 항체를 포함하는 전항체 (whole antibody), 예를 들어 임의의 이소타입 (IgG, IgA, IgM, IgE 등)의 전항체, 및 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하여 이와 결합할 수 있는 이들의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 통상적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있고, 단편은 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 이러한 용어는 특정 단백질과 선택적으로 반응할 수 있는 항체 분자의 단백분해적으로 절단되거나 재조합적으로 제조된 부분의 절편을 포함한다. 이러한 단백분해 단편 및/또는 재조합 단편의 비제한적 예로는 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 펩티드 링커에 의해 결합된 V[L] 및/또는 V[H] 도메인을 함유하는 단일 사슬 항체 (scFv)가 있다. scFv는 2개 이상의 결합 부위를 지닌 항체를 형성하도록 공유결합되거나 비공유결합될 수 있다.
"보존적 치환"이란 용어는 광범위하게 유사한 분자 특성을 지닌 아미노산들 사이의 변화를 의미한다. 예를 들어 지방족 그룹인 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신내에서의 상호교환은 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 때때로 이들 중 하나를 글리신으로 치환하는 것이 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 그 밖의 보존적 상호교환으로는 지방족 그룹인 아스파르테이트 및 글루타메이트내에서의 상호교환; 아미드 그룹인 아스파라긴 및 글루타민내에서의 상호교환; 히드록실 그룹인 세린 및 트레오닌내에서의 상호교환; 방향족 그룹인 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판내에서의 상호교환; 염기성 그룹인 리신, 아르기닌 및 히스티딘내에서의 상호교환; 및 황 함유 그룹인 메티오닌 및 시스테인내에서의 상호교환이 있다. 때때로, 메티오닌 및 류신 그룹내에서의 치환이 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 바람직한 보존적 치환 그룹은 아스파르테이트-글루타메이트; 아스파라긴-글루타민; 발린-류신-이소류신; 알라닌-발린; 발린-류신-이소류신-메티오닌; 페닐알라닌-티로신; 페닐알라닌-티로신-트립토판; 리신-아르기닌; 및 히스티딘-리신-아르기닌이다.
본원에 사용된 용어 "본질적으로 비세포용해성"이란 레트로바이러스가 세포를 중대하게 손상시키거나 치사시키지 않음을 의미한다.
"동등한"이란 핵산 또는 누클레오티드 서열을 설명하기 위해 사용되는 경우 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 의미한다. 동등한 누클레오티드 서열은 하나 이상의 누클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 달라지는 서열, 예를 들어 대립유전자 변이체를 포함하며, 따라서 유전 코드의 축중으로 인해 달라지는 서열을 포함한다. 예를 들어, 핵산 변이체는 누클레오티드 치환, 결실 또는 첨가에 의해 생성된 변이체를 포함한다. 치환, 결실 또는 첨가는 하나 이상의 누클레오티드를 포함할 수 있다. 변이체는 코딩 영역, 비코딩 영역 또는 둘 모두에서 변화될 수 있다. 코딩 영역에서의 변화는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 일으킬 수 있다.
변이체 펩티드는 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하는 직접 화학 합성에 의해 공유적으로 제조될 수 있다. 변이체는 추가로 예를 들어 아미노산 서열내에서의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 구성물에 도달하기 위해 이루어질 수 있는데, 단, 최종 구성물은 요망되는 활성을 지닌다. 이들 변이체는 펩티드 분자를 엔코딩하는 DNA내의 누클레오티드의 특정부위 돌연변이유발 (예: Adelman et al., DNA 2: 183 (1983))에 의해 제조될 수 있는데, 이로써 변이체를 엔코딩하는 DNA를 생성시킨 후 재조합 세포 배양물에서 DNA를 발현시킬 수 있다. 변이체는 전형적으로 야생형 폴리펩티드와 동일한 질적 생물학적 활성을 나타낸다. 공지된 폴리펩티드의 모든 가능한 단일 아미노산 치환체가 또한 합성될 수 있는 것으로 당 분야에 공지되어 있다 (Geysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 18:3998-4002 (1984)). 다양한 치환의 효과가 항상 상가적인 것은 아니지만, 폴리펩티드내의 다양한 잔기 위치에서의 2개의 유리하거나 중립적인 단일 치환이 임의의 단백질 활성을 상실시키지 않고 안전하게 조합될 수 있음을 기대하는 것은 타당하다. 축중 폴리펩티드의 제조 방법은 루터(Rutter)의 미국 특허 제 5,010,175호, 문헌 [Haughter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 82:5131-5135 (1985)], [Geysen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 18:3998-4002 (1984)], WO86/06487 및 WO86/00991에 기재되어 있다.
치환 방법을 고안하는 경우, 당업자는 어느 잔기를 변화시키고, 어느 아미노산 또는 아미노산의 부류가 적합한 대체물인 지를 결정할 것이다. 또한, 족 또는 천연 상동 단백질에서의 서열 변화 연구가 고려될 수 있다. 특정 아미노산 치환이 다른 것들 보다 더 자주 허용되고, 이는 본래의 아미노산과 이의 대체물 사이의 크기, 전하 등의 유사성과 상호관련된다. 아미노산의 삽입 또는 결실은 또한 상기 기재된 바와 같이 이루어질 수 있다. 치환은 바람직하게는 보존적이다 [참조: Schulz et al., Principle of Protein Structure (Springer-Verlag, New York (1978)); 및 Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco (1983)); 둘 모두 본원에 전체내용이 참조로 포함되어 있음].
본원에 사용된 핵산의 "기능적" 단편이란 단편과 결부된 유전자에 대한 신호 서열을 코딩할 수 있는 핵산 단편이다. 따라서, 핵산의 "기능적 단편"은 적절한 조건에서 신호 서열을 코딩할 수 있는 핵산을 포함하는 것으로 의도된다.
"HIV"란 용어는 인간 면역결핍 바이러스를 의미하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 2가지 유형의 HIV, 즉, HIV-1 및 HIV-2가 존재한다. 다수의 다양한 HIV-1 균주가 존재한다. HIV-1의 균주는 3가지 군, 즉, "주요" M군, "가외(outlier)" O군 및 "신규" M군으로 분류될 수 있다. 이러한 3가지 군은 인간내로의 원숭이(simian) 면역결핍 바이러스의 3가지 개별적 도입형태를 나타낼 수 있다. M군내에서, 적어도 10가지의 아형(subtype) 또는 클레이드(clade), 예를 들어 클레이드 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J 및 K가 존재한다. "클레이드"는 구성원들 이 공통 조상으로부터 유래된 상동성 특징을 공유하는 생물체의 군, 예를 들어 종이다. 본원에서 HIV-1이라 함은 이들 모든 균주를 포함한다.
"폴리누클레오티드" 및 "핵산"이란 용어는 데옥시리보누클레오티드 또는 리보누클레오티드 또는 이의 유사체인 임의의 길이의 누클레오티드의 중합체 형태를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리누클레오티드의 비제한적 예로는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 규정된 유전자좌(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리누클레오티드, 분지형 폴리누클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머가 있다. 폴리누클레오티드는 변형된 누클레오티드, 예를 들어 메틸화된 누클레오티드 및 누클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 누클레오티드 구조의 변형은 중합체의 조립 전 및 후에 이루어질 수 있다. 누클레오티드의 서열은 비-누클레오티드 성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리누클레오티드는 중합 후에, 예를 들어 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해, 추가로 변형될 수 있다. "재조합" 폴리누클레오티드란 용어는 자연계에 존재하지 않거나 비-천연 배열로 또 다른 폴리누클레오티드에 결합된 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리누클레오티드를 의미한다. "올리고누클레오티드"는 약 100개 미만의 누클레오티드, 예를 들어 75개, 50개, 25개 또는 10개 미만의 누클레오티드를 지닌 단일 가닥 폴리누클레오티드를 의미한다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" (단일 사슬인 경우)이란 용어는 본원에 서 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 간섭될 수 있다. 또한, 이러한 용어는, 예를 들어 이황화물 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작에 의해, 예를 들어 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해, 변형된 아미노산 중합체를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 화학적으로, 무세포 시스템 중의 리보솜에서 또는 세포내 리보솜에서 합성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 화학 합성은 단계적 고체상 합성, 펩티드 단편의 입체형태 보조된 재연결을 통한 반합성, 클로닝된 절편 또는 합성 펩티드 절편의 효소적 연결, 및 화학 연결을 포함하는 당 분야에 인식된 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 자연적 화학 연결은 보호되지 않은 2개의 펩티드 절편의 화학선택적 반응을 이용하여 일시적인 티오에스테르 결합된 중간체를 생성시킨다. 그 후, 일시적인 티오에스테르 결합된 중간체는 자발적으로 재배열이 일어나서 연결 부위에서 천연 펩티드 결합을 지니는 전장 연결 생성물을 제공한다. 전장 연결 생성물은 무세포 합성에 의해 생성된 단백질과 화학적으로 동일하다. 전장 연결 생성물은 허용되는 경우 리폴딩되고/되거나 산화되어 천연 이황화물함유 단백질 분자를 형성할 수 있다 (참조: 미국 특허 제 6,184,344호 및 제 6,174,530호; 및 T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p 420; M. Miller, et al., Science (1989): vol. 246, p 1149; A. Wlodawer, et al., Science (1989): vol. 245, p 616; L. H. Huang, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 7402; M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): vol. 40, p 180-193; K. Rajarathnam, et al., Science (1994): vol. 264, p 90; R. E. Offord, "Chemical Approaches to Protein Engineering", in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp. 253-282; C. J. A. Wallance, et al., J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, p 3852; L. Abrahmsen, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151; T. K. Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12544-12548; M. Schnlzer, et al., Science (1992): vol., 3256, p 221; 및 K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33: 184).
당업자에게 공지된 바와 같이, "레트로바이러스"는 통합된 DNA 중간체 (프로바이러스 DNA)를 통해 복제하는 2배체 양성가닥 RNA 바이러스이다. 특히, RNA 바이러스에 의한 감염시, 렌티바이러스 게놈은 각각의 레트로바이러스내에 단백질로서 함유된 바이러스 엔코딩된 역전사효소에 의해 DNA로 역전사된다. 그 후, 바이러스 DNA는 감염 세포의 숙주 세포 게놈내로 유사-무작위적으로 (pseudo-randomly) 통합되어, 딸세포에 의해 유전되는 "프로바이러스"를 형성한다. 레트로바이러스 게놈은 적어도 3개의 유전자, 즉, 바이러스의 코어 및 구조 단백질을 코딩하는 gag; 역전사효소, 프로테아제 및 통합효소(integrase)를 코딩하는 pol; 및 바이러스 표면 단백질을 코딩하는 env를 함유한다. 레트로바이러스 족내에서, HIV는 고양이 (고양이 면역결핍 바이러스), 양 (비스나(visna) 바이러스), 염소 (염소 관절염-뇌염 바이러스) 및 인간 이외의 영장류 (원숭이 면역결핍 바이러스)를 감염시키 는 것과 같은 동물 렌티바이러스와 유전적 및 형태적 유사성을 지닌 렌티바이러스로서 분류된다.
본원에 사용된 "충분한 결실"은 전사를 억제하여 상응하는 단백질 생성물의 생성을 억제하기에 충분한 핵산 서열의 결실을 의미한다.
2. 개관
본 발명은 HIV-1의 외피 당단백질 gp120의 천연 신호 서열 (NSS)를 1개 이하의 양하전된 아미노산을 함유하는 신호 서열로 치환하면 비세포용해성이고 그 자체로 gp120의 고도로 효율적인 합성, 당화 및 분비를 일으킬 수 있는 변형된 HIV-1을 초래한다는 의외의 발견을 적어도 부분적으로 기초로 한다. 특히, gp120 신호 서열 중의 양하전된 아미노산 잔기의 변화가 발현 수준을 증가시킬 뿐만 아니라 분비 수준도 증가시키는 것으로 관찰되었다. 분비 수준은 양전하량이 감소할 수록 증가하였다. 대조적으로, HIV-1 클레이드 B gp120 신호 서열 중의 모든 5개의 양하전된 아미노산 잔기의 제거는 대량의 당화되지 않은 형태의 gp120이 세포에 축적되게 하였다. 이러한 결과는 최소 개수의 양하전된 아미노산 잔기가 ER 막을 가로지르는 단백질의 효율적인 전좌를 위해 필요함을 나타내었다.
3. 재조합 렌티바이러스
한 가지 일면에 있어서, 본 발명은 바이러스의 외피 당단백질의 NSS가 1개 이하의 양하전된 아미노산을 함유하는 길이가 약 20개 내지 약 40개 아미노산인 신호 서열로 치환된, 고도로 효율적으로 복제될 수 있는 본질적으로 비세포용해성인 재조합 HIV-1를 제공한다.
변형된 gp120 신호 서열은 천연 신호 서열
Figure 112007081211565-PCT00001
중의 양하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환함으로써 이루어질 수 있고; 이러한 변형은
Figure 112007081211565-PCT00002
로서 표현될 수 있으며, 여기서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 중성 아미노산이다. 양하전된 잔기는 진한 글자체로 표시되고 밑줄그어져 있다.
예시적인 변형된 신호 서열로는 다음과 같은 것들이 있다:
Figure 112007081211565-PCT00003
Figure 112007081211565-PCT00004
(변형된 멜리틴 신호 펩티드, 밑줄그어진 서열은 링커 삽입의 결과이며 이는 신호 서열 및 성숙 gp120 단백질 사이의 5개 아미노산을 나타냄; SEQ ID NO: 7),
Figure 112007081211565-PCT00005
(변형된 인터류킨 3 신호 펩티드, 밑줄그어진 서열은 링커 삽입의 결과이며 이는 신호 서열 및 성숙 gp120 단백질 사이의 7개 아미노산을 나타냄; SEQ ID NO:8), 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체.
4. 본 발명의 백신
또한, 본 발명은 유효량의 상기 기재된 비병원성이고 본질적으로 비세포용해성인 렌티바이러스를 포함하는 백신을 특징으로 한다.
본 발명의 백신 조성물은 피검체에 생물학적으로 양립가능한 형태로 생체내 투여하기에 적합하다. 본원에 사용된 표현 "생체내 투여하기에 적합한 생물학적으로 양립가능한 형태"는 임의의 독성 효과 보다 치료 효과가 더 큰 투여하고자 하는 물질의 형태를 의미한다. 이러한 물질은 임의의 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은 적절한 희석제, 애쥬번트 및/또는 담체를 추가로 함유할 수 있다. 바람직하게는, 백신은 생체내에서 이러한 백신의 면역원성을 향상시킬 수 있는 애쥬번트를 함유한다. 이러한 애쥬번트는 당 분야의 다수의 공지된 애쥬번트로부터 선택될 수 있으며, 예로는 그람 음성 세균 내독소의 지질-A 부분, 미코박테리아의 트레할로오스 디미콜레이트, 인지질 리소레시틴, 디메틸딕타데실 암모늄 브로마이드 (DDA), 특정한 선형 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 (POP-POE) 블록 중합체, 알루미늄 히드록시드, 리포솜 및 CpG (시토신-포스페이트-구아니딘) 중합체가 있다. 또한, 백신은 면역 반응을 향상시키는 것으로 공지된 시토카인을 포함할 수 있으며, 이의 예로는 GM-CSF, IL-2, IL-12, TNF 및 IFNγ가 있다.
백신의 투여량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 요망되는 반응을 유도시키는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 투여 방법은 최적 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 수 개의 분할된 투여량이 매일 투여될 수 있거나 투여량은 치료 상황의 긴급성에 의해 처방되는 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 또한, 백신의 투여량은 상황에 따라 최적의 예방적 투여량 반응을 제공하도록 변화될 수 있다.
본 발명의 백신은 백신으로서 제형화되어 경구, 피내, 근내, 정맥내, 피하, 비내 및 질내 경로, 또는 임의의 다른 표준 면역화 경로를 통해 도입될 수 있다.
본 발명의 백신의 제형화에 있어서, 습윤제, 유화제 및 윤활제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트, 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 착향제 및 방향제, 방부제 및 산화방지제가 제형화된 약물에 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 비강, 국소 (협측 및 설하를 포함함), 직장, 질, 에어로졸 및/또는 비경구 투여를 위해 적합할 수 있다. 제형은 편리하게는 단위 투여량 형태로 제공될 수 있고, 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 1회 투여량을 생성시키기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 조성물의 양은 치료하려는 피검체 및 특정 투여 형태에 따라 달라질 수 있다.
이러한 제형을 제조하는 방법은 본 발명의 조성물을 담체 및 임의로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 작용제들을 균일하고 철저하게 액체 담체, 미세 분할된 고체 담체 또는 이 둘 모두와 회합시킨 후, 필요에 따라 생성물로 성형시킴으로써 제조된다.
경구 투여용으로 적합한 제형은 캡슐, 캐세이(cachet), 알약, 정제, 로젠지 (통상적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트라가칸트인 착향 기본물질을 사용함), 분말, 과립의 형태로, 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로서, 또는 엘릭서 또는 시럽으로서, 또는 파스틸(pastille) (젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아와 같은 비활성 기본물질을 사용함)로서 존재할 수 있고, 이들 각각은 활성 성분으로서 소정량의 본 발명의 조성물을 함유한다. 또한, 본 발명의 조성물은 볼루스(bolus), 연질약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여용 고체 투여량 형태 (캡슐, 정제, 알약, 드라제, 분말, 과립 등)에 있어서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 시트르산 나트륨 또는 인산 이칼륨, 및/또는 하기 물질 중 어느 하나와 혼합된다: (1) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 및/또는 실리스산; (2) 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스 및/또는 아카시아; (3) 보습제, 예를 들어 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들어 한천-한천, 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정한 실리케이트, 및 탄산 나트륨; (5) 용해 지연제, 예를 들어 파라핀; (6) 흡수 가속제, 예를 들어 4차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예를 들어 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들어 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등이 락토오스 또는 유당과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
정제는, 임의로 하나 이상의 보조 성분을 사용하여, 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스), 윤활제, 비활성 희석제, 방부제, 붕해제 (예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스), 표면활성제 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 적합한 장치에서 비활성 액체 희석제로 보습된 본 발명의 조성물의 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제 및 다른 고체 투여형, 예를 들어 드라제, 캡슐, 알약 및 과립은 코팅 및 쉘(shell), 예를 들어 장용 코팅 및 약제 제형화 분야에 널리 공지된 그 밖의 코팅을 사용하여 임의로 스코어링(scoring)되거나 제조될 수 있다.
경구 투여용 액체 투여형으로는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서가 있다. 본 발명의 조성물 이외에, 액체 투여형은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 비활성 희석제, 예를 들어 물 또는 그 밖의 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩(groundnut)유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물 이외에, 현탁액은 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여용 제형은 본 발명의 조성물을, 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제용 왁스 또는 살리실레이트를 포함하며 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이어서 체강에서 용융되어 활성 물질을 방출시키는 하나 이상의 적절한 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합시킴으로써 제조될 수 있는 좌제로서 제공될 수 있다. 또한, 질 투여용으로 적합한 제형으로는 당 분야에서 적절한 것으로 공지된 담체를 함유하는 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움(foam) 또는 스프레이 제형이 있다.
본 발명의 조성물의 경피 투여용 투여형으로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 있다. 활성 성분은 멸균 조건하에서 약제학적으로 허용되는 담체 및 필요에 따라 임의의 방부제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 본 발명의 조성물 이외에 부형제, 예를 들어 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리스산, 탈크 및 아연 산화물, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 본 발명의 조성물 이외에 부형제, 예를 들어 락토오스, 탈크, 실리스산, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 통상적인 추진제, 예를 들어 클로로플루오로히드로카본 및 휘발성 비치환 탄화수소, 예를 들어 부탄 및 프로판을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 대안적으로 에어로졸에 의해 투여될 수 있다. 이는 화 합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제제 또는 고체 입자를 제조함으로써 달성된다. 비수성 (예를 들어, 플루오로카본 추진제) 현탁액이 사용될 수 있다. 음파 분무기가 사용될 수 있는데, 이는 이러한 분무기가 본 발명의 조성물에 함유된 화합물의 분해를 일으킬 수 있는 전단(shear)에 약물이 노출되는 것을 최소화시키기 때문이다.
일반적으로, 수성 에어로졸은 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 및 안정화제를 사용하여 본 발명의 조성물의 수용액 또는 현탁액을 제형화시킴으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정한 본 발명의 조성물의 요건에 따라 달라지지만, 전형적으로 비이온성 계면활성제 (트윈(Tween), 플루로닉(Pluronic) 또는 폴리에틸렌 글리콜), 무해한 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 소르비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 아미노산, 예를 들어 글리신, 완충제, 염, 당 또는 당 알코올을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장 용액으로부터 제조된다.
또한, 백신은 주사액으로서 비경구적으로 투여될 수 있다 (정맥내, 근내 또는 피하). 본 발명의 백신 조성물은 임의로 하나 이상의 애쥬번트를 함유할 수 있다. 임의의 적합한 애쥬번트가 사용될 수 있는데, 이의 예로는 CpG 중합체, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 식물 및 동물 오일 등이 있고, 애쥬번트의 양은 사용되는 특정 애쥬번트의 성질에 좌우된다. 또한, 항감염 백신 조성물은 하나 이상의 안정화제, 예를 들어 소르비톨, 만니톨, 전분, 수크로오스, 덱스트린 및 글루코오스와 같은 탄수화물 뿐만 아니라 알부민 및 카제인과 같은 단백질, 및 알칼리 금속 포스페이트와 같은 완충제 등을 함유할 수 있다.
비경구 투여용으로 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 조성물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 함께 포함하며, 이는 산화방지제, 완충제, 정균제, 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장이 되도록 하는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
또한, 본 발명의 비세포용해성 재조합 렌티바이러스는 리포솜에 캡슐화되어 주사에 의해 투여될 수 있다. 시판되는 리포솜 전달 시스템은 노바백스, 인크. (Novavax, Inc., Rockville, Md.)로부터 입수가능하며, 이는 노바솜즈(NovasomesTM)로 시판되고 있다. 이러한 리포솜은 특히 면역원 또는 항체 전달을 위해 제형화된다. 본 발명의 구체예에서, 이러한 비-인지질 양하전된 리포솜의 표면에 결합된 노바솜즈TM 함유 Isd 펩티드 또는 항체 분자가 사용될 수 있다.
5. 사용 방법
또한, 본 발명은 피검체에 유효량의 백신을 투여하는 것을 포함하여 피검체에서 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스는 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 렌티바이러스는 숙주에서 렌티바이러스의 복제 및 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 바이러스의 외피 당단백질 gp120의 천연 신호 서열이 본질적으로 비-세포독성 바이러스를 제공하도록 변형되거나 본질적으로 비-세포용해성인 신호 서열로 치환된 재조합 렌티바이러스로 트랜스펙션된 세포를 또한 제공한다. 세포는 바람직하게는 T-림프구, 더욱 바람직하게는 형질전환된 세포주로부터 유래되지 않은 T-세포이다.
따라서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 본질적으로 비-세포용해성이고 비병원성인 사멸된 재조합 렌티바이러스를 렌티바이러스 감염의 예방 또는 치료가 필요한 동물에게 투여하는 것을 포함하여 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본원에 사용된 용어 "유효량"이란 요망되는 결과를 달성하는데 필요한 기간 및 투여량에서 효과적인 양을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "동물"은 포유동물을 포함하는 동물계의 모든 구성원, 바람직하게는 인간을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 렌티바이러스 감염의 예방 또는 치료가 필요한 동물에게 유효량의 본질적으로 비-세포용해성이고 비병원성인 사멸된 재조합 렌티바이러스를 투여하는 것을 포함하여 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질, 바람직하게는 gp120의 천연 신호 서열은 본질적으로 비세포용해성인 신호 서열을 제공하도록 변형되고, 바람직하게는 바이러스는 nef 유전자를 결실시킴으로써 비병원성으로 된다.
상기 언급된 구체예에 따르면, 비-세포용해성 NSS를 제공하기 위한 변형은 NSS 서열에서 1개 이하의 양하전된 아미노산을 생성시킨다. 가장 바람직하게는, 동물은 사람이고, 바람직하게는 렌티바이러스는 HIV-1이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 렌티바이러스 감염의 예방 또는 치료가 필요한 동물에게 유효량의 본질적으로 비-세포용해성이고 비병원성인 사멸된 재조합 렌티바이러스를 투여하는 것을 포함하여 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 바이러스의 외피 당단백질, 바람직하게는 gp120의 신호 서열은 본질적으로 비-세포용해성인 신호 서열로 치환되고, 바람직하게는 바이러스는 nef 유전자를 결실시킴으로써 비병원성으로 된다. 가장 바람직하게는, 동물은 인간이고, 바람직하게는 렌티바이러스는 HIV-1이다.
또한, 본 발명은 유효량의 재조합 바이러스, 바람직하게는 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 또는 바람직하게는 HIV-1의 NSS를 함유하는 표적 세포에 대해 특이적인 임의의 다른 캐리어 RNA 바이러스를 표적 세포(들)에 투여하는 것을 포함하여 표적 세포, 바람직하게는 암 세포를 치사시키거나 파괴하는 방법을 포함한다.
바람직하게는, 세포는 이의 치사 또는 파괴를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 인간 체내에 존재한다. 감염되거나 암성인 세포는 세포 특이적 마커를 발현시키는데, 이러한 마커에 대한 상보적 인식 부위는 HIV-1의 NSS가 통합된 적절한 벡터내로 통합될 수 있다. 이러한 방법은 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로 수행되었는데, 이러한 바이러스는 CD4 및 CXCR4에 대한 유전자를 포함하여 변형된 VSV가 HIV-1 감염된 세포를 감염시키게 하도록 처리되었다 (Schnell, M. J. et al. Cell 90 : 849-857 (1997)). 따라서, 본 발명은 표적 세포를 치사시킬 필요가 있는 동물에 NSS 및 표적 세포에 대해 특이적인 인식 부위를 함유하는 재조합 바이러스를 투여하는 것을 포함하여 표적 세포, 예를 들어 암 세포를 치사시키는 방법을 제공한다. 구체예에서, HIV-1의 NSS는, 특정 암 세포 표면 항원을 기초로 하여 특정 암세포 유형에 표적화됨으로써 VSV에 표적화된 암세포에서 아폽토시스를 유도하는 능력을 부여하는 변형된 VSV 유사 벡터내로 통합된다.
7. 실시예
하기 비제한적 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예 1a -- 재조합 바큘로바이러스의 구성방법
인간 면역결핍 바이러스-1 당단백질 gp120을 이의 천연 신호 서열과 함께 (gp120-NSS), 이의 천연 신호 서열이 꿀벌 멜라틴 신호 서열로 대체된 형태 (gp120-MSS), 및 이의 천연 신호 서열이 제거된 형태 (gp120-ΔS)로 발현하는 재조합 바큘로바이러스의 구성방법은 리(Li) 등의 문헌 (Virology 204 : 266-278 (1994))에 공지되었다. 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G (VSVInd G)를 발현하는 재조합 바큘로바이러스의 구성방법은 배일리(Bailey) 등의 문헌 (Virology 169 : 323-331 (1989))에 공지되었다.
VSVInd G 단백질을 HIV-1 외피 당단백질 gp120 신호 서열과 함께 발현하는 (VSV-G-NSS) 재조합 바큘로바이러스의 구성방법은 하기 기재되어 있다.
VSV-G 단백질의 신호 서열을 치환하기 위해, 본 발명자들은 먼저 하기 2개의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 VSV-G-ΔS (신호 서열이 없는 수포성 구내염 바이러스 당단백질 G)를 구성하였다:
Figure 112007081211565-PCT00006
플라스미드 pwK1 (VSVInd 전장 G 유전자를 함유함; 미국 버지니아 대학의 로버트 알. 와그너 (Robert R. Wagner) 박사의 호의로 제공받음)를 주형으로서 사용하고, 진앰프(Geneamp) 키트를 사용하여 주형으로서 20ng의 pwK1 및 1.0 μM의 각각의 프라이머로부터 퍼킨 엘머 세투스 써모사이클러 (Perkin Elmer Cetus Thermocycler)에서 30 사이클의 PCR (사이클은 94℃, 1분; 45℃, 2분; 72℃, 3분이었음)에 의해 증폭시켰다.
모든 프라이머는, 증폭된 VSV-G-ΔS DNA 단편이 플라스미드 pBluescript SK VECTOR (Stratagene)의 BamHI 부위내로 삽입될 수 있도록 이들의 5' 말단에서 BamHI 부위를 지녔다. VSV-G-ΔS의 5' 말단이 T7 프로모터쪽으로 향해있는 클론을 선택하고, 이를 SphI + XhoI 제한 효소로 분해하였다.
실시예 1b -- 중합효소 사슬 반응 (PCR)에 의한 부위 특이적 돌연변이유발
HIV-1 외피 gp120의 신호 서열 중에 위치한 양하전된 아미노산을 비극성 아미노산으로 변화시키기 위해, 퍼킨-엘머 세투스 써모사이클러에서 PCT에 의해 올리고누클레오티드 유도된 돌연변이유발을 수행하였다. HIV-1 외피 gp120 신호 서열의 코딩 영역에서의 일련의 돌연변이 (YL-1, YL-2, YL-3 & YL-4)를 생성시키도록 4개의 돌연변이용 올리고누클레오티드 프라이머를 설계하였다:
Figure 112007081211565-PCT00007
밑줄그어진 누클레오티드는 변화된 것들이다.
또한, gp120 유전자의 C-말단에 상보적인 범용 프라이머
Figure 112007081211565-PCT00008
를 사용하여 전장 돌연변이 gp120 클론을 수득하였다. gp120 엔코딩 서열은 진앰프(Geneamp) 키트를 사용하여 주형으로서의 20ng의 HindIII 선형화된 pUC19-gp120-NSS 및 1.0μM의 각각의 돌연변이 프라이머 및 범용 프라이머로부터 30 사이클의 PCR (사이클은 94℃, 1분; 45℃, 2분; 72℃, 3분이었음)에 의해 증폭시켰다. 증폭된 gp120 DNA 단편이 pAcYM1의 BamH1 부위내로 삽입될 수 있도록 모든 프라이머는 이들의 5' 말단에서 BamH1 부위를 지녔다. 모든 구성된 돌연변이체는 디데옥시 사슬-종결 시퀀싱에 의해 입증되는 예상 돌연변이를 지닌다.
실시예 1c -- HIV-1 신호 서열의 증폭
env 유전자의 HIV-1 신호 서열은 하기 2개의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 pBluescript-gp120-NSS로부터 증폭시켰다:
Figure 112007081211565-PCT00009
HIV-1 신호 서열을 함유하는 증폭된 DNA 단편을 XhoI 및 SphI 제한 효소로 분해하고, XhoI 및 SphI 분해된 벡터인 pBluescript VSV-G-ΔS 내로 삽입시켰다. 생성된 플라스미드를 pBSK VSV-G-NSS로 명명하고, 이러한 구성물을 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 확인하였다.
VSV-G-NSS의 BamHI 단편을 바큘로바이러스 pAcYM1 (Li, Y. et al. Virology 204 : 266-278 (1994))의 BamHI 부위내로 삽입시키고, VSV-G-NSS를 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 표준 트랜스펙션 방법 (Li, Y. et al. Virology 204 : 266-278 (1994))에 의해 생성시켰다.
실시예 2 -- 재조합 바큘로바이러스 감염된 세포의 현미경 검사
SF21 세포를 5 PFU/세포의 m.o.i.로 재조합 AcNPV를 사용하여 감염시키고, 27℃에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 감염된 세포를 위상차 현미경에 의해 검사하였다. 결과는 도 1에 도시되어 있다. 이러한 결과는 HIV-1 env 신호 서열이 세포를 신속히 치사시킴을 나타낸다.
실시예 3 -- 세포 사멸에 대한 HIV-1 env 신호 서열의 효과
I. 트립판 블루 검정: SF21 세포를 5 PFU/세포의 m.o.i.로 재조합 AcNPV를 사용하여 1시간 동안 감염시키고, 접종물을 분리하고, 10% 우태아 혈청 (FBS)를 함유하는 완전 배지 TNM-FH와 함께 인큐베이션시켰다. 감염 후 24시간, 48시간 및 72시간째에, 세포를 트립판 블루 (GIBCO, BRL)를 사용하여 5분간 염색시키고, 세포를 현미경을 통해 계수하고, 사멸 세포의 비율을 하기 식을 사용하여 측정하였다:
Figure 112007081211565-PCT00010
II. 락테이트 탈수소효소 방출 검정 (LDRA): LDRA을 제조업자 (Boehringer Mannheim Cytotoxicity Detection Kit)의 지시에 따라 수행하였다. SF21 세포를 5 PFU/세포의 m.o.i.로 재조합 AcNPV를 사용하여 1시간 동안 감염시키고, 접종물을 분리하고, 27℃에서 완전 배지와 함께 인큐베이션시키고, 배지를 12시간의 규칙적인 간격으로 수거하고, 12,000rpm에서 1분간 원심분리시켰다. 배양물 상층액을 10배 희석하고, 100㎕의 상층액을 100㎕의 반응 혼합물 (세포독성 검출 키트)과 실온에서 30분간 인큐베이션시켰다. 샘플의 흡광도는, 마이크로플레이트 (ELISA) 판독기 (Bio-Rad 550)을 사용하여 형성된 포르마젠 염료를 정량함으로써 490nm에서 측정하였다. 트립판 블루 및 락테이트 탈수소효소 방출 검정의 결과는 각각 도 2A 및 2B에 도시되어 있다.
결론적으로, HIV-1 env 천연 신호 서열을 지닌 rgp120 및 VSV-G는 세포를 훨씬 신속히 치시시킨다. 세포는 HIV-1 env 천연 신호 서열이 없거나 멜리틴 신호 서열을 지닌 경우 훨씬 길게 생존한다. HIV-1 env 천연 신호 서열은 신속한 세포 사멸을 담당한다.
실시예 4 -- 아폽토시스의 검사
1. 전체 DNA 추출법: SF21 세포 (3 x 106)를 5 PFU/세포의 m.o.i.로 재조합 AcNPV를 사용하여 1시간 동안 감염시켰다. 접종물을 분리하고, 27℃에서 48시간 동안 완전 배지와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 2500rpm에서 10분간 펠레트화시키고, TSE (10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA, 1% SDS; 여기에 프로테이나아제 K가 70㎍/ml의 최종 농도로 첨가됨)로 추출하였다. 그 후, 샘플을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 인큐베이션의 종료시에 NaCl을 1M의 최종 농도로 첨가한 후, 샘플을 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. DNA를 페놀:클로로포름 (1:1) 및 클로로포름을 사용하여 추출하였다. 최종적으로, 에탄올 (100%)을 첨가하여 DNA를 침전시키고 (80℃에서 15분), DNA 침전물을 12,000rpm에서 15분간 마이크로원심분리에 의해 펠레트화시켰다. DNA 펠레트를 70% 에탄올로 1회 세척하고, RNase A (50㎍/ml)를 사용하여 TE (10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA) 중에 재현탁시키고, 1.2% 아가로오스 겔상에서 전기영동시키고, 에티듐 브로마이드로 염색시켰다 (N. Chejanovsky and E. Gershburg, Virology 209 : 519-525 (1995)). 결과는 도 3에 도시되어 있다. 상기 결과는 HIV-1 env 천연 신호 서열이 아폽토시스를 유도함을 나타낸다.
II. 단편화된 DNA의 추출: SF21 세포를 5 PFU/세포의 m.o.i.로 vAc-VSV-G (VSV-G) 또는 vAc-VSV-G-NSS (VSV-G-NSS)를 사용하여 감염시키고, 27℃에서 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 감염 후 48시간째에, 이들 세포 (3 x 106)를 2,500rpm에서 5분간 펠레트화시키고, 10mM 트리스 HCl (pH 8.0), 10mM EDTA 및 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 용액에 용해시키고, 에펜도르프 마이크로원심분리기로 12,000rpm에서 25분간 원심분리시켜서 염색체 DNA를 펠레트화시켰다. 상층액을 37℃에서 1시간 동안 ml 당 0.1mg의 RNaseA로 분해한 후, 1% SDS의 존재하에서 50℃에서 ml 당 1mg의 프로테이나아제 K로 2시간 동안 분해하고, 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, 차가운 에탄올로 침전시켰다. 침전물을 TE 중에 재현탁시키고, ml 당 5㎍의 에티듐 브로마이드를 함유하는 11.5% 아가로오스 겔상에서 전기영동하였다. DNA를 UV 투과조명(transillumination)에 의해 가시화시켰다 (Rosario Leopardi and Bernard Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 9583-9587 (1996)). 결과는 도 4에 도시되어 있다.
실시예 5 -- 부분 vpu 및 nef 결실 및 NSS 치환을 함유하는 재조합 HIV-1의 구성과정
I. NSS 치환 (MSS, IL-3 또는 임의의 다른 신호 서열에 의함) 및 vpu 결실을 함유하는 플라스미드 pNL4-3 의 구성과정: 감염성 HIV-1 프로바이러스 DNA 클론인 pNL4-3 (NIH NIAID의 AIDS 부의 AIDS 리서치 앤드 레퍼런스 리에이전트 프로그램 (AIDS Research and Reference Reagent program)을 통해 말콤 마틴 (Malcolm Martin) 박사에 의해 제공받음; Adachi, et al J. Virol. 59 : 284-291 (1986))은 2개의 독특한 제한 효소 부위, 즉, EcoRI (5744번 위치) 및 BamHI (8466번 위치)를 함유한다. env 유전자 엔코딩 영역은 6221번 위치에서 출발하여 8785번 위치에서 종결된다. HIV-1 env의 천연 신호 서열을 멜리틴, IL-3 또는 임의의 다른 분비 단백질 신호 서열로 치환하기 위해, pNL4-3의 EcoRI-BamHI 단편을 아가로오스 겔로부터 단리하고, pBluescript SK (pBSK) 벡터의 EcoRI-BamHI 부위내로 서브클로닝시킨다. 이러한 생성물로부터, 4개의 프라이머를 하기와 같이 설계한다:
Figure 112007081211565-PCT00011
주형으로서의 pBSK-env 및 프라이머 #1과 #2를 사용하고, PCR을 수행하여 env 영역의 좌측부인 477bp 단편을 증폭시킨다. 유사하게, 프라이머 #3과 #4를 사용하여 env의 우측부인 2245bp를 증폭시킨다. EcoRI-PstI PCR 생성물 (477bp 단편)은 EcoRI + PstI로 분해하고, PstI-BamHI PCR 생성물 (2245bp 단편)은 PstI + BamHI로 절단하였다. 그 후, PstI-BamHI 분해된 2245bp 단편을 pBSK 벡터의 PstI + BamHI 부위내로 클로닝하였다.
그 다음, pBSK-2245를 EcoRI + PstI로 분해하고, EcoRI + PstI 분해된 PCR 생성물 (445bp 단편)과 연결시켜서 플라스미드 pBSK-env-ΔS를 생성시켰다.
플라스미드 pBSK-env-ΔS를 PstI + NcoI로 분해한 후, MSS 신호 서열, IL-3 신호 서열, 돌연변이된 천연 신호 서열 또는 임의의 다른 요망되는 신호 서열을 엔코딩하는 합성 올리고누클레오티드와 연결시켰다. 이러한 합성 올리고누클레오티드는 5' 단부에서 PstI 부위를 함유하고, 3' 단부에서 NcoI 부위를 함유한다. 벡터내로 연결시키기 전에, 먼저 이러한 이중 가닥 올리고누클레오티드를 PstI + NcoI로 분해하였다.
멜리틴 신호 서열을 엔코딩하는 합성 올리고누클레오티드는 다음과 같다 (포지티브 센스만이 도시됨):
Figure 112007081211565-PCT00012
인터류킨-3 신호 서열을 엔코딩하는 합성 올리고누클레오티드는 다음과 같다 (포지티브 센스만이 도시됨):
Figure 112007081211565-PCT00013
시퀀싱하여 올바른 변형 여부를 확인한 후, 플라스미드를 EcoRI + BamHI로 분해하여 EcoRI-BamHI 단편을 단리하고, 이를 pNL4-3 프로바이러스 DNA 벡터의 EcoRI-BamHI 부위내로 리클로닝(recloning)하였다. 생성된 플라스미드는 pHIV-1-MSS (또는 pHIV-1-IL3SS)라 명명하였다.
또한, 상기 구성과정 동안, NSS를 MSS 또는 IL-3 신호 서열로 치환시킬 뿐만 아니라 부분적 vpu 유전자 결실을 생성시켰다. vpu는 82개 아미노산을 엔코딩하며, 이의 3' 단부는 HIV-1 env 유전자의 신호 서열인 약 28개 아미노산과 겹쳐진다. 그러나, 이는 상이한 리딩 프레임에 존재한다 (-1 리딩 프레임). 연구 결과, vpu 또는 nef 유전자의 결실은 침팬지 PBMC, 인간 PBMC 또는 B/T 하이브리드 세포주 CEMx174에서 바이러스 복제를 변화시키지 않는 것으로 나타났다 (James, et. al AIDS Res. Human Retrovirus 10 : 343-350 (1994)). 따라서, 프라이머 #1과 #2를 사용한 env의 좌측부의 455 bp 단편의 PCR 증폭 동안, 2개의 정지 코돈이 env 유전자의 시작 코돈 바로 앞에 첨가되어 vpu의 28개 아미노산의 결실을 일으킨다 (프라이머 #2 참조).
II. nef 결실을 함유하는 플라스미드의 구성과정: nef 유전자 코딩 서열은 pNL4-3 프로바이러스 DNA 클론의 8787번 위치에서 출발하여 9407번 위치에서 종결된다. 또한, 2개의 독특한 제한 부위, 즉, env 유전자의 8466번 위치의 BamHI 부위 및 nef 유전자의 8887번 위치의 XhoI 부위가 존재한다. nef 유전자 결실을 일으키기 위해, 플라스미드 HIV-1 MSS (또는 IL-3SS)를 BamHI 및 XhoI로 분해하였다. 생성된 BamHI-XhoI 단편의 421bp를 단리하고, pBSK 벡터의 BamHI-XhoI 부위내로 서브클로닝하였다.
2개의 프라이머는 다음과 같이 설계하였다:
Figure 112007081211565-PCT00014
nef 유전자는 본 발명의 설계에 따라 260개의 아미노산을 엔코딩한다. 2개의 정지 코돈을 XhoI 부위에 삽입하였는데, 이는 단지 33개의 아미노산을 코딩하는 nef를 생성시켰다. PCR 증폭 및 BamHI + XhoI 분해 후, PCR DNA 단편의 이러한 421bp를 BamHI-XhoI pHIV-1-MSS (또는 IL-3SS) 벡터내로 다시 클로닝하였다. 생성된 재조합 플라스미드는 NSS 치환 및 부분적 vpu 및 nef 결실을 함유하며, 이는 백신 시험을 위해 사용된다.
실시예 6 -- 바이러스 생성의 측정
먼저 A3.01 세포를 1x106개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트내로 시딩하고, 10㎍의 프로바이러스 DNA로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 3일째 및 그 후 2일 마다, 배양물을 수거하고, 추가의 감염되지 않은 세포의 첨가없이 세포를 1:2로 신선한 배지내로 분할하였다. 수거된 배양물 상층액을 제시된 각각의 시점에서 풀링시키고, 바이러스 생성의 지표로서 ELISA에 의해 p24의 존재를 분석하였다. NL4-3WT 또는 NL4-3nef- 바이러스로 감염된 세포는 트랜스펙션 후 13일째에 최대 바이러스 생성을 나타내었지만, 세포는 높은 수준의 CPE를 나타내었고 세포수는 급속히 감소 하였으며, 배양은 트랜스펙션 후 17일째에 중지되었다. 그러나, NL4-3SSR 또는 NL4-3nef-/SSR 바이러스로 감염된 세포는 최소의 CPE를 나타내었고, 트랜스펙션 후 29일째까지 지속적으로 감염된 상태로 존재하였는데, 이러한 시점에서 세포는 결국 바이러스 유도된 CPE에 압도되고 배양이 중지되었다. NL4-3WT 또는 NL4-3nef- 바이러스 배양물은 최대 1x102㎍의 p24를 생성시키며, NL4-3SSR 또는 NL4-3nef-/SSR 바이러스는 1회 수거에서 1x106㎍이 넘는 p24를 생성시켰다. 결과는 도 6에 도시되어 있다.
실시예 7 -- 감염도 측정
프로바이러스 DNA의 트랜스펙션 후, 세포를 2일 마다 분할하고, 배양 상층액의 샘플을 수거하여 p24 ELISA에 의해 분석함으로써 바이러스 복제를 모니터하였다. 생성되는 바이러스 입자의 감염도를 평가하기 위해, 샘플을 A3.01 및 H9 세포 둘 모두에서 트랜스펙션 후 8일째에 MAGI 검정에 의해 추가로 분석하고, 결과를 표준화하여 p24 단백질 ng 당 존재하는 감염성 바이러스 입자의 수를 나타내었다. 상기 제시된 바와 같이, Env 신호 서열 치환 돌연변이체 (NL4-3SSR) 및 nef-결실/Env 신호 서열 치환 복합 돌연변이체 (NL4-3nef-/SSR)는 둘 모두 실질적으로 감소된 감염도를 지니는데, 치환 돌연변이체는 야생형 바이러스 (NL4-3WT)에 비해 약 2배 내지 3배 덜 감염성이고, 복합 돌연변이체는 야생형에 비해 50배나 감소된 감염도를 나타낸다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.
실시예 8 -- 세포병변 효과의 유도
H9 세포를 지시된 각각의 바이러스를 사용하여 3의 감염 배수로 감염시켰다. 감염을 진행시키며, 배양물을 2일 마다 1:2로 분할하였다. 감염 후 6일째에, 세포를 광학 현미경에 의해 검사하고, 세포병변 효과 (CPE)를 관찰하였다 (도 8 참조). 제시된 바와 같이, NL4-3WT 또는 NL4-3nef- 바이러스 (둘 모두 천연 Env 신호 서열을 함유함)로 감염된 H9 세포는 세포 사멸 및 거대 신시티아(syncitia)의 형성 (흑색 화살표)을 포함하는 CPE의 신속한 개시를 나타내었다. 대조적으로, NL4-3SSR 또는 NL4-3nef-/SSR 바이러스 (천연 Env 신호 서열 대신 멜리틴 신호 서열을 함유함)로 감염된 세포는 활발한 HIV 복제에도 불구하고 CPE의 징후를 거의 나타내지 않았다 (HIV-1 p24 ELISA에 의해 측정됨; 제시되지 않음).
실시예 9 -- gag-NE 키메라 유전자의 구성과정
본 발명자들은 HIV-1의 모든 주요 클레이드로부터 V3 및 C3 서열의 선택에 의해 키메라 gag 유전자를 구성하였다. 본 발명자들은 이러한 다수의 선형 에피토프에 대해 생성된 항체가 본래의 V3 영역과 상호작용할 뿐만 아니라 천연 감염에 의해 생성되었을 수 있는 임의의 부차적 변이체 또는 HIV에 존재하고 개체군 전체에 걸쳐 자연 전파되는 변이체와 상호작용할 수 있다는 가설을 세웠다. gp120의 V3 영역 및 Gag 단백질 둘 모두는 중화 에피토프 (NE) 뿐만 아니라 세포독성 T-림프구 에피토프 (TCE)를 함유한다. 이러한 에피토프는 면역원으로서 독립적으로 작용할 수 있다. 본 발명자들은 다수의 V3 루프 서열을 HIV-2 gag 서열에 결합시켜 서 발현을 위한 커다란 항원을 제공하고, 바이러스 유사 입자 (VLP)를 형성하여 세포독성 이펙터의 유도를 위한 잠재력을 증가시켰다. 다수의 V3 에피토프를 결합시키는 본 발명자들의 방법은 도 9a 및 9b에 도시되어 있다.
본 발명자들은 gag-V3 및 gag-TCE 키메라 유전자를 Ad5의 Ela 영역내로 삽입시킴으로써 복제 결함 재조합 인간 아데노바이러스 5 (rAd)를 구성하였다. 이러한 재조합 Ad5는 E1a 단백질을 항시적으로 발현하는 인간 2P3 세포에서 증폭시켰다 (실시예 11 참조).
중화 항체는 V3 도메인 뿐만 아니라 HIV-1의 다른 영역에 대해 유도되는 것으로 밝혀졌다 (Luo et al., Virology 179:874, 1990). 흥미롭게도, 다양한 바이러스 단리물의 교차중화(cross-neutralization) 분석은 보존된 중화 패턴이 HIV-1의 아형에 걸쳐서 존재할 수 있음을 제시한다. 예를 들어, HIV-1 감염된 개체의 하나의 유형으로부터의 일부 혈청은 클레이드와 무관하게 모든 HIV-1 아형을 중화시킨다. 이러한 중화의 증거는 보존된 중화 에피토프, 예를 들어 gp41에 존재하는 에피토프 (Muster, et al., J. Virol. 67: 6642, 1993) 또는 gp120의 CD4-결합 부위에 상응하는 에피토프 (Thali, M. et al., J. Virol. 66: 5635, 1992)의 결과이다. HIV-1 변이체의 출현과 관련된 차별적 선택 압력은 장기적 비-진행(non-progression)과 관련되어 있다. 따라서, gp120의 이러한 C3 영역의 존재는 추가의 보호를 제공할 것으로 여겨진다 (Wang, W-K. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6693, 1996) (도 9c 참조).
실시예 10 -- gag-TCE 키메라 유전자의 구성과정
HIV 특이적 CTL은 HIV 감염된 사람에서 면역학적 선택 압력을 나타낼 것으로 생각된다. 그러나, 생체내에서의 바이러스 서열 변화에 대한 이러한 제약사항의 효과에 대한 데이터는 단지 소수만이 이용가능하다. 본 발명자들은 HIV-1 gp120, gp41, Nef, RT 및 Rev의 주요 세포독성 T-세포 에피토프 (TCE)를 선택하였고, 이들을 HIV-1 gag 유전자에 결합시켜서, 재조합 아데노바이러스에 의해 발현될 수 있는 키메라 gag-TCE 유전자를 생성시켰다. 도 10a는 HIV-IHXB2 균주의 gp120으로부터의 2개의 상이한 TCE, Nef로부터의 2개의 상이한 TCE 및 gp41로부터의 하나의 TCE를 사용하여 HIV-1 gag 유전자를 구성하는 것을 도시한다. 또한, 본 발명자들은 HIV-1HXB2로부터의 RT, Tat 및 Rev 단백질의 TCE를 발현하는 또 다른 HIV-1 gag-TCE 키메라 유전자를 구성하였다. 본 발명자들은 HIV/AIDS 백신의 일부로서 이러한 HIV-2 gag-NE 및 HIV-1 gag-TCE를 함유하는 복제 결함 재조합 인간 아데노바이러스 (rAd)를 구성하였다.
실시예 11 -- HIV/AIDS 백신의 일부로서 HIV-2 gag-NE 및 HIV-1 gag-TCE를 함유하는 복제 결함 재조합 아데노바이러스의 생성
본 발명자들은 아데노바이러스 벡터내로 삽입시키기 위해 BamHI 제한 부위에 의해 플랭킹된 HIV-2 gag-NE 및 HIV-1 gag-TCE의 코딩 서열을 함유하는 유전자 카세트의 말단 DNA 서열을 변형시켰다. 아데노바이러스 벡터의 조작을 위해 사용되는 일반적 프로토콜은 이미 공지되어 있다 (Graham, et al., J. Gen. Virol. 36: 59, 1977). 본 발명자들은 그레이엄(Graham)과 동료들에 따른 재조합 아데노바이 러스를 생성시키기 위해 단순화된 시스템을 사용하였다 (He, T.-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 2509, 1998). 이러한 신규한 기술은 진핵 세포가 아니라 세균에서 상동 재조합을 이용하는 최소의 효소적 조작을 필요로 한다. 본 발명자들은 이러한 신규한 방법을 조정하였고, 이것이 재조합 아데노바이러스를 생성시키기 위한 매우 효율적인 시스템임을 발견하였다. 인간 아데노바이러스 (Ad5)의 Ela 영역내에 HIV-2 gag-NE 또는 HIV-1 gag-TCE 키메라 유전자의 삽입물을 지닌 복제 결함 재조합 아데노바이러스 벡터는 본 발명자들이 이전에 사용했던 기술을 사용하여 구성하였다. 본 발명자들은 HIV-2 gag-NE를 지닌 3개의 복제 결함 재조합 아데노바이러스 및 HIV-1 gag-TCE를 지닌 2개의 복제 결함 재조합 아데노바이러스를 성공적으로 생성시켰다. HIV-2 Gag-NE 키메라 단백질의 발현 및 Gag-NE 바이러스 유사 입자의 형성은 항-Gag 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석 및 면역침전에 의해 확인하였다 (Luo, L, Li, Y, and Kang C.Y. Budding and secretion of HIV Gag-Env virus-like particles from recombinant human adenovirus infected cells, Virus Research 92: 75-82, 2003).
인간 아데노바이러스 5의 Ela 영역에 HIV-2 gag-NE 또는 HIV-1 gag-TCE 키메라 유전자를 함유하는 복제 결함 재조합 아데노바이러스는 Ela 단백질을 항시적으로 발현하는 293 세포에서 증식시켰다. 이러한 재조합 아데노바이러스는 293 세포에서 잘 복제되고, CsCl 정제 후 1012개 플라크 형성 단위 (PFU)를 제조하기가 용이하였다.
실시예 12 -- 신규한 프라임-부스트 (Prime-Boost) HIV-1/AIDS 백신의 시험을 위한 선지적 백신접종 프로토콜
이러한 백신 실험을 위한 시험 피검체는 18마리의 수컷 붉은털 원숭이 (Macaca mulatto)이다.
I. 항원 및 애쥬번트: 하기 항원 및 애쥬번트를 사용한다.
1. 전체 비활성화된 바이러스 항원: 유전적으로 변형된 HIV-1 클레이드 B (NL4-3nef-/SSR)을 생성시키고, 정제하고, AT-2 비활성화를 수행한다. 면역화를 위해, 지정된 동물에 500㎕의 PBS 중에 현탁된 500㎍의 항원 (500㎕의 CpG 올리고누클레오티드 (ODN) 애쥬번트로 제형화됨)을 투여한다.
2. 복제 결함 재조합 아데노바이러스 (rAd): 다수의 선택된 중화 및 T-세포 에피토프와 함께 HIV-1 gag 유전자를 발현하는 5개의 재조합 아데노바이러스 벡터의 고역가 스톡(stock)을 제조하고, 정제한다. 면역화를 위해, 지정된 동물에 500㎕의 전체 부피 (500㎕의 애쥬번트로 제형화됨)로 1x109개 pfu의 각각의 재조합 바이러스 (1x109개 x 5개 재조합 바이러스 = 5x109개 pfu)를 투여한다.
3. CpG 올리고데옥시누클레오티드 (ODN) 애쥬번트: 서열 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 26; 변화되기 쉬운 서열)의 정제된 포스포로티오에이트 올리고데옥시누클레오티드를 구입한다. 500㎍의 이러한 ODN을 상기 기재된 각각의 항원으로 제형화시키기 위해 전체 부피 500㎕의 PBS 중에 현탁시킨다.
II. 면역화: 동물을 3개의 군 (군 1 내지 3으로 표시됨)으로 나누는데, 각각의 군에는 총 6마리의 붉은털 원숭이가 포함된다. 접종 시점, 항원/애쥬번트의 유형 및 양, 및 근내 (i.m.) 면역화 경로를 포함하는 각각의 동물 군에 대한 면역화 스케줄은 하기 기재되어 있다.
군 1
0주째 - 500㎕의 전체 비활성화된 바이러스 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
4주째 - 500㎕의 rAd 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
8주째 - 500㎕의 rAd 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
16주째 - 500㎕의 rAd 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
군 2
0주째 - 500㎕의 rAd 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
4주째 - 500㎕의 rAd 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
8주째 - 500㎕의 rAd 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
16주째 - 500㎕의 전체 비활성화된 바이러스 항원과 500㎕의 CpG 애쥬번트 - i.m.
군 3
군 3은 이러한 실험을 위한 비면역화된 대조군으로서 기능한다.
III. 공격(challenge): 면역화 후 24주째에, 모든 동물을 정맥내 주사에 의 해 SHIVSF162-P4의 100 TCID50와 SHIV89.6의 100 TCID50의 혼합물로 공격한다.
IV. 샘플 수거: 면역후 (p.i.) 1, 0, 4, 6, 8, 10, 16, 18 및 20주째에, 혈액을 수거하고, 면역 반응에 대해 분석한다. 공격 후 (p.c.) 1, 2 및 5주째 그리고 그 후 1개월 마다 혈액을 수거하고, 바이러스 로드 및 면역 반응 실험을 위해 저장한다. p.c 24주째에, 동물을 안락사시키고, 혈액 및 조직을 바이러스 로드 및 중화 항체 측정을 위해 수거한다.
V. 면역 반응 분석: 둘 모두의 백신접종에 의해 생성된 면역 반응 및 공격 기간 동안 생성된 면역 반응을 평가하기 위해, 모든 샘플을 하기 항목에 대해 시험한다:
1. 항-HIV 항체 생성: 혈청 샘플을 효소-결합 면역흡수 검정 (ELISA)에 의해 항-HIV-1 Env 및 Gag 항체의 수준에 대해 분석한다.
2. HIV 특이적 T-세포 증식: 전체 비활성화된 HIV-1를 항원 자극물로 사용하여 HIV-1 특이적 T-세포 증식 반응을 측정한다.
3. 세포독성 T-림프구 검정: 항원 자극된 이펙터 PBMC를 HIV-1/SHIV 특이적 세포독성 활성에 대해 평가한다.
VI. 백신접종 분석의 보호 효과: 바이러스 공격에 대한 보호를 제공하는 백신접종 프로토콜의 능력을 평가하기 위해, 공격 후 취해진 모든 샘플을 하기 항목에 대해 추가로 시험한다:
1. 바이러스 로드 (vRNA): 혈장 샘플을 정량적 분지(branched) DNA 검정에 의해 vRNA 수준에 대해 분석한다.
2. CD4:CD8 T-세포비: CD4 및 CD8 T-세포 둘 모두의 수준을 sAIDS에 대한 잠재적 마커로서 공격 후 모니터한다.
3. 항체 중화 검정: 열 비활성화된 혈청 샘플을 공격 바이러스가 sMAGI 리포터 세포주내로 진입하는 것을 억제하는 능력에 대해 시험한다.
4. IFN-γ 분비: IFN-γ 분비 세포의 수를 ELISPOT 검정에 의해 측정한다.
5. 시토카인 생성: 시토카인 mRNA 발현의 유도를 역전사효소 실시간 PCR에 의해 모니터한다. 시토카인 IFN-α, IFN-β, Mx, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12, IL-6, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β 및 MDC의 존재를 평가한다.
8. 균등물
본 발명이 바람직한 실시예로 간주되는 것을 참조로 하여 설명되었지만, 본발명은 개시된 실시예로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 오히려, 본 발명은 첨부된 청구의 범위의 사상 및 범위에 포함되는 다양한 변형 및 균등한 사항을 포함하는 것으로 의도된다.
9. 참조에 의한 포함
본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 개개의 간행물, 특허 또는 특허 출원은 개개 문헌의 전체 내용이 참조에 의해 포함되도록 구체적이고 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 그 전체내용이 참조로 포함된다.
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Claims (21)

  1. SEQ ID NO 3 내지 6으로서 기재된 폴리펩티드 서열, 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 당단백질 120 신호 서열을 지닌 재조합 렌티바이러스로서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개 이하의 양하전된 아미노산을 함유하는 것인 재조합 렌티바이러스.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개의 양하전된 아미노산을 함유하는 재조합 렌티바이러스.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 되는 재조합 렌티바이러스.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 재조합 렌티바이러스.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 되고, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 재조합 렌티바이러스.
  6. SEQ ID NO 3 내지 6으로서 기재된 폴리펩티드 서열, 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 당단백질 120 신호 서열을 지닌 재조합 렌티바이러스를 포함하는 백신으로서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개 이하의 양하전된 아미노산을 함유하는 것인 백신.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개의 양하전된 아미노산을 함유하는 것인 백신.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 된 것인 백신.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 백신.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 되고, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 백신.
  11. 제 6항에 있어서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개의 양하전된 아미노산을 함유하고, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 된 것인 백신.
  12. 제 6항에 있어서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개의 양하전된 아미노산을 함유하고, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 되며, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 백신.
  13. 제 6항에 있어서, 상기 백신이 애쥬번트를 추가로 포함하는 백신.
  14. SEQ ID NO 3 내지 6으로서 기재된 폴리펩티드 서열, 또는 이의 작용성 단편 또는 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 당단백질 120 신호 서열을 지닌 재조합 렌티바이러스를 포함하는 백신의 유효량을 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개 이하의 양하전된 아미노산을 함유하는 것인 렌티바이러스 감염을 예방하거나 치료하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개의 양하전된 아미노산을 함유하는 것인 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 된 것인 방법.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 방법.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 되고, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 방법.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개의 양하전된 아미노산을 함유하고, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 된 것인 방법.
  20. 제 14항에 있어서, 상기 작용성 단편 또는 변이체가 1개의 양하전된 아미노산을 함유하고, 상기 재조합 렌티바이러스가 충분량의 nef 유전자의 결실에 의해 비병원성으로 되며, 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스가 HIV-1인 방법.
  21. 제 14항에 있어서, 상기 백신이 애쥬번트를 추가로 포함하는 것인 방법.
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