KR20040089602A

KR20040089602A - 락톤류의 제조방법

Info

Publication number: KR20040089602A
Application number: KR10-2004-7012177A
Authority: KR
Inventors: 마코토 가네코; 야스히로 니노미야; 데츠지 나카무라; 에이지 사토
Original assignee: 미츠비시 레이온 가부시키가이샤
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-03
Publication date: 2004-10-21
Anticipated expiration: 2023-02-03
Also published as: JPWO2003066617A1; EP1473291A4; TWI332953B; US7579485B2; WO2003066617A1; TW200302827A; DE60322836D1; JP4608216B2; CN1273459C; US20050080276A1; KR100951490B1; EP1473291B1; EP1473291A1; CN1436775A

Abstract

하기 화학식 I의 아마이드 화합물을 수성 매체와 반응시키는 것을 포함하는 락톤류의 제조방법:

화학식 I

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

R, R' 및 R₁내지R₆은 각각 독립적으로 수소원자 또는 임의의 치환기를 나타내고,

n은 0 내지 2의 정수를 나타낸다.

Description

락톤류의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING LACTONE}

락톤은 고리내에 에스터기를 갖는 환상 화합물로, 고리 원(員)의 수가 3, 4, 5, 6 및 7인 것을 각각 α-, β-, γ-, δ- 및 ε-락톤이라고 부른다. 락톤류의 합성에는 다양한 제법이 공지되어 있는데, 예컨대 γ-뷰티로락톤류의 합성법으로서, 4-하이드록시뷰티르산류로부터의 산 촉매에 의한 합성법 이외에, 무수 석신산류의 환원, 4-할로겐화 뷰티르산류의 가열 등의 합성법이 알려져 있다.

그러나, 제조하는 γ-뷰티로락톤류의 종류에 따라 다르지만, 많은 경우 부산물 생성, 저수율, 폭발성, 원료가 합성되기 어렵다는 등의 문제가 있어, 신규 합성법이 절실히 요망되고 있다.

3-하이드록시-γ-뷰티로락톤류의 유기 합성적 제조법으로서는, 예컨대 글라이시돌과 일산화탄소를 고온 고압하에서 귀금속 촉매를 촉매로 하여 반응시키는 방법(미국 특허 제 4,968,817 호), 3-뷰텐산을 백금 촉매하에서 과산화수소를 작용시켜 에폭시화한 것을 수화한 후에 락톤화하는 방법(문헌[Angew. chem., Int. Ed. Eng 994-1000(1966)]) 등이 알려져 있지만, 이들 모두 폭발 등의 위험성이 높은 방법이다. 또한, L-아스코브산 또는 D-아이소아스코브산을 출발 원료로서 이용하여 7공정을 거쳐 제조하는 방법(문헌[Synthesis 570-572(1987)]), L-말산으로부터 3공정으로 제조하는 방법(일본 특허 공개 제 1994-172256 호) 등도 알려져 있지만, 다공정 반응을 경유하기 때문에 조작이 번잡해지고, 수율 면에서도 결코 바람직하지 않다.

또한, 3-하이드록시-γ-뷰티로락톤류의 생물학적 제조방법으로서는 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균 또는 엔테로박터(Enterobacter)속 세균을 미생물 촉매로 하여 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산 에틸로부터 (S)-3-하이드록시-γ-뷰티로락톤을 제조하는 방법(문헌[Tetrahedr. Asym. 11. 3109-3112(1996) 등])이 알려져 있다. 그러나, 어떤 방법도 효소의 안정성을 만족시킬 수 없었다. 또한, 기질의 조제가 번잡하여 공업적으로 유리한 방법이라고는 할 수 없다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 용이하게 합성할 수 있는 아마이드류를 원료로 하여, 온화한 조건하에서, 보다 공정이 적으면서도 부산물이 적은, 공업적으로 유리한 락톤, 특히 γ-뷰티로락톤류 또는 δ-발레로락톤류를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 놀랍게도, 4-할로-뷰틸아마이드류를 물과 반응시키면 할로겐과 암모니아가 빠르게 이탈되어 대응하는 γ-뷰티로락톤류가 고수율로 생성된다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 하기 화학식 I의 아마이드 화합물을 수성 매체와 반응시키는 것을 포함하는 락톤류의 제조방법이다:

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

n은 0 내지 2의 정수를 나타낸다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 II의 4-할로-뷰틸아마이드를 수성 매체와 반응시켜 하기 화학식 III의 γ-뷰티로락톤류를 생성시키는 것을 포함하는 γ-뷰티로락톤류의 제조방법이다:

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

R₁내지R₆은 각각 독립적으로 수소원자 또는 임의의 치환기를 나타낸다.

상기 방법에 있어서, 화학식 II의 4-할로-뷰틸아마이드로서는 예컨대 4-할로-3-하이드록시뷰틸아마이드를 들 수 있다. 또한, 화학식 II의 화합물로서는 하기 화학식 IV의 4-할로-뷰티로나이트릴을 나이트릴 하이드라타제로 처리하여 수득되는 것을 들 수 있다. 「나이트릴 하이드라타제로 처리」한다는 것은 나이트릴 하이드라타제의 촉매 작용에 의해 수화하는 것을 의미한다:

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

여기서, 나이트릴 하이드라타제로서는 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 카세오박터(Caseobacter)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속 및 로도코커스(Rhodococcus)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 속에 속하는 1종 이상의 미생물, 또는 상기 군으로부터 선택된 하나의 속에 속하는 1종 이상의 미생물과 상기 군으로부터 선택된 다른 속에 속하는 1종 이상의 미생물의 혼합 미생물에 의해 생산되는 것을 들 수 있다. 또한, 나이트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환체에 의해 나이트릴 하이드라타제를 생산할 수도 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 V의 5-할로-펜틸아마이드를 수성 매체와 반응시켜 하기 화학식 VI의 δ-발레로락톤류를 생성시키는 것을 포함하는 δ-발레로락톤류의 제조방법이다:

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

R₁내지 R₈은 각각 독립적으로 수소원자 또는 임의의 치환기를 나타낸다.

상기 방법에서, 반응 온도는 예컨대 30 내지 100℃이며, 반응시의 pH는 예컨대 pH 1.0 내지 6.0이다.

본 발명은 락톤류의 제조방법에 관한 것이다. 락톤류는 의약품, 농약 등과 같은 다양한 화합물의 합성 원료 또는 용제로서 유용하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 I의 아마이드 화합물을 수성 매체와 반응시킴으로써 할로겐 원자와 암모니아의 이탈 반응을 일으켜 목적하는 락톤류를 수득한다는 것이다. 본 발명에 의해, 공정이 적으면서도 고수율인 락톤류의 제조방법을 제공할 수 있다. 특히, 4-할로-뷰틸아마이드류로부터 γ-뷰티로락톤류를 제조할 수 있다는 것은 전혀 예상할 수 없었던 것이다.

여기서, 화학식 I에 있어서, n은 0 내지 2의 정수를 나타내고, X는 할로겐 원자를 나타낸다. 할로겐 원자는 불소원자, 염소원자, 브롬원자 또는 요오드원자를 의미하지만, 염소원자가 바람직하다. n이 0인 경우, 원료가 되는 아마이드 화합물은 하기 화학식 II의 4-할로-뷰틸아마이드이며, 생성되는 락톤류는 하기 화학식 III의 γ-뷰티로락톤류이다:

화학식 II

화학식 III

n이 1인 경우, 원료가 되는 아마이드 화합물은 하기 화학식 V의 5-할로-펜틸아마이드이며, 생성되는 락톤류는 하기 화학식 VI의 δ-발레로락톤류이다:

화학식 V

화학식 VI

그리고, n이 2인 경우, 원료가 되는 아마이드 화합물은 6-할로-헥실아마이드이며, 생성되는 락톤류는 ε-카프로락톤류이다.

화학식 I 내지 VI에 있어서, R₁내지 R₈과 R 및 R'(화학식 I에 있어서 n이 1인 경우, R 및 R'는 각각 R₇및 R₈에 대응한다)는 각각 서로 독립적으로 동일 또는 상이하고, 수소원자 또는 임의의 치환기를 말한다. 여기서 말하는 「임의의 치환기」란 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 20(C₁내지 C₂₀)의 탄화수소기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 20(C₁내지 C₂₀)의 알콕시기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 6 내지 20(C₆내지 C₂₀)의 아릴옥시기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 7 내지 20(C₇내지 C₂₀)의 알킬아릴옥시기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 2 내지 20(C₂내지 C₂₀)의 알콕시카보닐기, 치환기를 가질 수 있는 아미노기, 치환기를 가질 수 있는 실릴기 또는 하이드록실기이다. 또한, 치환기를 가질 수 있는 알킬티오기, 치환기를 가질 수 있는 아릴티오기, 치환기를 가질 수 있는 알킬설포닐기 또는 치환기를 가질 수 있는 아릴설포닐기일 수도 있다.

탄화수소기는 포화 또는 불포화의 비환식일 수도 있고 포화 또는 불포화의 환식일 수도 있다. 탄화수소기가 비환식인 경우에는 직쇄상일 수도 있고 분지쇄상일 수도 있다. 탄화수소기에는 C₁내지 C₂₀알킬기, C₂내지 C₂₀알케닐기, C₂내지 C₂₀알키닐기, C₄내지 C₂₀알킬다이엔일기, C₆내지 C₁₈아릴기, C₆내지 C₂₀알킬아릴기, C₆내지 C₂₀아릴알킬기, C₄내지 C₂₀사이클로알킬기, C₄내지 C₂₀사이클로알케닐기, (C₃내지 C₁₀사이클로알킬) C₁내지 C₁₀알킬기 등이 포함된다.

C₁내지 C₂₀알킬기는 C₁내지 C₁₀알킬기인 것이 바람직하다. 알킬기로서는 예컨대 메틸기, 에틸기, 프로필기, 아이소프로필기, n-뷰틸기, s-뷰틸기, t-뷰틸기, 펜틸기, 헥실기, 옥틸기, 노닐기, 데실기, 운데실기, 도데실기 등을 들 수 있다.

C₂내지 C₂₀알케닐기는 C₂내지 C₁₀알케닐기인 것이 바람직하다. 알케닐기로서는 예컨대 비닐기, 알릴기, 프로펜일기, 아이소프로펜일기, 2-메틸-1-프로펜일기, 2-메틸알릴기, 2-뷰텐일기 등을 들 수 있다.

C₂내지 C₂₀알키닐기는 C₂내지 C₁₀알키닐기인 것이 바람직하다. 알키닐기로서는 예컨대 에틴일기, 프로핀일기, 뷰틴일기 등을 들 수 있다.

C₄내지 C₂₀알킬다이엔일기는 C₄내지 C₁₀알킬다이엔일기인 것이 바람직하다. 알킬다이엔일기로서는 예컨대 1,3-뷰타다이엔일기 등을 들 수 있다.

C₆내지 C₁₈아릴기는 C₆내지 C₁₀아릴기인 것이 바람직하다. 아릴기로서는 예컨대 페닐기, 1-나프틸기, 2-나프틸기, 인덴일기, 바이페닐기, 안트릴기, 페난트릴기 등을 들 수 있다.

C₆내지 C₂₀알킬아릴기는 C₆내지 C₁₂알킬아릴기인 것이 바람직하다. 알킬아릴기로서는 예컨대 o-톨릴기, m-톨릴기, p-톨릴기, 2,3-자일릴기, 2,4-자일릴기,2,5-자일릴기, o-큐멘일기, m-큐멘일기, p-큐멘일기, 메시틸기 등을 들 수 있다.

C₆내지 C₂₀아릴알킬기는 C₆내지 C₁₂아릴알킬기인 것이 바람직하다. 아릴알킬기로서는 예컨대 벤질기, 펜에틸기, 1-나프틸메틸기, 2-나프틸메틸기, 1-페닐에틸기, 페닐프로필기, 페닐뷰틸기, 페닐펜틸기, 페닐헥실기, 메틸벤질기, 다이메틸벤질기, 트라이메틸벤질기, 에틸벤질기, 메틸펜에틸기, 다이메틸펜에틸기, 다이에틸벤질기 등을 들 수 있다.

C₄내지 C₂₀사이클로알킬기는 C₄내지 C₁₀사이클로알킬기인 것이 바람직하다. 사이클로알킬기로서는 예컨대 사이클로프로필기, 사이클로뷰틸기, 사이클로펜틸기, 사이클로헥실기, 사이클로헵틸기, 사이클로옥틸기 등을 들 수 있다.

C₄내지 C₂₀사이클로알케닐기는 C₄내지 C₁₀사이클로알케닐기인 것이 바람직하다. 사이클로알케닐기로서는 예컨대 사이클로프로펜일기, 사이클로뷰텐일기, 사이클로펜텐일기, 사이클로펜타다이엔일기, 사이클로헥센일기 등을 들 수 있다.

C₁내지 C₂₀알콕시기는 C₁내지 C₁₀알콕시기인 것이 바람직하다. 알콕시기로서는 예컨대 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 부톡시기, 헵틸옥시기 등을 들 수 있다.

C₆내지 C₂₀아릴옥시기는 C₆내지 C₁₀아릴옥시기인 것이 바람직하다. 아릴옥시기로서는 예컨대 페닐옥시기, 나프틸옥시기, 바이페닐옥시기 등을 들 수 있다.

C₇내지 C₂₀알킬아릴옥시기는 C₇내지 C₁₂알킬아릴옥시기인 것이 바람직하다. 알킬아릴옥시기로서는 예컨대 메틸페닐옥시기, 에틸페닐옥시기, 프로필페닐옥시기, 뷰틸페닐옥시기, 다이메틸페닐옥시기, 다이에틸페닐옥시기, 다이프로필페닐옥시기, 다이뷰틸페닐옥시기, 메틸에틸페닐옥시기, 메틸프로필페닐옥시기, 에틸프로필페닐옥시기 등을 들 수 있다.

C₂내지 C₂₀알콕시카보닐기는 C₂내지 C₁₀알콕시카보닐기인 것이 바람직하다. 알콕시카보닐기로서는 예컨대 메톡시카보닐기, 에톡시카보닐기, 2-메톡시에톡시카보닐기, t-뷰톡시카보닐기 등을 들 수 있다.

치환기를 가질 수 있는 아미노기로서는 예컨대 아미노기, 다이메틸아미노기, 메틸아미노기, 메틸페닐아미노기, 페닐아미노기 등을 들 수 있다.

치환기를 가질 수 있는 실릴기로서는 예컨대 다이메틸실릴기, 다이에틸실릴기, 트라이메틸실릴기, 트라이에틸실릴기, 트라이메톡시실릴기, 트라이에톡시실릴기, 다이페닐메틸실릴기, 트라이페닐실릴기, 트라이페녹시실릴기, 다이메틸메톡시실릴기, 다이메틸페녹시실릴기, 메틸메톡시페닐기 등을 들 수 있다.

본 발명에서는, 용매로서, 다른 유기 용매에 비해 매우 저렴하고도 안전하게 취급할 수 있는 수성 매체를 사용하는데 특징을 갖는다. 수성 매체로서는 수돗물, 증류수 등 이외에, 인산 완충액, 트리스-HCl 완충액, 아세트산 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다.

본 발명의 반응시에 사용하는 아마이드류(예컨대 4-할로-뷰틸아마이드류) 및 수성 매체는 임의의 비율로 혼합할 수 있고, 수성 매체의 사용량에 특별히 제한은없다. 통상, 화학식 I의 화합물에 대하여 1 내지 1000중량배의 범위인 것이 바람직하고, 2 내지 100중량배의 범위인 것이 보다 바람직하다. 이들 반응 용액의 조제는 수성 매체와 아마이드류를 한번에 혼합할 수도 있고, 또는 소정량의 수성 매체 중에 아마이드류를 분할 첨가하여 혼합할 수도 있다.

또한 반응액 중에는, pH 조정을 용이하게 하는 등의 목적으로 적당한 완충액을 존재시키거나, 4-할로-뷰틸아마이드류의 용해도를 높이는 등의 목적으로 적당한 유기 용제를 존재시키는 것도 가능하다.

반응 온도는 원료의 안정성 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있는데, 예컨대 30 내지 100℃이고, 바람직하게는 50 내지 70℃이며, 더욱 바람직하게는 70℃이다.

반응을 실시하기 위한 반응 pH는 예컨대 pH 1.0 내지 6.0이고, 바람직하게는 1.2 내지 5이며, 더욱 바람직하게는 3.5이다. 또한, 반응 중에 pH가 저하된 경우에는 적당한 알칼리, 예컨대 NaOH, KOH, 암모니아 등에 의해 조정하는 것이 효과적이다. 예컨대, 4-할로-3-하이드록시뷰틸아마이드로부터 3-하이드록시-γ-뷰티로락톤을 생성하는 반응에 있어서, 알칼리에 의해 pH 1.2 내지 5로 조정함으로써 pH를 조정하지 않는 경우보다 고수율로 3-하이드록시-γ-뷰티로락톤을 수득할 수 있다.

반응액 중에 생성 축적된 락톤류는 공지의 방법을 이용하여 채취 및 정제할 수 있다. 예컨대, γ-뷰티로락톤류를 제조하는 경우에, 목적하는 γ-뷰티로락톤류가 비수용성일 때는 상 분리에 의해, 수용성일 때는 물을 증류 제거하든지 또는 적당한 용매로 추출함으로써 수득할 수 있다.

추출 용매로서는 피롤리돈류, 메틸 에틸 케톤, 메틸 아이소뷰틸 케톤, 사이클로헥산온, 아세트산에틸, n-뷰탄올, 아이소뷰탄올, 헥세인, 톨루엔 등을 들 수 있고, 이들 용매를 적절히 선택한다. 또한, 반응액에 할로겐화암모늄이 생성되기 때문에, 필요에 따라 적당한 염류를 추가함으로써 할로겐화암모늄을 상 분리시킬 수 있다. 이에 의해, 아세토나이트릴 또는 t-뷰탄올과 같은 수용성 용매를 이용한 경우에도 상 분리가 가능하여, 특히 친수성이 높은 γ-뷰티로락톤류의 제조에 효과적이다. 또한, 증류 등에 의해 더욱 정제할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 아마이드류(예컨대 4-할로-뷰틸아마이드류)는 일반적인 아마이드 합성법, 예컨대 산염화물 또는 산무수물, 또는 이들의 에스터물에 암모니아를 작용시키거나, 고온하에서의 카복실산과 암모니아의 탈수축합, 또는 대응하는 4-할로-뷰티로나이트릴류의 광산 또는 알칼리에 의한 수화에 의해 수득된다.

단, 나이트릴류를 나이트릴 하이드라타제의 작용에 의해 수화하는 방법이 수율 및 순도가 우수하다는 점에서 보다 바람직하다.

이하, 4-할로-뷰틸나이트릴류를 수화하는 경우를 예로 들어 설명한다.

이 때, 사용되는 나이트릴 하이드라타제로서는 하기 화학식 IV의 4-할로-뷰틸나이트릴류를 하기 화학식 II의 4-할로-뷰틸아마이드류로 전환시킬 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다:

화학식 IV

화학식 II

이들 나이트릴 하이드라타제를 포함하는 미생물로서는 예컨대 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 카세오박터(Caseobacter)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속 또는 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 구체적으로는, 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans) IFO 12138, 브레비박테리움 헬보럼(Brevibacterium helvolum) ATCC 11822, 코리네박테리움 플라베센스(Corynebacterium flavescens) IAM 1642, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IFO 12540, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IFO 12539 등을 들 수 있고, 이들 미생물은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC), 재단법인 발효 연구소(IFO) 또는 동경 대학 분자 세포 생물학 연구소(IAM)로부터 용이하게 입수할 수 있다.

또한, 아트로박터 sp. SK103, 카세오박터 sp. BC23, 로도코커스 로도크로우스 J-1(FERM BP-1478: 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁센터(일본 이바라기켄 305-8566 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오 다이 6), 1987년 9월 18일자), 슈도모나스 sp. BC15-2(FERM BP-3320: 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁센터(일본 이바라기켄 305-8566 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오 다이 6), 1991년 3월 18일자), 슈도모나스 sp. SK31, 슈도모나스 sp. SK87, 슈도모나스 sp. SK13(FERM BP-3325: 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물 기탁센터(일본 이바라기켄 305-8566 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 쥬오 다이 6), 1991년 3월 18일자), 로도코커스 sp. SK70, 로도코커스 sp. HR11, 로도코커스 sp. SK49 등을 예시할 수도 있다. 이들 미생물은 일본 제 3014171 호 특허 공보에 기재되어 있고, 당업자는 상기 공보를 참조하여 용이하게 취득할 수 있다. 또한, 이들 미생물 중 로도코커스 로도크로우스 J-1(FERM BP-1478), 슈도모나스 sp. BC15-2(FERM BP-3320) 및 슈도모나스 sp. SK13(FERM BP-3325)은 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다. 기탁 정보 일람은 이하와 같다.

본 발명에 있어서는 상기 임의의 속에 속하는 미생물을 단독으로 또는 복수종 조합시켜 사용할 수 있다 또한, 하나의 속에 속하는 1종 또는 복수 종의 미생물과 다른 속에 속하는 1종 또는 복수 종의 미생물을 조합시켜 혼합 미생물로서 사용할 수도 있다.

또한, 상기 미생물로부터 나이트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자를 채취하여 적당한 숙주 벡터계에서 발현시킨 미생물을 사용할 수도 있다.

예컨대, 상기 미생물로부터 염색체 DNA를 조제하여, 적당한 플라스미드 벡터를 이용하여 염색체 DNA 라이브러리를 제작한다. 나이트릴 하이드라타제 유전자의 클로닝은 예컨대 콜로니 하이브리다이제이션 등에 의해 실시할 수 있다. 나이트릴 하이드라타제의 부분 아미노산 서열(예컨대 N 말단 서열)로부터 설계된 PCR용 프라이머를 이용하고 염색체 DNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR을 실시함으로써 목적하는 DNA 단편을 수득할 수 있다. 또한, 나이트릴 하이드라타제를 암호화하는 DNA의 염기 서열은 시판의 염기 서열 결정 장치를 이용하여 결정된다.

수득된 나이트릴 하이드라타제 유전자를 이용하여 나이트릴 하이드라타제를 생산하기 위해서는, 우선 상기 유전자를 적당한 발현 벡터에 연결하여 플라스미드를 제작하고, 이것을 예컨대 적당한 숙주에 도입하여 형질전환체를 수득한다.

나이트릴 하이드라타제 유전자의 클로닝 및 유전자 재조합 기술은 당 분야에서 주지되어 있다(예컨대 일본 제 2840253 호 특허 공보 및 제 2907479 호 특허 공보를 참조).

다음으로, 이 형질전환체를 배양함으로써 나이트릴 하이드라타제가 숙주 세포내에 대량 생산된다. 이 효소는 균체 그대로 전환 반응에 사용할 수도 있지만,균체를 파쇄하여 무세포 추출액으로서, 또는 정제 효소로서 사용한다.

상기 미생물을 배양하기 위한 배지로서는 통상 이들 미생물이 생육할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대, 탄소원으로서 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스 등의 당류, 아세트산, 시트르산 등의 유기산류, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류 등을 사용할 수 있고, 질소원으로서 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 일반 천연 질소원 이외에 각종 무기 및 유기산 암모늄염 등을 사용할 수 있고, 그 밖에 무기염, 미량 금속류, 바이타민 등이 필요에 따라 적절히 사용된다.

이 때, 보다 높은 나이트릴 하이드라타제 활성을 유도시키기 위해, n-프로피오나이트릴, n-뷰티로나이트릴, 아이소뷰티로나이트릴, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 벤질 시아나이드 등의 각종 나이트릴 화합물, n-프로피온아마이드, n-뷰틸아마이드, 아이소뷰틸아마이드 등의 각종 아마이드 화합물, γ-뷰티로락탐, δ-발레로락탐, ε-카프로락탐 등의 락탐 화합물 등을 배지에 첨가하는 것도 유효한 경우가 있다.

상기 미생물은 상법에 의해 배양할 수 있는데, 예컨대 pH 4 내지 10 및 온도 10 내지 40℃의 범위에서 호기적으로 10 내지 180시간 동안 배양한다. 배양은 액체 배양 및 고체 배양 중 어떤 것으로도 실시할 수 있다.

상기 반응에 있어서, 나이트릴 하이드라타제는 조효소, 정제 효소, 또는 배양하여 수득한 미생물의 배양액, 여과 또는 원심 분리 등에 의해 수득한 균체, 균체 파쇄물, 균체 추출물 등의 형태로 사용된다. 또한 상기 형태물을, 아크릴아마이드, 카라기난, 아가로스 등의 적당한 담체에 고정화시키거나, 또는 이온 교환 수지 등에 흡착시킬 수도 있다. 상기 사용 형태는 반응 양식에 따라 적절히 선택된다. 반응 양식에는 반응 기질을 첨가하여 미생물 배양과 동시에 반응을 실시하는 방법, 이들 나이트릴 하이드라타제를 필요에 따라 적당한 수성 매체에 현탁하여 기질에 첨가하는 방법, 이들 나이트릴 하이드라타제를 현탁한 수성 매체에 기질을 첨가하는 방법 등이 있다.

나이트릴 하이드라타제 반응에 사용하는 수성 매체는 물 이외에, 물에 유기산, 인산, 붕산, 아민류 등의 염으로 이루어진 완충액, 기타 염류, 유기 용매 등을 필요에 따라 첨가하여 조제한 것을 들 수 있다. 반응 온도 및 반응 pH는 특별히 한정되지 않지만, 각각 0 내지 50℃ 및 pH 3 내지 10의 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.

또한, 나이트릴 하이드라타제에 의해 4-할로-뷰티로나이트릴류로부터 4-할로-뷰틸아마이드류를 수득하는 반응과 동시에 및/또는 반응 후에 4-할로-뷰틸아마이드류를 γ-뷰티로락톤류로 전환시킬 수도 있다.

이 경우, 고수율로 γ-뷰티로락톤류를 수득하기 위해서는 0 내지 50℃에서 나이트릴 하이드라타제가 촉매하는 반응을 실시하고, 4-할로-뷰티로나이트릴류가 가능한 한 소비된 후, 온도를 30 내지 100℃로 설정하여 7-뷰티로락톤류로의 전환 반응을 실시하는 것이 바람직하다.

4-할로-뷰티로나이트릴류로부터 4-할로-뷰틸아마이드류를 수득하는 반응 및 4-할로-뷰틸아마이드류로부터 γ-뷰티로락톤을 수득하는 반응은 어느 것이나 통상발열 반응이기 때문에, 반응조는 재킷, 내부 코일, 열 교환기 등으로 필요에 따라 냉각시킨다.

또한, 이들 반응, 회수, 정제 등의 조작은 회분식 및 연속식 중 어떤 것도 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예로 한정되지는 않는다.

실시예 1

34.5질량%의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 수용액 100ml를 70℃의 수욕 중에서 3시간 동안 반응시켰다.

반응액 중의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 확인은, 반응액으로부터 아세트산에틸로 추출을 실시하고, 용매를 감압하에 증발 제거한 후, 잔사를 IR,¹H-NMR 및¹³C-NMR로 분석하였다. 각 화합물의 정량은 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 하기 조건에서 실시하였다.

<고속 액체 크로마토그래피 분석 조건>

컬럼: 이너트실(Inertsil) ODS-3V(4.6mm ID× 25mm) GL 사이언스사(GL Science, Inc.) 제품

이동 상: 0.1% 인산 수용액

유속: 1ml/분

컬럼 온도: 40℃

검출: 시차 굴절 검출기(일본 분광사(Japan Spectroscopic Co., Ltd.) 제품)

그 결과, 잔존하고 있는 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드는 초기량의 1% 이하, β-하이드록시-γ-뷰티로락톤 수율은 65.2%, 반응 종료액의 pH는 0.9였다. 또한, 반응 중 또는 반응 후에 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산은 검출되지 않았다.

실시예 2

20mM의 인산 완충액을 함유하는 34.5질량%의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 수용액 100ml를 70℃의 수욕 중에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24질량% NaOH로 조정하여 pH를 1.2, 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 또는 5.5로 유지하고, pH를 조절하지 않은 것과 비교하였다.

실시예 1과 동일하게 반응액 중의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 정량을 실시한 결과, 잔존하고 있는 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드는 어느 것이나 초기량의 1% 이하이며, β-하이드록시-γ-뷰티로락톤 수율은 표 1과 같았다. 또한, pH 조절을 하지 않은 것의 종료시의 pH는 1.0이었다.

또한, 어느 것이나 반응 중 또는 반응 후에 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산은 검출되지 않았다.

실시예 3

20mM의 인산 완충액을 함유하는 34.5질량%의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 수용액 100ml를 30, 50, 70 또는 100℃의 수욕 중에서, 잔존하고 있는 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드가 초기량의 1몰% 이하가 될 때까지 반응시켰다. 그 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24질량% NaOH로 조정하여 pH를 3.5로 유지하였다.

실시예 1과 동일하게 반응액 중의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 정량을 실시한 결과, 수율은 표 2에 나타낸 바와 같았다. 또한, 어느 것이나 반응 중 또는 반응 후에 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산은 검출되지 않았다.

실시예 4

20mM의 인산 완충액을 함유하는 11.5, 23 또는 34.5질량%의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 수용액 100ml를 70℃의 수욕 중에서, 잔존하고 있는 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드가 초기량의 1몰% 이하가 될 때까지 반응시켰다. 그 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24% NaOH로 조정하여 pH를 3.5로 유지하였다.

실시예 1과 동일하게 반응액 중의 β-하이드록시-7-뷰티로락톤의 정량을 실시한 결과, 수율은 표 3에 나타낸 바와 같았다. 또한, 어느 것이나 반응 중 또는 반응 후에 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산은 검출되지 않았다.

실시예 5

20mM의 인산 완충액을 함유하는 23질량%의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 수용액 100ml를 70℃의 수욕 중에서, 잔존하고 있는 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드가 초기량의 1몰% 이하가 될 때까지 반응시켰다. 그 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24% NaOH로 조정하여 pH를 3.5로 유지하였다.

반응 종료액 50ml에 50ml의 메틸 에틸 케톤을 첨가하여 격렬하게 교반한 후, 상 분리시켜 유기층을 채취하였다. 이 조작을 3회 반복하고, 취득한 약 170ml의 유기층을, 회전 증발기를 사용하여, 수욕 온도 60℃ 및 10torr에서 휘발 성분을 증발 제거함으로써 맑은 액을 수득하였다.

실시예 1과 동일하게 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 정량을 실시한 결과, β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 농도는 94.5%, 칼 피셔(Karl Fisher)법에 의한 수분 측정 결과는 0.2%였다.

또한, 상기 액에 200ml의 메틸 에틸 케톤을 첨가한 결과, 염화암모늄을 주성분으로 하는 백탁이 발생하였기 때문에, 1㎛의 여과지로 가압 여과하고, 상기와 같이 휘발 성분을 증발 제거하여 맑은 액을 수득하였다. β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 농도는 98.1%, 수분은 0.1% 이하였다. 초기 투입 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드로부터의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 총 수율은 64.0%였다.

실시예 6

반응 종료액 50ml에 50ml의 사이클로헥산온을 첨가하고, 회전 증발기를 사용하여 수욕 온도 60℃ 및 60torr에서 물 및 휘발 성분을 증발 제거하였다. 염화암모늄을 주성분으로 하는 백탁이 발생하였기 때문에, 1㎛의 여과지로 가압 여과하고, 회전 증발기를 사용하여 수욕 온도 60℃ 및 10torr에서 나머지의 휘발 성분을 증발 제거하였다.

실시예 1과 동일하게 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 정량을 실시한 결과, β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 농도는 92.3%, 수분은 0.1% 이하였다. 초기 투입 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드로부터의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 총 수율은 90.4%였다.

실시예 7

글루코스 10g/l, K₂HPO₄0.5g/l, KH₂PO₄0.5g/l, MgSO₄·7H₂O 0.5g/l, 효모 추출물 1g/l 및 폴리펩톤 7.5g/l로 이루어진 배지(pH 7.2) 10ml를 시험관에 넣고, 121℃에서 15분 동안 오토클레이브 멸균한 후, 로도코커스 로도크로우스 J-1 균주를 접종하여 28℃에서 48시간 진동 배양하고, 이것을 전 배양액으로 하였다.

상기 조성의 배지에, 요소 15g/l 및 CoCl₂10mg/l를 첨가한 배지(pH 7.2) 100ml를 500ml 삼각 플라스크에 넣고, 121℃에서 15분 동안 오토클레이브 멸균한 후, 전 배양액 4ml를 접종하여 28℃에서 96시간 동안 진동 배양하였다.

상기 방법에 의해 배양하여 수득한 균체를 원심 분리로 집균하고, 배양액과 동량의 50mM 인산 완충액(pH 7.7)을 첨가하여 원심 분리로 집균한 후, 10ml의 동일 완충액에 균체를 현탁하였다.

상기 균체 현탁액 10g, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴 30g 및 20mM 인산 완충액(pH 7.0)을 함유하는 수용액 100g을 조제하여 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 도중, 액 온도가 상승하였기 때문에 적절히 수냉하여 30℃로 유지하였다.

실시예 1과 동일하게 반응액 중의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드의 정량을 실시한 결과, 수율은 99%였다.

상기 용액을 70℃의 수욕 중에서 3시간 동안 반응시켰다. 이 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24질량% NaOH로 조정하여 pH를 3.5로 유지하였다.

실시예 1과 동일하게 반응액 중의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 정량을 실시한 결과, 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴로부터의 수율은 84.3%였다. 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴, 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 및 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산은 검출되지 않았다.

실시예 8

11.5질량%의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 및 10질량%의 물을 함유하는 메틸 에틸 케톤 용액 100ml를 60℃의 수욕 중에서 24시간 동안 반응시켰다.

실시예 1과 동일하게 반응액 중의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 정량을 실시한 결과, 수율은 92%였다. 또한, 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 잔존율은 5%이며, 반응 중 또는 반응 후에 4-클로로-3-하이드록시뷰티르산은 검출되지 않았다.

참고예 1

일본 특허 제 3014171 호 명세서에 기재된 조건에서, 로도코커스 로도크로우스 J-1을 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴로부터 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드를 생성하는 반응에 제공하여, β-하이드록시-γ-뷰티로락톤이 생성되는지 확인하였다.

하기 조성의 배지를 5ml씩 시험관에 분리 주입하여 120℃에서 15분간 살균한 후, 아이소뷰티로나이트릴 및 아이소뷰틸아마이드의 각각 5(w/v)%의 수용액을 멤브레인 필터로 제균하고, 0.1ml씩 첨가하였다. 이 배지에, 로도코커스 로도크로우스 J-1 균주를 접종하여 30℃에서 72시간 동안 진동 배양을 실시하였다. 균체를 원심 분리에 의해 집균하고, 50mM 인산 완충액(pH 7.2) 1.5ml를 첨가하여 세정한 후,88mM의 4-클로로-3-하이드록시뷰티로나이트릴을 함유하는 50mM 인산 완충액 (pH7.2) 1ml를 첨가하고, 20℃에서 24시간 동안 반응시켰다.

실시예 1과 동일하게 반응액 중의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드의 정량을 실시한 결과, 77.6mM였다. β-하이드록시-γ-뷰티로락톤은 검출 한계(1mM) 이하였다.

실시예 9

로도코커스 로도크로우스 J-1 균주를 실시예 7과 동일한 방법에 의해 배양하여 균체 현탁액을 조제하였다.

1g(화학 순도 92%) 및 균체 현탁액 1g을 10mM 인산 완충액(pH 6.6) 18.9ml에 첨가하고, 5 내지 10℃에서 10시간 동안 반응시켰다. 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 하기 조건에서 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드 메타크릴산 에스터의 정량을 실시한 결과, 수율은 99%였다.

<고속 액체 크로마토그래피 분석 조건>

컬럼: 이너트실 ODS-3V(4.6mm ID× 25mm) GL 사이언스사 제품

이동 상: 0.1% 인산-20% 아세토니트릴 수용액

유속: 1ml/분

컬럼 온도: 40℃

검출: 시차 굴절 검출기(일본 분광사 제품)

상기 용액을 70℃의 수욕 중에서 7시간 동안 반응시켰다. 이 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24질량% NaOH로 조정하여 pH를 pH 2.5 내지 3.0으로 유지하였다.

반응 종료 후, 동량의 톨루엔으로 2회 추출하고, 회전 증발기로 톨루엔층을 농축하여 유상 액체 0.43g을 수득하였다.

농축물 중의 β-하이드록시-γ-뷰티로락톤 메타크릴산 에스터의 정량을 상기의 고속 액체 크로마토그래피로 실시한 결과, 순도는 62%였다.

실시예 10

2-시아노벤질 브로마이드 1g 및 균체 현탁액 1g을 10mM 인산 완충액(pH 7.0) 98ml에 첨가하여 10℃에서 3일 동안 반응시켰다.

실시예 9와 동일하게 반응액 중의 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드의 정량을 실시한 결과, 수율은 99% 이상이었다.

상기 용액을 70℃의 수욕 중에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24질량% NaOH로 조정하여 pH를 pH 3.0으로 유지하였다.

반응액으로부터 톨루엔으로 추출을 실시하고, 용매를 감압하에 증발 제거한 후, 잔사를 IR,¹H-NMR 및¹³C-NMR로 분석한 결과, 하기 화학식 VII의 γ-뷰티로락톤류의 생성이 확인되고, 실시예 9와 같은 정량을 실시한 결과, 수율은 21%였다.

실시예 11

20mM의 인산 완충액을 함유하는 10질량%의 4-클로로-2-하이드록시뷰틸아마이드 수용액 100ml를 70℃의 수욕 중에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 때, pH 조절제를 사용하여, 즉 24질량% NaOH로 조정하여 pH를 3.5로 유지하였다.

반응액으로부터 아세트산에틸로 추출을 실시하고, 용매를 감압하에 증발 제거한 후, 잔사를 IR,¹H-NMR 및¹³C-NMR로 분석한 결과, α-하이드록시-γ-뷰티로락톤의 생성이 확인되고, 실시예 1과 동일한 정량을 실시한 결과, 잔존하고 있는 4-클로로-3-하이드록시뷰틸아마이드는 어느 것이나 초기량의 1% 이하이며, 수율은 54%였다.

본 발명에 의해, γ-뷰티로락톤류 또는 δ-발레로락톤류의 제조방법이 제공된다. 본 발명에 의하면, 4-할로-뷰틸아마이드류 등을 원료로 하여, 공정이 적고도 부산물이 적게 상기 락톤류를 제조할 수 있기 때문에, 공업적으로 유용하다.

Claims

하기 화학식 I의 아마이드 화합물을 수성 매체와 반응시키는 것을 포함하는 락톤류의 제조방법:

화학식 I

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

R, R' 및 R₁내지R₆은 각각 독립적으로 수소원자 또는 임의의 치환기를 나타내고,

n은 0 내지 2의 정수를 나타낸다.
하기 화학식 II의 4-할로-뷰틸아마이드를 수성 매체와 반응시켜 하기 화학식 III의 γ-뷰티로락톤류를 생성시키는 것을 포함하는 γ-뷰티로락톤류의 제조방법:

화학식 II

화학식 III

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

R₁내지R₆은 각각 독립적으로 수소원자 또는 임의의 치환기를 나타낸다.
제 2 항에 있어서,

화학식 II의 4-할로-뷰틸아마이드가 4-할로-3-하이드록시뷰틸아마이드인 방법.
제 2 항에 있어서,

화학식 II의 4-할로-뷰틸아마이드가, 하기 화학식 IV의 4-할로-뷰티로나이트릴을 나이트릴 하이드라타제로 처리하여 수득되는 방법:

화학식 IV

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

R₁내지 R₆은 각각 독립적으로 수소원자 또는 임의의 치환기를 나타낸다.
제 4 항에 있어서,

나이트릴 하이드라타제가 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 카세오박터(Caseobacter)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속 및 로도코커스(Rhodococcus)속으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 속에 속하는 1종 이상의 미생물, 또는 상기 군으로부터 선택된 하나의 속에 속하는 1종 이상의 미생물과 상기 군으로부터 선택된 다른 속에 속하는 1종 이상의 미생물의 혼합 미생물에 의해 생산되는 방법.
제 4 항에 있어서,

나이트릴 하이드라타제가 나이트릴 하이드라타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 형질전환체에 의해 생산되는 방법.
하기 화학식 V의 5-할로-펜틸아마이드를 수성 매체와 반응시켜 하기 화학식 VI의 δ-발레로락톤류를 생성시키는 것을 포함하는 δ-발레로락톤류의 제조방법:

화학식 V

화학식 VI

상기 식에서,

X는 할로겐 원자를 나타내고,

R₁내지 R₈은 각각 독립적으로 수소원자 또는 임의의 치환기를 나타낸다.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

반응 온도가 30 내지 100℃인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

반응시의 pH가 pH 1.0 내지 6.0인 방법.