KR20070113926A

KR20070113926A - 암의 진단과 치료를 위한 ａｉｍｐ2ｄｘ2의 용도

Info

Publication number: KR20070113926A
Application number: KR1020060047831A
Authority: KR
Inventors: 김성훈
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2007-11-29

Abstract

본원에는 암 조직에서 특이적으로 발현하는 AIMP2의 엑손 2가 결손된 변이체 AIMP2DX2를 제공하고, 이를 암 진단 마커로 사용하여 암을 진단하며, AIMP2DX2를 저해하여 암을 치료 또는 예방하는 것에 대해 기술되어 있다.

AIMP2, AIMP2DX2, 암, 폐암, 간암, 진단 마커

Description

암의 진단과 치료를 위한 ＡＩＭＰ2ＤＸ2의 용도{Use of AIMP2DX2 for the diagnosis and treatment of cancer}

도1은 TGF-β 신호전달에서 AIMP2의 기능적 중요성 및 AIMP2과 Smad2/3의 상호작용을 보여준다.

도 2는 TGF-β 신호전달에서 AIMP2의 작동 기작을 보여준다.

도3은 AIMP2의 차이나는 발현과 AIMP2의 엑손2-결실 형태의 생성을 살펴본 결과이다.

도 4는 AIMP2DX2가 AIMP2의 세포내 안정성에 미치는 효과를 살펴본 결과이다.

도 5는 TGF-β 신호 전달 및 세포 성장 조절에서 AIMP2DX2의 붕괴적 효과를 살펴본 결과이다.

도 6은 폐암 형성과 AIMP2의 관련성을 살펴본 결과이다.

도 7은 AIMP2와의 상호작용에 관련된 Smad2 도메인을 측정한 결과이다.

도 8은 인간 AIMP2 유전자의 엑손 배열 및 AIMP2 cDNA에서 프라이머 위치를 보여준다.

도 9는 암세포주에서 AIMP2의 발현 감소 및 AIMP2DX2의 생성을 살펴본 결과이다.

도 10 폐암 조직에서 AIMP2DX2 생성 및 AIMP2의 억제를 살펴보았다.

도 11은 다양한 암조직과 암세포주에서 AIMP2DX2가 발현됨을 보여주는 결과이다.

도 12는 AIMP2 유전자를 넉아웃시킨 마우스에서의 발암 정도를 야생형 마우스와 비교하여 살펴본 결과이다.

도 13는 AIMP2DX2 발현 벡터를 보여준다.

도 14는 마우스 DX2를 타겟으로 하는 si-RNA를 삽입하는 벡터를 보여준다.

본 발명은 AIMP2의 엑손 2가 결손된 변이체 AIMP2DX2 및 이의 이용에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 AIMP2DX2, 이의 진단 마커로서의 용도 및 이의 억제제를 사용한 항암 용도에 관한 것이다.

세계적으로 암으로 인한 사망이 계속 증가하고 있다. 지난 수년간 암에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고 암은 여전히 전세계적인 주요 사망 원인이며, 외과 절제술, 방사선 요법, 화학요법 또는 기타 공지된 치료 방법에 의한 적절한 치료 작용을 용이하게 하기 위하여 암의 초기 진단을 위한 신속하고 간단한 방법이 요구된다.

암 특이적 마커의 개발은 암의 진단뿐만 아니라 암 특이적인 치료를 위해서도 요구되고 있다. 사이토톡신 치료(cytotoxic therapies)는 첫 항암 치료제로 사용된 이래 50여년 동안 암 치료에 광범위하게 쓰여 왔으나 암세포 외에 분열 속도 가 비교적 빠른 다른 장기의 세포에 비특이적으로 작용하여 강한 독성을 나타내고, 심각한 부작용을 초래하는 문제가 있다. 이러한 기존 항암제의 부작용 및 내성을 극복하기 위하여 정상세포의 암화 과정에 나타나는 암 특이적 마커(cancer specific marker) 이용하여 종양 세포 특이적으로 작용하는 치료제를 개발하고자 하는 연구가 진행되었다. 항암제에 의한 독성을 최소화하기 위한 방안으로 떠오르는 암 타겟팅 치료(cancer targeted therapy)의 핵심은 암세포 특이적인 유전자를 찾아내는 것이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자는 AIMP2의 엑손 2 결실 변이체인 AIMP2DX2를 마커로 이용할 경우 매우 신뢰도가 높게 암 발생 여부를 확인할 수 있으며, 또한 AIMP2DX2는 그 발현이 암 유발의 직접적 원인이 되므로 AIMP2DX2 단백질에 특이적인 항체, AIMP2DX2 mRNA에 대한 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 이용할 경우 암 세포 특이적으로 암을 치료할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AIMP2 단백질의 엑손 2의 영역이 결실된 AIMP2DX2 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조 합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 AIMP2DX2 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2 단백질에 특이적인 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2 단백질에 대한 항체를 포함하는 암 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료에서 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 포함하여, 암 진단 마커 단백질 AIMP2DX2를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 특이적 siRNA 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자를 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2의 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2의 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티 센스 핵산을 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2DX2의 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산을 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AIMP2 단백질의 mRNA와 AIMP2DX2 단백질의 mRNA를 구분하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 암 진단 마커 단백질 AIMP2DX2의 mRNA를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 시험물질을 AIMP2 단백질과 AIMP2DX2 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질이 AIMP2DX2 단백질과 AIMP2 단백질 사이의 헤테로다이머 형성을 억제하는지를 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2DX2 단백질과 AIMP2 단백질 사이의 헤테로다이머 형성을 억제하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2DX2 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2DX2 단백질의 분해를 촉진하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

도면의 상세한 설명

도 1은 TGF-β 신호전달에서 AIMP2의 기능적 중요성 및 AIMP2과 Smad2/3의 상호작 용을 보여준다. AIMP2^+/+ 및 AIMP2^-/- MEFs에서 TGF-β가 세포 증식(a), 콜로니 형성(b), 세포주기 진행(c), Smad2 및 Smad3의 핵 이동(d)에 미치는 효과를 측정하였다. a. 2, 4 및 4ng/ml의 TGF-β 농도로 6시간 동안 세포를 배양하였다. TGF-β 무처리 된 세포에서 티미딘 삽입(thymidine incorporation)을 1로 잡았을 때, 수치값은 4번의 독립적 실험값의 평균을 나타낸다. b. AIMP2^+/+ 및 AIMP2^-/- MEFs (14.5d)를 TGF-β (2 ng/ml) 존재하에 4시간 배양하고, 포름알데하이드로 고정한 뒤, Giemsa 염색으로 콜로니를 보이게 하였다. c. MEFs를 TGF-β로 24시간 처리한 뒤, G0/G1 상 세포가 차지하는 정도를 유세포 분석기(flow cytometry)로 살펴보았다. d. MEFs를 TGF-β(2ng/ml)로 1시간 동안 처리하였다. Smad2 및 Smad3를 이의 특이적 항체로 반응시킨 후 FITC-콘쥬게이트된 항체(녹색)로 살펴보았다. 핵은 PI(빨간색)으로 염색되었다. e. AIMP2과 Smad2 및 Smad3와의 상호작용은 Smad2 및 Smad3에 대한 항체를 이용한 공동-면역침전으로 살펴보았다.

도 2는 TGF-β 신호전달에서 AIMP2의 작동 기작을 보여준다. a. A549 세포를 TGF-β(2ng/ml)로 처리 후에, 정해진 시간에 수확하여 추출한 단백질을 항-Smad 2 또는 Smad3 항체로 면역침전하였고, 공동침전된 AIMP2을 항-AIMP2 항체로 측정하였다. WCL은 전체 세포 라이세프(lysate)의 단백질 웨스턴 블랏을 나타낸다. b. TGF-β 의 타겟 유전자, p15, p21, 및 PAI-1의 발현을 대조구 및 AIMP2-형질전환된 DU145에서 RT-PCR 로 살펴보았다. c. AIMP2^-/- MEFs에서 Smad2의 인산화에 미치는 AIMP2의 효과를 보여준다. d. Smad2의 개별 도메인(Mad-상동 도메인, MH1, MH2 및 링커)을 LexA 융합 단백질로 발현시키고, B42-융합된 AIMP2와의 상호작용을 X-gal-함유된 효모 배지에서의 블루 콜로니 형성으로 관찰하였다. e. Smad2와 TGF-β 수용체의 TGF-β-의존적 상호작용을 공동-면역침전으로 측정하였다. MEFs를 37℃에서 TGF-β로 처리하고, 면역침전 전에 8℃에서 배양하였다. TGF-β 수용체와 Smad2와의 결합을 항-TβRⅠ 항체로 면역블랏팅하여 관찰하였다. f. TGF-β 처리 후의 AIMP2^+/+ 및 AIMP2^-/- MEFs에서 총 Smad2, 인산화된 Smad2 (p-Smad2), 및 AIMP2 수준의 시간별 추이를 보여준다.

도 3은 AIMP2의 차이나는 발현과 AIMP2의 엑손2-결실 형태의 생성을 살펴본 결과이다. 다양한 암 세포주에서 AIMP2 수준을 웨스턴 블랏(a), 유세포 분석기(b)로 비교하였다. A549, NCI-H460, -H322 및 H290은 폐암 세포주이고, DU145 및 HCT116은 각각 전림선과 대장암 세포주이다. b. "Negative"는 2차 항체만 처리한 DU145를 나타낸다. 각 세포주의 2000 세포를 분석하였다. c. AIMP2의 전사 수준을 상이한 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR로 비교하였다. 엑손 3-4 및 1-3을 관통하는 전사물은 각각 프라이머 6/7 및 1/5 (도 8b)를 사용하여 생성되었다. GAPDH를 로딩 대조구로 사용되었다. 엑손 1-3의 전사물에 해당하는 프라이머 쌍을 이용할 경우 작은 크기의 AIMP2 전사물(smaller AIMP2 transcript)이 생성되었다. 이런 작은 크기의 전사물은 엑손 2가 부족한, AIMP2의 상이한 스프라이싱 형태(AIMP2DX2)이다. 이런 전사물은 프라이머 DX2-F와 엑손 1 및 3 사이를 접합 서열에 특이적인 프라이머(DX2-B)(도 8b)를 사용하여 RT-PCR을 할 때, 낮은-AIMP2 수준을 보이는 세 포주에서만 생성되었다. d. AIMP2의 TGF-β-의존적 유도 및 핵 이동은 TGF-β로 2시간 동안 배양한 후에 면역형광 염색하여 조사하였다. e. 표시된 세포의 증식에 미치는 TGF-β의 효과를 [³H] 티미딘 삽입 (n=4)으로 비교하여 보았다. f. 목적 유전자, p21 및 PAI-1의 TGF-β-의존적 유도를 TGF-β로 2시간 처리 후에 RT-PCR로 비교하여 보았다.

도 4는 AIMP2DX2가 AIMP2의 세포내 안정성에 미치는 효과를 살펴본 결과이다. a. TGF-β로 2시간 처리 또는 무처리 된 DU145 세포로 DX2를 형질전환한 후에, AIMP2 수준을 웨스턴 블랏으로 측정하였다. c-myc, DX2 및 GAPDH(대조구)의 발현을 RT-PCR로 살펴보았다. b. DU145로 DX2 및 공 벡터를 형질전환한 후에, TGF-β-의존적 세포 성장 억제에 미치는 효과를 티미딘 삽입으로 살펴보았다(n=4). c. AIMP2-F 및 -DX2 간의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 어세이법(Rho et al, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4488-93, 1999)으로 측정하였다. d. AIMP2-F 및 -DX2를 [³⁵S] 메티오닌 존재하에 인.비트로 번역으로 합성한 뒤, GST-AIMP2-F 또는 -CDK2 (대조구)와 혼합한 뒤, 글루타치온-세파로즈로 침전하였다. 침전된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 자가방사법으로 검출하였다. e. AIMP2-F 또는 -DX2와 FUSE-결합 단백질 (FBP: FUSE-binding protein)(Kim et al, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003) 및 Smad2와의 상호작용을 이스트 투 하이브리드로 측정하였다. f. 프로테아좀 억제제, ALLN (50 μM, 4시간)이 AIMP2-F 및 -DX2의 수준에 미치는 효과를 DX2-생성 H322 세포에서 항-AIMP2 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 측정하였다. DX2 형태 는 이의 인. 비트로 합성된 카운터파트(counterpart)와 젤상 공동-이동(co-migration)으로 확인하였다(자료 없음). g. ALLN (20 μM, 2시간) 처리 후 AIMP2 증가를 H322 세포에서 항-AIMP2 항체를 이용하여 면역형광염색으로 살펴보았다. h. Myc-태크된 DX2를 ALLN 처리된 DU145 세포로 형질전환하고, 항-AIMP2 항체를 이용하여 AIMP2을 면역침전한 뒤, 유비퀴틴화된 AIMP2 분자를 항-유비퀴틴 항체(Ubi)로 면역블랏팅하여 관찰하였다

도 5는 TGF-β 신호 전달 및 세포 성장 조절에서 AIMP2DX2의 붕괴적 효과를 살펴본 결과이다. a. DX2(또는 공벡터)를 MEFs로 형질전환한 뒤 세포 성장에 대한 효과를 살펴보았다. 세포 및 클로니를 각각 광학 현미경(상) 및 Giemsa 염색(하)으로 살펴보았다. b. DX2 특이적인 3 종류의 siRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 보여준다. c. 3가지 종류의 siRNA를 발현하는 벡터를 각각 제조하여 암 세포주인 H322 및 H460 세포주에 형질전환한 후 정상적 AIMP2 및 smad2의 인산화에 미치는 영향을 조사하였다. d. 4번 및 5번 siRNA를 H322 세포에 형질전환 하였을 때, TGF-β에 의한 세포 사멸 정도(좌)와 세포주기의 정지 정도(우)를 살펴보았다. e. AIMP2DX2를 타겟팅하는 4번 siRNA(si-DX2)를 발현하는 벡터를 H322로 유입하고 DX2 전사 억제에 대한 효과를 RT-PCR로 측정하였다(상). si-DX2는 엑손 3-4에 해당하는 전사물의 RT-PCR에서 알 수 있듯이 전장 AIMP2(full-length AIMP2) 전사에는 영향을 미치지 않았다. si-DX2가 Smad2의 인산화 및 AIMP2 발현에 미치는 효과를 웨스턴 블랏으로 측정하였다(하). TGF-β 신호전달의 복구에 미치는 si-DX2의 효과를 H322를 이용하여 Smad2의 면역형광(f), 3TP 프로모터하 TGF-β 의존적 리포퍼 어세이(g), 성장 정지(h)로 측정하였다. f. p-Smad2 및 핵을 TGF-β 처리 30분 후에 FITC-콘쥬게이트된 이차 항체(초록색) 및 PI(빨간색)로 30분 염색하였다. si-DX2의 형질전환에 의하여 p-Smad2가 증가하고 핵에 위치하게 된다.

도 6은 폐암 형성과 AIMP2의 관련성을 살펴본 결과이다. a. AIMP2^+/+ 및 AIMP2^+/- 마우스로 벤조-(α)-피렌(benzo-(α)-pyrene)을 복강내 투여한 후 시간 간격으로 폐 종양 형성을 관찰하였다. “N"은 희생된 마우스 수를 나타낸다. b. 폐암 환자에서 분리된 정상 및 종양 부위에서 분리된 RNA를 DX-2 특이적 프라이머로 RT-PCR을 수행하였다. c. 환자의(코드 번호로 표시) 정상 및 종양 조직을 항-AIMP2 항체를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

도 7은 AIMP2와의 상호작용에 관련된 Smad2 도메인을 측정한 결과이다. AIMP2 또는 CDK2 를 코딩하는 cDNA를, pGEX4T-1의 EcoRI 및 XhoI 부위와 결합시켜서, GST-융합 단백질로 E.coli BL21(DE3)에서 발현시킨 후, 제조사의 설명에 따라서 융합 단백질을 분리하였다. 상이한 Smad2 결실 단편은 TNT 커플된 전사 키트(Promega)를 이용하여 [³⁵S] 메치오닌 존재하에, 시험관내 전사(in vitro translation)로 합성하였다. 글루타치온 세파로즈 비드에 결합된 GST 융합 단백질은, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM 페닐메틸설포닐 플로라이드(PMSF), 및 1% 트리톤 X-100을 포함하는 PBS 완충액(pH 7.4)의 결합 완충액에서 [³⁵S] 메치오닌-라벨된 Smad 단편과 배양하였다. 결합 혼합물을 4℃에서 회전시키면서 밤새 배양한 후 0.5% 트리톤 X-100을 포함하는 결합 완충액으로 4번 세척하였다. SDS 샘플 완충액을 첨가 후에, 결합된 단백질을 가열하여(boiling) 용출시켜 SDS 젤 전기영동으로 분리하였다. Smad2 단편의 존재는 자가방사법(autoradiography)으로 확인하였다.

도 8은 인간 AIMP2 유전자의 엑손 배열 및 AIMP2 cDNA에서 프라이머 위치를 보여준다. a. AIMP2 유전자는 표시된 크기의 폴리펩타이드를 코딩하는 4개의 엑손(파란색으로 표시)으로 구성되어 있다. b. AIMP2의 상이한 영역을 관통하는 cDNA를 생성시키는데 사용되는 프라이머의 위치 및 서열을 나타내는 도식도이다.

도 9는 암세포주에서 AIMP2의 발현 감소 및 AIMP2DX2의 생성을 살펴본 결과이다. a. DX2-포지티브 및 -네가티브 세포간의 AIMP2 수준을 비교하기 위하여, 하나의 디쉬에 DU145 및 H460 세포를 배양하고, 항-AIMP2 항체(초록색)로 면역 형광염색을 수행하였다. DU145 세포는 돌연변이 때문에 높은 수준으로 p53을 발현하는데 반하여 H460 세포는 야생형의 p53을 가지므로 낮은 수준을 유지하므로, 두 세포주를 p53 면역형광염색(빨간색)으로 구분하였다. 세포를 TGF-β로 2시간 처리하고 메탄올로 고정하였다. b. AIMP2 발현에 AIMP2DX2가 미치는 효과를 검토하기 위하여, AIMP2 수준을 유세포 분석기로 살펴보았다. 2 μg/ml 의 공벡터 또는 DX2를 DU145 세포로 형질전환하고, 24시간 배양하였다. 세포를 70% 에탄올로 고정한 뒤, 항-AIMP2 항체, 뒤이어 FITC-콘쥬게이트된 이차항체로 반응시켰다. c. TGF-β-의존적 세포주기 정지에 미치는 AIMP2DX2의 효과를 유세포 분석기로 비교하였다. 공벡터로 형질전환된 DU145 세포에서 G0/G1 상 세포의 비율은 증가함에 비하여, DX2-형질전환된 세포에서는 그렇지 않았다. 검정색과 파란색 선은 각각 TGF-β로 무처리 및 처리된 세포를 표시한다. d. 10 μM의 ALLN으로 2시간 무처리(대조구) 또는 처리된 H460 세포에서 AIMP2 수준을 비교하였다. “네가티브”는 FITC-콘쥬게이트된 이차항체만으로 배양된 세포를 나타낸다.

도 10 폐암 조직에서 AIMP2DX2 생성 및 AIMP2의 억제를 살펴보았다. 벤조피렌으로 주사된 AIMP2^+/+ 및 AIMP2^+/- 마우스에서 폐를 분리한 뒤, AIMP2DX2의 생성을 RT-PCR로 측정하기 위하여 각 폐에서 RNA를 분리하였다. DX2를 생성하는 모든 폐는 폐에서 종양이 생성되었다 (+로 표시).

도 11은 다양한 조직과 세포에서의 AIMP2DX2가 발현됨을 보여준다. a. 인간 조직에서 간암과 AIMP2DX2 형성을 RT-PCR로 살펴보았다. b. 다양한 암 세포주에서 AIMP2DX2의 발현을 보여주는 결과이다.

도 12는 AIMP2 유전자를 넉아웃(AIMP2^+/-)시킨 마우스에서의 발암 정도를 AIMP2 발현이 정상인 야생형 마우스와 비교하여 살펴보았다. a. AIMP2 돌연변이 마우스의 특징을 서던 블랏과 PCR 분석으로 확인하였다. 마우스 AIMP2 유전자의 인트론 I 영역에서 프라이머 f3와 r2를 이용하여 1223bp PCR 단편이 생성되었고, 이를 마우스 게놈 DNA의 SacI 단편의 하이브리드화를 위한 프로브로 사용하였다. f6, r6, 및 pKOf2 프라이머의 혼합물을 PCR 분석에 사용하였다. 야생형 및 돌연변이된 형질은 각각 약 1.2 및 1.9kb PCR 산물을 생성하였다. AIMP2의 발현에 미치는 돌연변이 효과를 AIMP2 cDNA 프로브를 이용한 노던 블랏팅과 분리된 인간 AIMP2에 대해 생성된 다클론 래빗 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 측정하였다. 노던 블랏의 각 레인에서 동일한 양의 액틴이 검출되었다(자료 없음). +/+, +/- 및 -/- 는 야생 형, 헤테로자이고스 및 호모자이고스 돌연변이 마우스를 나타낸다. 또한, gene trap 삽입된 위치를 돌연변이된 형질의 게놈 DNA의 시퀸싱으로 측정하였다. b. AIMP2^+/-와 야생형 마우스의 암 발생 비율을 나타낸다. c. AIMP2^+/-와 야생형 마우스의 형성된 종양의 평균수를 나타낸다. d. AIMP2^+/-와 야생형 마우스의 육종 형성을 보여준다.

도 13은 AIMP2DX2 발현 벡터를 보여준다.

AIMP2(ARS-interacting multi-functional protein 2)는 아미노아실-tRNA 합성효소 복합체(Aminoacyl-tRNA synthetase: ARSs)의 형성에 관련된 단백질 중의 하나로, p38/JTV-1 또는 p38로 불려지기도 한다.

본 발명자는 AIMP2 단백질의 새로운 기능으로, 선행연구에서 AIMP2의 유전적 붕괴가 c-myc의 과발현을 유도하고 이로 인해 폐의 치조 상피세포(alveolar epithelial cell)가 과증식되면서 신생쥐의 치사(neonatal lethality)가 유도됨을 밝혔으며, 또한 AIMP2가 TGF-β에 의해 유도되고 핵으로 이동하여 c-myc의 발현을 억제하는 것을 분자 및 세포학적 분석으로 밝힌 바 있다(M. J. Kim, B.-J. Park, Y.-S. Kang, H. J. Kim, J.-H. Park, J. W. Kang, S. W. Lee,J. M. Han, H.-W. Lee, S. Kim, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003).

상기한 연구에 이어, 본 발명자는 AIMP2가 신규한 암 억제자(tumor suppressor)로 Smad2/3과 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β의 신호전달을 강화시키는 기능을 함을 밝혔다. 또한, 암 세포주 및 조직에서 p38의 엑손 2가 결손된 형태의 변이체인 AIMP2DX2가 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다: 엑손 2가 결손된 AIMP2 변이체인 AIMP2DX2의 존재를 RT-PCR을 수행하여 AIMP2-특이적 프라이머 조합에 따라 밴드가 다르게 나타나는 것에서 확인하였다. 엑손 3과 4를 포함하는 AIMP2 cDNA에서 유래한 프라이머 쌍을 RT-PCR에 사용하였을 때는, 웨스턴 블랏에서 낮은 AIMP2 수준을 보이는 세포에서 AIMP2 전사 감소가 관찰되지 않았으나, 엑손 1 내지 3을 포함하는 전사물에서 유래한 프라이머를 가지고 RT-PCR을 수행하였을 때 예상 크기의 전사물와 함께 크기가 작은 전사물도 함께 나타났다. 작은 크기의 밴드로 나타나는 전사물을 시퀸싱 해 본 결과 AIMP2의 엑손 2에 해당하는 69 아미노산 모두가 결손된 AIMP2의 변이체였다. 엑손 1과 엑손 3의 접합 서열에 특이적인 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하였을 때, 낮은 AIMP2 수준을 보이면서 표준의 AIMP2 전사물 외에도 크기가 적은 전사물을 생성하는 세포주에서만 PCR 산물이 생성되는 것을 확인하여 다시 한번 AIMP2 변이체의 존재를 증명하였다.

또한, 본 발명자는 AIMP2DX2-형질전환된 세포에서는 TGF-β와 상관없이 AIMP2 수준이 극적으로 감소되는 것으로 AIMP2DX2 생성이 AIMP2 활성의 상실을 초래하는 것을 확인하였으며, 실제로 세포 내로 AIMP2DX2를 형질전환시킨 결과 c-myc 발현을 증가시키고 AIMP2의 핵 이동을 막고 세포 성장을 정지시키는 등의 TGF-β 신호의 이상-기능이 초래되었다. AIMP2DX2는 AIMP2와 헤테로다이머를 형성하고, 이는 암 형성과 진행에 밀접하게 연관되어 있음을 입증하였다. 이러한 AIMP2DX2의 생성은 폐암, 간암, 피부암, 유방암, 신장암, 골육종 등의 다양한 암에서 관측되었다.

하나의 양태로서, 본 발명은 엑손 2가 결실된 AIMP2 변이체인 AIMP2DX2 단백질을 제공한다.

본 발명의 AIMP2DX2 단백질은 AIMP2 단백질 서열 중 엑손 2의 영역이 결실된 변이체로서, AIMP2 단백질의 서열(312aa version:AAC50391.1 또는 GI:1215669; 320aa version: AAH13630.1, GI:15489023, BC013630.1)은 문헌(312aa version: Nicolaides,N.C., Kinzler,K.W. and Vogelstein,B. Analysis of the 5' region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene, Genomics 29 (2), 329-334 (1995)// 320 aa version: Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))에 기술되어 있으며, 이 중 엑손 2에 해당하는 영역이 결실된 단백질이다. 본 발명자에 의해 출원된 한국 특허 출원 10-2003-0018424는 AIMP2 단백질의 암 치료 효과에 대해 기술하고 있으며, 이 특허 문헌에서 기술된 AIMP2 단백질에 대한 설명이 본원에 인용된다.

상기한 AIMP2DX2 단백질은, 전체 서열의 AIMP2에서 엑손 2의 영역이 결실된 단백질을 포함하여, AIMP2 등가물(아미노산 서열의 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 변형체로 AIMP2과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물, 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지나 AIMP2과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 유도체)에서 엑손 2의 영역이 결실된 단백질을 포함한다.

본 발명에서 AIMP2 단백질 서열 중 “엑손 2의 영역이 결실”되었다는 것은 AIMP2 단백질에서 엑손 2 영역의 아미노산 서열(아미노산 46번 내지 114번)이 부분적으로나 전체적으로 상실되어 생긴 변이체가 AIMP2 단백질과 헤테로다이머를 형성하여 AIMP2의 정상적인 기능을 방해하고 분해를 촉진하게 하는 것을 말한다. 따라서, AIMP2DX2 단백질은 AIMP2 단백질의 엑손 2의 아미노산 서열이 모두 결실되거나 이 영역의 아미노산 서열을 포함하여 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4 또는 이들 영역 모두에서 이들 영역의 일부도 결실되거나, 엑손 2의 아미노산 서열의 일부만이 결실된 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 AIMP2DX2 단백질은 AIMP2 단백질의 엑손 2의 아미노산 서열이 모두 결실된 단백질이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 AIMP2DX2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

또한, 본 발명의 AIMP2DX2 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐 만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. AIMP2DX2 단백질의 변이체란 AIMP2DX2 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 AIMP2DX2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, AIMP2DX2를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 AIMP2DX2가 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 형질전환체로부터 AIMP2DX2를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명자는 AIMP2DX2 단백질이 폐암, 간암, 유방암, 피부암, 신장암, 골육종 등의 암 조직에서 특이적으로 발현된다는 것을 발견하였으며, 이러한 단백질의 검출이 폐암 또는 간암을 진단하는데 이용될 수 있어 AIMP2DX2는 폐암 또는 간암의 진단 마커로 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

상술한 바와 같은 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은, 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들 의 조합에 의해 변이될 수 있다. 상기한 서열번호 2의 AIMP2DX2 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.

본 발명의 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있다. 본 발명의 AIMP2DX2 단백질 코딩하는 핵산 서열을 이를 발현할 수 있는 벡터에 작동적으로 연결시켜 AIMP2DX2 단백질을 제공할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 AIMP2DX2 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

형질전환체의 배양은 목적 단백질인 AIMP2DX2의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

형질전환체에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 p38DX2 단백질을 정제할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

또 다른 양태로서, 본 발명은 AIMP2DX2에 특이적인 항체를 제공한다.

본 발명에서 용어 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 AIMP2와 구분하여 AIMP2DX2를 특이적으로 인지하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 AIMP2DX2 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 AIMP2DX2 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4,816,567호) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 AIMP2DX2 단백질 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 AIMP2DX2에 특이적인 항체는 폐암 또는 간암 진단에 사용될 뿐만 아니라, 환자에게 투여함으로써 AIMP2DX2의 활성을 억제하여 폐암 또는 간암 치료에도 사용될 수 있다. 치료용 항체로 사용될 경우, 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다.

항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종(radionuclide), 약제, 림포카인, 독소, 이형가능성 항체 등이 있으나 이로 제한되지는 않는다. 방사성핵종에는 ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁰⁵Rh, ⁴⁷Sc, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹¹At, ⁶⁷Ga, ¹²⁵I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵³Sm, ¹²³I, ¹¹¹In 등이 있다. 약제에는 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin)등 이 있고 림포카인에는 인터페론 등이 있다. 독소에는 리신, 아브린, 드프테리아 등이 있다. 그리고 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포 (예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체인 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies)가 있다.

항체는 그 자체 또는 항체를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다. 치료용 조성물의 경우 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다.

본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 약학 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 항체를 포함하는 조성물은 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내, 및 국부적 면역억제치료를 위해 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하투여가 포함된다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 제제의 pH는 항체 안정성(화학적 및 물리적 안정성)의 균형을 맞추고 투여되는 환자에게 적절하도록 하는데 일반적으로, pH 4 와 pH 8 범위이다. 그 외에도 경피 투여 및 경구 투여 등의 투여를 위 한 다른 기술들을 적절하게 변형시켜 이용하여, 적당한 제제를 고안할 수 있다. 전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 항체를 암호화하는 핵산의 형태로 투여되어 세포내에서 항체가 생성되도록 할 수 있다(WO 96/07321).

또 다른 양태로서, 본 발명은 AIMP2DX2에 특이적인 항체를 포함하는 암 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 폐암 또는 간암 진단 키트에는 AIMP2DX2 단백질을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 암 진단 키트는 이에 한정되는 것은 아니나 ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플 로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있다.

본 발명에서 용어 “암 진단 마커”란 암 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 암의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상조직과 암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 암 진단 마커는 다양한 암 조직 및 세포에서만 특이적으로 발현되는 AIMP2DX2이며, AIMP2DX2의 발현을 mRNA 수준 또는/및 단백질의 수준에서 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. 본 발명의 항체는 암, 보다 구체적으로 폐암, 간암, 유방암, 피부암, 신장암, 골육종암 등을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 분석할 시료를 제공하는 단계 및 (b) 상기 시료에서 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 포함하여, 암 진단 마커 단백질 AIMP2DX2를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 “분석할 시료”란 암 발생에 의해 마커 단백질의 발현량의 차이가 검출될 수 있는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 정액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 생물학적 시료를 의미하며 당 업계에서 널리 공지된 방법으로 처리하여 준비된다.

구체적으로, 분석 시료에서 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 단백질 수준 또는 mRNA 수준에서 검출할 수 있다.

AIMP2DX2 단백질의 검출은 상기 단백질에 특이적으로 인지하는 항체를 시료에 접촉하여 이의 항원-항체 복합체 형성을 측정하여 수행된다.

본 발명에서 용어, “항원-항체 복합체”란 생물학적 시료 중의 AIMP2DX2 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체 형성을 살펴보는 실험방법에는 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블랏팅(Western Blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물 에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy)₃]²⁺ , [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

AIMP2DX2 mRNA 검출은 당 분야에서 알려진 증폭반응 또는 하이브리드화 반응으로 수행된다. 증폭반응 또는 하이브리드화 반응은 AIMP2DX2 mRNA에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 용어, “프라이머”란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에서 용어, “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 프로브로 사용할 수 있다.

프로브나 프라이머를 이용하여 AIMP2DX2 mRNA를 검출할 수 있는 방법으로는 DNA 시퀸싱(DNA sequencing), RT-PCR, 프라이머 연장 방법(Nikiforov, T.T. et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175 (1994)), 올리고뉴클레오티드 연장 분석(OLA)(Nickerson, D.A. et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927 (1990)), 대립형질 특이적인 PCR 방법(Rust, S. et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629 (1993)), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage; Myers R.M. et al., Science, 230, 1242-1246 (1985)), 단일가닥 형상 다형성(single strand conformation lymorphism: SSCP; Orita M. et al.,Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770 (1989)), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al., Mol Cells, 5:668-672 (1995)), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE; Cariello NF. et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734 (1988)), 변성 고압 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography: D-HPLC, Underhill PA. et al., Genome Res, 7, 996-1005 (1997)) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 폐암 또는 간암 진단 마커 mRNA를 검출하는 방법이다. RT-PCR은 P. Seeburg(1986)에 의해 RNA를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하게 된다. 이 때 증폭 단계에서는 본 발명의 목적에 맞게 제조된 프라이머를 사용하도록 한다. 본 발명의 목적상 프라이머는 각각 정상 AIMP2 mRNA와 변이체 AIMP2DX2 mRNA에 해당하는 크기가 다른 2개의 밴드로 나타내는 프라이머와 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 해당하는 밴드만 나타내는 프라이머로 제작할 수 있다. 크기가 다른 2개의 밴드로 나타나도록 하기 위해서는 엑손 2에 해당하는 부분이 전사되도록 2개의 프라이머 위치를 지정하여 제작하면 된다. 프라이머의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 본 발명에서는, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 사용하였다. 변이체에 해당하는 밴드만 나타나도록 프라이머를 제작하기 위해서는 하나의 프라이머가 엑손 1의 C말단과 엑손 3의 N말단이 연결되는 지점의 서열을 가지도록 제작하면 된다. 본 발명에서는 접합 지점에 해당하는 프라이머로 서열번호 8의 프라이머를 제작하고 서열번호 7의 프라이머와 함께 사용하거나, 접합 지점에 해당하는 서열번호 16의 프라이머를 서열번호 6의 프라이머와 함께 사용하여 RT-PCR하였다. RT-PCR은 밴드 패턴을 확인함으로써 진단 마커 AIMP2DX2 mRNA 발현 여부를 확인 가능하고 폐암 또는 간암 발생 여부를 진단할 수 있는 간편한 방법이다.

대조구와 검출 시료중의 AIMP2DX2 발현에 유의적인 차이가 있는지를 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 살펴봄으로써 암, 특히 폐암, 간암, 유방암, 피부암, 신장암 및 골육종암을 진단할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 AIMP2DX2의 mRNA에 특이적인 siRNA(small interfering RNA) 핵산 분자를 제공한다.

본 발명에서 용어 "siRNA”란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이의 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자 치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 전장은, 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사슬 돌출을 구성하는 길이의 합으로 나타내었다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서, 용어 “특이적” 또는 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 AIMP2DX2 특이적이다. 본 발명의 siRNA는 AIMP2DX2 특이적으로 작동하도록 AIMP2DX2의 엑손 1과 엑손 3의 경계 지점에 해당하는 mRNA와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.

상기에서 “유전자 발현의 감소(Inhibition of gene expression)” 란 목적 유전자에서 생성된 mRNA 및/또는 단백질의 수준이 제거 또는 감소된 것을 의미하고, 이는 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 일어나는 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference) 현상에 의한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트를 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 siRNA는 AIMP2DX2 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있으면 서열과 길이는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 구체적 실시에서는 3 종류의 AIMP2DX2 특이적 인 siRNA를 발현하는 벡터를 제작하였으며, siRNA가 세포내 AIMP2DX2의 수준을 감소시키고 AIMP2의 기능과 TGF-β 신호 전달 과정을 회복할 있음을 확인하였다.

본 발명의 AIMP2DX2에 특이적인 siRNA는 AIMP2DX2 mRNA의 엑손 1과 엑손 3이 연결되는 부위에 해당하는 서열을 포함하는 핵산이다. 바람직하게는 각각 서열번호 9와 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 3번 siRNA, 서열번호 11과 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 4번 siRNA, 또는 서열번호 13과 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 5번 siRNA이다. 그 중에서 서열번호 11과 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열로부터 발현되는 RNA 서열을 포함하는 siRNA가 가장 바람직하다. 단일 또는 두 종류 이상의 siRNA를 혼합하여 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 상보적인 안티센스 핵산 서열을 제공한다.

본 발명에서 용어 "안티센스 핵산”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 AIMP2DX2 mRNA에 상보적이고 AIMP2DX2 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 AIMP2DX2 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기 이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티 센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 AIMP2DX2에 특이적인 안티센스 핵산은 AIMP2DX2 mRNA의 엑손 1과 엑손 3이 연결되는 부위에 해당하는 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물 및 이를 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시에 의하면, AIMP2DX2 특이적 siRNA를 처리할 경우, AIMP2DX2 발현 유도에 의해 발생된 AIMP2의 기능적 붕괴가 복구되는 것을 AIMP2의 세포내 수준 증가, Smad2의 인산화가 유도되는 것을 통하여 확인할 수 있었다. 즉, AIMP2DX2는 AIMP2의 기능을 붕괴하여 암을 유발하는 직접적인 원인으로 작용하는데 AIMP2DX2의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 이용할 경우, 세포내 AIMP2의 세포내 수준이 증가되면서 기능이 복구되므로 암 세포 특이적인 암 치 료에 유용하다.

본 발명의 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산을 이용하여 AIMP2DX2 발현이 유도에 의해 발생한 모든 암을 치료할 수 있다. 이런 암은, 폐암, 간암, 유방암, 피부암, 신장암, 골육종암 등을 포함한다.

siRNA 또는 AIMP2DX2 안티센스 핵산 1종 이상을 포함하는 약제학적 조성물은 환자의 암 세포의 증식을 저해시키는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제 예를 들어, 리포좀 (미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한, 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩파이드 독소 등이 있다(Haralambid et al, WO 8903849; Lebleu et al., EP 0263740].

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 함유되는 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 핵산의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여 방법, 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 이외의 본 발명 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 시험물질을 AIMP2 단백질과 AIMP2DX2 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질이 AIMP2DX2 단백질과 AIMP2 단백질 사이의 헤테로다이머 형성을 억제하는지를 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2DX2 단백질과 AIMP2 단백질 사이의 헤테로다이머 형성을 억제하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

AIMP2DX2 단백질 및 AIMP2 단백질 사이의 헤테로다이머 형성은 실시예에서 증명한 것과 마찬가지로 암과 관련되어 있다. 따라서, 헤테로다이머 형성을 억제하는 기 질은 함암제로 볼 수 있다.

헤테로다이머 형성을 스크리닝할 수 있는 방법은 예를 들어, 이스트 투 하이브리드(yeast-two-hybrid), 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)가 이용될 수 있다.

이스트 투-하이브리드 어세이는 Field & Song(1989)에 의해 최초 개발된 방법으로, 전사조절 단백질의 DNA 결합 도메인(DNA binding domain)과 전사 활성 도메인(transcription activation domain)에 각각 바이트와 프레이 단백질을 융합 단백질의 형태로 발현시키고, 전사조절 단백질에 조절받는 유전자의 발현과 영양결핍 배지에서 효모가 자라는 여부로 살펴봄으로써 두 단백질(프레이 단백질, 바이트 단백질)의 상호작용 여부를 확인할 수 있는 스크리닝 방법이다. 시험관 풀-다운 어세이는 단백질간의 상호작용을 태그된 단백질(바이트 단백질)을 정제하고 이때 바이트 단백질에 결합하는 단백질 결합 파트너(프레이단백질)의 풀-다운 여부를 확인함으로써 두 단백질의 결합 여부를 확인할 수 있는 스크리닝 방법이다. 이들 스크리닝 방법을 수행하여 AIMP2DX2와 AIMP2의 헤테로다이머 형성을 저해시키는 억제제를 선별할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 시험물질을 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2DX2 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여, AIMP2DX2 단백 질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2DX2 단백질의 분해를 촉진하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

AIMP2DX2 유전자의 발현은 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있다. AIMP2DX2 mRNA 발현을 검출하고자 할 경우, 바람직하게는 상기한 바와 같은 AIMP2DX2 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 수행할 수 있다. AIMP2DX2 단백질 발현을 검출하고자 할 경우, 상기한 바와 같은 AIMP2DX2 특이적인 항체를 사용하는 다양한 면역 어세이 방법, 예를 들어 웨스턴 블랏으로 수행할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

세포 배양, 화합물 및 세포주기 분석

본 연구에 사용된 세포주는 10% FBS 포함하는 RPMI-1640에서 유지하였다. 마우스 배아 섬유아세포(MEFs: Mouse embryonic fibroblasts)는 12.5 일 내지 14.5일 된 배아에서 분리하였으며 20% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. TGF-β가 세포주기에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 세포를 무혈청 또는 1% FBS를 포함하는 배지에서 2 ng/ml의 TGF-β로 처리하여 배양하고, 세포를 모아서 FACS 분석하였다. 또한, 세포 증식은 [³H] 티미딘 삽입(thymidine incorporation)으로 측정하였다. 세포를 TGF-β를 처리 또는 무처리한 상태의 무혈청 배지에서 20시간 동안 배양한 뒤, [³H] 티미딘 1 μCi/ml 존재하에 4시간 배양하였다. 삽입된 티미딘은 액체 섬광계수기(liquid scintillation couner)를 이용하여 문헌 (Kim et al, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003)에 따라 정량하였다. TGF-β는 R&D system에서, 항-Smad 2, 및 -Smad4 항체는 Santa Cruz에서 구입하였다. 항-AIMP2 항체는 실험실에서 제조하였다. 분리한 AIMP2 단백질 500ug(1mg/ml)을 래빗(male, New Zealand)에 complete adjuvant(Sigma) 500ul 와 섞어 피하에 주사하였다. 7일 후 AIMP2 단백질 500ug을 incomplete adjuvant(Sigma) 500ul와 섞어 래빗 피하에 주사하고 이를 7일 간격으로 2 번 더 시행하였다. 3일 후, 래빗 혈액으로부터 항체를 채취하는 공정으로 항-AIMP2 항체를 제조하였다.

면역침전과 웨스턴 블랏 분석

세포를 TGF-β로 일정 시간 동안 처리하고 프로티아제(protease)를 포함하는 RIPA 완충액을 이용하여 세포에서 단백질을 추출하고, 10 내지 12% SDS-PAGE를 이용해서 분리한 뒤, 특이적 항체로 ECL 시스템을 이용하여 면역블랏팅 하였다. 면역 침전을 위하여, 세포 라이세트를 IgG 및 아가로즈-콘쥬게이트된 단백질-A로 처리하였다. 원심분리 후에, 상등액을 특이적 항체 및 아가로즈-콘쥬게이트된 A로 2시간 배양하였다. 차가운 PBS 로 2번, RIPA로 1번 세척한 후에, 결합된 단백질을 특이적 항체로 침전시키고 용출하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

RT - PCR

전체 RNA(total-RAN)를 제조사(Qiagen)의 프로토콜에 따라서 분리하였다. 신선하게 준비된 조직(3×3×3mm)을 작은 조각으로 자르고, 350ul 라이시스 완충액으로 혼합하여, 호모게나이저 또는 주사기로 균질화시켰다. 350ul의 70% 에탄올을 첨가한 뒤에, 라이세트(lysate)를 여러번 아래위로 흔들어서, 컬럼에 로딩하고 13,000 RPM으로 15초간 원심분리하였다. 컬럼을 세척 완충액으로 2번 세척한 후에, RNA를 40ul의 RNase-free DW로 용출하였다. 역전사를 위하여, 1㎍의 분리된 RNA를 AIMP2-특이적 프라이머(도 8b)의 주형으로 사용하였다. 역전사 후, DW 3배로 희석시키고, 1ul를 0.5ul dMTP(각 2.5mM), 0.5ul의 표시된 프라이머(각 10pM), 1.5ul DMSO 및 0.1ul Taq 폴리머라제(5U/ul)을 포함하는 30ul PCR 반응에 사용하였다.

siRNA 이용한 AIMP2DX2 의 억제

AIMP2DX2의 발현을 억제하기 위하여, AIMP2DX2에 대한 siRNA를 제작하였다. AIMP2DX2에 대한 siRNA를 코딩하는 서열을 제작하고 IMG-700(Imgenex) 벡터의 SalI 과 XbaI 부위와 연결시키고 클로닝을 DNA 시퀸싱으로 확인하였다. H322 세포를 si-DX2 발현하는 벡터 2μg으로 형질전환시켰다. 1ml 무혈청 배지에서 3시간 동안 DNA-리포좀 복합체와 인큐베이션한 후, 20% FBS을 포함하는 RPMI-1640 1ml을 H322 세포에 투여하였다. 추가로 20시간 더 배양한 후 무혈청 조건 또는 지시된 시간동안 TGF-β 를 처리하였다.

이스트 투 하이브리드 어세이

인간 AIMP2 및 Smad2 (및 이의 결실 단편들)을 코딩하는 cDNA를 특이적 프라이머를 이용하는 PCR로 획득하였다. Smad2 및 AIMP2의 PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI으로 절단하여 각각 pEG202(LexA) 및 pJG4-5(B42)의 같은 사이트로 결합시켰다(Gyuris et al, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75, 791-803, 1993). Lex-Smad2 단편 및 B42-AIMP2간의 상호작용은 X-gal을 포함하는 효모 배지에서 생존하는 능력으로 분석하였다(Rho et al, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4488-4493. 1999).

AIMP2DX2 를 안정적으로 생성하는 세포 구축

야생형 MEFs를 pcNDA-AIMP2DX2 또는 pcDNA로 형질전환시키고, 형질전환체를 400ug/ml G418을 포함하는 DMEM 배지에서 선택하였다. 형질전환되지 않은 세포를 제거한 후에, 형질전환체를 G418을 포함하지 않는 배지에서 3일간 배양 후, 2% PFA 로 고정시키고 Giemsa로 염색하였다.

면역염색과 조직학적 분석

냉동된 조직 슬라이드를 2% 파라포름알데하이드로 고정하고 차가운 PBS로 세 번 세척하였다. 0.2% 트리톤 X-100(PBST) 및 1% BSA를 포함하는 PBS로 블랏킹 및 침윤(permeablization)후에, 슬라이드를 항-AIMP2 항체로 2 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후에, 항-래빗 고트 IgG-FITC 및 프로피디유 요오다이드(propidium iodide: PI 50 μg/ml)로 1시간 동안 배양한 뒤, PBS로 세척하고, 고정하여 콘포컬 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였다.

AIMP2DX2 발현 벡터 제작

AIMP2DX2를 발현하는 플라스미드를 구축하기 위하여, AIMP2DX2의 cDNA를 pcDNA3.1-myc으로 클로닝하였다. 먼저 AIMP2DX2를 H322 cDNA에서 EcoR1 and Xho I linker가 달린 primer를 이용하여 증폭시킨 후 EcoR1 과 Xho1을 이용하여 pcDNA3.1-myc에 클로닝하였다. AIMP2DX를 발현하는 pcDNA3-myc/AIMP2DX2 벡터 (도 13)는 Escherichia coli DH5alpha/AIMP2DX2의 형태로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 2004년 10월 25일자로 기탁번호 KCTC 10710BP로 기탁하였다.

넉아웃 ( knock - out ) 마우스 제작

마우스 게놈 DNA상의 돌연변이는 방법에 의한 gene trap 방법에 따랐다(Zambrowicz et al, Nature, 9, 608-611, 1998). gene trap 벡터는 129/SvEvBrd 마우스에서 유래한 배아 줄기세포의 무작위적 돌연변이 라이브리(OmniBank library, Lexicon Genetics, USA) 생성에 사용되었다. 라이버리에서 AIMP2 유전자가 파괴된 OST7994 클론을 동정하였다. 상기 클론을 이용하여, Lexicon Genetics사의 표준 프로토콜에 따라 C57/BL6 헤테로자이고스(heterozygous)의 마우스를 생성하였다. 호모자이고스 돌연변이 마우스를 얻기 위하여 헤테로자이고스 마우스를 교배시켰다. 분리된 13.5일된 마우스를 배를 razor blade로 자르고, 트린신 효소 처리하여 페트리 디쉬에 배양을 위한 플레이팅을 하였다. 마우스 배 섬유세포(embryonic fibroblast cells)에서 분리된 게놈 DNA를 이용하여 서던 블랏 및 PCR 분석하여 돌연변이를 확인하였다. AIMP2 발현을 노던 블랏 및 웨스턴 블랏으로 확인하였다. gene trap 삽입된 위치를 게놈 DNA 시퀸싱으로 확인하였다. 서던 블랏을 위하여, 마우스 꼬리에서 게놈 DNA를 분리하고 SacI으로 분해하였다. 잘려진 DNA 조각을 변성 젤 전기영동(denaturing gel electrophoresis)으로 분리하고 방사학적으로 라벨된 AIMP2 유전자의 1.2kb PCR 산물을 서열번호 17와 18의 프라이머로 하이브리드시켰다. 하이브리드된 밴드를 형광이미지 분석기(phosphorimage analyzer)를 이용하여 검출하였다. 분리된 게놈 DNA를 서열번호 19와 21, 서열번호 20과 21의 특 이적 프라이머로 PCR 분석에 사용하였다.

노던 블랏 분석을 위하여, 마우스 배아 섬유세포로부터 전체 세포 RNA를 제조사의 지시에 따라 RNeasy Midi kit(QIAGEN)을 이용하여 준비하였다. 분리된 RNA(30ug)를 1.2% 아가로즈/2.2M 포르알데하이드 젤에서 전기영동으로 분리하고 Hybond N membranes (Amersham)으로 이동시키고 UV 조사로 막에 고정하였다. 막 위의 RNA를 AIMP2 cDNA의 PCR에 의해 생성된 특이적 프로브로 ExpressHyb hybridization solution (CLONTECH)을 이용하여 하이브리드시켰다. 마우스의 배 섬유세포에서 단백질을 추출하고, SDS-PAGE로 분리하고(Park et al., J Biol Chem, 274, 16673-16676, 1999; Kim et al., J Biol Chem, 275, 21768-21772, 2000)에서 기술한 항-AIMP2 다클론 항체로 웨스턴 블랏을 수행하였다.

폐암 형성

AIMP2^+/- 마우스 32마리와 (수컷 19마리와 암컷 13마리) AIMP2^+/+ 마우스 25마리 (수컷 14마리 및 암컷 11마리)를 실험에 사용하였다. 마우스 복강내로 벤조피렌(100 mg/kg)을 단일 주사하였다. 대조구로, AIMP2^+/+ 마우스 3마리(수컷 2마리 및 암컷 1마리) 및 AIMP2^+/- 마우스 5마리(수컷 4마리 및 암컷 1마리)를 비컬 용액(살린에 10% DMSO 및 35% PEG 40이 녹은 용액)으로 주사하였다.

넉아웃 ( knock - out ) 마우스에서의 피부암의 발암 모델

상기에서 제작한 AIMP2 넉아웃(KO) 타입과 야생형(WT) 타입 마우스 총 33마리를 WT 수컷 대조구(3 마리), WT 수컷 처리구(6 마리), WT 암컷 대조구(2 마리), WT 암컷 처리구(6 마리), KO 수컷 대조구(2 마리), KO 수컷 처리구(6 마리), KO 암컷 대조구(3 마리), KO 암컷 처리구(5 마리)로 분류하였다.

DMBA(7,12-dimethylbenz[a]anthracene)를 0.2μmol/(0.2 ml 아세톤) 농도로 처리구 마우스의 면도한 등에 국부적으로 적용하였다. 이 때, 대조구에 속하는 마우스는 아세톤만 처리하였다. 일주일 후, DMBA-유도된 마우스를 10 nmol/(0.2 ml acetone) 농도의 TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)로 일주일에 2번씩 21주 동안 처리하였고, 이 때 대조구는 아세톤만 처리하였다. 촉진제 처리 후, 1주일부터 1mm 직경 이상의 종양의 수를 매주 계산하였다. 21주에 마우스를 희생시켜 생화학적 분석의 위한 종양 시료를 수집하였다.

실시예 1 - TGF -β 신호 전달에서 AIMP2 의 기능적 중요함과 작용 방식

TGF-β 신호 전달에서 AIMP2가 중요하게 작용하는 것을 살펴보기 위하여, TGF-β 유도된 세포 성장 정지, Smad2/3의 핵 이동 및 Smad2/3과 AIMP2의 상호작용에 대한 AIMP2^+/+ 및 AIMP2^－/－ MEFs의 반응을 조사하였다. 티미딘 삽입, 콜로니 형성 및 유 세포 분석기(flow cytometry)로 살펴본 결과, 정상 세포(wild type cells)의 성장은 TGF-β에 억제되는데 비하여, AIMP2-결핍된 세포는 이러한 신호에 반응을 보이지 않았다(각 도. 1a, b 및 c). MEFs를 TGF-β로 처리하였을 때, 정상세포에서는 Smad2 및 Smad3가 핵으로 이동되었으나 AIMP2^－/－ 세포에서는 그렇지 않았다(도 1d). 이런 모든 결과들은 Smad2 및 3을 경유하는 TGF-β 신호전달에서 AIMP2의 기능적 중요성을 나타내는 것이다.

AIMP2의 Smad2 및 3과의 가능한 상호작용을 공동-면역침전으로 조사하였다. AIMP2은 Smad2/3과 상호작용을 보였으며, 이는 TGF-β에 의해 강화되었다(도 1e). AIMP2과 두개의 R-Smad간의 직접적 상호작용을 이스트 투 하이브리드 및 시험과내 풀-다운 어세이로 확인하였다(도2, 도 7). Smad2/3에 결합하는 AIMP2의 양은 TGF-β 에 의해 AIMP2가 유도됨에 따라 증가하였다(도 2a). 형질전환에 의해 AIMP2 수준이 증가할 때, TGF-β 타겟 유전자의 발현은 강화되었고, 이는 TGF-β 신호전달에서 AIMP2의 자극적인 역할을 의미하는 것이다(도 2b). AIMP2은 Smad2 및 3 모두에 결합하기 때문에, 이러한 두 R-Smad는 비슷한 방식으로 작동할 것이라고 예측할 수 있었고, 따라서, AIMP2과 Smad2와의 상호작용에 초점을 맞추어 더 자세히 살펴보았다. TGF-β 의존적 Smad2의 인산화는 AIMP2-결핍된 MEFs에서 억제되었으나, AIMP2가 AIMP2^-/- 세포로 유입되면 복구되었다(도 2c). AIMP2와 상호작용에 관련된 Smad2의 도메인을 이스트 투 하이브리드(도 2d) 및 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)(도 7)로 살펴보았다. 두 실험을 통하여, Smad2의 MH2 도 메인이 상호작용에 관련된 것으로 밝혀졌다.

TGF-β 신호전달에서 AIMP2의 작용 방식을 살펴보기 위해, 정상 및 AIMP2 결핍된 세포에서 Smad2와 TGF-β 수용체의 TGF-β-유도된 결합을 살펴보았다. 세포를 TGF-β로 처리하고 Smad2와 수용체의 결합을 Smad2와 타입Ⅰ수용체의 공동-면역침전으로 시간 간격을 두고 모니터하였다. 야생형 세포(wild type cell)에서는 TGF-β 유도된 Smad2의 TGF-β 수용체와의 결합이 초기 시점에서 관찰되고 감소되었으나, AIMP2 결핍된 세포에서는 Smad2와 결합한 수용체가 TGF-β 처리 후 후기 단계에서 축적되었다(도 2e). TGF-β-유도된 Smad2의 인산화에서, 야생형 세포에서는 인산화된 Smad2는 점차 증가하였지만, AIMP2^-/- 세포에서는 심각하게 억제되었다(도 2f). 이런 결과는 AIMP2가 R-Smad2와의 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β 유도된 R-Smad의 인산화에 결정적 역할을 한다는 것을 의미한다.

실시예 2 - 암 세포에서 AIMP2 의 억제와 AIMP2 의 결실 형태의 생성

암 형성과 AIMP2의 관련성을 조사하기 위하여, 상이한 여러 암 세포주에서 AIMP2의 발현 정도를 살펴보았다. 살펴본 6개 세포주 중에서 3개는 웨스턴 블랏(도 3a) 및 FACS 분석(도 3b)에서 낮은 AIMP2 수준을 보였다. 낮은 AIMP2 수준을 보이는 세포주 모두 TGF-β 타입 II 수용체가 정상 수준으로 발현되었고 키나제 활성도 보유하고 있다는 사실은, 낮은 AIMP2 수준이 수용체의 기능 이상에 의한 결과가 아니라는 것을 의미한다. AIMP2 수준차가 전사 차이에 의한 것인지를 살펴보기 위하여, 다른 조합의 AIMP2 특이적 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. AIMP2 유전자는 4개의 엑손으로 구성되어 있다 (도 8a). 엑손 3 및 4를 관통하는 AIMP2 cDNA 생성시키는 서열번호 3과 4의 프라이머를 사용하였을 때, 감소된 AIMP2 수준을 보이는 세포에서 AIMP2 전사의 감소는 관찰되지 않았고(도 3c, 첫 번째 줄), 이는 낮은 AIMP2 수준이 낮은 전사의 결과가 아니라는 것을 의미한다. 엑손 1에서 3까지의 전사물을 생성시키는 서열번호 5와 6의 프라이머를 사용하였을 때, 예상한 크기의 전사물 뿐만 아니라 작은 크기의 전사물도 얻을 수 있었다(도 3c, 두 번째 줄). 작은 크기의 전사물의 서열분석 결과, AIMP2의 69개 아미노산을 코딩하는 엑손2가 결손되어 있다는 것을 알 수 있었다(도 8b). 이 작은 크기의 전사물의 생성을 재확인하기 위하여, 엑손 2 결손에 의해 생성되는 엑손 1 및 엑손 3의 접합 서열을 타겟팅하는 서열번호 8의 프라이머(도 8b, 프라이머 DX-B)를 제작하고, 서열번호 7 프라이머를 함께 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 낮은 수준의 AIMP2을 발생하는 세포주는 작은 크기의 전사물(DX2라고 명명, 도 3c, 두 번째 및 세 번째 줄)을 생성하였다.

항-AIMP2 항체로 웨스턴 블랏 분석하면 일반적으로 전장 AIMP2(full-length AIMP2)만 검출되고 DX2는 검출되지 않으므로 (도 2a), 단백질 수준에서의 DX2는 매우 불안정하다는 것을 의미한다. 또한, H460, H322 및 H290에서의 낮은 AIMP2 수준이 면역 형광 염색으로 증명되었다(도 3d). 염색 차이가 생길 가능성을 배제하기 위하여, H460 및 DU145 세포를 같은 플레이트에 공동 배양하고 AIMP2을 염색하였다. H460에서의 AIMP2의 염색 강도는 DU145 보다 많이 약하였다(도 9a). 낮은 AIMP2 수준을 보이는 세포에서 TGF-β-의존적인 AIMP2의 핵 이동이 관찰되지 않았다(도 3d, 아랫줄). AIMP2와 TGF-β 기능 사이의 관련성을 검토하기 위하여, 상기 세포주에서 TGF-β에 의한 성장 억제를 측정하였다. A549 및 DU145 세포의 성장은 TGF-β에 의하여 억제되는데 반하여, 낮은 AIMP2 수준을 보이는 세포는 TGF-β에 반응하지 않았다(도 3e). 이런 결과는 A549 세포는 TGF-β에 민감하고, H460 세포는 TGF-β 둔감하다는 선행의 연구와 일치하는 것이다(Osada et al, Cancer Res. 61, 8331-8339, 2001; Kim et al, Lung Cancer 31, 181-191, 2001). 또한, A549 및 DU145 세포에서 타겟 유전자는 TGF-β에 의해 유도되었으나 낮은 AIMP2 수준을 보이는 H322 및 다른 2개 세포주에서는 유도되지 않았다(도 3f).

실시예 3 - 기능성의 AIMP2 와 불활성의 결실 돌연변이체의 헤테로다이머 형성

DX2 생성과 AIMP2 억제와의 일반적인 관련성을 이해하기 위하여, DX2를 DU145 세포로 형질전환한 후, AIMP2 수준의 변화를 조사하였다. 웨스턴 블랏(도 4a, 첫번째 줄) 및 FACS 분석(도 9b) 결과, DX2 형질전환된 세포에서 AIMP2는 감소되었다. 또한, AIMP2의 타겟인, c-myc의 발현이 DX2 유입에 의해 증가하였다(도 4a, 세번째 줄). DX2는 TGF-β 에 의한 성장 저지(growth arrest)를 경감시켰다(도 4b, 도 9c).

DX2가 기능적 AIMP2(AIMP2-F)에 어떻게 영향을 미치는지 살펴보았다. AIMP2는 호 모다이머를 형성할 수 있으므로(Quevillon et al, J. Mol. Biol. 285, 183-195, 1999; Kim et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99, 7912-7916, 2002), AIMP2DX2가 AIMP2-F와 상호작용하는지를 이스트 투 하이브리드 어세이로 살펴보았다. AIMP2DX2는 AIMP2-F와 상호작용 하였으나, AIMP2-DX끼리는 상호작용하지 않았다 (도 4c). 인 비트로 풀-다운 어세이에서, 방사선적으로의 합성된 AIMP2-F 및 -DX2는 GST-AIMP2-F와 공동 정제되었고(도 4d), 이는 AIMP2-F 와 -DX2 사이의 직접적 상호작용이 있음을 증명하는 것이다. DX2가 TGF-β 신호전달에 활성을 나타내는지 살펴보기 위하여, 이스트 투 하이브리드 어세이로 Smad2와의 상호작용을 살펴보았다. AIMP2는 AIMP2의 타겟으로 알려진 FBP뿐만 아니라 Smad2와 상호작용하는 반면에(Kim et al, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003), DX2는 이러한 단백질과 전혀 결합하지 않았고 이는 DX2의 기능적 불활성을 의미하는 것이다(도 4e).

헤테로다이머 형성이 어떻게 AIMP2을 억제하는지 알기 위하여, AIMP2 수준이 프로테아좀-의존적 분해 과정에 의해 조절되는지를 체크하였다. DX2-생산하는 H322 세포를 프로테아좀 억제제 ALLN (Zhou et al, J. Biol. Chem. 271, 24769-24775, 1996)으로 처리하고, AIMP2 수준이 프로테아좀 차단에 의해 증가하는지를 살펴보았다. 웨스턴 블랏 (도 4f), 면역 형광 염색 (도 4g) 및 유세포 분석기(도 9d)에서 볼 수 있듯이, AIMP2는 ALLN 처리에 의해 현저하게 증가하였고, 이는 세포내 AIMP2 수준이 프로테아좀-매개된 분해로 조절된다는 것을 나타낸다. 또한, AIMP2DX2 형태도 프로테오좀 억제에 의해 검출되었다(도 4f). AIMP2DX2의 낮은 강도는 RT-PCR 분석으로 증명하였듯이 정상 AIMP2와 비교하여 낮은 발현(도 3c) 및/또는 항-AIMP2 항체에 의한 불충분한 인지 때문이다. AIMP2 분해는 프로테아좀에 의해 매개되기 때문에, 유비퀴틴화(ubiqutination)가 DX2에 의해 촉진되는지 살펴보았다. ALLN으로 처리된, 대조구 및 DX2-형질전환된 세포로부터 AIMP2을 면역침전하고 항-유뷔퀴틴 항체로 블랏팅하였을 때, 대조구 세포와 비교하여 높은 양의 유비퀴틴화된 AIMP2가 DX2-형질전환된 세포에서 관찰되었다(도 4h). 이상으로부터, DX2는 AIMP2에 결합하여 불활성의 헤테로다이머를 형성하는 도미넌트 네가티브 돌연변이(dominant negative mutant)로 작용하는 것으로 여겨진다.

실시예 4 - AIMP2DX2 에 의한 TGF -β 신호전달 불활성화 및 세포 성장 촉진

DX2를 MEFs로 트랙스펙션한 뒤, DX2가 세포 성장에 미치는 효과를 현미경 분석 및 콜로니 형성으로 관찰하였다. 세포 성장은 DX2 유입에 의하여 현저하게 증가하였다(도 5a). 또한, DX2에 특이적으로 결합할 수 있는 3가지 종류의 siRNA(si-DX2)를 (도 5b), 발현하는 각각 벡터를 제조하여 DX2를 생성하는 H322 및 H460 세포에 형질전환한 후 정상적 AIMP2 및 smad2의 인산화에 미치는 영향을 살펴보았다(도 5c). 4번 또는 5번의 siRNA를 발현하는 벡터를 H322 세포에 형질전환 하였을 때, TGF-β에 의한 세포 사멸이 증가하고(좌) 세포주기의 정지(우)가 일어남을 유세포 분석기로 관찰할 수 있었다(도 5d). DX2를 발현하는 H322 세포에 DX2의 전사를 특이적으로 억제하는 4번 siRNA(si-DX2)를 발현하는 벡터를 유입하고, siRNA에 의해 AIMP2의 정상적 수준 및 TGF-β 신호전달이 복구 되는지를 체크하였다. si-DX2는 DX2 전사물을 제거시키며(도 5e 상), 정상적 AIMP2 수준 및 TGF-β-유도된 Smad2의 인산화(도 5e 하 및 도 5f), Smad2의 핵 이동(도 5f), TGF-β-의존적 리포터 발현(도 5g) 및 성장 정지(growth arrest)(도 5h)를 복구시켰다. 상기 모든 결과는 TGF-β 신호전달 및 세포 성장 조절에 미치는 DX2의 붕괴적인 효과를 증명하는 것들이다.

실시예 5 - AIMP2 결실 변이체와 인간 폐암과의 관련성

AIMP2의 감소는 다양한 암 세포주에서 자주 발견되고(도3a, b 및 d), AIMP2의 손실은 폐 세포의 과-증식을 초래하기 때문에 (Kim et al, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003) 본 발명자는 AIMP2 이상(abnormality)이 폐암 형성과 관련되어 있는지 살펴보았다. 이러한 가능을 검토하기 위하여, 화학적 발암물질, BP(benzo-(α)-pyrene)(Wang et al, Cancer Res. 63, 4389-4395, 2003)를 AIMP2^+/+ 및 AIMP2^+/- 마우스 복강내로 투여하여 폐 종양을 유도한 뒤, 폐에서 종양 형성을 살펴보았다. BP 투여 후 6주로부터, AIMP2^+/- 마우스에서는 50 내지 70%의 빈도로, 정상의 마우스에서는 약 30%로 폐 종양이 관찰되었고(도 6a), 이는 이형의 마우스(heterozygous mice)가 BP-유도된 종양형성(BP-induced tumorigenesis)에 더 민감하다는 것을 의미한다. BP-주사된 마우스의 폐에서 DX2 생성 여부를 조사하였다. 세 마리의 AIMP2^+/+ 마우스에서 한 마리만이 종양을 발생시키는데 비하여, AIMP2^+/- 마우스에서 분리한 4개 폐 중에서 3개에서 종양이 생성되었다. 모든 이런 종양은 DX-2를 생성시켰고(도 10), 이는 폐암 형성과 DX2의 관련성이 있다는 것을 의미한다.

인간 폐의 비종양의 염증성의 조직과(the inflammatory but non-tumor) 종양 조직에서 AIMP2 수준을 비교하였다. DX2는 종양 조직에서만 생성되었다(도 6b). 상이한 개체에 따라 AIMP2 수준과 DX2 형성이 차이가 날 가능성을 배제하기 위하여, 같은 환자에서 분리한 정상 및 종양 조직에서 RT-PCR을 수행하였다. AIMP2의 암-특이적 감소와 DX2의 생성은 관련되어 있었다(도 6c). 암 부위에서 정상적 AIMP2 수준을 보이는 하나의 사례에서 DX2가 관찰되지 않았다(도 6c, 환자 22872).

실시예 6 - 암 발생과 AIMP2 , AIMP2DX2 의 연관성

암 발생과 AIMP2, AIMP2DX2의 연관성을 다양한 조직 및 암세포주에서의 AIMP2DX2 발현으로 살펴보았다.

2개의 간암(hepatocellular carcinoma) 시료에서 정상과 암조직에서 AIMP2DX2 생성 여부를 RT-PCR로 관찰하였다. 암조직에서 AIMP2DX2의 형성이 관찰되었다(도 11a) 그 외 다양한 암 세포주에서의 AIMP2DX2의 생성을 살펴보았다. 세포주를 6웰 플레이트에 1×10⁵씩 씨딩(seeding)하고 24시간 후 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 1% beta-mercaptoethanol을 포함하는 GSS 용액을 이용하여 라이시스시키고 acdic phenol(pH 4.3)과 chloroform을 포함하는 4% isoamylalcohol을 넣고 혼합하였다. 이를 원심분리하고 상층액을 이소프로판올로 침전시키고 다시 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 펠렛을 에탄올로 세척하고 DW에 녹여서 RNA를 얻었다. RNA를 M-MLV 역전사 효소(invitrogen)을 이용하여 42℃에서 1시간 역전사시키고 서열번호 16의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 조건으로 38 사이클로 PCR 하였다. 그 결과, 폐암 세포주(H226, H460, H322 및 H290), 배아신장암 세포주(293), 골육종 세포주(SaOS2), 피부암 세포주(HaCAT), 유방암 세포주(MCF7)에서 AIMP2DX2가 발현되었다(도 11b)

실시예 7 - AIMP2 넉아웃된 마우스를 이용한 발암 연구

AIMP2 유전자를 넉아웃시킨 마우스에서의 발암 정도를 AIMP2 발현이 정상인 야생형 마우스와 비교하여 살펴보았다. 그 결과, AIMP2 넉아웃시킨 마우스에서 피부 종양이 발생하는 마우스 수와 마우스의 종양의 수가 확연하게 증가함을 알 수 있었다. 구체적으로, 마우스를 DMBA로 암을 유발하고 TPA로 암 유발을 촉진시킬 경우, AIMP2 넉아웃된 암컷 마우스는 암컷 대조구 마우스에 비하여 종양 발생률은 약 1.3배 증가하였고 AIMP2를 넉아웃시킨 수컷 마우스는 수컷 대조구 마우스에 비하여 종양 발생률이 약 2배 증가하였다(도 12b). 또한, 종암 발생된 마우스에서 발생된 종양의 수도 AIMP2 넉아웃된 암컷 마우스는 암컷 대조구 마우스에 비하여 약 4배 증가하였고 AIMP2 넉아웃된 수컷 마우스는 수컷 대조구 마우스에 비하여 약 2배 증가하였다(도 12c 및 도 12d).

실시예 8 -

8.1 발현 벡터

도 14에 도시된 벡터(IMGENEX 사)의 Sal I / XbaI site 에 아래와 같이 mouse DX2를 타겟으로 하는 si-RNA를 삽입하였다.

Primer sequence

tcga GCGGGCCACGTGCAGGACTA ttcaagaga TAGTCCTGCACGTGGCCCGC tttt

CGCCCGGTGCACGTCCTGAT aagttctct ATCAGGACGTGCACCGGGCG aaaa GATC

( 이는 IMGENEX 사의 상품이며, 자세한 vector data sheet 은 pdf 로 첨부합니다.)

8.2 실험 방법

가. Carcinogenesis by Benzo [a] pyrene (이하 B.P )

생후 6주된 mouse에 농도 100mg/kg 농도로 복강 주사(intra peritoneal)한 후, 첫 번째 투여 후 일주일이 지나서, 상기와 같은 농도로 다시 한번 주사하였다. 예를 들어 체중이 20g인 mouse의 경우에 B.P 2mg/100ul에 투여하였다.

몸무게 20g인 mouse 한마리에 투여할 경우의 B.P 용액 만드는 방법은 다음과 같다.

10ul DMSO 에 B.P 2mg 을 녹이고, 이 용액을 PEG 400(poly ethylene glycol) 36ul 에 다시 희석한 후, 20분 동안 강하게 vortex 하였다. 완성된 용액에 0.9% saline(주사용 생리식염수) 54 ul 를 넣고 다시 5분간 votex 하였다. 한편, 위에 제시된 수치는 1마리를 위한 것이기 때문에, 주로 30마리를 기준으로 수치를 계산하였다(X 30).

이전의 실험들을 통해 투여한 후 6주 후에는 wild type, hetero type 모두 종양이 발생하였음을 확인하였다.

PEG의 점성이 높기 때문에, syringe는 22Gx1 1/4 짜리를 사용하며, 주사시, 피스톤을 왕복해주며 주사하였다.

나. si-p38DX2 plasmid 도입

10mg/ml 농도의 stock Glucosylated PEI(poly ethylene imine, 이하 GPEI) 는 4도 온도 냉장 보관한다.

준비해둔 DNA 와 G-PEI의 중량 비율은 1g : 2.67g 이 되도록 한다.

처리할 DNA 와 GPEI complex 만드는 방법은 다음과 같다. 50ml conical tube 에 G-PEI stock (10mg/ml) 267ul 를 넣고, D.W 를 final volume 30ml 가 되도록 맞춘뒤, 잘 흔들어주었다. maxi prep으로 준비한 ( D.W 에 녹인) DNA 를 아주 천천히 drop by drop 으로 떨어뜨리면서 vortex를 통해 섞어 주었다. 이때 반응 속도가 매우 중요한데, 조금만 빨라도 침전이 생기므로 주의하여야 한다. 그 뒤 최종 ㅂ부피가 50ml 되도록 증류수를 첨가하였다.

한편, GPEI 와 DNA 상의 반응이 완벽하게 이루어지려면, 30분 정도의 시간이 필요하며, 60분이 지나고 나면, 그 산물이 활성을 잃기 시작하므로, 반응 시작한지 20분 후부터 60 분이 되기 전까지 40분간을 이용하여, 전달(delivery)하고자 하는 DNA 를 노출시켰다.

상기에서 준비한 용액은 자체 제작된 입자 분쇄기와 Bio-Rad의 compressor에 의해, mouse가 보정되어 있는 관까지 기체상태로 이동시켰다. 또한, 손실을 최소화하기 위해 처리 후 30분이 지나면, D.W 20ml을 더 추가해서 complex가 용액의 농도를 낮추어, 10분간 더 노출시켰다. 이와 같은 방식으로 3일에 한번씩 총 4회에 걸쳐 투여하였다. 장치의 구조상 4마리를 한번 처리하도록 되어 있다. 즉, 위에서 설명한 1mg의 DNA와 2.67mg의 GPEI complex는 4마리에 한번 처리할 수 있는 양이며, 필요한 경우, 1회 처리시 DNA 2mg 에 GPEI 5.34 mg 처리할 수 있다.

8.3 결과

가. 위의 방법으로 GFP vector 를 통해, 1회 처리하고 2일이 지난뒤 mouse를 처리하고, paraffin sample을 immuno fluorescent로 확인한 결과, 폐 전체의 50 % 가량이 GFP positive 를 보였고, 특히, bronchiol track 을 따라 매우 강한 GFP signal 이 관찰되었다.

나. 생존율

Gene therapy 처리군 과 대조군 의 생존율을 차이를 보기 위한 실험에 대해서는, 위의 Benzo pyrene 처리가 완료된 일주일 후부터 일주일 간격으로 총 4회에 걸쳐 Butyl Hydroxy Toluene (BHT) 을 처리하여, 생존기간 단축을 시도하였다. 그 결과, 대조군은 평균 20주의 수명을 보인데 비해, 처리군은 이에 비해30여일 생존이 연장되었다. (그룹당 n=11)

다. pathologic data

위의 모식도에 따라 gene therapy를 완료한 뒤, 8주 동안 breeding 한 후, 처리하였을때, H&E staining 결과 lung cancer의 면적도 대조군에 비해 평균 70% 이상 줄어 있었다(그룹당 n=4).

라. diagnostic imaging (by microPET /CT)

또한, 위의 결과를 micro PET 으로 확인하고자, 8주간의 처리후 ROI (region of interests) 를 비교하였을 때, 최고값으로 비교해서 치료군이 대조군에 비해 60.2% 로 줄어있었으며, 평균값으로 비교해서, 83% 의 감소를 보였다.

마. 기타

delivery를 위해 대체할 수 있는 viral vector로는 우선, lenti viral vector, adeno viral vector, adeno associated vector 등이 있고, non-viral vector 로는 liposome 형식으로는 DOTAP( 1, 2-dioleoyl-3-(trimethylammonio) propane), cholesterol, POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-3-sn-phosphatidylcholine) 등을 다양한 비율로 혼합하여 사용할 수 있었다.

또한 target sequence 는 DNA 형식으로가 아닌, double strand RNA 형식으로 곧 바로 liposome 과 섞어 주입될 수도 있다.

투여방법은 viral vector 나 liposome 형태로 사용된다면, intra vein injection 에 의해서도 가능하고, intra peritoneal injection 에 의해서도 가능하다.

또한, G-PEI 의 delivery 는 humid mist 입자가 아닌 dry dust 형태로 투여될 수 있다.

Img-700 vector 의 U6 promoter 는 H1 promoter 등으로 대체될 수 있다.

본 발명의 암에서 특이적으로 발현되는 AIMP2DX2(단백질, mRNA)를 암 진단 마커로 사용하여 암을 정확하고 용이하게 진단할 수 있으며, AIMP2DX2 단백질에 대한 항체, siRNA, 안티센스 핵산 등과 같은 AIMP2DX2의 억제제를 사용하여 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Use of AIMP2DX2 for the diagnosis and treatment of cancer <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 756 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(753) <223> p38DX2 amino acid sequence <400> 1 atg ccg atg tac cag gta aag ccc tat cac ggg ggc ggc gcg cct ctc 48 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 cgt gtg gag ctt ccc acc tgc atg tac cgg ctc ccc aac gtg cac ggc 96 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly 20 25 30 agg agc tac ggc cca gcg ccg ggc gct ggc cac gtg cag gat tac ggg 144 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly 35 40 45 gcg ctg aaa gac atc gtg atc aac gca aac ccg gcc tcc cct ccc ctc 192 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu 50 55 60 tcc ctg ctt gtg ctg cac agg ctg ctc tgt gag cac ttc agg gtc ctg 240 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu 65 70 75 80 tcc acg gtg cac acg cac 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Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #4 coding nucleic acid sequence <400> 12 ctagaaaagc tggccacgtg caggattacc agtactcgta atcctgcacg tggccagc 58 <210> 13 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #5 coding nucleic acid sequence <400> 13 tcgacacgtg caggattacg gggcgagtac tggccccgta atcctgcacg tgtttt 56 <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-DX2 #5 coding nucleic acid sequence <400> 14 ctagaaaaca cgtgcaggat tacggggcca gtactcgccc cgtaatcctg cacgtg 56 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer <400> 15 cagcaccacg tctgc 15 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DX2-S2 <400> 16 ctggccacgt gcaggattac gggg 24 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer f3 <400> 17 gagcatctga gtttgacccc tggaatctac 30 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> priemr r2 <400> 18 ttgcaggatg ttggttacgt ccaagtctgc atctg 35 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> priemr f6 <400> 19 gtcaccgaat gtaactgtgc tggcttcgaa g 31 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> primer pKOf2 <400> 20 ggtaggtcca gagtcttcag agatcaagtc 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> primer r6 <400> 21 ccataaccca ggttgacggg tttagtgccc 30

Claims

AIMP2(ARS-interacting multi-functional protein 2) 단백질의 엑손 2의 영역이 결실된 AIMP2DX2 단백질.
제1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 AIMP2DX2 단백질.
제1항에 있어서, 암 진단 마커인 AIMP2DX2 단백질.
제1항의 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
제4항에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.
제1항의 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제7항의 형질전환체를 배양하여 제1항의 AIMP2DX2 단백질을 제조하는 방법.
제1항의 AIMP2DX2 단백질에 특이적인 항체.
제1항의 AIMP2DX2 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 진단 키트.
(a) 분석할 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 시료에서 제1항의 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 포함하여, 암 진단 마커 단백질 AIMP2DX2를 검출하는 방법.
제11항에 있어서, 단계(b)에서 제1항의 AIMP2DX2 단백질에 특이적인 항체와 접촉시 켜 검출하는 방법.
제11항에 있어서, 단계(b)에서 증폭반응 또는 하이브리드화 반응으로 검출하는 방법.
제13항에 있어서, 증폭반응이 AIMP2와 AIMP2DX2의 mRNA를 구분하는 프라이머를 사용하는 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)로 수행되거나 하이브리드 반응이 AIMP2와 AIMP2DX2의 mRNA를 구분하는 프로브를 사용하는 방법.
제13항에 있어서, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 또는 서열번호 16과 6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머; 또는 서열번호 8 또는 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프로브를 사용하는 방법.
서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 16의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산분자.
제1항의 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 특이적인 siRNA 핵산 분자.
제17항에 있어서, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12 또는 서열번호 13과 14의 뉴클레오타이드 서열로 코딩되는 센스와 안티센스 RNA를 포함하는 siRNA 핵산 분자.
제17항의 siRNA 핵산 분자를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제17항의 siRNA 핵산 분자를 투여하여, 암을 치료하는 방법.
제1항의 AIMP2DX2 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 핵산 분자.
제21항의 안티센스 핵산 분자를 포함하는 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제21항의 안티센스 핵산 분자를 투여하여, 암을 치료하는 방법.
(a) 시험물질을 AIMP2 단백질과 AIMP2DX2 단백질을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질이 AIMP2DX2 단백질과 AIMP2 단백질 사이의 헤테로다이머 형성을 억제하는지를 측정하는 단계를 포함하여, 제1항의 AIMP2DX2 단백질과 AIMP2 단백질 사이의 헤테로다이머 형성을 억제하는 항암제를 스크리닝하는 방법.
제24항에 있어서, 이스트 투 하이브리드(yeast-two-hybrid) 또는 시험관내 풀-다운 어세이(in vitro pull-down assay)로 스크리닝하는 방법.
(a) 시험물질을 제1항의 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질에 의한 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제 또는 AIMP2DX2 단백질의 분해 촉진을 측정하는 단계를 포함하여, 제1항의 AIMP2DX2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제 또는 AIMP2DX2 단백질의 분해를 촉진하는 항암제를 스크리닝하는 방법.
제26항에 있어서, RT-PCR 또는 웨스턴 블랏으로 스크리닝하는 방법.