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KR20060057992A - ｐ38-ＤＸ2 및 이의 용도 - Google Patents

ｐ38-ＤＸ2 및 이의 용도 Download PDF

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KR20060057992A
KR20060057992A KR1020050039073A KR20050039073A KR20060057992A KR 20060057992 A KR20060057992 A KR 20060057992A KR 1020050039073 A KR1020050039073 A KR 1020050039073A KR 20050039073 A KR20050039073 A KR 20050039073A KR 20060057992 A KR20060057992 A KR 20060057992A
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South Korea
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nucleic acid
lung cancer
mrna
cancer
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Application number
KR1020050039073A
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English (en)
Inventor
김성훈
Original Assignee
재단법인서울대학교산학협력재단
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Publication date
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Abstract

본원에는 폐암 또는 간암 조직에서 특이적으로 발현되는 p38의 엑손 2가 결손된 변이체 p38-DX2를 제공하고, 이를 폐암 또는 간암 진단 마커로 사용하여 폐암 또는 간암을 진단하며, p38-DX2를 저해하여 폐암 또는 간암을 치료 또는 예방하는 것에 대해 기술되어 있다.
p38, p38-DX2, 폐암, 간암, 진단 마커

Description

ｐ38-ＤＸ2 및 이의 용도{p38-DX2 and its use}
도1은 TGF-β 신호전달에서 p38의 기능적 중요성 및 p38과 Smad2/3의 상호작용을 보여준다.
도 2는 TGF-β 신호전달에서 p38의 작동 기작을 보여준다.
도3은 p38의 차이나는 발현과 p38의 엑손2-결실 형태의 생성을 살펴본 결과이다.
도 4는 p38-DX2가 p38의 세포내 안정성에 미치는 효과를 살펴본 결과이다.
도 5는 TGF-β 신호 전달 및 세포 성장 조절에서 p38-DX2의 붕괴적 효과를 살펴본 결과이다.
도 6은 폐암 형성과 p38의 관련성을 살펴본 결과이다.
도 7은 p38와의 상호작용에 관련된 Smad2 도메인을 측정한 결과이다.
도 8은 인간 p38 유전자의 엑손 배열 및 p38 cDNA에서 프라이머 위치를 보여준다.
도 9는 암세포주에서 p38의 발현 감소 및 p38-DX2의 생성을 살펴본 결과이다.
도 10 폐암 조직에서 p38-DX2 생성 및 p38의 억제를 살펴보았다.
도 11은 간암에서 p38-DX2가 발현됨을 보여준다.
도 12는 p38-DX2 발현 벡터를 보여준다.
본 발명은 p38의 엑손 2가 결손된 변이체 p38-DX2 및 이의 이용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 p38-DX2, 이의 진단 마커로서의 용도 및 이의 억제제를 사용한 항암 용도에 관한 것이다.
폐암 또는 간암은 전세계적으로 발병율이 높고 사망률도 매우 높은 암이다. 암은 X선 촬영, 전산화 단층촬영, 기관지 조영술 등의 방사선학적 검사, 기관지 내시경 검사등을 통해서 진단할 수 있다. 그러나, 이런 검사들을 통해서 해부학적 진행 정도를 판단할 수 있으나 세포 생리학적 상태나 분자 유전학적 상태를 정확히 평가할 수는 없다.
이에, 마커들을 이용하여 폐암 또는 간암을 진단하기 위한 다양한 시도들이 진행되었다.
한국 특허 출원 10-1998-0038212에는 폐암의 전이성을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 폐암 조직에서 미토젠 활성화 인산화 단백질 탈인산화 효소-1 (mitogen activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)의 발현을 측정하여 국부 전이성 폐암을 진단하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 국제특허 WO04005891는 OE372, ATP5D, B4GALT, Ppase, GRP58, GSTM4, P4HB, TPI, 및 UCHLI 등의 유전자를 폐암 진단 마커로 사용하여 폐암을 진단하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 미국 특허 US6117981은 LCGA을 타겟으로 하는 단클론 항체를 이용한 비소세포성 폐암 및 난소암의 진단 및 치료 방법에 대하여 기술하고 있다. 유럽특허 EP0804451은 폐암 특이적 항원 HCAVIII을 이용하여 폐암을 진단하고 치료하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 그 외에도 미국특허 6,759,508, 미국 특허 6,746,846, 미국특허 6,737,514, 유럽특허 EP0621480 등이 폐암 진단 마커 등에 대하여 기술하고 있다.
한국 특허 출원 10-2000-0040609에는 렉틴을 포획 단백질(capture protein) 또는/및 프로브 단백질(probe protein)로 사용하는 샌드위치형 어세이(sandwich assay)로 아사이알로당 단백질의 농도를 측정하여 간경변, 간암 등의 간 질환의 조기 진단하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 한국 특허 출원 10-2002-0035260에는 긴 사슬 지방산-코엔자임 A 리게이즈 4, 파네실 디포스페이트 신쎄이즈, 신데칸 2, 이모파밀-결합단백질, 멜라노마에서 프레퍼렌셜리 발현된 항원, 및 히스티딘 암모니아-리에이즈을 포함하는 인간 간암진단용 조성물을 이용하여 인간 간암 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 기술하고 있다. 유럽특허 EP0334962는 UDP-N-아세틸그루쿠사민과 클리코단백질 N-아세틸글루코사민트랜스퍼자제 함량을 비교함으로서 간암을 진단하는 방법을 기술하고 있다. 또한 EP0339097은 혈청, 플라즈마, 활액에 존재하는 콜라게네이즈 억제제의 양을 샌드위치 어세이 방법으로 측정하여 간암을 진단하는 방법을 기술하고 있다.
그러나, 지금까지 밝혀진 폐암 또는 간암 마커들은, 정상세포에서도 발현되는 유전자를 마커로 사용하여, 정상 세포와 암 세포에서의 마커 유전자의 발현양의 차이를 비교하여 암 발생 여부를 판단하므로 정확도가 낮다는 점에서 특이적인 폐암 또는 간암 마커로서의 유용성이 낮다.
이러한 배경하에서, 본 발명자는 p38이 엑손 2의 결실 변이체인 p38-DX2가 정상세포에서는 전혀 발현되지 않고 폐암 또는 간암 세포에서만 발현되므로 이를 마커로 이용할 경우 매우 신뢰도가 높게 암 발생 여부를 확인할 수 있으며, 또한 p38-DX2는 그 발현이 암 유발의 직접적 원인이 되므로 p38-DX2 단백질에 특이적인 항체, p38-DX2 mRNA에 대한 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 이용할 경우 암을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 p38 단백질의 엑손 2의 영역이 결실된 p38-DX2 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 p38-DX2 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질에 특이적인 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질에 대한 항체를 포함하는 폐암 또는 간암 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질에 특이적인 항체를 검출 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성한 후 항원-항체 복합체의 형성량을 대조구와 비교하여, 폐암 또는 간암 진단 마커 p38-DX2 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질의 mRNA에 특이적 siRNA 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 포함하는 폐암 또는 간암을 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 투여하여 폐암 또는 간암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2의 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2의 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산을 포함하는 폐암 또는 간암을 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2의 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산을 투여하여 폐암 또는 간암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38 단백질의 mRNA와 p38-DX2 단백질의 mRNA를 구분하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 폐암 또는 간암 진단 마커 단백질 p38-DX2의 mRNA를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2 단백질과 p38 단백질의 헤테로다이머 형성을 저해하는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p38-DX2가 발현되는 세포를 배양하고 후보 억제제를 상기 세포에 처리한 후 대조구와 mRNA 또는 단백질 수준을 비교하여, p38-DX2 단백질 발현을 저해하는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
도면의 상세한 설명
도1은 TGF-β 신호전달에서 p38의 기능적 중요성 및 p38과 Smad2/3의 상호작용을 보여준다. p38+/+ 및 p38-/- MEFs에서 TGF-β가 세포 증식(a), 콜로니 형성(b), 세포주기 진행(c), Smad2 및 Smad3의 핵 이동(d)에 미치는 효과를 측정하였다. a. 2, 4 및 4ng/ml의 TGF-β 농도로 6시간 동안 세포를 배양하였다. TGF-β 무처리 된 세포에서 티미딘 삽입(thymidine incorporation)을 1로 잡았을 때, 수치값은 4번의 독립적 실험값의 평균을 나타낸다. b. p38+/+ 및 p38-/- MEFs (14.5d)를 TGF-β (2 ng/ml) 존재하에 4시간 배양하고, 포름알데하이드로 고정한 뒤, Giemsa 염색으로 콜로니를 보이게 하였다. c. MEFs를 TGF-β로 24시간 처리한 뒤, G0/G1 상 세포가 차지하는 정도를 유세포 분석기(flow cytometry)로 살펴보았다. d. MEFs를 TGF-β(2ng/ml)로 1시간 동안 처리하였다. Smad2 및 Smad3를 이의 특이적 항체로 반응시킨 후 FITC-콘쥬게이트된 항체(녹색)로 살펴보았다. 핵은 PI(빨간색)으로 염색되었다. e. p38과 Smad2 및 Smad3와의 상호작용은 Smad2 및 Smad3에 대한 항체를 이용한 공동-면역침전으로 살펴보았다.
도 2는 TGF-β 신호전달에서 p38의 작동 기작을 보여준다. a. A549 세포를 TGF-β(2ng/ml)로 처리 후에, 정해진 시간에 수확하여 추출한 단백질을 항-Smad 2 또는 Smad3 항체로 면역침전하였고, 공동침전된 p38을 항-p38항체로 측정하였다. WCL은 전체 세포 라이세프(lysate)의 단백질 웨스턴 블랏을 나타낸다. b. TGF-β 의 타겟 유전자, p15, p21, 및 PAI-1의 발현을 대조구 및 p38-형질전환된 DU145에서 RT-PCR 로 살펴보았다. c. p38-/- MEFs에서 Smad2의 인산화에 미치는 p38의 효과를 보여준다. d. Smad2의 개별 도메인(Mad-상동 도메인, MH1, MH2 및 링커)을 LexA 융합 단백질로 발현시키고, B42-융합된 p38와의 상호작용을 X-gal-함유된 효모 배지에서의 블루 콜로니 형성으로 관찰하였다. e. Smad2와 TGF-β 수용체의 TGF-β-의존적 상호작용을 공동-면역침전으로 측정하였다. MEFs를 37℃에서 TGF- β로 처리하고, 면역침전 전에 8℃에서 배양하였다. TGF-β 수용체와 Smad2와의 결합을 항-TβRⅠ 항체로 면역블랏팅하여 관찰하였다. f. p38+/+ 및 p38-/- MEFs에서 TGF-β 처리 후에 총 Smad2, 인산화된 Smad2 (p-Smad2), 및 p38 수준의 시간별 추이를 보여준다.
도 3은 p38의 차이나는 발현과 p38의 엑손2-결실 형태의 생성을 살펴본 결과이다. 다양한 암 세포주에서 p38 수준을 웨스턴 블랏(a), 유세포 분석기(b)로 비교하였다. A549, NCI-H460, -H322 및 H290은 폐암 세포주이고, DU145 및 HCT116은 각각 전림선과 대장암 세포주이다. b. "Negative"는 2차 항체만 처리한 DU145를 나타낸다. 각 세포주의 2000 세포를 분석하였다. c. p38의 전사 수준을 상이한 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR로 비교하였다. 엑손 3-4 및 1-3을 관통하는 전사물은 각각 프라이머 6/7 및 1/5 (도 8b)를 사용하여 생성되었다. GAPDH를 로딩 대조구로 사용되었다. 엑손 1-3의 전사물에 해당하는 프라이머 쌍을 이용할 경우 작은 크기의 p38 전사물(smaller p38 transcript)이 생성되었다. 이런 작은 크기의 전사물은 엑손 2가 부족한, p38의 상이한 스프라이싱 형태(p38-DX2)이다. 이런 전사물은 엑손 1 및 3 사이를 접합 서열에 특이적인 프라이머 DX2-F 및 다른 프라이머(DX2-B)(도 8b)를 사용하여 RT-PCR을 할 때, 낮은-p38 수준을 보이는 세포주에서만 생성되었다. d. p38의 TGF-β-의존적 유도 및 핵 이동은 TGF-β로 2시간 동안 배양한 후에 면역형광 염색하여 조사하였다. e. 표시된 세포의 증식에 미치는 TGF-β의 효과를 [3H] 티미딘 삽입 (n=4)으로 비교하여 보았다. f. 목적 유전자, p21 및 PAI-1의 TGF-β-의존적 유도를 TGF-β로 2시간 처리 후에 RT-PCR로 비교하여 보았다.
도 4는 p38-DX2가 p38의 세포내 안정성에 미치는 효과를 살펴본 결과이다. a. TGF-β로 2시간 처리 또는 무처리 된 DU145 세포로 DX2를 형질전환한 후에, p38 수준을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. c-myc, DX2 및 GAPDH(대조구)의 발현을 RT-PCR로 살펴보았다. b. DU145로 DX2 및 공 벡터를 형질전환한 후에, TGF-β-의존적 세포 성장 억제에 미치는 효과를 티미딘 삽입으로 살펴보았다.(n=4) c. p38-F 및 -DX2 간의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 어세이법(Rho, S. B. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4488-93, 1999)으로 측정하였다. d. p38-F 및 -DX2를 [35S] 메티오닌 존재하에 인.비트로 번역으로 합성한 뒤, GST-p38-F 또는 -CDK2 (대조구)와 혼합한 뒤, 글루타치온-세파로즈로 침전하였다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 자가방사법으로 검출하였다. e. p38-F 또는 -DX2와 FUSE-결합 단백질 (FBP: FUSE-binding protein)(Kim, M. J. et 미., Nat. Genet. 34, 330-336, 2003) 및 Smad2와의 상호작용을 이스트 투 하이브리드로 측정하였다. f. 프로테아좀 억제제, ALLN (50 μM, 4시간)이 p38-F 및 -DX2의 수준에 미치는 효과를 DX2-생성H322 세포에서 항-p38 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 측정하였다. DX2 형태는 이의 인. 비트로 합성된 카운터파트(counterpart)와 젤상 공동-이동(co-migration)으로 확인하였다(자료 없음). g. ALLN (20 μM, 2시간) 처리 후 p38 증가를 H322 세포에서 항-p38 항체를 이용하여 면역형광염색으로 살펴보았다. h. Myc-태크된 DX2를 ALLN 처리된 DU145 세포로 형질전환하고, 항-p38 항체를 이용하 여 p38을 면역침전한 뒤, 유비퀴틴화된 p38 분자를 항-유비퀴틴 항체(Ubi)로 면역블랏팅하여 관찰하였다
도 5는 TGF-β 신호 전달 및 세포 성장 조절에서 p38-DX2의 붕괴적 효과를 살펴본 결과이다. a. DX2(또는 공벡터)를 MEFs로 형질전환한 뒤 세포 성장에 대한 효과를 살펴보았다. 세포 및 클로니를 각각 광학 현미경(상) 및 Giemsa 염색(하)으로 살펴보았다. b. DX2 특이적인 3 종류의 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 보여준다. c. 3가지 종류의 siRNA를 발현하는 벡터를 각각 제조하여 암 세포주인 H322 및 H460 세포주에 형질전환한 후 정상적 p38 및 smad2의 인산화에 미치는 영향을 조사하였다. d. 4번 및 5번 siRNA를 H322 세포에 형질전환 하였을 때, TGF-β에 의한 세포 사멸 정도(좌)와 세포주기의 정지 정도(우)를 살펴보았다. e. p38-DX2를 타겟팅하는 4번 siRNA(si-DX2)를 발현하는 벡터를 H322로 유입하고 DX2 전사 억제에 대한 효과를 RT-PCR로 측정하였다(상). si-DX2는 엑손 3-4에 해당하는 전사물의 RT-PCR에서 알 수 있듯이 전장 p38(full-length p38) 전사에는 영향을 미치지 않았다. si-DX2가 Smad2의 인산화 및 p38 발현에 미치는 효과를 웨스턴 블랏으로 측정하였다(하). TGF-β 신호전달의 복구에 미치는 si-DX2의 효과를 H322를 이용하여 Smad2의 면역형광(f), 3TP 프로모터하 TGF-β 의존적 리포퍼 어세이(g), 성장 정지(h)로 측정하였다. f. p-Smad2 및 핵을 TGF-β 처리 30분 후에 FITC-콘쥬게이트된 이차 항체(초록색) 및 PI(빨간색)로 30분 염색하였다. si-DX2의 형질전화에 의하여 p-Smad2가 증가하고 핵에 위치하게 된다.
도 6은 폐암 형성과 p38의 관련성을 살펴본 결과이다. a. p38+/+ 및 p38+/- 마우스로 벤조-(α)-피렌(benzo-(α)-pyrene)을 복강내 투여한 후 시간 간격으로 폐 종양 형성을 관찰하였다. “N"은 도살된 마우스 수를 나타낸다. b. p38+/- 마우스에서 분리한 폐 종양에서의 조직학적 특성 및 p38 수준을 H&E (좌) 및 항-p38 항체를 이용한 면역형광 (IF) 염색(우)로 살펴보았다. “T" 및 "N"은 각각 종양 및 정상 부위를 의미한다. 핵 및 p38는 빨간색(PI 염색) 및 초록색(FITC)으로 보인다. c. 폐암 환자에서 분리된 정상 및 종양 부위에서 p38의 면역형광 염색이다. 정상 조직은 비종양의 염증성 조직에서 분리되었다. d. 총 RAN는 (c)에서 사용된 조직에서 분리되었으며 DX-2 특이적 프라이머로 RT-PCR을 수행하였다. 같은 환자의(코드 번호로 표시) 정상 및 종양 조직을 항-p38 항체를 이용하여 면역형광 염색(e) 및 RT-PCR(f)을 수행하였다. f. p38의 엑손 4 영역 및 GAPDH를 대조구로 사용하였다.
도 7은 p38와의 상호작용에 관련된 Smad2 도메인을 측정한 결과이다. p38 또는 CDK2 를 코딩하는 cDNA를, pGEX4T-1의 EcoRI 및 XhoI 부위와 결합시켜서, GST-융합 단백질로 E.coli BL21(DE3)에서 발현시킨 후, 제조사의 설명에 따라서 융합 단백질을 분리하였다. 상이한 Smad2 결실 단편은 TNT 커플된 전사 키트(Promega)를 이용하여 [35S] 메치오닌 존재하에, 시험관내 전사(in vitro translation)로 합성하였다. 글루타치온-세파로즈 비드에 결합된 GST 융합 단백질은, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM 페닐메틸설포닐 플로라이드(PMSF), 및 1% 트리톤 X-100 을 포함하는 PBS 완충액(pH 7.4)의 결합 완충액에서 [35S] 메치오닌-라벨된 Smad 단편과 배양하였다. 결합 혼합물을 4℃에서 회전시키면서 밤새 배양한 후 0.5% 트리톤 X-100을 포함하는 결합 완충액으로 4번 세척하였다. SDS 샘플 완충액을 첨가 후에, 결합된 단백질을 가열하여(boiling) 용출시켜 SDS 젤 전기영동으로 분리하였다. Smad2 단편의 존재는 자가방사법(autoradiography)으로 확인하였다.
도 8은 인간 p38 유전자의 엑손 배열 및 p38 cDNA에서 프라이머 위치를 보여준다. a. p38 유전자는 표시된 크기의 폴리펩타이드를 코딩하는 4개의 엑손(파란색으로 표시)으로 구성되어 있다. b. p38의 상이한 영역을 관통하는 cDNA를 생성시키는데 사용되는 프라이머의 위치 및 서열을 나타내는 도식도이다.
도 9는 암세포주에서 p38의 발현 감소 및 p38-DX2의 생성을 살펴본 결과이다. a. DX2-포지티브 및 -네가티브 세포간의 p38 수준을 비교하기 위하여, 하나의 디쉬에 DU145 및 H460 세포를 배양하고, 항-p38 항체(초록색)로 면역 형광염색을 수행하였다. DU145 세포는 돌연변이 때문에 높은 수준으로 p53을 발현하는데 반하여 H460 세포는 천연형의 p53을 가지므로 낮은 수준을 유지하므로, 두 세포주를 p53 면역형광염색(빨간색)으로 구분하였다. 세포를 TGF-β로 2시간 처리하고 메탄올로 고정하였다. b. p38 발현에 p38-DX2가 미치는 효과를 검토하기 위하여, p38 수준을 유세포 분석기로 살펴보았다. 2 μg/ml 의 공벡터 또는 DX2를 DU145 세포로 형질전환하고, 24시간 배양하였다. 세포를 70% 에탄올로 고정한 뒤, 항-p38 항체, 뒤이어 FITC-콘쥬게이트된 이차항체로 반응시켰다. c. TGF-β-의존적 세포주기 정지에 미치는 p38-DX2의 효과를 유세포 분석기로 비교하였다. 공벡터로 형질 전환된 DU145 세포에서 G0/G1 상 세포의 비율은 증가함에 비하여, DX2-형질전환된 세포에서는 그렇지 않았다. 검정색과 파란색 선은 각각 TGF-β로 무처리 및 처리된 세포를 표시한다. d. 10 μM의 ALLN으로 2시간 무처리(대조구) 또는 처리된 H460 세포에서 p38 수준을 비교하였다. “네가티브”는 FITC-콘쥬게이트된 이차항체만으로 배양된 세포를 나타낸다.
도 10 폐암 조직에서 p38-DX2 생성 및 p38의 억제를 살펴보았다. a. 벤조피렌으로 주사된 p38+/+ 및 p38+/- 마우스에서 폐를 분리한 뒤, p38-DX2의 생성을 RT-PCR로 측정하기 위하여 각 폐에서 RNA를 분리하였다. DX2를 생성하는 모든 폐는 폐에서 종양이 생성되었다 (+로 표시). b. 각 4명의 환자로부터 정상 및 종양 조직을 분리하고, p38 수준을 항-p38 항체를 이용하여 면역형광 염색(초록색)하여 비교하였다. 핵은 PI 염색(빨간색)으로 관찰되었다. 분리된 조직의 조직학적 특성을 H&E 염색으로 관찰하였다. 화살로 표시된 조직 부위를, 상단에서 볼 수 있듯이 면역 염색하였다.
도 11은 간암에서 p38-DX2가 발현됨을 보여준다. a. 인간 조직에서 간암과 p38-DX2 형성을 RT-PCR로 살펴보았다. b. 간암 조직에서 p38의 수준의 감소를 조직 염색으로 살펴보았다.
도 12는 p38-DX2 발현 벡터를 보여준다.
p38 단백질과 관련하여, 본 발명자는 선행 연구에서 p38의 유전적 붕괴가 c-myc의 과발현을 유도하고 이로 인해 폐의 치조 상피세포(alveolar epithelial cell)가 과증식되면서 신생쥐의 치사(neonatal lethality)가 유도됨을 밝혔으며, 또한 p38이 TGF-β에 의해 유도되고 핵으로 이동하여 c-myc의 발현을 억제하는 것을 분자 및 세포학적 분석으로 밝힌 바 있다(M. J. Kim, B.-J. Park, Y.-S. Kang, H. J. Kim, J.-H. Park, J. W. Kang, S. W. Lee,J. M. Han, H.-W. Lee, S. Kim, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003).
상기한 연구에 이어, 본 발명자는 p38이 신규한 암 억제자(tumor suppressor)로 Smad2/3과 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β의 신호전달을 강화시키는 기능을 함을 밝혔다. 또한, 암 세포주 및 조직에서 p38의 엑손 2가 결손된 형태의 변이체인 p38-DX2가 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다: 엑손 2가 결손된 p38 변이체인 p38-DX2의 존재를 RT-PCR을 수행하여 p38-특이적 프라이머 조합에 따라 밴드가 다르게 나타나는 것에서 확인하였다. 엑손 3과 4를 포함하는 p38 cDNA에서 유래한 프라이머 쌍을 RT-PCR에 사용하였을 때는, 웨스턴 블랏에서 낮은 p38 수준을 보이는 세포에서 p38 전사 감소가 관찰되지 않았으나, 엑손 1 내지 3을 포함하는 전사물에서 유래한 프라이머를 가지고 RT-PCR을 수행하였을 때 예상 크기의 전사물와 함께 크기가 작은 전사물도 함께 나타났다. 작은 크기의 밴드로 나타나는 전사물을 시퀸싱 해 본 결과 p38의 엑손 2에 해당하는 69 아미노산 모두가 결손된 p38의 변이체였다. 엑손 1과 엑손 3의 접합 서열에 특이적인 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하였을 때, 낮은 p38 수준을 보이면서 표준의 p38 전사물 외에도 크기가 적은 전사물을 생성하는 세포주에서만 PCR 산물이 생성되는 것을 확인하여 다시 한번 p38 변이체의 존재를 증명하였다.
또한, 본 발명자는 p38-DX2-형질전환된 세포에서는 TGF-β와 상관없이 p38 수준이 극적으로 감소되는 것으로 p38-DX2 생성이 p38 활성의 상실을 초래하는 것을 확인하였으며, 실제로 세포 내로 p38-DX2를 형질전환시킨 결과 c-myc 발현을 증가시키고 p38의 핵 이동을 막고 세포 성장을 정지시키는 등의 TGF-β 신호의 이상-기능이 초래되었다. p38-DX2는 p38와 헤테로다이머를 형성하고, 이 경우 p38은 유비퀴틴화 되면서 빠르게 분해된다는 것을 확인하여, p38-DX2가 p38 수준의 감소를 유발하고, 이로 인한 암 형성과 진행에 밀접하게 연관되어 있음을 입증하였다. 이러한 p38-DX2의 생성은 폐암뿐만 아니라 간암에서도 관측되었다.
하나의 양태로서 본 발명은 폐암 또는 간암에서 특이적으로 발현되는 엑손 2가 결실된 p38 변이체인 p38-DX2 단백질을 제공한다.
본 발명의 p38-DX2 단백질은 p38 단백질 서열 중 엑손 2의 영역이 결실된 변이체로서, p38 단백질의 서열(312aa version:AAC50391.1 또는 GI:1215669; 320aa version: AAH13630.1, GI:15489023, BC013630.1)은 문헌(312aa version: Nicolaides,N.C., Kinzler,K.W. and Vogelstein,B. Analysis of the 5' region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene, Genomics 29 (2), 329-334 (1995)// 320 aa version: Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))에 기술되어 있으며, 이 중 엑손 2에 해당하는 영역이 결실된 단백질이다. 본 발명자에 의해 출원된 한국 특허 출원 10-2003-0018424는 p38 단백질의 암 치료 효과에 대해 기술하고 있으며, 이 특허 문헌에서 기술된 p38 단백질에 대한 설명이 본원에 인용된다.
상기한 p38-DX2 단백질은, 전체 서열의 p38에서 엑손 2의 영역이 결실된 단백질을 포함하여, p38 등가물(아미노산 서열의 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 변형체로 p38과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물, 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지나 p38과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 유도체)에서 엑손 2의 영역이 결실된 단백질을 포함한다.
본 발명에서 p38 단백질 서열 중 “엑손 2의 영역이 결실”되었다는 것은 p38 단백질에서 엑손 2 영역의 아미노산 서열(아미노산 46번 내지 114번)이 부분적으로나 전체적으로 상실되어 생긴 변이체가 p38 단백질과 헤테로다이머를 형성하여 p38의 정상적인 기능을 방해하고 분해를 촉진하게 하는 것을 말한다. 따라서, p38-DX2 단백질은 p38 단백질의 엑손 2의 아미노산 서열이 모두 결실되거나 이 영역의 아미노산 서열을 포함하여 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4 또는 이들 영역 모두에서 이들 영역의 일부도 결실되거나, 엑손 2의 아미노산 서열의 일부만이 결실된 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 p38-DX2 단백질은 p38 단백질의 엑손 2의 아미노산 서열이 모두 결실된 단백질이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 p38-DX2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.
또한, 본 발명의 p38-DX2 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백 질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. p38-DX2 단백질의 변이체란 p38-DX2 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 p38-DX2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, p38-DX2를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 p38-DX2가 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 형질전환체로부터 p38-DX2를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명자는 p38-DX2 단백질이 폐암 또는 간암 조직에서 특이적으로 발현된다는 것을 발견하였으며, 이러한 단백질의 검출이 폐암 또는 간암을 진단하는데 이용될 수 있어 p38-DX2는 폐암 또는 간암의 진단 마커로 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
상술한 바와 같은 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기한 서열번호 2의 p38-DX2 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
본 발명의 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있다. 본 발명의 p38-DX2 단백질 코딩하는 핵산 서열을 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 p38-DX2 단백질을 제공할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 p38-DX2 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
형질전환체의 배양은 목적 단백질인 p38-DX2의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
형질전환체에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 p38-DX2 단백질을 정제할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
본 발명에서 용어 “폐암 또는 간암 진단 마커”란 폐암 또는 간암과 관련된 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 폐함 또는 간암의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상조직과 폐암 또는 간암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 정상세포에서는 발현되지 않으나 폐암 또는 간암 조직 및 세포에서만 특이적으로 발현되는 p38-DX2가 폐암 또는 간암의 진단 마커로 사용된다. 바람직하게는, p38-DX2의 mRNA 수준 또는/및 단백질의 수준에서 발현여부를 확인함으로써 폐암 또는 간암을 진단할 수 있다
다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2에 특이적인 항체를 제공한다.
발명에서 용어 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 p38와 구분하여 p38-DX2를 특이적으로 인지하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 p38-DX2 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 p38-DX2 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 p38-DX2 단백질 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 p38-DX2에 특이적인 항체는 폐암 또는 간암 진단에 사용될 뿐만 아니라, 환자에게 투여함으로써 p38-DX2의 활성을 억제하여 폐암 또는 간암 치료에도 사용될 수 있다. 치료용 항체로 사용될 경우, 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다.
항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종(radionuclide), 약제, 림포카인, 독소, 이형가능성 항체 등이 있으나 이로 제한되지는 않는다. 방사성핵종에는 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등이 있다. 약제에는 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin)등이 있고 림포카인에는 인터페론 등이 있다. 독소에는 리신, 아브린, 드프테리아 등이 있다. 그리고 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포 (예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체인 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies)가 있다.
항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다.
치료용 조성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내, 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 제제의 pH는 항체 안정성(화학적 및 물리적 안정성)의 균형을 맞추고 투여되는 환자에게 적절하도록 하는데 일반적으로, pH 4 와 pH 8 범위이다. 그 외에도 경피 투여 및 경구 투여 등의 투여를 위한 다른 기술들을 적절하게 변형시켜 이용하여, 적당한 제제를 고안할 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체는 항체를 암호화하는 핵산의 형태로 투여되어 세포내에서 항체가 생성되도록 할 수 있다(WO96/07321).
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 또는 간암 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 폐암 또는 간암 진단 키트에는 p38-DX2 단백질을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 폐암 또는 간암 진단 키트는 이에 한정되는 것은 아니나 ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2에 특이적인 항체를 검출 시료와 접촉 시키고 항원-항체 복합체를 형성하고 항원-항체 복합체의 형성량을 대조구와 비교함으로써 폐암 또는 간암 진단 마커 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 “검출 시료”란 폐암 또는 간암 발생에 의해 마커 단백질의 발현량의 차이가 검출될 수 있는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 정액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 생물학적 시료를 의미하며 당 업계에서 널리 공지된 방법으로 처리하여 준비된다.
본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 생물학적 시료 중의 p38-DX2 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체 형성을 살펴보는 실험방법에는 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블랏팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 “폐암 또는 간암 진단 마커 단백질 검출”은 항원-항체 결합체와 결합한 검출 라벨(detection label)의 시그널 크기를 정성 또는 정량적으로 측정하여 폐암 또는 간암 진단 마커인 p38-DX2 단백질의 존재 여부와 양을 확인하는 것을 의미한다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy)3]2+ , [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
대조구와 검출 시료중의 항원-항체 복합체 형성량 사이에 유의적인 차이가 있는지를 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 살펴봄으로써 폐암 또는 간암을 진단할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2의 mRNA에 특이적인 siRNA(small interfering RNA) 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서 용어 "siRNA”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 전장은, 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사슬 돌출을 구성하는 길이의 합으로 나타내었다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서, 용어 “특이적” 또는 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 p38-DX2 특이적이다. 본 발명의 siRNA는 p38-DX2 특이적으로 작동하도록 p38-DX2의 엑손 1과 엑손 3의 경계 지점에 해당하는 mRNA와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.
상기에서 “유전자 발현의 감소(Inhibition of gene expression)” 란 목적 유전자에서 생성된 mRNA 및/또는 단백질의 수준이 제거 또는 감소된 것을 의미하고, 이는 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 일어나는 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상에 의한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트를 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생 물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 siRNA는 p38-DX2 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있으면 서열과 길이는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 구체적 실시에서는 3종류의 p38-DX2 특이적인 siRNA를 발현하는 벡터를 제작하였으며, siRNA가 세포내 p38-DX2의 세포내 수준을 감소시키고 p38의 기능과 TGF-β 신호 전달 과정을 회복할 있음을 확인하였다.
본 발명의 p38-DX2에 특이적인 siRNA는 p38-DX2 mRNA의 엑손 1과 엑손 3이 연결되는 부위에 해당하는 서열을 포함하는 핵산이다. 바람직하게는 각각 서열번호 9와 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 3번 siRNA, 서열번호 11와 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 4번 siRNA, 또는 서열번호 13과 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 5번 siRNA이다. 그 중에서 서열번호 11와 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 siRNA가 가장 바람직하다. 단일 또는 두 종류 이상의 siRNA를 혼합하여 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2 단백질의 mRNA에 상보적인 안티센스 핵산 서열을 제공한다.
본 발명에서 용어 "안티센스 핵산”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발 명의 안티센스 서열은 p38-DX2 mRNA에 상보적이고 p38-DX2 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 p38-DX2 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실 아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 p38-DX2에 특이적인 안티센스 핵산은 p38-DX2 mRNA의 엑손 1과 엑손 3이 연결되는 부위에 해당하는 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는 폐암 또는 간암을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이를 투여하여 폐암 또는 간암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
siRNA 또는 p38-DX2 안티센스 핵산 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 환자의 암 세포의 증식을 저해시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제 예를 들어, 리포좀 (미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한, 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩파이드 독소 등이 있다(Haralambid et al, WO 8903849; Lebleu et al., EP 0263740].
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 함유되는 p38-DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여 방 법, 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 이외의 본 발명 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38 단백질의 mRNA와 p38-DX2 단백질의 mRNA를 구분하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 폐암 또는 간암 진단 마커 p38-DX2 단백질의 mRNA를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 “p38-DX2 단백질의 mRNA 검출”은 세포에서 발현되는 폐암 또는 간암 진단 마커인 p38-DX2의 mRNA 존재 여부와 양을 확인하는 것으로 p38-DX2 mRNA에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 사용하여 검출 가능하다.
본 발명에서 용어 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 용어 “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하 며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.
프로브나 프라이머를 이용하여 p38-DX2 mRNA를 검출할 수 있는 방법으로는 DNA 시퀸싱(DNA sequencing), RT-PCR, 프라이머 연장 방법(Nikiforov, T.T. et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175 (1994)), 올리고뉴클레오티드 연장 분석(OLA)(Nickerson, D.A. et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927 (1990)), 대립형질 특이적인 PCR 방법(Rust, S. et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629 (1993)), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage; Myers R.M. et al., Science, 230, 1242-1246 (1985)), 단일가닥 형상 다형성(single strand conformation lymorphism: SSCP; Orita M. et al.,Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770 (1989)), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al., Mol Cells, 5:668-672 (1995)), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE; Cariello NF. et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734 (1988)), 변성 고압 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography: D-HPLC, Underhill PA. et al., Genome Res, 7, 996-1005 (1997)) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 폐암 또는 간암 진단 마커 mRNA를 검출하는 방법이다. RT-PCR은 P. Seeburg(1986)에 의해 RNA 를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하게 된다. 이 때 증폭 단계에서는 본 발명의 목적에 맞게 제조된 프라이머를 사용하도록 한다. 본 발명의 목적상 프라이머는 각각 정상 p38 mRNA와 변이체 p38-DX2 mRNA에 해당하는 크기가 다른 2개의 밴드로 나타내는 프라이머와 p38-DX2 단백질의 mRNA에 해당하는 밴드만 나타내는 프라이머로 제작할 수 있다. 크기가 다른 2개의 밴드로 나타나도록 하기 위해서는 엑손 2에 해당하는 부분이 전사되도록 2개의 프라이머 위치를 지정하여 제작하면 된다. 프라이머의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 본 발명에서는, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 사용하였다. 변이체에 해당하는 밴드만 나타나도록 프라이머를 제작하기 위해서는 하나의 프라이머가 엑손 1의 C말단과 엑손 3의 N말단이 연결되는 지점의 서열을 가지도록 제작하면 된다. 본 발명에서는 접합 지점에 해당하는 프라이머로 서열번호 8의 프라이머를 제작하고 서열번호 7의 프라이머와 함께 사용하여 RT-PCR하였다. RT-PCR은 밴드 패턴을 확인함으로써 진단 마커 p38-DX2 mRNA 발현 여부를 확인 가능하고 폐암 또는 간암 발생 여부를 진단할 수 있는 간편한 방법이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2 단백질과 p38의 헤테로다이머 형성을 저해하는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
스크리닝에는 바람직하게는, 이스트 투 하이브리드(yeast-two-hybrid), 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)가 이용될 수 있다.
이스트 투-하이브리드 어세이는 Field & Song(1989)에 의해 최초 개발된 방 법으로, 전사조절 단백질의 DNA 결합 도메인(DNA binding domain)과 전사 활성 도메인(transcription activation domain)에 각각 바이트와 프레이 단백질을 융합 단백질의 형태로 발현시키고, 전사조절 단백질에 조절받는 유전자의 발현과 영양결핍 배지에서 효모가 자라는 여부로 살펴봄으로써 두 단백질(프레이 단백질, 바이트 단백질)의 상호작용 여부를 확인할 수 있는 스크리닝 방법이다. 시험관 풀-다운 어세이는 단백질간의 상호작용을 태그된 단백질(바이트 단백질)을 정제하고 이때 바이트 단백질에 결합하는 단백질 결합 파트너(프레이단백질)의 풀-다운 여부를 확인함으로써 두 단백질의 결합 여부를 확인할 수 있는 스크리닝 방법이다. 이들 스크리닝 방법을 수행하여 p38-DX2 와 p38의 헤테로다이머 형성을 저해시키는 억제제를 선별할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p38-DX2 단백질이 발현되는 세포를 배양하고 후보 억제제를 세포에 처리한 뒤 후보 억제제를 처리하지 않는 대조구 세포에서의 폐암 또는 간암 진단 마커(단백질, mRNA)의 발현 정도와 비교하여 p38-DX2 단백질 발현을 저해하는 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
스크리닝에는 바람직하게는, 폐암 또는 간암 진단 마커의 mRNA 발현 정도를 프라이머 또는 프로브를 이용하는 방법이 이용될 수 있으며 그 중에서도 RT-PCR이 바람직하다. 대조구와 비교하여 진단 마커의 발현을 감소시키는 억제제를 선별하여 폐암 또는 간암의 치료에 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
세포 배양, 화합물 및 세포주기 분석
본 연구에 사용된 세포주는 10% FBS 포함하는 RPMI-1640에서 유지하였다. 마우스 배아 섬유아세포(MEFs: Mouse embryonic fibroblasts)는 12.5 일 내지 14.5일 된 배아에서 분리하였으며 20% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. TGF-β가 세포주기에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 세포를 무혈청 또는 1% FBS를 포함하는 배지에서 2 ng/ml의 TGF-β로 처리하여 배양하고, 세포를 모아서 FACS 분석하였다. 또한, 세포 증식은 [3H] 티미딘 삽입(thymidine incorporation)으로 측정하였다. 세포를 TGF-β를 처리 또는 무처리한 상태의 무혈청 배지에서 20시간 동안 배양한 뒤, [3H] 티미딘 1 μCi/ml 존재하에 4시간 배양하였다. 삽입된 티미딘은 액체 섬광계수기(liquid scintillation couner)를 이용하여 문헌 (Kim, M. J. et al., Nat. Genet. 34, 330-336 (2003))에 따라 정량하였다. TGF-β는 R&D system에서, 항-Smad 2, 및 -Smad4 항체는 Santa Cruz에서 구입하였다.
면역침전과 웨스턴 블랏 분석
세포를 TGF-β로 일정 시간 동안 처리하고 프로티아제(protease)를 포함하는 RIPA 완충액을 이용하여 세포에서 단백질을 추출하고, 10 내지 12% SDS-PAGE를 이용해서 분리한 뒤, 특이적 항체로 ECL 시스템을 이용하여 면역블랏팅 하였다. 면역 침전을 위하여, 세포 라이세트를 IgG 및 아가로즈-콘쥬게이트된 단백질-A로 처리하였다. 원심분리 후에, 상등액을 특이적 항체 및 아가로즈-콘쥬게이트된 A로 2시간 배양하였다. 차가운 PBS 로 2번, RIPA로 1번 세척한 후에, 결합된 단백질을 특이적 항체로 침전시키고 용출하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
RT-PCR
전체 RNA(total-RAN)를 제조사(Qiagen)의 프로토콜에 따라서 분리하였다. 신선하게 준비된 조직(3×3×3mm)을 작은 조각으로 자르고, 350ul 라이시스 완충액으로 혼합하여, 호모게나이저 또는 주사기로 균질화시켰다. 350ul의 70% 에탄올을 첨가한 뒤에, 라이세트(lysate)를 여러번 아래위로 흔들어서, 컬럼에 로딩하고 13,000 RPM으로 15초간 원심분리하였다. 컬럼을 세척 완충액으로 2번 세척한 후에, RNA를 40ul의 RNase-free DW로 용출하였다. 역전사를 위하여, 1㎍의 분리된 RNA를 p38-특이적 프라이머(도 8b)의 주형으로 사용하였다. 역전사 후, DW 3배로 희석시키고, 1ul를 0.5ul dMTP(각 2.5mM), 0.5ul의 표시된 프라이머(각 10pM), 1.5ul DMSO 및 0.1ul Taq 폴리머라제(5U/ul)을 포함하는 30ul PCR 반응에 사용하였 다.
siRNA 이용한 p38DX2의 억제
p38DX2의 발현을 억제하기 위하여, p38DX2에 대한 siRNA를 제작하였다. p38DX2에 대한 siRNA를 코딩하는 서열을 제작하고 IMG-700(Imgenex) 벡터의 SalI 과 XbaI 부위와 연결시키고 클로닝을 DNA 시퀸싱으로 확인하였다. H322 세포를 si-DX2 발현하는 벡터 2μg으로 형질전환시켰다. 1ml 무혈청 배지에서 3시간 동안 DNA-리포좀 복합체와 인큐베이션한 후, 20% FBS을 포함하는 RPMI-1640 1ml을 H322 세포에 투여하였다. 추가로 20시간 더 배양한 후 무혈청 조건 또는 지시된 시간동안 TGF-β 를 처리하였다.
이스트 투 하이브리드 어세이
인간 p38 및 Smad2 (및 이의 결실 단편들)을 코딩하는 cDNA를 특이적 프라이머를 이용하는 PCR로 획득하였다. Smad2 및 p38의 PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI으로 절단하여 각각 pEG202(LexA) 및 pJG4-5(B42)의 같은 사이트로 결합시켰다(Gyuris, J et al., a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75, 791-803 (1993)). Lex-Smad2 단편 및 B42-p38간의 상호작용은 X-gal을 포함하는 효모 배지에서 생존하는 능력으로 분석하였다(Rho, S. B. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4488-93. (1999)).
p38DX2를 안정적으로 생성하는 세포 구축
야생형 MEFs를 pcNDA-p38DX2 또는 pcDNA로 형질전환시키고, 형질전환체를 400ug/ml G418을 포함하는 DMEM 배지에서 선택하였다. 형질전환되지 않은 세포를 제거한 후에, 형질전환체를 G418을 포함하지 않는 배지에서 3일간 배양 후, 2% PFA로 고정시키고 Giemsa로 염색하였다.
면역염색과 조직학적 분석
냉동된 조직 슬라이드를 2% 파라포름알데하이드로 고정하고 차가운 PBS로 세 번 세척하였다. 0.2% 트리톤 X 100(PBST) 및 1% BSA를 포함하는 PBS로 블랏킹 및 침윤(permeablization)후에, 슬라이드를 항-p38 항체로 2 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후에, 항-래빗 고트 IgG-FITC 및 프로피디유 요오다이드(propidium iodide: PI 50 μg/ml)로 1시간 동안 배양한 뒤, PBS로 세척하고, 고정하여 콘포컬 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다.
p38-DX2 발현 벡터 제작
p38-DX2를 발현하는 플라스미드를 구축하기 위하여, p38-DX2의 cDNA를 pcDNA3.1-myc으로 클로닝하였다. 먼저 p38-DX2를 H322 cDNA에서 EcoR1 and Xho I linker가 달린 primer를 이용하여 증폭시킨후 EcoR1 과 Xho 1를 이용하여 pcDNA3.1-myc에 클로닝하였다. p38DX를 발현하는 pcDNA3-myc/p38DX2 벡터 (도 12)는 Escherichia coli DH5alpha/p38-DX2의 형태로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 2004년 10월 25일자로 기탁번호 KCTC 10710BP로 기탁하였다.
폐암 형성
p38+/- 마우스 32마리와 (수컷 19마리와 암컷 13마리) p38+/+ 마우스 25마리 (수컷 14마리 및 암컷 11마리)를 실험에 사용하였다. 마우스 복강내로 벤조피렌(100 mg/kg)을 단일 주사하였다. 대조구로, p38+/+ 마우스 3마리(수컷 2마리 및 암컷 1마리) 및 p38+/- 마우스 5마리(수컷 4마리 및 암컷 1마리)를 비컬 용액(살린에 10% DMSO 및 35% PEG 40이 녹은 용액)으로 주사하였다. 마우스를 표시된 시간에 도살하여 폐 조직을 포름알데하이드로 고정한 뒤, 문헌 (Kim, M. J. et al., Nat. Genet. 34, 330-336, 2003)의 방법으로 H&E 염색을 하고 광학 현미경으로 관찰하였다.
실시예 1 - TGF-β 신호 전달에서 p38의 기능적 중요함과 작용 방식
TGF-β 신호 전달에서 p38이 중요하게 작용하는 것을 살펴보기 위하여, TGF-β 유도된 세포 성장 정지, Smad2/3의 핵이동 및 Smad2/3과 p38의 상호작용에 대한 p38+/+ 및 p38－/－ MEFs의 반응을 조사하였다. 티미딘 삽입, 콜로니 형성 및 유세포 분석기(flow cytometry)로 살펴본 결과, 정상 세포(wild type cells)의 성장은 TGF-β에 억제되는데 비하여, p38-결핍된 세포는 이러한 신호에 반응을 보이지 않았다(각 도. 1a, b 및 c). MEFs를 TGF-β로 처리하였을 때, 정상세포에서는 Smad2 및 Smad3가 핵으로 이동되었으나 p38－/－ 세포에서는 그렇지 않았다(도 1d). 이런 모든 결과들은 Smad2 및 3을 경유하는 TGF-β 신호전달에서 p38의 기능적 중요성을 나타내는 것이다. p38의 Smad2 및 3과의 가능한 상호작용을 공동-면역침전으로 조사하였다. p38은 Smad2/3과 상호작용을 보였으며, 이는 TGF-β 에 의해 강화되었다(도 1e). p38과 두개의 R-Smad간의 직접적 상호작용을 이스트 투 하이브리드 및 시험과내 풀-다운 어세이로 확인하였다(도2, 도 7). Smad2/3에 결합하는 p38의 양은 TGF-β 에 의해 p38이 유도됨에 따라 증가하였다(도 2a). 형질전환에 의해 p38 수준이 증가할 때, TGF-β 타겟 유전자의 발현은 강화되었고, 이는 TGF-β 신호전달에서 p38의 자극적인 역할을 의미하는 것이다(도 2b). p38은 Smad2 및 3 모두에 결합하기 때문에, 이러한 두 R-Smad는 비슷한 방식으로 작동할 것이라고 예측할 수 있었고, 따라서, p38과 Smad2와의 상호작용에 초점을 맞추어 더 자세히 살펴보았다. TGF-β 의존적 Smad2의 인산화는 p38-결핍된 MEFs에서 억제되었으나, p38이 p38-/- 세포로 유입되면 복구되었다(도 2c). p38와 상호작용에 관련된 Smad2의 도메인을 이스트 투 하이브리드(도 2d) 및 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)(도 7)로 살펴보았다. 두 실험을 통하여, Smad2의 MH2 도메인이 상호작용에 관련된 것으로 밝혀졌다.
TGF-β 신호전달에서 p38의 작용 방식을 살펴보기 위해, 정상 및 p38 결핍된 세포에서 Smad2와 TGF-β 수용체의 TGF-β-유도된 결합을 살펴보았다. 세포를 TGF-β로 처리하고 Smad2와 수용체의 결합을 Smad2와 타입Ⅰ수용체의 공동-면역침전으로 시간 간격을 두고 모니터하였다. 야생형 세포(wild type cell)에서는 TGF-β 유도된 Smad2의 TGF-β 수용체와의 결합이 초기 시점에서 관찰되고 감소되었으나, p38 결핍된 세포에서는 Smad2와 결합한 수용체가 TGF-β 처리 후 후기 단계에서 축적되었다(도 2e). TGF-β-유도된 Smad2의 인산화에서, 야생형 세포에서는 인산화된 Smad2는 점차 증가하였지만, P38-/- 세포에서는 심각하게 억제되었다(도 2f). 이런 결과는 p38이 R-Smad2와의 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β 유도된 R-Smad의 인산화에 결정적 역할을 한다는 것을 의미한다.
실시예 2 - 암 세포에서 p38의 억제와 p38의 결실 형태의 생성
암 형성과 p38의 관련성을 조사하기 위하여, 상이한 여러 암 세포주에서 p38 의 발현 정도를 살펴보았다. 살펴본 6개 세포주 중에서 3개는 웨스턴 블랏(도 3a) 및 FACS 분석(도 3b)에서 낮은 p38 수준을 보였다. 낮은 p38 수준을 보이는 세포주 모두 TGF-β 타입 II 수용체가 정상 수준으로 발현되었고 키나제 활성도 보유하고 있다는 사실은, 낮은 p38 수준이 수용체의 기능 이상에 의한 결과가 아니라는 것을 의미한다. p38 수준차가 전사 차이에 의한 것인지를 살펴보기 위하여, 다른 조합의 p38 특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. p38 유전자는 4개의 엑손으로 구성되어 있다 (도 8a). 엑손 3 및 4를 관통하는 p38 cDNA 생성시키는 서열번호 3과 4의 프라이머를 사용하였을 때, 감소된 p38 수준을 보이는 세포에서 p38 전사의 감소는 관찰되지 않았고(도 3c, 첫 번째 줄), 이는 낮은 p38 수준이 낮은 전사의 결과가 아니라는 것을 의미한다. 엑손 1에서 3까지의 전사물을 생성시키는 서열번호 5와 6의 프라이머를 사용하였을 때, 예상한 크기의 전사물 뿐만 아니라 작은 크기의 전사물도 얻을 수 있었다(도 3c, 두 번째 줄). 작은 크기의 전사물의 서열분석 결과, p38의 69개 아미노산을 코딩하는 엑손2가 결손되어 있다는 것을 알 수 있었다(도 8b). 이 작은 크기의 전사물의 생성을 재확인하기 위하여, 엑손 2 결손에 의해 생성되는 엑손 1 및 엑손 3의 접합 서열을 타겟팅하는 서열번호 8의 프라이머(도 8b, 프라이머 DX-B)를 제작하고, 서열번호 7 프라이머를 함께 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 낮은 수준의 p38을 발생하는 세포주는 작은 크기의 전사물(DX2라고 명명, 도 3c, 두 번째 및 세 번째 줄)을 생성하였다.
항-p38 항체로 웨스턴 블랏 분석하면 일반적으로 전장 p38(full-length p38)만 검출되고 DX2는 검출되지 않으므로 (도 2a), 단백질 수준에서의 DX2는 매우 불 안정하다는 것을 의미한다. 또한, H460, H322 및 H290에서의 낮은 p38 수준이 면역 형광 염색으로 증명되었다(도 3d). 염색 차이가 생길 가능성을 배제하기 위하여, H460 및 DU145 세포를 같은 플레이트에 공동 배양하고 p38을 염색하였다. H460에서의 p38의 염색 강도는 DU145 보다 많이 약하였다(도 9a). 낮은 p38 수준을 보이는 세포에서 TGF-β-의존적인 p38의 핵 이동이 관찰되지 않았다(도 3d, 아랫줄). p38와 TGF-β 기능 사이의 관련성을 검토하기 위하여, 상기 세포주에서 TGF-β에 의한 성장 억제를 측정하였다. A549 및 DU145 세포의 성장은 TGF-β에 의하여 억제되는데 반하여, 낮은 p38 수준을 보이는 세포는 TGF-β에 반응하지 않았다(도 3e). 이런 결과는 A549 세포는 TGF-β에 민감하고, H460 세포는 TGF-β 둔감하다는 선행의 연구와 일치하는 것이다(Osada, H. et al. Cancer Res. 61, 8331-8339,2001; Kim, T. K. et al., Lung Cancer 31, 181-191, 2001). 또한, A549 및 DU145 세포에서 타겟 유전자는 TGF-β에 의해 유도되었으나 낮은 p38 수준을 보이는 H322 및 다른 2개 세포주에서는 유도되지 않았다(도 3f, 자료 없음).
실시예 3 - 기능성의 p38와 불활성의 결실 돌연변이체의 헤테로다이머 형성
DX2 생성과 p38 억제와의 일반적인 관련성을 이해하기 위하여, DX2를 DU145 세포로 형질전환한 후, p38 수준의 변화를 조사하였다. 웨스턴 블랏(도 4a, 첫번째 줄) 및 FACS 분석(도 9b) 결과, DX2 형질전환된 세포에서 p38는 감소되었다. 또한, p38의 타겟인, c-myc의 발현이 DX2 유입에 의해 증가하였다(도 4a,세번째 줄 ). DX2는 TGF-β 에 반응하여 성장 저지(growth arrest)를 경감시켰다(도 4b, 도 9c).
DX2가 기능적 p38(p38-F)에 어떻게 영향을 미치는지 살펴보았다. p38는 호모다이머를 형성할 수 있으므로(Quevillon, S. et al., J. Mol. Biol. 285, 183-195, 1999; Kim, J. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99, 7912-7916, 2002), p38-DX2가 p38-F와 상호작용하는지는 이스트 투 하이브리드 어세이로 살펴보았다. p38-DX2는 p38-F와 상호작용 하였으나, p38-DX끼리는 상호작용하지 않았다 (도 4c). 인.비트로 풀-다운 어세이에서, 방사선적으로의 합성된 p38-F 및 -DX2는 GST-p38-F와 공동 정제되었고(도 4d), 이는 p38-F 와 -DX2 사이의 직접적 상호작용이 있음을 증명하는 것이다. DX2가 TGF-β 신호전달에 활성을 나타내는지 살펴보기 위하여, 이스트 투 하이브리드 어세이로 Smad2와의 상호작용을 살펴보았다. p38는 p38의 타겟으로 알려진 FBP뿐만 아니라(Kim, M. J. et al., Nat. Genet. 34, 330-336, 2003) Smad2와 상호작용하는 반면에, DX2는 이러한 단백질과 전혀 결합하지 않았다 (도 4e).
헤테로다이머 형성이 어떻게 p38을 억제하는지 알기 위하여, p38 수준이 프로테아좀-의존적 분해 과정에 의해 조절되는지를 체크하였다. DX2-생산하는 H322 세포를 프로티아좀 억제제 ALLN (Zhou, M., et al., J. Biol. Chem. 271, 24769-24775, 1996)으로 처리하고, p38 수준이 프로테아좀 차단에 의해 증가하는지를 살펴보았다. 웨스턴 블랏 (도 4f), 면역 형광 염색 (도 4g) 및 유세포 분석기(도 9d)에서 볼 수 있듯이, p38는 ALLN 처리에 의해 현저하게 증가하였고, 이는 세포내 p38 수준이 프로테아좀-매개된 분해로 조절된다는 것을 나타낸다. 또한, p38-DX2 형태도 프로테오좀 억제에 의해 검출되었고(도 4f), 이는 DX2가 빠른 프로테오좀-의존적 분해 때문에 불안정하다는 개념을 확인시키는 것이다. p38-DX2의 낮은 강도는 RT-PCR 분석으로 증명하였듯이(도 3c) 정상 p38와 비교하여 낮은 발현 및/또는 항-p38 항체에 의한 불충분한 인지 때문이다. p38 분해는 프로테아좀에 의해 매개되기 때문에, 유비퀴틴화(ubiqutination)가 DX2에 의해 촉진되는지 살펴보았다. ALLN으로 처리된, 대조구 및 DX2-형질전환된 세포로부터 p38을 면역침전하고 항-유뷔퀴틴 항체로 블랏팅하였을 때, 대조구 세포와 비교하여 높은 양의 유비퀴틴화된 p38이 DX2-형질전환된 세포에서 관찰되었다(도 4h). 이상으로부터, DX2는 p38에 결합하여 분해 과정으로 빠르게 진행되는 불활성의 헤테로다이머를 형성하는 도미넌트 네가티브 돌연변이(dominant negative mutant)로 작용하는 것으로 여겨진다.
실시예 4 - p38-DX2에 의한 TGF-β 신호전달 불활성화 및 세포 성장 촉진
DX2를 MEFs로 트랙스펙션한 뒤, DX2가 세포 성장에 미치는 효과를 현미경 분석 및 콜로니 형성으로 관찰하였다. 세포 성장은 DX2 유입에 의하여 현저하게 증가하였다(도 5a). 또한, DX2에 특이적으로 결합할 수 있는 3가지 종류의 siRNA(si-DX2)를 (도 5b), 발현하는 각각 벡터를 제조하여 DX2를 생성하는 H322 및 H460 세포에 형질전환한 후 정상적 p38 및 smad2의 인산화에 미치는 영향을 살펴보 았다(도 5c). 4번 또는 5번의 siRNA를 발현하는 벡터를 H322 세포에 형질전환 하였을 때, TGF-β에 의한 세포 사멸이 증가하고(좌) 세포주기의 정지(우)가 일어남을 유세포 분석기로 관찰할 수 있었다(도 5d). DX2를 발현하는 H322 세포에 DX2의 전사를 특이적으로 억제하는 4번 siRNA(si-DX2)를 발현하는 벡터를 유입하고, siRNA에 의해 p38의 정상적 수준 및 TGF-β 신호전달이 복구 되는지를 체크하였다. si-DX2는 DX2 전사물을 제거시키며(도 5e 상), 정상적 p38 수준 및 TGF-β-유도된 Smad2의 인산화(도 5e 하), Smad2의 핵이동(도 5f), TGF-β-의존적 리포터 발현(도 5g) 및 성장 정지(growth arrest)(도 5h)를 복구시켰다. 상기 모든 결과는 TGF-β 신호전달 및 세포 성장 조절에 미치는 DX2의 붕괴적인 효과를 증명하는 것들이다.
실시예 5 - p38 결실 변이체와 인간 폐암과의 관련성
p38의 감소는 다양한 암 세포주에서 자주 발견되고(도3a, b 및 d), p38의 손실은 폐 세포의 과-증식을 초래하기 때문에 (Kim, M. J. et al., Nat. Genet. 34, 330-336, 2003) 본 발명자는 p38 이상(abnormality)이 폐암 형성과 관련되어 있는지 살펴보았다. 이러한 가능을 검토하기 위하여, 화학적 발암물질, BP(benzo-(α)-pyrene)(Wang, Y. et al., Cancer Res. 63, 4389-4395 (2003))를 p38+/+ 및 p38+/- 마우스 복강내로 투여하여 폐의 종양을 유도한 뒤, 폐에서 종양 형성을 살펴보았다. BP 투여후 6주로부터, p38+/- 마우스에서는 50 내지 70%의 빈도로 폐 종양이 관찰되었고, 정상의 마우스에서는 약 30%로 관찰되었고(도 6a), 이는 이형의 마우스(heterozygous mice)가 BP-유도된 종양형성(BP-induced tumorigenesis)에 더 민감하다는 것을 의미한다. 항-p38 항체를 이용한 인.시추 면역형광 분석(In situ immunofluorescence analysis)에 의하면 종양 부위에서 p38이 현저하게 감소된 것으로 보였다(도 6b). BP-주사된 마우스의 폐에서 DX2 생성 여부를 조사하였다. 세 마리의 p38+/+ 마우스에서 한 마리만이 종양을 발생시키는데 비하여, p38+/- 마우스에서 분리한 4개 폐 중에서 3개에서 종양이 생성되었다. 모든 이런 종양은 DX-2를 생성시켰고(도 10a), 이는 폐암 형성과 DX2의 관련성을 지지한다.
인간 폐의 비종양의 염증성의 조직과(the inflammatory but non-tumor) 종양 조직에서 p38 수준을 비교하였다. p38는 비-종양 부위와 비교하여 종양 부위에서 현저하게 감소하였다(도 6c). DX2는 종양 조직에서만 생성되었다 (도 6d). 상이한 개체에 따라 p38 수준과 DX2 형성이 차이가 날 가능성을 배제하기 위하여, 같은 환자에서 분리한 정상 및 종양 조직에서 RT-PCR 및 면역형성 분석을 수행하였다. 다시, p38의 암-특이적 감소가 고 빈도로 관찰되었으며(도 6e 및 도 10b), DX2의 생성과 관련되어 있었다(도 6f). 암 부위에서 정상적 p38 수준을 보이는 하나의 사례에서 DX2가 관찰되지 않았다(도 6e 및 f, 환자 22872). 병리학상으로 폐 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma) 및 대세포암(large cell adenocarcinoma)으로 진단된 10개의 상이한 샘플을 조사하였을 때, 8개 경우에서 p38의 암-특이적 감소 및 DX2의 생성을 관찰할 수 있었다(표 1). 2개 경우에 조직 학적으로 정상 영역에서 DX2가 발견되었지만, 이의 발생은 p38의 낮은 수준과 관련되어 있었다.
Figure 112005024527492-PAT00001
p38-F 컬럼에서 (+) 및 (-)는 정상(N) 및 종양(T) 조직에서 조직학적 분석으로 결정된 p38의 면역형광 염색을 의미한다. p38-DX2 컬럼에서 포지티브 및 네가티브는 RT-PCR로 측정한 DX2의 생성을 표시한 것이다. 약어들은 다음과 같다. Recur (recurrence), SQC (squamous cell carcinoma), ADC (adenocarcinoma), LAC (large cell adenocarcinoma), Opdate (operation date)
실시예 6 - 간암과 p38, p38-DX2의 연관성
인간 조직에서 간암과 p38, p38-DX2의 연관성을 살펴보았다.
2개의 간암(hepatocellular carcinoma) 시료에서 정상과 암조직에서 p38-DX2 생성 여부를 RT-PCR로 관찰하였다. 암조직에서 p38DX2의 형성이 관찰되었다(도 11a). 또한 동일한 간암 조직에서 p38의 수준이 매우 낮게 나타났다(도 11b).
본 발명의 폐암 또는 간암에서 특이적으로 발현되는 p38-DX2(단백질, mRNA)를 폐암 또는 간암 진단 마커로 사용하여 암을 정확하고 용이하게 진단할 수 있으며, p38-DX2 단백질에 대한 항체, siRNA, 안티센스 핵산 등과 같은 p38-DX2의 억제제를 사용하여 폐암 또는 간암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> p38-DX2 and its use <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 756 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(753) <223> p38DX2 amino acid sequence <400> 1 atg ccg atg tac cag gta aag ccc tat cac ggg ggc ggc gcg cct ctc 48 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 cgt gtg gag ctt ccc acc tgc atg tac cgg ctc ccc aac gtg cac ggc 96 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly 20 25 30 agg agc tac ggc cca gcg ccg ggc gct ggc cac gtg cag gat tac ggg 144 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly 35 40 45 gcg ctg aaa gac atc gtg atc aac gca aac ccg gcc tcc cct ccc ctc 192 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu 50 55 60 tcc ctg ctt gtg ctg cac agg ctg ctc tgt gag cac ttc agg gtc ctg 240 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu 65 70 75 80 tcc acg gtg cac acg cac tcc tcg gtc aag agc gtg cct gaa aac ctt 288 Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu 85 90 95 ctc aag tgc ttt gga gaa cag aat aaa aaa cag ccc cgc caa gac tat 336 Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr 100 105 110 cag ctg gga ttc act tta att tgg aag aat gtg ccg aag acg cag atg 384 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met 115 120 125 aaa ttc agc atc cag acg atg tgc ccc atc gaa ggc gaa ggg aac att 432 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 gca cgt ttc ttg ttc tct ctg ttt ggc cag aag cat aat gct gtc aac 480 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 gca acc ctt ata gat agc tgg gta gat att gcg att ttt cag tta aaa 528 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 gag gga agc agt aaa gaa aaa gcc gct gtt ttc cgc tcc atg aac tct 576 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 gct ctt ggg aag agc cct tgg ctc gct ggg aat gaa ctc acc 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Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met 115 120 125 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for exon 3-4 <400> 3 agtgctttgg agaacagaat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for exon 3-4 <400> 4 aagagcagag ttcatggagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for exon 1-3 <400> 5 tctgacggtt tctgagcgtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for exon 1-3 <400> 6 aagtgaatcc cagctgatag 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DX2 <400> 7 tgctttggtt ctgccatgcc g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for DX2 <400> 8 cgtaatcctg cacgtggcca g 21 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #3 coding nucleic acid sequence <400> 9 tcgaggccac gtgcaggtta cgggagtagg ccgtaatcct gcacgtggcc tttt 54 <210> 10 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #3 coding nucleic acid sequence <400> 10 ctagaaaagg ccacgtgcag gattacggca gactcccgta atcctgcacg tggcc 55 <210> 11 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #4 coding nucleic acid sequence <400> 11 tcgagctggc cacgtgcagg attacgagta ctggtaatcc tgcacgtggc cagctttt 58 <210> 12 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #4 coding nucleic acid sequence <400> 12 ctagaaaagc tggccacgtg caggattacc agtactcgta atcctgcacg tggccagc 58 <210> 13 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #5 coding nucleic acid sequence <400> 13 tcgacacgtg caggattacg gggcgagtac tggccccgta atcctgcacg tgtttt 56 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #5 coding nucleic acid sequence <400> 14 ctagaaaaca cgtgcaggat tacggggcca gtactcgccc cgtaatcctg cacgtg 56 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer <400> 15 cagcaccacg tctgc 15

Claims (25)

  1. p38 단백질의 엑손 2의 영역이 결실된 p38-DX2 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 p38-DX2 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 폐암 또는 간암 진단 마커인 p38-DX2 단백질.
  4. 제1항의 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 1의 핵산 분자.
  6. 제1항의 p38-DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  8. 제7항의 형질전환체를 배양하여 제1항의 p38-DX2 단백질을 제조하는 방법.
  9. 제1항의 p38-DX2 단백질에 특이적인 항체.
  10. 제1항의 p38-DX2 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 또는 간암 진단 키트.
  11. 제1항의 p38-DX2 단백질에 특이적인 항체를 검출 시료와 접촉시키는 단계, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 항원-항체 복합체의 형성량을 대조구와 비교하는 단계를 포함하여, 폐암 또는 간암 진단 마커 단백질 p38-DX2를 검출하는 방법.
  12. 제1항의 p38-DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12 또는 서열번호 13과 14의 뉴클레오타이드 서열로 코딩되는 센스와 안티센스 RNA 이중 사슬인 siRNA 핵산 분자.
  14. 제12항의 siRNA 핵산 분자를 포함하는, 폐암 또는 간암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  15. 제12항의 siRNA 핵산 분자를 투여하여, 폐암 또는 간암을 치료하는 방법.
  16. 제1항의 p38-DX2 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산 분자.
  17. 제16항의 안티센스 핵산 분자를 포함하는 폐암 또는 간암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  18. 제16항의 안티센스 핵산 분자를 투여하여, 폐암 또는 간암을 치료하는 방법.
  19. 제1항의 p38-DX2 단백질의 mRNA와 p38 단백질의 mRNA를 구분하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 폐암 또는 간암 진단 마커 단백질 p38-DX2의 mRNA를 검출하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 프라이머가 서열번호 5와 6, 또는 서열번호 7과 8인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 프로브가 서열번호 8인 방법.
  22. 제1항의 p38-DX2 단백질과 p38 단백질의 헤테로다이머 형성을 저해하는 억제제를 스크리닝하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 이스트 투 하이브리드(yeast-two-hybrid) 또는 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)로 스크리닝하는 방법.
  24. 제1항의 p38-DX2 단백질이 발현되는 세포를 배양하는 단계, 후보 억제제를 상기 세포에 처리하는 단계 및 대조구와 mRNA 또는 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하여, 제1항의 p38-DX2 단백질의 발현을 저해하는 억제제를 스크리닝하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)로 스크리닝하는 방법.
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