KR20030038690A - 응집이 최소화된, 흡입성 분무 건조 4-나선 다발 단백질분말 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고도로 분산성인 분무 건조 분말 조성물, 특히 폐로의 에어로졸화 전달을 위한 흡입성 건조 분말 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 분말은 (i) 응집으로부터 단백질을 보호하고, 또한 (ii) 흡입에 적절한 입자 (즉, 우수한 에어로졸 성능을 나타냄)를 제공하는 조건 하에 4α-나선 다발 단백질을 분무 건조시킴으로써 제조된다.

Description

응집이 최소화된, 흡입성 분무 건조 4-나선 다발 단백질 분말 {INHALEABLE SPRAY DRIED 4-HELIX BUNDLE PROTEIN POWDERS HAVING MINIMIZED AGGREGATION}

본 출원은 하기의 U.S 가출원을 우선권으로 청구하고, 이들의 내용은 본원에 전체적으로 참고로 반영된다: 특허출원 일련번호 60/223,144 (2000년 8월 7일 출원); 특허출원 일련번호 60/228,634 (2000년 8월 29일 출원); 및 특허출원 일련번호 60/240,478 (2000년 10월 13일 출원).

전통적으로, 흡입 요법은 경구 및 정맥내 투여와 같은 더욱 전통적인 약물 투여 경로와 비교하여, 생물요법제 및 통상적인 제약의 투여에서 비교적 작은 역할을 했다. 주사는 여전히 생물요법제 (예를 들어, 펩티드, 단백질 및 핵산)의 관습적인 경로이고, 주사와 관련된 많은 단점 (예를 들어, 불편, 불쾌, 바늘을 기초로 하는 전달 방법에 대한 환자의 혐오)으로 인해, 대안적인 투여 경로가 필요하다.

폐로의 전달은 바늘을 기초로 하는 투여에 비해 여러 장점을 제공할 수 있는 한 대안적인 투여 경로이다. 이러한 장점에는 환자의 자가 투여의 편리함, 바늘의 제거 등이 포함된다. 흡인된 단백질, 펩티드, DNA 및 소형분자로의 많은 임상전 및 임상 연구는 폐 내에서 및 전신적으로 모두 효능이 달성될 수 있음을 나타냈다. 그러나, 이같은 결과에도 불구하고, 흡입성 약물 제형물의 개발에 독특한 일군의 문제점으로 부분적으로 인해, 건강 케어 분야에서의 흡입 요법의 역할은 최근 예상만큼 성장하지 않았다. 특히, 폐로의 전달을 위한 건조 분말 제형물은 성가신 액체 제형물 및 추진제 구동 제형물에 비해 독특한 장점을 제공하지만, 응집되고 유동성 페노메논이 낮은 경향이 있고, 이는 건조 분말을 기재로 하는 흡입 요업의 효능을 상당히 감소시킨다.

최근, 건조 분말의 에어로졸 전달에 대한 관심 및 건조 분말의 공지된 제조 기술 (예를 들어, 동결건조, 공기건조, 및 공침전)의 일부 결점에 의해 부분적으로 추진되어, 분무 건조가 폐로의 투여를 위한 마이크로 크기의 분말을 제조하는 방법으로서 사용되었다 (Platz, R. 등, 국제 특허 공보 WO 96/32149). 분무 건조는 액체 공급원료의 분무화에 의해 생성된 미세분산 액적을 증발시켜 건조 분말을 형성시키기 위해 고온 기체 스트림을 사용한다. 분무 건조가 식품 및 약학 산업에서 건조 분말을 제조하기 위해 오랫동안 사용되어 왔지만, 치료용 단백질에의 적용은 분무 건조 공정 동안 특정 단백질이 열적으로 분해될 수 있다는 우려로 인해다소 제한되었다. 흡입에 적절한 생물학적 활성 분말을 제조하기 위해 거대분자를 기재로 하는 생물치료요법 제형물을 분무 건조시키는 것의 일반적인 유용성을 지지하는 증거가 증가하고 있지만 (Foster, L. 등, 국제 특허 공보 WO 98/16205; Platz, R. 등, 국제 특허 공보 WO 97/41833; Eljamal, M. 등, 국제 특허 공보 WO 96/32152; Eljamal, M. 등, 국제 특허 공보 96/32116; Eljamal, M. 등, 국제 특허 공보 95/24183; Bennett, D. 등, 국제 특허 공보 01/00312), 많은 펩티드 및 단백질들은 분무 건조의 가혹한 조건에 노출되었을 때 어느 정도 응집되는 경향이 있다 (언폴딩: unfolding).

특정 단백질, 특히 4-α-나선형 다발 상과에 속하는 것을 특징으로 하는 단백질 (예를 들어, hGH, INF-γ, INF-β, GM-CSF, M-CSF, IL-2, IL-4, IL-5)은 변성, 언폴딩, 응집 및 침전되어, 생물학적 활성을 손실하기가 매우 쉽다. 이러한 단백질들은 이중 오버핸드 루프 토폴로지를 갖는 α-나선 다발에 대해 업, 업, 다운, 다운, 역평행, 좌선형 (left-handed)으로 폴딩된 단백질 코어를 특징으로 하는, 광범위한 서열 및 구조적 (구성) 상동성을 공유한다. 따라서, 이들의 불안정성으로 인해, 이러한 부류의 단백질을 흡입을 위해 분무 건조 및 제형하는 것은 일련의 독특한 도전을 나타낸다.

분무 건조 공정의 여러 양상, 예컨대 전단 강도, 고온, 액적 내 단백질의 액체 공기 계면에의 노출 (표면 효과), 액체-장벽 상호작용 등이 이러한 부류의 단백질의 단백질 언폴딩에 대해 기여할 수 있고, 그 결과 흡입에 부적절한 (또는 적어도 최적이 아닌) 크기 범위의 응집된 형태의 단백질을 고도로 함유하는 건조 입자가 형성될 수 있다. 프로세싱시 4-α-나선 다발 단백질의 불안정성의 예는 셀 수 없이 많다. 재조합 콘센서스 α-인터페론 (rConIFN)은 에어-제트 연무에 의해 불안정화되고, 그 결과 연무 25 분 후 약 25 %의 초기 단량체성 단백질만이 잔존하면서, 불용성의 비공유 응집물이 급속하게 형성되는 것으로 나타났다 (Ip, A. Y. 등, J. Pharm Sci., 84 (10), 1995: 1210-1214). hGH와 같은 단백질의 분무 건조의 타당성 시험에서, 25 %의 단백질이 가공 동안 분해되는 것으로 발견되었지만, 0.1 % (w/v) 폴리소르베이트 20의 첨가는 분무 건조 동안 불용성 및 가용성 응집물의 형성을 약 70-85 % 감소시켰다 (Mumenthaler, M. 등, Pharm. Research, 11 (1), 1994: 12). 2가 아연 이온의 존재 하에서의 폴리소르베이트 20의 첨가는 분무 건조 시 hGH 분해를 더욱 억제하는 것으로 발견되었다 (Maa, Y-F. 등, J. Pharm. Sci., 87 (2), 1998: 152-159). 연속적인 주입에 의한 전달시 인터류킨-2의 생물활성 및 물리적 안정성의 연구에서, IL-2와 카테터 튜빙의 일시적인 표면 회합이 관찰되는 생물학성 활성 손실 (~90 % 손실)의 주요 원인인 것으로 동정되었다 (Tzannis, S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 5460 (1996).

4-α-나선 단백질 중에서, 성상 호르몬이 특히 불안정하고, 안정한 치료용 제형물에 도달하기 위해 많은 접근법이 현재까지 사용되어 왔다. 성장 호르몬의 분해 생성물에는 탈아미노화 또는 술폭실화 생성물 및 이량체 또는 중합체 형태물이 포함된다. 구체적으로, 성장 호르몬의 우세한 분해 반응은 (i) 직접적인 가수분해에 의한 또는 고리형 숙신이미드 중간체를 통한 탈아미노화로 다양한 양의 L-asp-hGH, L-isoasp-hGH, D-asp-hGH, 및 D-iso-asp-hGH가 형성됨, 및 (ii) 14 및125 위치에서의 메티오닌 잔기의 산화이다. 인간 성장 호르몬은 또한 14 및 125 위치에서 쉽게 산화된다. 더욱 중요하게는, 인간 성장 호르몬에서의 응집물 형성은 감소된 생물활성 및 증가된 면역원성에 이를 수 있기 때문에 해롭다 (Becker 등, Biotech. Appl. Biochem., 9: 478-487 (1987); Leppert, P., Moore, W. V., J. Clin. Endocrinol., 51: 691-697 (1980)).

따라서, 단백질 변성, 응집물의 형성, 및 유동성이 불량하고 분산성이 낮은 분말의 제조는 흡입 요법을 위한 에어로졸성 4-나선 다발 단백질 분말을 제조하기 위한 개발 노력을 계속 방해하였다. 또한, 폐 병리학을 방해하는 것으로 여겨지고 상피 자극물인 계면활성제를 사용함, 또는 너무 커서 폐 깊이까지 효율적으로 전달될 수 없는 입자가 생성될 수 있는, 분무 건조 전 용액의 단백질 고체 농도를 증가시킴과 같은 현재까지 사용된 다수의 접근법들은 흡입 요법용 분말 제형물에 바람직하지 않거나 적절하지 않다.

따라서, 4-나선 다발 단밸질을 폐로 전달하기 위한 개선된 흡입성 분말 에어로졸, 특히 에어로졸 성질이 우수하고 응집이 감소된 분무 건조 분말이 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 4-α 나선형 다발 단백질을 분무 건조시켜 호흡성 단백질 분말 제형물, 특히 (i) 분무 건조 동안 및 보관 시 단백질 응집에 저항성이 있고, (ii) 고도로 분산성이며, (iii) 흡입에 적절한 크기 범위 내인 4α-나선 다발 단백질 분말 제형물을 제공하는 독특한 조건의 발견을 기초로 한다. 사용되는 안정화 조건 또는 부형제는, 그렇지 않은면 (즉, 이같은 안정화 조건이 없는 경우에) 단백질이고도로 응집되도록 하는 공정 파라메터들이 (i) 10 % 미만의 전체 단백질 응집물, 더욱 바람직하게는 7 % 미만의 전체 응집물, 더더욱 바람직하게는 5 % 미만의 전체 응집물을 함유하고, (ii) 약 65 % 이상, 더욱 바람직하게는 약 70 % 이상의 방출량을 갖는 입자를 형성하기에 적절하도록, 종종 최적이도록, 단백질을 분무 건조의 극한 조건으로부터 차단시킨다. 본 발명의 분무 건조된 입자는 흡입 요법에 적합한 크기이고, 즉 MMAD가 10 마이크론 미만, 바람직하게는 5 마이크론 미만, 더욱 바람직하게는 3.5 마이크론 미만, 가장 바람직하게는 3 마이크론 미만이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 4-α 나선형 다발 단백질은 인간 성장 호르몬을 함유한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 분무 건조된 제형물은 분무 건조된 순물질 제형물과 비교하여 분말의 응집물 수준 (즉, 불용성 또는 가용성 응집물 수준)을 유지시키거나 저하시키는데 효과적인 안정화 부형제를 함유한다. 구체적으로, 안정화 부형제에는 당, 아미노산, 및 아미노산 2 내지 5 개로 이루어지는 올리고머가 포함된다.

한 구현예에서, 안정화 부형제는 수크로스 또는 라피노스이다.

또다른 구현예에서, 안정화 부형제는 류신, 이소류신 또는 노르류신이다.

또다른 구현예에서, 안정화 부형제는 트리류신이다.

본 발명의 한 특정 구현예에서, 안정화제는 분무 건조된 입자 내에 약 30 중량% 이하의 양으로 존재한다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 분무 건조된 분말은 인간 성장 호르몬과같은 4α-나선형 다발 단백질을 약 50 중량% 이상으로 함유한다.

본 발명의 분무 건조된 분말은 보관시 또한 안정하여, 특정 구현예에서, 40 ℃에서 1개월 동안 보관된 후 약 10 % 미만의 전체 응집물 함량을 유지한다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 4α-나선형 다발 단백질은 추가적인 안정화제의 존재가 요구되지 않는 최적화 분무 건조 조건 하에 분무 건조된다. 놀랍게도, 안정화제가 없는 분무 건조 방법론이 단백질 응집물 (가용성 및 불용성 응집물)이 최소량 (즉 10 % 미만)이고, 분산성이 우수하고 (65 % 이상, 바람직하게는 70 % 방출량), 공기역학적 입자 크기가 작은 (약 4 마이크론 미만의 MMAD) 분무 건조 입자의 제조에 효과적이다.

또다른 양상에서, 본 발명은 분무 건조로 유도된 4α-나선형 다발 단백질의 2차 구조에서의 변화를 최소화시키는, 즉 α-나선이 대부분 유지되는 제형물 및 분무 건조 조건을 제공한다. 특히, 본 발명은 FT IR 또는 원평광이색성 (circular dichroism: CD)에 의해 측정시, α-나선의 손실이 분무 건조 전의 천연 구조에 비해 약 50 % 이하, 바람직하게는 40 % 이하, 더욱 바람직하게는 30 % 이하, 더더욱 바람직하게는 약 10-20 % 이하인 분무 건조된 분말을 제공한다. 본 발명의 분무 건조된 제형물에서 사용하기에 특히 바람직한 구조 안정화제 및 용매는 단백질의 α-나선 함량을 보존하고 β-시트 형성을 반대하는 것들이고, 알콜, 특히 에탄올이 포함된다. 단백질의 α-나선성을 보존하는 본 발명의 이러한 양상의 한 구현예에서, 분무 건조 전 용액의 고체 농도는 2 ㎎/㎖ 미만이다.

본 발명의 이러한 및 기타 목적 및 특징은 첨부된 실시예와 함께 하기의 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다.

본 발명은 고도로 분산성인 분무 건조 분말 조성물, 특히 폐(肺)로의 에어로졸화 전달을 위한 흡입성 건조 분말 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 분말은 (i) 응집으로부터 단백질을 보호하고, 또한 (ii) 흡입에 이상적으로 적절한 입자 (즉, 우수한 에어로졸 성능을 나타냄)를 제공하는 조건 하에 4α-나선 다발 단백질을 분무 건조시킴으로써 제조된다.

I.정의

본원에서 사용된 용어들은 하기의 의미를 갖는다.

본원에서 사용된 성장 호르몬은 새, 소, 말, 인간, 양 및 돼지와 같은 임의의 기원으로부터의 성장 호르몬일 수 있고, 인간 성장 호르몬이 가장 바람직하다. 단백질 활성제, 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 4α-나선형 다발 단백질에 대해, 본 발명은 전체 길이 펩티드/단백질과 관련된 치료적 활성을 합당한 정도로 유지하는 정도로 천연 및 합성 또는 재조합 유래 단백질, 뿐만 아니라 이의 유사체의 용도를 예상한다.

본원에서 사용된 용어 "유사체"는 천연 (야생형) 인간 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 (즉, 단편), 첨가 (예를 들어, N- 또는 C-말단이 확장된 유도체 예컨대 Met-hGH) 또는 개질되고, 천연 (비합성) 내인성 펩티드의 생물활성의 약 10, 20, 30 또는 40, 바람직하게는 적어도 50 %, 60 % 또는 70 %, 가장 바람직하게는 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 100 % 또는 100 % 초과를 나타내는 단백질을 가리킨다.

"아미노산"은 아미노 기 및 카르복실산 기 모두를 함유하는 임의의 화합물을 가리킨다. 아미노 기가 카르복시 관능기에 인접한 위치에서 가장 통상적으로 발생하지만, 아미노 기는 분자 내 임의의 위치에 배치될 수 있다. 아미노산은 또한 부가적인 관능기, 예컨대 아미노, 티오, 카르복실, 카르복스아미도, 이미다졸등을 함유할 수 있다. 아미노산은 합성 또는 천연 발생일 수 있고, 다양한 비의 입체이성질체를 포함하여, 라세믹 또는 광학 활성 (D- 또는 L-) 형태로 사용될 수 있다.

"류신"은 D-류신, L-류신, 라세믹 류신, 및 다양한 비의 두 거울상이성질체를 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 "순물질" 제형물은 4-α 나선형 단백질 및 임의로 버퍼 (전형적으로 건조 분말의 0-15 중량%)를 함유하고, 추가적인 부형제가 실질적으로 없는, 즉 약 1 중량% 미만의 추가적인 부형제를 함유하는 분무 건조 분말을 가리킨다.

"펩티드"는 각각 펩티드 결합으로 연결된 약 100 개 미만의 아미노산으로 구성된다. 펩티드는 호모- 또는 헤테로-펩티드 (즉, 상기 정의된 동일 또는 상이한 아미노산 잔기로 구성됨)일 수 있고, 2 개의 아미노산에서 약 100 개의 아미노산으로 길이가 다양할 수 있다.

"디펩티드"는 본원에서 이량체로 또한 언급되고, 펩티드 결합에 의해 연결된 2 개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 가리킨다.

"트리펩티드"는 본원에서 삼량체로 또한 언급되고, 3 개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 가리킨다.

"단백질"은 100 개 이상의 아미노산으로 구성된 거대분자이다.

"전체 단백질 응집물"은 각각 크기 배제 크로마토그래피 및 UV 분광학에 의해 결정된 100 % 단량체성 4-α 나선형 단백질에 대한 가용성 및 불용성 단백질 응집물의 백분율을 가리킨다.

"응집물 수준"은 달리 지적되지 않는다면 가용성 또는 불용성 응집물을 가리킨다.

"표면 활성" 물질은 이러한 물질이 용해된 액체의 표면 장력을 감소시키는 능력을 특징으로 하는 표면 활성 (예를 들어, 표면 장력학에 의해 측정)을 갖는 것이다. 액체와 또다른 상 간의 경계면과 관련된 표면 장력은 이에 의해 표면 분자가 내향성을 나타내는 액체의 성질이다.

"속효성" 건조 분말은 흡입에 의한 투여시 조절 방출 또는 서방성 방출 특징을 갖지 않는 분말이다.

본원에서 사용된 "수성 용매"는 물, 또는 물과 하나 이상의 수혼화성 공용매를 함유하는 혼합 용매계를 가리킨다.

"건조 분말"은, 분말화된 조성물 내의 활성제의 유형에 따라, 전형적으로 약 10 % 미만의 수분, 바람직하게는 7 % 미만의 수분, 더욱 바람직하게는 약 5-6 % 수분, 더더욱 바람직하게는 약 3 % 미만의 수분, 가장 바람직하게는 2 % 미만의 수분을 함유하는 분말 조성물을 가리킨다.

"폐로의 전달에 적합한 흡입성" 건조 분말은 (i) 흡입 장치 내에 또는 흡입 장치에 의해 용이하게 분산될 수 있고, (ii) 적어도 일부의 입자가 폐에 도달하여 폐포 내로 투과될 수 있도록 대상에게 흡입될 수 있는 고체 (즉, 용액이 아님) 입자를 함유하는 조성물을 가리킨다. 이같은 분말은 "호흡성" 또는 "흡입성"인 것으로 간주된다.

"에어로졸화" 입자는, 수동 또는 활성 흡입 장치에 의해 기체 스트림 내로 분배되었을 때, 일부의 흡입된 입자가 폐에 도달하도록 적어도 일부의 입자가 환자에게 흡입되기에 충분한 시간 동안 기체 내에 현탁되어 유지되는 입자이다.

"방출량 (Emitted Dose)" 또는 "ED"는 발사 또는 분산 이벤트 후 적절한 흡입기 장치로부터 약물 제형물의 전달의 지표를 제공한다. 더욱 구체적으로, 건조 분말 제형물에 대해, ED는 단위 투여 포장물로부터 드로잉되어 흡입기 장치의 마우스피스를 나오는 분말의 백분율의 측정이다. ED는 흡입기 장치에 의해 전달되는 용량 대 공칭 용량 (즉 발사 전에 적절한 흡입기 장치 내로 놓이는 단위 용량 당 분말의 질량)의 비로 정의된다. ED는 실험적으로 결정되는 파라메터이고, 모(母) 투여와 유사한 실험관내 장치 설비를 사용하여 전형적으로 결정한다. ED 값을 결정하기 위해, 전형적으로 단위 투여 형태의 공칭 용량의 건조 분말을 적절한 건조 분말 흡입기 (예컨대 Inhale Therapeutic Sysmtems의 U.S. 특허 5,785,049에 기술된 것) 내에 놓은 후, 이를 작동시켜, 분말을 분산시킨다. 이어서 생성된 에어로졸 클라우드를 진공에 의해 장치로부터 드로잉시키고, 이는 장치 마우스피스에 부착된 칭량된 필터 상에 포착된다. 필터에 도달한 파우더의 양이 방출량을 구성한다. 예를 들어, 흡입기 장치 상에 놓인 5 ㎎ 건조 분말 함유 제형물에 대해, 분말의 분산으로 4 ㎎의 분말이 상기 기술된 바와 같은 칭량된 필터 상에 회수되면, 건조 분말 조성물에 대한 방출량은 하기와 같다: 4 ㎎ (전달량)/5 ㎎ (공칭 용량) ×100 = 80 %. 비균질성 분말에 대해, ED 값은 건조 분말보다는 발사 후 흡입기 장치로부터의 약물 전달의 지표를 제공하고, 전체 분말중량보다는 약물의 양을 기초로 한다. 유사하게 MDI 제형물에 대해, ED는 제형물로부터 드로잉되어 흡입기 장치의 마우스피스를 나오는 약물의 백분율에 해당된다.

본 발명의 문맥에서 "계면활성제가 없는"은 약 0.1 중량% 미만의 계면활성제를 함유하는 분무 건조 분말을 가리킨다.

"미립자 용량 (Fine Particle Dose)" (FPD_{<3.3 ㎛})은 에어로졸 품질의 측정을 제공하고, 케스케이드 충격에 의해 결정된 3.3 마이크론 미만 (FPD_{<3.3 ㎛})인 분말의 양으로 정의된다. 이러한 파라메터는 1 cfm (28.3 L/분)의 유속으로 구동되었을 때 앤더슨 (Anderson) 충격기의 단계 3 미만의 전체 질량에 해당되고, 환자에게 전달되는 3.3 마이크론 미만의 용량의 실험관내 추정을 제공한다.

"미립자 분획 (Fine Particle Fraction)" (FPF_{<3.3 ㎛})은 단위 제형물 (예를 들어, 블리스터 팩)로부터 폐 깊이까지로의 에어로졸화 분말 전달 효능의 측정을 제공하고, 분당 28.3 리터의 진공으로 구동되는 쇼트 스택 (short stack) 앤더슨 케스케이드 충격기를 사용하여 실험적으로 결정된다. FPF는 단위 제형물 내에 함유된 분말의 질량 (㎎)에 대한 입자 크기가 3.3 마이크로미터 미만인 에어로졸 분말의 전체 질량 (㎎)으로 정의되고, 백분율로 표시된다.

"분산성" 또는 "에어로졸성" 분말은 ED 값이 약 30 % 이상, 더욱 바람직하게는 40-50 %, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 50-60 % 이상인 것이다. 에어로졸성이 우수한 분말은 ED 값이 적어도 약 65 % 이상이다.

"질량 중위 직경 (Mass median diameter)" 또는 "MMD"는 본 발명의 분말이 일반적으로 다분산성 (즉. 광범위한 입자 크기로 구성됨)이므로 평균 입자 크기의 측정이다. 본원에 보고된 MMD 값은 원심분리 침강에 의해 결정되지만, 임의의 통상적으로 사용되는 다수의 기술을 평균 입자 크기의 측정을 위해 사용할 수 있다 (예를 들어, 전자 현미경, 광산란, 레이저 회절).

"질량 중위 공기역학적 직경 (Mass median aerodynamic diameter)" 또는 "MMAD"는 분산된 입자의 공기역학적 크기의 측정이다. 공기역학적 직경은 침전 거동의 관점에서 에어로졸화 분말을 기술하기 위해 사용되고, 공기 내에서 입자와 동일한 침전 속도를 갖는 단위 밀도 구형물의 직경이다. 공기역학적 직경은 입자의 입자 형상, 밀도 및 물리적 크기를 포함한다. 본원에서 사용되는 MMAD는, 달리 표시되지 않는다면, 케스케이드 충격에 의해 결정된 에어로졸화 분말의 공기역학적 입자 크기 분포의 중간점 또는 중위수를 가리킨다.

"약학적으로 허용가능한 염"에는, 제한되지는 않지만, 무기 산으로 제조된 염, 예컨대 클로라이드, 술페이트, 포스페이트, 디포스페이트, 브로마이드, 및 니트레이트 염, 또는 유기 산으로 제조된 염, 예컨대 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 숙시네이트, 에틸숙시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄술포네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 파라-톨루엔술포네이트, 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트, 뿐만 아니라, 에스톨레이트, 글루셉테이트 및 락토비오네이트 염이 포함된다. 유사하게, 약학적으로 허용가능한 양이온을 함유하는 염에는, 제한되지는 않지만, 리튬, 나트륨, 칼륨, 바륨, 칼슘, 알루미늄,및 암모늄 (알킬 치환 암모늄 포함)이 포함된다.

"약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체"는 본 발명의 조성물에 임의로 포함될 수 있고, 대상, 특히 대상의 폐에 대한 현저한 독물학적 효과 없이 폐로 전달될 수 있는 부형제를 가리킨다.

"약리학적 유효량" 또는 "생리학적 유효량"은 본원에 기술된 특정 건조 분말 조성물 내에 존재하는 4-α 나선 다발 단백질의 이같은 조성물이 폐로 투여될 때 원하는 수준의 단백질을 치료될 대상의 혈류 내에 제공하여 예상된 생리학적 반응을 제공하는데 필요한 양이다. 정확한 양은 다양한 요소, 예를 들어, 4-α 나선 다발 단백질, 조성물의 활성, 사용되는 특정 흡입기 장치, 분말의 물리적 특성, 계획적인 환자 사용 (즉, 하루에 투여되는 1회 분량의 수), 환자 고려사항 등에 따라 좌우될 것이고, 본원에 제공된 정보를 기초로 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.

II.제형물 성분

본 발명은 분자, 특히 4α-나선형 다발 단백질과 같은 단백질을 분무 건조시켜 안정하고 비응집성인 호흡성 건조 분말을 제조하는 최적의 조건을 출원인이 발견한 것을 부분적으로 기초로 한다. 본 발명이 직면한 문제는 단백질 응집, 탈아미드화 (분해) 및 변성에 영향을 미치는 요소들을 공기역학적 입자 크기 및 입자 분산성에 영향을 미치는 것들, 뿐만 아니라 보관 안정성과 균형잡히게 하는 것이다. 이러한 요소들은 종종 반대 방향으로 작용하여, 최소화된 단백질 응집을 제공하는 조건의 결과로 종종 흡입에 적절하지 않은 성질 (예를 들어, 큰 입자 크기, 낮은 분산성)을 갖는 입자가 생성된다.

하기에 상세히 기술되는 특정 분무 건조 공정 파라메터와 함께 사용될 때 분무 건조의 가혹한 조건으로부터 단백질을 차단/차폐시키는데 효과적이어서 그렇지 않으면 단백질이 고도로 응집될 수 있는 조건이 호흡성 입자의 형성에 적절하도록, 종종 최적이도록 하는 바람직한 안정화 부형제 및 제형물 성분이 하기에 기술된다. 어떠한 특정 이론에도 구속되지 않고, 안정화제는 광범위한 방식으로, 예를 들어, 표면 장력의 감소, 확산 증가, 단백질과의 소수성/이온성 회합에 의한 언폴딩에 대한 안정화, 버퍼화 등에 의해 작용할 수 있다. 따라서, 이러한 안정화제들은 단백질 응집을 최소화시키기 위해서 뿐만 아니라, 생성된 분무 건조된 조성물의 에어로졸 기능을 증가시키기 위해, 또한 일부 경우에는 에어로졸성 제형물, 특히 에어로졸성 4α-나선형 다발 단백질 제형물이 기존에 공지되지 않았거나 수득하기 어려웠던 상황에서 에어로졸성 제형물을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 분무 건조 조성물의 성분들이 하기에 기술될 것이다.

A.4α-나선형 다발 단백질

본 발명은 단백질 약제, 특히 4α-나선형 다발 단백질에 관한 것이지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 구조적 부류에 속하는 단백질에는 G-CSF, 성장 호르몬, IFN-γ, IFN-β, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5 및 M-CSF가 포함된다. 서열 수준에서 한정된 상동성을 갖지만, 이러한 성장 인자 및 사이토카인은 오버핸드 루프 연결을 갖는 4 개의 나선형 토폴로지 (A-D)를 공유한다. 더욱 구체적으로, 이러한 단백질들은 이중 오버핸드 루프 토폴로지와 함께 업-업-다운-다운, 역평행,좌선형의 4 개의 α-나선형 다발을 특징으로 하는, 공통적인 폴드 (fold)를 이들의 형태적 구조 내에 갖는다. 4α 나선형 단백질의 한 예인 IL-2는 이의 천연 구조 내에 약 42-63 %의 α 나선을 갖고, β-시트는 거의 없거나 없다 (Tzannis, S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 5460-5465 (1996). 본 발명의 목표 중 하나는 β-시트 제형물은 분무 건조 동안 저해되면서 단백질 α-나선 2차 구조가 유지된 호흡성 단백질 분말을 제조하는 것이다.

성장 호르몬, 특히 인간 성장 호르몬과 같은 성장 인자가 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용하기에 특히 적절하다. 인간 성장 호르몬 (hGH)은 박동성 방식으로 뇌하수체 전엽에서 분비되는 단백질이고, 성장의 조절에 필수적이다. hGH는 분자량이 약 22 kDa이고 pI가 약 5.3인 아미노산 191 개의 단일 사슬 폴리펩티드이다. hGH는 일생 동안 골격 성장을 조절하고, 신체 영양소인 탄수화물, 단백질 및 지질의 정상적인 대사에 필수적이다. 이는 지방을 더욱 효율적인 에너지원으로 사용함으로써 단백질 합성 (동화작용)을 증가시키고 단백질 파괴 (이화작용)를 감소시키는 경향이 있어 단백질 대사에서 중요한 역할을 한다. 분비되는 천연 hGH의 양은 어린이에서 높고, 사춘기 동안에 최고 수준에 도달한 후, 성인기 동안 최저 수준으로 감소한다. 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 인간 성장 호르몬은 전형적으로 재조합에 의해 제조되거나 (예를 들어 대장균에 의해) 또는 뇌하수체에서 유래된다.

제형물 내의 4α-나선형 다발 단백질의 양은 단위 용량 당 치료적 유효량의 단백질을 전달하여 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 양일 것이다. 실제로,이는 특정 제제, 이의 활성, 치료될 상태의 심각도, 환자 집단, 투여 요구사항, 및 원하는 치료 효과에 따라 광범위하게 변할 것이다. 조성물은 일반적으로 약 1 중량% 내지 약 99 중량% 활성 단백질, 전형적으로 약 2 중량% 내지 약 95 중량% 활성 단백질, 더욱 전형적으로는 약 5 중량% 내지 85 중량% 4-α 나선형 다발 단백질을 함유할 것이고, 이는 또한 조성물 내에 함유된 부형제/첨가제의 상대적인 양에 좌우될 것이다. 더욱 구체적으로, 분무 건조된 조성물은 전형적으로 하나 이상의 하기 백분율의 활성제를 함유할 것이다: 약 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량% 이상의 4-α 나선 다발 단백질. 바람직하게는, 분무 건조된 분말은 약 50 중량% 이상, 예를 들어 약 50 내지 100 중량%의 4-α 나선 다발 단백질 예컨대 인간 성장 호르몬을 함유할 것이다. 본 발명의 특정 구현예에서 분무 건조된 분말은 약 60 중량% 이상의 4-α 나선 다발 단백질, 더욱 바람직하게는 약 70 중량% 이상의 4-α 나선 다발 단백질 (예를 들어, 약 70 %-100 % 활성 단백질), 더욱 바람직하게는 약 80 중량% 이상의 4-α 나선 다발 단백질 (80-100 중량% 활성 단백질), 또는 약 90-100 중량%의 4-α 나선 다발 단백질을 함유할 것이다. 일반적으로, 높은 단백질 함량이 입자에서 요망된다. 본 발명의 분무 건조된 조성물은 단백질, 예를 들어 4-α 나선 다발 단백질에 특히 유용하고, 이는 0.001 ㎎/일 내지 100 ㎎/일의 용량, 바람직하게는 0.01 ㎎/일 내지 75 ㎎/일의 용량, 더욱 바람직하게는 0.10 ㎎/일 내지 50 ㎎/일의 용량으로 전달된다.

B.안정성 강화 부형제

본 발명의 조성물은 일부 경우에 하나 이상의 보호성 또는 안정화 부형제를함유할 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 한 양상은, 대표적 단백질인 인간 성장 호르몬 (hGH)를 사용한 실시예에서 설명된 바와 같이, 최적화된 분무 건조 공정과 함께 사용되는 경우 특정 부형제 또는 첨가제 (예를 들어, 아미노산 예컨대 류신, 올리고머 예컨대 트리류신, 당 예컨대 수크로스, 만니톨 및 라피노스, 및 염 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨 등)가 단백질 응집을 감소시키는 것뿐만 아니라 생성된 분말화 조성물의 분산성을 증가시키고 공기역학적 크기를 감소시키는 능력이 우수하다는 출원인의 발견을 기초로 한다, 또한, 본 발명의 여러 대표적 조성물은 장기간의 보존에도 안정하였다. 즉, 보관시 응집물 수준이 실질적으로 증가하지 않았다.

대표적인 안정화제로는 아미노산, 펩티드 및 특히 2-9 개의 아미노산으로 이루어지는 올리고머, 더욱 바람직하게는 2-5개의 아미노산으로 이루어진 올리고머, 및 폴리펩티드가 포함되고, 이들 모두는 동종 또는 이종일 수 있다. 4α-나선형 다발 단백질 안정화제로서 사용하기 위한 아미노산에는 글리신 (gly), 알라닌 (ala), 발린 (val), 노르발린 (2-아미노펜탄산), 2-아미노헵탄산, 류신 (leu), 이소류신 (ile), 메티오닌 (met), 프롤린 (pro), 페닐알라닌 (phe), 트립토판 (trp), 세린 (ser), 트리오닌 (thr), 시스테인 (cys), 타이로신 (tyr), 아스파라긴 (asp), 글루탐산 (glu), 라이신 (lys), 아르기닌 (arg), 히스티딘 (his), 노르류신 (nor), 및 이들의 개질물이 포함된다. 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 2-아미노헵탄산, 페닐알라닌, 및 트립토판과 같은 아미노산이 바람직하다. 특히 바람직한 안정화 아미노산/부형제는 류신, 이소류신, 및 노르류신이다.

바람직한 아미노산 안정화제의 특성을 고려하여, 물에서의 용해도가 비교적 낮은 아미노산, 예를 들어, 용해도가 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 75 ㎎/㎖인 아미노산이 바람직하다. 이론에 제한되지 않고, 감소된 수용해성은 생성된 분무 건조된 분말에서 수분 흡수의 감소 및 지연된 결정화를 제공하고, 이둘 모두는 본 발명의 호흡성 분말에 바람직한 특성이다 (예를 들어, 이와 관련하여, 글리신보다 알라닌이 바람직하고, 알라닌보다 히스티딘이 바람직하고, 히스티딘보다 류신이 바람직함). 반데르발스 부피가 다소 큰, 예를 들어 약 100 A³를 초과하는 아미노산, 예를 들어, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌 및 페닐알라닌이 또한 바람직하다. 반데르발스 부피의 증가는 생성된 분무 건조 약학적 분말의 증가된 Tg와 상관되는 경향이 있고, 따라서 더 큰 보관 안정성을 가리킨다. 소수성 아미노산, 예컨대 류신 (leu), 발린 (val), 이소류신 (isoleu), 트립토판 (try), 알라닌 (ala), 메티오닌 (met), 페닐알라닌 (phe), 타이로신 (tyr), 히스티딘 (his), 및 프롤린 (pro)이 또한 바람직하다. 아미노산 안정화제에 바람직한 또다른 요소는 물의 표면 장력을 감소시키는 능력이고, 이는 생성된 분무 건조 입자의 더 낮은 MMD 및 감소된 단백질 응집과 상관된다; 물의 표면 장력의 저하에 효과적인 계면활성 아미노산에는 아스파라긴, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 류신 및 발린이 포함된다. 유리 전이 온도가 40 ℃ 초과, 더욱 바람직하게는 50 ℃ 초과, 더더욱 바람직하게는 60 ℃ 초과, 가장 바람직하게는 70 ℃ 이상인 아미노산이 또한 바람직하다. 이같은 아미노산이 분무 건조된 분말에 포함되면 전형적으로 에어로졸성능, 특히 MMAD 및 ED가 약 10-25 % 개선된다. 특히 바람직한 한 아미노산은 표면 활성으로 인해 분무 건조된 입자의 표면 상에 농축되는 경향이 있는, 즉 분무 건조된 단백질 입자의 표면 상의 류신의 농도가 전형적으로 벌크 분말보다 더 높은 류신이다. 분무 건조된 단백질 입자의 표면 상에 농축되는 경향이 있는 다른 표면 활성 아미노산에는 아스파라긴, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 노르류신 및 발린이 포함된다. 이는 본 발명의 안정화제의 또다른 바람직한 성질- 약학적 제제, 예를 들어 4-α 나선형 단백질을 분무 건조 동안 보호 또는 차단하는 경향을 나타낸다. 이러한 특정 구현에에서, 약학적 제제는 액적 표면 상의 안정화제 분자의 존재에 의해 분무 건조의 가혹한 조건으로부터 차폐된다. 이러한 예에서, 안정화제는 캡슐화제가 아니고, 불연속 코팅을 형성하지 않고, 그보다는 분무 건조 동안 높은 농도로 액적의 표면 상에 단순히 축적되어, 그 결과 안정화제의 표면 농도가 강화된 입자가 생성된다.

본원에 전체적으로 참조로 반영된 Inhale Therapeutic System의 국제 특허 공보 WO 01/32144에 기술된 바와 같은, 2개 이상의 류실 잔기를 함유하는 디펩티드 및 트리펩티드가 또한 안정화제로 사용하기에 바람직하다. 대표적인 이러한 부류의 안정화제는 디류신 및 트리류신이다. 디-류실 함유 삼량체는 서로 인접한 두 개의 류실 잔기 (1 및 2 위치)를 함유할 수 있거나, 또는 이들은 삼량체의 말단 (1 및 3 위치를 차지함)을 형성할 수 있다. 삼량체 내에 함유된 나머지 아미노산은 상기 섹션 I에서 정의된 바와 같은 임의의 아미노산일 수 있다. 글리신 (gly), 알라닌 (ala), 발린 (val), 류신 (leu), 이소류신 (ile), 메티오닌 (met),프롤린 (pro), 페닐알라닌 (phe), 트립토판 (trp), 세린 (ser), 트레오닌 (thr), 시스테인 (cys), 타이로신 (tyr), 아스파라긴 (asp), 글루탐산 (glu), 라이신 (lys), 아르기닌 (arg), 히스티딘 (his), 노르류신 (nor), 및 이들의 개질물과같은 아미노산이 적절하다. 바람직하게는, 디-류실 함유 삼량체에 대해, 삼량체의 제 3 아미노산 성분은 하기의 것들 중 하나이다: 류신 (leu), 발린 (val), 이소류신 (isoleu), 트립토판 (try) 알라닌 (ala), 메티오닌 (met), 페닐알라닌 (phe), 타이로신 (tyr), 히스티딘 (his), 및 프롤린 (pro). 본 발명에서 사용하기에 대표적인 삼량체에는 하기의 것들이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다: leu-leu-gly, leu-leu-ala, leu-leu-val, leu-leu-leu, leu-leu-ile, leu-leu-met, leu-leu-pro, leu-leu-phe, leu-leu-trp, leu-leu-ser, leu-leu-thr, leu-leu-cys, leu-leu-tyr, leu-leu-asp, leu-leu-glu, leu-leu-lys, leu-leu-arg, leu-leu-his, leu-leu-nor, leu-gly-leu, leu-ala-leu, leu-val-leu, leu-ile-leu, leu-met-leu, leu-pro-leu, leu-phe-leu, leu-trp-leu, leu-ser-leu, leu-thr-leu, leu-cys-leu, leu-try-leu, leu-asp-leu, leu-glu-leu, leu-lys-leu, leu-arg-leu, leu-his-leu, 및 leu-nor-leu.

상기 기술된 아미노산의 임의의 조합으로 구성되는 이량체 및 삼량체 또한 본 발명에서 사용하기에 적절하다. 2 개 이상의 하기 아미노산을 함유하는 이량체 및 삼량체가 가장 바람직하다: 류신, 이소류신, 발린, 노르류신, 페닐알라닌, 및 트립토판.

물에의 제한된 용해도로 인해 덜 바람직하지만, 본 발명에서 사용하기 위한추가적인 안정성 및 에어로졸 성능 강화 펩티드는 상기 기술된 아미노산의 임의의 조합을 함유하는 4량체 및 5량체이다. 더욱 바람직하게는, 4량체 또는 5량체는 2 개 이상의 류신 잔기를 함유할 것이다. 류신 잔기는 펩티드 내에서 임의의 위치를 차지할 수 있고, 나머지 (즉 류실이 아닌) 아미노산 위치는 상기 기술된 임의의 아미노산이 차지하고, 단 생성된 4량체 또는 5량체는 수용해도가 약 1 ㎎/㎖ 이상이다. 바람직하게는, 4량체 또는 5량체 내의 류실이 아닌 아미노산은 라이신과 같은 친수성 아미노산이어서, 펩티드의 수용해성을 증가시킨다.

유리 전이 온도가 약 40 ℃ 초과, 더욱 바람직하게는 50 ℃ 초과, 더더욱 바람직하게는 60 ℃ 초과, 가장 바람직하게는 70 ℃ 초과인 디펩티드 및 트리펩티드 또한 바람직하다.

폴리아미노산, 특히 임의의 본원에 기술된 아미노산을 함유하는 것들 또한 안정화제로서 사용하기에 적절하다. 폴리-라이신, 폴리-글루탐산, 및 폴리(lys, ala)과 같은 폴리아미노산이 바람직하다.

탄수화물 부형제 탄수화물 (예를 들어, 당, 유도체화 당 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당, 및 당 중합체), 특히 당이 또한 분무 건조 동안 단백질을 보호하기 위해 사용하기에 적절하다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 탄수화물 부형제에는, 예를 들어, 단당류 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨 (글루시톨),피라노실 소르비놀, 미오이노시톨 등이 포함된다. 비환원당, 분무 건조된 고체 내의 단백질과 다공성 또는 유리질 상을 형성할 수 있는 당, 및 Tg가 비교적 높은 당 (예를 들어, 40 ℃ 초과, 바람직하게는 50 ℃ 초과, 더욱 바람직하게는 60 ℃ 초과, 더더욱 바람직하게는 70 ℃ 초과, 가장 바람직하게는 80 ℃ 이상의 Tg) 이 바람직하다. 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 수크로스, 만니톨 및 트레할로스가 안정화 부형제로서 특히 바람직하다.

전해질, 특히 강전해질 또한 4-α 나선형 단백질의 분무 건조에 유익하다. 출원인이 수행한 예비 조사에서, 전해질 (예를 들어, 임의수의 약학적으로 허용가능한 무기 염 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨 등)을 용액의 이온 강도를 조절하기 위해 4-α 나선형 단백질을 함유하는 액체 제형물 내로의 혼입시키는 것이 분무 건조 동안 단백질을 "차단"하는데 또한 효과적이라는 것이 발견되었다. 이론에 제한되지 않고, 용액 내의 증가된 전해질 농도로 인해, 이온이 분무 건조 동안 액적 표면 상에 농축되는 경향이 있어, 분무 건조 공정 동안 액적 코어 내의 활성 단백질을 보호 또는 차폐하는 것으로 추정된다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 추가적인 부형제 및 첨가제는 Inhale Therapeutic Systems의 국제 공보 WO 96/32096 및 ["Handbook of Pharmaceutical Excipients" 제3판, Kibbe, A. H. Editor (2000)]에서 제공된다. 유리 전이 온도 (Tg)가 약 35 ℃ 초과, 바람직하게는 약 40 ℃ 초과, 더욱 바람직하게는 약 45 ℃ 초과, 가장 바람직하게는 약 55 ℃ 초과인 부형제가 바람직하다.

대표적인 단백질 부형제에는 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합인간 알부민 (rHA), 젤라틴, 카제인, 헤모글로빈 등이 포함된다. 본 발명의 조성물은 버퍼 또는 pH 조절제, 필수적이지는 않지만 전형적으로 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염을 또한 함유할 수 있다. 대표적인 버퍼로는 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄소산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 유기산 염이 포함된다. 기타 적절한 버퍼로는 트리스, 트로메타민 히드로클로라이드, 보레이트, 글리세롤 포스페이트 및 포스페이트가 포함된다. 글리신과 같은 아미노산 또한 적절하다.

본 발명의 분무 건조된 조성물은 전형적으로 속효성인 것으로 간주된다. 즉, 이들은 흡입에 의한 투여시 조절방출 또는 서방성 방출 특성을 나타내지 않는다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 미소구체성이 아니고 리포좀성이 아니며, 입자는 중공성이 아닌 경향이 있다. 또한, 본 발명의 분무 건조된 인간 성장 호르몬 입자는 모델 단백질인 락테이트 탈수소효소에서 분무 건조 제품의 보관 안정성에 해로운 효과를 갖는 것으로 나타난 계면활성제가 없다 (Adler, M.; Lee, G., J. Pharm Sci: Feb 88(2): 199-208 (1999)). 놀랍게도, 출원인은 기존의 연구에서 건조 동안 단백질 응집의 방지에 필수적인 것으로 나타났던 계면활성제의 부재 하에 인간 성장 호르몬의 응집되지 않은 분무 건조 분말을 제조하였다 (Maa, Y-F. 등, J. Pharm Sci, 87(2): 152-159 (1998)).

조성물은 향료제, 미각 차폐제, 무기 염 (예를 들어, 염화나트륨), 항균제 (예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드), 감미료, 항산화제, 정전기 방지제, 계면활성제 (예를 들어, 폴리소르베이트 예컨대 "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80", 및 플루로닉F68 및 F88, BASF 공급, 단 약 0.1 중량% 미만의 수준으로 사용됨), 소르비탄 에스테르, 지질 (예를 들어, 인지질 예컨대 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 단 바람직하게는 리포좀 형태가 아님), 지방산 및 지방산에스테르, 스테로이드 (예를 들어, 콜리스테롤), 및 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA, 아연 및 기타 이같은 적절한 양이온)을 추가로 함유할 수 있다. 4-α 나선형 단백질 분말에서 사용되는 경우, 플루로닉은 전형적으로 약 1 중량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.1 중량% 미만의 백분율로 존재한다. 본 발명의 한 바람직한 부형제 조합물은 F68과 같은 플루로닉 및 트리류신을 함유한다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 바람직한 양이온에는 알루미늄, 마그네슘, 칼슘, 아연 및 마그네슘이 포함된다. 이같은 양이온은, 존재하는 경우, 약 50:1 양이온 (mol)/단백질 (mol) 내지 약 1:1, 더욱 바람직하게는 약 20:1 내지 2:1 범위의 상대적 몰량으로 전형적으로 존재한다. 양이온 대 단백질의 몰비가 약 2:1, 7:1, 10:1, 15:1, 및 20:1인 조성물이 특히 바람직하다. 아연 또는 다른 2가 양이온의 부재 하에서도 가용성 응집물의 수준이 무의미한 분무 건조된 제형물이 달성되지만, 아연 양이온이 이러한 비에서 특히 바람직하다. 바람직하게는, 조성물에는 투과 증강제가 없거나, 또는 존재한다면 이같은 증강제는 전형적으로 소량, 예를 들어, 약 10 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 미만으로 건조 고체 내에 존재한다. 본 발명에 따른 조성물에서 사용하기에 적절한 기타 약학적 부형제 및/또는 첨가제는 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 제19판, Williams & Williams, (1995)], 및 ["Physician's Desk Reference", 제52판,Medical Economics, Montvale, NJ (1998)]에 열거되어 있다.

일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 약 1 중량% 내지 약 99 중량%의 안정화제, 바람직하게는 약 5-98 중량%의 안정화제, 더욱 바람직하게는 약 15-95 중량%의 안정화제를 함유할 것이다. 더더욱 바람직하게는, 분무 건조된 조성물은 약 0-40 중량%의 안정화제, 더욱 바람직하게는 0-30 중량%의 안정화제를 함유할 것이고, 예를 들어, 바람직한 조성물은 임의의 하기 양의 안정화제를 함유할 것이다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 중량%. 일반적으로, 높은 단백질 농도가 분무 건조된 입자, 특히 분무 건조된 인간 성장 호르몬에 요망된다. 따라서, 약 30 중량% (고체) 미만의 농도로 이상적으로 존재하기 때문에, 본 발명의 안정화제는 분무 건조 동안 단백질을 보호하는데 전형적으로 매우 효과적이다. 전형적으로, 최적량의 안정화제는 실험적으로, 즉 다양한 양의 안정화제 (저농도에서 고농도 범위)를 함유하는 조성물을 제조하고, 생성된 분무 건조된 조성물의 단백질 응집, MMAD 및 분산성을 시험한 후, 추가로 단백질 응집 또는 보관 안전성에 현저한 역효과 없이 최적의 에어로졸 성능이 수득되는 범위를 조사함으로써 결정된다.

III.건조 분말의 제조

본 발명의 건조 분말 제형물은 단백질 응집의 정도를 최소화하는 조건 하에 분무 건조시킴으로써 제조된다. 제형물의 분무건조는, 예를 들어, ["Spray Drying Handbook", 제5판, K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1991)], 및 Platz, R. 등의 국제 특허 공보 WO 97/41833 (1997) 및 WO 96/32149 (1996)에기술된 대로 수행될 수 있고, 상기 문헌들의 내용은 본원에 참조로 반영된다.

약학적 제제, 바람직하게는 4-α 나선형 단백질 예컨대 성장 호르몬은 사용되는 pH 범위에서의 활성 단백질의 용해도에 따라 수용액 또는 현탁액으로부터 전형적으로 분무된다. 이러한 접근법을 사용하여, 4-α 나선 다발 단백질을 먼저 생리학적으로 허용가능한 버퍼를 임의로 함유하는 물에 용해 또는 현탁시킨다. 바람직한 구현예에서, 단백질 (예를 들어, hGH)은 수용액에 용해된다. 활성제를 함유하는 용액의 pH 범위는 일반적으로 약 3 내지 11, 더욱 전형적으로 약 3.5-9이고, 몇몇 예에서는 중성에 더 가까운 pH (5.5-7.8)가 바람직한데, 이는 이같은 pH가 폐 내에서의 분말의 용해 후 분말의 생리학적 적합성을 유지시키는 것을 보조할 수 있기 때문이다. 따라서 용액은 단백질의 pI, pI 초과, 또는 pI 미만인 pH에서 제조된다. 즉, 액체 제형물은 약 3-4, 4-5, 5-6, 6-7, 7-8 또는 8-9 범위의 pH에서 분무 건조된다. 본원의 실시예에 나타난 바와 같이, 낮은 pH 조건, 즉 약 4 미만 (3.5-4)의 pH에서 분무 건조된 hGH 분말에 대해 놀랍게도 우수한 에어로졸 성질이 수득되었다. 그러나, 중성 근처의 pH (7-8)에서 분무 건조되는 경우 적절한 분말이 또한 수득되었다. 본 발명의 한 구현예에서, 4-α 나선형 단백질 예컨대 hGH의 현탁액은 hGH의 경우 5.3인 pI (등전점)와 거의 동일한 pH에서 분무 건조된다. 본 발명의 특히 바람직한 한 구현예에서, 용액 내의 트리류신 및 pH 5.3의 현탁액 내의 4-α 나선형 단백질, hGH을 함유하는 현탁액이 분무 건조된다.

수성 제형물은 부가적인 수혼화성 용매, 예컨대 아세톤, 알콜 등을 선택적으로 함유할 수 있다. 대표적인 알콜은 저급 알콜 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 등이다. 이같은 혼합 용매계는 전형적으로 약 0-80 %의 수혼화성 용매, 더욱 바람직하게는 약 20-40 %, 가장 바람직하게는 약 10-30 %의 수혼화성 용매를 함유할 것이다. 분무 건조 전의 용액은 일반적으로 0.01 % (중량/부피) 내지 약 20 % (중량/부피), 일반적으로 0.05 % 내지 10 % (중량/부피, 예를 들어, mg/ml), 바람직하게는 약 0.1 내지 2 % (중량/부피, 즉 1-20 mg/ml)의 농도로 용해된 고체를 일반적으로 함유할 것이다. 구체적으로, 분무 건조 전의 제형물은 하기 고체 농도 중 하나를 전형적으로 함유할 것이다: 0.1 mg/ml 이상, 0.5 mg/ml 이상, 1 mg/ml 이상, 1.5 mg/ml 이상, 2 mg/ml 이상, 3 mg/ml 이상, 4 mg/ml 이상, 또는 5 mg/ml 이상. 약 10-15 mg/ml의 고체 농도가 바람직하다. 본 발명의 한 구현예에서, 단백질은 천연 단백질 구조가 유지된 분무 건조된 고체를 제공하기에 효과적인 0.1 mg/ml의 고체 농도로 분무 건조된다. 따라서 본 발명의 바람직한 구현예는, 임의로 하나 이상의 안정화체와 관련하여, 분무 건조 동안 최적의 고체 농도를 사용하여 단백질 응집이 최소화되고 에어로졸 성질이 우수한 호흡성 분말을 제공할 것이다.

또한, 단백질의 알파 나선성을 유지하는 고체 농도 (상기 기술된 바와 같음) 내에서 작업하면서, 더 높은 단백질 농도는 액적 내의 고량의 단백질에 상응하고, 이는 공기-물 계면과의 접촉으로 인해 액적 표면 상에서 변성될 수 있는 단백질의 상대적인 백분율을 감소시키기 때문에, 더 높은 한도의 바람직한 농도 범위 (즉, 더 높은 고체 함량)로 단백질을 분무 건조시키는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 수의 단백질 분자만이 액적 표면 상에 피팅되고, 이러한 분자들만이 변성될 여지가 있다 (또는 적어도 가장 변성될 여지가 있다)고 가정한다면, 표면 상에 위치하지 않은 나머지 단백질 분자들은 "보호된 페이로드 (payload)"를 나타낸다.

이어서 용액을 통상적인 분무 건조기, 예컨대 Niro A/S (Denmark), Buchi (Switzerland) 등과 같은 공급자가 시판하는 것들에서 분무 건조시키고, 그 결과 분산성의 건조 분말이 생성된다. 용액을 분무 건조시키는 최적의 조건은 제형물 성분에 따라 달라질 것이고, 일반적으로 실험에 의해 결정된다. 물질을 분무 건조시키기 위해 사용되는 기체는 전형적으로 공기이지만, 질소 또는 아르곤과같은 불활성 기체 또한 적절하다. 또한, 분무된 물질을 건조시키기 위해 사용되는 기체의 입구 및 출구 모두의 온도는 분무된 물질 내의 활성제의 분해를 야기하지 않는 것이다. 이같은 온도는 전형적으로 실험에 의해 결정되지만, 일반적으로 입구 온도는 약 50 ℃ 내지 약 200 ℃ 범위이고, 출구 온도는 약 30 ℃ 내지 약 150 ℃ 범위일 것이다. 바람직한 파라메터에는 약 20-150 psi, 바람직하게는 약 30-40 내지 100 psi 범위의 분무압이 포함된다. 사용되는 분무압은 전형적으로 하기의 압력 중 하나 일 것이다 (psi): 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 또는 그 이상. 분무 건조된 분말은 다른 증발 건조 방법에 의해 제조된 분말과 물리적으로 상이하고, 동결건조와 같은 다른 건조 방법에 의해 제조된 분말의 것과 상이한 형상 및 열 이력(履歷) (유리 전이 온도, 유리 전이 폭 및 엔탈피 완화 프로파일)을 전형적으로 나타낸다.

일단 형성되면, 4-α 나선 다발 단백질 건조 분말 조성물은 제조, 가공 및보관 동안 건조 (즉 비교적 낮은 습도) 조건에서 바람직하게는 유지된다. 사용된 특정 건조 파라메터에 상관 없이, 분무 건조 공정으로 활성 4-α 나선형 다발 단백질, 바람직하게는 인간 성장 호르몬을 함유하는, 단백질이 응집되지 않은 고분산성의 흡입성 입자가 생성될 것이다.

V.건조 분말 제형물의 성질

본 발명의 분말은 여러 요소, 가장 뚜렷하게는 (i) 보관시에도 유지되는, 일정하게 높은 분산성, (ii) 작은 공기역학적 입자 크기 (MMAD), (iii) 개선된 미세 입자 용량값, 즉 3.3 마이크론 MMAD 미만 크기의 입자의 백분율이 더 높은 입자를 추가로 특징으로 하고, 이들 모두는 hGH와 같은 단백질에 의한 전신 치료를 위해 하부 기도의 조직 (즉, 폐포)으로 투과하는 분말의 개선된 능력에 기여한다. 하기에 더욱 상세히 기술되는, 본 발명의 분무 건조 분말의 이러한 물리적 특성은 이같은 분말의 폐 깊이로의 에어로졸화 전달의 효능을 최대화하는데 중요하다.

본 발명의 건조 분말은 폐로의 투과에 효과적인 에어로졸성 입자로 구성된다. 본 발명의 입자는 중량 중위 직경 (MMD)이 약 20 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 10 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 약 7.5 ㎛ 미만, 가장 바람직하게는 약 4 ㎛ 미만, 더더욱 바람직하게는 약 3.5 ㎛ 미만이고, 일반적으로는 직경이 0.1 ㎛ 내지 5 ㎛ 범위이다. 바람직한 분말은 MMD가 약 0.2 내지 4.0 ㎛인 입자로 구성된다. 일부 경우에, 분말은 비호흡성 담체 입자 예컨대 락토스를 함유할 수 있고, 비호흡성 입자는 전형적으로 크기가 40 마이크론 초과이다.

본 발명의 분말은 질량 중위 공기역학적 직경 (MMAD)이 약 10 ㎛ 미만인 에어로졸 입자 크기 분포, 바람직하게는 약 5 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 4.0 ㎛ 미만, 더더욱 바람직하게는 3.5 ㎛ 미만, 가장 바람직하게는 3 ㎛ 미만의 MMAD를 추가로 특징으로 한다. 분말의 질량 중위 공기역학적 직경은 특징적으로 약 0.1 내지 10 ㎛, 바람직하게는 약 0.2 내지 5 ㎛ MMAD, 더욱 바람직하게는 약 1.0 내지 4.0 ㎛ MMAD, 더더욱 바람직하게는 약 1.5 내지 3.0 ㎛ 범위일 것이다. 대표적인 분무 건조된 hGH 분말에 대한 예시적인 MMAD 값은 실시예에서 제공된다. 여러 이러한 실시예는 최적화된 분무 건조 조건과 안정화제의 선택 및 농도의 조합에 의해 달성되는 에어로졸 입자 크기 분포에서의 개선을 설명한다.

본 발명의 분말은 이들의 밀도에 의해 추가로 특징지워질 수 있다. 분말의 벌크 밀도는 일반적으로 약 0.1 내지 10 g/㎤, 바람직하게는 약 0.1 내지 2 g/㎤, 더욱 바람직하게는 약 0.15 내지 1.5 g/㎤이다.

분말의 수분 함량은 일반적으로 약 20 중량% 미만, 통상적으로 약 10 중량% 미만, 바람직하게는 약 6 중량% 미만일 것이다. 더욱 바람직하게는, 분무 건조된 분말은 전형적으로 잔류 수분 함량이 약 3 중량% 미만, 더욱 바람직하게는 약 2 중량% 미만, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 2 중량%이다. 이같은 낮은 수분 함유 고체는 포장 및 보관시 더욱 양호한 안정성을 나타내는 경향이 있다. 일반적으로, 본 발명의 분말은 흡습성이다. 즉, 이들은 블리스터 포장과 같은 밀봉된 용기 내에서 보관되지 않는다면 대기로부터 수분을 흡수하는 경향이 있다.

본 발명의 조성물의 가장 현저한 특징은 ED 값으로 표시되는 이들의 높은 분산성이다. 본원에 기술된 분무 건조 방법 및 안정화제는 최적화되지 않은 대조물에 비해 분산성이 상당히 개선된 제형물을 제공하는데 효과적이다. 일반적으로, 이러한 분말의 방출량 (ED)은 30 % 초과, 통상적으로 40 % 초과이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 분말의 ED는 50 % 초과이고, 종종 55 %를 초과한다. 실제로, 실시예에서, 본 발명의 분무 건조된 분말은 65 %를 초과하고, 종종 약 70 내지 90 % 이상 범위인 최적화된 ED 값을 종종 갖는다.

건조 분말의 전체적인 에어로졸 성능을 특징짓는 추가적인 척도는 공기역학적 직경이 3.3 마이크론 미만인 분말의 백분율을 기술하는 미세 입자 분획 (FPF)이다. 본 발명의 분말은 폐로의 전달에 특히 적절하고, FPF 값이 약 30 % 내지 64 % 이상이다. 바람직한 분말은 에어로졸 입자 크기가 3.3 ㎛ 미만 내지 약 0.5 ㎛인 에어로졸 입자를 약 30 % 이상 함유하고, 따라서 에어로졸화 형태로 전달될 때 폐포가 포함되는 폐의 영역에 도달하는데 매우 효과적이다.

본원에 기술된 조성물은 또한 화학적 안정성 및 물리적 안정성 모두, 즉 경시적인 에어로졸 성능에 대해 우수한 안정성을 갖는다. 일반적으로, 화학적 안정성에 대해, 제형물 내에 함유된 4-α 나선 다발 단백질은 분무 건조시 약 10 % 이하로 분해될 것이다. 즉, 분말은 적어도 약 90 %의 손상되지 않은 활성 단백질, 바람직하게는 적어도 약 95 %의 손상되지 않은 활성제, 더더욱 바람직하게는 약 97 % 이상의 손상되지 않은 활성제를 함유할 것이다. 바람직하게는, 분무 건조 공정으로 분말이 약 10 % 미만의 전체 단백질 응집물, 바람직하게는 약 7 % 미만의 전체 응집물, 가장 바람직하게는 5 내지 6 % 미만의 전체 응집물을 함유할 것이다. 더욱 구체적으로, 분무 건조된 분말은 전형적으로 약 10 % 미만의 불용성 응집물, 바람직하게는 약 7 % 미만의 불용성 응집물, 더욱 바람직하게는 약 5 % 미만의 불용성 응집물을 함유할 것이다. 가용성 응집물을 고려하면, 분무 건조된 분말은 전형적으로 7 % 미만의 가용성 응집물, 바람직하게는 6 % 미만의 가용성 응집물, 더욱 바람직하게는 5 % 미만의 가용성 응집물, 가장 바람직하게는 4 %, 3 %, 2 % 또는 1 %의 가용성 응집물을 함유할 것이다. 분무 건조된 입자 내의 단량체의 전체 양은 전형적으로 90 % 초과, 더욱 바람직하게는 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 또는 95 % 초과일 것이다. 또한 본 발명의 조성물은 40 ℃ 및 주위 상대 습도에서의 1개월 동안의 보관 후 약 10 % 미만의 전체 단백질 응집물 함량을 특징으로 하는 보관시 양호한 안정성을 추가로 나타낸다. 즉, 다수의 본 발명의 예시적인 성장 호르몬 조성물의 전체 응집물 함량이 40 ℃에서의 1개월 동안의 보관시 실질적으로 변하지 않고 유지되고, 따라서 본 발명의 흡입성 성장 호르몬 조성물의 분무 건조 및 보관 모두의 경우에 대해 화학적 및 물리적 안정성 모두의 최적화된 균형을 달성을 나타낸다.

에어로졸 성능에 대해, 본 발명의 조성물은 3 개월 동안 주위 조건 하에 보관되었을 때 약 20 % 이하, 바람직하게는 약 15 % 이하, 더욱 바람직하게는 약 10 % 이하의 방출량 강하를 일반적으로 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서,

최소화된 단백질 응집과 함께, 본원의 조성물에 대해 주지되는 에어로졸 성질에서의 개선의 결과로 여러 관련된 장점, 예컨대 (i) 더 많은 분말이 에어로졸화되어 대상에 의한 흡입에 이용가능하므로, 흡입 장치로의 고비용의 약물 손실을 감소시킴, (ii) 분말의 에어로졸화의 고효능으로 인해, 단위 용량 당 요구되는 건조 분말의 양을 감소시킴, (iii) 대상의 폐에 도달하는 에어로졸화 약물의 양을 증가시킴으로써 일일 흡입횟수를 감소시킴이 달성된다.

VI.조성물의 투여

임의의 적절한 건조 분말 흡입기 (DPI: dry powder inhaler), 즉 환자의 들숨을 비히클로 사용하여 건조 분말 약물을 폐에 이동시키는 흡입기 장치를 사용하여 본원에 기술된 제형물을 전달할 수 있다. 본원에 참조로 반영된, Patton, J. S. 등의 U.S. 특허 5,458,135 (1995), Smith, A. E. 등의 U.S. 특허 5,740,794 (1998); 및 Smith, A. E. 등의 U.S. 특허 5,785,049 (1998), Schuler, C. 등의 국제 특허 공보 WO 01/00263에 기술된 바와 같은 Inhale Therapeutic Systems의 건조 분말 흡입 장치가 바람직하다.

이러한 유형의 장치를 사용하여 투여하는 경우, 분말은 구멍이 난 뚜껑 또는 기타 접근 표면을 갖는 용기, 바람직하게는 블리스터 포장 또는 카트리지 내에 함유되고, 용기는 단일 투여 단위 또는 다중 투여 단위를 함유할 수 있다. 다수의 공동(空洞) (즉 단위 투여 포장)에 계량된 용량의 건조 분말 의약을 충전하기 위한 편리한 방법은, 예를 들어, 본원에 참조로 반영된 Parks, D. J. 등의 WO 97/41031 (1997)에 기술되어 있다.

예를 들어, 본원에 참조로 반영된 Cocozza, S. 등의 U.S. 특허 3,906,950 (1974), 및 Cocozza, S. 등의, U.S. 특허 4,013,075 (1997)에 기술된 유형의 건조 분말 흡입기가 본원에 기술된 분말의 전달에 또한 적절하고, 여기서 대상에의 전달을 위한 예비측정된 용량의 건조 분말이 경질 젤라틴 캡슐 내에 함유된다.

건조 분말을 폐에 투여하기 위한 다른 건조 분말 분산 장치로는, 예를 들어, 본원에 참조로 반영된 Newell, R. E. 등의 유럽 특허 EP 129985 (1988); Hodson, P. D. 등의 유럽 특허 EP 472598 (1996); Cocozza, S. 등의 유럽 특허 EP 467172 (1994), 및 Lloyd, L. J. 등의 U.S. 특허 5,522,385 (1996)에 기술된 것들이 포함된다. Astra-Draco의 "TURBUHALER"와 같은 흡입 장치가 또한 본 발명의 건조 분말의 전달에 적절하다. 이러한 유형의 장치는 Virtanen, R.의 U.S. 특허 4,668,281 (1987); Wetterlin, K. 등의 U.S.특허 4,667,668 (1987); 및 Wetterlin, K. 등의 U.S. 특허 4,805,811 (1989)에 상세히 기술되어 있고, 이러한 문헌 모두는 본원에 참조로 반영된다. 기타 적절한 장치에는 Rotahaler(Glaxo), Discus(Glaxo), Spiros™ 흡입기 (Dura Pharmaceuticals), 및 Spinhaler(Fisons)와 같은 건조 분말 흡입기가 포함된다. 본원에 참조로 반영된 Mulhauser, P. 등의 U.S. 특허 5,388,572 (1997)에 기술된 바와 같이, 분말화 의약을 비말 동반하기 위해, 공기를 스크린에 통과시킴으로써 의약을 캐리어 스크린으로부터 리프트시키기 위해, 또는 공기를 혼합 챔버 내에서 분말 의약과 혼합시키기 위해, 공기를 제공하는 피스톤을 사용하고, 이어서 분말을 장치의 마우스피스를 통해 환자에게 도입하는 장치 또한 적절하다.

본원에 참조로 반영된 Laube 등의 U.S. 특허 5,320,094 (1994) 및 Rubsamen, R. M. 등의 U.S. 특허 5,672,581 (1994)에 기술된 바와 같이, 약학적으로 불활성인 액체 추진제, 예를 들어, 클로로플루오로카본 또는 플루오로카본 내의 약물의 용액또는 현탁액을 함유하는, 가압된 정량식 흡입기 (MDI), 예를 들어, Ventolin정량식 흡입기를 사용하여 건조 분말을 또한 전달할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 분말을 용매, 예를 들어, 물, 에탄올, 또는 염수에 용해 또는 현탁시킨 후, 연무에 의해 투여할 수 있다. 에어로졸화 용액의 전달을 위한 연무제에는 AERx™(Aradigm), Ultravent(Mallinkrodt), 및 Acorn II(Marquest Medical Products)가 포함된다.

사용 전에, 건조 분말은 일반적으로 주위 조건에서 보관되고, 바람직하게는 약 25 ℃ 이하의 온도 및 약 30 내지 60 %의 상대 습도 (RH)에서 보관된다. 더욱 바람직한 상대 습도 조건, 예를 들어, 약 30 % 미만은 제형물의 2차 포장 내에 건조제를 혼입시킴으로써 달성될 수 있다.

VII.활용

본 발명의 조성물은 포유동물 대상에게 치료적 유효량으로 폐에 투여되는 경우 상기 섹션 II.A에 기술된 바와 같은 4-α 나선형 다발 단백질의 투여에 반응성인 임의의 컨디션의 치료 또는 예방에 유용하다.

특히, 대표적인 4-α 나선 다발 단백질인 hGH는 치료적 유효량으로 투여되는 경우 소아 성장 호르몬 결핍, 성인 성장 호르몬 결핍, 만성 신장 기능부전 및 터너 증후군과 같은 컨디션의 치료에 유용하다.

하기의 실시예들은 본 발명의 예증이 되고, 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다. 이러한 실시예의 변형 및 등가물이 본 명세서, 도면 및 청구항에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.

본원에 인용된 모든 기사, 서적, 특허 및 기타 간행물은 전체적으로 본원에 참조로 반영된다.

재료 및 방법

A. 재료

Des-phe 인간 성장 호르몬 (des-phe hGH), BresaGen Limited (Adelaide, South Australia)

천연 인간 성장 호르몬, BresaGen Limited (Adelaide, South Australia)

메티오닐-인간 성장 호르몬 (met hGH), BresaGen Limited (Adelaide, South Australia)

L-류신 (Aldrich, St. Louis, MO)

에탄올, 200 표준강도 (USP/NF, Spectrum Chemical Mfg. Corp., New Brunswick, N.J.)

메탄올 (HPLC grade, EM Industries, Gibbstown, N.J.)

트리류신 (Bachem California Inc, USA Torrance, CA).

인산나트륨, 2염기성, 7-수화물 결정: J. T. Baker, Lot No.: M30150.

인산나트륨, 1염기성, 1수화물: J. T. Baker, Lot No.: N50156.

수크로스: T. J. Baker, Lot No.: N21593.

라피노스, 5수화물: Pfanstiehl, Lot No.: 25320A.

트리할로스, 2수화물: Spectrum, Lot No.: OF0359.

Ile: Sigma, 98%, Lot No. 28H00462.

Val: Aldrich, 99%, Lot No. 08311AU.

Phe: Aldrich, 99%, Lot No. 13022TS.

Trp: Aldrich, 99%, Lot No. 12729HS.

B. 방법

입자 크기 측정 (Horiba)

분말의 질량 중위 직경 (MMD)은 Horiba CAPA-700 입자 크기 분석기 (Horiba Instruments inc., Irvine, CA)를 사용하여 측정하였다. 측정은 현탁 매질 내의 분산된 입자의 원심분리 침강을 기초로 하였다. 입자의 스트로크 (Stroke) 직경을 기초로 하는 질량 중위 직경을 입자 밀도 및 현탁 매질의 밀도 및 점도를 사용하여 계산하였다.

분말의 밀도를 모든 분말에 대해 1.5 g/㎤으로 세팅하였다 (이러한 공칭값을 분석된 모든 분말에 대해 사용하였고, 이는 분무 건조된 분말에 전형적인 범위 내이다). 입자 크기 측정은 5 ㎖의 Sedisperse A-11 (Micromeritics, Norcross, GA)에 현탁되고 10 분 동안 초음파처리에 의해 분산된 약 5 내지 10 ㎎의 분말로 수행하였다. 입자 크기 데이타가 수득된 범위를 0.4 내지 10.0 ㎛으로 세팅하였다.

입자 크기 (VMD): 입자 크기 분포는 2 바의 전단력에서 작동되는 SYMPATEC HELOS 입자 크기 분석기를 사용하여 측정하였다. R2에 상응하는 초점길이를 유형 1DR 검출기와 함께 사용하였다. 부피 중위 직경 (VMD)이 분포로부터 수득되었다.

화학적 안정성. 단백질 순도/단백질 분해도를 역상 HPLC (RP-HPLC)에 의해 결정하였다.

수분 함량. 분말의 잔류 수분 함량을 Karl Fischer 적정법 기술에 의해 Mitsubishi 수분 측정기 모델# CA-06을 사용하여 결정하였다. 수분 함량은 또한 열 중량측정 분석 (TGA)에 의해서 결정될 수 있다.

가용성 응집물 결정. 가용성 응집물은 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 또는 SEC에 의해 용매 전달 시스템, 광다이오드 배열 검출기, 온도 조절된 오토샘플러 및 데이타 관리 시스템이 장착된 Waters HPLC 시스템을 사용하여 측정하였다.

불용성 응집물 결정. 불용성 응집물은 자외선 분광기 (UV)에 의해 Shimadzu UV-2101 PC 이중 분광광도계를 사용하여 결정하였다. 샘플들을 360 내지 240 nm 범위에 걸쳐 스캐닝하였다. 용액의 혼탁도를 측정하여 불용성 응집물을 정량적으로 결정하였다 (Eckhardt, B. M. 등, Pharm Res., 8(11), 1360-1364 (1991)).

공기역학적 입자 크기 측정

앤더슨 케스케이드 충격기. 앤더슨 케스케이드 충격기 (이들의 크기에 따른 관성 충격에 의해 플레이트 상에 입자를 포획하는 일련의 단계를 갖는, 체와 유사한 장치)를 사용하여 공기 스트림 내의 에어로졸화된 분말 제형물의 MMAD 및 입자 크기 분포를 결정하였다. 플레이트를 테스트 전후에 칭량하고, 각각의 단계의 플레이트 상에 침착된 분말의 질량을 결정하였다. 달리 지시되지 않는 한, 9.0 내지 0.4 ㎛ 범위의 차단 크기를 갖는 8단계 (정상에서 기저부까지 0-7 단계), 및 28.3 L/분의 유속으로 구동되는 경우 <0.4 ㎛의 입자를 포착하는 최종 필터 단계를갖는 전통적인 앤더슨 케스케이드 충격기를 사용하여 연구를 수행하였다. 장치 테스트 설비는 케스케이드 충격기 및 USP (United States Pharmacopia) 통로 (USP 23, 챕터 <601>)가 필터보다는 장치 마우스피스에 장착된 것을 제외하고는 ED 테스트와 유사하였다. 다중 분산을 전형적으로 각각의 케스케이드 충격 실행에 대해 수행하여 중량측정에 의해 정확한 데이타를 수득하였다.

앤더슨 쇼트 스택 (SS) 방법. SS 방법에서, 단계들이 놓이는 순서가 상기 기술된 통상적인 앤더슨 케스케이드 충격기 구성으로부터 변형된다. 정상으로부터, 단계 0을 입구 콘 부착에 사용하여 통로를 연결시켰다. 이어서 단계 3이 단계 0 밑에 놓이고, 그후 필터 단계 (단계 F) 놓인다. 분말을 함유하는 공기 스트림은 단계 0 및 단계 3만을 통과한다; 공기 (분말은 아님)는 단계 F 아래에 놓인 다른 단계들을 통해 흘러, 조립품의 나머지를 적절하게 유지시킨다. 예비칭량된 필터가 단계 F 상에 놓이고, 이는 <3.3 ㎛의 입자를 포획하였다. 2차 필터가 단계 3 아래의 인버티드 플레이트 상에 놓이고, >3.3 ㎛의 입자가 포획되었다. 본원에 기술된 연구를 위해, USP 방법 당 2 ㎎의 분말 조성물을 함유하는 하나의 BP (블리스터 팩)을 에어로졸 전달 장치에 분산시키고, 진공을 28.3 L/분으로 풀링하였다. 이어서 이러한 공정을 실행 당 6 ㎎의 표적 질량에 대해 2회 반복하였다. 이어서 필터를 제거하고 칭량하여, 침착된 분말의 양을 결정하였다.

실시예 1

폐로의 전달을 위한 순물질 hGH 제형물

천연의 전체 길이 hGH (n-hGH, BresaGen 천연 전체 길이, 카탈로그 No. hST-3, lot H057)를 순물질 분무 건조시켰다 (즉, 부형제/안정화제가 없음). 생성된 분말의 물리적 및 화학적 안정성 및 에어로졸 성능을 분무 건조 직후 및 상이한 세 온도에서 1개월 동안 보관한 후 평가하였다.

용액 제조. 분무 건조 전에, 단백질을 YM-10 멤브레인이 있는 Amicon (Millipore) 초여과 셀을 사용하여 투석여과하여, 시판 제형물 내에 함유된 만니톨 및 글리신을 제거하였다. hGH (725 mg) 및 5 mM 인산나트륨을 함유하는 pH 7.8의 용액을 제조하였다. 액체 제형물은 ㎖ 당 10 ㎎의 고체를 함유하였다 (즉, 1 % 전체 고체 함량). 버퍼는 6.9 %의 전체 고체를 나타냈고, [hGH]는 전체 고체의 93.1 % 또는 9.31 ㎎/㎖이었다.

분무 건조. 순물질 제형물을 개질된 사이클론 (Platz, R. 등, Inhale Therapeutic Systems의 국제 특허 공보 WO 97/41833, 1997년 11월 13일), 분무기 노즐 및 분말 수집 용기가 있는 Buchi 190 미니 분무 건조기 (Buchi Labortechnik AG, Meierseggstrasse, Switzerland)를 사용하여 분무 건조시켰다. 수집 효율은 70 %를 초과하였다; 전형적인 수집 효율은 약 75-95 % 범위였다.

분말 포장 및 특징화. 생성된 분말을 상대 습도 5 % 미만의 글러브 박스 내의 5 ㎎ 단위 제형물 (블리스터 팩, BP) 내에 손으로 충전시켰다. BP를 건조제와 함께 파우치화시키고, 4 ℃, 25 ℃ 및 40 ℃의 상이한 세 온도에서 1개월 동안 보관하였다. 이어서 분말의 물리적 (에어로졸 성능) 및 화학적 성질을 상기에 일반적으로 기술된 방법을 사용하여 평가하였다.

상기 데이타는 특정 분무 건조 조건 (고체 함량, 분무압, pH 등)을 사용하여 분산성이 우수하고 (70 % 초과의 ED), 공기역학적 크기 범위가 양호하며 (평균 약 3.5 마이크론의 MMAD), 단백질 분해도가 낮고 (약 5 % 미만), 가용성 및 불용성 응집물의 합이 40 ℃에서 보관되었을 때 8 % 미만, 주위 조건에서 보관되었을 때 약 6 % 미만, 저온에서 보관되었을 때 약 4 % 미만인 hGH 건조 분말을 제조할 수 있음을 가리킨다.

실시예 2

다양한 공정 조건 하에서의 순물질 hGH의 분무 건조

부가적인 부형제/안정화제가 없는 인간 성장 호르몬의 수용액을 제조하고, 다양한 상이한 공정 조건 하에 상기 기술된 바와 같이 분무 건조시켜, 생성된 분말의 특징에 대한 효과(들)을 시험하였다.

관련된 공정 파라메터 및 생성된 건조 분말의 성질이 하기 표 2에서 제공된다. IA = 불용성 응집물; SA = 가용성 응집물.

상기 데이타는 분무 건조시 최소한의 단백질 응집을 나타내고 에어로졸 성질이 우수한 (70 % 초과의 ED 및 평균 약 3 마이크론의 MMAD) 4α-나선형 다발 단백질 분말의 제조에서의 본원에 기술된 바람직한 공정 파라메터들의 유용성을 추가로 지지한다.

실시예 3

트리류신을 함유하는 호흡성 분무 건조 hGH 제형물

이러한 연구의 목적은 분무 건조된 Met-hGH의 에어로졸 성질뿐만 아니라 1개월 안정성에 대한 트리류신의 효과를 결정하는 것이다.

A.제형물

5 개의 상이한 제형물 용액을 하기와 같이 제조하였다. 메티오닐-인간 성장 호르몬을 1.5 및 3 ㎎/㎖ 농도의 트리류신 (L3)와 함께 7 ㎎/㎖ (70 % w/w)의 농도로 혼합시켜, 15 중량% 및 30 중량%의 트리류신을 각각 함유하는 분말을 제공하였다. 이러한 용액들의 pH를 3.6 또는 7.8로 조정하였다. 유사하게, 메티오닐-인간 성장 호르몬 (10 ㎎/㎖) 및 인산나트륨 (5 mM)의 pH 7.8의 수용액을 제조하였다. 모든 제형물은 1 %의 전체 고체 함량으로 제조되었다.

B.분무 건조

상기 기술된 hGH 용액을 상기 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 Buchi 190 실험실 규모 분무 건조기를 사용하여 분무 건조시켰다; 사용된 분무압은 80 psi였다.

C.특징화

분무 건조된 Met-hGH 분말의 에어로졸 성질 및 화학적 안정성이 하기에 제공된다:

상기 데이타는 트리류신이 hGH와 같은 대표적인 4α-나선형 다발 단백질을 분무 건조하는 동안 사용될 때 효과적인 안정화제임을 가리킨다. 또한, 분무 건조 동안 사용된 낮은 pH 조건은 분산성을 증강시키는 것으로 나타났고, 특히 트리류신과 함께 사용되는 경우, 성장 호르몬 분자의 협조적인 안정화를 제공하여 최소한도의 단백질 분해를 나타내고, 우수한 ED (평균 약 90 %) 및 작은 공기역학적 직경 (약 2.6 내지 3.1 마이크론 범위) 모두를 갖는 분말을 제공한다.

실시예 4

당을 함유하는 호흡성 분무 건조 hGH 제형물

본 연구의 목적은 바람직한 에어로졸 성질 및 양호한 hGH 안정성 프로파일을 갖는 분말을 수득하기 위한 hGH 제형물의 분무 건조에서 최적화된 공정 파라메터와 함께 안정화제로서의 당의 용도를 연구하는 것이다.

수많은 당 중에서, 비환원당, 건조 고체 내의 단백질과 조합되는 경우 다공질 상을 형성할 수 있는 당 및 Tg가 높은 당 (예를 들어, 유리 전이 온도가 30 ℃ 초과, 바람직하게는 40 ℃ 초과, 더욱 바람직하게는 50 ℃ 초과, 더더욱 바람직하게는 60 ℃ 초과, 가장 바람직하게는 70 ℃ 이상)이 바람직하다. 이러한 선호성을 고려하여, 수크로스 (Tg=74 ℃), 라피노스 (Tg=102 ℃) 및 트레할로스 (Tg=115 ℃)를 이러한 연구에서 사용하였다 (A. Saleki-Gerdt, Zografi, G., Pharm Res., 11(8), 1166-1172 (1994)로부터의 Tg 데이타).

A.제형물 제조. pH 7.8의 5 mM 인산나트륨 버퍼 용액을 제조하였다. 각각의 met-hGH 친액성 바이알을 5 ㎖의 HPLC 물로 재구성시켰다. 총 18 개의 바이알이 사용되었다. 재구성 전에 hGH 용액을 투석여과시켜 부형제를 제거하였다. 사용된 투석여과 설비는 YM 10,000 필터가 있는 Amicon (Millipore) 초여과 셀이었다. 단백질 용액을 pH 7.8의 5 mM 인산나트륨 버퍼 및 37 psig의 기체압을 사용하여 4-5 ℃에서 11 시간 동안 투석여과시켰다. 투석여과 단계 후, 단백질농도를 UV 분광광도계에 의해 277 nm에서 점검하고, pH 7.8의 5mM 인산나트륨 버퍼로 농도를 12.1 mg/ml로 조절하였다.

당의 모액(母液)을 수크로스, 라피노스 및 트레할로스에 대해 각각 22.8, 22.7 및 22.7 mg/mL의 농도로 제조하였다. 이러한 용액들은 pH 7.8의 5 mM 인산나트륨 내에 제조되었다. 4 개의 제형물을 S5-01 (수크로스), S5-02 (트레할로스), S5-03 (라피노스) 및 S5-04 (버퍼 단독)로 각각 라벨링된 원심분리 튜브 내에 제조하였다. S5-01: 40 ml의 12.1 mg/ml hGH를 병 내로 분배하고, 10 ㎖의 수크로스 모액을 첨가하였다. pH를 7.8로 조절하였다. S5-02: 40 ml의 12.1 mg/ml hGH를 병 내로 분배하고, 10 ㎖의 라피노스 모액을 첨가하였다. pH를 7.8로 조절하였다. S5-03: 34 ml의 12.1 mg/ml hGH를 병 내로 분배하고, 8.5 ㎖의 트레할로스 모액을 첨가하였다. pH를 7.8로 조절하였다. S5-04: 40 ml의 12.1 mg/ml hGH를 병 내로 분배하고, 10 ㎖의 pH 7.8의 5 mM 인산나트륨 버퍼를 첨가하였다. pH를 7.8로 조절하였다. 제형물의 개요가 하기 표 4에 제공된다.

B.분무 건조: 상기 기술된 제형물 용액을 상기 실시예에 기술된 대로 Buchi 190미니 분무 건조기를 사용하여 분무 건조시켰다. 분무 건조는 60 psi의 분무압 및 60 ℃의 출구 공기 온도에서 수행되었다. 분말을 약 60 내지 85 % 범위의 수율로 수집하였다.

C.안정성. 분말을 상대 습도 5 % 미만의 글러브 박스 내로 옮기고, 단위 제형물 (각각의 블러스터 팩 내의 5.0 ㎎의 분말)로 옮겨, 이를 리드스톡 (lidstock)으로 열밀봉시켰다. 각각의 제형물로부터의 블리스터를 40 ℃ 온도 스테이션 내에 놓았다. 블리스터를 건조제와 함께 알루미늄 백 내로 밀봉시켰다. 1개월 시점에 샘플들을 온도 스테이션으로부터 제거하였다.

에어로졸 성능, 단백질 응집물, 단백질 순도 및 잔류 수분 분석의 결과가 하기 표에 제시된다.

데이타는 테스트된 모든 제형물에 대한 ED가 75 % 초과임을 가리킨다. 3종류의 당 (30 %)과 함께 제형된 hGH 분말은 순물질 제형물과 비교하여 더 높은 ED를 제공하지 않았다. 파우치화된 분말을 40 ℃에서 1개월 동안 보관한 경우, ED는 현저하게 변하지 않았지만, 트레할로스 및 순물질 제형물에 대한 ED에서 약간의 감소가 관찰되었다.

네 제형물로부터의 분말은 MMAD 값 (3.8 내지 3.9 ㎛)이 유사하였다. 40 ℃에서 1개월 동안 보관한 후, 수크로스 제형물 (3.4 ㎛)을 제외하고는, MMAD 값이 동일한 범위 내에서 유지된 것이 관찰되었다. 측정으로부터의 CIE가 115 % (100 % 초과)의 값을 갖기 때문에, 수크로스 제형물에서의 MMAD 감소는 예기치 않은 실험 에러로부터 발생할 수 있다. 기타 제형물에 대한 입자 크기 분포는 초기와 1개월 시점 간에 매우 일관되었다.

수분은 1 내지 1.6 % 범위였다. 예상대로, 수분 수준은 건조제와 함께 40 ℃에서의 1 개월 보관 후 증가하지 않았다.

데이타는 테스트된 모든 제형물에 대해 40 ℃에서의 1개월 보관 후 초기 방출 피크 (EE: early-eluted peak) 및 hGH의 백분율이 유사한 수준에서 유지되었음을 가리킨다. 제조된 제형물 간의 EE 및 hGH의 양에서의 현저한 차이는 RP-HPLC 분석에서 관찰되지 않았다.

가용성 응집물 (SA)이 모든 제형물의 분무 건조 후 약간 증가하였다 (약 2 %). 건조제와 함께 40 ℃에서 1개월 동안 보관한 후, 가용성 응집물이 약간 증가하였다. 순물질 제형물에 대한 가용성 응집물은 4.7 %로 증가하였다. 이는 이들와 같은 당이 응집에 대해 hGH 단백질을 안정화시킴을 제시할 수 있다. 3종류의 당 제형물 중에서, 수크로스 제형물이 초기 및 1개월 시점 모두에서 가장 낮은 값의 응집물 백분율을 나타냈다.

불용성 응집물은 테스트된 모든 제형물에 대해 3 % 미만이었다. 40 ℃에서의 1개월 보관 후, 불용성 응집물에서의 증가는 관찰되지 않았다. 1개월 시점에 대해 표 9에 보고된 SD 및 %RSD는 동일한 샘플의 삼중 스캔으로부터 수득되었다. 이는 동일한 샘플로부터의 UV 측정에서의 편차를 반영하지만, 샘플에서 샘플로의 변이는 반영하지 않는다.

전체 단량체 (TM)의 백분율을 또한 [B. M. Eckhardt, J. Q. Oeswein, 및 T. A. Bewley, Pharm. Res., 8(11): 1360-1364 (1991)]에 기술된 대로 계산하였다.

이러한 연구에서 평가된 당은 순물질 제형물과 비교하여 에어로졸 성능 (ED 및 MMAD)에서의 강화를 나타내지 않았다. 그러나, 당을 함유하는 제형물은 더 양호한 안정성 프로파일을 나타내는 것으로 보이고, 예를 들어, hGH가 당과 함께 제형되었을 때 가용성 응집물 수준이 순물질 제형물보다 낮았다; 또한, 수크로스 제형물은 가장 낮은 양의 가용성 응집물을 제공하였다.

실시예 5

분무 건조 파라메터의 최적화

본 연구의 목적은 분산성을 희생시키거나 단백질 분해를 증가시키지 않으면서 3 마이크론 미만으로 4α-나선형 다발 단백질 분말의 MMAD를 추가로 감소시키는 것이다. des-Phe hGH가 사용되었지만, 천연 전체 길이 hGH의 분말의 특성에서 현저한 차이가 발생할 것으로 예상되지 않았다.

hGH의 응집을 분무 건조 동안 피할 수 없고 대부분의 응집은 분무화 단계 동안 발생하는 것으로 나타났다 (Mumenthaler, M. 등, Pharm Res., 11: 12-20 (1994) 및 Maa, Y-F 등, J. Pharm Sci, 87: 152-159 (1998)). 출원인은 순물질 천연 hGH를 40 psi 분무화로 건조 분말 내로 분무 건조시켰다 (실시예 1). 이러한 많은 분말의 MMAD는 3.5 마이크론으로 (VMOD = 2.7 마이크론), 3 마이크론보다 컸다. 본 연구의 목적은 낮은 단백질 분해도를 희생시키지 않으면서 공기역학적 입자 크기를 3 마이크론 미만으로 추가로 감소시키는 최적화된 공정 파라메터를 결정하는 것이다.

감소된 MMAD를 수득하는 한 방법은 일차 입자 크기의 감소에 의한 것이고, 이는 분무압의 증가 또는 분무 건조될 용액 내의 고체 함량의 감소에 의해 실행될 수 있다. 양 파라메터 모두의 조절이 연구된다.

실험 고안

분무압 (40 내지 60 psi), 및 고체 함량 (0.5 내지 2.0 % w/v)을 고안의 요소로 사용하였다.

더 작은 입자를 제조하기 위한 목적으로 1 % 고체에서 60 psi로 분무압을 증가시켰다 (S6-02). 입자 크기를 추가로 감소시키기 위해 고체 함량을 0.5 %로 감소시켰다 (S6-03). 그러나, 더 작은 입자 크기를 생성시키기 위해 사용되는 조건 (더 낮은 고체 및 증가된 분무)에서, hGH의 응집 수준에서의 증가가 종래에 관찰되었음을 주지하여야 한다. 바꾸어 말하면, 증가된 hGH 농도로 더 낮은 응집이 생성될 수 있다. 따라서, 고체 함량을 2 % w/v로 증가시키기로 결정하였다. 실험 S6-04의 목적은 40 psi의 분무압을 사용하여 응집을 최저 수준에서유지시키는 것이다. 고안 매트릭스가 하기에 제공된다. 표 13 내의 단백질 순도 값으로부터 나타날 수 있는 바와 같이, 출발 hGH 물질은 매우 불순하다.

용액 제조 및 분무 건조는 상기 실시예에서 기술된 대로 수행하였다. 생성된 분무 건조 분말의 특징화는 하기 표에서 제공된다.

실시예 6

아미노산 안정화제의 사용

아미노산을 분무 건조 동안 4α-나선형 다발 단백질에 대한 잠재적인 안정화제로서 연구하였다. 데이타의 복잡함을 기초로, 출원인은 아미노산을 함유하는분말 제형물에 관해 특정 경향을 발견하거나 관찰하였다. 일반적으로, 가용성 감소는 수분 흡수 감소 및 지연된 결정화와 관련되고 (Leu > His > Ala > Gly); 반데르발스 부피 증가는 Tg 증가와 관련되고 (Leu > His > Ala > Gly); 표면 축적 인자 증가는 소수성 증가과 관련되며; 표면 장력 감소는 감소된 MMD 및 응집과 관련된다는 것이 관찰되었다.

이러한 정보를 기초로, 특정 아미노산 (Leu, Ile, Val, nLeu, Phe, 및 Trp)을 4α-나선형 다발 단백질에 대한 잠재적인 분무 건조 안정화제로서 연구하였다. hGH-아미노산 제형물에서, 아미노산의 백분율을 전체 고체 함량의 30 % 미만으로 유지시켰다. 낮은 백분율의 아미노산이 결정화를 지연/저해시킬 수 있을 것으로 생각되었다.

수성 아미노산-인간 성장 호르몬 제형물을 상기 기술된 바와 같이 제조하였따. 제형물의 개요가 하기 표 14에 제공된다.

제형물들을 80 psi의 분무압을 사용하여 상기 실시예들에 상술된 바와 같이 제조하였다; 분말 회수율은 55 내지 66 %였다.

분말 특징화 결과를 하기 표에 제공한다.

테스트된 모든 제형물에 대한 ED는 73.5 % 내지 78.5 % 범위였다.

제형물로부터의 분말은 3.0 내지 3.6 마이크론의 MMAD 값을 나타냈다. Trp 및 Val을 함유하는 제형물은 각각 3.6 및 3.4 마이크론의 더 큰 MMAD 값을 나타냈다. Leu, Ile 및 nLeu을 함유하는 제형물에 대한 MMAD에서는 현저한 차이가 없었다. 순물질 제형물의 MMAD는 3.3 마이크론이고, 이는 이전의 실시예로부터의 순물질 제형물의 MMAD 데이타보다 훨씬 작다. 80 psi의 분무압은 60 psi의 분무압에 비해 작은 입자 크기의 형성에 유리하므로, 차이에 기여할 수 있는 한 요소는 더 높은 분무압 (80 psi)이다. 제형물에 대한 VMD의 경향은 MMAD 데이타 경향과 일치하였다. 제형물에 대한 입자 크기 분포는 유사하였다. Leu, Ile 및 nLeu은 분무 건조 안정화제로서 약간 더 양호한 성질을 갖는 것으로 나타나, 공기역학적 크기가 작고 FPF가 높은 입자의 형성에 적합하게 한다.

모든 분말의 잔류 수분 함량은 0.8 내지 1.5 % 범위였다.

데이타는 초기 방출 피크 (EE) 및 hGH의 백분율이 연구된 모든 제형물에 대해 유사한 수준임을 가리켰다. 제형물 간의 EE 및 hGH의 백분율에서의 현저한 차이는 RP-HPLC 분석에서 관찰되지 않았다. 분무 건조되지 않은 용액과 비교하여, 임의의 제형물에 대해 초기 방출 피크에서의 증가는 없는 것으로 나타난다.

Leu, Ile 및 Val을 함유하는 제형물은 가용성 응집물이 더 높은 반면, 다른 제형물들은 가용성 응집물의 수준이 유사한 것으로 나타났다 (~ 1 %).

불용성 응집물은 테스트된 모든 제형물에 대해 0.3 내지 1.5 % 범위였다. IA는 분무 건조 후 증가하지 않은 것으로 관찰되었다. 모든 제형물은 IA의 수준이 유사하였다. 표 11에서 보고된 SD 및 %RSD가 동일한 샘플의 삼중 스캔으로부터 수득되었다.

간략하게, 모든 제형물의 ED는 73 % 초과였고, MMAD는 약 3.0 내지 3.6 ㎛ 범위였다. Val 및 Trp과 함께 제형된 분말이 MMAD (3.4 및 3.6 ㎛)가 비교적 큰 반면, 화학적 안정성의 관점에서, 30 % 수준의 Leu 및 Ile와 각각 함께 제형된 hGH는 다른 아미노산을 함유하는 제형물에 비해 가용성 응집물이 약간 더 높았다.

실시예 7

hGH의 분무 건조 조성물

des-phe hGH의 4개의 제형물을 제조하고, 상기에 일반적으로 기술된 바와 같이 분무 건조시켰다: 순물질 hGH 제형물, Zn²⁺/트윈20/hGH 제형물, 및 두 개의 상이한 아연 함유 제형물, Zn²⁺:hGH (7:1 및 20:1). 단백질 농도는 5 mM 인산나트륨 버퍼를 첨가하여 조절하였다. 배치 사이즈는 500 mg 내지 550 mg 범위였고, 분말의 수율은 80 % 내지 100 %였다. 제형물과 관련된 데이타의 요약이 하기 표에 제공된다.

분무 건조된 분말의 물리적 및 화학적 안정성 및 에어로졸 성능을 결정하였고, 이는 하기 표에 요약된다.

주위 및 가속 환경 조건 하에 1개월 동안 보관된 후, 순물질 분말에 대한 방출량 및 MMAD 모두는 각각 70 % 및 3.5 ㎛에서 거의 일정하게 유지되었고, 이는 순물질 제형물의 견고성을 입증한다.

실시예 8

hGH 분무 연구

하기의 연구들을 수행하여, 소정량의 안정화 부형제와 조합된 경우, 대표적인 4-α 나선 단백질인 hGH의 분무 건조를 위한 최적화된 분무압과 같은 가공 파라메터 및/또는 제형물의 효과를 결정하였다. 분무 연구는 상기 기술된 바와 같은 Buchi 190를 사용하여 수행하였고, 분무되는 용액은 Erlemeyer 플라스크에 수집되었다. 달리 지적되지 않는 한, 모든 실험은 5 mM 포스페이트 버퍼 내의 10 mg/mL의 met-rHGH의 일정한 농도로 수행되었고, 80 psi에서 분무되었다. 구현되는 부형제/용매는 하기 표 24에 표시된 양의 알파 글리세롤 포스페이트, 류신, 에탄올, 트리류신, 트리페닐알라닌, F-68, rHA, 아연, 마그네슘, 칼슘 및 히드록시에틸스타치였다. 모든 분무되기 전 및 후의 샘플들을 pH, UV 및 SE-HPLC에 의해 분석하였다. 분취량의 샘플을 또한 원심분리하여, UV에 의해 분석하였다. 모든 분무되기 전 샘플들을 표면 장력에 대해 측정하였다.

결과

상기 표의 결과의 검토 및 분무 건조 후의 값과 분무 건조 전의 값의 비교에서, agphos (알파 글리세롤 포스페이트) 제형물은 agphos가 고농도로 존재할 때 약간의 응집물 감소를 나타냈다; 류신을 함유하는 제형물은 마찬가지로 수행되지 않았지만, 전반적으로 결과가 양호하였다. 침전물이, 특히 고농도에서, 용액에서 나오지만, 에탄올을 함유하는 제형물은, 특히 고농도에서, 응집 감소를 나타냈다. 트리류신 제형물은 고농도에서 응집 감소를 나타냈지만, 저농도 및 고농도의 Phe-3 제형물에서는 응집에서의 변화가 없었다 - 모두 잘 수행됨. F-68을 함유하는 제형물은 고농도에서 응집 감소를 나타냈지만, 아연을 함유하는 제형물에 대해서는, 아연 7:1 제형물이 최선으로 수행되었다. (모든 아연 제형물에 대해, 침전물이 용액으로부터 나왔고, 20:1이 최악이었다). 양이온인 Mg 및 Ca를 함유하는 제형물 또한 양호하게 수행되었지만, 유사하게 침전물이 형성되었다. (주: 용액으로부터 나오는 침전물의 문제). HES를 함유하는 제형물은 HES 고농도에서 약간의 응집 증가를 나타냈다.

Claims (52)

1. 4-α 나선 다발 단백질을 함유하는, 에어로졸성 및 단백질 안정성이 우수한 분무 건조된 흡입성 4-α-나선 다발 단백질 분말로, 계면활성제가 없고, (i) 약 65 % 이상의 방출량 및 (ii) 10 % 미만의 전체 단백질 응집물을 특징으로 하는 분말.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 4-α 나선 다발 단백질이 성장 호르몬을 함유하는 분말.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 성장 호르몬이 인간 성장 호르몬인 분말.
4. 제 3 항에 있어서, 본질적으로 인간 성장 호르몬과 버퍼로 구성되는 분말.
5. 제 4 항에 있어서, 본질적으로 인간 성장 호르몬과 포스페이트 버퍼로 구성되는 분말.
6. 제 4 항에 있어서, 약 3.5 마이크론 미만의 MMAD를 추가로 특징으로 하는 분말.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 4-α 나선 다발 단백질과 함께 분무 건조 동안 사용되는 경우, 상응하는 순물질 제형물과 비교하여 분말의 응집물 수준을 유지 또는 저하시키는데 효과적인 안정화 부형제를 추가로 함유하는 분말.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 부형제가 당, 아미노산, 및 아미노산 2 내지 5 개로 이루어지는 올리고머로 구성되는 군으로부터 선택되는 분말.
9. 제 7 항에 있어서, 속효성인 분말.
10. 제 7 항에 있어서, 수용성인 분말.
11. 제 8 항에 있어서, 상기 부형제가 당인 분말.
12. 제 11 항에 있어서, 당이 수크로스 또는 라피노스인 분말.
13. 제 12 항에 있어서, 단백질이 인간 성장 호르몬인 분말.
14. 제 8 항에 있어서, 상기 부형제가 아미노산인 분말.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 아미노산이 아스파라긴, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 류신, 노르류신 및 발린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분말.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 아미노산이 류신, 이소류신 및 노르류신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분말.
17. 제 15 항에 있어서, 상기 단백질이 인간 성장 호르몬인 분말.
18. 제 8 항에 있어서, 상기 부형제가 아미노산 2 내지 5 개로 이루어지는 올리고머인 분말.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 부형제가 트리류신인 분말.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 단백질이 인간 성장 호르몬인 분말.
21. 제 20 항에 있어서, 3.0 마이크론 미만의 MMAD를 특징으로 하는 분말.
22. 제 7 항에 있어서, 약 30 중량% 미만으로 상기 안정화 부형제를 함유하는 분말.
23. 제 7 항에 있어서, 40 ℃에서 1개월 동안 보관된 후 약 10 % 미만의 전체 응집물 함량을 추가로 특징으로 하는 분말.
24. 제 7 항에 있어서, 약 50 중량% 이상의 4α-나선 다발 단백질을 함유하는 분말.
25. 하기 단계를 포함하는, 분무 건조시 에어로졸성 및 단백질 안정성이 우수한 흡입성 4-α 나선 다발 단백질 분말의 제조 방법:

    (a) 4-알파 나선 다발 단백질을 계면활성제의 부재 하에 수성 용매에 용해시켜 용액을 형성시키고,

    (b) 상기 용액을 (i) 약 65 % 이상의 방출량 및 (ii) 10 % 미만의 전체 단백질 응집물을 특징으로 하는 분말을 제조하기에 효과적인 조건 하에 분무 건조시킴.
26. 제 25 항에 있어서, 상기 4-α 나선 다발 단백질이 성장 호르몬을 함유하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 성장 호르몬이 인간 성장 호르몬인 방법.
28. 제 25 항에 있어서, 단계 (a)에서 형성된 용액의 고체 함량이 약 0.02 내지 약 20 중량%인 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 단계 (a)에서 형성된 용액의 고체 함량이 약 0.05 내지 약 5 중량%인 방법.
30. 제 28 항에 있어서, 단계 (a)에서 형성된 용액의 고체 함량이 약 0.05 내지 약 2 중량%인 방법.
31. 제 25 항에 있어서, 단계 (a)에서 형성된 용액이 본질적으로 4-α 나선 다발 단백질과 버퍼로 구성되는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 버퍼가 포스페이트인 방법.
33. 제 31 항에 있어서, 상기 단백질이 성장 호르몬을 함유하는 방법.
34. 제 25 항에 있어서, 단계 (b)에서 제조된 분말의 MMAD가 약 3.5 마이크론 미만인 방법.
35. 제 25 항에 있어서, 단계 (a)에서 형성된 단백질 용액에 상응하는 순물질 제형물과 비교하여 분말의 응집물 수준을 유지 또는 저하시키는데 효과적인 안정화 부형제를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, 안정화 부형제가 당, 아미노산, 및 아미노산 2 내지 5 개로 이루어지는 올리고머로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
37. 제 36 항에 있어서, 안정화 부형제가 당인 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 당이 수크로스 또는 라피노스인 방법.
39. 제 38 항에 있어서, 단백질이 인간 성장 호르몬인 방법.
40. 제 36 항에 있어서, 부형제가 아미노산인 방법.
41. 제 40 항에 있어서, 아미노산이 아스파라긴, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 류신, 노르류신 및 발린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
42. 제 41 항에 있어서, 상기 아미노산이 류신, 이소류신 및 노르류신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
43. 제 42 항에 있어서, 상기 단백질이 인간 성장 호르몬인 방법.
44. 제 36 항에 있어서, 상기 부형제가 아미노산 2 내지 5 개로 이루어지는 올리고머인 방법.
45. 제 44 항에 있어서, 상기 부형제가 트리류신인 방법.
46. 제 45 항에 있어서, 상기 단백질이 인간 성장 호르몬인 방법.
47. 제 46 항에 있어서, 단계 (b)에서 제조된 분말이 3.0 마이크론 미만의 MMAD를 추가로 특징으로 하는 방법.
48. 제 45 항에 있어서, 단계 (a)에서, 단백질 용액의 pH를 약 4 미만으로 조절하는 것을 추가로 포함하는 방법.
49. 제 25 항에 있어서, 상기 수성 용매 내에 용해된 4-α 나선 다발 단백질에서 상기 용액 내에 존재하는 전체 고체가 약 50 % 이상인 방법.
50. 제 25 항에 있어서, 상기 조건이 약 30-100 psi 범위의 분무압에서 상기 용액을 분무 건조시키는 것을 포함하는 방법.
51. 제 50 항에 있어서, 상기 조건이 약 30-80 psi 범위의 분무압에서 상기 용액을 분무 건조시키는 것을 포함하는 방법.
52. 인간 성장 호르몬을 함유하는, 에어로졸성 및 단백질 안정성이 우수한 분무 건조된 흡입성 인간 성장 호르몬 분말로, 계면활성제가 없고, (i) 약 65 % 이상의 방출량 및 (ii) 10 % 미만의 전체 단백질 응집물을 특징으로 하는 분말.