KR20050070034A

KR20050070034A - 질량 분석용 플레이트, 그 제조 방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR20050070034A
Application number: KR1020057005872A
Authority: KR
Inventors: 겐지 다나카; 이량자; 고지 무네치카; 히사시 아리쿠니; 분고 오치아이
Original assignee: 미쯔비시 웰 파마 가부시키가이샤
Priority date: 2002-10-04
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2005-07-05
Also published as: CA2501993A1; EP1550862A4; AU2003272924B2; WO2004031759A1; US8372655B2; US20060051741A1; AU2003272924A1; US20100264029A1; EP1550862B1; CA2501993C; EP1550862A1

Abstract

지지체 및, 그 위에 접착된 PVDF 함유 코팅 (특히, 그 위에 증착된 PVDF 를 함유한 박층) 을 포함하는 질량 분석용 플레이트; 및 지지체 표면을 PVDF 로 코팅하는 것을 특징으로 하는 질량 분석용 플레이트의 제조 방법. 또한, 분석 대상물을 함유한 시료를 겔 전기영동하여 분석 대상물을 분리하고, 분리된 분석 대상물을 겔로부터 질량 분석용 플레이트로 이동시킨 후, 상기 플레이트를 질량분석하여 옮겨진 분석 대상물의 분석을 수행하는 것을 포함하는 분석 대상물 동정 방법을 제공한다.

Description

질량 분석용 플레이트, 그 제조 방법 및 그 용도{PLATE FOR MASS SPECTROMETRY, PROCESS FOR PREPARING THE SAME AND USE THEREOF}

본 발명은 프로테옴 해석을 다량, 신속, 또한 고감도로 실시할 수 있는, 신규 질량 분석용 플레이트, 그 제조 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

분자 생물학이나 게노믹스 (게놈 과학) 를 비롯한 약물 개발의 기반 연구의 진보에 의해, 최근 수년간 약물 개발의 양상이 급속히 변화하여, 게놈 약물 개발로 대표되는 새로운 약물 개발 방법이 개발되고 있다.

그러나, 게노믹스가 밝힌 염기 배열로부터는 아직 단백질의 기능 (생리 작용) 은 예측할 수 없고, 유전 정보를 신약에 결부시키는 수법의 확립이 포스트 게놈에 요구되고 있다. 그 하나로서, 상기 기술한 염기 배열로부터 번역되는 단백질 (10만종 이상이라고도 알려짐) 을 모두 단리ㆍ동정하여, 그 기능을 귀속하는 것을 목적으로 하는 프로테오믹스 (단백질 해석 과학) 가 주목을 받고 있다.

프로테옴이란, 좁은 의미로는 한 개의 생물체를 구성하는 모든 단백질을 의미하지만, 넓은 의미로는 어떤 세포의 세포액 중의 모든 단백질, 혈청 중에 포함되는 모든 단백질, 어떤 조직에 포함되는 모든 단백질 등과 같이, 생물체의 조직학적, 해부학적으로 특정되는 부위에 포함되는 모든 단백질을 의미하는 경우도 있다. 본 명세서에서는 넓은 의미로 사용하고 있지만, 넓은 의미의 프로테옴의 완전한 집합체가 좁은 의미의 프로테옴인 것은 분명하다.

프로테옴 해석에서는 종래부터 2차원 전기 영동법과 질량 분석법을 조합하는 방법이 범용되어 왔지만, 이하의 문제점이 아직 해결되지 않고 있다. 즉, 종래 법에서는 영동 후의 시료를 질량 분석법에 제공할 때까지, 영동 겔을 소편으로 나누고, 특수한 용액으로 각각의 소편으로부터 단백질을 추출해야 한다. 이와 같이 장시간을 소비하고, 다단계의 번잡한 조작이 요구되기 때문에, 측정 시간의 단축화, 장치의 소형화, 대량 분석 대상물(analyte)의 처리, 장치 전체의 로봇화가 매우 곤란하였다.

또한 이른바 「다수의 미량 단백질" (low-abundance proteins) 의 문제가 있다. 예를 들어, 효모에서는 단지 100개의 유전자가 효모의 모든 단백질 중량의 50% 를 제조하고 있다. 이것은 나머지 50% 의 단백질이 몇천이나 되는 유전자의 산물인 것을 의미한다. 대량의 미량 단백질에는, 조절 단백질, 수용체를 포함한 정보 전달 단백질 등, 생체에 있어 가장 중요한 단백질이 대량 포함된다. 그러나, 종래법에서는 전기 영동에 의해 분리한 다수 또한 미량의 단백질 시료를 회수하는 것이 불가능한 상황에 있다.

이러한 전기 영동법과 질량 분석법의 조합 기술의 한계를 해결하고, 또한 단백질-단백질 상호 작용을 해명하기 위해, 현재 다양한 연구가 행해지고 있다. 예를 들어, 동위체 표지화 어피니티 태그법 (ICAT: isotope-coded affinity tag; Nat. Biotech., 17: 994-999 (1999)), 효모에서의 two-hybrid system, BIA-MS-MS, 단백질 분석법 (용액, 칩; Trends Biotechnol., 19: S34-39 (2001), LC-MS-MS 에 의한 펩티도믹스 등이다. 이 중, 단백질 분석법으로서는 고상 단백질 분석법 (칩법;Curr. Opin. Biotechnol. 12: 65-69 (2001)), 나노 입자에 정보를 집어넣는 액상 분석법 (fluorescence-encoded beads;Clin.Chem., 43: 1749-1756 (1997); Nat. Biotech., 19: 631-635 (2001); barcoded nanoparticles; Trends Biotechnol. (2001) ibidem) 등을 들 수 있다.

한편, 본 발명자들은 막 단백질과 당해 단백질과 상호 작용가능한 화합물을 각각 그룹화하여, 양자를 동시 분석할 수 있는 프로테옴 해석법을 제안하고 있다 (WO 02/56026).

이러한 측정 방법 (시스템) 의 개량과는 별도로, 프로테옴 해석을 목적으로 하지 않거나, 또는 기술적으로 프로테옴 해석에 대한 사용은 곤란하지만, 단백질의 질량 분석 분야에서의 개선을 목표로 한 몇몇 보고가 있다. 전기 영동에 의해 분리한 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride; PVDF) 막에 전사(blotting)하고, MALDI형 질량 분석용의 스테인리스제 플레이트에 양면 테이프 (Electrophoresis, 17; 954-961 (1996)), 프레임 (Anal. Chem., 69: 2888-2892 (1997)) 또는 그리스 (Anal. Chem., 71: 4800-4807 (1999); Anal. Chem., 71: 4981-4988 (1999); WO 00/45168) 로 고정화하여 측정하는 방법이 보고되어 있다. 이들 방법은 일단 PVDF 막을 측정 도중에 질량 분석용 플레이트에 고정화하는 점에서 조작이 번잡해질 뿐만 아니라, 백그라운드가 높고, 상대 피크 강도가 극단적으로 낮다는 결점이 있어, 높은 검출 감도가 요구되는 프로테옴 해석에는 적합하지 않다.

또한, 미리 매트릭스를 도포한 질량 분석용 플레이트에 전기 영동 후의 겔을 직접 전사시켜 질량 분석하는 방법이나, 일단 플롯용 PVDF 막에 단백질을 전기 전사한 후에, 미리 매트릭스를 도포한 질량 분석용 플레이트에 확산 전사하는 방법도 보고되어 있다 (US 5,595,636). 그러나, 이들 방법에서는 전기 전사를 사용한 경우, 매트릭스가 전사 중에 전사 완충액 중에 용출되어 측정 자체가 불가능해질 우려가 있다. 한편, 확산 전사를 사용한 경우에는 전사 효율이 낮기 때문에, 특히 미량 단백질을 질량 분석용 플레이트에 전사하기 위해서는 검출 감도의 면에서 불충분하다.

또한 상기 기술을 개량하여, 매트릭스에 니트로셀룰로스 (블롯용 막성분이다) 를 혼합하여 질량 분석용 플레이트에 도포하는 방법이 보고되어 있다 (GB 2312782 A). 그러나, 이 방법에서도 전기 전사, 확산 전사의 어느 경우에서의 문제점도 완전히 해결되었다고는 할 수 없다.

그런데, 질량 분석용 플레이트로서는 통상 사용되는 알루미늄 또는 스테인리스 스틸제 플레이트 외에 이들을 개량하여, 실리카로 코트하거나, 또는 소수성 기를 부가한 질량 분석용 플레이트 등도 시판되고 있다 (Ciphergen 사 제, WO 94/28418). 그러나, 이들 기술ㆍ제품도, 대량, 신속 또한 고감도로 프로테옴 해석을 행한다는 연구 개발의 요구를 반드시 만족시키는 것은 아니다.

본 발명의 목적은 종래의 전기 영동법과 질량 분석법의 조합 기술에 의한 프로테옴 해석법에 새로운 기술을 도입하는 데에 있다. 상세하게는 프로테옴 해석을 다량, 신속 또한 고감도로 실시할 수 있는 기술을 제공하는 데에 있다.

도 1 은 영동 겔에서 질량 분석용 플레이트로 전기 전사한 정도를 나타낸다. A 는 영동 겔 (전사 전), B 는 영동 겔 (전사 후), C 는 본 발명의 질량 분석용 플레이트 (전사 후) 를 나타낸다. 좌단의 숫자는 밴드에 대응하는 단백질의 분자량을 나타낸다. 전기 전사에 의해서 단백질의 종류에 따라서는 겔 중의 거의 전량이 질량 분석용 플레이트에 이동되는 것을 나타내고 있다.

도 2 는 영동 겔과 질량 분석용 플레이트의 위치 관계 (도 2A) 및 플레이트 상의 이동된 단백질이 받는 레이저광량의 차이 (도 2B) 를 나타낸다. 도면 중, 1 은 질량 분석용 플레이트, 2 는 영동 겔, 3 은 단백질을 각각 나타낸다. 또한, A 는 광량 최대, B 는 광량 소, C 는 광량 제로인 경우를 각각 나타낸다.

도 3 은 본 발명의 질량 분석용 플레이트 (도 3A), 알루미늄 플레이트 (도 3B), ProteinChip array (H4, 도 3C) 를 사용하였을 때의 질량 분석 피크의 상대 강도를 나타낸다.

도 4 는 본 발명의 질량 분석용 플레이트 또는 알루미늄 플레이트를 사용하여 얻어지는 SCUPA 와 HSA 의 질량 분석 스펙트럼 (피크 이미지) 을 나타낸다. 가로축은 분자량, 세로축은 상대 강도를 나타낸다. 도 4A 및 B 는 SCUPA 를, 도 4C 및 D 는 HSA 를 각각 나타낸다. 또한, 도 4A 및 C 는 본 발명의 질량 분석용 플레이트를 사용한 경우를, 도 4B 및 D 는 알루미늄 플레이트를 사용한 경우를 각각 나타낸다.

도 5 는 본 발명의 질량 분석용 플레이트를 사용하여 전기 전사한 단백질 (SCUPA) 과 그것에 특이적으로 반응하는 항체 (항SCUPA 항체) 의 단백질-단백질 상호 작용을 질량 분석법에 의해 해석한 결과를 나타낸다. 가로축은 분자량, 세로축은 상대 강도를 나타낸다. 도면 중의 숫자는 피크의 분자량을 나타낸다. 도 5A 는 분리ㆍ전사된 SCUPA 와 항SCUPA 항체의 상호 작용을 나타낸다. 또한, 도 5B 는 항SCUPA 항체를 단독으로 사용한 경우의 결과를 나타낸다.

도 6 은 전기 영동에 의해 분리한 단백질을 PVDF 막에 전사한 경우의 질량 분석 스펙트럼을 나타낸다. 가로축은 분자량, 세로축은 상대 강도를 나타낸다. 도면 중의 숫자는 피크의 분자량을 나타낸다. 도 6A 는 SCUPA 를, 도 6B 는 HSA 를 각각 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

질량 분석용 플레이트

본 발명의 질량 분석용 플레이트는 지지체 (기본 구조) 상에 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride; PVDF) 를 함유하는 코팅 (박층) 을 갖는 것이다. 지지체의 소재는 통상 질량 분석용 플레이트에 있어서 사용되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 절연체 (유리, 세라믹스, 플라스틱/수지 등), 금속 (알루미늄, 스테인리스 스틸 등), 도전성 폴리머, 이들의 복합체 등을 들 수 있다. 바람직하게는 알루미늄 플레이트를 사용한다.

본 발명의 질량 분석용 플레이트의 형상은 사용하는 질량 분석 장치의, 특히 시료 도입구에 적합하도록 고안된다. 예를 들어, 전기 영동 후의 겔의 사이즈에 맞춘 집합형의 질량 분석용 플레이트에 단백질을 전사한 후에, 질량 분석 장치의 시료 도입구에 적합하도록 각 절편을 간단히 분리할 수 있게 미리 커팅선을 새긴 클러스터형 질량 분석용 플레이트 등을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 "PVDF 를 함유하는 코팅" 이란, 종래 공지된 PVDF 막과 같이 미리 성형된 구조체를 지지체 상에 중층하는 것이 아니라, PVDF 분자가 분산된 상태에서 지지체 상에 퇴적되어 형성되는 박층을 말한다. PVDF 가 퇴적되는 태양은 특별히 제한되지 않지만, 후술하는 질량 분석용 플레이트의 제조 방법에 있어서 예시되는 수단이 바람직하게 사용된다.

박층의 두께는 단백질의 전사 효율 및 질량 분석의 측정 감도 등에 바람직하지 못한 영향을 미치지 않는 범위에서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들어 약 0.1∼약 1000㎛, 바람직하게는 약 1∼약 300㎛ 이다.

질량 분석용 플레이트의 제조 방법

본 발명의 질량 분석용 플레이트는, PVDF 로 지지체 표면을 코팅함으로써 제조된다. 코팅의 수단으로서는 도포, 분무, 증착, 침지, 인쇄 (프린트), 스퍼터링 등이 바람직하게 예시된다.

"도포" 하는 경우, PVDF 를, 적당한 용매, 예를 들어 디메틸포름아미드 (dimethyl formamide; DMF) 등의 유기 용매에 적당한 농도 (예를 들어, 약 1∼약 100mg/mL 정도) 로 용해한 것 (이하, "PVDF 함유 용액" 이라고 한다) 을, 브러시 등의 적당한 도구를 사용하여 지지체 (기본 구조, 기판) 에 도포할 수 있다.

"분무" 하는 경우, 상기와 같이 하여 제조한 PVDF 함유 용액을 분무기에 넣어, 지지체 상에 균일하게 PVDF 가 퇴적되도록 분무하면 된다.

"증착" 하는 경우, 통상의 유기 박막 제작용 진공 증착 장치를 사용하여, 지지체를 넣은 진공조 속에서 PVDF (고체이어도 되고 용액이어도 된다) 를 가열ㆍ기화시킴으로써, 지지체 표면 상에 PVDF 의 박층을 형성시킬 수 있다.

"침지" 시키는 경우, 상기와 동일하게 하여 제조한 PVDF 함유 용액 중에 지지체를 침지시키면 된다.

"인쇄 (프린트)" 하는 경우에는 지지체의 재질에 따라 통상 사용될 수 있는 각종 인쇄 기술을 적절히 선택하여 이용할 수 있고, 예를 들어 스크린 인쇄 등이 바람직하게 사용된다.

"스퍼터링" 하는 경우에는 예를 들어, 진공 중에 불활성 가스 (예, Ar 가스 등) 를 도입하면서 지지체와 PVDF 사이에 직류 고전압을 인가하고, 이온화된 가스를 PVDF 에 충돌시켜, 튕겨져 날린 PVDF 분자를 지지체 상에 퇴적시켜 박층을 형성시킬 수 있다.

코팅은 지지체 전체면에 실시해도 되고, 질량 분석에 이용되는 한 면에만 실시해도 된다.

PVDF 는 코팅 수단에 따라 적절히 바람직한 형태로 사용할 수 있고, 예를 들어 PVDF 함유 용액, PVDF 함유 증기, PVDF 고체 분자 등의 형태로 지지체에 적용될 수 있지만, PVDF 함유 용액의 형태로 적용하는 것이 바람직하다. "적용" 이란 접촉 후에 PVDF 가 지지체 상에 잔류ㆍ퇴적되도록 지지체에 접촉시키는 것을 말한다. 적용량은 특별히 제한되지 않지만, PVDF량으로서, 예를 들어, 약 1∼약 100㎍/㎠ 를 들 수 있다. 적용 후에 용매는 자연 건조, 진공 건조 등에 의해 제거한다.

본 발명의 질량 분석용 플레이트에 있어서의 지지체 (기본 구조, 기판) 는 PVDF 로 코팅하기 전에 미리 적당한 물리적, 화학적 수법에 의해 그 표면을 수식 (가공) 하고 있어도 된다. 구체적으로는 플레이트 표면을 연마하는, 흠집을 내는, 산 처리, 알칼리 처리, 유리 처리 (테트라메톡시실란 등) 등의 수법이 예시된다.

본 발명의 질량 분석용 플레이트는 안정성이 우수하다. 즉, pH 2∼10 또는 각종 염을 함유하는 수용액, 메탄올, 아세토니트릴 등의 용매, 이들의 혼합 용매로의 침지, 전기적인 부하, 습윤과 건조의 반복, 고도한 진공 상태 등의 조건 하에서도 접착면은 박리되지 않는다는 특성을 갖는다.

당해 플레이트의 용도

A. 단백질 등의 동정

본 발명의 질량 분석용 플레이트를 사용하여 단백질을 비롯한 여러 가지의 화합물을 동정할 수 있다. 즉, 분석 대상물 (예: 단백질, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 당, 올리고당, 세포막 리셉터에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트, 독소, 바이러스 에피토프, 호르몬, 펩티드, 효소, 효소의 기질 또는 저해제, 코팩터, 약물, 렉틴, 항체 등) 함유 시료를 전기 영동 (예: 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동) 에 제공하여 분석 대상물을 분리하고, 분리된 분석 대상물을 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 전사하고, 전사된 분석 대상물을 질량 분석함으로써, (그 분자량에 관한 정보로부터) 분석 대상물을 동정하는 것이다.

분석 대상물 함유 시료

분석 대상물 함유 시료는 공지된 모든 수법에 의해 (생체) 재료로부터 제조될 수 있다. 여기서 (생체) 재료로서는 예를 들어, 동식물이나 미생물 등의, 임의의 생물의 세포 또는 조직, 또는 세포 외액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 뇨, 골수액, 복수 등), 세포 내액, 세포 소과립 내액 등을 들 수 있다. 또한, 세포 배양액, 유전자 재조합에 의해 얻어지는 배양액 등도 포함된다.

전기 영동에 제공되는 분석 대상물 함유 시료를 제조하는 데에는 공지된 방법이 이용된다. 예를 들어, 단백질 함유 시료의 경우, 표적 세포를 입수 후, 적절한 완충액 속에서 여러 가지의 단백질 분해 효소 저해제의 존재 하에 호모게나이즈하거나, 폴리트론 등의 세포 파괴 장치로 현탁화하거나, 저침투압 쇼크에 의해 세포를 파괴하거나, 초음파 처리에 의해 세포막을 파괴한 후, 원심분리 하여 상등액을 채취함으로써 가용성 분획을 얻을 수 있다. 또한 얻어진 침전 (불용성) 분획을, 계면 활성제나 단백질 변성제에 의해 가용화하여 사용할 수도 있다.

전기 영동

시료 중의 분석 대상물을 전기 영동에 의해 분리 (겔 상에 전개) 하는 공정이다. 전기 영동 장치는 공지된 것을 사용할 수 있다. 또한 시판되는 제품을 사용해도 된다. 목적에 따라 1차원 겔 전기 영동, 2차원 겔 전기 영동 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 2차원 겔 전기 영동에서는 1차원의 영동은 분석 대상물의 등전점에 의한 분리, 2차원의 영동은 분석 대상물의 분자량에 의한 분리가 기본이다. 전기 영동에 사용되는 겔의 사이즈는 특별히 제한되지 않는다. 10cm×10cm 가 일반적이지만, 필요하다면 20cm×20cm 또는 다른 사이즈도 사용할 수 있다. 또한, 겔의 소재도 폴리아크릴아미드가 기본이지만, 목적에 따라서는 아가로스 겔, 셀룰로오스아세테이트막 등, 다른 매체의 이용도 가능하다. 겔의 농도도 균일 농도 또는 기울 농도 모두를 사용할 수 있다.

전사

겔 전기 영동에 의해 분리한 분석 대상물을, 겔로부터 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 이동시키는 공정이다. 전사 장치로서는 공지된 것을 사용할 수 있다. 또한 시판되는 제품을 사용해도 된다. 전사 방법 자체는 공지이다. 영동 후 겔에 전개된 분석 대상물은 여러 가지 방법 (확산, 전기력 기타) 에 의해서 질량 분석용 플레이트에 이동된다. 이 공정은 일반적으로 전사 (blot) 라고 불린다. 확산 전사, 전기 전사 등을 들 수 있다. 특히 바람직하게는 전기 전사이다.

전기 전사시에 사용하는 완충액으로서는 pH 7∼9, 저염 농도의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 트리스 완충액, 인산염 완충액, 붕산염 완충액, 아세트산염 완충액 등이 예시된다. 트리스 완충액으로서는 트리스/글리신/메탄올 완충액, SDS-트리스-트리신 완충액 등, 인산염 완충액으로서는 ACN/NaCl/등장 인산염 완충액, 인산나트륨/ACN 등, 붕산염 완충액으로서는 붕산나트륨-염산 완충액, 트리스-붕산염/EDTA, 붕산염/ACN 등, 아세트산염 완충액으로서는 트리스-아세트산염/EDTA 등을 들 수 있다. 바람직하게는 트리스/글리신/메탄올 완충액, 붕산나트륨-염산 완충액이다. 트리스/글리신/메탄올 완충액의 조성으로서는 트리스 10∼15mM, 글리신 70∼120mM, 메탄올 7∼13% 정도가 예시된다. 붕산나트륨-염산 완충액의 조성으로는 붕산나트륨 5∼20mM 정도가 예시된다.

또한, 당해 전사 후, 이후의 질량 분석 (MALDI 법에 따름) 에 유리하도록, 레이저광을 흡수하여, 에너지 이동을 통하여 분석 대상물 분자의 이온화를 촉진하기 위해서 매트릭스라고 불리는 시약을 첨가할 수도 있다. 당해 매트릭스로서는 질량 분석에 있어서 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 시나핀산 (sinapinic acid; SPA (=3,5-dimethoxy-4-hydoroxycinammic acid)), 인돌아크릴산 (Indoleacrylic acid; IAA), 2,5-디히드록시벤조산 (2,5-dihydroxybenzoic acid; DHB), α-시아노-4-히드록시신남산 (α-cyano-4-hydroxycinammic acid; CHCA) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는 DHB 또는 CHCA 이다. CHCA 의 경우, 적어도 21% 포화 농도의 것을 첨가하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 21∼100% 포화 농도의 것, 바람직하게는 40∼100% 포화 농도의 것, 특히 바람직하게는 50∼100% 포화 농도의 것을 들 수 있다.

질량 분석

본 발명의 질량 분석용 플레이트 상에 전사된 분석 대상물을 질량 분석함으로써, (분자량에 관한 정보로부터) 분석 대상물을 동정하는 공정이다. 질량 분석 장치는 가스 형상의 시료를 이온화한 후, 그 분자나 분자 단편을 전자장에 투입하고, 그 이동 상황으로부터 질량수/전하수에 따라서 분리, 물질의 스펙트럼을 구함으로써, 물질의 분자량을 측정ㆍ검출하는 장치이다. 시료와 레이저광을 흡수하는 매트릭스를 혼합, 건조시켜 결정화하고, 매트릭스로부터의 에너지 이동에 의한 이온화와 레이저 조사에 의한 순간 가열에 의해, 이온화된 분석 대상물을 진공중으로 유도하는 매트릭스 지원 레이저 탈이온화 (MALDI) 와, 초기 가속에 의한 시료 분자 이온의 비행 시간차로 질량수를 분석하는 비행 시간형 질량 분석 (TOFMS) 을 합쳐 사용하는 MALDI-TOFMS 법, 1 분석 대상물을 1 액적에 얹어 액체로부터 직접 전기적으로 이온화하는 방법, 시료 용액을 전기적으로 대기 중에 스프레이하여, 개개의 분석 대상물 다가 이온을 펼쳐진(unfolded) 상태에서 증발시키는 것을 포함하는 나노 일렉트로 스프레이 질량 분석 (nano-ESMS) 법 등의 원리에 기초하는 질량 분석 장치를 사용할 수 있다.

본 발명의 질량 분석용 플레이트 상에 존재하는 분석 대상물을 질량 분석하는 방법 자체는 공지이다.

또한, 본 발명에 의한 프로테옴 해석의 완전 자동화를 위해서는 레이저 사출구, 또는 반대로 질량 분석용 플레이트를 실은 가대를 1차원 또는 2차원 방향으로 이동시키고, 연속 전체면 스캔함으로써, 전기 영동에 의해 1차원 또는 2차원으로 전개된 분석 대상물을 모두 분석에 제공할 수 있게 된다 (단속적인 스캔법에서는 레이저광이 조사되지 않는, 즉 분석되지 않는 분석 대상물이 잔존한다). 이 방식에 단속 스캔법을 도입하면 96웰 플레이트에 분주된 96종의 샘플을 일괄해서 질량 분석용 플레이트에 마운트하고 (직사각형 칩에 96종류의 샘플이 동일 간격으로 배열된다), 그대로 질량 분석에 제공할 수도 있다.

B. 분석 대상물군의 동정

본 발명에 의하면 여러 종류의 분석 대상물의 집합체 (분석 대상물군) 를 한번에 해석할 수 있다. 즉, 상기 기술한 여러 가지의 생체 재료로부터 제조되는 분석 대상물 함유 시료는 통상 다종 다양한 분석 대상물을 함유하고 있다. 이러한 분석 대상물군을 1차원 또는 2차원의 겔 전기 영동에 의해서 분리하고, 겔 상에 분리ㆍ전개된 분석 대상물군을, 예를 들어 영동 겔과 적합한 크기의 본 발명의 질량 분석용 플레이트 (바람직하게는 전사 후, 질량 분석 장치의 시료 도입구에 적합하도록 각 시편을 간단하게 분리할 수 있게 미리 커팅선을 새긴 클러스터형 질량 분석용 플레이트) 에 전사함으로써, 원칙적으로 분석 대상물 함유 시료 중에 포함되는 모든 분석 대상물 (분석 대상물이 단백질이면 프로테옴) 을, 개별 위치에 분획하여 질량 분석용 플레이트 상에 전사할 수 있다. 이들 분석 대상물군을 상기 연속 스캔형 질량 분석 장치를 사용하여 측정함으로써, 전사된 분석 대상물군을 일괄해서 동정할 수 있게 된다.

C. 분석 대상물 복합체의 동정

본 발명에 의하면 분석 대상물과 당해 분석 대상물과 친화성을 갖는 것 (상호 작용을 나타내는 것) 의 관련성을 한번에 해석할 수 있다. 즉, 전기 영동에 의해 분석 대상물을 분리하고, 분리된 분석 대상물을 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 전사하고, 그 후에 당해 분석 대상물과 친화성을 갖는 (상호 작용을 나타내는) 화합물을 함유하는 시료 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 핵산, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액, 세포막 분획, 오르가넬라막 분획 등) 를 첨가하여 당해 플레이트 상에서 복합체를 형성시키고, 형성된 복합체를 질량 분석함으로써, (분자량에 관한 정보로부터) 전사된 분석 대상물, 당해 분석 대상물과 친화성을 갖는 (상호 작용을 나타낸다) 화합물, 및/또는 이들의 복합체를 동정하는 것이다.

본 발명을 보다 상세히 설명하기 위해서 이하에 실시예를 들지만, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

발명의 개시

본 발명은, PVDF 로 기판을 코팅하여 그 기판 상에 PVDF 의 박층을 형성시킨 질량 분석용 플레이트는 PVDF 를 막의 형태로 기판 상에 고정화한 것에 비해, 질량 분석의 검출 감도 및 정밀도가 비약적으로 향상된다는 발견에 기초하고 있다. 또한, 이러한 질량 분석용 플레이트는 전사시에 매트릭스를 포함하지 않으므로, 전기 전사에 의해서도 용출되는 경우가 없다는 이점도 갖는다.

즉, 본 발명은

1) 지지체 상에 PVDF 를 함유하는 코팅을 갖고 이루어지는 질량 분석용 플레이트;

2) PVDF 로 지지체 표면을 코팅하는 것을 특징으로 하는 질량 분석용 플레이트의 제조 방법;

3) 분석 대상물 함유 시료를 겔 전기 영동하여 분석 대상물을 분리하고, 분리된 분석 대상물을 상기 1) 의, 또는 상기 2) 의 방법에 의해 얻어지는 질량 분석용 플레이트에 전사하고, 전사된 분석 대상물을 질량 분석하는 것을 포함하는 분석 대상물의 동정 방법;

에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적 및 특징, 그리고 본 발명의 효과는 이하의 발명의 상세한 설명에 있어서 보다 명확해질 것이다.

실시예 1: 질량 분석용 플레이트의 제조

ProteinChip System (Ciphergen 사 제) 의 질량 분석용 플레이트 도입부에 적합하도록 제조한 알루미늄제의 기본 구조 (알루미늄 플레이트) 를 1% 테트라메톡시실란/1% 아세트산 용액에 침지하고, 공기중에 건조시킨 후에 소성 (130℃, 3시간) 하였다. 이 플레이트에, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 를 디메틸포름아미드 (DMF) 에 10mg/mL 가 되도록 용해한 것을 도포하였다. 제조된 질량 분석용 플레이트는 크기가 78mm×8mm×2mm, 표면이 백색의 판 형상이었다.

본 질량 분석용 플레이트는 그 후의 유기 용매로의 침지에 의한 예비공정, 전기 영동 겔과의 접촉, 여러 가지의 완충액 중에서의 전기 전사, 그 후의 매트릭스의 도포 및 건조 및 질량 분석시의 고도 진공하 등의 각 공정에서, 균열, 박리, 손상, 변색 등의 화학적, 전기적, 기계적, 물리적 변성이 일체 생기지 않았다.

본 질량 분석용 플레이트를 사용하여 이하의 검토를 하였다.

실시예 2: 질량 분석용 플레이트에 대한 단백질의 전기 전사

프레스테인드 분자량 마커 (prestained molecular weight marker: Bio-Rad 사 제) 를 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔전기 영동한 후에, 겔 상의 단백질을 12.5mM Tris/96mM 글리신/10% 메탄올 완충액 속에서, 실시예 1 에서 제조한 질량 분석용 플레이트에 대하여, 90mA 로 3시간 전기 전사하였다. 그 결과, 전사 후의 폴리아크릴아미드 겔에는 분자량 9만과 11만의 프레스테인드 단백질이 약간 잔존하지만 (도 1B), 모든 단백질이 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 효율적으로 전사되었다 (도 1C).

실시예 3: 질량 분석용 플레이트에 전사된 단백질에 대한 질량 분석

샘플 (단백질 혼합물) 을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동한 후에 겔을 직접, 실시예 1 의 질량 분석용 플레이트에 접촉시키고, 전기 영동으로 분리된 단백질을 실시예 1 에서 제조한 질량 분석용 플레이트에 전기 전사시켜, 본 질량 분석용 플레이트를 즉시 질량 분석 장치에 도입하여 측정하였다. 매트릭스로서 2,5-디히드록시벤조산 (DHB; 75mg/mL 의 에탄올 용액) 을 사용하고, 측정 장치는 ProteinChip System (상기) 을 사용하여, 검출 전압: 1800V, 검출 감도: 8 및 레이저 강도: 280 의 조건에서 측정하였다. 질량 교정은 미오글로빈 (말 근육 유래), GAPDH (토끼 유래), 알부민 (소 혈청 유래) 을 사용하여 외부 교정을 행하였다. 본 실험에서는 단백질 혼합물로서, 단일 사슬 뇨성 플라스미노겐 활성화제 (single chain urinary plasminogen activator; SCUPA) 와 인간 혈청 알부민 (human serum albumin; HSA) 의 2종류의 단백질을 사용하여, 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 각 4㎍ 의 단백질 혼합물을 환원 하에서 일렬로 2회 전기 영동하였다. 즉, 초기 샘플을 첨가하여 30mA 에서 40분간 전기 영동한 후, 전류를 일단 멈추고, 2회째에 동일한 레인에 동일한 샘플을 첨가하여, 추가로 30mA 에서 23분간 전기 영동하였다. 영동 후, 겔을 영동 레인마다 커트하고, 추가로 겔 상면의 첨가 위치로부터 39mm 의 위치에서 커트하여, 2장의 영동 겔의 상면끼리가 접촉하도록 나열한 후에, 질량 분석용 플레이트를 접촉시켰다 (도 2A). 이 때, 영동 샘플은 SCUPA, HSA, SCUPA, HSA, HSA, SCUPA, HSA 및 SCUPA 의 순서로 배열하고, 질량 분석용 플레이트에는 각 단백질이 4개 밴드, 합계 8개 밴드가 전사되었다.

사용한 질량 분석 장치는 1개의 질량 분석용 플레이트에 대하여 레이저광이 연속적으로 조사되지 않고, 24개소에 걸쳐 동일 간격으로 조사되기 때문에, 전사된 단백질의 질량 분석용 플레이트 상의 위치에 따라서는 레이저광이 전혀 닿지 않는 경우, 일부분 닿는 경우, 완전히 닿는 경우가 상정된다 (도 2B). 이러한 분석 장치의 제약 하에서 레이저광이 가장 다량으로 닿아 피크 강도가 가장 높아지는 확률을 향상시키기 위해서, 앞서 기술한 수법으로 각 모델 단백질을 질량 분석용 플레이트의 상이한 4개 위치에 전사시키도록 설계하였다. 그 결과, 이론적으로는 같은 질량의 단백질이 전사되더라도, 질량 분석의 결과 얻어진 피크의 높이는 각양각색이었다 (도 3). 따라서, 본 실험에서는 얻어진 복수의 피크 중에서 상대 강도가 가장 높은 피크를 레이저광이 완전히 닿은 참값에 가장 가까운 값으로 간주하여 고찰하였다.

질량 분석용 플레이트는 사전에 메탄올에 침지하고, 전사용 완충액 (10mM 붕산나트륨 완충액, pH 8.0) 으로 평형화한 후에, 90mA 에서 2시간 전기 전사를 행하였다. 또한 질량 분석하여 상대 피크 강도를 측정하였다. 비교 대조로서, PVDF 를 코팅되지 않은 통상의 알루미늄 플레이트, 헥사데실기를 도입한 알루미늄 플레이트 (ProteinChip array, Ciphergen 사 제, H4) 도 사용하여 동일한 실험을 하였다. 결과를 도 3, 도 4 에 나타낸다.

SCUPA 의 경우, 본 발명의 질량 분석용 플레이트 (도 3A) 에서의 상대 피크 강도는 12.31 로, 통상의 알루미늄 플레이트 (도 3B) 의 값 (0.87) 보다 14배 높은 것이었다. HSA 에 관해서 동일하게 비교하면, 본 질량 분석용 플레이트에서의 상대 피크 강도는 알루미늄 플레이트에 비교하여 49배 (6.26:0.129) 높은 것이었다. 또한, 질량 분석용 플레이트는 H4 (도 3C) 와 비교하더라도 2배∼4배 상대 피크 강도가 높은 것이었다. 또한, 본 발명의 질량 분석용 플레이트 (도 4A 및 C) 는 알루미늄 플레이트 (도 4B 및 D) 에 비교하여 스펙트럼이 선명하였다. 이들 결과로부터, 본 발명의 질량 분석용 플레이트를 사용함으로써, 여러 종류의 단백질을 전기 영동으로 분리한 후, 신속 또한 고감도로 일괄해서 질량 분석할 수 있는 것이 판명되었다.

실시예 4: 전기 영동 분리 후의 전기 전사 단백질과 결합 단백질의 상호 작용의 분석

본 발명의 질량 분석용 플레이트를 사용한 응용예의 하나로서, 질량 분석용 플레이트에 전사된 단백질과 상호 작용할 수 있는 단백질의 결합 및 그 후의 질량 분석에 의한 그들 단백질 복합체의 동정을 검토하였다. 재료로서 SCUPA 와 그 항체 (항SCUPA 항체) 를 사용하였다.

SCUPA (4㎍) 를 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 첨가 후, 1시간 전기 영동하였다. 영동 후에 겔을 커트하여, 겔 상의 SCUPA 를 실시예 1 에서 제조한 질량 분석용 플레이트에 실시예 3 과 동일하게 전기 전사하였다. SCUPA 가 전사된 질량 분석용 플레이트를 블로킹한 후, 항혈청 (황산암모늄에 의해 조정제한 것, 항SCUPA 항체를 포함하고 있다) 을 첨가하여 하룻밤 반응시켰다. 반응 종료 후, 플레이트를 PBS 완충액으로 세정하고, 매트릭스를 첨가하여 질량 분석을 하였다. 그 결과를 도 5 에 나타낸다.

전기 영동 후의 질량 분석용 플레이트에 전사된 SCUPA 는 48,616 에 피크가 나타나고, 동 플레이트 상에 고정된 SCUPA 와 상호 작용한 항SCUPA 항체의 피크는 145,300 (73,115 는 동 항체의 2가 이온) 에서 관찰되었다 (도 5A). 또한, 대조군로서 SCUPA 를 포함하지 않은 겔에서는 전기 전사, 블로킹, 항SCUPA 항체 첨가, PBS 세정 등, 동일한 조작을 하였음에도 불구하고, 본 질량 분석용 플레이트에는 피크가 일절 관찰되지 않았다 (도 5B).

이상의 결과로부터, 전기 영동 분리 후, 본 질량 분석용 플레이트에 전사된 SCUPA 는 자신과 상호 작용할 수 있는 단백질 (항SCUPA 항체) 의 결합 활성을 유지한 것, 및 전사된 단백질과 그것과 상호 작용하는 단백질의 쌍방의 분자량이 실제로 일괄해서 측정되고, 그 결과, 양 분자가 동정된 점에서, 본 질량 분석용 플레이트 상에서 단백질-단백질 복합체의 검출과, 본 질량 분석용 플레이트 상에서 생성된 복합체의 동정이 가능한 것이 증명되었다.

비교예 1: PVDF 막에 대한 전사와 질량 분석

12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 SCUPA 와 HSA 의 2종류의 단백질 각 4㎍ 의 혼합물을 환원 하에서 일렬로 2회 전기 영동하였다. 초기 샘플을 첨가하여, 30mA 에서 40분간 전기 영동한 후, 전류를 일단 멈추고, 2회째에 동일한 레인에 동일한 샘플을 첨가하고, 추가로 30mA 로 23분간 전기 영동하였다. 영동 후 겔을 영동 레인마다 커트하고, 추가로 겔 상면의 첨가 위치로부터 39mm 의 위치에서 커트하여, 도 2A 에 나타내는 바와 같이 2장의 영동 겔의 상면끼리가 접촉하도록 나열한 겔 상에, 78mm×8mm 로 커트한 PVDF 막을 얹고, 10mM 붕산나트륨 완충액 (pH 8.0) 속에서 90mA, 2시간 전기 전사하였다. 전사 종료 후, PVDF 막을 PBS 로 세정하고, 증류수로 린스, 건조시켜, 추가로 투명 양면 테이프 (Sumitomo 3M Ltd. 사 제) 로 알루미늄 플레이트에 붙였다. 이것에 매트릭스 (DHB) 를 첨가하여 ProteinChip System (상기) 으로 질량 분석하였다.

그 결과, PVDF 막에 전사된 SCUPA 는 50,096.9 에, HSA 는 67,394.5 에, 각각 피크가 나타났지만, 상대 피크 강도가 매우 낮고, 또한 S/N 비도 낮기 때문에 피크의 동정이 곤란하였다 (도 6). 또한, 통상의 질량 분석용 플레이트 (본 발명의 질량 분석용 플레이트도 동일하지만) 에서는 고도 진공 상태에 도달하는 시간이 2∼3분이고, 그 후 바로 측정가능해지는 데 비하여, PVDF 막을 사용한 경우에는 진공 상태에 도달하는 시간이 45분이나 걸려, 사용한 질량 분석 장치에 과대한 부하를 가하기 때문에, 빈번한 사용에 견딜 수 없는 것이 판명되었다.

실시예 5: 본 발명의 질량 분석용 플레이트를 사용한 여러 가지의 프로테옴 분석

여러 가지의 세포 또는 조직 추출 샘플을 사용하여, 비교적 저분자량 범위 (분자량 1,000∼20,000) 에서의 본 발명의 질량 분석용 플레이트의 성능을 확인하였다. 이하의 실험에서는 분석 대상물을 16% SDS-폴리아크릴아미드 겔 (트리스-트리신 완충액 중) 에 적용하여, 90분간 전기 영동한 후, 10mM 붕산나트륨 완충액 (염산으로 pH 8.0 으로 조정한 것) 중, 겔로부터 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 1∼2시간 전기 전사하였다. 전사 종료 후, 플레이트를 린스하고, 매트릭스를 스팟팅(spot)하여 질량 분석을 하였다.

(1) 돼지 소뇌를 4℃, 1N 아세트산으로 균질화하고, 4℃, 3,000rpm 으로 30분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 아세토니트릴을 최종 농도 10% 가 되도록 첨가하여 역상 크로마토용 칼럼에 적용하였다. 10% 아세토니트릴을 포함하는 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) 으로 세정하여, 60% 아세토니트릴을 포함하는 0.1% TFA 로 용출시켰다. 용출물을 동결 건조시키고, 돼지 소뇌 추출물로 하였다. 이 추출물을, SDS-PAGE 로 분리후, 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 전기 전사하였다. 매트릭스로서, 0.5% TFA/50%ACN 중에 포화 α-시아노-4-히드록시신남산 (CHCA) 을 포함하는 것을 사용하여 질량 분석을 하였다. 그 결과, 분자량 3,000∼20,000 의 범위에서 피크를 검출가능하였다.

이것을, 매트릭스로서 포화 CHCA 대신에, DHB (150mg/mL 에탄올), 포화 SPA (0.5% TFA/50%ACN 중) 을 사용한 경우와 비교하여 보았다. DHB 의 경우에는 분자량 3,000∼20,000 의 범위에서는 명확한 피크가 인정되지 않았다. 포화 SPA 의 경우는 동일한 분자량의 범위에서 수개의 피크가 인정되었을 뿐이었다. 이에 비하여, 포화 CHCA 에서는 분자량 2,000∼10,000 의 범위 및 5,000∼20,000 의 범위에서 다수의 피크가 인정되었다. 이들 결과를 통해, 비교적 저분자량역의 단백질의 동정에는 CHCA 가 보다 바람직한 것을 알 수 있었다.

(2) 매트릭스로서 50% 포화 CHCA 를 사용한 것 이외에는 상기 (1) 과 동일하게 하여, 돼지 소뇌 추출물의 질량 분석을 하였다. 그 결과, 분자량 1,000 이상의 범위에서 피크를 검출할 수 있었다. 특히, 분자량 3,000∼20,000 의 범위에서 피크를 검출하는 데에 우수하였다.

이것을, 50% 포화 농도의 CHCA 대신에, 10 또는 20% 포화 농도의 것을 사용한 경우와, 분자량 1,000∼10,000 의 범위에서의 질량 분석에 있어서의 피크의 출현의 정도를 비교하여 보았다. 10% 포화 농도의 CHCA 의 경우는 수개의 피크가 인정되었다. 20% 포화 농도의 CHCA 의 경우에는 피크의 수가 10% 포화 농도의 것에 비하여 약간 많이 인정되었다. 이에 비하여, 50% 포화 농도의 CHCA 의 경우에는 다수의 피크가 인정되었다.

(3) U937 세포 (1×10⁵∼2×10⁶개/ml) 를, 10% FCS 를 포함하는 RPMI 1640 배지 중, 100ng/ml 포르볼(phorbol) 12-미리스트산 에스테르13-아세트산염 (PMA) 의 공존 하에서 48시간 배양하였다. PMA 비공존 하에서 동일하게 실험을 한 것을 대조로 하였다. 배양 종료 후에 인산염 완충 생리식염수 (PBS) 로 세포를 세정하고, 셀 펠릿을 제조하였다. 또한, 프로테인 추출 시약 (Novagen Inc.) 및 프로테아제 저해제를 첨가하여 4℃ 에서 15분간 방치한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하여 세포 용해물(cell lysate)로 이용하였다. 이것을 SDS-PAGE 로 분리 후, 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 전기 전사하였다. 또한 질량 분석을 하여, 분자량 3,000∼20,000 의 범위에서 검출된 피크의 강도에 관해서, PMA 로 자극한 U937 세포에서의 결과를 대조로서 U937 세포에서의 결과와 비교하였다. 그 결과, PMA 자극에 의한 단백질 발현 (피크 강도) 의 변동은 다음과 같았다 (표 1).

피크 (강도) 의 변동	피크수
소실	38
출현	11
감소	1
증가	2

(4) 마우스 조직의 프로파일링(profiling)을 행하였다. 마우스의 각 조직 (뇌, 폐, 간, 근육) 을 Beads Shocker (Yasui Kikai Corporation, Osaka) 를 사용하여 2,500rpm 으로 10∼30초간 처리하고 분쇄하여, 트리신 PAGE 샘플 완충액 (Wako Pure Chemical Industries) 을 첨가하여 12,000rpm 으로 5분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. SDS-PAGE 로 분리 후, 본 발명의 질량 분석용 플레이트에 전기 전사하여 질량 분석을 하였다. 그 결과, 각각의 조직에서 조직 특이적인 펩티드 (분자량 3,000∼20,000) 가 검출되었다.

실시예 6: 전기 전사시의 완충액의 효과의 검토

전기 전사시의 완충액으로서, 트리스 완충액 (25mM 트리스/192mM 글리신/20% 메탄올, pH 8.3), 인산염 완충액 (5%ACN/125mM NaC1/PBS, pH 7.2), 아세트산염 완충액 (40mM 트리스-아세트산염/1mM EDTA, pH 8.0), 붕산염 완충액 (10mM 붕산나트륨-염산, pH 8.0) 을 사용하였다. 질량 분석용 단백질로서는 HSA, SCUPA 를 사용하였다. 그 밖에는 실시예 5 의 방법에 준하여 실험하였다. 그 결과, 각 완충액 중에서는 붕산염 완충액을 사용한 경우에 질량 분석의 피크 강도가 최대가 되었다. 예를 들어, 피크 강도의 최대치는 붕산염 완충액 대 인산염 완충액에서는 SCUPA 에서 약 21배, HSA 에서 약 4배이었다.

본 발명의 질량 분석용 플레이트는 리간드 흡착 소재로서 PVDF 를 사용한 것에 의해, 각종 단백질을 균등하게 흡착할 수 있고, 전사 효율이 우수하고, 단백질의 3차원 구조ㆍ기능을 정상으로 유지할 수 있게 된다. 또한, 비특이 흡착이 일어나지 않고, 전사 후 순간적으로 질량 분석을 할 수 있는 등의 특징을 갖는다.

본 발명의 질량 분석용 플레이트의 이러한 특징을 살려, 다량, 신속 또한 고감도로 단백질을 분석ㆍ동정할 수 있다. 단백질은 1종이어도 되고, 여러 종류의 집합체 (단백질군) 이어도 되고, 또한 당해 단백질과 친화성을 갖는 (상호 작용을 나타내는) 화합물과의 복합체이더라도 동일하게 (요컨대, 다량, 신속 또한 고감도로) 분석ㆍ동정할 수 있다.

또한, 조작 시간의 대폭적인 단축화와 공정의 간략화, 장치의 소형화, 저렴 화, 자동화, 대량의 분석 대상물 처리가 가능해져, 대규모인 프로테옴 해석이 용이해진다. 또한, 생리적으로 중요한 미량 단백질의 프로테옴 해석이 가능해져, 진단용의 바이오 마커의 발견, 신규 의약품 개발의 시드의 발견에 공헌할 수 있다.

따라서 본 발명은 전기 영동법과 질량 분석법을 조합한 종래의 프로테옴 해석에 새로운 수법을 도입하는 것을 가능하게 하는 것이다.

본 출원은 미국에서 출원된 US10/264,505 및 일본에서 출원된 일본 특허출원 2002-344710 을 기초로 하고 있고, 이들의 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

여기서 기술된 간행물 및 특허를 포함한 모든 인용 문헌은 여기서 언급됨에 따라, 인용에 의해 삽입되는 것이고, 개개로 상세하게 개시되어, 여기서 그 전부가 명시된 것과 같은 정도로, 명세서 중에 삽입되는 것이다.

본 발명은 바람직한 구체예를 강조하여 기재하였는데, 바람직한 구체예를 변경해도 됨은 당업자에게 명백하다. 여기서 상세하게 기재된 방법 이외의 방법으로 본 발명을 실행해도 된다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구 범위의 정신 및 범위 내에 포함되는 모든 변경을 포함하는 것이다.

Claims

지지체 및 그것에 접착하는 코팅을 포함는 질량 분석용 플레이트로서, 그 코팅이 폴리비닐리덴 디플루오라이드를 함유하는 플레이트.
제 1 항에 있어서, 지지체가 알루미늄 또는 스테인리스 스틸제인 플레이트.
폴리비닐리덴 디플루오라이드로 지지체를 코팅하는 것을 포함하는 질량 분석용 플레이트의 제조 방법.
제 3 항에 있어서, 코팅 수단이 도포, 분무, 증착, 침지, 인쇄 또는 스퍼터링인 방법.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 함유 용액을 지지체에 적용하는 것을 포함하는 방법.
제 5 항에 있어서, 적용 후에 용매를 제거하는 것을 포함하는 방법.
제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 질량 분석용 플레이트.
하기의 (a)∼(d) 단계를 포함하는 분석 대상물의 동정 방법:

(a) 제 1 항 또는 제 7 항에 기재된 질량 분석용 플레이트를 제공하는 단계,

(b) 분석 대상물 함유 시료를 겔 전기 영동에 제공하는 단계,

(c) 영동 후의 겔을 그 플레이트에 전사(blotting)하여 분석 대상물을 플레이트로 이동시키는 단계,

(d) 상기 플레이트를 질량 분석에 제공하여 이동된 분석 대상물을 분석하는 단계.
제 8 항에 있어서, 전사가 전기 전사인 방법.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 질량 분석이 MALDI-MS 인 방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 대상물 함유 시료가 여러 종류의 분석 대상물을 함유하는 방법.
제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 대상물을 단백질, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 당, 올리고당, 세포막 리셉터에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트, 독소, 바이러스 에피토프, 호르몬, 펩티드, 효소, 효소의 기질 또는 저해제, 코팩터, 약물, 렉틴 및 항체로 이루어지는 군에서 선택하는 방법.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 와 (d) 사이에, 이동된 분석 대상물과 친화성을 갖는 물질을 함유하는 시료를 플레이트에 접촉시키고, 플레이트 상에서 상기 분석 대상물과 상기 물질의 복합체를 형성시키는 단계 (c2) 을 추가로 포함함으로써, 단계 (d) 에 있어서 그 분석 대상물과 그 물질을 동시에 분석하는 방법.
제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 또는 (c2) 와 단계 (d) 사이에, 질량 분석용 매트릭스를 플레이트에 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 14 항에 있어서, 매트릭스가 2,5-디히드록시벤조산인 방법.