KR20070031902A - 이매티닙을 사용하는 치료에 대하여 감수성인아교모세포종의 서브세트의 확인 및 특성화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제공된 유전자 표지를 사용하여 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하는 방법, 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 반응으로 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하는 방법, 및 세포 증식성 질환을 앓으면서 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 포유 동물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 제공된 유전자 표지를 사용하여 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하는 방법, 하나 이상의 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하는 방법, 및 세포 증식성 질환을 앓으면서 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 포유 동물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
신경교 종양은 세계 보건 기구의 기준에 따라 4개의 등급으로 등급화된다. 등급화는 핵 비정형성, 유사분열 활성도, 혈관 혈전증, 미세혈관 증식 및 괴사와 같은 조직학적 기준에 기초한다. II 등급의 종양은 세포 타입의 기원에 따라 별아교세포종, 희소돌기아교세포종 및 혼합 희돌기교별세포종으로 유전적으로 분류된다. III 등급은 역형성 별아교세포종 및 역형성 희소돌기아교세포종으로 분류된다. 최고 형태인 IV 등급은 다형성 통상 아교모세포종 (GBM)으로서 공지되어 있다.
따라서, 아교모세포종 (GBM)은 가장 보편화된 성인의 악성 뇌종양이다. 현재, 치료법은 수술, 방사선 요법 및 화학요법에 기초한다. 그러나, 상기 치료 요법들을 사용할 경우, 반응은 극도로 열악하다. GBM 환자의 2년간의 생존율은 7.5% 미만이다 (Maher et al., 2001). 그러므로, 신규한 치료 전략법에 대한 확인이 고도로 보장받고 있다.
질환의 임상적 경과 및 유전자 변형의 특성화에 기초하여, GBM은 광범위하게 원발성 및 속발성 GBM으로 분류되었다 (Maher et al., 2002). 원발성 GBM들은 돌연변이적으로 변형된 EGF 수용체의 증식과 관련이 있는 반면, 속발성 GBM들은 p53 돌연변이화 및 PDGF 및 PDGF 수용체의 과다발현에 의해 특성화된다. 원발성 GBM들과 비교하여 속발성 GBM들은 더욱 어린 환자에서 발생한다. 또한, 최근 연구를 통해서 염색체 12q13-14상의 유전자의 과다발현에 의해 특성화되는 속발성 GBM들중에서 신규한 서브세트(subset)가 확인되었다 (Mischel et al., 2003).
GBM의 서브세트에서 PDGF 및 PDGF 수용체의 복합적인 발현은 GBM 성장에서 자가분비의 PDGF 수용체의 신호화(signaling)의 기능 역할에 양립한다. 상기 개념은 실험적 접근법에 의해 입증될 수 있다. 첫째로, 마우스의 뇌에서 PDGF가 과다생산된 후 GBM-양 종양이 마우스에서 유도될 수 있다 (Dai et al., 2001; Uhrbom et al., 1998). 두번째로, 상이한 타입의 PDGF 수용체 저해제를 사용한 실험상의 치료법 연구에서 GBM 유래된 세포주의 성장은 PDGF 수용체 신호화를 저지시킴으로써 차단될 수 있다는 것이 입증되었다 (Kilic et al., 2000; Shamah et al., 1993; Strawn et al., 1994).
화합물(I)과 같이 임상적으로 유용한 PDGF 수용체 길항제의 유용성을 통해 종양에서 PDGF 수용체 신호화를 저지시킴으로써 치료학적 효능을 얻을 수 있을 것이라는 가능성이 입증되었다 ((Pietras et al., 2003) 참조). 화합물(I)은 PDGF 수용체 외에도, c-Kit, c-Abl, Bcr-Abl 및 Arg의 티로신 키나제 활성 또한 차단하되, 경구적으로 이용될 수 있는 티로신 키나제 저해제이다 ((Capdeville et al., 2002) 참조). 각각 Bcr-Abl 및 c-Kit의 이상과 관련된 CML 및 GIST을 앓는 환자에 대한 연구를 통해 화합물(I)의 임상적 유용성이 잘 입증되었다 (Demetri et al., 2002; O'Brien et al., 2003).
상기 언급한 바와 같이, 현재까지 GBM의 만족할 만한 치료법이 존재하지 않았기 때문에 GBM을 앓되, 더욱 일반적으로는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물, 바람직하게 인간을 성공적으로 치료하는 신규한 치료학적 전략법을 밝혀내는 것이 요구되고 있다.
본 원에서 사용되는 바, "포유 동물"은 인간을 포함하는 온혈 포유 동물이다.
본 발명에 따라 "생물학적 샘플"은 조직, 세포, 혈장, 혈청, 세포 또는 조직 분해물, 및 바람직하게 종양 조직을 포함하여, 포유 동물의 신체로부터 분리된 임의의 생물학적 물질로부터 수득된 포유 동물의 샘플이다. 상기의 샘플은 예로서, 생검에 의해 수득할 수 있다.
본 원에서의 표현인 "혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 수용체 길항제"는 PDGF 수용체 신호화를 차단하는 임의의 제제, 예로서, PDGF 리간드 또는 수용체를 표적하는 항체, 수용체와 PDGF의 결합을 방해하는 재조합 형태의 가용성 수용체 또는 압타머, 및 PDGF 수용체 키나제 활성을 직접 저지하는 LMW 화합물, 예로서, 화합물(I) (하기 참조) 및 작용 기작이 유사한 다른 시약, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 바람직하게, 본 발명의 작용에 유용한 PDGF 수용체 길항제는 하기의 화합물(I), 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
표현 "약제학적으로 허용가능한"은 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 생물학적이지도, 다르게는, 바람직하며, 포유 동물, 바람직하게 인간의 약제학적 용도로 허용가능한 것을 포함하는 약제학적 조성물을 제조함에 유용하다는 것을 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은 특정 화합물 (예로서, 화합물(I) 또는 다른 PDGF 수용체 길항제)의 유리 산 및 염기의 생물학적 유효성을 유지하고 생물학적이지도, 다르게는, 바람직한 염을 의미하고자 한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예로서 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 디하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포름에이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피오네이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세베케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, γ-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄-설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 및 만델레이트를 포함한다.
무기산, 예로서, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 또는 유기산, 예로서, 아세트산, 말레산, 숙신산, 만델산, 푸마르산, 말론산, 피브루산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 피라노시딜산, 예로서, 글루쿠론산 또는 갈락투론산, 알파-하이드록시 산, 예로서, 시트르산 또는 타르타르산, 아미노산, 예로서, 아스파르트산 또는 글루타민산, 방향족 산, 예로서, 벤조산 또는 신남산, 설폰산, 예로서, p-톨루엔설폰산 또는 에탄설폰산 등을 사용하여 PDGF 수용체 길항제 예로서, 화합물(I)의 유리 염기로 처리하는 것을 포함하는, 본 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해 원하는 염을 제조할 수 있다.
고체인 화합물, 염, 또는 용매화물인 경우, 화합물, 염, 및 용매화물은 상이한 결정 형태로 존재할 수 있고, 이들 모두를 본 발명 및 특정 화학식의 범주내 포함시키고자 한다는 것을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다.
본 원에서 "약제학적 조성물"은 동의어 "약제학적 제제" 또는 "약물"로서도 언급된다.
화합물(I), 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 PDGF 수용체 길항제는 본 분야의 기술자에게 적절하다고 인식될 수 있는 임의의 약제학적 제형의 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 적절한 약제학적 제형으로서 고형, 반고형, 액상 또는 동결건조된 제형, 예로서, 정제, 분제, 캡슐제, 좌제, 현탁제, 리포좀, 및 에어로졸을 포함한다. 또한, 약제학적 조성물은 적절한 부형제, 희석제, 비히클 및 캐리어, 및 사용 용도 또는 투여 방식에 따라 다른 약제학적 활성제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물의 적절한 약제학적 제형을 제조하는 허용가능한 방법은 본 분야의 기술자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 경구, 비경구, 국소, 질내, 비내, 기관지내, 안내, 귀내 및/또는 직장 투여용의 바람직한 제품을 수득하기 위해 정제 형태를 필요로 할 경우에는 적절하게 성분을 혼합하고, 과립화시키고 압착시키거나, 혼합하고, 충진시키고 용해시키는 단계를 포함하는 약제학적 약사의 통상의 기술에 따라 약제학적 제제를 제조할 수 있다.
고형 또는 액상의 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 희석제, 비히클, 또는 부형제를 약제학적 조성물에 사용할 수 있다. 고형 캐리어의 예로서 전분, 락토스, 황산칼슘 이수화물, 백토, 수크로스, 활석, 젤라틴, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 및 스테아르산을 포함한다. 액상 캐리어의 예로서, 시럽, 땅콩유, 올리브유, 식염수, 및 물을 포함한다. 캐리어 또는 희석제로서 적절한 서방성(prolonged-release) 물질, 예로서, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트만을 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 액상 캐리어를 사용할 경우, 제제는 시럽, 엘릭시르, 유제, 연성 젤라틴 캡슐제, 멸균 주사용수 (예로서, 액제), 또는 불용성 또는 수용성 액상 현탁제 형태일 수 있다.
PDGF 수용체 길항제, 특히 화합물(I), 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 용매화물의 투여는 본 분야의 기술자에게 이용될 수 있는 일반적으로 허용되는 임의의 투여 방식에 따라 실시할 수 있다. 적절한 투여 방식의 일례로서 경구, 비강, 비경구, 국소, 경피, 및 직장 투여를 포함한다.
1회 투여분의 약제학적 조성물은 적어도 치료학적 유효량의 활성 화합물 (예로서, 화합물(I) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물)을 함유하고, 바람직하게는 하나 이상의 약제학적 제형 단위로 구성된다. 국소적으로, 예를 들면, 연고제 또는 크림제로서; 경구, 직장으로, 예를 들면, 좌제로서; 주사에 의한 비경구적으로; 또는 질내, 비강내, 기관지내, 귀내, 또는 안내 주입에 의해 연속적으로 투여하는 것을 포함하는, 임의로 공지되거나 적절한, 투여량의 투여 방법에 의해 치료를 필요로 하는 포유 동물, 바람직하게 인간 환자에게 선택된 투여량으로 투여할 수 있다.
"치료학적 유효량"은 그를 필요로 하는 포유 동물에게 투여할 때, 세포 증식성 질환의 치료에 효능을 발휘하기에 충분한 활성제의 양을 의미하고자 한다. 치료학적으로 유효한 화합물의 일정량은 예로서, 특정 화합물, 질환 상태 및 그의 중증도, 그를 필요로 하는 포유 동물의 정체성과 같은 인자에 따라 달라질 수 있고, 상기 양은 본 분야의 기술자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다.
질환 상태의 "치료" 또는 "치료법"은 :
(1) 질환을 예방하는 것, 즉, 질환 상태에 노출될 수 있거나 상기 질환에 걸리기 쉽지만, 아직 질환 상태의 증상을 경험하지 못했거나 그러한 증상을 나타내지 않은 포유 동물, 바람직하게 인간에서 질환 상태의 임상적 증상이 발병하지 못하도록 하는 것;
(2) 질환 상태를 저해하는 것, 즉, 질환 상태 또는 그의 임상적 증상의 발생을 저지시키는 것; 또는
(3) 질환 상태를 완화시키는 것, 즉, 질환 상태 또는 그의 임상적 증상을 일시적으로 또는 지속적으로 퇴행시키는 것을 포함한다.
(4)
상기에서 사용된 "질환 상태"는 지정된 세포 타입의 축적을 암시하는 세포 증식성 질환을 의미하고, 모든 종양, 암, 암종, 육종, 림프종, 모세포종 등을 포함한다. 바람직하게, 세포 증식성 질환은 아교모세포종이다.
용어 "유전자 표지", "생체 표지", "표지", 및 "특성(feature)"은 동의어이고 본 원에서 상호교환적으로 사용된다.
화합물(I)은 하기 화학식을 갖는 4-(4-메틸피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐]-벤즈아미드이다:
화합물(I) 유리 염기, 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 그의 제조법은 본 원에서 참고 문헌으로서 인용되고 있는, 등록된 유럽 특허 EP 0564409에 기술되어 있다. 화합물(I) 유리 염기는 활성 부위가 일치한다. 화합물(I)은 혈소판-유래 성장 인자 수용체 알파 및 베타 (PDGFRα 및 β), Bcr-Abl 및 c-kit 티로신 키나제의 저해제이다.
이하, 염(I)로서 언급되는 화합물(I)의 모노메탄설폰산 부가염, 및 그의 바람직한 결정형, 예로서, 베타 결정형은 본 원에서 참고 문헌으로서 인용되고 있는 등록된 유럽 특허 EP 0998473에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명의 제 1의 측면은 적어도
a) 포유 동물로부터 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개의 유전자 표지의 샘플에서 발현 및/또는 인산화 프로파일을 측정하는 것을 포함하는, 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하는 방법에 관한 것이다.
유리하게는, 표 3으로부터 선택된 적어도 단지 3개 내지 5개의 유전자 표지만의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 단계 b)에서 측정한다.
유전자 표지의 발현 수준 및/또는 인산화 상태는 예를 들면, RT-PCR 기술을 사용하는 RNA 발현에 기초하거나, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학법 또는 ELISA (효소면역측정법), 예로서, 면역학적 측정법, 면역침전법 및 전기영동 분석법중 임의의 기술을 사용하는 단백질 발현에 기초하는 임의의 통상적인 기술에 의해 생물학적 샘플에서 분석할 수 있다. 바람직하게, 본 분야의 기술자는 샘플중 유전자 표지의 발현 수준 및/또는 그의 인산화 수준을 측정할 것이다.
예를 들면, 그의 인산화되지 않은 형태, 또는 그의 인산화된 형태, 또는 인산화되지 않은 형태 및 인산화된 형태 둘 모두의 유전자 표지에 대하여 특이적인 항체를 표준 면역학적 측정법에서 사용하여 상기 표지의 발현 및/또는 인산화 수준을 측정할 수 있다. 또한, 예를 들면, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하는 ELISA-타입 분석법, 면역침전-타입 분석법, 통상의 웨스턴 블롯팅 분석법, 및 면역조직화학 분석법을 사용하여 표지의 발현 및/또는 인산화 수준을 측정할 수 있다.
제 2의 측면에 따라, 본 발명은 적어도
a) 포유 동물로부터 생물학적 샘플을 제공하고;
b) 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개의 유전자 표지의 샘플에서 발현 및/또는 인산화 프로파일을 측정하고;
c) 반응성 및 무반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일을 표 3으로부터 산출된 평균 ± 표준 편차와 비교하고;
d) - 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일이 반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 산출된 평균 ± 표준 편차 범위내인 경우, 이때 상기 포유 동물은 당해 치료에 대하여 반응할 것으로 예측하고;
- 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일이 무반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 산출된 평균 ± 표준 편차 범위내인 경우, 이때 상기 포유 동물은 당해 치료에 대하여 반응하지 않을 것으로 예측하며;
- 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일이 반응성 및 무반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 산출된 평균 ± 표준 편차 범위 밖인 경우에는, 당해 치료에 대한 포유 동물의 행동이 결정되지 않는 것으로 포유 동물의 행동을 예측하는 것을 포함하는, 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시태양에서는 표 3으로부터 선택된, 적어도 단지 3개 내지 5개의 유전자 표지만의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 단계 b)에서 측정한다.
제 3의 측면에 따라, 본 발명은 적어도
a) 상기 기술된 방법을 사용하여 포유 동물의 행동을 예측하고;
b) 포유 동물이 반응할 것으로 예측되는 경우, 이때 상기 포유 동물을 선별하는 것을 포함하는, 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
상기 포유 동물은 다양한 목적으로, 예로서, 임상적 시도를 개시하거나, 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 사용하는 의학적 치료법으로 투여받기 위하여 선별될 수 있다.
본 발명의 제 4의 측면은 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개, 바람직하게 3개 내지 5개의 유전자 표지에 대한 cDNA들 및/또는 항체들을 포함하는, 포유 동물의 유전자 표지의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 시험관내에서 분석하기 위한 키트에 관한 것이다.
제 5의 측면으로 본 발명은 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개, 바람직하게 3개 내지 5개의 유전자 표지에 대한 cDNA들 및/또는 항체들을 포함하는, 포유 동물의 유전자 표지의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 시험관내에서 분석하기 위한 마이크로어레이 또는 바이오칩에 관한 것이다.
본 발명의 제 6의 측면은
- 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하기 위한 유전자 표지로서; 및/또는
- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하기 위한 유전자 표지로서; 및/또는
- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물을 선별하기 위한 유전자 표지로서, 표 3으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및/또는 하나 이상의 유전자 산물의 용도에 관한 것이다.
상기와 관련하여, 상기 유전자에 상응하는 cDNA, 및/또는 상기 유전자 산물에 특이적인 항체(들) (그의 인산화된 형태, 또는 그의 인산화되지 않은 형태, 또는 그 둘 모두)가 유리하게 사용된다.
제 7의 측면에 따라 본 발명은
- 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하기 위한; 및/또는
- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하기 위한; 및/또는
- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물을 선별하기 위한, 상기 언급한 키트, 마이크로어레이 또는 바이오칩의 용도에 관한 것이다.
제 8의 측면에 따라 본 발명은 상기 기술한 방법을 사용하여 선별되는 세포 증식성 질환을 앓는 반응성 포유 동물을 치료하기 위한 약물 제조에서 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기술된 방법을 사용하여 선별된 반응성 포유 동물에게 치료학적 유효량의 PDGF 수용체 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 반응성 동물에서 세포 증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시태양으로, PDGF 수용체 길항제는 약제학적 조성물에 포함된다.
본 발명은 제한하는 것은 아니지만, 하기 도면에 의해 설명된다:
도 1.
GBM
배양물의
성장율
및 화합물(I)-감수성
(A) 24-웰 플레이트에 웰당 4000개의 세포를 시딩하고, 4일간 배양한 후 세포 갯수를 측정하여 23개의 GBM 배양물의 성장율을 측정하였다. 값은 배양 기간에 따른 성장 배수로 나타내고 2개의 독립적인 실험으로부터의 평균값으로 나타내었다. (B) 화합물(I)에 대한 감수성을 측정하기 위하여, 가장 느리게 성장하는 7개의 배양물을 제외한 16개의 GBM 배양물 각각의 4000개의 세포를 96-웰 플레이트 웰에 시딩하고 1μM 화합물(I)의 존재 또는 부재하에 4일간 배양하였다. 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 광도계 측정에 의해 배양 종결시의 세포 갯수를 측정하였다. 화합물(I)-감수성은 화합물(I) 처리에 의해 유도된 성장 저해율(%)로서 나타내었다. 표준 편차와 함께 제시된 결과는 각 배양물을 4중으로 분석한 3개의 독립적인 실험으로부터 유도하였다. (C) 성장율과 화합물(I)-감수성 사이의 상관관계는 피어슨 상관계수가 0.39인 산점도(scatter plot)의 결과를 제시함으로써 설명한다.
도 2.
GBM
배양물에서
PDGF
수용체 발현 및 활성화
PDGFRα, PDGFRβ 및 포스포티로신을 인식하는 항체를 사용하여 GBM 배양물로부터의 WGA-분획을 연속적으로 면역블롯팅하여 상이한 세포 배양물에서 PDGFα- 및 β-수용체의 발현 수준 및 활성화 상태를 측정하였다. 수용체를 발현시키는 세포로부터의 샘플을 특이성 대조군으로서, 상이한 필터 사이의 표준화를 위해 사용하였다. (A) GBM 배양물 및 대조군 세포의 면역블롯팅 분석의 대표예. GBM 배양물에서 PDGFα-수용체 (B) 및 PDGFβ-수용체 (C)의 발현. PDGFα-수용체 발현 수준에 따라 세포주를 배열하였다. GBM 배양물 21에서의 발현 수준을 임의로 1로서 세팅하였다. 삽입부는 면역블롯팅 및 mRNA 발현 분석에 의해 측정된 PDGFα- 및 β-수용체의 발현 사이의 상관관계를 나타낸다 (피어슨 상관계수, PDGFα-수용체 r=0.86, PDGFβ-수용체 r=0.52). (D) 포스포-티로신 면역블롯팅에 의해 측정된 PDGFR의 티로신 인산화. PDGFα-수용체 및 PDGFβ-수용체의 복합적 이동 위치에 상응하는 필터의 면적을 분석하였다. 세포주를 B 및 C에서와 같이 배열하였다. GBM 배양물 21에서의 전체 PDGF 수용체 인산화를 임의로 1로서 세팅하였다.
도 3. 화합물(I)-감수성과
PDGFR
상태 사이의 상관관계.
화합물(I) 감수성과 PDGFα-수용체 발현 (좌측 상단 패널), PDGFβ-수용체 발현 (우측 상단 패널), 복합된 PDGFα- 및 β-수용체 발현 (좌측 하단 패널) 및 전체 PDGF 수용체 티로신 인산화 (우측 하단 패널) 사이의 상관관계를 나타낸다. 화합물(I)-감수성 실험에서 실험간 차이가 가장 큰 5개의 GBM 배양물을 제외시킨 후 남아있는 11개의 GBM 배양물에서 분석을 실시하였다.
도 4.
GBM
배양물중
ERK
및
Akt
의 인산화 수준 및 이들 파라미터와 화합물(I) 감수성 또는
PDGF
수용체 상태 사이의 상관관계
p44/42 MAPK, 포스포-p44/42 MAPK Thr202/Tyr204, Akt 및 포스포-Akt Ser473을 인식하는 항체를 사용하는 면역블롯팅에 의해 ERK 및 Akt의 특이 인산화를 측정하였다. ECL 신호(signal)를 측량하고 대조군 분해물을 사용하여 필터 사이의 전달 효율상의 차이에 대하여 표준화하였다. 10개의 GBM 배양물중 ERK (A) 및 Akt (C)의 상대적인 인산화 및 ERK, Akt의 인산화와 화합물(I) 감수성 (B, D, 좌측 상단 패널), PDGF 수용체 발현 (B, D, 우측 상단 패널) 및 PDGF 수용체 인산화 (B, D, 좌측 패널) 사이의 상관관계.
도 5.
Akt
및
ERK
의 인산화에 대한 화합물(I)의 효능 분석, 및 상기 파라미터와 화합물(I) 감수성 및
PDGF
수용체 상태 사이의 상관관계.
처리하지 않는 세포 및 1시간동안 1μM의 화합물(I)과 함께 예비인큐베이션된 세포에서의 ERK 및 Akt 인산화를 비교하여 ERK 및 Akt에서 화합물(I)-유도성 변화를 관찰하였다. 10개의 GBM 배양물중 ERK (A) 및 Akt (C) 인산화에서의 화합물(I)-유도성 변화 및 상기 파라미터와 화합물(I) 감수성 (B, D, 좌측 상단 패널), PDGF 수용체 발현 (B,D, 우측 상단 패널) 및 PDGF 수용체 인산화 (B, D, 좌측 패널) 사이의 상관관계.
도 6. 클러스터링(clustering) 분석법에서 사용된 특성(feature) 선별에 대하여 3개의 상이한 기준을 사용한 23개의
아교모세포종
세포 배양물의 계층적(
Hierarchical
) 클러스터링
(A) ANOVA 시험에서 p-값이 0.05 미만인 88개의 요소를 포함함과 동시에 적어도 3개의 GBM 배양물에서 2배 초과의 상향 조절을 나타내고 적어도 3개의 다른 GBM 배양물에서는 2배의 하향 조절을 나타내는 유전자 목록을 포함하는 피어슨 상관계수에 의한 계층적 클러스터링. (B) ANOVA 시험에서 유의수준을 0.05로 세팅함으로써 수득된 2795 개의 특성 목록을 포함하는 GBM 배양물의 클러스터링. (C) (B)에서와 같이 수득하되, ANOVA 시험에 따른 유의성을 p<0.000000001로 세팅한 311 개의 특성 목록 작성 후의 클러스터링. 어떤 기준을 사용하여 특성 목록이 선별되었는지와는 상관없이 모든 경우에 있어 23개의 GBM 배양물중 17개가 동일한 분포를 나타내는, 즉 GBM 배양물 5, 7, 8 및 11이 항상 함께 클러스터링되어 있는 3개의 주요 클러스터가 형성되어 있음을 설명하기 위하여 색상 부호화(Color coding)를 사용하였다.
도 7.
GBM
배양물의 3개의 하위 군(
subgroup
)을 정의하는 유전자의 클러스터링
특성에 대한 관계도(relationship tree)를 제시하는 피어슨 상관계수에 의해 도 6A에서 설명된 GBM 세포 클러스터에 대하여 사용된 특성을 계측적으로 클러스터링하였다. 상기 클러스터링을 통해 23개의 GBM 배양물에서 발현 패턴상의 유사성에 따라 유전자 군을 분석하였다. 적색 및 녹색은 각각 개체 GBM 배양물에서 유전자의 발현이 높고 낮음을 나타낸다.
도 8. 23개의
GBM
배양물의 생화학적 특성화 후 얻은 결과의 편집, 및 발현 프로파일링
제시한 클러스터링은 ANOVA 시험에서 p-값이 0.05 미만이고 동시에 적어도 3개의 GBM 배양물에서 2배 초과의 상향 조절을 나타내고 적어도 3개의 다른 GBM 배양물에서는 2배의 하향 조절을 나타내는 특성을 선별한 후 수득한 것이다 (도 6A). 성장율에 대한 기재는 도 1A에서와 같고, 갯수는 4일간 배양 기간에 걸친 세포 갯수의 증가 배수를 나타낸다. 화합물(I) 감수성과 관련하여 분석된 16개의 GBM 배양물은 6개의 반응자 (+, 40% 초과의 성장 저해율을 나타냄), 7개의 무반응자 (-; 20% 미만의 성장 저해율을 나타냄) 및 3개의 중간 반응자 (*; 20-40%의 성장 저해율)로 분류되었다. PDGF 수용체 발현 및 인산화에 대하여 분석된 21개의 GBM 배양물은 PDGF 수용체 발현 또는 인산화가 높거나 (+; 10개의 GBM 배양물) 낮은 (-; 11개의 GBM 배양물) 2개의 군으로 분류되었다.
도 9.
리브
-원-아웃(
leave
-
one
-
out
) 시험에서 화합물(I) 반응자 및
무반응
자의 가중-투표(weighted-voting) 분류 실시
분류를 위해 세포주 6, 7, 9 및 31을 반응자로서 선택하고 5, 18, 21, 30, 35 및 38은 무반응자로서 선택하였다. x축은 분류에 사용된 특성의 번호 (1-250)를 기재하고, y축은 리브-원-아웃 시험에서 잘못 분류된 배양물의 분율을 기재하였다.
도 10. 트레이닝 세트(
training
set
)로부터 제외된 5개의
GBM
배양물에 대한 분류자의 실시
10개의 아교모세포종 세포로부터의 잡은 등급별 유전자 목록에 대한 신호에서 상위의 특성으로부터 작성되고 3-5개의 특성으로 구성된 분류자를 사용하여 5개 추가의 GBM 배양물의 반응을 예측하였다. 스테이플 다이어그램(staple diagram)은 도 1B에서 측정된 바와 같은 배양물의 화합물(I) 감수성을 나타낸다. 하단의 각각의 막대는 3, 4, 또는 5개의 특성으로 구성된 특성 목록에 의해 얻은 5개의 GBM 배양물의 분류화를 제시한다. 각각의 세포 배양물에 대하여 상이한 분류자를 사용한 예측에 대한 신뢰도는 신뢰값에 의해 제시된다.
본 발명은 실시예를 포함하는 하기의 실험에 대한 상세한 설명을 참조하여 더욱 잘 이해될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 분야의 기술자는 본 실험에 대한 기술은 제한되지 않고, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않는 한, 다양하게 수정, 치환, 생략, 및 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
I- 재료 및 방법
I- 1 - 조직 배양물 및
GBM
배양물의
성장율
및 화합물(I)- 감수성 측정
원발성 GBM 배양물의 확립은 표준 방법에 따라 실시하였다 (Ponten and Westermark, 1978). 아교모세포종으로부터 유래된 원발성 세포 배양물을 37°에서 5% C02의 대기하에 10% FBS, 10U/ml 페니실린 및 10μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 MEM에서 배양하였다. 성장율을 측정하기 위하여 세포를 24개의 웰 플레이트 (사르스테트(Sarstedt))에 4000개의 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 4일동안 배양한 후, 트립신 분해에 의해 세포를 수거하고 쿨터 세포 계수기(Coulter cell counter)에서 계수하였다. 성장율은 배양 기간동안 세포 갯수의 증가 배수로서 나타내었다. 제시한 데이타는 2개의 독립적인 실험으로부터 유도된 것으로서, 상기 실험에서 각 분석은 2중으로 실시하였다.
I-2 - 화합물(I)에 의해 유도된 성장 저해
화합물(I)은 노바티스 파마슈티칼스(Novartis Pharmaceuticals)로부터 입수하였다. 각 실험을 위해 6mg의 화합물(I)을 10ml PBS에 용해시킨 후, 45㎛ 필터로 멸균 여과하여 새로운 1mM 화합물(I) 원액을 제조하였다. 4일간의 기간동안 성장율이 1.2배를 초과하지 않는 세포 배양물은 화합물(I)에 의해 유도된 성장 저해에 대하여 시험하지 않았다. 세포 성장에 대한 화합물(I)의 효능을 측정하기 위하여 세포를 세포를 96개의 웰 플레이트 (사르스테트)에 웰당 4000개의 세포의 밀도로 시딩하였다. 다음날, 배지를 1μM의 화합물(I)을 포함하거나 포함하지 않는 배지로 교환하였다. 2일후의 배지 교체를 포함하여 4일동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 PBS중 냉 4% 파라포름알데히드 (PFA)에서 30분동안 고정시키고 4% 에탄올중 0.01% 크리스탈 바이올렛으로 30분동안 염색하였다. 수돗물을 사용하여 샘플을 3회에 걸쳐 세척하고 적어도 30분동안 대기 건조시켰다. 염색된 세포를 100㎕의 1% SDS에 용해시키고 600nm 필터를 사용하여 바이오메크(Biomek) 1000 (베크맨(Beckman)) 광학 기기로 흡광도를 측량하였다.
화합물(I)의 효능은 4일간의 처리 기간동안 세포 갯수에서 증가의 하락율(%)로서 나타내었고, 따라서, 100%의 성장 하락율은 배양 기간의 종결 및 개시에서의 세포 갯수가 동일한 상황에 상응한다. 양성 대조군으로서 각 실험은 앞서 화합물(I)-감수성 성장을 나타내는 세포를 포함하였다 (Sjoblom et al., 2001). 각 GBM 배양물에 대한 화합물(I)의 효능에 대하여 제시된 데이타는 2중/4중으로 실시된 2개 또는 3개의 독립된 분석으로부터 유도된다.
I-3 -
PDGF
수용체,
ERK
및
Akt
의 발현 및 인산화 상태의 분석을 위한 대조군 세포
분해물의
제조
PDGF α- 또는 β-수용체로 안정적으로 형질감염된 돼지의 대동맥 내피 세포 (각각 PAE/Rα 및 PAE/Rβ 세포 (Claesson-Welsh et al., 1988; Claesson-Welsh et al., 1989)를 표준 배양 조건을 사용하여 10cm 디쉬 (사르스테트)에 고밀도 시딩하였다. 16시간 후, 0.1% FBS를 함유하는 배지로 교환하여 24시간동안 세포에 혈청을 결핍시켰다. 이어서, 0.1% FBS를 함유하는 배지중에서 100ng/ml PDGF-BB를 사용하거나 사용하지 않고 37°에서 5분동안 세포를 처리하였다. 빙냉 PBS로 세척한 후, 0.5% Triton X-100, 0.5% 디옥시콜산, 150mM NaCl, 20mM Tris pH 7.5, 10mM EDTA, 30mM 테트라-소듐 디포스페이트 데카하이드레이트, 1% 트라시롤, 0.5% 페닐메틸 설포닐 플루오라이드 (PMSF) 및 0.5% NaV03으로 구성된 1ml의 분해 완충액중 10분동안 세포를 얼음상에서 분해하였다. 15000 x g에서 15분동안 원심분리한 후, 세포 분해물을 수거하고 단백질 농도를 BCA 단백질 에세이 시약 A 키트 (피어스(Pierce))를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도를 표준화한 후, 4°에서 16시간동안 밀 배아 응집소 (WGA)-세파로스와 함께 인큐베이션시켜 당단백질을 분리하였다. 세포를 15000 x g에서 15분동안 원심분리하여 WGA-세파로스 비드를 펠릿화하였다. 상등액을 제거하고 ERK 및 Akt 분석법을 위한 대조군으로서 사용하였다. 0.5% Triton X-100, 0.5% 디옥시콜산, 500mM NaCl, 20mM Tris pH 7.5, 10mM EDTA, 30mM 테트라-소듐 디포스페이트 데카하이드레이트, 1% 트라시롤, 0.5% PMSF 및 0.5% NaV03으로 구성된 1ml의 고 염 분해 완충액을 사용하여 3회에 걸쳐 WGA 비드를 세척하였다. 세포 분해물-상등액 또는 당단백질의 WGA-세파로스 분획을 램나이(Laemmli) 완충액 (0.0625M Tris-HCl, 10% 글리세롤, 2% SDS, 5% 베타-머캅토에탄올, 0.0125% 브로모페놀 블루)과 혼합하고, 5분동안 95°로 가열하고 -20°에서 저장하였다.
I- 4 -
PDGF
수용체 발현 및 인산화의 분석
10% FCS로 보충된 배지에 저장된 서브융합된(subconfluent) 배양물로부터 유래된, 대략 500,000개의 GBM 세포로부터의 세포 분해물을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 표준화된 단백질 함량을 갖는 세포 분해물로부터 WGA-분획을 상기 기술된 바와 같이 분리하였다.
샘플을 7% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE 시켰다. 자극시키지 않거나 PDGF-BB-자극시킨 PAE/Rα 및 PAE/Rβ 세포로부터의 대조군 샘플을 각 겔상에 로딩하였다. 이어서, 단백질을 하이드로본드-C-엑스트라(Hydrobond-C-Extra) 필터 (아머샴 라이프 사이언스(Amersham Life Science))에 전기영동으로 이동시켰다. PDGFRβ의 검출을 위해 5% BSA를 함유하는 TBS에서 1시간동안 필터를 차단시킨 후, TTBS (10mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 0.02% Tween-20)중 1μg/ml 958 (산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnologies))을 포함하는 일차 PDGFRβ 항체 용액과 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. 10분간 3회에 걸쳐 세척한 후, 필터를 1:25000로 희석된 홍당무 과산화효소 커플링된 당나귀 항-래빗 항체 (아머샴 라이프 사이언스)와 함께 1시간동안 인큐베이션시키고 TTBS에서 3회에 걸쳐 세척하였다. 인텔리전트 다크박스 II(Intelligent Darkbox II) 디지털 스캐너 (후지필름(FUJIFILM))로 제조사의 설명에 따라 루미-라이트 플러스 웨스턴 블롯팅(Lumi-Light plus Western blotting) 기질 (로세(Roche))을 사용하여 증강 화학발광에 의해 항원을 검출하였다. 검출한 후, 50°에서 30분동안 박리 완충액 (2% SDS, 62.5mM Tris HCl pH 6.7 및 100mM 베타-머캅토에탄올)중에서 필터를 박리시키고 1회에 걸쳐 TTBS에서 세척하고 5% BSA를 함유하는 TBS중에서 1시간동안 차단시켰다. PDGFRα의 검출을 위해 필터를 TTBS중에서 1μg/ml PDGFRα 항체 338 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)로 재프로브(re-probe)시키고 밤새도록 인큐베이션시켰다. 현상 및 검출은 상기 기술된 바와 같이 실시하였다. 인산화된 PDGFR의 검출을 위해 필터를 TTBS중에서 1μg/ml 포스포티로신 특이 항체 PY99 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)로 세번째 재프로브시키고 밤새도록 인큐베이션시켰다. 2차 항체로서 TTBS중 1:50000로 희석된 홍당무 과산화효소 커플링된 양 항-마우스 항체 (아머샴 라이프 사이언스)를 사용하는 것을 제외하고 현상 및 검출은 상기 기술된 바와 같이 실시하였다.
AIDA 소프트웨어 버전 3.10.039 (후지필름)를 사용하여 수용체 발현 및 인산화를 측량하였다. GBM 배양물로부터의 값과 대조군 샘플로부터의 값을 관련시켜 전달 효율상에 있어 필터간의 차이를 표준화시켰다. GBM 배양물 21중 PDGFRα 및 PDGFR 발현 수준, 및 수용체 인산화를 임의로 값 1로서 지정하였다.
I- 5 - 화합물(I)의 부재 또는 존재하에 배양된
GBM
배양물중의
Akt
및
ERK
발현 및 인산화 분석
아교모세포종 세포 배양물을 12-웰 플레이트 웰 (팔콘(Falcon))에서 융합시까지 플레이팅시켰다. 다음날, 세포를 처리하지 않고 남겨두거나 1시간동안 1μM의 화합물(I)을 사용하여 처리하였다. 세포 분해물을 상기 기술한 바와 같이 제조하였다.
표준화된 단백질 함량을 갖는 샘플을 12% 겔을 사용하여 SDS-PAGE 시켰다. 자극시키지 않거나 PDGF-BB-자극시킨 PAE/Rβ 세포로부터의 대조군 샘플을 각 겔상에 로딩하였다. 샘플을 하이드로본드-C-엑스트라 필터 (아머샴 라이프 사이언스)에 전기영동으로 이동시켰다. 인산화된 형태의 ERK 및 Akt를 검출하기 위하여 1시간동안 5% BSA를 함유하는 Tris 완충처리된 염수 pH 7.6 (TBS), 0.137 M NaCl 및 0.0035 M Tris-HCl에서 필터를 차단시키고 0.001% Tween-20을 포함하는 TBS (TTBS)중 1μg/ml 항 포스포-p44/42 MAPK Thr202/Tyr204 (셀 시그날링 테크놀러지(Cell Signaling Technology)) 또는 1μg/ml 항 포스포-Akt Ser473 (셀 시그날링 테크놀러지)과 함께 밤새도록 인큐베이션시켰다. TTBS중에서 10분동안 3회에 걸쳐 세척한 후, 1:25000로 희석된 홍당무 과산화효소 커플링된 양 항-래빗 항체 (아머샴 라이프 사이언스)와 함께 1시간동안 필터를 인큐베이션시키고 TTBS에서 10분동안 3회에 걸쳐 세척하였다. 인텔리전트 다크박스 II 디지털 스캐너 (후지필름)로 제조사의 설명에 따라 루미-라이트 플러스 웨스턴 블롯팅 기질 (로세)을 사용하여 증강 화학발광에 의해 항원을 검출하였다. 검출한 후, 필터를 10분동안 0.4M NaOH에서 박리시키고 TTBS에서 1회에 걸쳐 세척하고 5% BSA를 함유하는 TBS에서 1시간동안 차단하였다. ERK 및 Akt 발현의 측정을 위해 밤새도록 TTBS에서 1μg/ml 항 p44/42 MAPK (셀 시그날링 테크놀러지) 및 1μg/ml 항 Akt (셀 시그날링 테크놀러지)로 필터를 재프로브시켰다. 현상 및 검출은 상기 기술된 바와 같이 실시하였다. AIDA 소프트웨어 버전 3.10.039 (후지필름)을 사용하여 값을 측량하였다.
PAE/Rβ 세포로부터의 참고 샘플을 사용하여 상이한 GBM 배양물중 ERK 및 Akt의 상대적인 발현 및 인산화를 측정하였다. 화합물(I) 처리에 대한 반응은 ERK 및 Akt의 특이적인 인산화에서 배수 변화로서 나타내었다.
I- 6 - 유전자 발현 분석법을 위한
RNA
추출
RNAeasy 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 각 23개의 GBM 배양물중 하나의 저융합된(subconfluent) 75cm 배양물 디수로부터 RNA를 추출하였다. RNA 양을 분광광도분석으로 평가하여 상이한 배양물로부터 10-100μg의 RNA의 수율을 나타내었다. 아가로스 겔 전기영동법에 의해 RNA의 구조적 완전도(integrity)를 확인하였다.
I- 7 - 경쟁적인
혼성화를
위한
RNA
의 증폭 및 표지화
일부 수정한 선형 증폭 (Van Gelder et al., 1990)을 위해 각 세포주로부터의 5μg의 RNA를 사용하였다. 간단하게, 1시간동안 42°에서 5μg의 RNA, 1㎕의 박테리아 RNA 칵테일, 1㎕의 dT-T7 프라이머 (1μg/ml, 서열번호 1: AAA CGA CGG CCA GTG AAT TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CGC TTT TTT TTT TTT TTT), 4㎕의 5X 슈퍼스크립트 II(Superscript II) 반응 완충액 (인비트로겐(Invitrogen)), 2㎕의 DTT (인비트로겐), 1㎕의 울트라푸어(Ultrapure) dNTP 믹스 (클론테크(Clontech)), 1㎕의 RNAsin (앰비온), 1㎕의 주형 스위치 올리고 프라이머 (1μg/ml, 서열번호 2: AAA CAG TGG TAT CAA CGC AGA GTA CGC GGG) 및 2㎕의 슈퍼스크립트 II (인비트로겐)의 혼합물중에서 cDNA를 역전사시켰다. 2차 스트랜드 합성을 위해 106㎕의 물, 15㎕의 어드밴티지(Advantage) 10X PCR 완충액 (클론테크), 3㎕의 울트라푸어 dNTP 믹스, 1㎕의 RNase H (프로메가(Promega)) 및 3㎕의 cDNA 폴리머라제 (클론테크)를 가하였다. 이어서, RNase H 분해를 위해 2분동안 37°에서 샘플을 PCR 기기 (어플라이드 바이오9시스템(Applied Bio9systems))에서 인큐베이션시켰다. 연속하여 샘플을 변성시키기 위해 3분동안 94°에서 인큐베이션시키고, 프라이머 어닐링을 위해 3분동안 65°에서 인큐베이션시키고 cDNA 폴리머라제에 의해 연장시키기 위해 75°에서 인큐베이션시켰다. 7.5㎕의 1M NaOH 및 2mM EDTA을 첨가하여 반응을 종결시키고 10분동안 65°에서 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물을 350㎕의 물 및 500㎕의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 25:24:1 (시그마(Sigma))로 페놀 추출에 의해 세정하고, 마이크로콘(Microcon) YM-100 원심분리 필터에서 500㎕의 물을 사용하여 3회에 걸쳐 세척하고 마지막으로 16㎕의 용량으로 농축시켰다. 시험관내 전사 키트 (앰비온)를 사용하여 시험관내 전사에 의해 안티-센스 RNA를 생성하였다. 상기 기술한 바와 같이, 슈퍼스크립트 II 반응에서 안티-센스 RNA로부터 cDNA를 역전사시킨 후, DNA 폴리머라제 반응에서 더블 스트랜드 DNA를 생성시켰다. 증폭 제 2단계에서 UTP 뉴클레오티드 믹스를 1:3의 UTP Cy-염료-UTP 믹스 (앰비온)으로 일부 치환하였다. 동시에, 모든 배양물로부터 수득한 동량의 RNA로 구성된 풀(pool)을 증폭시켜 추후 혼성화 실험에서 참조로서 사용하였다.
I- 8- 센스
cDNA
칩에 대한
Cy
-염료-
표지된
안티
-센스
RNA
의
혼성화
풀링된 배양물의 참조 샘플과 함께, 이중 염료-교환에 의해 4중으로 각 세포 배양물을 혼성화시켰다. 각각의 혼성화를 위해 66㎕의 용량중 4μg의 표지된 샘플 및 4μg의 표지된 풀을 4㎕의 cotDNA (1mμg/ml, 인비트로겐) , 4㎕의 폴리아데닐산 (2μg/ml, 시그마), 8㎕의 70% 에탄올 및 7㎕의 3M 아세트산나트륨 pH 5.2와 혼합하였다. 침전시킨 후, 30분동안 -70°에서 인큐베이션시켜 샘플을 20분동안 4°에서 15000 x g으로 원심분리시켰다. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 60분동안 대기건조시키고 8㎕의 물 및 40㎕의 혼성화 용액 (5 x SSC, 6 x 덴하트 용액(Denhardt's solution), 60mM Tris-HCl pH 7.6, 0.12% 사코실(sarkosyl), 48% 포름아미드, 세균 여과됨)에 용해시키고, 5분동안 100°로 가열시키고 실온으로 냉각시켰다. 샘플을 예비-냉각된 마이크로어레이 칩 (더 웰컴 트러스트 상거 인스티튜트(The Welcome Trust Sanger Institute), 휴먼 버전 1.2.1, 약 6000개의 개별 유전자에 상응하는 대략 10000개의 요소를 포함, http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/)상에 놓고 커버 글래스로 덮고 47°에서 16시간동안 40㎕의 40% 포름아미드 및 2 x SSC를 포함하는 코닝(Corning) 혼성화 챔버에서 47°에서 인큐베이션시켰다. 칩을 5분동안 2 x SSC에서 1회, 30분동안 0.1 x SSC 및 0.1% SDS에서 3회 및 10분동안 0.1 x SSC에서 1회 세척하였다. 최종적으로 2분동안 1000rpm에서 원심분리하여 칩을 건조시켰다.
I- 9 - 칩의 어레이 스캐닝 및
데이타
추출
스캔어레이(ScannArray) 소프트웨어 버전 3.1 (패커드바이오칩 테크놀로지(PackardBioChip Technologies))를 사용하는 스캔어레이(ScanArray) 5000 (GSI 루모닉스(GSI Lumonics))로 칩을 스캐닝하였다. 퀀트어레이(QuantArray) 소프트웨어 버전 3.0.0.0 (패커드바이오칩 테크놀로지)를 사용하여 발현 강도 값을 측량하였다. 신뢰할 수 없는 스팟은 수동으로 신호를 표시하고 신호는 히스토그램 방법에 의해 측량하였다.
I-10 - 계층적 클러스터링
데이타를 진스프링(GeneSpring)으로 로딩한 후 로웨스(LOWESS)로 표준화시켰다. 분산분석, ANOVA, 또는 임의의 세트 컷-오프 값(arbitrarily set cut-off values)에 의해 차별적으로 발현되는 유전자를 포함하는 목록을 작성하였다. 진스프링에서의 분산분석을 위해, 샘플은 동일한 분산을 갖는다고 가정할 수 없기 때문에 전역 오류 모델을 턴 오프하고, 다중 시험 정정을 위해 본페로니(Bonferroni) 모델을 사용하였다. 수개의 상이한 방법으로 특성 목록을 작성하였지만, 최종 제시를 위해 3개의 버전을 선택하였다. 첫번째 유전자 목록에서 특성은 88개의 특성을 제시하되, ANOVA 시험에서 0.05 미만의 p-값을 가졌고, 또한 적어도 3개의 샘플에서 2배 초과로 상향조절되고 적어도 3개의 샘플에서 2배 초과로 하향조절되는 기준을 이행하여야 했다. 두번째 및 세번째 유전자 목록은 2795 및 311 개의 특성을 포함하고 각각 0.05 또는 0.000000001 미만의 ANOVA p-값의 포함 기준을 갖는 것으로 작성되었다. 3개의 유전자 목록을 연속적으로 사용하여 피어슨 상관계수에 따라 세포 배양물을 계측적으로 클러스터링하였다.
I- 11 - 화합물(I)-반응성에 대한 표지 유전자를 확인하기 위한
감독하
분석
가중 투표 방법(weighted voting method) (Golub et al., 1999)을 성장 저해 실험에서 실험간 차이가 최소로 작은 10개의 세포 배양물에 적용시켰다. 10개의 세포 배양물로부터의 발현 데이타를 진클러스터(GeneCluster) 버전 2.1.3 베타 (http://www-genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html)로 로딩하였다 (Golub et al., 1999; Tamayo et al., 1999). 길이가 상이한 특성 목록을 사용한 분류를 실행함으로써 리브 원 아웃 크로스 확인(cross validation)에 의해 시험하였다. 특성을 분류하는 것에 대한 선별은 잡음값에 대하여 최고의 중앙 신호를 갖는, 허용된 갯수의 특성을 사용하는 것에 기초한다. 잡음값에 대하여 최고의 절대 신호를 갖는 특성을 채택하도록 진클러스터를 세팅하되, 목록이 잡음 등급별 유전자 목록에 대한 양성 및 음성의 신호 측으로부터 동일한 갯수의 특성을 포함하도록 요하지는 않는다.
GBM 배양물의 독립적인 세트에 대한 분류자의 평가를 위해 3-5개의 특성을 포함하는 분류자를 구성하였다. 특성 선별은 트레이닝 세트에서 반응자 및 무반응자중 특성의 잡음비에 대한 최고의 신호에 기초하였다. 이어서, 화합물(I) 감수성이 실험적으로 측정되는 5개의 독립적인 GBM 배양물에 대한 분류를 위해 가중 투표 방법에 기초하여 분류를 위해 상기 분류자를 사용하였다.
II
- 결과
II
- 1 -
GBM
배양물의 화합물(I)-감수성의 특성화
화합물(I) 감수성과 관련하여 23개의 상이한 배양물을 특성화하기 앞서, 10% FCS로 보충된 배지에서의 4일간의 성장에 따른 세포 갯수의 증가를 측정하여 개개 배양물의 성장 특징을 분석하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, 성장율에 있어 큰 차이가 관찰되었다. 가장 느리게 성장하는 배양물에서만 4일간의 성장에 따른 세포 갯수가 1.2배 증가한 것으로 나타났고, 가장 빠르게 성장한 배양물에서는 세포 갯수가 18배 증가한 것으로 나타났다.
화합물(I) 처리에 의해 유도된 성장 저해는 화합물(I)의 존재 또는 부재하에서 4일간의 성장 후 세포 갯수를 비교함으로써 분석하였다. 화합물(I)의 효능은 4일간의 처리동안 세포 갯수 증가에 대한 하락율(%)로 나타내었다. 본 분석법에서 가장 느리게 성장하는 배양물 7개는 제외시켰다. 남은 16개의 배양물에 대한 3개의 독립적인 실험으로부터 얻은 결과를 도 1B에 나타내었다. 화합물(I) 처리에 대한 반응으로 배양물간에 큰 차이가 관찰되었다. 세포 배양물 5, 18, 21, 30, 34, 35 및 38 모두는 15% 미만의 성장 저해를 나타내었다. 대조적으로, 배양물 6, 7, 9, 11, 31 및 45의 성장은 40% 초과로 하락하였다. 배양물 8, 13 및 27은 20-40%의 성장 저해로 중간정도의 반응을 나타내었다.
성장 저해와 성장율과의 관련성 여부를 분석하기 위하여 상기 두개의 파라미터 사이의 상관계수를 산출하였다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, 상기 분석법을 통해서는 성장율과 화합물(I) 처리에 대한 반응 사이의 강한 상관관계에 대한 어떤 증거도 제공되지 않았다.
II
- 2 -
GBM
배양물에서
PDGF
수용체 발현 및 활성화 및 화합물(I) 감수성과의 상관관계
PDGF 수용체는 GBM 배양물의 화합물(I)-유도성 성장 저해에 대한 성장 저해 작용을 매개하는 가장 유망한 표적이다. PDGF 수용체 발현 및 활성화를 분석하고 상기 파라미터를 성장 저해와 관련시켰다 (도 2 및 3).
PDGFα- 및 β-수용체에 대한 항체 및 포스포-티로신 항체를 사용하여 배양된 GBM 세포로부터의 WGA-분획을 면역블롯팅함으로써 PDGF 수용체 활성화 및 발현을 분석하였다. 양성 대조군으로서 PDGFα- 또는 β-수용체로 형질감염된, 리간드-자극을 받은 또는 자극을 받지 않는 돼지의 대동맥 내피 세포를 사용하였다 (도 2A). 수용체 발현에 대한 값, 및 전체 PDGF 수용체 인산화에 대한 값을 임의로 배양물 21에서 1로 세팅하였다.
도 2B 및 C에 나타낸 바와 같이, 배양물간의 PDGFα- 및 β-수용체 발현에 있어서 100배 초과의 차이가 관찰되었다. PDGF 수용체 단백질 발현에 대한 예측치를 유전자 발현 분석 (하기 참조)으로부터의 데이타와 비교하고 각각 PDGFα- 및 β-수용체에 대하여 0.86 및 0.52의 r-값을 수득하였다 (도 2B 및 C, 삽입부). 추가로, PDGFα- 및 β-수용체의 복합적 이동 위치에서 포스포-티로신 신호를 측량하여 PDGF 수용체 인산화를 측정하였다 (도 2A, D). 전반적으로 상기 분석법을 통해 PDGFα- 및 β-수용체 발현을 조합하여 수득된 것과 매우 유사한 패턴을 수득하였다. 따라서, 상기 분석법은 배양물이 수용체당 유사한 인산화를 나타낸다는 것을 시사하였다.
분석한 16개의 배양물중 11개의 화합물(I) 감수성을 사용하여 이들 데이타의 상관관계로부터의 결과를 도 3에 나타내었다. 배양물 11, 45, 8, 27 및 34는 이들 배양물의 성장 저해 실험에서 차이가 크기 때문에 상기 분석법으로부터 제외시켰다. 4개의 분석한 PDGF 수용체-관련 파라미터 모두는 화합물(I) 감수성과 고도의 상관관계를 나타내었고, 이는 0.85 (PDGFβ-수용체 발현) 내지 0.73 (PDGFα-수용체 발현) 범위의 r-값을 나타내었다.
따라서, 상기 분석을 통해 GBM 배양물의 패널내 PDGF 수용체 발현과 관련된 광범위한 차이가 밝혀졌고, 또한 PDGF 수용체 발현과 화합물(I) 감수성, 및 전체 PDGF 수용체 인산화와 화합물(I) 감수성 사이의 강력한 상관관계도 밝혀졌다.
II
- 3 - 화합물(I)의 존재 및 부재하에서의
ERK
및
Akt
의 활성화 상태
단백질 키나제 ERK 및 Akt는 PDGF 수용체 신호화의 중요한 매개자이고, 또한, 예로서, 인테그린과 같은, 다른 타입의 세포 표면 수용체에 의해 유발되는 하류 신호화에 참여한다. 두개의 양 효소는 인산화를 통해 활성화되고, 활성화되고 인산화된 형태에 대하여 특이적인 항체를 사용하는 면역블롯팅을 사용하여 상기 효소의 활성화 상태를 측정하였다. 이들 효소의 활성화 상태는 성장 저해 연구로부터 얻은 확고한 결과를 사용하여 11개의 배양물에서 측정하였다. ERK 및 Akt 둘 모두의 활성화 상태는 세포 배양물간에 큰 차이를 나타내었다 (도 4A 및 C). 활성화 상태가 화합물(I) 반응 (도 4B 및 D, 좌측 상단 패널), 전체 PDGF 수용체 발현 (도 4B 및 D, 우측 상단 패널) 또는 PDGF 수용체 인산화 (도 4B 및 D, 좌측 패널)와 관련을 갖고 있을 때에는 어떤 상관관계도 관찰되지 않았다.
1시간동안 화합물(I)로 처리하여 유도된 ERK 및 Akt의 특이적인 인산화에서의 변화를 분석하여 이들 경로에서 약물-유도성 변화가 화합물(I) 반응 또는 수용체 발현과 상관관계가 있는지를 조사하였다. 전반적으로, 약물 처리후 ERK 및 Akt 인산화에서의 중간 정도의 변화만이 관찰되었다 (도 5A 및 C). Akt 인산화에서 화합물(I)-유도성 변화 및 화합물(I) 반응성 또는 PDGF 수용체 상태 사이에는 어떠한 상관관계도 관찰되지 않았다 (도 5D). 그러나, ERK 인산화에서의 하락 및 화합물(I)-유도성 성장 저해 사이의 상관관계가 관찰되었다 (r=-0.47).
상기 분석은 세포 배양물 사이에 발생된 ERK 및 Akt 활성화에서의 큰 차이를 시사하고 상기 경로의 활성화의 기초 수준은 PDGF 수용체 상태 또는 화합물(I) 감수성과 상관이 없다는 것을 나타낸다. 이는 또한 화합물(I) 처리는 상기 신호화 분자의 총 활성화 상태의 강력한 변화는 상관이 없다는 것을 확립시켰다. 그러나, 성장 반응 및 ERK 인산화에서 화합물(I)-유도성 변화상의 변화와의 몇몇 상관관계도 주시되었다.
II
- 4 - 21개의
GBM
-유도성 1차 배양물의 유전자 발현-기초의 클러스터링
23개의 GBM-유도성 1차 배양물 사이의 유전자 발현에 기초한 상이함과 유사함을 기술하기 위하여 유전자 발현 프로파일링을 실시하였다. RNA를 10% FCS에서 배양된 저-계대(low-passage) 배양물로부터 분리하였다. 마이크로어레이 분석을 위해 충분량의 RNA를 수득하기 위하여 2회에 걸쳐 RNA를 증폭시켰다. 두번째 증폭시 RNA로 형광 염료를 혼입시켰다. 대략 10000개의 인간 cDNA들를 함유하는 cDNA 어레이 (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/)를 사용하여 각각의 배양물을 4중으로 분석하였다. 참조 RNA는 모든 배양물로부터의 RNA 풀로 구성되었다.
계층적 클러스터링으로부터의 결과는 도 6에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 상이한 통계학적 기준을 사용하여 클러스터링을 위해 어떤 유전자가 사용되어야 하는지를 결정하였다. 어떤 기준이 사용되는지와는 상관없이 23개의 샘플중 17개를 포함하는 몇몇 일치하는 패턴을 관찰할 수 있었다. 배양물 18, 21, 35, 및 38은 모든 분석물에서 함께 클러스터링하였다 (클러스터 1). 또한, 배양물 5, 7, 8 및 11은 모든 분석물에서 함께 발견되었다 (클러스터 2). 최종적으로 배양물 9, 10, 15, 16, 31, 34, 37, 43 및 45를 포함하는 군 (클러스터 3)은 유전자 선별에 대한 통계학적 기준과는 상관없이 관찰되었다.
도 7은 표 1 및 2에도 열거되어 있는 클러스터-한정 유전자를 포함하여, 3개의 샘플에서 적어도 2배의 조절을 나타내는 유전자를 사용하여 분석한 후 유도된 클러스터링 도해를 나타낸다.
표 1에서 차별적으로 발현된 유전자는 유전자 온톨로지(Ontology) 프로그램에 의해 기술된 바와 같은 그의 분자 작용에 따라 군으로 분류되었다. 세포의 클러스터링에 사용된 88개의 혼성화 신호는 75개의 특이한 유전자를 나타낸다. 이들 유전자중 47개는 유전자 온톨로지 프로그램에서의 작용에 속하는 것으로 생각되었다; 대부분의 유전자는 카테고리 신호전달 단백질, 전사 조절자, 및 부착 또는 증식과 관련된 단백질에서 발견되었다.
표 2에서 유전자는 3개의 배양물 클러스터를 정의하는 유전자 클러스터의 출현 방법에 따라 조직화하였다. 3개의 배양물 클러스터에서 그의 평균 발현은 3개의 배양물 클러스터와 관련된 그의 발현 패턴을 설명하기 위하여 집중되었다. 일반적으로 유전자 클러스터 III군 및 VI군은 각각 배양물 클러스터 2 및 3에서 상향 조절되는 유전자로 구성된다. 유전자 클러스터 I군은 몇몇을 제외하고는 거의 항상 배양물 클러스터 1군에서 높다. 반대로, 유전자 클러스터 IV 및 V는 배양물 클러스터 1에서 하향 조절되는 유전자를 포함하고 유전자 클러스터 III은 배양물 클러스터 3에서 발현이 낮은 유전자로 구성된다.
II
- 5 - 성장 특성 및
PDGF
수용체 상태와
GBM
배양물의 유전자 발현-기초 클러스터링의 비교
GBM 배양물의 성장율, 및 그의 화합물(I) 감수성 분석으로부터 얻은 결과를 유전자 발현에 기초한 배양물의 계측적 클러스터링으로부터 얻은 결과와 조합하였다 (도 8). 몇몇 관심의 대상이 되는 경향이 관찰되었다. 가장 느리게 성장하는 배양물 7개중 6개 (굵게 표시함)는 클러스터 3에서 발견되었다. 6개의 반응자는 클러스터 2 및 3에 집중되어 있었다. 클러스터 2에서의 모두는 서브클러스터 2b에서 발견되었다. 7개의 무반응자중 4개의 배양물 (18, 21, 35, 38)이 완전한 서브클러스터 1b 세트를 구성하였다.
또한, PDGF 수용체 상태로부터 얻은 결과를 유전자 발현에 기초한 배양물의 분류(grouping)와 비교하였다 (도 8). PDGF 수용체 발현 및 인산화와 관련하여 배양물을 발현 또는 인산화가 고도한 10개의 배양물, 및 발현 또는 인산화가 낮은 11개의 배양물을 야기하는 2개의 부류로 분류하였다. 클러스터 1은 확실하게 수용체 발현 및 인산화가 낮은 배양물로 보충된 반면, 클러스터 2 및 3 둘 모두는 2개의 카테고리의 혼합물로 구성되었다. 상기 데이타의 편집을 통해서도 6개의 확고한 화합물(I) 무반응자 모두는 낮은 수용체 발현 및 인산화를 나타낸 반면, 반대로 확실한 반응자 모두는 높은 수용체 발현 및 인산화에 의해 특성화되었다는 것이 강조되었다.
II
- 6 - 화합물(I) 반응성과 관련된 유전자 발현 패턴에 대한
감독하
확인
유전자 발현 패턴 및 화합물(I) 반응성 사이에 상관관계가 존재한다는 지적과 관련하여, 화합물(I) 반응성과 최고로 상관관계를 갖는 유전자 발현 패턴을 확인하기 위한 목적으로 감독하 분석을 실시하였다. 상기 목적을 위해 화합물(I) 감수성에 대하여 가장 확실한 결과를 야기하는 10개의 배양물을 반응자 (배양물 6, 7, 9 및 31) 및 무반응자 (배양물 5, 18, 21, 30, 35 및 38)로 분류하였다 (도 1 B).
"리브-원-아웃" 확인법을 포함하는 가중 투표 방법을 사용하여 감독하 분석을 실시하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 분류하기 위하여 2-40개의 특성을 사용하고, 10개의 배양물 모두를 리브-원-아웃 확인법으로 정확하게 분류하였다. 각각 4개 및 10개의 특성으로 구성된 목록을 포함하는 분류를 위해 8개 및 16개의 유전자를 사용하였다. 리브-원-아웃 시험에서 사용된 유전자를 표 3에 표로 제시하였다.
10개의 배양물 모두로부터의 발현 데이타를 사용하여 3-5개의 특성의 분류자를 구성하였다 (표 4). 상기 분류자를 사용하여 분류자의 구성에 사용된 10개의 배양물 모두를 반응자 및 무반응자로서 정확하게 기술하였다. 상기 분석법을 확장시키기 위하여, 트레이닝 세트 (도 10)에 포함되지 않았던 5개의 배양물 (배양물 8, 11, 27, 34 및 45)에 대한 예비 시험을 위해 분류자를 사용하였다. 예비 시험 세트에 대한 상기 분류자의 적용으로부터 얻은 결과는 도 10에 나타낸다. 흥미롭게도, 배양물 11, 45는 성장 저해 실험으로부터 얻은 결과와 동일하게, 반응자로서 특성화된 3개의 분류자 모두와 함께 하였다. 또한, 성장 저해 결과와 동일하게, 배양물 34는 무반응자로서 일관되게 분류되었다. 중간 정도의 반응을 나타내는 배양물 8 및 27은 각각 무반응자 및 반응자로서 명시된 3개의 반응자 모두와 함께 하였다. 상기 나타낸 바와 같이, 원발성 GBM 배양물은 화합물(I)-감수성과 관련하여 광범위하게 다양한다. PDGF 수용체 상태의 특성화에 의해 화합물(I)-감수성과 PDGF 수용체 발현 및 인산화 사이의 확실한 상관관계를 나타내었다 (도 1-3, 8). 화합물(I)-감수성 또는 ERK 및 Akt의 기본 인산화 사이에는 어떠한 명백한 상관관계도 나타나지 않았다 (도 4). 화합물(I)-감수성은 ERK 인산화에서 화합물(I)-유도성 하락과 일부 상관관계를 나타내었다 (도 5). 유전자 발현 프로파일링은 화합물(I)-감수성, 성장율 및 PDGF 수용체 인산화와 관련하여 상이한 명백한 GBM 서브세트의 존재를 제시하였다 (도 6-8). 마지막으로 유전자 발현 데이타의 감독하 분석을 사용하여 화합물(I)-반응을 예측하는 짧은 유전자 목록을 작성할 수 있었다 (도 9, 10).
종전 연구를 통해 GBM 세포주에 대하여 보고된 바 있지만, GBM 성장에 대한 PDGF 수용체 저해의 조직적인 효과 분석은 본 원에서 처음으로 기술되었다.
PDGF 수용체 상태 및 화합물(I)-반응 사이의 상관관계 (도 3)는 현저하였다. PDGF 수용체 발현 및 인산화의 분석을 통해 이들 파라미터 사이의 강력한 공-변이(co-variation)가 제시되었고, 이는 리간드-생산은 배양물간에 현저히 상이한 것은 아니라는 것을 시사하였다.
하류 신호화 분자 Akt 및 ERK의 기본 활성화 상태, 및 PDGF 수용체 상태 사이에는 상관관계가 없다는 것 (도 4)은 이들 GBM 배양물중 Akt 및 ERK의 활성화는 다중 신호전달 경로의 조절하에 있음을 시사하는 것이다. 이와 관련하여 성장-저해 실험 및 Akt- 및 ERK-활성화 분석 둘 모두는 10% FCS의 존재하에서 보존된 세포에서 실시되었다는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 이들 경로에 대하여 갖는 PDGF 수용체 신호화의 잠재된 영향력이 다른 배양 조건하에서도 더욱 명확하게 검출될 수 있다고 볼 수 있다.
Akt 및 ERK 인산화에서 화합물(I)-유도성 변화에 대한 분석은 강력한 성장-저해 반응을 나타내는 10개의 선택된 GBM 배양물 (배양물 6, 7, 9 및 31) 및 6개의 무반응자에 주시하고 있다. PDGF 수용체 신호화에서 Akt-신호화가 중요하다면, 가정컨대, PDGF 수용체 저해를 통해 달성될 것으로 되는 예측되는 성장 저해 효능은 Akt의 활성화에서 일관된 하락의 부재하에서 관찰될 수 있다는 것이 다소 놀라운 일이다 (도 5). 상기 발견은 혈청 성분이 의존성 경로에서 PDGF를 통해 Akt의 고도한 활성화를 제공하는 배양 조건하에서 보존된 세포에서 검출되는 것이 아니라, PDGF 수용체 저해에 의해 영향을 받는 PDGF 수용체 의존성 pAkt의 존재에 의해 설명될 수 있다. 신호화에서 화합물(I)-유도성 변화에 대해 분석되는 세포 분해물은 1시간동안 화합물(I)에 노출되기만 한 세포부터 유래되었다는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 잘-특성화된 PDGF-의존성 대조군 시스템에서 상기와 같은 시간 길이는 ERK 및 Akt의 PDGF 수용체- 의존성 인산화에서 검출가능한 변화를 유도하기에 충분하다는 것을 확인하여야 한다.
유전자-발현 프로파일 및 생화학적 특성화의 복합 분석을 통해 관심의 대상이 되는 일련의 상관관계가 밝혀졌다 (도 6 및 8). 간단하게, 클러스터 1은 PDGF 수용체 발현이 낮고 화합물(I)에 대한 감수성이 낮은 배양물도 보충되고, 클러스터 2는 고도한 PDGF 수용체 발현을 갖는 화합물(I)-반응자로 보충되고, 클러스터 3은 주로 성장율이 낮고 PDGF 수용체 발현이 일관되지 않는 배양물로 구성되어 있다. 화합물(I)-반응자로 보충된 GBM 클러스터 2에서 과다발현되는 유전자 클러스터 III, IV 및 V에 포함된 유전자의 예비 분석 (도 7, 표 2)은 GBM 서브세트의 특정 발생 기원, 또는 특이적인 생물학적 특징을 제시하는데는 실패하였다.
화합물(I)-감수성의 특성화 및 상기 GBM 패널의 유전자-발현 분석에 기초하는 감독하 분석을 사용하여 반응자 및 무반응자를 기술하는 분류자를 구성하였다 (도 9, 표 3). 일반적으로 상기 분류자는 적어도 2개의 목적으로 사용될 수 있다. 먼저, 진단 또는 예후 도구의 개발을 위한 출발점으로서 사용될 수 있다. 분류자의 성능이 우수하다면, 분류자를 구성하는 유전자의 생물학적 유의성에 주의하지 않고도 분류자의 기능은 개발될 수 있다. 두번째로, 화합물(I)-감수성 또는 -내성에 있어서 분류자에 의해 식별되는 2개의 표현형을 유발하는 생물학적 관계에 대하여 분류자는 지적할 수 있다.
참고문헌
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aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggc gctttttttt ttttttt 57
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Primer
<400> 2
aaacagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30
Claims (18)
- a) 포유 동물로부터 생물학적 샘플을 제공하고;b) 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개의 유전자 표지의 샘플에서 발현 및/또는 인산화 프로파일을 측정하고;c) 환자의 유전자 발현 프로파일을 표 3에 제시한 평균 무반응성 발현 프로파일과 비교하고;d) (b)의 비교의 결과로서 형성된 2개의 유전자 발현 프로파일 사이의 유사성을 측정하고;e) (c)에서 측정된 유사도에 의해 환자가 약물에 대하여 반응성인 GBM 상태를 가질 가능성을 결정하는 것을 적어도 포함하는, 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 표 3으로부터 선택된 적어도 3개 내지 5개의 유전자 표지의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 단계 b)에서 측정하는 것인 방법.
- a) 포유 동물로부터 생물학적 샘플을 제공하고;b) 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개의 유전자 표지의 샘플에서 발현 및/또는 인산화 프로파일을 측정하고;c) 반응성 및 무반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일을 표 3으로부터 산출된 평균 ± 표준 편차와 비교하고;d) - 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일이 반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 산출된 평균 ± 표준 편차 범위내인 경우, 상기 포유 동물은 당해 치료에 대하여 반응할 것으로 예측하고;- 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일이 무반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 산출된 평균 ± 표준 편차 범위내인 경우, 상기 포유 동물은 당해 치료에 대하여 반응하지 않을 것으로 예측하며;- 단계 b)에서 얻은 발현 및/또는 인산화 프로파일이 반응성 및 무반응성 발현 및/또는 인산화 프로파일에 대하여 산출된 평균 ± 표준 편차 범위 밖인 경우에는, 당해 치료에 대한 반응으로서의 포유 동물의 행동이 결정되지 않는 것으로 포유동물의 행동을 예측하는 것을 적어도 포함하는,하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 표 3으로부터 선택된 적어도 3개 내지 5개의 유전자 표지의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 단계 b)에서 측정하는 방법.
- a) 제 3항 또는 제 4항에 따른 방법을 사용하여 포유 동물의 행동을 예측하고;b) 포유 동물이 반응할 것으로 예측되는 경우, 이때 상기 포유 동물을 선별하는 것을 적어도 포함하는, 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물을 선별하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 포유 동물이 인간인 방법.
- 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개의 유전자 표지에 대한 cDNA들 및/또는 항체들을 포함하는, 포유 동물의 유전자 표지의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 시험관내에서 분석하기 위한 키트.
- 제 7항에 있어서, 표 3으로부터 선택된 적어도 3개 내지 5개의 유전자 표지에 대한 cDNA들 및/또는 항체들을 포함하는 키트.
- 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 포유 동물이 인간인 키트.
- 표 3으로부터 선택된 적어도 2개 내지 40개의 유전자 표지에 대한 cDNA들 및/또는 항체들을 포함하는, 포유 동물의 유전자 표지의 발현 및/또는 인산화 프로파일을 시험관내에서 분석하기 위한 마이크로어레이 또는 바이오칩.
- 제 10항에 있어서, 표 3으로부터 선택된 적어도 3개 내지 5개의 유전자 표지에 대한 cDNA들 및/또는 항체들을 포함하는 마이크로어레이 또는 바이오칩.
- 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 포유 동물이 인간인 마이크로어레이 또는 바이오칩.
- - 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하고(하거나);- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하고(하거나);- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물을 선별하기 위한 유전자 표지로서, 표 3으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 및/또는 하나 이상의 유전자 산물의 용도.
- 제 13항에 있어서, 유전자에 상응하는 cDNA 및/또는 유전자 산물에 대해 특이적인 항체(들)를 사용하는 용도.
- - 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하고(하거나);- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하고(하거나);- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물을 선별하기 위한, 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
- - 포유 동물의 세포 증식성 질환을 시험관내에서 진단하고(하거나);- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대한 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물의 행동을 예측하고(하거나);- 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제를 사용하는 의학적 치료에 대해 반응할 것으로 예측되는 세포 증식성 질환을 앓는 포유 동물을 선별하기 위한, 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 마이크로어레이 또는 바이오칩의 용도.
- 제 5항에 따른 방법을 사용하여 선별되는 세포 증식성 질환을 앓는 반응성 포유 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 사용하기 위한 하나 이상의 PDGF 수용체 길항제의 용도.
- 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 포유 동물이 인간인 용도.
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