DE602004011900T2

DE602004011900T2 - Verfahren zum Nachweis und zur Analyse von makromolekularen Komplexen

Info

Publication number: DE602004011900T2
Application number: DE602004011900T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Baumeister; Stephan Nickell; Christine Kofler; Marius Boicu; Thomas Keil
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2004-04-28
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2024-04-29
Also published as: EP1591783A1; JP2007534950A; WO2005106447A1; DE602004011900D1; US20080213748A1; ATE386931T1; EP1591783B1; JP5054514B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Analyse der Struktur von makromolekularen Komplexen und/oder Makromolekülen, umfassend die Schritte (a) Aufreinigung oder Trennung der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle aus einer Probe, welche die makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle enthält, durch die Anwendung einer Trennkraft in einer porösen Matrix in eine erste Dimension (X-Achse); (b) Transfer der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle, die in Schritt (a) aufgereinigt oder getrennt wurden, durch Adsorptionskräfte in eine zweite Dimension (Z-Achse) von der porösen Matrix auf einen Träger, wobei der Träger die Oberfläche der porösen Matrix berührt und parallel zu der Oberfläche der Matrix und parallel zu der Richtung der in Schritt (a) angewandten Trennkraft ausgerichtet ist; (c) Immobilisierung der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle auf dem Träger nach dem Transfer von Schritt (b); und (d) Untersuchung der Struktur der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle auf dem Träger nach der Immobilisierung von Schritt (c).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Analyse, ob ein Individuum an einer Krankheit leidet oder anfällig dafür ist, eine Krankheit zu entwickeln, wobei die Krankheit korreliert mit dem Auftreten oder Fehlen von Proteinkomplexen und/oder Viruskomplexen und/oder bakteriellen Komplexen und/oder Pilz-Komplexen und/oder Prionen-ähnlichen Komplexen, umfassend die Schritte (a) Feststellung des Auftretens und gegebenenfalls der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe (mit Prionen in Zusammenhang stehenden Komplexen) durch (aa) Aufreinigung oder Trennung der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe aus einer Probe, die mutmaßlich die Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe enthält, durch die Anwendung einer Trennkraft in eine erste Dimension (X-Achse) in einer porösen Matrix; (ab)Transfer der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe, die in Schritt (aa) aufgereinigt oder getrennt wurden, durch Adsorptionskräfte in eine zweite Dimension (Z-Achse) von der porösen Matrix auf einen Träger, wobei der Träger die Oberfläche der porösen Matrix berührt und parallel zu der Oberfläche der Matrix und parallel zu der Richtung der in Schritt (aa) angewandten Trennkraft ausgerichtet ist; (ac) Immobilisierung der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe auf dem Träger nach dem Transfer in Schritt 2(ab); und (b) Korrelierung des Auftretens oder Fehlens oder der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe auf dem Träger mit dem Leiden des Individuums an einer Krankheit oder der Anfälligkeit, eine Krankheit zu entwickeln.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Für viele biochemische Bedürfnisse ist es wünschenswert in der Lage zu sein, für die weitere Analyse bestimmte Moleküle aus einem Gemisch an Molekülen abzutrennen. Dies schließt beispielsweise die Aufreinigung von Proteinen oder anderen biologischen Molekülen aus Zellextrakten, die Aufreinigung von synthetisch hergestellten Chemikalien von Kontaminationen oder die Auftrennung von chemischen Gemischen ein. Des weiteren ist die Abtrennung von Molekülen für die Strukturanalyse und die Identifizierung von Bestandteilen in einem Gemisch an Molekülen wichtig. Insbesondere verlangt die wachsende Wissenschaft der Proteomics die Identifizierung von Molekülen und größeren Ansammlungen interagierender Moleküle, die makromolekulare Komplexe innerhalb des Proteoms einer Zelle bilden, also der Gesamtheit an Proteinen, die von einer bestimmten Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt hergestellt werden. Es gibt daher einen Bedarf an allgemeinen Verfahren, die eine quantitative Analyse eines großen Satzes an Proteinen erlauben, die verschiedene Größen, Funktionen, Aktivitäten, Konformationen und Löslichkeiten aufweisen. Das Problem erscheint im Lichte der Erfordernisse für pharmakologische Studien, bei denen Hunderte bis Tausende Proteine und makromolekulare Komplexe parallel und in einem angemessenen experimentellen Zeitrahmen analysiert werden müssen, noch schwieriger zu lösen.
Traditionell wurde eine solche Trennung oder Aufreinigung durch verschiedene Verfahren wie Fällung und Dialysetechniken (Englard, S. et al. (1990); Pohl, T. (1990)), chromatographische Verfahren (Hagel, L. (1989); Stellwagen, E. (1990); Cutler, P. (1996)) und Gel-Elektrophorese (Rickwood, D., et al. (1990); Harnes, B. D. (1998)) erreicht, die sich der Trennung von Molekülen auf der Grundlage ihrer Mobilität bedient, welche von ihrem Ladungs-/Masse-Verhältnis dominiert ist. Die Elektrophorese wird weithin eingesetzt und üblicherweise in einer porösen Matrix durchgeführt, wie einem Agarose- oder Polyacrylamidgel. Oft werden Moleküle durch Anlegen eines elektrischen Feldes in einer ersten Dimension in Relation zu ihrer Mobilität aufgetrennt. Es ist auch möglich, dann einen zweiten Trennungsschritt durchzuführen, wobei ein elektrisches Feld angelegt wird, das sich in der Orientierung von dem elektrischen Feld unterscheidet, das für die Auftrennung in der ersten Dimension eingesetzt wurde, wodurch eine zweidimensionale Gel-Elektrophorese generiert wird. Gel-Elektrophorese ist somit eine Technik zur Auftrennung von Gemischen an Molekülen mit hoher Auflösung.
Weitere Analyseschritte umfassen die Lokalisierung und Identifizierung der spezifischen Banden durch Färbeverfahren, beispielsweise mit Coomassieblau, Silber, Ethidiumbromid oder mit fluoreszierenden Stoffen, sowie die Bestimmung des Masse-/Ladungsverhältnisses bzw. der Masse, wobei die Position der Banden mit einer Vergleichsmarkierung verglichen wird, die parallel zur Probe verläuft. Ferner kann der auto-fluoreszierende Effekt und die Lichtabsorption zur Lokalisierung und Identifizierung der spezifischen Banden eingesetzt werden. Dieses Verfahren kann mit nativen und denaturierten (SDS-)Gelen durchgeführt werden.
Die fraktionierten und gereinigten Moleküle werden routinemäßig durch Massenspektrometrie oder verschiedene Blottingverfahren wie Southern-(Southern, E. (1975)) und Northern-Blots und spezifische Untersuchung mit Antikörpern (Western Blot) untersucht und charakterisiert. Voraussetzung für weitere Untersuchungen, insbesondere strukturelle Untersuchungen, ist die Extraktion oder Abtrennung der bereits fraktionierten Probe aus der porösen Matrix bzw. aus dem laufenden Gel. Das Herausschneiden der spezifischen Banden mit einem Skalpell, das Blotten oder Herausschütteln der Moleküle aus dem Gel sind die häufig eingesetzten Standardverfahren. Es gibt mehrere Blottingverfahren, einschließlich Diffusionstransfer, Kapillartransfer, hitzebeschleunigtem Konvektionstransfer, Vakuum-Blottingtransfer und Elektroelution (Jeno, P. et al. (1996)). Das für Proteine am häufigsten eingesetzte Transferverfahren ist Elektroelution oder elektrophoretischer Transfer und zwar wegen der Schnelligkeit und Transfereffizienz. Dieses Verfahren nutzt die elektrophoretische Mobilität von Proteinen, um sie vom Gel auf eine Matrix zu verlagern. Der elektrophoretische Transfer von Proteinen schließt das direkte In-Kontakt-Bringen des Protein-enthaltenden Gels mit einem Stück Nitrozellulose oder einem anderen geeigneten Protein-bindenden Träger und die Sandwichbildung davon zwischen zwei Elektroden ein, die in eine leitende Lösung eingetaucht sind. Nach dem Anlegen eines elektrischen Feldes bewegen sich die Proteine aus dem Polyacrylamidgel heraus und auf die Oberfläche der Membran, wo sie fest verankert werden. Der Großteil an Proteinausbeute ist daher an die Membran gebunden und nur unter Schwierigkeiten in einer Pufferlösung wieder zu solubilisieren. All diese Techniken setzen ein festes Trägermaterial wie Zellulosepapier oder eine poröse Membran ein, wo die abgetrennte Probe abgelagert wird.
Eine Technik, die dem elektrophoretischen Filterblottingverfahren im Konzept ähnelt und die Elektronenmikroskopie anzuwenden versucht, ist in Jett & Baer, 1993, beschrieben und von einem früher von Easom et al., 1989, beschriebenen Ansatz abgeleitet. In diesen Veröffentlichungen wird ein Elektronenmikroskopiegitter als Träger eingesetzt, der für die Adsorption der Moleküle an seine Oberfläche und die Untersuchung im Elektronenmikroskop geeignet ist. Dieses Verfahren wird als „Schnappschuß-Blotting" beschrieben und schließt verschiedene experimentelle Schritte wie das vorherige Anfärben der Moleküle mit Ethidiumbromid oder YOYO-1 (Molecular Probe), das besondere Gitterpräparationsverfahren oder die Menge an Glycerin (5–10 Vol-%) ein, die vor der Beladung des Gels mit den Proben zugegeben werden muss. Vor der Montage und dem Einführen in das Gel werden die Gitter zur Verbesserung ihrer hydrophilen Eigenschaften behandelt und in einen Spermidinpuffer getaucht, damit sie positiv geladen werden. Das Elektrophoresegel wird aus dem Elektrophoreseapparat entfernt und auf den Transilluminator gelegt, wodurch die Banden sichtbar gemacht werden. Vertikale Einschnitte werden von Hand mit einem Skalpell in die Mitte jeder zu untersuchenden Gelbande gesetzt, das Gel dann in die Gelbox zurückgeführt und 5 Sekunden lang einer Elektrophorese unterworfen. In einem zweiten Schritt wird das Gel wieder auf den Transilluminator gelegt und die Gitter werden im rechten Winkel in Bezug auf die obere Oberfläche des Gels in die Einschnitte eingesetzt, wobei die Kohlenstoffseite des Gitters den negativen Polen gegenübersteht. Nach dem Einsetzen der Gitter wird das Gel ein zweites Mal in die Gelbox überführt und eine Elektrophorese findet 5 Sekunden bei 80 V statt. Sie verbleiben anschließend weitere 5 Minuten im Gel, wobei die Stromzufuhr abgeschaltet ist. Anschließend werden die Gitter aus den Gel genommen, durch negative Färbung nach üblichen Verfahren fixiert und anschließend in einem Transmissions-Elektronenmikroskop weiter untersucht.
Experimentell werden all diese Schritte von Hand ausgeführt, sie sind arbeitsintensiv und anfällig für Fehler des Anwenders. Wenn die Gitter in die Gele eingesetzt werden, so führt dies zu wesentlichen Veränderungen in den elektrophoretischen Eigenschaften der Auftrennungsmedien, was zu einem Verlust an Auflösung führt. Das Verfahren ist ferner anfällig für die Denaturierung der Proteine durch Dehydrierung während der Transportvorgänge durch die Luft und durch das Fixierungsverfahren an der Gitteroberfläche. Mögliche Verunreinigungen der Probe resultieren daraus, dass Reste des trennenden Gels an dem Gitter anhaften und chemische und physikalische Veränderungen im Elektronenmikroskop durchmachen, wenn sie dem Elektronenstrahl ausgesetzt werden. Diese Veränderungen können beispielsweise das Schmelzen, die Koagulierung und die Ladungseigenschaften der zu analysierenden Proben beeinflussen. Dies führt zu einer verminderten Qualität der elektronenmikroskopischen Aufnahmen und macht eine quantitative und strukturelle Analyse der Proteine schwierig.
Ein automatisiertes Verfahren ist in der WO 02/090966 (Michael et al., 2002) beschrieben. Es beschreibt ein automatisiertes Hochdurchsatzsystem zur Ausschneiden von (punktuellen) Proben aus einem Elektrophoresegel umfassend eine Vorrichtung zum punktuellen Ausschneiden von Gel, Einsatz von löchrigen Kohlenstoff-Kupfer-Gittern für die Elektronen-Kryomikroskopie, einen Computerkontrollierten Roboterarm, ein Hantierungssystem für Probenplatten, wobei ein Computer mit einer Scan- und digitalen Bildverarbeitungsvorrichtung zur Identifizierung von durch eine Schneidevorrichtung auszuschneidenen und nachfolgend in Platten mit vielen Vertiefungen zu übertragenden Punkten (Flecken; „Spots") verbunden ist.
Wie diskutiert, weisen die vorstehend beschriebenen Techniken und Verfahren größere Nachteile hinsichtlich einer einfach zu handhabenden und zuverlässigen Erfassung und strukturellen Analyse makromolekularer Komplexe auf, insbesondere hinsichtlich der nachfolgenden Verwendung in Bildverarbeitungstechnologien. Der Stand der Technik hat nicht einmal Verfahren beschrieben, die leicht durchgeführt werden können und keine intensive Laborarbeit verlangen. Das der Erfindung zugrunde liegende technische Problem war daher, derartige Verfahren bereit zu stellen.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Analyse der Struktur von makromolekularen Komplexen und/oder Makromolekülen, umfassend die Schritte (a) Aufreinigung oder Trennung der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle aus einer Probe, welche die makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle enthält, durch die Anwendung einer Trennkraft in einer porösen Matrix in eine erste Dimension (X-Achse); (b) Transfer der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle, die in Schritt (a) aufgereinigt oder getrennt wurden, durch Adsorptionskräfte in eine zweite Dimension (Z-Achse) von der porösen Matrix auf einen Träger, wobei der Träger ein Elektronenmikroskopiegitter ist und die Oberfläche der porösen Matrix berührt und parallel zu der Oberfläche der Matrix und parallel zu der Richtung der in Schritt (a) angewandten Trennkraft ausgerichtet ist; (c) Immobilisierung der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle auf dem Träger nach dem Transfer von Schritt (b); und (d) Untersuchung der Struktur der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle auf dem Träger nach der Immobilisierung von Schritt (c).
Der Begriff „wobei der Träger die Oberfläche der porösen Matrix berührt" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass makromolekulare Komplexe sich ohne einen Verlust an struktureller Information aus der porösen Matrix heraus bewegen oder daraus diffundieren können und zwar zum Träger hin. Dies wird üblicherweise erreicht, wenn sich eine flüssige Schicht zwischen der Oberfläche der porösen Matrix und der Oberfläche des Trägers bildet. Die flüssige Schicht kann sich beispielsweise sofort nach dem Aufbringen des Trägers auf die Oberfläche der porösen Matrix bilden oder kann durch zusätzliches Aufbringen der Flüssigkeit hergestellt werden.
Der Begriff „makromolekulare Komplexe" bezeichnet erfindungsgemäß jede aus Untereinheiten aufgebaute Zusammensetzung. Die Untereinheit ist üblicherweise die kleinste Einheit des makromolekularen Komplexes und ist die Ursache für die kennzeichnende Struktur oder Eigenschaft des makromolekularen Komplexes. Die Untereinheit ist beispielsweise ein Proteinmonomer, ein DNA- oder RNA-Makromolekül oder ein anorganisches Makromolekül.
Der Begriff „poröse Matrix", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezeichnet ein organisches oder anorganisches Medium, das durch seine Durchlässigkeit für andere Stoffe gekennzeichnet ist.
Der Begriff „Trennkraft" bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Kraft, der ein makromolekularer Komplex oder ein Makromolekül aufgrund seiner Ladung in einem elektrischen Feld ausgesetzt ist.
Der Begriff „Adsorptionskraft" bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Kraft bzw. die Kräfte, die die Ablagerung der makromolekularen Komplexe auf dem Träger bewirken. Diese Kräfte schließen van-der-Waals-Kräfte, kovalente Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen, Dipol-Dipol-Interaktionen, hydrophile und hydrophobe Wirkungen ein.
Der Begriff „Träger" schließt erfindungsgemäß alle Mittel ein, die aus einem Substrat bestehen, das eine Adsorption der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle erlaubt und geeignete bildverarbeitende Eigenschaften beispielsweise für die Elektronenmikroskopie bereitstellt.
Wie vorstehend ausgeführt und in anderen Worten löst die Erfindung das genannte technische Problem durch ein äußerst verlässliches und reproduzierbares Verfahren zum Nachweis und zur Analyse von makromolekularen Komplexen, das einfach durchführbar ist. Wie insbesondere vorstehend ausgeführt wurde, stützen sich Verfahren aus dem Stand der Technik auf Blotting-Verfahren, bei denen makromolekulare Komplexe, vor allem Proteine und Proteinkomplexe, von einer porösen Matrix wie einem Gel auf Blotting-Membranen übertragen werden und zwar unter Anwendung von Elektroelution oder elektrophoretischem Transfer, wobei man sich die elektrophoretische Mobilität der Proteine zunutze macht. Nachdem die makromolekularen Komplexe auf eine Blotting-Membran übertragen worden sind, müssen sie z. B. in einem Puffer gelöst und nachfolgend auf einen für die direkte Bildverarbeitung geeigneten Träger übertragen werden, beispielsweise ein Gitter für die Elektronenmikroskopie. Dieses Verfahren kann letztendlich zur Denaturierung der Probe und/oder zum Verlust von Material führen. Überraschenderweise haben die Erfinder gefunden, dass makromolekulare Komplexe bei einer Platzierung des Trägers parallel zur Oberfläche der porösen Matrix effizient und ohne signifikanten Verlust auf den Träger transferiert werden. Nach der Immobilisierung können die makromolekularen Komplexe direkt analysiert werden. Darüber hinaus wird die native Struktur der makromolekularen Komplexe beibehalten und das Verfahren ist äußerst zuverlässig und reproduzierbar. Der vorstehend genannte Befund ist insbesondere deshalb überraschend, weil für den Transfer der aufgetrennten makromolekularen Komplexe von der porösen Matrix auf den Träger keine elektrophoretischen Übertragungsschritte oder Elutionsschritte notwendig sind. Wie erwähnt, werden die aufgetrennten makromolekularen Komplexe im Stand der Technik aus der porösen Matrix ausgeschnitten oder auf eine Blotting-Membran geblottet oder aus der porösen Matrix herausgeschüttelt, bevor sie auf einen Träger übertragen, fixiert und dann analysiert werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann wirksam ohne die vorstehend erläuterten Schritte durchgeführt werden, wodurch die praktische Anwendung einfacher, schneller und auch billiger wird. Wie auch vorstehend erläutert wurde, war im Stand der Technik bekannt, dass man Gitter in einem rechten Winkel relativ zur Oberfläche des Gels in vertikale Einschnitte einführen und Proteine nachfolgend auf die Gitter transferieren kann. Diese „Schnappschuss-Blotting"-Technik erfordert die Vorbehandlung der Gitter mit einem Spermidinpuffer. Darüber hinaus muss das Gel aus dem Elektrophorese-Apparat herausgenommen werden, damit man die Banden sichtbar machen kann, in die dann die Einschnitte gesetzt werden. Anschließend wird das Gel in die Gelbox rücküberführt und es wird für 5 Sekunden bei 80 V eine Elektrophorese durchgeführt, wodurch die Proteine auf des Elektronenmikroskopiegitter übertragen werden. Die Platzierung des Gitters in die Einschnitte im Gel und die Durchführung des Elektrophoreseschrittes vor der Fixierung führt zu vielen Nachteilen bei der nachfolgenden Analyse der Struktur der Proteine in einem Transmissionselektronenmikroskop und führt zu einem Verlust an Auslösung und möglichen Verunreinigungen, die von Resten des Trenngels herrühren, die an dem Gitter anhaften.
Das erfindungsgemäß am meisten ermutigende Ergebnis war der Nachweis, dass die vorstehend genannten Nachteile durch den unerwarteten Befund ausgeräumt werden konnten, dass ein Träger wie ein Elektronenmikroskopiegitter parallel zur Oberfläche einer porösen Matrix in Kontakt gebracht werden und der Transfer ohne Anwendung irgendeines zusätzlichen elektrophoretischen Transferschrittes erfolgen kann. Es ist insbesondere unerwartet und überraschend, das die Positionierung des Trägers, wie erfindungsgemäß durchgeführt, d. h. parallel zur Oberfläche der porösen Matrix und parallel zur Richtung der Trennkraft, zu hochwertigen Darstellungen der Struktur der makromolekularen Komplexe führt.
Experimentell wird ein Träger, wie beispielsweise ein kommerziell verfügbares Elektronenmikroskopiegitter auf die Punkte der porösen Matrix aufgebracht, in denen zuvor die makromolekularen Komplexe durch Färbung oder Autofluoreszenz identifiziert wurden. Diese Identifizierung kann vom Anwender durch Anfertigung einer Bildverarbeitung des Gels oder mit geeigneter Computersoftware erfolgen. Der Träger ist parallel zu Oberfläche der porösen Matrix orientiert, wodurch ein enger Kontakt zwischen den Oberflächen des Trägers und der Matrix ermöglicht wird. Gegebenenfalls kann ein Tropfen einer geeigneten Pufferlösung, üblicherweise im pH-Bereich der aufgetrennten Moleküle zur Aufrechterhaltung der nativen Bedingungen auf den Träger aufgebracht werden und zwar zwischen die Oberflächen des Trägers und der Matrix. Die makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle bewegen sich zur Oberfläche des Trägers hin, die von einer dünnen Schicht oder einem dünnen Film bedeckt ist, welche/r die Ablagerung der Moleküle ermöglicht und gleichzeitig für den Elektronenstrahl transparent ist. Ein übliches Material im Bereich der Elektronenmikroskopie für die genannte dünne Schicht, das auch erfindungsgemäß eingesetzt wird, ist eine dünne Kohlenstoffschicht, die gegebenenfalls Löcher aufweist.
Üblicherweise wird der Träger nach 30 bis 90 Sekunden von der Oberfläche der porösen Matrix entfernt. Um gegebenenfalls die Ausbeute an auf der Oberfläche des Trägers abgelagerten Molekülen zu erhöhen, kann das Gel an seiner Oberfläche aufgeraut werden, indem die Geloberfläche mit einer Pinzette oder einem rasierklingenartigen Gerät gelöchert wird. Auf diese Weise wird eine größere Menge der innerhalb des Gels befindlichen makromolekularen Komplexe gegenüber der Trägeroberfläche exponiert und kann adsorbiert werden. Eine andere Möglichkeit, die Menge an adsorbierenden Molekülen zu erhöhen, liegt darin, zusätzlich ein elektrisches Feld zwischen dem Träger und der porösen Matrix anzulegen. Dadurch wird eine zusätzliche elektrische Kraft eingesetzt, die zu einem erhöhten Transport zur und einer erhöhten Ablagerung der Moleküle auf der Trägeroberfläche führt. Es ist ferner möglich, die Menge an an die Trägeroberfläche adsorbierenden Molekülen zu erhöhen, indem die Oberfläche mit chemischen Substanzen behandelt wird, die spezifische Bindungsdomänen für chemische Komplexe bereitstellen. Dies kann beispielsweise durch Inkorporation von hydrophoben oder hydrophilen, polaren oder nicht-polaren Gruppen erreicht werden. So kann eine maßgeschneiderte Immobilisierung von spezifischen Molekülen und molekularen Anordnungen erhalten werden. Auch die Morphologie der Trägeroberfläche kann angepasst werden, um die Bindeeigenschaften zu verbessern (Eckerskorn, Ch. et al., (1993)). Anstelle einer ununterbrochenen Folie kann eine löchrige Kohlenstofffolie auf die Trägeroberfläche aufgebracht werden. In diesem Fall bedeckt die Pufferlösung mit den gelösten Molekülen gleichzeitig das Gitter und die löchrigen Bereiche in dem löchrigen Kohlenstofffilm. Nach einem üblichen Kryofixierungsverfahren bildet die Pufferlösung amorphes Eis in den Löchern der löchrigen Kohlenstofffolie, wodurch die Molekülstruktur immobilisiert wird. Die native Struktur, insbesondere von makromolekularen Komplexen und Proteinen wird hierdurch fast zur Gänze beibehalten. Dieses amorphe Eis kann auch von einem Elektronenstrahl durchdrungen und für die Bildverarbeitung von makromolekularen Komplexen eingesetzt werden. All diese Schritte können auf einfache Weise mit einem automatisierten System unter Verwendung von Standardkomponenten durchgeführt werden, wie einem Computer für Kontrollzwecke, einem Mikrofluid-System, einer Robotervorrichtung zur Handhabung der Träger und einer Scanvorrichtung. Nach der Aufbereitung der makromolekularen Komplexe auf dem Träger kann die Fixierung oder Immobilisierung in einer automatisierten Vorrichtung stattfinden. Für die Lagerung in Eis eingebetteter Proben werden routinemäßig Standard-Flüssigstickstoff-Dewargefäße eingesetzt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Analyse, ob ein Individuum an einer Krankheit leidet oder dafür anfällig ist, eine Krankheit zu entwickeln, wobei die Krankheit korreliert mit dem Auftreten oder Fehlen von Proteinkomplexen und/oder Viruskomplexen und/oder bakteriellen Komplexen und/oder Pilz-Komplexen und/oder Prionen-ähnlichen Komplexen, umfassend die Schritte (a) Feststellung des Auftretens und gegebenenfalls der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe durch (aa) Aufreinigung oder Trennung der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe aus einer Probe, die mutmaßlich die Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe enthält, durch die Anwendung einer Trennkraft in einer porösen Matrix in eine erste Dimension (X-Achse); (ab) Transfer der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe, die in Schritt (aa) aufgereinigt oder getrennt wurden, durch Adsorptionskräfte in eine zweite Dimension (Z-Achse) von der porösen Matrix auf einen Träger, wobei der Träger ein Elektronenmikroskopiegitter ist und die Oberfläche der porösen Matrix berührt und parallel zu der Oberfläche der Matrix und parallel zu der Richtung der in Schritt (aa) angewandten Trennkraft ausgerichtet ist; (ac) Immobilisierung der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe auf dem Träger nach dem Transfer in Schritt 2(ab); und (b) Korrelierung des Auftretens oder Fehlens oder der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe auf dem Träger mit dem Leiden des Individuums an einer Krankheit oder der Anfälligkeit, eine Krankheit zu entwickeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Individuum ein Mensch.
Die vorstehend genannten vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind von besonderem Interesse. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf die Analyse von Krankheiten angewendet werden, die mit dem Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Proteinkomplexen und/oder Viruskomplexen und/oder bakteriellen Komplexen und/oder Pilz-Komplexen und/oder Prionen-ähnlichen Komplexen korrelieren. Es ist daher möglich, einen breiten Bereich an Krankheiten nachzuweisen und zu analysieren, wie Krankheiten, die mit der Funktionsstörung der Proteinqualitätskontrolle (Proteasome oder Chaperone) zusammenhängen oder neurodegenerative Erkrankungen, die durch das Vorkommen von Proteinaggregaten gekennzeichnet sind. Die Protein-, Virus-, bakteriellen, Pilz- und/oder Prion-Komplexe können aus jeder menschlichen Körperflüssigkeit, Blut, Urin, Stuhl und Speichel isoliert werden. Auf diese Weise kann die Erfindung auch zum Screenen von Arzneimitteln in pharmakologischen Studien eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, weiterhin umfassend nach Schritt 1(a) oder Schritt 2(aa) und vor Schritt 1(b) oder Schritt 2(ab) einen Schritt (a'), wobei eine zweite Trennkraft in einer dritten Dimension (Y-Achse) auf die makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle, die in Schritt 1(a) gereinigt oder abgetrennt wurden, oder die Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe, die in Schritt 2(aa) gereinigt oder abgetrennt wurden, angewandt wird.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beschreibt der Vektor der zweiten Trennkraft in der dritten Dimension einen Winkel zu dem Vektor der Trennkraft von Schritt 1(a) oder Schritt 2(aa) im Bereich von 1 bis 180 Grad.
Der Begriff „Vektor" beschreibt im Zusammenhang mit dieser Erfindung die Orientierung der eingesetzten Trennkraft.
Es ist bevorzugt, dass der Vektor einen Winkel von 90 Grad beschreibt. Durch Einsatz einer zweiten Trennkraft ist es möglich, das Gemisch an Proteinen und/oder makromolekularen Komplexen abhängig von ihrer Größe und Struktur weiter aufzutrennen. Es ist daher möglich, eine fein abgestimmte Trennung der komplexen makromolekularen Mischungen durchzuführen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trennkraft durch ein elektrisches Feld oder durch Schwerkraft erzeugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach Schritt 1(a) oder Schritt 2(aa) und vor Schritt 1(b) oder Schritt 2(ab) die poröse Matrix gefärbt und/oder gescannt.
Um die interessierenden makromolekularen Komplexe zu identifizieren, kann man die poröse Matrix, insbesondere das Gel, vor dem Transfer auf den Träger färben. Das Färbeverfahren wird nach aus dem Stand der Technik bekannten Standardverfahren durchgeführt, wie Färbung mit Ethidiumbromid oder Silberfärbung (Wray W. et al. (1981); Merril, C. et al. (1981); Williams, L. R. (2001)).
In einer anderen Ausführungsform kann die poröse Matrix auch ohne Färbeverfahren gescannt werden, wobei die innewohnenden physikalischen Fluoreszenzeigenschaften der Proteinprobe genutzt werden.
Üblicherweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, wie in 1 dargestellt und in den Beispielen 1.2 und 1.3 beschrieben, dass das Färbeverfahren in den Teilen des Gels ausgeführt wird, die an die interessierenden Bereiche des Gels angrenzen, welche die Banden mit den makromolekularen Komplexen enthalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Oberfläche der porösen Matrix aufgeraut.
Diese vorteilhafte erfindungsgemäße Ausführungsform, auch in Beispiel 1.4 dargestellt, ermöglicht einen wirksameren Transfer der interessierenden Makromoleküle auf den Träger. Unter diesem Gesichtspunkt wird die poröse Matrix, insbesondere das Gel, an den interessierenden Banden mit Pinzetten gelöchert, um die Oberfläche des Gels zu vergrößern. Somit werden tiefere Lagen des Gels mit einer hohen Konzentration an Makromolekülen an der Oberfläche der porösen Matrix exponiert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Träger, der die Oberfläche der porösen Matrix berührt, von einem Puffermedium umgeben.
Wie in Beispiel 1.6 dargelegt ist es möglich, einen Tropfen Laufpuffermedium auf den Träger zu tropfen, nachdem der Träger auf der porösen Matrix positioniert worden ist. Diese erfindungsgemäße Ausführungsform ist besonders nützlich, um eine diffusionsgetriebene Bewegung der Makromoleküle auf die Trägeroberfläche zu ermöglichen. Dies ist besonders wichtig, wenn die Feuchtigkeit in der die poröse Matrix umgebenden Kammer oder in der porösen Matrix selbst nicht erlaubt, dass sich eine Flüssigkeitsschicht zwischen dem Träger und der Oberfläche der porösen Matrix bildet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Transfer in Schritt 1(b) oder Schritt 2(ab) durch die Anwendung eines elektrischen Feldes durchgeführt, wobei der Vektor des elektrischen Feldes in die zweite Dimension (Z-Achse) ausgerichtet ist.
Die Z-Achse ist vorzugsweise senkrecht zum Vektor der Trennkraft (X-Achse) und zur Oberfläche des Trägers oder Gels ausgerichtet.
Der Transfer der interessierenden Makromoleküle auf den Träger kann beschleunigt und der Ertrag der transferierten Probe kann erhöht werden, indem zusätzlich ein elektrisches Feld angelegt wird. Das Gel wird daher an ein leitendes Material, d. h. eine Metallplatte angelegt und mit der Anode eines elektrischen Kreises verbunden. Der Träger wird mit der Kathode des Kreises verbunden. Auf diese Weise wird ein elektrisches Feld ausgebildet, das in einer elektrischen Kraft resultiert, die die makromolekularen Komplexe zum Träger hin anzieht, wo sie adsorbiert werden. Im Gegensatz zum Konzept der Elektroelution wird der Träger als eine Elektrode eingesetzt sowie gleichzeitig als eine Ablagerungsoberfläche für die Probe.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die poröse Matrix ein Gel oder eine Nanoverbundstruktur.
Der Begriff „Nanoverbundstruktur" bedeutet erfindungsgemäß ein physikalisches Material, das Körnerbestandteile von 1 bis 1000 nm Durchmesser oder Lagen oder Filamente im gleichen Dickebereich aufweist.
Die porösen Matrices, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind beispielsweise keramische Materialien, Metalle (z. B. Aluminium), Plastik oder Zellulose.
In einer stärker bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Gel ein Polyacrylamidgel oder ein Agarosegel.
Im erfindungsgemäßen Verfahren ist bevorzugt, dass ein Polyacrylamidgel eingesetzt wird, das einen Standard in der elektrophoretischen Auftrennung darstellt und Trennmöglichkeiten für einen weiten Bereich an Proben bereitstellt.
In einer weiteren stärker bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Gel ein Gradientengel.
In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt der Gradient im Bereich von 0,01% (Gew./Vol.) bis 50% (Gew./Vol.), stärker bevorzugt im Bereich von 0,5% (Gew./Vol.) bis 40% (Gew./Vol.) und noch stärker bevorzugt in Bereich von 1% (Gew./Vol.) bis 8% (Gew./Vol.).
In einer stärker bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Elektronenmikroskopiegitter bedeckt ist mit einer elektronendurchlässigen Schicht oder einer Folie mit Löchern.
Der Begriff „elektronendurchlässige Schicht" bezeichnet erfindungsgemäß einen dünnen Film (üblicherweise 3–30 nm), der als Substratoberfläche für die Probe dient und gleichzeitig transparent für den Elektronenstrahl ist. Um Ladungseffekte zu vermeiden, ist der Film leitend.
Die erfindungsgemäß eingesetzte elektronendurchlässige Schicht ist vorzugsweise eine Kohlenstofffolie. Die löchrige Folie ist vorzugsweise eine löchrige Kohlenstofffolie.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die makromolekularen Komplexe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinkomplexen, Viruspartikeln, Eubakterien, Archaebakterien, organischen und anorganischen chemischen Verbindungen.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Proteinkomplexe natürliche Proteinkomplexe.
Jeder einzelne Schritt, d. h. insbesondere die Auftrennung, der Transfer und die Immobilisierung der makromolekularen Komplexe kann unter nicht-denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden. Die native Struktur der Komplexe wird daher beibehalten.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Immobilisierung in Schritt 1(c) oder Schritt 2(ac) eine Kryofixierung. Kryofixierung ist besonders vorteilhaft, da die makromolekularen Strukturen besser beibehalten werden als beim Negativfärbungsprotokoll (Dubochet, J. et al., (1982)).
In einer anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Immobilisierung in Schritt 1(c) oder Schritt 2(ac) eine negative Färbung mit Salzen schwerer Atome.
Salze schwerer Atome, die erfindungsgemäß einsetzbar sind, schließen Uranylacetat oder Uranylformiat oder Phosphorwolframat oder Ammoniummolybdat ein. Erfindungsgemäß wird jedoch vorzugsweise Uranylacetat eingesetzt, das im Bereich der Elektronenmikroskopie weithin verwendet wird (Harris, J. R. et al. (1991)).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Untersuchung der Struktur der makromolekularen Komplexe und/oder der Makromoleküle in Schritt 1(d) oder die Untersuchung des Auftretens und gegebenenfalls der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe in Schritt 2(a) durch optische Mittel.
Der Begriff „optische Mittel" umfasst erfindungsgemäß alle Mittel und Verfahren, die zur Bildverarbeitung der Makromoleküle eingesetzt werden können. Diese umfassen Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie oder mikroskopische Verfahren mit einer scannenden Sonde wie Rasterkraft-Mikroskopie oder optische Raster- Nahfeldmikroskopie.
Unter einem anderen Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das optische Mittel Elektronenmikroskopie oder Lichtmikroskopie.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Elektronenmikroskopie für die Bildverarbeitung der interessierenden Makromoleküle und makromolekularen Komplexe besonders bevorzugt. Die Auflösung des Elektronenmikroskops im Angström- bis Nanometerbereich ist für die Analyse eines großen Bereiches von makromolekularen Komplexen in drei Dimensionen einsetzbar, insbesondere auch von Proteinkomplexen und/oder Viruskomplexen und/oder bakteriellen Komplexen und/oder Pilz-Komplexen und/oder Prionen-ähnlichen Komplexen, die mit Krankheiten korreliert sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch durch den Einsatz von Lichtmikroskopietechniken für die Bildverarbeitung durchgeführt werden. Mit einem lichtdurchlässigen Träger, z. B. einem Objektträger aus Glas, kann die Probe durch ein Standardlichtmikroskop untersucht werden, wobei Strukturen im Bereich von einigen 100 nm bis hin zu einigen Mikron aufgelöst werden oder unter Verwendung von fortgeschrittenen Instrumenten mit erstklassiger Auflösung („advanced superresolution instruments"), die Strukturen von mehreren 10 nm auflösen. Zusätzlich können Fluoreszenzmarkierungen auf die Probe angewendet werden und das Bild in einem Standard-Fluoreszenzmikroskop verarbeitet werden.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Verfahren ein Verfahren mit hohem Durchsatz.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung oder einen Roboter zum Nachweis und/oder zur Analyse der Struktur von makromolekularen Komplexen und/oder Makromolekülen, wie erfindungsgemäß definiert, oder für die Analyse, ob eine Person an einer Krankheit leidet oder anfällig dafür ist, eine Krankheit zu entwickeln, wie erfindungsgemäß definiert, wobei die Vorrichtung oder der Roboter (a) eine Gelladevorrichtung, (b) einen Geltransporter, (c) einen Netz-/Gitter-Blotting-Roboter mit einem Netz-/Gittergreifgerät, ein Positionierungssystem, einen Gelscanner und gegebenenfalls ein Instrument, um Gele aufzurauen, (d) eine Fixierungsvorrichtung, (e) eine Speichervorrichtung und (f) eine Computersteuereinheit umfasst.
Die in der Beschreibung genannten Dokumente sind hiermit per Referenz inkorporiert.
Die Figuren zeigen:
1 zeigt ein Diagramm einer Möglichkeit, die Erfindung experimentell durchzuführen.
2 veranschaulicht eine mögliche Anordnung des Elektronenmikroskopieträgers auf dem Trenngel, überdeckt mit einem Tropfen Pufferlösung.
3 zeigt ein Foto eines nativen Elektrophoresegels, das in verschiedenen Spuren mit zwei unterschiedlichen Proteinen P1 und P2 beladen wurde. Das Protein P1 wurde auf die linke Hälfte der Gels geladen und das Protein P2 auf die rechte Hälfte. Die Flanken sind mit einem Marker beladen, der ein Molekulargewicht im Bereich von 20 KDa bis 669 KDa umfasst. Die Bereiche A und C sind gefärbt, der Bereich B stellt den nicht gefärbten Bereich des Gels dar. Die nach unten zeigenden Pfeile geben die Laufrichtung des Gels in den verschiedenen Spuren an, der von links nach rechts weisende Pfeil zeigt auf die Bande von Protein P1, der von rechts nach links weisende Pfeil auf die Bande von Protein P2. Die schwarzen Kreise sind die erfindungsgemäß auf die Oberfläche des Gels aufgebrachten Gitter zum Blotten der Proteine P1 und P2 im nicht gefärbten Bereich B. Die Positionierung der Gitter ist an den Positionen von P1 bzw. P2 orientiert, die sich angrenzend in den gefärbten Teilen des Gels befinden.
4 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von zwei Beispielen biologischer Makromoleküle (Proteasom und AAA-ATPase VAT), die erfindungsgemäß aufgetrennt und analysiert wurden. 4A zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines negativ gefärbten Proteasoms, 4B zeigt das gleiche Protein unter Kryofixierungsbedingungen, eingebettet in glasartiges Eis unter Verwendung eines Gitters aus einem Kohlenstofffilm mit Löchern als Träger. 4C zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines negativ gefärbten VAT-Komplexes, 4D zeigt das gleiche Protein unter Kryofixierungsbedingungen, eingebettet in glasartiges Eis unter Verwendung eines Gitters aus einem Kohlenstofffilm mit Löchern.
5 erläutert eine mögliche automatisierte Anordnung für das erfindungsgemäße Verfahren, die den Einsatz mehrerer Proben und Gitter ermöglicht.
6 veranschaulicht eine mögliche Vorrichtung für die Identifizierung der Lage des abgetrennten makromolekularen Komplexes im Gel. Das Gitter wird dann erfindungsgemäß mit Hilfe des Computer-kontrollierten xyz-Positionierungssystems auf die identifizierte Position aufgebracht.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Beispiel 1 erläutert eine mögliche Art zur Ausführung der Erfindung. Diese ist auch in 1 dargestellt.
1. Gel-Elektrophoreselauf unter nicht-denaturierenden (nativen) Bedingungen
Eine Elektrophorese der zu analysierenden makromolekularen Komplexe, wie beispielsweise der in 4 dargestellten, wird unter nicht-reduzierenden (nativen) Bedingungen unter Verwendung eines Puffersystems durchgeführt, das die native Proteinkonformation, Interaktion der Untereinheiten und biologische Aktivität beibehält (Maurer, H. (1971); Laemmli, U. K. (1970)). Während der nativen Elektrophorese werden Proteine gemäß ihrem Ladung-zu-Masse-Verhältnis aufgetrennt.
Alle Gel-Elektrophoreseschritte werden mit einer Ausrüstung durchgeführt, die von Invitrogen (Carlsbad, USA) erhältlich ist. Ein Polyacrylamid-Trenngel (NuPAGE Novex^® Tris-Acetat-Gel, Bereich 3–8%, 1 mm dick) läuft in einer Minizelle (X-Cell SureLock) bei einer konstanten Spannung von 150 V für 2,30 Stunden bei 18 mA/Gel (Start) bis 7 mA/Gel (Ende). Als Laufpuffer wird 100 ml nativer 10 × Tris-Glycin-Laufpuffer mit 900 ml deionisiertem Wasser verwendet. In mehreren Spuren wird dieselbe Probe, hier ein makromolekulares Protein, auf das Gel geladen, was die weitere Identifizierung erlaubt (siehe nachfolgenden Schritt 3). Um den Identifizierungsschritt (siehe 3) zu verbessern, wird eine Spur mit einem Marker beladen (HMW Elektrophorese-Kalibrierungskit 17-0445, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA), der vom Hersteller hinsichtlich definierter Masse- /Ladungsverhältnisse gut charakterisiert ist und spezifische Banden auf dem Gel ausbildet.
2. Gelfärbung
Für die Sichtbarmachung der Proteinbanden wird das Gel in zwei Hälften geschnitten. Ein Teil davon wird in einem feuchten Gewebe aufbewahrt und in einem Kühlschrank bei 4°C für die weitere Verwendung gelagert. Der andere Teil wird mit Silber angefärbt, auf der Grundlage der chemischen Reduktion von Silberionen zu metallischem Silber auf einer Proteinbande, wobei der von Invitrogen (Carlsbad, USA) erhältliche SilverXpress^® Silberfärbe-Kit eingesetzt wird.
3. Identifizierung von Punkten (Flecken)
Ein Beispiel für die Identifizierung von Punkten (Flecken) auf dem Gel, die die gereinigten oder abgetrennten molekularen Komplexe enthalten, ist in 3 dargestellt.
Um interessierende Banden zu identifizieren, wird der gefärbte Teil des Gels neben das nicht gefärbte Gel positioniert und sorgfältig an der Spitze bündig ausgerichtet. Durch Extrapolieren der Positionen der gefärbten Banden auf das nicht gefärbte Gel werden die Bereiche von Interesse, bzw. die die Makromoleküle tragenden Banden lokalisiert. Für Vergleichs- und Orientierungszwecke kann mit der Markerspur, die gut definierte Banden mit gut definierten Masse-Ladungsverhältnissen zeigt, zusätzliche Information eingeholt werden.
4. Gelaufrauen
Nach der Identifizierung der Positionen der Banden kann man das Gel mit einer Pinzette an den Stellen, wo sich die interessierenden Banden befinden, löchern, um die Oberfläche an diesen Positionen zu erhöhen. Dadurch wird die oberste Schicht des Gels aufgebrochen und tiefere Gelschichten mit einer hohen Konzentration an Makromolekülen werden an der Oberfläche des Gels exponiert. Die Tiefe des Aufbrechens entspricht der Hälfte der Gitterhöhe, üblicherweise 0,5 mm und die seitliche Länge entspricht dem Durchmesser des Gitters, üblicherweise 3 mm.
5. Platzierung der Träger
Ein Kupfergitter, das mit einem Kohlestofffilm (käuflich erwerbbar von Piano GmbH, Wetzlar, Deutschland) bzw. mit einem löchrigen Kohlenstofffilm (käuflich erwerbbar von Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Deutschland oder von Pacific GridTech, San Diego, USA) bedeckt ist, wird mit einer Pinzette zentral auf spezifische, in Schritt 3 identifizierte Banden gelegt. Das Gitter wird am Rand vorsichtig behandelt, um jede Zerstörung des Kohlenstofffilms zu vermeiden und parallel zur Oberfläche des Gels orientiert wie auch parallel zur Richtung der Trennkraft. 2 zeigt schematisch, wie das Gitter auf dem Gel orientiert ist.
6. Zugabe der Blotting-Flüssigkeit
Nach der Positionierung der Gitter wird ein zusätzlicher Tropfen Pufferflüssigkeit auf das Gitter gegeben, wodurch ein Diffusionsmedium zwischen dem Gel und der Gitteroberfläche bereitgestellt wird. Dementsprechend werden 10 μl Laufpufferlösung mit einer Pipette auf das Gitter aufgetragen. Die Lösung umgibt das Gel und ermöglicht die Bewegung der Makromoleküle zur Kohlenstoffschicht auf der Gitteroberfläche. Dort werden die Proteine adsorbiert. Die Inkubationszeit beträgt etwa 60 Sekunden.
7. Einsammeln der Träger
Danach wird das Gitter vorsichtig mit einer Pinzette entfernt.
8. Immobilisierung durch Negativfärbung und Einbetten in Eis
Die Immobilisierung der makromolekularen Komplexe, wie der in 4 gezeigten, auf dem Träger für die Elektronenmikroskopie wird mit zwei verschiedenen Techniken durchgeführt – Negativfärbung und Kryofixierung (Harris, J. R. et al. (1991); Dubochet, J. et al. (1982)). Für die übliche Negativfärbung wird nach der Adsorption der makromolekularen Komplexe ein Waschschritt mit zwei Tropfen deionisiertem Wasser und nachfolgend eine Kontrasterhöhung mit zwei Tropfen Schwermetall durchgeführt. Durch Anwendung einer zweiten Präparationstechnik – Kryofixierung – wird die Probe schnell eingefroren. Nach Entfernung überschüssiger Flüssigkeit durch Blotten wird eine dünne Lösungsschicht auf dem Gitter für die Elektronenmikroskopie erhalten. Das Gitter wird dann in flüssiges Ethan getaucht. Bei einer Einfrierrate von mehr als 10⁵ K s^–1 wird die wässrige Lösung direkt in eine glasartige Phase überführt, wobei die Phase kristallinen Eises umgangen wird. Somit weist das gefrorene Gitter eine dünne wässrige Schicht auf, in die Makromoleküle in fast natürlich gefrorener hydrierter Umgebung eingebettet sind. Nach dem Gefrierprozess können die Gitter lange Zeit bei Temperaturen flüssigen Stickstoffs aufbewahrt werden. Diese strukturell konservierten gefroren-hydrierten Proben werden dann in einem Elektronenmikroskop bei Temperaturen flüssigen Stickstoffs oder flüssigen Heliums zu Bildern verarbeitet.
Beispiel 2
Beispiel 2 in Verbindung mit den 5 und 6 erläutert eine Möglichkeit, wie das erfindungsgemäße Verfahren in einem von einem Roboter kontrollierten automatisierten Prozess eingesetzt werden kann.
Roboterverfahren
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in automatisierter Weise unter Verwendung eines Apparat eingesetzt werden. Unter Verweis auf 5 ist eine Gelladevorrichtung (1) mit einer Computersteuereinheit (12) verbunden und transportiert auf Gelträgern (8) lokalisierte Gele (2) in Serie zum Gitter-Blotting-Roboter (6). Ein einzelnes, tatsächlich prozessiertes Gel wird auf einen Gelscanner (9) innerhalb des Gitter-Blotting-Roboters (6) platziert. Nachdem das Gel in seine Position bewegt worden ist, wird es mit Hilfe eines Gelscanners (9) abgetastet, der automatisch von der Computersteuerungseinheit (12) gesteuert wird. Dieses Verfahren ist im Detail in 6 dargestellt, wo die Scanvorrichtung (2) mit dem Kontrollcomputer (4) verknüpft ist und ein Bild der elektrophoretischen Matrix (1) liefert. Die interessierenden Banden können dadurch identifiziert und lokalisiert werden, dass man die Koordinaten des Bildes vom Gel auf die Koordinaten des Positionierungssystems (3) bzw. des Positionierungssystems (5) in 5 überträgt. Das Positionierungssystem (5) wird verwendet, um das Werkzeug zum Aufrauen des Gels (4b) über die Position der erfindungsgemäß untersuchten Bande zu bewegen, das wie eine Pinzette ausgebildet ist. Das Gel wird mit Hilfe des Werkzeugs zum Aufrauen des Gels (4b) so aufgeraut, dass tiefere Lagen des Gels exponiert werden. Nachdem das Werkzeug zum Aufrauen des Gels (4b) zurückgezogen worden ist, bewegt das Positionierungssystem (5) das Gittergreifgerät (4) über die Speichereinheit für Gitter (7) und entnimmt ein Gitter. Danach wird das Gitter durch das Positionierungssystem (5) computerkontrolliert in die ausgewählte Position auf dem Gel bzw. zur interessierenden Bande auf dem Gel bewegt und vorsichtig parallel zur Oberfläche des Gels platziert, wie im erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben. In einem nächsten Schritt wird gegebenenfalls ein Tropfen Laufpufferlösung zu dem auf dem Gel befindlichen Gitter gegeben, wobei eine Mikrofluid-Vorrichtung (3) eingesetzt wird, die von dem Positionierungssystem (5) gesteuert wird, das von der Computersteuerungseinheit (12) kontrolliert wird. Nach einer Inkubationszeit von 60 Sekunden wird das Gitter von dem Gittergreifgerät aufgenommen, durch das Positionierungssystem (5) bewegt und auf einen Gitterträger (11) transferiert. Von dort aus wird das Gitter bzw. werden mehrere prozessierte Gitter zu einer Fixierungsvorrichtung (13) übertragen, wo das Gitter durch Negativfärbung oder Kryofixierung der Probe weiter prozessiert wird. In einem nächsten Schritt wird das fixierte Gitter für die kurz- oder langzeitige Lagerung der Probe in eine Lagerungsvorrichtung (14) hinein bewegt.
Referenzen
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Nitrozellulose:

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PVDF (PolyVinyliDendiFluorid):

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Glassfiber/Polybrene

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Vakuum-Dialyse:

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Gel-Elektrophorese:

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Claims

Verfahren zum Nachweis und/oder zur Analyse der Struktur von makromolekularen Komplexen und/oder Makromolekülen, umfassend die Schritte (a) Aufreinigung oder Trennung der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle aus einer Probe, welche die makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle enthält, durch die Anwendung einer Trennkraft in einer porösen Matrix in eine erste Dimension (X-Achse); (b) Transfer der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle, die in Schritt (a) aufgereinigt oder getrennt wurden, durch Adsorptionskräfte von der porösen Matrix auf einen Träger in eine zweite Dimension (Z-Achse), wobei der Träger ein Elektronenmikroskopgitter ist und die Oberfläche der Matrix berührt und parallel zu der Oberfläche der Matrix und parallel zu der Richtung der in Schritt (a) angewandten Trennungskräfte ausgerichtet ist; (c) Immobilisierung der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle auf dem Träger nach dem Transfer von Schritt (b); und (d) Feststellung der Struktur der makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle auf dem Träger nach der Immobilisierung von Schritt (c).
Verfahren zur Analyse, ob eine Testperson an einer Krankheit leidet oder anfällig ist, eine Krankheit zu entwickeln, wobei die Krankheit korreliert mit dem Auftreten oder Fehlen von Proteinkomplexen und/oder Viruskomplexen und/oder bakteriellen Komplexen und/oder Pilz-Komplexen und/oder Prionen-ähnlichen Komplexen, umfassend die Schritte (a) Feststellung des Auftretens und gegebenenfalls der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe durch (aa) Aufreinigung oder Trennung der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe aus einer Probe, die mutmaßlich die Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe enthält, durch die Anwendung einer Trennkraft in einer porösen Matrix in eine erste Dimension (X-Achse); (ab) Transfer der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe, die in Schritt (aa) aufgereinigt und/oder getrennt wurden, durch Adsorptionskräfte von der porösen Matrix auf einen Träger in eine zweite Dimension (Z-Achse), wobei der Träger ein Elektronenmikroskopgitter ist und die Oberfläche der Matrix berührt und parallel zu der Oberfläche der Matrix und parallel zu der Richtung der in Schritt (aa) angewandten Trennungskräfte ausgerichtet ist; (ac) Immobilisierung der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe auf dem Träger nach dem Transfer in Schritt 2(ab); und (b) Korrelierung des Auftretens oder Fehlens oder der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe auf dem Träger mit dem Leiden der Testperson an einer Krankheit oder der Anfälligkeit, eine Krankheit zu entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Testperson ein Mensch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend nach Schritt 1(a) oder Schritt 2(aa) und vor Schritt 1(b) oder Schritt 2(ab) einen Schritt (a'), wobei eine zweite Trennkraft in einer dritten Dimension (Y-Achse) auf die makromolekularen Komplexe und/oder Makromoleküle, die in Schritt 1(a) gereinigt oder abgetrennt wurden, oder die Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe in Schritt 2(aa) angewandt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Vektor der zweiten Trennkraft in der dritten Dimension einen Winkel zu dem Vektor der Trennkraft von Schritt 1(a) oder Schritt 2(aa) im Bereich von 1 bis 180 Grad aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Trennkraft durch ein elektrisches Feld oder Schwerkraft erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei nach Schritt 1(a) oder Schritt 2(aa) und vor Schritt 1(b) oder Schritt 2(ab) die poröse Matrix gefärbt und/oder gescannt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Oberfläche der porösen Matrix aufgeraut wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Träger, der die Oberfläche der porösen Matrix berührt, von einem Puffermedium umgeben ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Transfer in Schritt 1(b) oder Schritt 2(ab) beschleunigt und der Ertrag der transferierten Probe erhöht wird durch die zusätzliche Anwendung eines elektrischen Feldes, wobei der Vektor des elektrischen Feldes in die zweite Dimension (Z-Achse) ausgerichtet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die poröse Matrix ein Gel oder eine Nanoverbundstruktur ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Gel ein Polyacrylamidgel oder ein Agarosegel ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Gel ein Gradientengel ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Gradient im Bereich von 0,01% (Gew./Vol.) bis 50% (Gew./Vol.), vorzugsweise im Bereich von 0,5% (Gew./Vol.) bis 40% (Gew./Vol.), und stärker bevorzugt in Bereich von 1% (Gew./Vol.) bis 8% (Gew./Vol.) liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Elektronenmikroskopgitter bedeckt ist mit einer elektronendurchlässigen Schicht oder einer Folie mit Löchern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 4 bis 15, wobei die makromolekularen Komplexe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinkomplexen, Viruspartikeln, Eubakterien, Archaebakterien, organischen und anorganischen chemischen Verbindungen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Proteinkomplexe natürliche Proteinkomplexe sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Immobilisierung in Schritt 1(c) oder Schritt 2(ac) eine Kryofixierung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Immobilisierung in Schritt 1(c) oder Schritt 2(ac) eine negative Färbung mit Salzen schwerer Atome ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Feststellung der Struktur der makromolekularen Komplexe und/oder der Makromoleküle in Schritt 1(d) oder die Feststellung des Auftretens und gegebenenfalls der Struktur der Proteinkomplexe und/oder Viruskomplexe und/oder bakteriellen Komplexe und/oder Pilz-Komplexe und/oder Prionen-ähnlichen Komplexe in Schritt 2(a) durch Elektronenmikroskopie erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das Verfahren ein Verfahren mit hohem Durchsatz ist.
Vorrichtung oder Roboter zum Nachweis und/oder zur Analyse der Struktur von makromolekularen Komplexen und/oder Makromolekülen gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 und 4 bis 21 oder für die Analyse, ob eine Testperson an einer Krankheit leidet oder anfällig ist, eine Krankheit zu entwickeln gemäß der Definition in einem der Ansprüche 2 bis 15 und 17 bis 21, wobei die Vorrichtung umfasst: (a) eine Gelladevorrichtung (1) (b) einen Geltransporter (c) einen Netzabsetzroboter (6) mit einem Netzgreifgerät (4), ein Positionierungssystem (5), einen Gelscanner (9) und gegebenenfalls ein Instrument, um Gel aufzurauen (4b) (d) eine Befestigungsvorrichtung (13) (e) eine Speichervorrichtung (14); und (f) eine Computersteuereinheit (12).