KR20020068461A

KR20020068461A - 비타민 ｅ 중간체의 제조 방법

Info

Publication number: KR20020068461A
Application number: KR1020020008903A
Authority: KR
Inventors: 본라트베르너; 아이젠크라에처데틀레프; 엔졸라스발레리; 카르게라인하르트; 네쳐트호마스; 슈나이더미카엘
Original assignee: 로슈 비타민즈 아게
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2002-08-27
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: CN1373225A; ATE478960T1; US20020161246A1; US6743615B2; KR100831541B1; JP2002291495A; ES2350741T3; EP1239045A1; DE60237411D1; CN1242067C; EP1239045B1

Abstract

본 발명은 리파제를 사용하여 선택적으로 효소적인 모노에스테르 가수분해 반응을 수행함으로써 트리메틸하이드로퀴논 디아세테이트로부터 트리메틸하이드로퀴논-1-모노아세테이트를 수득하는 방법에 관한 것이다.

효소의 활성은 효소를 고체 담체 물질 상에 고정화함으로써 증가시킬 수 있다. 효소를 적절한 담체 상에 고정화할 때, 모노에스테르 가수분해 반응을 회분식 대신 연속식으로 수행할 수 있다.

트리메틸하이드로퀴논-1-모노아세테이트를 이소피톨 또는 그의 등가물과 반응시켜 직접적으로 또는 경우에 따라 후속적으로 아세틸화함으로써 (완전-라세미성)-α-토코페롤 또는 그의 아세트산 염으로 전환시킬 수 있다.

Description

비타민 Ｅ 중간체의 제조 방법{PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF A VITAMIN E INTERMEDIATE}

비타민 E의 주요 시판 형태는, 예를 들어 아세트산 무수물로 (완전-라세미성)-α-토코페롤을 아세틸화함으로써 합성된 아세테이트 유도체이다.

(완전-라세미성)-α-토코페롤의 산업적인 합성은 트리메틸하이드로퀴논(TMHQ)과 이소피톨, 피톨 또는 그의 유도체(예를 들어, 할로겐화 피틸)의 축합에 바탕을 두고 있다. 그러나, TMHQ는 값비싼 2,3,6-트리메틸페놀로부터 수득되는 것이 정상적이고, TMHQ를 이소피톨, 피톨 또는 그의 유도체(예를 들어, 할로겐화 피틸)와 축합하기 위해 산성 촉매를 사용해야 한다.

또 다르게는, (완전-라세미성)-α-토코페롤 아세테이트는 트리메틸하이드로퀴논-1-모노아세테이트(TMHQ-1-MA)를 이소피톨 또는 그의 등가물과 축합함으로써 합성될 수 있다. 그러나, 이러한 또 다른 합성에 사용된 TMHQ-1-MA는 케토이소포론을 통한 훨씬 덜 값비싼 α-이소포론 및 트리메틸하이드로퀴논 디아세테이트(TMHQ-DA)로부터 수득될 수 있으나, 트리메틸하이드로퀴논 디아세테이트는 문헌에서 공지된 방법(예를 들어, 수성 알칼리성 염기에 의한 처리)에 의해 달성되기 어려운 완전히 위치 선택적인 모노-탈아세틸화 반응을 겪어야 한다.

본 발명의 목적은 TMHQ-DA를 TMHQ-1-MA로 완전히 위치 선택적으로 전환하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의해, 리파제를 사용하여 TMHQ-DA를 효소적으로 모노에스테르 가수분해 반응시킴으로써 완전히 위치 선택적으로 TMHQ-1-MA로 전환시킬 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명의 바람직한 양태로, 리파제는 고체 담체 물질 상에 고정화된다. 상기 담체 물질은 소수성 담체, 예를 들어 독일 오베른부르크 소재의 멤브라나 게엠베하(Membrana GmbH)로부터 제공된 액큐럴 엠피(ACCUREL MP) 1001과 같은 폴리프로필렌 담체일 수 있다. 그러나, 다른 성질의 담체, 즉 효소를 고정화하기 위해 종종 사용하는 알칼리성 촉매 담체 셀라이트(CELITE)[화학 조성: SiO₂87%, CaO 0.9%, Al₂O₃6.1%, Fe₂O₃1.6%, Na₂O+K₂O 1.6%; pH 8.5(10% 현탁액, 25℃)]는 고정화된 효소의 만족스러운 성능을 제공하지 않았다.

본 발명의 목적에 적합한 리파제는 효소 분류 EC 3.1.1.3에 속하는 것들을포함한다.

시판되는 다양한 리파제 중에서, 특히 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus) 리파제(TLL), 무코르 미헤이(Mucor mihei) 리파제(MML), 알칼리제네스(Alcaligenes)종 리파제(ASL), 칸디다 루고사(Candida rugosa) 리파제(CRL), 칸디다 안타르티카(Candida antartica)(분획 B) 리파제(CAL(B)) 및 슈도모나스(Pseudomonas)종 리파제(PSL)(예를 들어, 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 리파제(PFL))는 본 발명의 목적에 효과적임이 입증되었다. 리파제는 바람직하게는 PSL, PFL 및 TLL이고, 특히 바람직하게는 TLL이다.

본 발명의 효소적 모노에스테르 가수분해 반응은 편의상 소수성 용매, 예를 들어 1-메틸-2-피롤리돈, 또는 특히 에테르 용매(예를 들어, 3차-부틸 메틸에테르, 부틸 에테르, 메틸 2-메틸-2-부틸 에테르 등) 중에서, 특히 바람직하게는 3차-부틸 메틸에테르 중에서 수행된다.

편의상 약 0.01 내지 약 99.5 용량%, 바람직하게는 약 0.03 내지 약 20 용량%, 가장 바람직하게는 약 0.09 내지 약 5 용량%의 물 또는 완충액(예를 들어, 인산염 완충액)은 에테르 용매에 첨가될 수 있다. 에탄올은 1% 이하의 농도로 존재할 수 있다.

문헌[Tetrahedron,56, 317-321, 2000]에는, 특히 물의 존재하에 3차-부틸 메틸에테르 중에서 유리 효소 PSL에 의해 2-메틸-1,4-디아세톡시나프탈렌을 상응하는 1-아세톡시-4-하이드록시 화합물로 선택적으로 모노에스테르 가수분해 반응시킴이 기재되어 있다. 그러나, 185시간 이하의 시간에 걸쳐 상기 실험을 반복하였을 때, 일관성 없는 결과를 나타냄이 밝혀졌다. 또한, 약 300시간 이하의 시간에 걸쳐 동일한 반응 조건하에 TMHQ-DA를 유리 효소 PSL로 처리할 때, 초기 반응 속도는 단지 약 1/3이었다. 그에 비하여, 100시간 미만의 시간에 걸쳐 고정화된 PSL에 의해 TMHQ-DA를 모노에스테르 가수분해 반응시킨 결과, 대부분의 양적 전환이 일어났고, 고정화된 PFL 및 고정화된 TLL에 의해 유사한 결과를 수득하였다.

본 발명의 모노에스테르 가수분해 반응의 반응 속도는 반응 온도가 증가함에 따라 증가하는 것이 정상적이다. 물론, 최대 온도는 용매의 비점(3차-부틸 메틸에테르의 경우 55℃)에 의해 제한되지만, 압력하에 효소적으로 모노에스테르 가수분해 반응을 수행할 경우에 훨씬 더 높은 온도를 달성할 수 있다. 일부 리파제, 특히 TLL에 대하여, 반응 온도를 약 60 내지 80℃로 증가할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 모노에스테르 가수분해 반응은 편의상 약 4 내지 약 80℃, 바람직하게는 약 20 내지 약 75℃의 온도 범위에서 수행된다.

기질(TMHQ-DA)에 대한 유리되고 고정화된 효소의 비는 편의상 약 0.001 내지 약 10 g/g, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 0.2 g/g의 다소 넓은 범위로 다양할 수 있다.

용매에 대한 기질(TMHQ-DA)의 비는 마찬가지로 편의상 약 0.001 내지 약 100 g/g, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 0.8 g/g의 다소 넓은 범위로 다양할 수 있다.

효소를 적절한 담체 상에 고정화할 때, 본 발명의 모노에스테르 가수분해 반응은 회분식 대신, 예를 들어 고정상 반응기 또는 연속적으로 교반되는 탱크 반응기에서 연속식으로 수행하는 것이 유리할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 효소적 모노에스테르 가수분해 반응에 의해 수득된 TMHQ-1-MA는, 예를 들어 이소피톨과 반응함으로써 (완전-라세미성)-α-토코페릴 아세테이트로 전환될 수 있다. (완전-라세미성)-α-토코페롤이 조생성물에 존재할 경우, (완전-라세미성)-α-토코페롤은, 경우에 따라, 예를 들어 아세트산 무수물로 아세틸화함으로써 그의 아세트산 염으로 전환될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 예시하지만, 여하튼 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

유리 리파제를 사용한 유리 용기 내에서의 회분식 실험

3차-부틸 메틸에테르 5㎖, 물 50㎕, 유리 효소[리파제는 스위스 부흐스 소재의 플루카 케미에 아게(Fluka Chemie AG)로부터 수득됨] 1.67mg 및 TMHQ-DA[조물질, 즉 케토이소포론의 전위-방향족화 반응에 의해 생성되고 TMHQ-DA 약 90% 및 트리메틸카테콜 디아세테이트(TMC-DA) 약 9%로 구성된 물질] 80mg을 용기 내에 첨가하였다. 용기의 상부 공간을 질소가 흐르게 하였다. 용기를 항온기에 넣고 50℃로 하고, 700 rpm으로 교반하여 잘 혼합하였다. 샘플을 채취하기 위해, 용기를 열고 500㎕를 취하고, 상부 공간을 질소가 흐르게 하고, 다시 용기를 밀폐하였다. 이어서, 상기 샘플을 0.5 내지 1.0 중량%의 기질 또는 생성물 농도로 희석하고, 기체 크로마토그래피(GC)로 분석하였다.

각각 6, 12, 24 또는 48시간 후에 다양한 리파제 및 TLL의 전환율(E_I/S= 1/48, C_TMHQ-DA= 0.019 g/g)

	전환율[%]
시간[h]	PFL	TLL
6	5	5
12	47	6
24	61	12
48	74	19

실시예 2

고정화된 효소를 사용한 회분식 실험

(a) 상표명 액큐럴 엠피 1001로 멤브라나 게엠베하로부터 제공된 담체의 크기는 400 내지 1000㎛이었다. 먼저 크기가 1000㎛인 고정화 담체 입자를 체질하여 선택하였다.

고정화를 위해, 에탄올 1.7㎖ 중의 액큐럴 엠피 1001 500mg, 및 인산칼륨염 완충액(KH₂PO₄, pH 7, 20mM) 2.5㎖ 중에 용해시킨 리파제 분말 100mg을 혼합하고, 진탕기에서 실온으로 밤새 진탕하였다. 여과하여 상기 고정화된 리파제를 수거하고, 상기와 동일 완충액으로 3회 세척하여 실온에서 몇 시간동안 건조시켰다. 상기 고정화된 효소를 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.

고정화된 단백질의 양을 변형된 로리(Lowry) 법을 사용하여 측정하였다.

(b) 3차-부틸 메틸에테르 10㎖, 물 100㎕, 고정화된 효소(효소 13%/ 액큐럴담체 87%)[상기 리파제는 "키라자임(Chirazyme)"이라 명명되고 독일 만하임 소재의 로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH)로부터 제공된 스크리닝 키트(screening kit)의 일부임] 20mg 및 TMHQ-DA 160mg을 용기에 첨가하였다. 용기의 상부 공간을 질소가 흐르게 하였다. 용기를 항온기에 넣고 33℃로 하고, 700 rpm으로 교반하여 잘 혼합하였다. 샘플을 채취하기 위해, 용기를 열고, 500㎕를 취하고, 상부 공간을 질소가 흐르게 하고, 용기를 다시 밀폐하였다. 이어서, 상기 샘플을 0.5 내지 1.0 중량%의 기질 또는 생성물 농도로 희석하고, GC로 분석하였다.

96시간 후에 키라자임을 사용한 순수한 TMHQ-DA의 전환율(E_I/S= 1/8, C_TMHQ-DA= 0.019 g/g)

리파제	공급원	전환율[%]
CAL(B)	칸디다 안타르티카(분획 B)	70.0
CRL	칸디다 루고사	65.0
CRL(순수)	칸디다 루고사(정제됨)	87.0
CAL(A)	칸디다 안타르티카(분획 A)	0.7
PSL	슈도모나스 종	96.1
HPL	돼지 췌장	5.0
TTL	써모마이세스 라누기노서스	100.0
MML	무코르 미헤이	18.0
ASL	알칼리제네스 종	24.0
HL1(에스테라제)	돼지 간(분획 1)	0.2

조질 TMHQ-DA를 사용한 결과(실시예 1 참조), 상대 전환율은 순수한 TMHQ-DA를 사용한 것과 비교하여 95 내지 100%의 범위이었다.

고정화된 PSL과 TLL의 비교(E_I/S= 1/2, C_TMHQ-DA= 0.014 g/g, 온도 50℃, 다른 조건은 상기 참조, 두 효소 모두 선택도 99.5% 초과)

	전환율[%]
시간[h]	PSL	TLL
6	10	93
12	20	99
24	37	99

실시예 3

고정상 반응기에서 연속적인 효소적 에스테르 가수분해 반응

TMHQ-DA의 TMHQ-1-MA로의 연속적인 에스테르 가수분해 반응은 고정상 반응기[액큐럴 엠피 1001 상에 고정화된 TLL 900mg; 층 높이 73mm; 층 직경 12.0mm; 층 밀도 0.11 g/㎖; 층 부피 8.1㎖; 담체 직경 0.7mm]에서 40℃; 기질 유량: 물-포화된 3차-부틸 메틸에테르 중 0.01 g/g 농도의 TMHQ-DA; 3차-부틸 메틸에테르의 질량 유량= 0.080 mg/분; 및 TMHQ-DA의 질량 유량= 0.85 g/일로 수행되었다.

고정화된 TLL은 224시간 이상 동안 안정하고 활성이 있고; TMAQ-DA를 TMHQ-1-MA로 에스테르 가수분해 반응시킬 때, TLL의 선택도는 전환율 100%에서 거의 100%이었고; 심지어 잔류 시간을 길게 하거나, TMAQ-DA 용액의 농도를 낮게 하여 주입할 때도 TMHQ-1-MA의 TMHQ로의 에스테르 가수분해 반응은 실질적으로 일어나지 않았다.

본 발명에 의해 적합한 리파제를 사용하여 TMAQ-DA를 효소적 모노에스테르 가수분해 반응시킴으로써 완전히 위치 선택적으로 TMHQ-1-MA로 전환시키는 경제적인 방법이 제공된다.

Claims

트리메틸하이드로퀴논 디아세테이트를 리파제를 사용하여 효소적으로 모노에스테르 가수분해 반응시킴을 포함하는, 트리메틸하이드로퀴논 디아세테이트를 트리메틸하이드로퀴논-1-모노아세테이트로 고도의 선택성으로 전환시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

리파제가 고체 담체 물질 상에 고정화되는 방법.
제 1 항에 있어서,

리파제가 슈도모나스(Pseudomonas)종 리파제, 특히 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 리파제, 또는 써모마이세스 라누기노서스(Thermomyces lanuginosus) 리파제인 방법.
제 3 항에 있어서,

리파제가 써모마이세스 라누기노서스 리파제인 방법.
제 1 항에 있어서,

효소적 모노에스테르 가수분해 반응을 소수성 용매 중에서 수행하는 방법.
제 5 항에 있어서,

용매로서 3차-부틸 메틸에테르를 사용하는 방법.
제 2 항에 있어서,

효소적 모노에스테르 가수분해 반응을 연속적으로 수행하는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,

생성된 트리메틸하이드로퀴논-1-모노아세테이트를 이소피톨 또는 그의 등가물과 반응시켜 직접적으로 또는 경우에 따라 후속적으로 아세틸화함으로써 (완전-라세미성)-α-토코페롤 또는 그의 아세트산 염으로 전환시킴을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서,

반응을 압력하에 수행하는 방법.
트리메틸하이드로퀴논 디아세테이트를 리파제에 의해 트리메틸하이드로퀴논-1-모노아세테이트로 전환시키는 단계; 및

생성된 트리메틸하이드로퀴논-1-모노아세테이트를 이소피톨 또는 그의 등가물과 축합하고, 선택적으로 후속적으로 아세틸화하는 단계

를 포함하는, (완전-라세미성)-α-토코페롤 또는 그의 아세트산 염을 제조하기 위한 방법.