CN101884787A

CN101884787A - 猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN101884787A
Application number: CN 201010236634
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 乔荣岑
Original assignee: LUOYANG PULAIKE BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: LUOYANG PULAIKE BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2010-11-17

Abstract

本发明的主要目的在于提供一种PCV2亚单位疫苗及其制备方法，具体地说是，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗。采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac Baculovirus ExpressionSystem)对猪圆环病毒2型的ORF2基因进行全基因扩增，并在5′端引入蜂毒素信号肽核苷酸序列，构建含有蜂毒素信号肽核苷酸序列和PCV2ORF2基因序列的开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞表达出具有高效良好PCV2抗原性的重组ORF2蛋白，制备成含有PCV2重组ORF2蛋白的亚单位疫苗。通过仔猪攻毒试验，验证该亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用。

Description

猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒属的代表种，它是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列的不同，可将PCV分为猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)两个型。PCV1对猪无致病性，为非致病性PCV。PCV2对猪有致病性，可引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)，又称PMWS相关PCV。Hamel等通过对PCV基因组分析，发现PCV1和PCV2均可能含有11个开放阅读框(Openreading frame，ORF)。PCV2阅读框中，ORF1和开放阅读框2(ORF2)为主要阅读框。现已证实ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2全长702bp，编码病毒的主要结构蛋白及病毒核衣壳蛋白(Cap)。PCV2在细胞上的增值滴度很低，很难应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗。新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率并不高；而亚单位疫苗比DNA疫苗有更好的免疫力。

现在已经开发了利用昆虫细胞的一个便利和多用途的杆状病毒载体表达系统(Baculovirus Expression Systems)。杆状病毒的特征是通常包含在包涵体(也称为多角体)的杆状病毒颗粒。杆状病毒科可以分为两个亚科：真杆状病毒，有两个包涵体病毒属，即核多角体病毒(NPV)和颗粒体病毒(GV)；和包括非包涵体病毒的亚科裸杆状病毒。许多蛋白质已经在编码该蛋白质的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。杆状病毒表达系统提供了生产重组蛋白质的有力工具。昆虫细胞的无血清培养技术已经十分成熟，昆虫细胞的微载体培养技术和悬浮培养技术为大规模制备重组蛋白提供了条件。我国每年因猪圆环病毒2型的爆发给我国养猪业带来了巨大的经济损失，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达重组ORF2蛋白，研制出具有良好免疫效果的亚单位疫苗，对于猪圆环病毒相关病毒的防制具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1).克隆猪圆环病毒2型ORF2基因并引入信号肽基因序列，转入转移载体，获得包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的转移载体；

(2).包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒；

(3).重组杆状病毒感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养；

(4).由重组杆状病毒的猪圆环病毒2型重组ORF2基因表达猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，收获和纯化猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白；

(5).利用猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，辅以佐剂，经乳化，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。

优选地，本发明步骤(1)中猪圆环病毒2型ORF2基因序列包含序列表中的SEQ ID NO1。

优选地，本发明步骤(1)中信号肽基因序列包括蜂毒素信号肽核苷酸序列。

优选地，本发明所述的蜂毒素信号肽核苷酸序列包含序列表中的SEQ ID NO2。

优选地，本发明步骤(2)中所述重组猪圆环病毒2型ORF2基因的表达受多角体启动子的控制。

优选地，本发明步骤(4)中所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列包含序列表中的SEQ ID NO3。

优选地，本发明所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白是下面任意一种多肽：

i)选自序列表中SEQ ID NO3序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。

优选地，本发明步骤(5)中所述的佐剂为水性佐剂或油性佐剂。

本发明的另一个方面为使用本发明方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

本发明的另一个方面为使用本发明方法制备的猪圆环病毒2型亚单位疫苗。

优选地，本发明所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗包含至少1微克/头份的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白。

发明效果

(1)目的蛋白表达的高效性：选用蜂毒素分泌信号对目的基因进行分泌表达，使目的蛋白在杆状病毒-昆虫细胞中获得高效表达。

(2)杆状病毒表达系统是目前颇受欢迎的一种表达系统，他可以进行多种翻译后修饰作用，包括糖基化、脂肪酸酰化、氨基末端乙酰化、羧基末端酰胺化和信号肽切割、转运，所表达蛋白在结构和功能上与天然蛋白比较接近。重组杆状病毒感染昆虫细胞表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白进行了多种翻译后加工和修饰作用，具有较高的生物学活性。

(3)生物安全性：杆状病毒具有高度的种属特异性，仅感染昆虫，对脊椎动物无感染性，其表达产物安全可靠。

(4)制备方便，成本低廉：重组杆状病毒感染的昆虫细胞能分泌表达重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白，只需经过超滤纯化、灭活等简单处理程序即可以直接应用于畜禽疾病的临床应用。

(5)疫苗免疫保护效果较好：通过动物试验检测该亚单位疫苗效果，免疫保护率在80％以上。

附图说明

图1为PCR扩增猪圆环病毒2型ORF2序列的结果；

图2为鉴定猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图3为猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白的Western blotting图；

图4为猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白的表达量测定；

图5为重组病毒vBac-P2构建流程图。

具体实施方式

本发明实施例中采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-

Baculovirus Expression System，Invitrogen)对猪圆环病毒2型的ORF2基因进行全基因扩增，并在5′端引入蜂毒素信号肽核苷酸序列，构建含有蜂毒素信号肽核苷酸序列和猪圆环病毒2型ORF2序列的开放阅读框的重组杆状病毒，感染昆虫细胞，表达具有高效猪圆环病毒2型抗原性的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，制备成含有猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白的亚单位疫苗。通过仔猪攻毒试验，验证该亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用。

本发明实施例中利用猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，辅以佐剂，并使用本领域常用的乳化方法，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。其他本领域常用的佐剂，包括油性佐剂或水性佐剂，其他本领域常用的疫苗乳化剂、稳定剂，其他本领域常用的疫苗制备手段，都可利用本发明之PCV2重组ORF2蛋白进行疫苗的制备。

本发明实施例中PCV2重组ORF2蛋白为含序列SEQ ID NO3的多肽；使用本发明之方法还可生产如下重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白：与含序列表中SEQ ID NO3序列的多肽至少80％同源的多肽及含上述多肽的免疫原性部分的多肽。制备上述多肽的实施例方法与过程与本发明实施例相同，下面不再累述。

本发明实施例中优选了疫苗成品PCV2重组ORF2蛋白的含量为0.2微克/头份、1微克/头份、2微克/头份、4微克/头份、8微克/头份、16微克/头份和40微克/头份。根据本发明实施例，当剂量大于0.1微克/头份时即可以对猪产生良好的免疫效果。制备好的疫苗经粘度检测、离心检测、剂型检测、稳定性检测后，各项指标均符合规定。疫苗保存于4℃。每头份为2ml。本发明术语头份的含义为一般情况下，免疫一头牲畜所需的疫苗用量。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1 猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法

1、克隆猪圆环病毒2型ORF2基因并引入蜂毒素信号肽基因序列，转入pMD-18T载体，获得包含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组载体：

首先设计引物Spe-ATG(5′-cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3′)和引物Hind-TAA(5′-gcaagctttattcattaagggttaagttggg-3′)，以保藏号为CGMCC No.2389的PCV2-SH株的基因组DNA为模板，扩增PCV2ORF2基因，并将扩增的ORF2基因克隆入pMD-18T载体中，获得重组载体pT-ORF2。PCR产物大小约730bp，结果见附图1。其中，第1孔为DNA Marker2000；第2孔为PCV2 ORF2扩增产物；第3孔为PCR阴性对照。将PCR产物进行测序，由电泳及测序结果可知，重组载体pT-ORF2含序列表中的SEQ ID NO1序列。

设计四条引物，以pT-ORF2为模板，通过融合PCR方法在ORF2基因序列5`端引入蜂毒素信号肽核苷酸序列和限制性酶SpeⅠ和HindⅢ酶切位点。引物如下：

HBM-F15′-tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt-3′

HBM-R15′-ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3′

HBM-F25′-ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg-3′

HBM-R25′-aaacaagggcaacgttgactaagaatttc-3′

通过SpeⅠ和HindⅢ双酶切带有蜂毒素信号肽核苷酸序列的ORF2序列，并将其克隆入转移载体pFastBac^TM1(Invitrogen)，构成包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的载体pFastBacP2。用PCR扩增并测序，由测序结果可知，重组转移载体pFastBacP2含蜂毒素信号肽核苷酸序列，即含序列表中的SEQ ID NO2序列。

2、包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的转移载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒vBac-P2；

将pFastBacP2转化含有病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DH10Bac(购自Invitrogen公司)，获得重组质粒Bacmid-P2；PCR筛选，提取阳性质粒，制备阳性重组质粒Bacmid-P2DNA。采用Reagent转染Sf9细胞(购自Invitrogen公司)，待细胞出现病变后，进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增，然后通过通用引物M13F和M13R进行PCR验证目的重组ORF2基因。纯化获得重组杆状病毒，命名为vBac-P2，重组病毒构建的过程和方法参见图5。扩增重组杆状病毒vBac-P2作为种毒，通过噬斑法进行效价滴定后于4℃保存备用。

3、重组杆状病毒vBac-P2感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养

将vBac-P2重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen公司)。在含有200～350ml的EXPRESS FIVE SFM培养基的500ml转瓶中无菌悬浮培养High Five^TM细胞，接种细胞密度为0.3～0.6×10⁶个细胞/ml。当细胞密度达到1×10⁶个细胞/ml时，用重组病毒vBac-P2接种各转瓶，接种到各转瓶中的重组杆状病毒具有不同的感染复数(M.O.I.)，分别是0.01、0.1、1。接种重组杆状病毒后，以26～28℃，转速为100rpm，培养4天。

4、重组杆状病毒的猪圆环病毒2型重组ORF2基因表达猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，收获和纯化猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白；

①猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白的表达

在以步骤(3)中所述培养条件培养的High Five^TM细胞培养瓶中，接种后每12小时对各瓶取样，即48h、60h、72h、84h和96h取样。各样品以10,000g离心20分钟，分离上清液和沉淀。上清液通过1μm的滤膜进行过滤，过滤后进行SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计测定上清液中的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白及其含量。

结果见附图4，其中，横坐标表示重组病毒以不同的M.O.I.感染High Five^TM细胞后不同的取样时间点，纵坐标为不同的取样时间点样品中重组蛋白的含量。由结果可知，在重组病毒感染细胞72小时后上清中重组蛋白含量达到60微克/毫升以上。结果说明重组病毒感染细胞后，培养至少72h后回收培养上清，能够显著提高猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白的产率。

②猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白的鉴定：

采用Western blotting鉴定表达的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白。分别收集重组杆状病毒感染的High Five^TM细胞，经3,000r/min离心10min取上清，进行SDS-PAGE电泳，结果见图2；其中，第1孔为蛋白质Marker；第2孔为细胞阴性对照；第3孔为vBac-P2感染48h后收获的培养上清；第4孔为vBac-P2感染72h后收获的培养上清。SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶观察到大小约为28.2KDa的特异性条带，即为重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白。将目的蛋白进行测序，由电泳及测序结果可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列含序列表中的SEQ ID NO3序列。

SDS-PAGE电泳后，再进行转膜，将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，加上针对猪圆环病毒2型ORF2蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的表达。结果见附图3，其中，第1孔为蓝色预染低分子量蛋白质Marker；第2孔为vBac-P2表达蛋白；第3孔为阴性对照。用Westernblotting分析表达的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白。用猪的抗猪圆环病毒2型高免血清对重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白进行检测。结果显示，在硝酸纤维素膜上仅观察到一条分子量大小与预期大小一致的特异性条带，说明表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白能够与猪圆环病毒2型抗体特异性结合，说明重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白具有特异的猪圆环病毒2型免疫原性。

③收获和纯化猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白

将培养物经10000g离心20分钟，分离沉淀和上清液，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，然后通过超滤浓缩纯化，超滤膜孔径为10000(切割分子量)，纯化后的样品溶液经7mM二乙烯亚胺(BEI)灭活重组杆状病毒载体，36～48小时，加入等量的硫代硫酸钠中和。然后通过紫外分光光度计进行蛋白含量测定。

5、利用猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。

准备不同浓度的抗原稀释物，并与油佐剂ISA206佐剂混合乳化。ISA206佐剂经121℃、60min高压湿热灭菌，按照抗原/佐剂体积比例46∶54混合。使用德国产IKA 2000/4型乳化机，先将佐剂加入乳化机料筒内，在搅拌状态下(100r/min)缓缓将抗原水相滴入佐剂中，滴完后，继续搅拌5min。用乳化机5000r/min，循环乳化4min，得到亚单位疫苗成品。

优选地，疫苗成品重组ORF2蛋白的的含量为0.2微克/头份、1微克/头份、2微克/头份、4微克/头份、8微克/头份、16微克/头份和40微克/头份。制备好的疫苗经粘度检测、离心检测、剂型检测、稳定性检测后，各项指标均符合规定。疫苗保存于4℃。每头份为2ml。

本发明方法生产的蛋白抗原还可以与其他的油性佐剂、水性佐剂或其他佐剂混合使用，如本领域常见的白油佐剂、铝胶佐剂、弗氏佐剂等等。

实施例2 PCV2亚单位疫苗的效力检测：

对洛阳某猪场的猪进行主要病原和相关抗体检测，选用10-14日龄的猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒等主要病原阴性猪。

将符合条件的仔猪随机分为9组，每组10头，7组给予包含不同量重组ORF2蛋白的亚单位疫苗(分别包含重组ORF2蛋白0.2微克/头份、1微克/头份、2微克/头份、4微克/头份、8微克/头份、16微克/头份和40微克/头份)，1组做为攻毒对照，另1组做为阴性对照。其中，第1组给予包含重组ORF2蛋白0.2微克/头份的亚单位疫苗；第2组给予包含重组ORF2蛋白1微克/头份的亚单位疫苗；第3组给予包含重组ORF2蛋白2微克/头份的亚单位疫苗；第4组给予包含重组ORF2蛋白4微克/头份的亚单位疫苗；第5组给予包含重组ORF2蛋白8微克/头份的亚单位疫苗；第6组给予包含重组ORF2蛋白16微克/头份的亚单位疫苗；第7组给予包含重组ORF2蛋白40微克/头份的亚单位疫苗；第8组做为攻毒对照组，不给予任何包含重组ORF2蛋白的亚单位疫苗。第1～7组进行两次免疫，间隔2周。在第二次免疫后21天对第1～8组进行病毒攻击，毒株选用PCV2-SH株(CGMCC No.2389)(10^6.0TCID₅₀/ml)，每头猪滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7天分别在两腋下和两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。在第11天和19天腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。攻毒后25天进行剖杀。第9组做为阴性对照组，单独隔离饲养，在第1～8组攻毒后25天进行剖杀。所有猪只在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前收集血样。

在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前对所有猪只收集血样，通过ELISA法进行PCV2血清抗体分析。攻毒后25天剖检全部猪只，观察各组织器官病理变化、拍照记录。符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。A.临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。

结果

本实施例结果如下。

表1是各组试验猪在第1次在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前对所有猪只收集的血样进行ELISA检测血清中PCV2特异性抗体的结果。

表1.各组试验猪PCV2血清抗体分析结果

表2.是各组试验动物在剖杀前观察临床表现和剖杀后进行病理变化检测和淋巴结PCR检测病毒的试验结果。

表2.各组试验动物发病判定结果

结果分析：根据试验动物临床症状、剖检病理变化检测和病原的PCR检测判断结果，其中第8组攻毒对照组仔猪全部发病。第1组试验动物有5只发病，亚单位疫苗保护率为50％，第2组试验动物有1只发病，保护率为90％，第3～7组试验动物均没有发病，保护率均为100％。第2组亚单位疫苗效果明显好于第1组，临床上认为当大约80％或更多的动物被保护时，畜群即获得了保护，可以推断必须包含PCV2重组ORF2蛋白1微克/头份或者更多蛋白的亚单位疫苗可以给动物提供保护，以能有效的保护畜群对抗PCV2。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(3).重组杆状病毒感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中猪圆环病毒2型ORF2基因序列包含序列表中SEQ ID NO1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中信号肽基因序列包括蜂毒素信号肽核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的蜂毒素信号肽核苷酸序列包含序列表中SEQ ID NO2。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中所述重组猪圆环病毒2型ORF2基因的表达受多角体启动子的控制。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列包含序列表中的SEQ IDNO3。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白是下面任意一种多肽：

i)含有序列表中SEQ ID NO3序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中所述的佐剂为水性佐剂或油性佐剂。

9.由权利要求1～7任意一项方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白。

10.由权利要求1～8任意一项方法制备的猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗。

11.根据权利要求10所述的猪圆环病毒2型亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含至少1微克/头份的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白。