KR20030013373A

KR20030013373A - 발효 브로스의 정제 방법

Info

Publication number: KR20030013373A
Application number: KR1020027011048A
Authority: KR
Inventors: 케리빌모스; 디크라요스; 포르각스일로나
Original assignee: 비오갈 기오기스제르갸르 알티.
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2003-02-14
Also published as: AU3654301A; IL151290A0; CN1406283A; RU2002122746A; WO2001062949A1; JP2003523751A; CA2400952A1; AU2001236543B2; RU2265665C2; PL357946A1; HRP20020683A2; IS6521A; ZA200206496B; US6387258B1; HUP0300073A3; CZ20022779A3; EP1263979A1; SK12012002A3; JP3740062B2; EP1263979A4

Abstract

본 발명은 추출 및 결정화에 의해 발효 브로스로부터 스타틴 화합물을 정제하는 방법에 관한 것이다. 발효 브로스로 알칼리 전처리 및 알칼리 정제를 포함하는 전처리 절차를 수행한다. 전처리 절차 후, 산성 조건하에 스타틴 화합물을 소수성 용매로 추출하고, 결정화에 의해 정제한다. 유기 추출 용매를 농축시킨 후, 약염기로 추출한다. 그 후 스타틴 화합물을 결정화에 의해 정제한다.

Description

발효 브로스의 정제 방법{METHOD OF PURIFYING A FERMENTATION BROTH}

심혈관 질환, 예컨대 심근경색, 뇌졸중 및 말초 혈관 질환의 합병증은 미국에서 사망 원인의 1/2을 차지한다. 혈류 중의 고농도의 저밀도 지단백질(LDL)은 혈류를 차단하고, 혈전증을 파열 및 촉진할 수 있는 관상동맥 병변의 형성과 관련이 있다. Goodman 및 Gilman의 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics 879(Joel G. Hardman 등 편저, 9판, 1996] 참조. 혈장 LDL 농도를 낮추는 것은 심혈관 질환 환자와, 심혈관 질환은 없으나 고콜레스테롤혈증이 있는 환자의 임상적 현상들의 위험을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 문헌[Scandinavian Simvastatin Survival Study Group, 1994; Lipid Research Clinics Program, 1984a, 1984b] 참조.

스타틴 약물은 현재로서 심혈관 질환의 위험이 있는 환자의 혈류 중의 LDL 농도를 낮추는 데 유용한 치료적으로 가장 효과적인 약물이다. 이러한 약물의 부류에는 특히, 콤팩틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴 및 플루바스타틴이 포함된다. 스타틴 약물의 작용 기전은 어느 정도 상세히 규명되었다. 스타틴 약물은 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A 리덕타제 효소("HMG-CoA 리덕타제")를 경쟁적으로 억제함으로써 간에서의 콜레스테롤과 기타 스테롤의 합성을 방해한다. HMG-CoA 리덕타제는, 콜레스테롤의 생합성에서 속도 제한 단계인 HMG-CoA에서 메발로네이트로의 전환을 촉매한다. 결론적으로, 이 단계를 억제하면 간에서의 콜레스테롤의 형성 속도가 감소하게 된다.

콤팩틴은 하기 화학식으로 표시되는 화합물 2-메틸부타논산 1,2,3,7,8,8a-헥사히드로-7-메틸-8-[2-(테트라히드로-4-히드록시-6-옥소-2H-피란-2-일)에틸]-1-나프탈레닐 에스테르의 일반 의약명이다.

콤팩틴

콤팩틴은 메바스타틴으로도 불리며, HMG-CoA 리덕타제 억제제인 것으로 밝혀진 최초의 스타틴 약물이다. 콤팩틴은 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum) 및 페니실리움 아다메트지오이드(Penicillium adametzioides)로부터 정제되었다(본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제3,983,140호, 제4,049,495호 및 제5,691,173호 참조).

로바스타틴은 하기 화학식으로 표시되는 화합물 2-메틸부타논산 1,2,3,7,8,8a-헥사히드로-3,7-디메틸-8-[2-(테트라히드로-4-히드록시-6-옥소-2H-피란-2-일)에틸]-1-나프탈레닐 에스테르의 일반 의약명이다.

로바스타틴

로바스타틴은 메비놀린으로도 불리며, 메틸기가 존재한다는 것이 콤팩틴과 유일하게 다른 점이고, 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터 분리할 수 있다(본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제4,294,926호, 제4,420,491호, 제4,319,039호 및 제4,294,896호 참조). 로바스타틴은 몇몇 다른 미생물로부터 분리되기도 하였다(영국 특허 제GB 2,046,737호, 독일 특허 제44 02 591호, 캐나다 특허 제2,129,416호 및 헝가리 특허 제HU 208,997호 참조).

콤팩틴과 로바스타틴은 물론, 다른 스타틴들도 다음과 같이 개환 히드록시산및 락톤형으로 존재한다.

락톤 히드록시산

스타틴 화합물의 유리산과 락톤형은 상이한 극성을 지니기 때문에 락톤과 히드록시산간의 평형은 정제를 어렵게 한다. 한가지 형태를 정제하는 방법은 다른 형태를 제거시켜서 총 수율을 감소시킬 가능성이 있다. 따라서, 이들을 고수율로 분리하기 위해 스타틴 화합물을 정제할 때에는 통상 많은 주의를 기울여야 한다.

미국 특허 제5,202,029호는 HPLC를 이용하여 스타틴 화합물의 락톤형을 정제하는 방법에 관한 것이다. 미정제 발효 브로스(예, 로바스타틴, 심바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴 및 메바스타틴)를 유기 용매에 용해시키고, HPLC 컬럼을 통해 용리시킨다. 용질이 용리액에 용해됨에 따라 스타틴은 컬럼으로부터 용리되어 나온다. 용리액을 부분적으로 증발시킨 후 물을 첨가하여 결정화를 유도한다. 이 방법을 이용한 산업적 규모의 생산에 있어서 주요 단점은 크로마토그래피 컬럼의 비용이 많이 든다는 것이다.

미국 특허 제5,616,595호는 접촉 여과(tangential filtration)에 의해 발효 브로스로부터 각종 수불용성 화합물을 회수하는 연속 방법에 관한 것이다. 이 방법은 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴의 락톤형에 적용될 수 있다. 이 방법은 불용성 화합물을 보유하는 필터를 통해 발효 브로스를 순환시키는 단계를 포함한다. 이 경우 화합물은 용매에 용해시키고 용액을 여과한다. 목적 화합물의 용액을 여과물로서 수집한 후, 목적 화합물을 추가 정제할 수 있다. 화합물의 수불용성으로 인해, 이 방법에는 가용화를 위한 용매가 필요하고, 다중 여과 막이 필요하다. 반복되는 여과는 대규모 제조의 경우 공정 비용을 크게 증가시키게 된다.

락톤형의 로바스타틴을 분리하는 방법은 미국 특허 제5,712,130호에 기술되어 있다. 이 방법에서는, 부틸 아세테이트를 사용하여 발효 브로스로부터 로바스타틴을 추출한다. 그 후 얻어진 용액을 원심분리하고, 수성상은 폐기한다. 유기상을 40℃이상에서 진공 증류시키고, 이에 부가하여 용액을 농축시키면 물이 제거됨으로써 락톤의 형성이 촉진된다. 냉각시키면 로바스타틴 락톤의 결정이 형성되며, 이를 순도 90% 이상으로 재결정화시킨다. 그러나, 약제로서 사용하기 전에 결정화된 로바스타틴을 추가 정제할 필요가 있으며, 이렇게 하면 총 수율이 감소되고 정제 절차에 대한 추가 비용이 부가된다.

발명의 목적 및 개요

발효 브로스로부터 스타틴을 분리하기 위한 공지된 방법은 산업적 규모에 대해 경제적인 공정으로 약학적으로 허용가능한 수준의 순도를 달성하지 못하거나, 또는 고순도를 얻기 위한 크로마토그래피 분리를 필요로 한다. 본 발명의 이와 같은 목적은 발효 브로스로부터 스타틴을 약학적으로 허용가능한 수준의 순도(즉, 98.5% 이상)로 분리하기 위한 간단하고 신속한 고수율 공정에 대한 당업계의 요구를 충족시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 발효 브로스로부터 락톤을 형성할 수 있는 카르복실산과 융합형 이환 고리를 포함하는 스타틴 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 발효 브로스를 추출 용매와 접촉시켜서 발효 브로스로부터 추출 용매로 스타틴 화합물을 추출함으로써, 발효 브로스로부터 스타틴 화합물을 추출하는 단계[추출 용매는 소수성 유기 추출 용매임], 발효 브로스로부터 소수성 유기 추출 용매를 분리하는 단계, 추출된 스타틴 화합물을 포함하는 소수성 유기 추출 용매의 용액을 농축시키는 단계, 및 결정화에 의해 추출된 스타틴 화합물을 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 발효 브로스로부터 락톤을 형성할 수 있는 카르복실산과 융합형 이환 고리를 포함하는 스타틴 화합물을 분리하는 방법으로서,

(a) 알칼리 조건하에 발효 브로스를 전처리하여 비극성 불순물을 제거하는 단계;

(b) 발효 브로스로부터 소수성 유기 추출 용매로 스타틴 화합물을 추출하는 단계;

(c) 발효 브로스로부터 소수성 유기 추출 용매를 분리하는 단계;

(d) 추출된 스타틴 화합물을 포함하는 소수성 유기 추출 용매의 용액을 농축시키는 단계;

(e) 염기를 포함하는 수용액으로 소수성 유기 추출 용매의 농축 용액을 세척하여 락톤을 정제하는 단계; 및

(f) 결정화에 의해 추출된 스타틴 화합물을 정제하는 단계

를 포함하는 것인 방법이다.

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2000년 2월 2일에 출원된 가명세서 출원 일련번호 제60/184,522호의 이익을 주장하며, 그 출원 내용은 본원에서 참고로 인용한다.

본 발명은 발효 브로스(broth)로부터 화합물을 정제하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 발효 브로스로부터 결정형의 스타틴을 분리하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 콤팩틴과 로바스타틴의 정제에 의해 예시된 바와 같이, 발효 브로스로부터 스타틴 화합물의 고순도 결정을 얻기 위한 방법이다. 당업자는 본 발명의 방법이 미생물 공정 또는 효소 공정에 의해 제조되는, 심바스타틴, 프라바스타틴 및 플루바스타틴과 같은 락톤을 포함하는 다른 화합물을 정제하는 데 이용될 수 있음을 알 것이다. 당업자는 또한 스타틴 화합물의 정제를 위한 최적 조건은 분리하고자 하는 특정 스타틴 화합물, 발효 브로스 및 그 화합물을 생산하는 미생물에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예는 (i) 알칼리 조건하에 발효 브로스를 전처리하여 비극성 불순물을 제거하는 단계; (ii) 산성 조건하에 발효 브로스로부터 스타틴을 히드록시산 또는 락톤 형태로 소수성 유기 추출 용매로 추출하는 단계; (iii) 발효 브로스로부터 소수성 유기 추출 용매를 분리하는 단계; (iv) 락톤을 형성하는 동안 추출된 스타틴 화합물을 포함하는 소수성 유기 추출 용매를 농축시키는 단계; 및 (v) 결정화에 의해 추출된 스타틴 화합물을 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서는 알칼리 조건하에 발효 브로스를 전처리하는 단계가 생략된다.

다른 구체예에서는 결정화 전에 농축된 소수성 유기 용매를 염기를 포함하는 수용액으로 세척하여 수율을 증가시킨다. 바람직한 염기성 용액은 수산화암모늄(NH₄OH, pH 약 7.5 ∼ 약 10), 또는 약 1 ∼ 5%(w/w)중탄산나트륨(NaHCO₃) 또는 탄산나트륨(Na₂CO₃)을 포함한다.

알칼리 조건하의 발효 브로스의 전처리

발효 브로스의 전처리는 알칼리 조건하에 발효 브로스를 처리한 후, 소수성 유기 추출 용매 또는 용매 혼합물로 추출하는 것을 포함한다. 전처리 단계의 알칼리 조건은 스타틴의 락톤을 상응하는 스타틴 히드록시산으로 가수분해시킨다(Andrew Streitweiser, Jr. 및 Clayton Heathcock, Introduction to Organic Chemistry, 858-60 MacMillan Publishing Co., 2판, 1981). 스타틴 히드록시산은 수성 발효 브로스에 잔류하는 반면, 지방 성분 및 유성 성분과 발효 브로스 유래의 기타 비극성 유기 불순물은 전처리 소수성 유기 추출 용매 또는 용매 혼합물로 분배된다. 따라서, 알칼리 조건하에 발효 브로스를 전처리하면 불순물로부터 스타틴 히드록시산이 분리되어 스타틴 히드록시산이 전체적으로 정제된다.

발효 브로스내 비극성 불순물의 존재는 결정화의 총 수율을 감소시키는 것으로 보이므로, 비극성 불순물의 제거는 결정화의 총 수율을 향상시킨다. 따라서, 알칼리 조건하에 발효 브로스를 전처리하면 발효 브로스로부터 비극성 불순물이 제거되어, 결정화 단계의 총 수율이 상당히 증가하게 된다.

전처리 단계 동안, 발효 브로스의 pH, 또는 발효 브로스와 소수성 유기 추출 용매의 혼합물의 pH를 알칼리 pH로 조절한다. pH는 무기 염기 또는 유기 아민을 첨가하여 조절하는 것이 바람직하다. 바람직한 무기 염기 또는 유기 아민으로는 NaOH, KOH, LiOH, Ca(OH)₂, NH₄OH 및 트리에틸아민을 들 수 있다. 가장 바람직한 염기는 NaOH이다. pH는 약 7.0 ∼ 약 13.9이다. 콤팩틴과 로바스타틴에 대해서는, pH를 약 8.5 ∼ 약 10.0의 범위로 조절하는 것이 바람직하다. 콤팩틴과 로바스타틴에 대한 가장 바람직한 pH는 약 9.0 ∼ 약 9.6이다.

알칼리 조건하의 사전 항온처리는 약 15℃ ∼ 약 100℃의 온도에서 수행할 수 있다. 약 15℃ ∼ 20℃의 온도는 정제된 스타틴의 총 수율을 감소시킨다.

약 80℃ ∼ 약 100℃에서, 사전 항온처리를 위한 바람직한 조건은 pH 약 12.0 ∼ 약 13.9에서 약 15분간 처리하는 것이다. 약 55℃ ∼ 약 65℃에서 바람직한 사전 항온처리 조건은 pH 약 9.0 ∼ 약 9.6에서 2시간이다. 약 15℃ ∼ 약 25℃에서 바람직한 사전 항온처리 조건은 pH 약 9.0 ∼ 약 9.6에서 48시간이다.

전처리 소수성 유기 추출 용매의 비제한적인 예로는 i-부틸-아세테이트, n-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 톨루엔, 아세토니트릴, 메틸 포르메이트, 메탄올, 에탄올, i-프로판올, n-프로판올, n-부탄올, i-부탄올, t-부탄올, 아밀 알코올 및 벤질 알코올을 들 수 있다.

또는, 전처리 소수성 유기 추출 용매는 상기 용매들의 임의의 혼합물을 포함할 수 있다. 알칼리 추출을 위한 유기 용매의 비제한적인 예로는 i-부틸-아세테이트, n-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 톨루엔 및 벤질 알코올을 들 수 있다. 바람직한 전처리 소수성 유기 추출 용매는 i-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 및 톨루엔이다. 가장 바람직한 소수성유기 추출 용매는 i-부틸 아세테이트이다. 알코올 사용은 용매 재생 때문에 바람직하지 못하다. 그러나, 알코올은 알칼리 pH에서 아세테이트의 경우에 존재한다. 알코올은 알칼리 조건에서 락톤 고리의 개환을 촉진한다. 전처리는 추출 용매없이 수행될 수도 있다.

이러한 바람직한 구체예에서는, 전처리 후, 지방 성분 및 유성 성분은 물론, 기타 비극성 유기 불순물이 발효 브로스로부터 거의 제거될 때까지 알칼리 조건하에 소수성 유기 추출 용매를 발효 브로스와 접촉시킨다. 주관적인 판단을 비롯하여, 얇은 막 크로마토그래피 또는 임의의 다른 방법을 이용하여 발효 브로스로부터 비극성 불순물의 고갈을 평가할 수 있다. 최적의 불순물 제거를 위해서는 추출을 다수회 수행할 수 있다. 그러나, 알칼리 추출을 위해 i-부틸 아세테이트를 사용하는 경우 1 ∼ 2회의 추출이 가장 효율적이다. 알칼리 추출은 발효 부피의 약 20% ∼ 약 50%(v/v)의 용매로 수행하는 것이 바람직하다.

산성 조건하에 발효 브로스를 추출하기 전에 pH를 조절함

정제된 발효 브로스의 pH는 스타틴 화합물을 소수성 유기 추출 용매로 추출하기 전에 강산을 사용하여 약 1.0 ∼ 약 6.4로 조절하는 것이 바람직하다. 로바스타틴과 콤팩틴의 경우 바람직한 pH 범위는 약 2.0 ∼ 약 4.5이다. 프라바스타틴의 경우 바람직한 pH는 약 4.5 ∼ 약 6.0이다. pH 조절에 바람직한 산은 황산과 인산이다. 대안으로, 스타틴 화합물의 추출은 소수성 추출 용매의 pH를 약 1.0 ∼ 약 6.4로 조절하여 수행할 수 있다.

산성 조건하에 히드록시산 또는 락톤으로서 스타틴 화합물을 추출함

히드록시산과 락톤이 발효 브로스로부터 거의 제거될 때까지 산성 조건하에 소수성 유기 추출 용매를 정제된 발효 브로스와 접촉시킨다. 주관적인 판단을 비롯하여, 얇은 막 크로마토그래피 또는 임의의 다른 방법을 이용하여 락톤이 소수성 유기 추출 용매로 회수된 것을 평가할 수 있다. 최적의 회수를 위해서는 추출을 다수회 수행할 수 있다. 그러나, 소수성 유기 추출 용매가 i-부틸 아세테이트이고, pH가 상기한 바와 같은 최적 범위에 속하는 경우 2 ∼ 3회의 추출이 가장 효율적이다. 유기 추출 용매 부피의 약 2배인 부피의 발효 브로스를 사용하여 추출을 수행하는 것이 바람직하다.

콤팩틴 추출을 위한 가장 바람직한 소수성 유기 추출 용매는 i-부틸 아세테이트이다. 다른 적절한 소수성 유기 추출 용매의 비제한적인 예로는 n-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄 및 톨루엔을 들 수 있다. 바람직한 추출 용매는 i-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 및 부틸 메틸 케톤이다. 산성 추출시에는 용매 혼합물을 사용하지 않는다.

발효 브로스와 소수성 유기 추출 용매의 상 분리

발효 브로스는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 소수성 유기 추출 용매로부터 분리할 수 있다. 바람직한 분리 방법으로는 역류 추출이 있다. 디캔터(decanter)는 역류 추출을 위한 공지된 장치이다. 상 분리 후, 물로 세척하여 용매의 순도를 향상시킬 수 있다.

소수성 유기 추출 용매의 농축

상 분리 후에는 소수성 유기 추출 용매의 부피를 감소시킨다. 부피 감소는 약 30℃ ∼ 약 90℃의 온도에서 감압하에 증발에 의해 수행할 수 있다. 증발은 감압하에 약 40℃ ∼ 약 70℃의 온도에서 수행된다. 대안으로, 소수성 용매의 증발은 고온(약 90℃ 이하)에서 감압하에 또는 대기압에서 수행된다.

결정화에 의한 추출된 스타틴 화합물의 정제

결정화되는 스타틴 화합물의 농도가 50 ∼ 250 g/ℓ로 될 때까지 소수성 유기 추출 용매를 증발시킨다. 로바스타틴은 80 ∼ 100 g/ℓ의 농도로 최적으로 결정화시키고, 콤팩틴은 130 ∼ 170 g/ℓ의 농도로 최적으로 결정화시키고, 프라바스타틴은 80 ∼ 120 g/ℓ의 농도로 최적으로 결정화시킨다.

결정화는 상온에서 밤새도록 수행할 수 있다. 바람직한 온도 범위는 약 -10℃ ∼ 약 5℃이다. 결정화는 약 -10℃에서 약 20시간 동안 수행하는 것이 가장 바람직하다.

결정화는 하기 용매 중 임의의 것, 또는 하기 용매들의 혼합물 중에서 수행할 수 있다: 에탄올, i-프로판올, n-프로판올, i-부탄올, n-부탄올, t-부탄올, 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올, 아세토니트릴, 에틸 포르메이트, i-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 톨루엔, 프로필 아세테이트 및 부틸 메틸 케톤. 바람직한 용매로는 톨루엔, 이소프로판올, i-부틸 아세테이트 또는 에탄올-물 혼합물의 혼합물을 들 수 있다. 가장 바람직한 용매는 i-부틸 아세테이트와 에탄올-물 혼합물이다.

바람직한 구체예의 방법을 이용하여 얻은 결정은 3.6%(w/w) 이하의 불순물을 포함하고, 75% w/w 이상의 수율로 얻어진다. 물:에탄올로부터의 재결정화에 의해 얻은 스타틴 정제의 경우, 바람직한 물:에탄올의 비는 약 0.8 ∼ 약 2.0이다. 가장 바람직한 물:에탄올 비는 0.9 ∼ 1.2이다. 바람직한 구체예를 이용하여 얻은 결정은 순도가 98.5%(w/w) 이상이다.

본 발명은 하기 실시예를 통해 추가로 설명될 것이다. 다른 언급이 없다면 모든 수율은 %(w/w)로 표시하며, 총 수율 또는 모든 단계들의 수율을 나타내는 것이다. 그러나, 본 발명은 실시예에 의해 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다. 당업자는 원하는 결과를 얻기 위해 예시된 제조법들을 어떻게 변화시켜야 하는지 알 것이다.

실시예 1: 콤팩틴의 분리

350 kg의 콤팩틴을 포함하는 발효 브로스(70 m³)를 당업계에 잘 알려진 방법으로 제조하였다(예컨대, 미국 특허 제3,983,140호, 제4,049,495호 및 제5,691,173호 참조). i-부틸 아세테이트(35 m³) 및 물(35 m³)을 연속적으로 수성 발효 브로스(70 m³)에 첨가하였다. 농축 NaOH를 첨가하여 pH를 약 9.0 ∼ 9.6으로 조절하였다. 그 후 혼합물을 60℃로 가열하고, 그 온도에서 2시간 동안 유지시켰다. 그 후 형성된 유기상과 수성상을 역류 분리를 이용하여 분리하였다. 분리 중에 혼합물의 탈유화를 촉진하기 위해 나트륨 라우릴 설페이트를 첨가하였다.

황산을 사용하여 정제된 발효 브로스의 pH를 약 2.0 ∼ 4.5로 산성화시켰다. 그 후 i-부틸 아세테이트(35 m³)를 연속적으로 첨가하고, 동일계에서 혼합한 후 콤팩틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 연속적으로 분리하였다.

i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켜서 부피가 약 2,150 ℓ가 되게 하였다. 농축된 용액을 0 ∼ 5 ℃에 밤새도록 정치시키자, 콤팩틴이 78%(w/w) 수율 및 93%(w/w) 순도로 결정화되었다. 그 후 1.2:0.9의 에탄올:물 혼합물로부터 미정제 콤팩틴을 재결정화시키자, 수율 75%(w/w) 및 순도 99.0%(w/w)가 되었다.

실시예 2: 알칼리 조건하에서의 발효 브로스의 사전 정제 단계없이 콤팩틴을 분리함

실시예 1에서와 같이 콤팩틴을 포함하는 발효 브로스를 제조하였다. 황산을 사용하여 발효 브로스(50 ℓ)의 pH를 약 2.0 ∼ 4.5로 산성화하였다. 그 후 i-부틸 아세테이트(25 ℓ) 및 물(25 ℓ)을 첨가하고, 약 0.5시간 동안 혼합한 후, 콤팩틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 분리하였다. 순수한 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 사용하여 추출을 반복하였다. 합한 i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켜서 부피가 약 1.5 ℓ가 되게 하였다. 농축된 용액을 0 ∼ 5℃에 밤새도록 정치시키자, 콤팩틴이 수율 33%(w/w) 및 순도 94.5%(w/w)로 결정화되었다. 실시예 1은 알칼리 추출을 이용하는 것에 대해 예시한 것이고, 실시예 2는 알칼리 추출 단계가 없는 기법을 이용하는 것에 대해 예시한 것이다.

실시예 3: 콤팩틴의 분리: 알칼리 조건하에 농축된 i-부틸 아세테이트의발효 브로스의 전처리 및 NaHCO ₃ 를 사용한 세척

실시예 1에서와 같이 발효 브로스를 제조하였다. i-부틸 아세테이트(25 ℓ) 및 물(25 ℓ)을 수성 발효 브로스(50 ℓ)에 첨가하였다. 농축 NaOH를 첨가하여 pH를 약 9.0 ∼ 약 9.6으로 조절하였다. 그 후 혼합물을 약 60℃로 가열하고, 그 온도에서 2시간 동안 유지시켰다. 그 후 상을 분리하였다. 분리 중에 혼합물의 탈유화를 촉진하기 위해 도데실 트리메틸 암모늄 클로라이드를 첨가하였다. 황산을 사용하여 정제된 발효 브로스의 pH가 약 2.0 ∼ 4.5가 되도록 산성화하였다. 그 후 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 첨가하고, 약 0.5시간 동안 혼합한 후, 콤팩틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 분리하였다. 순수한 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 사용하여 산 추출을 반복하였다.

합한 i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켜서 부피가 약 1.5 ℓ가 되게 하였다. 농축된 용액을 희석시켜서 부피가 약 8 ℓ가 되게 하고, 이를 포화 중탄산나트륨으로 세척하였다. 세척된 용액을 다시 농축시켜서 부피가 1.5 ℓ가 되게 하고, 이것을 0 ∼ 5℃에서 밤새도록 정치시키자, 수율 76.5%(w/w) 및 순도 98.9%(w/w)로 콤팩틴이 결정화되었다.

사전 알칼리 추출을 하지 않는 경우, 콤팩틴은 단지 수율 39%(w/w) 및 순도 99.1%(w/w)로 얻어졌다.

실시예 4: 콤팩틴의 분리: 알칼리 조건하의 발효 브로스의 전처리 중 감소된 온도가 미치는 영향

실시예 1에서와 같이 발효 브로스를 제조하였다. i-부틸 아세테이트(25 ℓ) 및 물(25 ℓ)을 수성 발효 브로스(50 ℓ)에 첨가하였다. 농축 NaOH를 첨가하여 pH를 약 9.0 ∼ 약 9.6으로 조절하였다. 그 후 혼합물을 약 15℃ ∼ 약 20℃에서 약 2시간 동안 유지시켰다. 그 후 상을 분리하였다. 분리 중에 혼합물의 탈유화를 촉진하기 위해 도데실 트리메틸 암모늄 클로라이드를 첨가하였다. 황산을 사용하여 정제된 발효 브로스의 pH가 약 2.0 ∼ 4.5가 되도록 산성화시켰다. 그 후 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 첨가하고, 약 0.5시간 동안 혼합한 후, 콤팩틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 분리하였다. 순수한 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 사용하여 추출을 반복하였다. 합한 i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켜서 부피가 약 1.5 ℓ가 되게 하였다. 농축된 용액을 0 ∼ 5℃에서 밤새도록 정치시키자, 콤팩틴이 결정화되었다. 그 후 1.2:0.9의 에탄올:물 혼합물로부터 미정제 콤팩틴을 재결정화하였다. 총 수율은 67%(w/w)였고, 순도는 99.1%(w/w)였다.

실시예 5: 콤팩틴의 분리: 산성 추출시의 산성 pH 1.0 ∼ 2.0과 결정화 중에 하강된 온도가 미치는 영향

실시예 1에서와 같이 발효 브로스를 제조하였다. i-부틸 아세테이트(25 ℓ) 및 물(25 ℓ)을 수성 발효 브로스(50 ℓ)에 첨가하였다. 농축 NaOH를 첨가하여 pH를 약 9.0 ∼ 약 9.6으로 조절하였다. 그 후 혼합물을 약 60℃에서 약 2시간 동안 유지시켰다. 그 후 상을 분리하였다. 분리 중에 혼합물의 탈유화를 촉진하기 위해 도데실 트리메틸 암모늄 클로라이드를 첨가하였다. 황산을 사용하여 발효 브로스의 pH가 약 1.0 ∼ 2.0이 되도록 산성화하였다. 그 후 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 첨가하고, 약 0.5시간 동안 혼합한 후, 콤팩틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 분리하였다. 순수한 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 사용하여 추출을 반복하였다.

콤팩틴의 농도가 약 150 g/ℓ가 될 때까지 합한 i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켰다. 농축된 용액을 약 -10℃의 온도에서 약 20시간 동안 유지시켰다. 결정을 여과하고, i-부틸 아세테이트로 세척하였다. 그 후 1.2:0.9의 에탄올:물 혼합물로부터 미정제 콤팩틴을 재결정화하였다. 콤팩틴은 수율 67%(w/w) 및 순도 98.8%(w/w)로 얻어졌다. 산성 추출(pH 1.0 ∼ 2.0)은 수율을 감소시켰다.

알칼리 조건하의 발효 브로스의 전처리를 이용한 이 실시예의 절차를 약 15℃에서 수행할 경우, 콤팩틴의 총 수율은 60%(w/w)로 감소되었고, 순도는 98.7%(w/w)가 되었다.

실시예 6: 로바스타틴의 분리

로바스타틴을 포함하는 발효 브로스는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 제조하였다(예컨대, 미국 특허 제5,403,728호, 제4,420,491호, 제4,342,767호, 제4,319,039호 및 제4,294,846호 참조). i-부틸 아세테이트(25 ℓ) 및 물(25 ℓ)을 수성 발효 브로스(50 ℓ)에 첨가하였다. 농축 NaOH를 첨가하여 pH를 약 9.0 ∼ 약 9.6으로 조절하였다. 그 후 혼합물을 약 60 ±5℃로 가열하고, 그 온도에서 약 2시간 동안 유지시켰다. 그 후 상을 분리하였다. 분리 중에 혼합물의 탈유화를 촉진하기 위해 도데실 트리메틸 암모늄 클로라이드를 첨가하였다.

황산을 사용하여 정제된 발효 브로스의 pH가 약 2.0 ∼ 4.5가 되도록 산성화하였다. 그 후 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 첨가하고, 이를 약 2시간 동안 혼합한후, 로바스타틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 분리하였다. 순수한 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 사용하여 추출을 반복하였다.

부피가 약 2.7 ℓ가 될 때까지 합한 i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켰다. 농축된 용액을 약 -10℃의 온도에서 36시간 동안 정치시키자, 로바스타틴이 76%(w/w) 수율 및 96.4%(w/w) 순도로 결정화되었다. 그 후 1.2:0.9의 에탄올:물의 혼합물로부터 미정제 로바스타틴을 재결정화하자 수율 71.4%(w/w) 및 순도 98.7%(w/w)가 되었다.

실시예 7: 알칼리 조건하에 발효 브로스를 사전 정제하지 않고 로바스타틴을 분리함

실시예 6에서와 같이 로바스타틴을 포함하는 발효 브로스를 제조하였다. 황산을 사용하여 정제된 발효 브로스(50 ℓ)의 pH가 약 2.0 ∼ 4.5가 되도록 산성화하였다. 그 후 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)와 물(25 ℓ) 첨가하고, 약 2시간 동안 혼합한 후, 로바스타틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 분리하였다. 순수한 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 사용하여 추출을 반복하였다. 합한 i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켜서 부피가 약 2.7 ℓ가 되게 하였다. 농축된 용액을 약 -10℃의 온도에서 36시간 동안 정치시키자, 로바스타틴이 수율 26%(w/w) 및 순도 88.0%(w/w)로 결정화되었다.

실시예 8: 로바스타틴의 분리: NaHCO ₃ 를 사용한 세척을 적용함

실시예 6에서와 같이 발효 브로스를 제조하였다. 수성 발효 브로스(50 ℓ)에i-부틸 아세테이트(25 ℓ)와 물(25 ℓ)을 첨가하였다. 농축 NaOH를 첨가하여 pH가 약 9.0 ∼ 약 9.6이 되도록 조절하였다. 그 후 혼합물을 약 60℃로 가열하고, 그 온도에서 약 2시간 동안 유지하였다. 그 후 상을 분리하였다. 분리 중에 혼합물의 탈유화를 촉진하기 위해 도데실 트리메틸 암모늄 클로라이드를 첨가하였다. 황산을 사용하여 정제된 발효 브로스의 pH를 약 2.0 ∼ 약 4.5로 조절하였다. 그 후 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 첨가하고, 이를 2시간 동안 혼합한 후, 콤팩틴을 포함하는 i-부틸 아세테이트 상을 분리하였다. 순수한 i-부틸 아세테이트(25 ℓ)를 사용하여 추출을 반복하였다.

합한 i-부틸 아세테이트 상을 진공하에 농축시켜서, 부피가 약 2.7 ℓ가 되게 하였다. 농축된 용액을 부피가 약 11 ℓ가 되도록 희석시키고, 이를 포화 중탄산나트륨으로 세척하였다. 세척된 용액을 다시 2.7 ℓ로 농축시키고 -10℃에서 36시간 동안 정치시키자, 로바스타틴이 수율 73.4%(w/w) 및 순도 98.0%(w/w)로 얻어졌다.

Claims

락톤을 형성할 수 있는 카르복실산과 융합형 이환 고리를 포함하는 스타틴 화합물을 발효 브로스로부터 분리하는 방법으로서,

(a) 알칼리 조건하에 발효 브로스를 전처리하여 비극성 불순물을 제거하는 단계;

(b) 발효 브로스를 추출 용매와 접촉시켜서 발효 브로스로부터 추출 용매로 화합물을 추출함으로써, 발효 브로스로부터 스타틴 화합물을 추출하는 단계로서, 상기 추출 용매는 소수성 유기 추출 용매인 것인 단계;

(c) 발효 브로스로부터 소수성 유기 추출 용매를 분리하는 단계;

(d) 추출된 스타틴 화합물을 포함하는 소수성 유기 추출 용매의 용액을 농축시키는 단계; 및

(e) 결정화에 의해 추출된 스타틴 화합물을 정제하는 단계

를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 스타틴 화합물은 HMG-CoA 리덕타제의 억제제인 것인 방법.
제1항에 있어서, 스타틴 화합물은 로바스타틴, 콤팩틴 및 프라바스타틴으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 스타틴 화합물을 포함하는 발효 브로스를 알칼리 조건하에 전처리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 발효 브로스의 전처리 단계 동안, 발효 브로스는

(a) 약 15℃ ∼ 약 100℃의 온도;

(b) pH 약 7.0 ∼ 약 13.9에서

(c) 0 ∼ 약 48시간 동안

유지되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 발효 브로스의 전처리 단계 동안, 발효 브로스는

(a) 약 55℃ ∼ 약 65℃의 온도;

(b) pH 약 9.0 ∼ 약 9.6에서

(c) 약 2시간 동안

유지되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 수산화암모늄, NaOH, KOH, LiOH 및 Ca(OH)₂로 구성된 군에서 선택되는 무기 염기를 사용하여 발효 브로스의 pH를 조절하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 추출 단계는 발효 브로스를 소수성 유기 추출 용매와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 전처리 소수성 유기 추출 용매는 i-부틸-아세테이트, n-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로에탄, 톨루엔, 아세토니트릴, 메틸 포르메이트, 메탄올, 에탄올, i-프로판올, n-프로판올, n-부탄올, i-부탄올, t-부탄올, 아밀 알코올 및 벤질 알코올, 그리고 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 소수성 유기 추출 용매는 i-부틸-아세테이트, n-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로메탄, 또는 톨루엔인 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효 브로스로부터 스타틴 화합물을 추출하는 단계는 발효 브로스의 pH를 약 1.0 ∼ 약 6.4로 조절하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 발효 브로스의 pH를 약 2.0 ∼ 약 4.5로 조절하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 발효 브로스의 pH는 황산 및 인산으로 구성된 군에서 선택되는 산으로 조절하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효 브로스로부터 스타틴 화합물을 추출하는 단계는 단계 (b)의 소수성 유기 추출 용매의 pH를 약 1.0 ∼ 약 6.4로 조절하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)의 소수성 유기 추출 용매는 i-부틸-아세테이트, n-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 에틸 포르메이트, 부틸 메틸 케톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로메탄 및 톨루엔으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b) 이후에 소수성 유기 추출 용매를 염기를 포함하는 수용액과 접촉시키는 것인 방법.
제16항에 있어서, 염기는 수산화암모늄, NaHCO₃및 Na₂CO₃로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 소수성 유기 추출 용매는 i-부틸 아세테이트이고, 스타틴 화합물은 콤팩틴인 것인 방법.
제1항에 있어서, 추출된 스타틴 화합물을 포함하는 소수성 유기 추출 용매의 용액을 농축시키는 단계는 감압에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 추출된 스타틴 화합물을 포함하는 소수성 유기 추출 용매의 용액을 농축시키는 단계는 약 90℃ 이하의 온도에서 증발에 의해 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 결정화 단계는 약 -10℃ ∼ 약 20℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 결정화 단계는 약 0℃ ∼ 약 5℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 결정화 단계는 약 -10℃ ∼ 약 0℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 결정화에 의해 추출된 스타틴 화합물을 정제하는 단계는 에탄올, i-프로판올, n-프로판올, i-부탄올, n-부탄올, t-부탄올, 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올, 아세토니트릴, 에틸 포르메이트, i-부틸 아세테이트, t-부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 톨루엔, 프로필 아세테이트 및 부틸 메틸 케톤, 그리고 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 용매를 사용하여 수행되는 것인 방법.
락톤을 형성할 수 있는 카르복실산과 융합형 이환 고리를 포함하는 스타틴 화합물을 발효 브로스로부터 분리하는 방법으로서,

(a) 알칼리 조건하에 발효 브로스를 전처리하여 비극성 불순물을 제거하는 단계;

(b) 발효 브로스를 소수성 유기 추출 용매와 접촉시켜서 발효 브로스로부터 소수성 용매로 스타틴 화합물을 추출함으로써, 발효 브로스로부터 스타틴 화합물을 추출하는 단계;

(c) 발효 브로스로부터 소수성 용매를 분리하는 단계;

(d) 추출된 스타틴 화합물을 포함하는 소수성 용매의 용액을 농축시키는 단계;

(e) 소수성 용매의 농축 용액을 염기를 포함하는 수용액으로 세척하는 단계; 및

(f) 결정화에 의해 추출된 스타틴 화합물을 정제하는 단계

를 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 수성 염기성 용액은 수산화암모늄, NaHCO₃및 Na₂CO₃를 포함하는 것인 방법.
제25항에 있어서, 스타틴 화합물은 HMG-CoA 리덕타제의 억제제인 것인 방법.