KR20030066766A - 피사체를 이미지화하는 장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

표면 위에 정렬된 또는 증착된 현미경 피사체의 식별 또는 분류를 가능하게 하는 자동화된 수집 및 이미지 분석을 위한 장치와 방법이 개시되어 있다. 그러한 피사체, 예컨대 검출가능하게 표시된 희귀 목표 세포가 자기적으로 또는 비자기적으로 고정되어서 자동화된 레이저 스캐닝에 종속되어, 전체 이미지를 재구성하여 형성하기 위한 목표 또는 비목표 피사체의 순차적으로 디지털화된 x-y 서브이미지 또는 부분적인 이미지를 생성하게 되고, 그럼으로써 크기, 형태 및 면역표현형을 기초로 이미지화된 피사체의 검출, 계산 및 차별화를 가능하게 한다.

Description

피사체를 이미지화하는 장치 및 방법{DEVICES AND METHODS TO IMAGE OBJECTS}

1674년 안토니 반 레벤후크(Antoni van Leewenhoek)의 현미경 발명은 세포와 같은 극히 미세한 물체의 시각화를 가능하게 하였다. 약 200년후 광 현미경과 조합되어서 서로 다른 성분이 착색된(stained) 염료(dye)가 폴 엘리크(Paul Ehrlich)에의해 도입되어 세포 분석의 새로운 시대의 첫 번째 단계로 간주되었다. 서로 다르게 표시(label)된 세포를 식별하고 구별하는 세포 표시 기술 및 기구의 발달로 세포 생물학 분야를 연구할 수 있는 능력이 향상되었다. 최근 25년간 자동화된 혈액 세포 계수기는 세포화학적(cytochemical)으로 착색된 혈액 도말표본(smear)의 수동 검사를 대체하여 왔다. 형태학적 수단에 의한 세포의 분류에 사용되는 기준은 핵 대 세포질 비율, 세포와 핵 크기 및 형태, 세포질 입자(granule)의 수와 크기 등과 같은 파라미터와 관련되어 있다. 세포는 성숙분열기(maturation) 동안 점진적으로 형태학적인(morphological) 모습을 변경하고, 셀의 지정에 있어서 관찰자 사이에 본질적인 변화에서 불확실성을 더 나타나게 된다. 악성종양(malignancy)과 관련된 형태학적인 변경은 성숙분열 과정 동안 세포 모습과 관련되어 있고 비전형적인 세포의 비정상적 빈발은 자주 그러한 세포를 악성으로 지정하기 위한 기준으로서 사용된다.

세포 분류의 발달은 면역표현형(immunophenotype)에 기초한 식별에서 기인한다. 양(羊)의 림프구 주위의 적혈구의 로제트(rosette)의 형성과 같은 초기의 기술은 특정 세포 표면을 인식하는 형광성(fluorescent) 항체 또는 세포내 항원으로 표시된 세포의 유동 세포 분석법(flow cytometric analysis)으로 대체되고 있다. 다중 파라미터 유동 세포 분석법은 크기와 착색된 특징을 기초로 하여 검출된 이벤트를 계산하고 분류하는 능력을 현저하게 발전시켰지만, 예컨대, 형태학적 수단에 의해 세포를 구별하는 것 같이 검출된 이벤트를 더 구별하는 것은 아니다. 이러한 이론을 사용하는 현재의 방법 및 장치는 백혈병이나 임파종 같은 다양한 질병을 진단및 분류하는 것에 또는 AIDS와 같은 질병의 경과를 추적하는 것에 쓰여질 수 있다. 기술이 발전하면서, 더 많은 정보가 얻어지게 되고 따라서 희귀한 목표 종(species)을 위한 검출 방법의 민감도와 특이성(specificity)을 확장하기 위한 더 많은 요구를 유발하게 되었다. 더 발전이 필요한 응용의 예는 혈액 ml당 1개의 암종(carcinoma) 세포보다 더 적은 빈도로 존재할 수 있는 암 환자의 혈액 내에서의 상피(epithelial) 근원의 순환하는 암종 세포의 식별 및 계산이다. 다중 파라미터 유동 세포 분석법에 의한 분석과 조합한 자성 수단에 의해 보강된 상피 세포의 조합을 사용하여 "순환하는 종양(tumor) 세포"의 수에 있어서의 중요한 차이점이 건강한 사람과 유방암 환자사이에서 발견되었다[라실라 등(Racila et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95, 4589-4594, 1998)]. 여러 연구에서, 그러한 "순환하는 종양 세포"(CTC)는 다음과 같은 특징을 표현하는 이벤트로 정의된다. 상피 세포 표지(marker) 세포각질(cytokeratin)에 대해 양성인 것이고, 백혈구 표지 CD45에 대해 음성인 것이고, 핵산 염료의 착색에 대해 양성인 것이고, 그리고 세포와 호환되는 광 산란(scattering) 특성이다. 그러나, 검출된 이벤트를 세포로 또 더 나아가 분자 증거로 형태학적으로 확인하는 것은 유동 세포 방법에 있어서 결여되어 있지만, 검출된 희귀 이벤트가 실제로 제1기 종양에서 기인한 종양 세포라는 것을 보증하는 것이 명백하게 필요하게 된다. 수동 방법에서 서로 다른 운영자 사이에 세포 분류에 대한 주관적인 오류를 감소시키기 위해서 자동화된 이미지 분석 시스템이 도입되고 있지만, 그러한 예비적인 세포 보강(enrichment) 단계가 없는 선행 기술의 시스템은 여전히 본래부터 민감도가 결여되어 있다. 여러 자동화된 세포 이미징 시스템이 설명되어 왔고 또는 상업적으로 세포 분석을 위해서 이용이 가능하다. 크로마비전(Chromavision)에서 개발된 ACIS^TM또는 자동화된 세포 이미징 시스템[더글라스 등(Douglass et al), 미국 특허 6,151,405호]은 자동화된 컴퓨터 제어 현미경으로 관찰한 크기, 형태, 색조(hue) 및 착색 강도(intensity)에 의해서 및/또는 건강 관리 전문가에 의한 육안 검사에 의해서, 준비된 세포를 현미경으로 검사한 색채계(colorimetric) 패턴 인식을 사용한다. 이 시스템은 현미경 슬라이드 상의 세포를 검사하는 것을 이용하며 특히 조직 부분을 위해 설계되었다. 어플라이드 이미징 사(Applied Imaging Corp.)의 SlideScan^TM또는 MDS^TM시스템[샌더스 등(Saunders et al), 미국 특허 5,432,054호]은 세포 또는 "피사체"를 색상, 강도, 크기, 패턴 및 형상에 이어지는 육안 식별 및 분류에 의해서 검출하는, 자동화되고 지능적인 현미경 및 이미징 시스템을 설명하고 있다. ACIS 시스템에 대비해서 보면, 이 시스템은 더 많은 가능성을 제공하는 형광성 표시를 검출하는 성능을 가지고 있다. 그러나, 이러한 그리고 다른 현재 사용가능한 방법론들은 혈액 내 순환하는 종양 세포와 같은 희귀한 이벤트를 정확한 분류하고 형을 정하는 데 충분하도록 민감한 것이 아니다. 따라서, 본 발명에서는 위에 서술한 방법론들을 개선하는 것을 추구하고 있으며, 예컨대 고-민감도 면역표현형과 결합하여 혈액 또는 다른 유체내의 CTC와 같은 희귀한 목표 종의 검출, 계산 및 정확한 분류를 가능하게 하는 피사체의 자동화된 이미징을 위한 간단하고 효율적인 수단과 방법을 제공하는 것을 추구하고 있다.

(관련된 출원에 대한 상호참조)

본 출원은 35 U.S.C 섹션 119(e)에 의해 2001년 1월 5일 제출된 미국 가출원 번호 06/259,959의 우선권을 주장하고 있으며, 이 가출원의 전체 개시사항이 본원에서 참조로서 병합된다.

본 발명은 일반적으로 피사체의 이미지를 획득하고 스캐닝하여 획득하는 장치 및 방법에 관한 것이고, 특히 2차원 평면에 분포되어 있는 생물학적 유체(fluid)에서 얻어지는 세포와 같은 피사체의 부분적인 서브이미지(sub-image)에서 이미지를 재구성하는 것에 관한 것이다.

본 발명에서 제공되는 스캐닝 및 이미징(imaging) 기술은 특히 자성(磁性) 수단에 의해 정렬되고 디지털화된 광전자 수단에 의해 검사되는 세포의 이미징에 있어서 장점을 가지고 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예를 사용하는 Cell Tracks 시스템의 개요도. 이미징을 위해 중요한 구성 요소는 굵은 글씨로 도시됨.

도 2a는 세포를 스캐닝하는데 사용되는 조사(illuminate) 초점 스팟(spot)의 이미지. 짧은 축은 4 ㎛이고 긴 축은 15 ㎛. 점선은 Ni 라인의 위치를 나타냄.

도 2b는 도 2a에 도시된 x-축에서의 합산된 픽셀 강도를 나타내는 그래프.

도 3은 이미지 재구성 방법을 나타내는 개요도. 검출된 이벤트 또는 세포는 인코더와 함께 구비된 스테이지를 움직여서 레이저에 의해 스캐닝됨. CCD 카메라는 개별적인 서브이미지를 획득하고 그것을 컴퓨터 메모리에 스테이지의 x-y 좌표계를 나타내는 대응되는 인코더 위치와 같이 저장함. 스캐닝이 완료된 후, 서브이미지는 결합되고 인코더 값을 사용하여 피사체의 완전한 재구성된 이미지를 형성하고, 인코더 값은 이어지는 서브이미지가 서로에 대해서 이동되어야 할 픽셀 수를 계산함. 이동된 서브 이미지의 합산은 세포의 형광성 이미지를 완전하게 재구성하게 함.

도 4a는 염료의 균질성(homogeneous) 층이 스캐닝될 때 획득되는 형광성 신호.

도 4b는 도 4a에서 스캐닝된 염료에 대한 x-방향 및 y-방향에서의 형광성 강도의 합을 나타내는 두 개의 그래프.

도 5a는 챔버 내의 위치의 기능으로써 대물 렌즈에 의해 획득된 고체 각(angle)의 그래픽 표현. 공기 중에서의 컴팩트 디스크(CD)의 대물 렌즈의 개구수(NA)는 0.45이고, 스테이지 상의 챔버 내에서 유효 NA는 0.34가 됨. 이 NA는 0.37 sr의 고체 각( □)에 대응됨. 니켈 라인 사이의 간격은 10 ㎛임. 원은 7 ㎛의 직경으로 정렬된 피사체를 나타냄. 두 점의 유효 수집 각도는 도면에서 표시됨.

도 5b는 도 4a의 z-방향에서 계산된 고체 각도의 상대적인 합을 나타내는 그래프.

도 6a는 CD45 항체-APC/Cy7 대 전체 혈액에 침투되고 EpCAM 항체-표시된 자기 나노입자(nanoparticle)에 의해 획득되고 정렬된 세포의 형광의 CAM5.2 항체-APC SKBR3의 산란 플롯(plot). 구역 1과 SKBR3 세포 구역의 측정된 이벤트의 서브이미지와, 및 파편을 포함하는 광대역의 서브이미지의 몇몇 대표적인 서브이미지가 도시됨. 구역 2는 백혈구가 존재하는 경우 나타날 수 있는 구역이며 Ni 라인을 따라서 정렬됨.

도 6b는 SKBR3 세포와 그에 대응되는 측정된 형광성 신호의 전체 이미지.

도 7은 Oxazine 750 형광성 대 전체 혈액 내에서 CD45-표시된 자성 나노입자에 의해 획득되고 정렬된 백혈 세포의 형광성의 CD45-APC 형광성의 산란 플롯. 단핵 세포(monocyte)와 과립구(granulocyte) 구역의 몇몇 대표적인 이미지가 도시됨.

도 8은 Cell Tracks 시스템을 사용하여 전체 혈액에서 획득된 백혈구의 CD45 강유체(ferrofluid)로 착색된 Oxazine 750의 시간적으로 분석된 이미지 : 시간 스팬(span)은 0에서 120 초로 20초 간격임.

본 발명은 새로운 이미징 가능성을 Cell Tracks^TM세포 분석 시스템과 같은 시스템에 티브(Tibbe) 등이 설명한 것처럼 응용하는 것을 가능하게 한다[네이처바이오텍(Nature Biotech). 17, 1210-13, 1999]. 티브에 의해서 설명된 장치 및 방법과 본 발명에서 개시된 장치 및 방법은 또한 다른 목표 피사체에 적용될 수 있다. 그러나, 주요 응용은 혈액으로부터 희귀 세포를 급속 면역자기적(immunomagnetic)으로 선택하고 고립된 세포를 자동적으로 정렬하고 자동적으로 이미지 분석을 하는 것이다. 간단하게는, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 혈액으로부터의 자성 수집(collection) 및 보강 후에, 자기적으로 표시된 세포는 니켈(Ni)의 강자성(ferromagnetic) 라인(line)을 따라서 정렬되고 CD 플레이어의 렌즈 같은 종래의 대물 렌즈를 수단으로 하여 초점이 맞추어진 레이저에 의해 스캐닝된다. 세포가 하나 이상의 형광 표시로 선택적으로 착색되어 있기 때문에, 측정되는 형광성 방출과 강도는 세포 유형을 식별하거나 또는 분류하는 데 사용될 수 있다.

어떤 액체 유동 시스템도 본 발명의 시스템에서 요구되지 않는다. 상기 니켈 라인에 근접하여 있는 각(angular) 자석에 의해서 유도된 자기장은 자기적으로 표시된 세포를 고정된 위치로 유지한다. 이것은 형광성 방출과 강도를 측정한 후, 검출된 이벤트를 더 심화된 분석을 위해 재검사하여, 검출된 이벤트를 더 식별하게 하는 것을 가능하게 한다. 또한 그러한 이벤트의 이미지를 현미경으로 보고 독립적인 형태학적 기준을 적용하여 그러한 이벤트를 실제 세포로 식별하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에 부합되게, 새로운 스캐닝 및 이미징 방법은 신체의 유체로부터 면역자기적으로 표시된 목표 셀을 수집하고 정렬하는 효율적인 자동화 수단을 포함하는 세포의 검출, 분석 및 계산을 위한 개선된 진단 시스템을 제공하고, 그러한 수집된 세포는 또한 목표를 비-목표 세포와 구별하여 서로 다른 형광성 표시로 표시하는 적어도 하나의 면역-특정(immuno-specific) 형광성 표시를 가진다. 수집되고 정렬된 세포의 이미지는 개별적으로 디지털화된 서브이미지와 그의 x-y 좌표계로부터 재구성되고, 그럼으로써 피사체의 전체 결합된 이미지를 제공하며, 검출된 피사체를 목표 이벤트로의 개선된 분류를 가능하게 한다.

본 발명에 부합되게, 새로운 레이저 스캐닝 및 이미징 기술은 Cell Tracks 시스템과 같은 시스템에 통합되어 높은 품질의 형광 이미지를 얻게 된다. 본원에서 설명되고 청구되는 발명은 선행기술의 시스템과 방법에서 보다 희귀 세포의 검출, 계산 및 분류를 크게 개선한 것이다.

매우 낮은 빈도의 세포, 소위 희귀 이벤트의 효율적인 검출은 세포의 손실을 막기 위해서 최소의 시료 취급을 요구한다. 게다가, 희귀 세포가 분리되고 보강되는 부피는 검출의 민감도를 증가시키기 위해서 필요한 만큼 커야 한다. 개시된 새로운 기술의 개발 및 응용과 같이, 특정 이벤트의 형광성 이미지를 얻는 것은 이제 높은 정확도의 식별의 결과를 가져오며, 따라서 본 발명의 시스템을 신체 유체에 있어서 희귀 이벤트의 검출을 위한 강력한 도구로 만들어 준다.

본 발명은 다음 설명에서의 바람직한 실시예를 참조로 해서 더 설명된다.

위치 정보:

도 1을 참조하면, 미리 측정된 이벤트의 전체 이미지가 만들어질 수 있고,전체 이미지는 다중 디지털화 서브이미지를 결합하여 구성된 재구성된 이미지로 정의되고, 이벤트는 도 1의 시료(sample) 챔버에서 재배치되어야 만하고, 이것은 각각의 서브이미지에 대한 x-y 시료 좌표계와 같은 공간 정보가 필요하기 때문이다. y-방향에 대해서 위치 정보를 얻기 위해서, 자석과 시료 챔버를 모두 움직이는 스테이지는 0.2 ㎛의 해상도를 가지는 인코더를 구비하고 있다. 특정 이벤트의 서브이미지를 위한 라인 번호는 x-방향의 위치 정보를 주기 위해서 측정될 수 있다. 라인 번호와 함께 인코더 신호는 메모리에 저장되고 각 서브이미지를 위해 측정된 PMT 신호와 결합된다. 이러한 방식으로, 모든 측정된 서브이미지 이벤트는 서로 관련되어 있고 시료의 x-y-위치로 표시된다.

특정 이벤트 또는 서브이미지가 측정된 위치로 되돌아가기 위해서, 레이저 초점이 현재 라인 번호에서 특정 이벤트가 측정된 라인 번호를 뺀 것과 같은 라인의 수만큼 이동된다. 병렬적으로, 스테이지는 y-방향으로 이동되어 특정 인코더 위치로 된다. 인코더 신호를 얻기 위한 대안적인 방법은 아래에 설명되는 위치를 기록하기 위한 신호를 제공하는 Ni 라인의 프로파일을 부가하는 것이다. 이 접근법은 더구나 시료를 움직이기 위한 현저하게 간단하고 저렴한 스테이지의 사용을 가능하게 한다.

이미징의 방법:

도 1의 시스템은 수동 이득 조절 및 25 Hz의 프레임 율(frame rate)을 가지는 표준 단색 감시 전하-결합 장치(CCD) 카메라로 구성된다. 광 빔에 탈착이 가능한 거울을 삽입함으로써, 컴팩트 디스크(CD) 대물렌즈에 의해 획득되는 형광성 광)은 구형 무색(achromatic) 렌즈(f= 150 mm)에 의해 핀홀(pinhole) 대신에 CCD위로 초점이 맞추어진다. CD 대물렌즈는 CD 플레이어에서 사용되는 것과 같은 780 nm의 파장에 대해 회절이 제한된 스팟 크기를 얻기 위해서 최적화된 단일 무색 렌즈로 구성된다. 세포를 스캐닝하는 데 사용되는 초점 스팟의 이미지는, 도 2a에 현출되어 있다. 이미지의 타원 형상은 각각의 개별적인 초점 거리의 2배보다 약간 큰 거리에 배치되어 있는 2개의 원통형 렌즈에 의해 얻어진다. 이 타원형 초점의 짧은 축은 4 ㎛(FWHM)에 설정되어 있고, 이는 세포의 직경보다 작아서 어느 한 순간이라도 하나 이상의 세포가 초점내에 있는 것을 방지하게 한다. 긴 축은 Ni 라인의 간격보다 크다. Ni 라인 위에 초점이 맞추어지는 광은 반사되고 피드백 제어를 위해서 사용된다. Ni 라인은 0.5 mm 두께의 유리 기판 위에 현출된다. 본 응용을 위해 최적화되지 않은 CD 대물렌즈와 같이 유리 기판을 통하여 Ni 라인 위에 레이저 광(635 nm)의 초점을 맞추는 것은 비균질성(non-homogeneous) 레이저 초점을 얻게 된다.

레이저 초점의 강도 프로파일은 비균질성일 뿐만 아니라, 세포의 직경이 통상적으로 5에서 20 ㎛ 사이이기 때문에, 그것은 또한 세포 직경보다 작게 된다. 그러나, 세포 직경보다 작고 비균질성 강도 프로파일을 가지는 레이저 초점으로 일정한 조사를 하는 것은, 빔의 광학성분을 움직임으로써 레이저를 세포 표면에 걸쳐서 스캐닝해서 얻을 수 있고, 이러한 것은 레이저 스캐닝 현미경에서와 같다[ 콜, 티알, 공유초점 스캐닝 현미경 및 관련된 이미징 시스템, 아카데믹 프레스, 뉴욕,1995(Corle, TR, Confocal Scanning Microscopy and Related Imaging Systems, Academic Press, NY, 1995)]. 본 발명의 시스템에서 이 방법은 피드백에서의 손실을 가져오고, 따라서 x-방향에서의 위치 정보의 손실을 가져온다. 도 2b는 도 2a의 y-방향에서의 초점 스팟의 개별적인 픽셀 강도를 합한 후 얻어지는 강도 프로파일을 나타낸다. 점선은 10 ㎛의 Ni 라인 간격을 나타낸다. 합해진 강도 프로파일은 라인 간격에 걸쳐서 ±6 %의 강도 변화를 도시한다. 이러한 초점을 통해서 세포를 y-방향으로 움직이는 것은, 이 레이저 초점을 통과한 후 세포의 모든 부분이 거의 동일한 조사를 수신하는 결과로 된다. 이 방법은 개별적인 서브이미지의 합에 기초하여 정렬된 세포의 전체 고품질 형광성 이미지를 얻는데 사용된다.

자기 스테이지 및 챔버:

자석과 챔버는 세포를 포커스를 통해서 y-방향으로 움직이는 스테이지 위에 미리 배치된다. 특정 세포의 전체 이미지를 얻기 위해서, 레이저 초점은 특정 서브이미지 이벤트가 측정되는 라인에 대해서 이동되고 스테이지는 대응되는 인코더 위치로 10 mm/sec의 속도로 y-방향으로 움직인다. 스테이지는 셀 위치와의 거리가 25 ㎛일 때 5 ㎛/sec로 속도를 줄인다. 이러한 y-방향에 대해서 낮고 일정한 속도로 스테이지를 움직이는 동안, 세포는 레이저 초점에 의해서 스캐닝되고, 각 서브이미지를 위한 형광성 신호는 CCD 상에 획득된다(도 3).

프레임 그래버(grabber) 카드는 CCD 서브이미지를 25 Hz로 획득하고 이를 메모리 내에 저장한다. 각각의 순차적인 서브이미지에서, 스캐닝 방향에서의 레이저 초점이 세포 직경보다 작기 때문에 세포의 서로 다른 부분들이 조사를 받는다. 서브이미지 획득과 함께, 인코더 위치가 판독되고 또한 컴퓨터 메모리에 모두 저장된다. 서로에 대해서 평균적으로 0.2 ㎛가 이동되고 각각 150×240픽셀을 가지는 200개의 획득된 서브이미지에 대응하여 모두 40 ㎛가 스캐닝된다. 이것은 CCD 표면상에서 2.63픽셀에 대응된다. 인코더 값을 사용하여 획득된 서브이미지가, 관련된 인코더 값×2.63의 차이에 대응되는 픽셀의 수만큼 이동되고, 곧 합해지거나 결합된다. 이 것은 도 3에 개요도로 도시된 바와 같이 재구성된 전체 세포 이미지가 된다. y-방향에서의 서브이미지 해상도는 0.2 ㎛인 인코더 해상도에 의해 결정된다. x-방향에서의 해상도는 x-방향에서의 레코딩된 이미지 내의 픽셀 수에 의해서 결정되고 이것은 픽셀 당 0.07 ㎛이다. 이 해상도는 모두 회절 한계보다 작다. 그러므로, 긍극적인 이미지 해상도가 인코더 또는 카메라에 의해 결정되는 것이 아니라 이미징 광학에 의해서 결정된다는 것이 당업자에 의해 인정될 것이다.

조사의 균질성:

본 발명의 방법에서 조사의 균질성은 농축된 형광성 염료 용액의 얇은 층을 가지고 테스트되었고, 10 ㎛간격으로 떨어져있는 Ni 라인 사이에 자기적으로 표시된 세포가 정렬되어 있는 평면에 이 층이 배치되어 있다. 위에서 설명하였듯이 5 ㎛/초의 속도로 스캐닝되고 이미지화된다. 순차적으로 획득된 서브이미지는 도 4a에 현출되어 있다. 형광성 염료의 균일한 층은, 만약 조사가 균일하다면, 균질성인 형광성 이미지가 기대된다. 얻어지는 이미지는 도 4b에 도시되어 있다. 이미지의y-방향에서 중심 트레이스(trace)를 따라서 강도 유닛을 측정한 것인 관찰되는 신호는 ±7 %정도로 변화하는 것이 발견된다. 이러한 변화에 대한 하나의 원인은 염료 층의 비균질성이 될 수 있으며, 이것은 방출되고 획득되는 형광성 광에 영향을 미친다. 2번째 원인은 스테이지가 일정한 속도로 움직이지 않는다는 것이다. 스테이지의 위치는 카메라의 프레임 율과 프레임 그래버 카드와 동기화되지 않지만, 이미지는 y-방향에서의 스테이지의 위치와 속도에 관계없이 25 Hz로 얻어진다. 만약 스테이지가 특정 구역에서 5 ㎛/초의 속도보다 빠르게 움직인다면, 이 구역에서 획득되는 이미지가 적어지고 따라서 전체 강도가 낮아질 것이다. 그러나, 이러한 스테이지의 속도의 변화는 측정되어서, 측정되는 이미지 강도의 변화가 관찰되는 것보다 더 작도록 될 것이다. 중심 트레이스를 따라서의 명백한 비균질성은 따라서 염료 층의 비균질성에 기인한 것이다. Ni 라인과 스캐닝 방향에 수직인 또는 x-방향의 강도의 프로파일이 또한 도 4b에 도시되어 있다. 이 방향에서의 서브이미지의 강도는 Ni 라인 사이에서 최대값을 가지고 Ni 라인의 가장자리에서 값이 떨어진다. Ni 라인은 형광성 광의 방출을 방해하고 더 작은 수집 각도가 되게 하며, 따라서 대물 렌즈의 유효 NA를 더 작게 하는 결과로 된다. 도 5a에서 대물 렌즈에 의해 검출되는 유효 고체 각도는 챔버 내에서의 위치에 따른 함수로서 계산된다. 10 ㎛의 라인 간격과 14 ㎛의 깊이 또는 층 두께를 사용하여 모의 실험이 수행되었다. 도 5b의 그래프는 도 5a의 z-방향에서 계산된 고체 각도 값의 합을 나타내고, 따라서 수집되고 측정된 강도의 측정값을 x-위치의 함수로서 제공한다. 계산된 강도 프로파일을 관찰하면, 균일한 염료 층에 대한 측정된 강도와 일치하는 것을 알 수 있다. Ni 라인에 근접한 피사체의 유효 NA는 크게 감소하여, 비록 균일한 조사가 사용되었지만 x-방향에서 획득된 강도가 균일하지 않은 결과로 된다. 도 5a에서 원으로 표시된 것 같은 직경이 7 ㎛보다 작은 피사체는, Ni 라인의 차폐 효과 때문에 강도 면에서 손실이 없게 이미지화되며, 이것은 이 구역에서의 유효 NA가 Ni 라인에 의해 감소되기 때문이다.

세포 이미징:

유동 세포계(flow cytometer)내에서 면역자기 표시에 이어진 면역표현형 분석을 포함하는 순차적인 단계를 이용하여 혈액에서 유방 암종(carcinoma) 세포를 분리하는 방법이 라실라 등(Racila et al, Proc. Nat. Sci. 95, 4589-94, 1998)에 의해 설명되었다. 본 발명의 시스템에서, 세포는 면역표현형으로 되고 그들의 정체(identity)가 형광성 이미지를 제공함으로써 검증된다. 이러한 절차는 전체 혈액 내에 침투(spike)하는 SKBR3 유방암 세포 라인의 배양된 세포를 검출함으로써 실험된다. 침투된 시료는 예에서 설명된 것과 같이 준비된다. 도 6a는 유동 세포계 내에서 APC/Cy7 채널 대 APC 채널의 산란 플롯을 나타낸다. SKBR3 세포는 구역 1에 배치된다. 파편(debris)은 광대역으로 존재하고 백혈구는 존재하는 경우 구역 2에 배치된다. 산란 플롯을 측정한 후, 몇몇 이벤트는 본원에서 설명한 새로운 이미징 기술로 이미지화된다. 산란 플롯 내에서 피사체 또는 세포를 선택한 후, 이미징 시스템은 자동적으로 세포의 측정된 위치로 되돌아가고 이미징 루틴이 시작된다. 구역 1내에서의 이벤트로부터 얻어지는 이미지의 세트는 세포질이 형광성으로 착색된세포를 도시한다. 이러한 세포의 핵은 어두운 구역으로 보이게 된다. 이미지는 파편에 대해서 서로 다르고, 이것은 구역 1에 배치되어 있지 않다. 도 6b는 측정된 형광성 신호와 대응되는 SKBR3의 이미지를 도시한다. 형광성 이미지와 측정된 PMT 신호는 상호 연관되어 있다.

신호 대 잡음 비:

이미징 스캐닝 속도를 감소시키는 것은 특정 이벤트의 서브이미지를 획득할 경우 더 많은 수로 되는 결과가 되고, 또한 더 좋은 신호 대 잡음 비를 가져온다. 그러나 이미지 스캐닝 속도가 감소되었을 때에도 APC 표시된 SKBR3 세포에서 이미지 품질의 개선은 관찰되지 않는다. 이미징 스캐닝 속도의 한계는 염료 분자의 광-표백(photo-bleaching) 비율에 의해서 결정된다. 만약 SKBR3 세포가 2번째로 스캐닝될 때라도, CCD 카메라로는 어떠한 형광성도 검출되지 않을 수 있고, 이것은 대부분의 APC분자가 이미 처음 스캐닝시 광분해(photo-destroy)되었다는 것을 나타낸다. 따라서 스캐닝 속도를 감소시키는 것은 형광성 신호를 검출하는데 있어서 차이가 없으며 단지 형광성 배경을 증가시기는 결과가 되는 것이다. 따라서 최적의 스캐닝 속도는 개별적인 염료 특성에 의존하는 것이고, 각각의 사용되는 형광성 물질에 대해서 서로 다를 것이다. 따라서 신호 대 잡음비를 개선시키기 위해서 스캐닝 속도를 더 빠르게 하는 것이 좋을 것이다. 다른 면으로, 25 Hz의 프레임 율을 가지는 카메라를 사용했을 때 5 ㎛/초보다 빠른 스캐닝은 해상도의 손실을 가져올 것이며, 이것은 획득된 이미지가 0.2 ㎛이상 서로 떨어져 있을 것이기 때문이다. 더 높은 프레임 율을 가지는 CCD 카메라는 손해상도 손실없이 스캐닝을 더 빠르게 하기 위해서 필요할 수 있다. 표준 감시 CCD카메라를 좀 더 민감한 것으로 교체하는 것은 또한 희미하게 착색된 세포의 이미징을 가능하게 한다.

공유초점(confocal) 이미징:

Cell Tracks 시스템에서의 자성 수집 방법은, 보통 슬라이드 위에 원심 증착(deposition)을 사용하는 세포회전(cytospin) 시스템에서 일반적인 것인, 세포에 압력을 주거나 왜곡을 주지 않는다. 그러므로 자기적으로 정렬된 세포는 그 고유한 3-차원 형상과 부피를 유지한다. 본원에서 설명된 장치와 방법은 또한 세포의 공유 초점 이미지를 얻는데 사용될 수 있고, 따라서, 세포내의 형광성 염료의 3차원 분포에 대해 좀더 정확한 결정을 할 수 있어서 이미지 품질을 증대시키는 데 사용될 수 있다[콜, 티알, 공유초점 스캐닝 현미경 및 관련된 이미징 시스템, 아카데믹 프레스, 뉴욕, 1995(Corle, TR, Confocal Scanning Microscopy and Related Imaging Systems, Academic Press, NY, 1995)]

Ni 라인이 없는 이미징:

Cell Tracks 시스템에서, Ni 라인은 세포를 정렬하는 데 사용되고, 대응되는 인코더 값과 같이 세포가 측정되는 라인 번호를 사용하여 세포를 재배치하는데 사용된다. 그러나 본원에서 설명된 이미징 발명은 Ni 라인 또는 자기 라인의 존재에 종속된 것이 아니며, 세포 또는 다른 관심있는 형광성 피사체가 존재하거나 또는증착될 수 있는 어떠한 표면 위라도 사용될 수 있다. 저장되고 얻어진 서브이미지로부터 이미지를 재구성하는 것에 단지 스캐닝 방향에서의 인코더 데이터만이 필요할 뿐이다.

본 발명의 실시예를 실행하기 위해 필요한 기본적인 요구조건은:

1) 스캐닝 방향에서 서브이미지의 합해진 강도 프로파일은 가능한 균일하여야 하며, 이는 이것이 직접적으로 전체 이미지 품질에 관련되어 있기 때문이다. 본 발명에서, 이 변화는 6%보다 작다.

2) 합해진 강도 프로파일의 균일도는, 스캐닝 방향에 대해서 수직인 방향에 대해서, 스캐닝될 피사체의 직경보다 더 넓은 범위로까지 확대되어야 한다.

3) 세포 내에서 가장 작은 요소(detail)와 동일하거나 또는 더 작은 해상도를 가지고 스테이지가 움직일 수 있어야 한다.

본 발명의 개선된 스캐닝 및 이미징 시스템이 위의 바람직한 실시예의 설명에 한정되는 것이 아니라는 것과, 전술한 바와 같이 이러한 개선점들을 구현한 본 발명의 바람직한 실시예는 또한 본 발명이 많은 분야와 응용에 대해서 세포를 진단하고 목표 종을 일반적으로 입자화(particulate)하는데 채택될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 다음의 예는 특정한 실시예를 설명하며 현재 본 발명에서 알려진 최선의 모드를 포함하는 것이나, 이것에 의해 범위가 한정되는 것은 아니다.

예 1

이 실험에 대해서, 10 ㎕의 고정된 SKBR3 세포( 50,000 세포/ml)가 290 ㎕의 EDTA 혈액과 혼합되었다. 또한 동시에 항-EpCAM[단백질과 스트렙타비딘(streptavidin)과 바이오티닐레이트된(biotinylated) EpCAM 항체로 코팅된 200 nm의 크기의 자성 입자]과 SKBR3 세포 위에 존재하는 것으로 알려진 상피 세포에 특정된(specific) 항체[펜실바니아 헌팅던 밸리 소재의 이뮤니온(Immunion) 사에서 배양됨]으로 코팅된 자기 강유체 100 ㎕와, 상피 세포내에 존재하는 세포골격(cytoskeletal) 단백질(예컨대 상피에서 유도되는 SKBR3 세포) 또는 항-세포각질(anti-cytokeratin) 종을 인식하는 단세포 항체와 접합된(conjugated) 알로피코시아닌(allophcocyanin, APC) 10 ㎕와, CD45-APC/Cy7[캘리포니아 벌링에임(Burlingame), 칼택(Caltag)] 10 ㎕를 부가하여, 백혈구를 식별하게 하고, 또한 세포각질 항체에 비특정적으로(nonspecifically) 구속(bind)될 수 있는 백혈구를 식별하게 한다. 15분 정도의 배양 후에, 이 혈액 반응 혼합물 50 ㎕가 챔버 내에 주입된다. 챔버는 Cell Tracks 자석 조립체 내에 배치되어 있고 2분 동안의 수집 시간 후에, 피드백 시스템이 켜지게 되고 측정이 시작된다. 단일 측정에서, 각각 길이 15 mm이고 30 ㎛의 라인 주기를 가지는 세포의 정렬된 40 라인이 스캐닝된다. 0.5 mm 높이의 챔버에서, 스캐닝된 부피는 9 ㎕를 나타낸다. 측정된 면역-형광성 신호에 대응되는 수집되고 표시된 SKBR3의 스캐닝 결과는 도 6a와 도 6b에 도시되어 있다. 도 6a는 CD45-APC/Cy7 염료 대 전체 혈액에 EpCAM-표시된 자기 나노입자에 의해 획득되고 정렬된 CAM5.2 항체-APC 형광성 SKBR3의 산란 플롯을 나타낸다. 구역 1의 측정된 이벤트의 일부 대표적인 이미지, SBKR3 세포 구역, 그리고 파편을 포함하는 광대역의 이미지가 도시되어 있다. 구역 2는 백혈구가 존재하고 Ni 라인을 따라서 정렬되는 경우 나타날 수 있는 구역이다. 도 6b는 하나의 SKBR3 세포와 그에 대응되는 측정된 형광성 신호의 이미지를 도시한다.

예 2

이 실험에서는 EDTA 항-응고처리된(anti-coagulated) 혈액 50 ㎕와, CD45-표시된 강자성 나노입자 5 ㎍을 포함하는 강유체 50 ㎕와, CD4-APC 1.5 ㎕와 10^-5M의 Oxazine 750 과염소산염(perchlorate)[오하이오 데이톤의 엑시톤(Exciton)사] 25 ㎕가 부가되었다. 시약(reagent)의 최적의 농도는 각 시약을 연속 적정(serial titration)하여서 얻을 수 있다. 15분간의 배양 후 PBS 300 ㎕가 부가되었고 혈액 혼합물 50 ㎕가 자석 사이에 미리 배치된 모세관(capillary)내로 배치된다. 모세관은 70도 기울어진 자석 사이를 꼭 맞추게 되는 방식의 형태를 가지는 유리 바닥을 가지고 있다. 0.5 mm의 두께를 가지는 양면 테이프[미네소타 세인트 폴의 쓰리엠(3M)사]의 2개의 띠가 3mm 간격을 가지도록 유리 위에 배치되어 모세관의 측벽을 형성한다. 약 30 ㎛의 폭과 약 0.2 ㎛의 두께를 가지는 Ni 라인은 7740 Pyrex^?유리 웨이퍼[독일 코닝(Corning) 인터내셔날]위에 표준 광리소그라피 기술로 제조된다. 웨이퍼는 4 mm×25 mm의 조각으로 잘려지고 이것이 바닥을 향한 Ni 라인과같이 양면 테이프 위에 배치되어 모세관의 윗부분을 형성한다. 모세관의 내부 수치는 크기= 0.5 mm, 길이 = 25 mm, 폭 = 3 mm이다. 여기서 현출된 측정에서 y-방향의 스캐닝 속도는 4 mm/초이고, 15 mm에 대해서 챔버가 스캐닝되고 40 라인이 스캐닝되어서, 2.5분의 측정 시간이 나온다. 라인의 간격이 30 ㎛이기 때문에, 스캐닝된 표면은 18 ㎟이다. 챔버의 높이가 0.5 mm이므로 스캐닝된 부피는 9 ㎕이다. 특이(deferential) 백혈구 계수(count)에 대해서는, 시약의 부가가 4.77의 희석 요소를 가져온다. 세포가 라인 사이에 정렬하기에 필요한 시간을 줄이기 위해서 또한 약하게 자기 표시된 세포도 상부 표면에 끌어당겨지도록 보장하기 위해서, 혈액이 모세관 내에 배치된 후에 자석과 함께 모세관이 윗부분이 아래쪽으로 향하도록 배치된다. 2분 후에 자석과 함께 모세관이 다시 반전되고, 그리고 약 1분 후에 피드백 시스템이 켜지게 되고 측정이 시작된다. 방출 스펙트럼을 분리하기 위해서, APC 형광성 물질을 위해서 600df32 대역통과(band-pass)필터가 사용되고 Oxazine 750을 위해서 730df100 대역통과 필터가 사용된다(두 필터는 모두 버몬트 브태틀보로의 오메가 옵티칼(Omega Optical)사에서 구할 수 있다]. Oxazine 750 착색된 세포의 형광성 강도가 면역-형광성 CD4-APC 표시된 세포의 강도보다 현저하게 크기 때문에, 스펙트럼 중첩에 대한 보상(compensation)이 필요하게 된다. 보상 후 얻어지는 산란 플롯의 통상적인 예가 도 7에 도시되어 있다. 4개의 개체군이 뚜렷하게 보이며 이들은 CD4+ 림프구, CD4+ 단핵세포, CD4- 림프구와 중호성(neutrophilic) 과립구로 식별된다. 도면에서 도시된 게이트 설정은 각 게이트 내에서의 이벤트의 수를 결정하는 데 사용된다. 측정된 백혈구의 총 개수는 12,350이었고 측정 시간은 2.5분이었다. 검출된 피사체에서부터 형광성 물질의 분포를 검사하기 위해서, 사용자가 산란 플롯 내에서 관심 있는 피사체를 지적할 수 있는 소프트웨어가 작성되었다. 시스템은 그후 이 이벤트의 위치로 움직이고 이미지를 얻는다. 놀랍게도, Oxazine 750 착색된 것으로부터 얻어지는 형광성 물질이 핵에서부터 유도되는 것이 아니라 과립(granule)으로부터 유도된다는 것이 이미지에서 명백하게 나타난다[사피로(Shapiro HM), 스티븐스(Stephens S): Oxazine 750 또는 관련된 레이저 염료를 633 nm 여기(excitation)와 같이 사용한 DNA 콘텐트의 유동 세포분석. 세포분석 1986;7:107-110]. 과립구 게이트내의 이벤트에서 얻어지는 6개의 이미지와 단핵세포 게이트 내에서 얻어지는 2개의 이미지가 도시되었다.

예 3

예 2에서의 실험이 반복되지만, 전체 혈액에서 획득된 백혈구의 CD45 강유체(ferrofluid) 및 착색된 Oxazine 750으로부터 Cell Tracks 시스템을 사용하여 시간적으로 분석된 이미지가 얻어진다. 도 8은 20초 간격으로 얻어진 이미지의 4개의 예를 도시한다. 세포 내에서의 형광성 물질의 분포는 명백하게 시간 간격 사이에서 변경하고 있으며 프레임 3 및 4에 이어지는 세포들에서 명백하듯이 서로 다른 세포는 서로 다르게 행동한다. 두 프레임 모두에서 서로 매우 근접한 두 세포로부터 이미지가 얻어지고, Oxazine 750의 세포 분포와 흡입(uptake)에서의 차이가 명백하다. 이러한 예에서 볼 때, Cell Tracks 시스템이, 예컨대 실시간으로 약물 또는 다른 성분에 대한 혈액의 반응을 연구하는 것과 같은, 세포의 기능적 분석을수행하는 특정의 능력을 가지고 있다는 것이 명백하다.

비록 본 발명이 특정 실시예를 참조로 설명되었지만, 여기에서 예컨대 여기서 설명한 특정 실험 조건과 같은 다양한 변화가 가능하다는 것을 당업자가 인식할 것이며, 본 발명의 목적과 장점을 본원 발명의 더 넓은 범위와 의의를 벗어나지 않고 본 발명에 부합되게 단지 몇 개의 바람직한 실시예를 개시한 것을 나타내는 것임을 이해하고 인정하여야 할 것이다. 이러한 본 발명에 부합되는 발명들은 단지 당업자에 의해서 가능할 수 있는 장치나 방법의 많은 추가적인 가능한 응용 중 예시적인 것에 불과한 것이며, 어떤 방식으로든 본 발명을 한정하기 위한 의도가 아니라는 것을 이해하고 인정해야 할 것이다. 따라서 본 발명의 다른 목적과 장점은 첨부한 청구항과 상세한 설명으로부터 당업자에게 명확하게 될 것이다.

본 발명에서는 예컨대 고-민감도 면역표현형과 결합하여 혈액 또는 다른 유체내의 CTC와 같은 희귀한 목표 종의 검출, 계산 및 정확한 분류를 가능하게 하는 피사체의 자동화된 이미징을 위한 간단하고 효율적인 수단과 방법을 제공한다.

Claims (25)

1. 목표 개체(entities)의 분석적 이미징(imaging)을 위한 방법으로서,

   (a) 상기 목표 개체를 포함하는 것으로 추측되는 시료(sample)를 얻는 단계와,

   (b) 상기 목표 개체에 대해 특정된(specific) 자성(磁性) 입자로 상기 목표 개체를 자기적으로(magnetically) 표시하는 단계와,

   (c) 상기 목표 개체를 수집 표면을 향하여 자기적으로 조작하는 단계와,

   (d) 상기 수집된 목표 개체를 조사(illuminate)하는 단계와,

   (e) 상기 수집된 목표 개체의 순차적인 서브이미지(sub-image)를 수집하는 단계와,

   (f) 상기 수집된 목표 개체의 완전한 이미지를 구성하기 위해서 상기 서브이미지를 재결합하는 단계

   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 목표 개체는 세포(cell)인 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 세포는 종양(tumor) 세포인 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 자성 표시는 콜로이드(colloidal) 자성 입자인 것인방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 콜로이드 자성 입자는 상피 세포 부착 분자(Epithelial Cell Adhesion Molecule, EpCAM)에 대해 특정된 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 수집 표면은 유리 기판 위의 병렬 니켈 라인(line)을 포함하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 조사하는 단계는 다중 파장 광원을 사용하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
8. 목표 개체의 분석적 이미징을 위한 장치로서,

   (a) 수집 표면을 포함하는 시료 챔버와,

   (b) 자기적으로 표시된 상기 목표 개체를 상기 수집 표면을 향하여 자기적으로 조작하는 것이 가능한 자석의 배열과,

   (c) 하나 이상의 광원(light source)과,

   (d) 상기 수집된 목표 개체의 서브이미지를 획득하는 것이 가능한 카메라와,

   (e) 상기 수집된 목표 개체의 완전한 이미지를 구성하기 위하여 상기 서브이미지를 재결합하는 것이 가능한 컴퓨터

   를 포함하는 장치.
9. 제8항에 있어서, 상기 수집 표면은 유리 기판 위의 니켈 라인을 포함하는 것인 장치.
10. 제8항에 있어서, 상기 광원은 레이저인 것인 장치.
11. 자기적으로 검출 가능하게 표시되고 평면형 표면 위에 배치된 마이크론 크기의 피사체-상기 표면 위에 자성 수단에 의해서 선형 어레이로 상기 피사체가 정렬됨-를 자동적으로 스캐닝하기 위한 방법으로서,

    (a) 상기 평면형 표면 상에 배치된 복수의 병렬 자화가능(magnetizable) 라인을 지니고 있는 챔버 안으로 상기 표시된 피사체를 포함하는 액체 시료를 로딩하는 단계- 상기 표시된 목표 피사체는 2에서 약 20㎛의 크기 범위를 가지고, 바람직하게는 약 5에서 약 15 ㎛의 크기 범위를 가짐- 와,

    (b) 상기 챔버를 현미경의 이동가능한 자성 x-y 스테이지 위에 배치하여, 상기 자화가능 라인의 근접부에 자기장을 생성시키고, 존재하는 경우 x-축을 따라서 선형 어레이내의 인접하는 자기 라인사이에 상기 피사체를 정렬하고 위치적으로 고정시키는 단계와,

    (c) 계단식(stepwise) 디지털화(digitized) 방식으로 x-축을 따라서 상기 정렬된 피사체를 지니는 상기 스테이지를 일정하게 초점이 맞춰진 광 빔의 경로로 움직이고, 상기 광 빔은, 상기 목표 또는 비-목표 피사체 위의 검출가능한 표시를 여기(excitation)시키기 위한 복수의 파장의 각각의 특성으로, 상기 정렬된 피사체를 순차적으로 조사하고, 따라서 상기 스테이지 위의 상기 서브이미지의 특정 x-y 위치로 인코딩된 상기 피사체의 상기 분할된 서브이미지에 대응되는 복수의 순차적으로 방출되는 신호를 생성하는 단계와,

    (d) CCD 장치의 스캐닝 속도에 균형을 맞출수 있는 비율로 프레임 그래버(grabber)에 결합된 상기 CCD 장치를 수단으로 하여 상기 순차적으로 분할된 서브이미지를 획득하고 저장하는 단계와,

    (e) 상기 스테이지 위의 상기 서브이미지의 각각의 x-y 스테이지 위치를 인덱스(index)로 하여 상기 순차적인 서브이미지를 컴퓨터 메모리 내에 저장하는 단계와,

    (f) 상기 피사체의 상기 저장된 서브이미지를 병합하여 각각의 검출된 피사체의 재구성된 전체 이미지를 생성하고, 따라서 상기 피사체를 목표 또는 비-목표(non-target) 피사체로 배치, 계산, 식별 및 분류하는 단계

    를 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 피사체는 콜로이드 자성 입자를 수단으로 해서 자기적으로 표시된 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 콜로이드 자성 입자는 50에서 300 nm의 직경을 가지는 것인 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 피사체는 상기 피사체 위의 검출 가능한 표지(marker)용도의 각각 실질적으로 특정된 하나 이상의 형광성 물질로 표시된 것인 방법.
15. 제14항에 있어서 상기 검출 가능한 표지는 유기 및 무기 형광성 물질의 그룹 중에서 선택되는 것인 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 피사체는 세포인 것인 방법.
17. 제11항에 있어서 상기 자성 라인은 폭이 약 20에서 40 ㎛이고 약 10에서 20 ㎛의 거리로 분리되어 있는 것인 방법.
18. 제11항에 있어서, 상기 자성 라인은 상자성(paramagnetic) 물질로 구성된 것인 방법.
19. 제11항에 있어서, 상기 레이저 광원은 상기 표시된 피사체 위의 상기 형광성 물질을 여기하기에 적합한 파장을 가지는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, CCD는 상기 스테이지의 스캐닝 속도에 균형을 맞출 수 있는프레임 율을 가지는 것인 방법.
21. 자기적으로 검출 가능하게 표시되고 평면형 표면 위에 배치된 마이크론 크기의 피사체- 상기 표면 위에 자성 수단에 의해서 선형 어레이로 상기 피사체가 정렬됨 -를 자동적으로 스캐닝하기 위한 장치로서,

    (a) 하나 이상의 레이저 광원과,

    (b) 피드백 검출기를 가지는 편광된 빔 스플리터와,

    (c) 이색성(dichroic) 거울 조립체와,

    (d) 포커싱 렌즈 조립체와,

    (e) 선형 어레이를 형성하도록 x-방향에서 적어도 2개의 병렬적인 자화가능한 라인이 그 위에 부착되어 있는 시료 챔버로, 상기 시료 챔버는 상기 x-y 스테이지에 안정적으로 부착되어 있는 자석 시스템에 삽입되어서, 상기 수집되고 표시된 피사체를 상기 초점이 맞춰진 광 빔 안으로 계단식 및 디지털화된 모드로 수집하고 정렬하고 이송하기 위한 수단을 제공하는 시료 챔버와,

    (f) CCD 카메라 또는 하나 이상의 PMT 관을 수단으로 하여 디지털화된 서브이미지로 된 상기 표시된 피사체로부터 나오는 순차적으로 디지털화된 신호 이미지를 획득하기 위한 수단과,

    (g) 대응되는 z-y 스테이지 위치를 인덱스로 하여 상기 획득된 서브이미지를 컴퓨터 메모리 내에 저장하는 수단과,

    (h) 상기 피사체의 상기 얻어진 서브이미지를 병합하여 상기 선형 어레이 위의 상기 피사체의 전체 이미지를 재구성하는 수단

    을 포함하는 장치.
22. 제21항에 있어서, 상기 선형 어레이 위의 상기 병렬 자성 라인은 약 10 ㎛ 떨어지게 배치되어 있는 것인 장치.
23. 제21항에 있어서, 상기 자성 라인은 상자성 물질로 구성된 것인 장치.
24. 제21항에 있어서 상기 상자성 물질은 니켈인 것인 장치.
25. 제21항에 있어서, 상기 CCD는 상기 스테이지의 스캐닝 속도에 균형을 맞출 수 있는 프레임 율을 가지고, 따라서 적어도 0.2 ㎛의 해상도를 유지하는 것인 장치.