KR20020038787A - 트랜스글루타미나제의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코리네형 세균을 이용하여 이종 단백질(특히, 트랜스글루타미나제)을 분비 생산하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 코리네형 세균에서 산업상 유용한 이종 단백질(특히, 트랜스글루타미나제)을 생산하고, 이를 효율적으로 균체외로 방출(즉, 분비 생산)시킴을 포함하는, 이종 단백질(특히, 트랜스글루타미나제)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 목적 이종 단백질(특히, 트랜스글루타미나제)은, 코리네형 세균 유래의 시그널 펩타이드 영역을 암호화하는 서열의 하류에 프로 구조부를 함유하는 목적 이종 단백질 유전자 서열(특히, 프로트랜스글루타미나제 유전자 서열)을 연결한 발현 작제물을 사용하고, 이러한 발현형 유전자 작제물을 코리네형 세균에 도입하여, 형질전환 코리네형 세균을 배양하고, 균체외로 방출된 단백질을 프로테아제 등으로 처리하여, 프로 부분을 절단 및 제거함으로써 제조한다.
Description
본 발명은 이종 단백질, 이 중에서도 트랜스글루타미나제를 코리네형 세균에서 분비 생산하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법으로 분비 생산되는 이종 단백질은 산업상 유용한 효소나 생리활성 단백질 등이며, 트랜스글루타미나제는 식품 가공이나 의약 등에 폭넓게 이용되고 있다.
이종 단백질의 분비 생산으로서는 지금까지 바실러스(Bacillus) 속 세균에 의한 분비 생산의 총설[참조: Microbiol. Rev., 57, 109-137(1993)], 메탄올 자화성 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 의한 분비 생산의 총설[참조: Biotechnol., 11, 905-910(1993)], 및 아스퍼길러스(Aspergillus) 속의 곰팡이에 의한 공업적 생산의 보고[참조: Biotechnol., 6, 1419-1422(1988); Biotechnol., 9, 976-981(1991)] 등과 같이 다수 보고되어 있다.
본 발명의 하나의 실시 양태에 있어서 분비 생산되는 트랜스글루타미나제는 단백질의 펩타이드쇄내에 있는 γ-카복시아미드 그룹의 아실 전이반응을 촉매하는 효소이다. 본 효소를 단백질에 작용시키면, ε-(γ-Glu)-Lys 가교 형성반응, Gln의 탈아미드화에 의한 Glu로의 치환반응이 일어날 수 있다. 이러한 트랜스글루타미나제는 젤리 등의 겔화 식품, 요구르트, 치즈 또는 겔상 화장품 등의 제조나 식육의 육질 개선 등에 이용되고 있다[참조: 일본 특허공보 제(평)1-50382호]. 또한, 열에 안정적인 마이크로캡슐의 소재, 고정화 효소의 담체 등의 제조에 이용되고 있는 등의 산업상 이용성이 높은 효소이다.
트랜스글루타미나제는 지금까지 동물 유래의 것과 미생물 유래의 것(미생물 트랜스글루타미나제(microbial transglutaminase): 이하「MTG」라고 한다)이 공지되어 있다. 전자는 칼슘 이온 의존성 효소이며, 동물의 장기, 피부, 혈액 등에 분포되어 있다. 예를 들면, 기니아 피그 간장 트랜스글루타미나제[참조: K. Ikura et al. Biochemistry 27, 2898(1988)], 사람 표피 케라틴 세포 트랜스글루타미나제[참조: M. A. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333(1990)], 사람 혈액 응고인자 XIII[참조: A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900(1990)] 등이 있다.
후자에 관해서는, 스트렙토버티실리움(Streptoverticillium) 속의 균으로부터 칼슘 비의존성의 것이 발견되어 있다. 예를 들면, 스트렙토버티실리움 그리세오카르네움(Streptoverticillium griseocarneum) IFO12776, 스트렙토버티실리움 신나모네움(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum)(이후, 에스. 신나모네움(S. cinnamoneum)이라고 약칭하는 경우가 있다) IFO12852, 스트렙토버티실리움 모바라엔세(Streptoverticillium mobaraense)(이후, 에스. 모바라엔세(S. mobaraense)라고 약칭하는 경우가 있다) IFO13819 등을 들 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호]. 이들 미생물이 생산하는 트랜스글루타미나제의 1차 구조는 펩타이드 맵핑 및 유전자 구조 해석의 결과, 동물 유래의 것과는 상동성을 전혀 갖지 않는 것으로 판명되어 있다[참조: 유럽 공개특허공보 0 481 504 A1].
미생물 유래 트랜스글루타미나제(MTG)는 상기한 균류의 배양물로부터 정제 조작을 하여 제조되고 있으므로, 공급량, 효율 등의 점에서 문제가 있다. 또한, 유전공학적 수법에 의한 트랜스글루타미나제의 제조도 시도되고 있다. 트랜스글루타미나제 단백질 및 이의 유전자에 관해서는, 예를 들면, 문헌[참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994), Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 88-92(1994), Biochimie, 80, 313-319(1998), Eur. J. Biochem., 257, 570-576(1998), WO 96/06931, WO 96/22366 등]에 보고되어 있으며, 이들에는, 예를 들면, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 등의 숙주 벡터계에서의 발현 생산에 관한 보고가 이루어지고 있다. 이들의 정보와 함께, 이. 콜라이, 효모 등의 미생물에서 분비 발현[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-199883호]에 의한 방법과 이. 콜라이에서 MTG를 불활성 융합 단백질 봉입체로서 발현시킨 다음, 이러한 봉입체를 단백질 변성제로 가용화하고, 탈변성제 처리를 경유하여 재생시킴으로써 활성을 갖는 MTG를 생산하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-30771호]이 보고되어 있다. 그러나, 이. 콜라이나 효모 등의 미생물에 의한 이러한 분비 발현에서는, 이의 발현량이 대단히 적다는 문제점이 지적된다.
한편, 코리네형 세균을 이용하여 이종 단백질을 효율적으로 분비 생산하기 위한 연구로서는 지금까지 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(이후, 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)이라고 약칭하는 경우가 있다)에의한 뉴클레아제나 리파제의 분비[참조: 미국 특허 제4965197호, J. Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)] 및 서브틸리신 등의 프로테아제의 분비[참조: Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995)], 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 분비에 관한 연구[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-502548호], 이를 이용한 피브로넥틴 결합 단백질의 분비[참조: Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)], 변이형 분비 장치를 이용하여 단백질의 분비를 향상시킨 보고[참조: 일본 공개특허공보 제(평)11-169182호] 등이 있지만, 극히 한정된 단백질에 관해서 극히 소수의 보고가 있을 뿐이다. 단백질의 축적량에서 보면, 문헌[참조: Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995)]에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 서브틸리신 유전자(aprE)의 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 시그널 펩타이드의 서열을 이용하여 디켈로박터 노도서스(Dichelobacter nodosus) 유래의 알칼리성 프로테아제의 유전자를 씨. 글루타미쿰에서 발현시켜, 약 2.5mg/ml의 축적을 확인한 예는 있지만, 미국 특허 제4965197호, 일본 공개특허공보 제(평)6-502548호 또는 일본 공개특허공보 제(평)11-169182호의 기재에서는 구체적인 분비 축적의 값이 기재되어 있지 않으며, 또한 피브로넥틴 결합 단백질의 분비[참조: Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)]에서는 최대 약 2.5㎍/L라는 대단히 소량의 분비 축적이 확인되어 있는 것에 불과하다. 이와 같이, 이종 단백질을 실용적인 수준으로 효율적으로 배지 중에 축적시킨다는 보고는 아직 이루어지고 있지 않다.
또한, 코리네형 세균의 유전자 조작 기술은 프로토플라스트에 의한 형질전환법의 확립[참조: J. Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Bacteriol., 161, 463-467(1985)], 각종 벡터의 개발[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984); J. Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246(1984); Gene, 47, 301-306(1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69(1989)], 유전자 발현 제어법의 개발[참조: Bio/Technology, 6, 428-430(1988)] 및 코스미드의 개발[참조: Gene, 39, 281-286(1985)] 등의 플라스미드나 파아지를 사용하는 시스템으로 발전하고 있다. 또한, 코리네형 세균 유래의 유전자 클로닝[참조: Nucleic Acids Res., 14, 10113-1011(1986); J. Bacteriol., 167, 695-702(1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598(1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922(1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859(1988); Agric. Biol. Chem., 52, 525-531(1988); Mol. Microbiol., 2, 63-72(1988); Mol. Gen. Genet., 218, 330-339(1989); Gene, 77, 237-251(1989)]에 관해서도 보고되어 있다.
또한, 코리네형 세균 유래의 전이 인자에 관해서도 보고되어 있다[참조: WO 93/l8151; EPO 445385; 일본 공개특허공보 제(평)6-46867호; Mol. Microbiol., 11, 739-746(1994); Mol. Microbiol., 14, 571-581(1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397-405(1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6(1995); 일본 공개특허공보 제(평)7-107976호].
전이 인자란 염색체 상에서 전이할 수 있는 DNA 단편이며, 원핵 생물로부터 진핵 생물까지의 넓은 범위의 생물에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 전이 인자를 이용한 트랜스포존이 개발되어 있으며[참조: WO 93/l8151; 일본 공개특허공보제(평)7-107976호; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405(1994); 일본 공개특허공보 제(평)9-70291호], 트랜스포존을 이용하여 이종 유전자를 발현시킬 수 있게 되었다.
발명의 개시
본 발명은 코리네형 세균에서 산업상 유용한 이종 단백질, 특히 트랜스글루타미나제를 생산하여, 이를 효율적으로 균체외로 분비(분비 생산)시킴으로써, 이종 단백질, 특히 트랜스글루타미나제를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 방선균 등의 분비 단백질에서 시그널 펩타이드와 함께 프로 부분도 분비 과정에서 중요한 기능을 하고 있는 것에 착안하여, 산업상 유용한 이종 단백질, 특히 트랜스글루타미나제를 효율적으로 분비 생산하는 방법을 발명하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 코리네형 세균 유래의 시그널 펩타이드의 하류에 프로 구조부를 함유하는 이종의 분비형 단백질이 연결된 융합 단백질을 코리네형 세균에서 생산 및 분비시킨 다음, 프로 구조부를 절단 및 제거함을 특징으로 하는, 이종의 분비형 단백질의 제조방법이다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 코리네형 세균 유래의 시그널 펩타이드 영역, 특히 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드 영역을 암호화하는 서열의 하류에 프로 구조부를 함유하는 목적 단백질 유전자 서열, 특히 프로트랜스글루타미나제 유전자 서열을 결합시킨 발현 작제물을 코리네형 세균에 도입하여, 수득된 형질전환 코리네형 세균을 배양하고, 생성된 단백질을 균체외로 효율적으로 분비시켜, 균체외로 방출된 단백질을 프로테아제 등으로 처리하여, 프로 구조 부분을 절단함으로써, 다량의 목적하는 이종 단백질, 특히 트랜스글루타미나제를 수득하는 방법이다.
또한, 본 발명은 프로테아제 등에 관해서도 트랜스글루타미나제 유전자 작제물과 동일하도록 이들의 프로테아제 등의 발현형 유전자 작제물을 작제하여, 프로트랜스글루타미나제 유전자를 함유하는 발현 작제물과 함께 코리네형 세균에 도입하여, 수득된 형질전환 코리네형 세균을 배양하거나 또는 별도의 코리네형 세균에 도입하여, 수득된 형질전환 코리네형 세균을 프로트랜스글루타미나제 유전자 도입균과 함께 배양하고, 프로트랜스글루타미나제 및 이들의 프로테아제를 분비 발현시킴으로써, 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조 부분을 절단한 트랜스글루타미나제를 수득하는 방법이다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단백질 또는 펩타이드가 「분비」된다고 하는 것은, 단백질 또는 펩타이드의 분자가 세균 균체외(세포외)에서 이송되는 것을 말하며, 최종적으로 이러한 단백질 또는 펩타이드 분자가 배지 중에 완전하게 유리 상태에 있는 경우는 물론, 일부만이 균체외에 존재하는 경우, 균체 표층에 존재하는 경우도 포함한다.
본 발명의 방법에 따라, 코리네형 세균이 숙주 벡터계로서 사용될 수 있으며, 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드의 하류로 분비형의 프로구조부를 함유하는 트랜스글루타미나제 유전자를 결합한 발현 작제물이 작제되며, 이것이 코리네형 세균내로 도입되어 발현되며, 균체외로 분비된 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 프로테아제 등으로 처리하여 절단함으로써, 프로 구조부가 제거된 다량의 트랜스글루타미나제가 수득된다.
또한, 본 발명의 방법에 따라, 프로테아제 등에 관해서도 프로트랜스글루타미나제 유전자 작제물과 동일하도록 이들의 프로테아제 등의 발현형 유전자 작제물을 작제하고, 프로트랜스글루타미나제 유전자 작제물과 함께 코리네형 세균에 도입하여, 수득된 형질전환 코리네형 세균을 배양하거나 또는 별도의 코리네형 세균에 도입하여, 수득된 형질전환 코리네형 세균을 프로트랜스글루타미나제 유전자 도입균과 함께 배양, 분비 발현시킴으로써 프로트랜스글루타미나제의 프로 부분을 절단한 트랜스글루타미나제를 직접 균체외에서 수득할 수 있다.
분비형 단백질은 일반적으로는 프리펩타이드 또는 프리프로펩타이드로서 해독되며, 다음에 성숙형 단백질로 되는 것으로 공지되어 있다. 즉, 일반적으로 프리펩타이드 또는 프리프로펩타이드로서 해독된 다음, 시그널 펩타이드(「프리 부분」)가 절단되어, 성숙 펩타이드 또는 프로펩타이드로 변환되며, 프로펩타이드는 프로테아제에 의해 추가로 프로 부분이 절단되어, 성숙 펩타이드로 되는 것으로 공지되어 있다. 본 명세서에 있어서, 「시그널 서열」이란 분비성 단백질 전구체의 N-말단에 존재하며, 또한 천연의 성숙 단백질에는 존재하지 않는 서열을 말하며, 「시그널 펩타이드」란 이러한 단백질 전구체로부터 절단한 펩타이드를 말한다. 일반적으로는, 시그널 서열은 균체외에서의 분비에 따라 프로테아제(일반적으로 시그널 펩티다제라고 호칭된다)에 의해 절단된다. 이러한 시그널 펩타이드는 생물 종을 초월하여 일정하게 공통된 서열 상의 특징을 갖지만, 어떤 생물 종에서 분비 기능을 나타내는 시그널 펩타이드가 다른 생물 종에서도 반드시 분비 기능을 발휘한다는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, 시그널 펩타이드 및 프로 부분의 양쪽을 갖는 단백질, 즉, 1차 해독 산물을 「프리프로단백질」이라고 호칭하는 경우가 있으며, 또한 시그널 펩타이드를 갖지 않지만 프로 부분을 갖는 단백질을 「프로단백질」이라고 호칭하는 경우가 있다. 프로단백질의 프로 부분은 「프로 구조부」 또는 단순히 「프로 구조」라고 호칭하는 경우도 있으며, 본 명세서에 있어서 단백질의 「프로 구조부/프로 구조」와 단백질의 「프로 부분」과는 호환적으로 사용된다. 프리프로단백질 또는 프리단백질에 있어서, 이의 시그널 펩타이드는 상이한 단백질에 유래하는 경우라도 목적 단백질에 천연으로 존재하는 시그널 펩타이드일 수 있지만, 사용하는 숙주의 분비형 단백질에 유래하는 것이 바람직하다. 또는, 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개질시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 목적에 사용할 수 있는 시그널 펩타이드는 이것이 유래하는 천연의 성숙 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 일부 함유할 수 있다. 시그널 펩타이드가 다른 단백질에 유래하는 경우에는 프리프로단백질을 특히 「이종 융합 프리프로단백질」이라고 호칭하는 경우도 있다. 예를 들면, 단백질이 트랜스글루타미나제인 경우에는, 각각 「프리프로트랜스글루타미나제」, 「프로트랜스글루타미나제」 및 「이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제」로 호칭된다. 또한, 「프로 부분을 절단한」 단백질과는 펩타이드 결합을 절단함으로써 프로 부분을 구성하는 1종 이상의 아미노산을 제거한 단백질을 말하며, 이러한 N-말단 영역이 천연의 성숙형 단백질의 것과 완전하게 일치하는 단백질 및 이러한 단백질의 활성을 갖는 한, 천연의 단백질과 비교하여 N-말단에 프로 부분에 유래하는 1종 이상의 추가의 아미노산을 갖는 것 및 천연의 성숙형 단백질보다 아미노산 서열이 짧은 단백질도 포함된다.
지금까지 코리네형 세균을 이용하여 이종 단백질을 균체외로 분비 생산하는 예는 종래의 기술항에 기재된 바와 같이 매우 적으며, 또한 기술로서는 미완이다. 또한, 코리네형 세균이 자체로 균체외로 프로테아제 등의 단백질을 분비한다는 예는 공지되어 있지 않으며, 내재성 DNase의 분비[참조: 미국 특허 제4965197호]와 본 발명에서 사용하는 세포 표층 단백질[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-502548호]이 세포 표층에서 벗겨지며, 균체외에서 발견되는 사실이 공지되어 있는 예이다. 단, 코리네형 세균에서는 분비에 관한 시그널 펩타이드는 세포 표층 단백질을 제외하고는 지금까지 공지되어 있지 않다. 지금까지 공지되어 있는 코리네형 세균의 세포 표층 단백질로서는 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS1 및 PS2의 유전자[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-502548호] 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)(이후, 씨. 암모니아게네스(C. ammoniagenes)라고 약칭하는 경우가 있다)의 세포 표층 단백질인 SlpA의 유전자[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]가 공지되어 있을 뿐이다. 이들 단백질내에서 PS1과 SlpA 사이에는 약간의 상동성(약 30%)이 확인되지만, 그외에는 거의 상동성은 확인되지 않으며, 또한 시그널 서열 영역에 관해서는 서로 상동성은 확인되지 않는다. 시그널 서열의 예로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 PS1과 PS2의 시그널 서열을 서열 29와 서열 1에, 코리네박테리움 암모니아게네스의 SlpA의 시그널 서열을 서열 2에 제시한다.
따라서, 본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰[구명칭, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)] ATCC13869주로부터의 PS2 단백질 유전자를 클로닝하여 이의 서열을 결정한 바, 시그널 서열 영역에는 기지의 씨. 글루타미쿰 유래의 것과 상이함이 확인되지 않지만, 성숙형 세포 표층 단백질의 N-말단 아미노산의 38번째 잔기까지 2개의 상이한 아미노산이 확인된다[서열 7에 제시된 아미노산 서열에서 40번째 잔기인 Thr에 대해 Asn, 55번째 잔기인 gly에 대해 Glu]. 이러한 시그널 서열 30개 아미노산 잔기 및 성숙형 세포 표층 단백질의 N-말단 38개 아미노산 잔기를 함유하는 68개 잔기를 암호화하는 염기 서열 및 프로모터 영역을 함유하는 이의 5'-상류 영역을 서열 6에 제시하고, 아미노산 서열을 서열 7에 제시한다.
다음에, 본 발명자는 코리네형 세균에 있어서 이종 단백질을 다량으로 균체외로 분비 생산하는 것이 가능한지 여부를 시도하려고 세포 표층 단백질의 프로모터 영역이나 시그널 펩타이드를 함유하는 영역을 이용하는 이종 단백질의 분비 연구를 수행하였다.
방선균 유래의 트랜스글루타미나제 유전자는 GC 함량이 높지만, 코리네형 세균도 또한 이에 근접하며, 또한 코돈 이용성도 근사하므로, 방선균의 유전자 그 자체가 그대로 이용할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명자는 방선균 유래의 트랜스글루타미나제 유전자를 그대로 이용할 수 있는지 여부를 검토한 결과, 방선균 유래의 트랜스글루타미나제의 시그널 펩타이드는 코리네형 세균에서는 기능하지 않는 것이 명확하게 된다. 그러나, 코리네형 세균 유래의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드와 융합한 방선균 유래의 프로 구조부를 함유하는 성숙 단백질을 암호화하는 트랜스글루타미나제 유전자는 그대로 효과적으로 기능하며, 프로 구조부를 갖는 프로단백질로서 효율적으로 균체외로 분비되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드 30개 아미노산 잔기와 성숙 세포 표층 단백질의 N-말단부분의 38개 아미노산 잔기를 추가로 함유하는, 즉, 성숙 세포 표층 단백질의 N-말단 부분이 융합된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제 유전자를 사용하면, 프로트랜스글루타미나제의 균체외 분비 효율이 보다 증대되는 것으로 나타난다.
본 발명에 언급된 코리네형 세균으로는 호기성 그램 양성 간균이고, 종래부터 브레비박테리움 속에 분류되어 있지만, 현재 코리네박테리움 속으로 통합된 세균을 포함하며[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)], 또한 코리네박테리움 속과 대단히 근연인 브레비박테리움 속 세균을 포함한다. 코리네형 세균을 이용하는 것의 이점으로서는 지금까지 이종 단백질의 분비에 적절하다고 하는 곰팡이, 효모나 바실러스 속 세균과 비교하여, 원래 균체외로 분비되는 단백질이 매우 적으며, 이종 단백질을 분비 생산하는 경우에 정제 과정이 간략화, 생략화될 수 있으며, 또한 당, 암모니아, 무기염 등의 단일한 배지에서 양호하게 생육되며, 배지의 가격이나 배양 방법, 배양 생산성이 우수하다.
본 발명에 있어서 숙주균으로서 사용할 수 있는 코리네형 세균으로서는 L-글루탐산 생산균으로 대표되는 브레비박테리움 사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC14066, 브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC14068, 브레비박테리움 락토페르멘툼(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC13869, 브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum) ATCC13825, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC14067, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 리륨(Brevibacterium lilium)(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC15990, 브레비박테리움 암모니아게네스(코리네박테리움 암모니아게네스) ATCC6871 등의 야성주 및 이들 야성주로부터 유도되는 변이주, 예를 들면, 글루탐산 생산성을 상실한 변이주, 또한 라이신 등의 아미노산 생산 변이주, 및 이노신 등의 핵산과 같은 다른 물질을 생산하는 변이주도 포함된다.
본 발명에 사용되는 유전자 작제물은 일반적으로 프로모터, 적절한 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열 및 목적 단백질을 암호화하는 핵산 단편, 및 코리네형 세균 중에서 목적 단백질 유전자를 발현시키기 위해 필요한 제어 서열(오퍼레이터나 터미네이터 등)을 이들이 기능할 수 있도록 적절한 위치에 갖는 것이다. 목적 단백질은 N-말단에 프로 구조부를 가질 수 있다. 이러한 작제물용으로 사용할 수 있는 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 코리네형 세균내에서 기능할 수 있는 것이면 가능하고, 플라스미드와 같이 염색체 외부에서 자율 증식하는 것이라도 세균 염색체에 삽입시킬 수 있다. 코리네형 세균 유래의 플라스미드가 특히 바람직하다.이들에는, 예를 들면, pHMl519[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)], pAM330[참조: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)] 및 이들을 개량한 약제 내성 유전자를 갖는 플라스미드가 포함된다. 또한, 인공 트랜스포존 등도 이용할 수 있다. 트랜스포존이 사용되는 경우에는 상동 재조합 또는 그 자신의 전이능에 의해 목적 유전자가 염색체 중에 도입된다.
본 발명에 사용할 수 있는 프로모터는 특별히 한정되지 않으며, 코리네형 세균내에서 기능할 수 있는 프로모터이면 일반적으로 사용할 수 있으며, 또한 이종 유래, 예를 들면, tac 프로모터 등의 이. 콜라이 유래의 프로모터일 수 있다. 이 중에서, tac 프로모터 등의 강력한 프로모터가 보다 바람직하다. 코리네형 세균 유래의 프로모터로서는, 예를 들면, 세포 표층 단백질의 PS1, PS2, SlpA의 유전자의 프로모터, 각종 아미노산 생합성계, 예를 들면, 글루탐산 생합성계의 글루탐산 탈수소효소 유전자, 글루타민 합성계의 글루타민 합성효소 유전자, 라이신 생합성계의 아스파르토키나제 유전자, 트레오닌 생합성계의 호모세린 탈수소효소 유전자, 이소로이신 및 발린 생합성계의 아세토하이드록시산 합성효소 유전자, 로이신 생합성계의 2-이소프로필말산 합성효소 유전자, 프롤린 및 아르기닌 생합성계의 글루탐산 키나제 유전자, 히스티딘 생합성계의 포스포리보실-ATP 피로포스포릴라제 유전자, 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌 등의 방향족 아미노산 생합성계의 데옥시아라비노헵투론산 인산(DAHP) 합성효소 유전자, 이노신산 및 구아닐산과 같은 핵산 생합성계에서 포스포리보실피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 유전자, 이노신산 탈수소효소 유전자 및 구아닐산 합성효소 유전자의 프로모터를 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 시그널 펩타이드는 숙주인 코리네형 세균의 분비성 단백질의 시그널 펩타이드이며, 바람직하게는 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드이다. 코리네형 세균의 세포 표층 단백질로서는 씨. 글루타미쿰에 유래하는 PS1 및 PS2[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-502548호] 및 씨. 암모니아게네스에 유래하는 SlpA[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]를 들 수 있다. PS1의 아미노산 서열을 서열 29에, PS2의 아미노산 서열을 서열 1에, SlpA의 아미노산 서열을 서열 2에 제시한다. 또한, 미국 특허 제4965197호에 따르면, 코리네형 세균 유래의 DNase에도 시그널 펩타이드가 있는 것으로 기재되어 있으며, 이러한 시그널 펩타이드도 본 발명에 이용할 수 있다.
시그널 펩타이드에는 이것이 유래하는 분비성 단백질의 N-말단 아미노산 서열의 일부가 부가될 수 있다. 시그널 서열은 해독 산물이 균체외로 분비될 때에 시그널 펩티다제에 의해 절단된다. 또한, 시그널 펩타이드를 암호화하는 유전자는 천연형의 그대로 사용할 수 있지만, 사용되는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개질시킬 수 있다.
이들 시그널 펩타이드를 사용하는 경우, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자는 시그널 펩타이드를 암호화하는 유전자의 3'-말단측에 연결되며, 또한 상기 프로모터에 의해 발현의 제어를 받도록 배치한다.
본 발명에 따라 분비 생산할 수 있는 유용 단백질은 본질적으로는 동식물이나 미생물 유래의 분비형 단백질 전반적인 것이 함유되며, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 프로테아제, 아미노펩티다제, 카복시펩티다제, 콜라게나제 및 키티나제 등의 단백질을 본 발명에 따라 분비 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 분비 생산되는 단백질은 천연으로 분비형인 단백질이 바람직하며, 보다 바람직하게는 프로 구조부가 부가된 단백질이 바람직하며, 트랜스글루타미나제는 본 발명에 따라 분비 생산되는 유용 단백질로서 특히 바람직하다. 트랜스글루타미나제 유전자로서는 방선균, 예를 들면, 에스. 모바라엔세 IFO13819, 에스. 신나모네움 IFO12852, 스트렙토버티실리움 그리세오카르네움 IFO12776, 스트렙토마이세스 리디쿠스(Streptomyces lydicus)[참조: WO 9606931] 등이나 난균강(Oomycetes)[참조: WO 9622366] 등의 곰팡이 등의 분비형의 트랜스글루타미나제의 유전자를 본 발명의 목적에 이용할 수 있다. 이들 단백질을 암호화하는 유전자는 사용하는 숙주에 따라 및 목적하는 활성을 수득하기 위해 개질시킬 수 있으며, 이들에는 1종 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 등이 포함되며, 필요에 따라 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈으로 변환될 수 있다.
천연으로 프리프로펩타이드로서 발현되는 단백질을 본 발명에 따라 분비 생산하는 경우에는 프로 구조부(프로 부분)를 함유하는 프로단백질을 암호화하는 유전자 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 프로 구조부의 서열의 예로서 방선균 유래 트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 서열을 서열 3(에스. 모바라엔세 유래) 및 서열 4(에스. 신나모네움 유래)에 제시한다. 단백질의 프로 구조부는 적당한 수단, 예를 들면, 프로테아제에 의해 절단할 수 있으며, 아미노펩티다제, 적절한 위치에서 절단하는 엔도펩티다제 또는 보다 특이적인 프로테아제를 사용할 수 있지만, 그 결과, 생성되는 단백질이 천연의 단백질과 동등하거나 그 이상의 활성을 갖도록 하는 위치에서 절단하는 프로테아제가 바람직하다. 또는, 목적 단백질 또는 목적 단백질의 프로 구조부를 암호화하는 유전자 서열을 개질시켜, 목적하는 위치에 특이적인 프로테아제의 인식 부위를 갖는 단백질을 발현시키도록 설계할 수 있다. 이러한 개질 기술, 유전자의 클로닝 기술, 생산된 단백질의 검출 기술을 포함하는 일반적인 분자생물학적 수법은 당업자에게 익히 공지되어 있는 것이며, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985), F.M. Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press 등]을 참조할 수 있다.
서열 3 및 4에 제시된 프로 구조부를 개질시킨 프로 구조부의 예로서는 서열 30 내지 38에 제시된 아미노산 서열을 갖는 개질 프로 구조부를 들 수 있다.
<서열목록 프리 텍스트>
서열 30 내지 37: 에스. 모바라엔세의 트랜스글루타미나제의 개질 프로 구조부
서열 38: 에스. 모바라엔세와 에스. 신나모네움의 트랜스글루타미나제 프로 구조부의 키메라
이들의 개질 프로 구조부는 하기와 같은 특징을 갖는다:
서열 30 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 C-말단의 AP가 결실되어 있다.
서열 31 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 C-말단의 FRAP가 결실되어 있다.
서열 32 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 N-말단의 D가 결실되어 있다.
서열 33 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 N-말단의 DNGAGE가 결실되어 있다.
서열 34 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 C-말단의 RAP가 GPK로 개질되어 있다.
서열 35 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 C-말단의 RAP가 GPR로 개질되어 있다.
서열 36 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 C-말단의 GPSFRAP가 GPK로 개질되어 있다(FRAP가 결실되고, C-말단의 S가 K로 개질되어 있다).
서열 37 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부(45개 아미노산 잔기)의 C-말단의 GPSFRAP가 GPR로 개질되어 있다(FRAP가 결실되고, C-말단의 S가 R로 개질되어 있다).
서열 38 = 에스. 모바라엔세 유래 프로 구조부의 일부(15개 아미노산 잔기)와 에스. 신나모네움 유래 프로 구조부(41개 아미노산 잔기)의 일부로 이루어진 키메라 프로 구조부(56개 아미노산 잔기).
이와 같이, 소정의 위치에 프로테아제의 특이적 인식 부위를 갖는 한, 프로 구조부에 있어서, 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가될 수 있다.
프로테아제 분해의 결과, 수득되는 단백질의 N-말단 영역은 반드시 천연의 단백질과 동일하지 않을 수 있으며, 1개 내지 수개의 아미노산이 추가로 부가되거나 결실된 것일 수 있다. 일반적으로는, 이러한 단백질의 활성이라는 관점으로부터, 천연의 단백질과 거의 동일한 위치에서 절단하는 것이 바람직하며, 천연의 것과 동일한 성숙 펩타이드인 것이 보다 바람직하다. 예를 들면, 에스. 모바라엔세 및 에스. 신나모네움의 성숙형 트랜스글루타미나제에 관해서는 이의 서열이 서열 5 및 서열 43에 각각 제시된다. 따라서, 일반적으로는 천연 성숙 단백질과 동일한 단백질을 생성시키는 위치에서 프로펩타이드를 절단하는 특이적 프로테아제가 가장 바람직하다. 그러나, 특정한 목적에 관해서는, 천연의 단백질과 비교하여 N-말단이 아미노산 1개 내지 수개분만큼 길거나 짧은 펩타이드가 보다 적절한 활성을 갖는 경우가 있다. 이러한 프로테아제에는 디스파제(Dispase, 제조원: Boeringer Manheim Co. Ltd.)와 같은 상업적으로 입수할 수 있는 이외에, 미생물의 배양액, 예를 들면, 방선균의 배양액 등으로부터 수득되는 것이 포함된다. 이러한 프로테아제는 미정제 상태로 사용할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 순도까지 정제한 후에 사용할 수 있다.
다른 적절한 프로테아제의 예로서는 스트렙토마이세스 알보그리세올루스(Streptomyces albogriseolus)(이후, 에스. 알보그리세올루스(S.albogriseolus)라고 약칭하는 경우가 있다)가 생산하는 세린 프로테아제인 SAMP45가 있다. 에스. 모바라엔세의 프로트랜스글루타미나제의 경우, SAMP45는 서열 3의 프로 구조부의 41번째의 Ser과 42번째의 Phe의 사이를 우선적으로 절단하므로, 서열 5에 제시된 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단에 프로 구조부의 C-말단의 Phe-Arg-Ala-Pro의 4개의 아미노산이 부가된 구조의 단백질이 생성된다. 본 발명자들은 이러한 단백질도 트랜스글루타미나제 활성을 가지는 것으로 확인하였다. 또한, SAMP45 유전자의 서열은 이미 결정되어 있으며, 서열 39에 프로 구조가 부가된 단백질(프로SAMP45)의 아미노산 서열을 기재한다[참조: J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)]. SAMP45는 에스. 알보그리세올루스의 배양액 또는 에스. 알보그리세올루스 균체의 형태로 프로트랜스글루타미나제에 작용시킨 경우에 프로 구조부를 일부 잔류시켜 절단할 수 있으며, 그 결과, 프로 구조부의 대부분을 제거한 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다. 또는, 프리프로SAMP45 유전자를 도입한 코리네형 세균을 프로트랜스글루타미나제를 균체외로 분비 생산하는 코리네형 세균과 함께 배양함으로써, 동일하게 프로 구조부의 대부분을 제거한 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다. 또한, 프리프로트랜스글루타미나제의 유전자를 도입한 코리네형 세균에 SAMP45 유전자를 동일한 방법으로 도입하여, 프로트랜스글루타미나제와 동시에 SAMP45를 균체 표층 또는 균체외로 분비 생산함으로써, 프로 구조부의 절단에 의한 트랜스글루타미나제의 활성화를 효율적으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명자들이 밝혀낸 에스. 모바라엔세가 생산하는 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP)를 SAMP45와 조합하여 사용함으로써, N-말단에 부가한 Phe-Arg-Ala-Pro의 4개의 아미노산도 제거되며, 천연형과 동일한 성숙 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다.
이러한 svPEP는 하기 식(I)의 펩타이드 또는 펩타이드 유사물을 식 중의 ↓의 부위에서, 즉, N-말단에서 3번째 또는 4번째의 프롤린 잔기의 카복실측을 특이적으로 절단하는 효소이다.
Y-Pro-↓- Z (I)
상기식에서,
Y는 2개 또는 3개의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고펩타이드이고,
Z는 아미노산, 펩타이드, 아미드 또는 에스테르이다.
보다 구체적으로는, 이러한 프롤린 특이적 펩티다제는 하기 (1) 내지 (8)의 특성을 갖는 프롤린 특이적 펩티다제이다.
(1) 하기의 프롤린 함유 펩타이드 중의 하나 이상을 ↓로 나타낸 위치, 즉, 프롤린의 카복실측에서 절단한다(pNA는 p-니트로아닐라이드이다).
Ala-Ala-Pro-↓-pNA, Ala-Phe-Pro-↓-pNA 및 Phe-Arg-Ala-Pro-↓-pNA[Phe-Arg-Ala-Xaa(서열 68)(여기서, Xaa는 Pro-pNA이며, pNA는 p-니트로아닐라이드를 나타낸다)과 동일]
(2) 최적 pH가 6.0 내지 6.5이다.
(3) pH 4 내지 9에서 안정적이다.
(4) 최적 온도가 25 내지 30℃이다.
(5) 20℃ 이하에서 안정적이다.
(6) 페닐메틸설포닐 플루오라이드 및 아미노에틸벤젠설포닐플루오라이드 하이드로클로라이드에 의해 활성이 저해된다.
(7) 등전점이 10.2이다.
(8) 분자량이 약 50,000이다.
이러한 svPEP는, 예를 들면, 하기와 같이 하여 제조할 수 있다. svPEP의 활성을 갖는 펩티다제를 생산하는 방선균, 예를 들면, 방선균 에스. 모바라엔세 IFO13819를 방선균의 배양에 통상적으로 사용되는 방법에 따라 배양한다. 방선균 IFO13819를 배양하기 위한 배지는 통상적인 탄소원, 질소원, 무기 이온 등을 함유하는 통상적인 배지일 수 있다. 탄소원으로서는 글루코스, 전분, 슈크로스, 기타를 사용할 수 있다. 질소원으로서는 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 암모늄 염, 기타를 필요에 따라 적절하게 사용한다. 배양은 호기 조건하에서 수행하며, 예를 들면, pH 5.0 내지 8.5, 온도를 15℃ 내지 37℃의 적당한 범위로 제어하여 수행할 수 있다. 배양 기간은 온도, pH, 배지에 따라 상이하지만, 통상적으로 1 내지 10일 정도이며, 일반적으로는 목적하는 svPEP의 생산이 최대에 도달할 무렵에 배양을 정지할 수 있다.
상기한 기간의 배양 후에 배양물로부터 균체를 회수하고, 가볍게 세정한 다음, 균체 표층에서 svPEP를 함유하는 분획을 용출시키고, HPLC, FPLC 등의 통상 단백질의 정제에 사용되는, 당업자에게 익히 공지되어 있는 각종 정제 수단을 조합함으로써, 정제 svPEP 표준품을 수득할 수 있다. 균체 표층으로부터의 svPEP 분획의 용출은, 예를 들면, 0.1M의 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 등의 완충액 중에서 일정시간, 1 내지 5시간 정도 진탕함으로써 수행할 수 있다. 이때의 온도는 효소의 활성 상실을 방지하기 위해 0℃ 내지 약 5℃가 바람직하다. svPEP는 배양 상등액로부터 정제 단리할 수 있지만, 오염된 단백질이 많아, 세정 균체 표층으로부터 용출 정제하는 편이 유리하다.
또한, 각 단계에서의 활성 분획의 확인은 이의 분획 중의 효소 활성을 측정함으로써 수행할 수 있다. 효소 활성의 측정은 적절한 기질 및 반응 생성물의 검출 방법을 조합하여 수행할 수 있으며, 예를 들면, Ala-Ala-Pro-pNA, Ala-Phe-Pro-pNA 또는 Phe-Arg-Ala-Pro-pNA를 기질로 하여 효소를 반응시켜, 유리된 pNA(p-니트로아닐라이드)의 양을 산출함으로써 활성을 정량하는 것으로 수행할 수 있다.
이와 동일하게 하여 정제한 svPEP를 필요에 따라 역상 크로마토그래피 등을 사용하여, 추가로 정제하고, 이의 부분 아미노산 서열을 결정하여 적절한 프로브를 설계함으로써, svPEP를 암호화하는 유전자를 수득할 수 있다. 이러한 순서는 당업자에 익히 공지되어 있는 것이며, 예를 들면, 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9. 31(1989)]을 참조할 수 있다. 이와 동일하게 하여 수득된 svPEP의 유전자의 염기 서열과 여기에 암호화되는 전체 아미노산 서열을 각각 서열 41 및 서열 42에, svPEP의 성숙 단백질의 아미노산 서열을 서열 40에 제시한다.
svPEP는 에스. 모바라엔세의 배양액 또는 에스. 모바라엔세 균체의 형태로 프로테아제와 함께 프로트랜스글루타미나제에 작용시킨 경우에, 프로 구조부를 완전하게 절단할 수 있으며, 그 결과, 프로 구조부가 완전하게 제거된 성숙형 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다. 또는, 프리프로-svPEP 유전자 및 프로테아제 유전자를 도입한 코리네형 세균을 프로트랜스글루타미나제를 균체외로 분비 생산하는 코리네형 세균과 함께 배양함으로써, 동일하게 프로 구조부가 완전하게 제거된 성숙형 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다. 또한, 프리프로트랜스글루타미나제의 유전자를 도입한 코리네형 세균에 SAMP45 유전자와 svPEP 유전자의 양쪽을 동일한 방법으로 도입하여, 프로트랜스글루타미나제 및 SAMP45와 동시에 svPEP를 균체 표층 또는 균체외로 분비 생산함으로써, 천연과 동일한 구조를 갖는 성숙형 트랜스글루타미나제의 생산을 효율적으로 수행할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 유전자 작제물의 코리네형 세균으로의 도입 방법은 특별히 한정되지 않으며, 일반적으로 사용되는 방법, 예를 들면, 프로토플라스트법[참조: Gene, 39, 281-286(1985)], 전기천공법[참조: Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)] 등을 사용할 수 있다. 수득된 유전자 도입형질전환체는 통상적으로 사용될 수 있는 방법 및 조건에 따라 배양할 수 있다. 예를 들면, 형질전환체는 탄소원, 질소원, 무기 이온을 함유하는 통상적인 배지에서 배양할 수 있다. 또한, 높은 증식을 수득할 수 있으므로, 비타민, 아미노산 등의 유기 미량 영양소를 필요에 따라 첨가할 수 있다.
탄소원으로서는 글루코스 및 슈크로스와 같은 탄수화물, 아세트산과 같은 유기산, 알콜류, 기타를 사용할 수 있다. 질소원으로서는 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄 염, 기타를 사용할 수 있다. 무기 이온으로서는 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온 등을 필요에 따라 적절하게 사용한다. 배양은 pH 5.0 내지 8.5, 15℃ 내지 37℃가 적절한 범위에서 호기적 조건하에 수행하고, 1 내지 7일 정도 배양한다. 이러한 조건하에 형질전환체를 배양함으로써, 목적 단백질은 균체내에서 다량으로 생산되어 효율적으로 균체외로 분비된다. 트랜스글루타미나제에 관해서는 미생물의 균체내에서 다량으로 축적되면 일반적으로 치사적인 것으로 공지되어 있지만, 본 발명에 따르면 생산된 트랜스글루타미나제는 균체외로 방출되므로, 치사적 영향을 받지 않고 연속적으로 트랜스글루타미나제가 생산된다.
본 발명에 따라 배지 중에 분비된 단백질은 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법에 따라 배양 후의 배지로부터 분리 정제할 수 있다. 예를 들면, 균체를 원심분리 등에 의해 제거한 다음, 염석, 에탄올 침전, 한외 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 칼럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 중고압 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피 등의 공지된 적절한 방법 또는 이들을 조합함으로써 분리 정제할 수 있다. 본 발명에 따라 균체 표층에 분비된 단백질도 당업자에게 익히 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 염 농도의 상승, 계면활성제의 사용 등에 따라 가용화한 후에, 배지 중으로 분비된 경우와 동일하게 하여 분리 정제할 수 있다. 또한, 어떤 경우에는 균체 표층으로 분비된 단백질을 가용화하지 않고, 예를 들면, 고정화 효소로서 사용할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명되지만, 이들은 어떠한 의미에서도 본 발명을 한정하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 프리프로트랜스글루타미나제의 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에서의 발현
(1) 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래 트랜스글루타미나제 유전자의 취득
에스. 모바라엔세 DSMZ주 유래 트랜스글루타미나제 유전자의 서열은 이미 결정되어 있다[참조: Eur. J. Biochem., 257, 570-576(1998)]. 이러한 서열을 참고로 하여, 서열 8과 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 통상적인 방법[사이토(Saito), 미우라(Miura)의 방법(참조: Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963))]에 따라 제조한다. 에스. 모바라엔세 IFO13819의 염색체 DNA로부터 성숙 트랜스글루타미나제 서열을 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다. PCR 반응에는 피로베스트 DNA 폴리머라제(Pyrobest DNA polymerase, 제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하고, 반응 조건은 업자의 추천하는 프로토콜에 따른다.
(서열 8) 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
(서열 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 8 및 서열 9: PCR 프라이머
다음, 증폭된 약 1.0kb의 DNA 단편을 랜덤 프라이머 DNA 라벨링 키트 버젼 2(Random Primer DNA Labeling Kit Ver. 2, 제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)와 [α-32P]dCTP를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 반응시켜 DNA 프로브를 작제한다. 작제된 프로브와 에스. 모바라엔세 IFO13819의 염색체 DNA를 사용하여, 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9. 31(1989)]에 기재된 바와 같은 일반적인 방법에 따라, 서던 블롯 하이브리드화를 수행한 바, 제한효소 SacI로 절단된 약 4kb의 단편에 트랜스글루타미나제 유전자가 존재하고 있는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 에스. 모바라엔세 IFO13819의 염색체 DNA를 SacI로 분해한 약 4kb의 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수하여, 이것을 pUC18(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)의 SacI 부위에 삽입한 다음, 에스케리키아 콜라이 JMl09(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)의 수용능 세포에 도입하여, 라이브러리를 작제한다.
먼저 작제한 트랜스글루타미나제의 DNA 프로브를 사용하여, 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1. 90(1989)]에 기재된 콜로니 하이브리드화에 의해 라이브러리의 스크리닝을 수행하고, 트랜스글루타미나제 유전자 단편이 클로닝된 플라스미드를 보유하는 균주를 수득하여, 이것으로부터 플라스미드를 회수하고, pUITG라고 명명한다. pUITG에 클로닝되어 있는 단편의 염기 서열을 결정한 바, 에스. 모바라엔세 IFO13819의 트랜스글루타미나제의 유전자는 에스. 모바라엔세 DSMZ주의 트랜스글루타미나제의 유전자와 동일한 염기 서열을 갖는 것으로 확인된다.
염기 서열 결정의 결과, 이러한 SacI의 약 4kb의 단편은 시그널 서열(프리부분)이 일부 결실된 불완전한 DNA 단편인 것으로 판명되었다. 따라서, 프로모터 영역과 완전한 시그널 서열 영역의 클로닝을 시도하였다. 클로닝은 TAKARA LA PCR 시험관내 클로닝 키트(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)와 서열 10 및 서열 11에 제시된 합성 프라이머를 이용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 수행한다.
(서열 10) 5'-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3'
(서열 11) 5'-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 10 및 서열 11: 에스. 모바라엔세의 프로모터 영역 및 시그널 서열을 위한 PCR 프라이머
그 결과, SalI의 카세트 프라이머를 사용할 때에 약 800bp의 PCR 증폭 단편이 수득되며, 이러한 단편의 염기 서열을 결정한 바, 트랜스글루타미나제 유전자의 프로모터 영역과 시그널 서열 영역을 함유하는 단편인 것으로 확인된다. 따라서, 이러한 약 800bp의 PCR 증폭 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVITGS5를 수득한다. 또한, pUITG를 SacI로 분해함으로써, 트랜스글루타미나제 유전자를 함유하는 약 4kb의 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수하고, 이러한 단편을 pVITGS5의 SacI 부위에 삽입하여, 완전한 길이의 트랜스글루타미나제 유전자를 함유하는 플라스미드 pVITGC를 작제한다. 또한, 염기 서열의 결정은 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing kit, 제조원: PE Applied Biosystems)와 DNA 시퀀서 373A(제조원: PE Applied Biosystems)를 사용하여 수행한다. 서열 12에 프리프로트랜스글루타미나제 유전자의 서열을 기재하며, 여기서, N-말단의 31개 아미노산 서열이 시그널 서열(프리 부분)이라고 생각된다. 프리프로트랜스글루타미나제의 아미노산 서열은 서열 13에 제시한다.
(2) 트랜스글루타미나제 유전자 프로모터 영역의 변환
씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자의 서열은 이미 결정되어 있다[참조: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]. 이러한 서열을 참고로 하여 서열 4와 서열 15에 제시된 프라이머를 합성하고, 통상적인 방법에 따라 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 염색체 DNA로부터 PS2 단백질 유전자의 개시 코돈의 5'-상류 영역의 프로모터를 함유하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 15) 5'-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 14 및 서열 15: PCR 프라이머
한편, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열 16과 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 취득한 pUITG를 사용하여 프리프로트랜스글루타미나제 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 16) 5'-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 16: PCR 프라이머
다음, 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2 유전자의 프로모터를 함유하는 영역과 역시 증폭시킨 프리프로트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 14와 서열 9를 사용하여 크로스오버(cross-over) PCR을 수행하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터를 함유하는 영역에 연결된 프리프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 증폭시킨다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써, pVKPTG0을 수득한다. 상기한 방법에 따라, 삽입 단편의 염기 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다.
(3) 프리프로트랜스글루타미나제 유전자의 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에서의 발현
실시예 1(1)에서 작제한 pVITGC(프로모터 및 프리프로트랜스글루타미나제 유전자의 전부가 에스. 모바라엔세 유래) 또는 실시예 1(2)에서 작제한 pVKPTG0(프로모터는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2 유전자 유래이며, 프리프로트랜스글루타미나제 유전자는 에스. 모바라엔세 유래)에서 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 CM2S 한천 배지(효모 추출물 10g, 트립톤 10g, 슈크로스 5g, NaCl 5g, 한천 15g, 물로 1L로 한다)에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVITGC 또는 pVKPTG0을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 MM 액체 배지(글루코스 30g, 황산마그네슘 7수화물 0.4g, 황산암모늄 30g, 인산2수소칼륨 1g, 황산철7수화물 0.01g, 황산망간5수화물 0.01g, 타아민 염산염 200㎍, 비오틴 500㎍, DL-메티오닌 0.15g, 탄산칼슘 50g, 물로 1L로 하고 pH 7.5로 조정)에서 각각 30℃, 48시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 문헌[참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법[예: J. Sambrook 등(1989)(상기)에 기재된 바와 같은 일반적인 순서]에 따라 웨스턴 블롯을 수행한다.
그 결과, 트랜스글루타미나제의 분비를 검출하는 것은 할 수 없다. 이상의 결과로부터 에스. 모바라엔세의 트랜스글루타미나제의 시그널 서열은 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에서는 기능하지 않는 것으로 확인된다.
실시예 2: 코리네 박테리움(씨. 글루타미쿰 ATCC13869)의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드 및 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 성숙 트랜스글루미타제를 암호화하는 융합 유전자를 사용하는 성숙 트랜스글루미타제의 분비 생산
(1) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 갖는 트랜스글루타미나제 유전자의 작제
씨. 글루타미쿰의 세균 표층 단백질인 PS2의 유전자의 서열은 이미 결정되어 있다[참조: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]. 이러한 서열을 참고로 하여 서열14와 서열 17에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(2)에 기재된 방법에 의해 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 염색체 DNA로부터 PS2에 상당하는 단백질의 N-말단측 44개 아미노산 잔기(시그널 펩타이드 30개 아미노산 잔기와 성숙 세포 표층 단백질의 14개 아미노산 잔기)를 암호화하는 영역과 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역을 PCR법으로 증폭시킨다. 또한, 서열 17에 제시된 프라이머는 트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해, 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단측의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 17) 5'-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 17: PCR 프라이머
한편, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열 8과 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 수득한 pUITG를 사용하여 성숙 트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
다음, 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2에 상당하는 단백질의 N-말단측 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역과 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역의 PCR 반응액 1㎕와 역시 증폭시킨 성숙 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 14와 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 N-말단측 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 성숙 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 증폭시킨다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.7kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써, pVKTG3을 수득한다. 상기한 방법에 따라 삽입 단편의 염기 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다.
또한, pVKTG3을 KpnI과 XbaI을 사용하여 분해함으로써, 약 1.7kb의 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 N-말단측 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 성숙 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수한다. 이러한 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써, pPKTG3을 작제한다.
(2) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 이용한 성숙 트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pVKTG3 또는 pPKTG3(양쪽 모두 프로모터와 시그널 펩타이드 및 N-말단 14개 아미노산 잔기로 이루어진 유전자는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869 유래이며, 성숙 트랜스글루타미나제 유전자는 에스. 모바라엔세 유래)을 사용하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVKTG3 또는 pPKTG3을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MM 액체 배지에서 30℃, 48시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 문헌[참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행한다. 그 결과, 양쪽 균주에 있어서 배양 상등액에서 성숙 트랜스글루타미나제와 거의 동일한 분자량을 갖는 분비된 트랜스글루타미나제를 소량 검출할 수 있다.
실시예 3: 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드에 결합된 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 프로트랜스글루미타제 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루미타제 유전자)를 사용하는 프로트랜스글루미타제의 분비 생산
(1) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)의 작제
씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자 서열[참조: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]을 참고로 하여, 서열 18, 서열 19, 서열 20 및 서열 21에 제시된 프라이머를 합성한다. 실시예 1(2)에 기재된 방법에 의해 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 염색체 DNA로부터 서열 14와 서열 18, 서열 14와 서열 19,서열 14와 서열 20 또는 서열 14와 서열 21의 조합에 의해 PS2에 상당하는 단백질의 N-말단측 아미노산을 각각 30개, 31개, 44개 및 68개 잔기를 암호화하는 영역(시그널 펩타이드 30개 아미노산 잔기를 함유한다)과 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
서열 18, 서열 19, 서열 20 및 서열 21에 제시된 프라이머는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해, 프로트랜스글루타미나제의 N-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 18) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3'
(서열 19) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3'
(서열 20) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'
(서열 21) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 18 내지 서열 21: PCR 프라이머
한편, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열 22와 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 취득한 pUITG를 사용하여 프로트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 22) 5'-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 22: PCR 프라이머
다음, 각각 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2에 상당하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 N-말단측 아미노산 30개, 31개, 44개 및 68개 잔기를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 역시 증폭시킨 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 14와 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여. 각각 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2에 상당하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역 및 N-말단측 아미노산 30개, 31개, 44개 및 68개 잔기를 암호화하는 각각의 영역에 연결된 프로트랜스글루타미나제와의 융합 유전자, 즉, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869 표층 단백질 유전자의 프로모터에 결합한 이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자 단편을 증폭시킨다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 각각 약 1.8kb 내지 1.9kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써, 각각 pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3 및 pVKPTG4를 수득한다. 상기한 방법에 따라 삽입 단편의 염기 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다.
또한, pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3 및 pVKPTG4를 KpnI과 XbaI을 사용하여 분해함으로써, 약 1.8kb 내지 1.9kb의 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2에 상당하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 N-말단측 아미노산 30개, 31개, 44개 및 68개 잔기를 암호화하는 각각의 영역에 연결된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해회수한다. 이들 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 및 pPKPTG4를 작제한다.
(2) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 또는 pPKPTG4를 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 상기 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTC2, pPKPTG3 또는 pPKPTG4를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MM 액체 배지에서 각각 30℃, 48시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 문헌[참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행한다. 그 결과, pVC7 또는 pPK4의 어느 쪽의 벡터에서도 거의 동일한 양의 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 분비가 확인되지만, PS2에 상당하는 단백질의 성숙 단백질의 N-말단측 아미노산 잔기의 길이에 따라 분비량에 유의적인 차이가 확인된다. 대표적인 분비량을 표 1에 제시한다.
| 플라스미드 | 프로트랜스글루타미나제(mg/ℓ) |
| pPKPTG1 | 78 |
| pPKPTG4 | 210 |
(3) 디스파제 분해에 의한 프로트랜스글루타미나제의 절단과 활성의 검출
pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 또는 pPKPTG4를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 배양 상등액에 프로테아제인 다스파제(제조원: Boeringer Manheim Co. Ltd.)를 기질:효소 = 1:1로 되도록 첨가하고, pH 7.5, 37℃에서 1시간 동안 반응을 수행한다. 디스파제 분해 반응 후, SDS-PAGE를 수행하여 프로트랜스글루타미나제의 절단을 확인하고, 또한 하이드록사메이트법[참조: J. Biol. Chem., 241, 5518-5525(1966)]으로 트랜스글루타미나제 활성을 확인한 바, 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4: 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열 및 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 프로트랜스글루미타제를 암호화하는 서열을 갖는 융합 유전자를 사용하는 프로트랜스글루미타제의 분비 생산
(1) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)의작제
씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 유전자 서열[일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]을 참고로 하여 서열 23와 서열 24에 제시된 프라이머를 합성하여, 통상적인 방법에 따라 제조한 씨. 암모니아게네스의 염색체 DNA로부터 세포 표층 단백질(SlpA) 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 N-말단측 25개 아미노산 잔기(시그널 펩타이드)를 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다. 또한, 서열 24에 제시된 프라이머는 프로트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해, 프로트랜스글루타미나제의 N-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 23) 5'-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3'
(서열 24) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 23 및 서열 24: PCR 프라이머
다음, 증폭시킨 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA) 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 N-말단측 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 실시예 3(1)에서 증폭시킨 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 23과 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA) 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 N-말단측 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 증폭시킨다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.7kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVSPTG1을 수득한다.
(2) 프로모터 영역의 변환; 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터와의 결합
씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자 서열[참조: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]을 참고로 하여 서열 14와 서열 25에 제시된 프라이머를 합성한다. 실시예 1(2)에 기재된 방법에 의해 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 염색체 DNA로부터 PS2에 상당하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역을 PCR법으로 증폭시킨다. 또한, 서열 25에 제시된 프라이머는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 작제하기 위해, 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열의 N-말단측 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 25) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3
<서열목록 프리 텍스트>
서열 25: PCR 프라이머
한편, 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자 서열을 기초로 하여 서열 26과 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 4(1)에서 수득한 pVSPTG1로부터 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 26) 5'-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3'
<서열 프리 텍스트>
서열 26: PCR 프라이머
다음, 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2에 상당하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역의 PCR 반응액 1㎕와 역시 증폭시킨 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자) 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 14와 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2에 상당하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역을 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단측 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 증폭시킨다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에삽입함으로써 pVKSPTG1을 수득한다. 상기한 방법에 따라, 삽입 단편의 염기 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다.
또한, pVKSPTG1을 KpnI과 XbaI을 사용하여 분해함으로써, 약 1.8kb의 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2에 상당하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역을 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단측 25개 아미노산 잔기(시그널 펩타이드)를 암호화하는 영역에 연결된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수한다. 이러한 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써 pPKSPTG1을 작제한다. 플라스미드 pVKSPTG1 및 pPKSPTG1은 함께, 프로모터는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2 유전자에 유래하고, 시그널 펩타이드는 씨. 암모니아게네스의 SlpA에 유래하고, 프로트랜스글루타미나제는 에스. 모바라엔세에 유래하는 유전자로 구성되어 있다.
(3) 이. 콜라이의 tac 프로모터로의 변환
이. 콜라이의 tac 프로모터가 클로닝되어 있는 플라스미드 pKK223-3(제조원: Amersham Pharmacia Co. Ltd.)의 서열을 참고로 하여 서열 27과 서열 28에 제시된 프라이머를 합성한다. pKK223-3의 DNA로부터 tac 프로모터에 상당하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다. 또한, 서열 28에 제시된 프라이머는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 작제하기 위해, 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열의 N-말단측의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 27) 5'-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3'
(서열 28) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3'
<서열 프리 텍스트>
서열 27 및 서열 28: PCR 프라이머
다음, 증폭시킨 tac 프로모터에 상당하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 실시예 4(2)에서 증폭시킨 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 27과 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, tac 프로모터를 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단측 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 증폭시킨다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.5kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVTSPTG1을 수득한다. 상기한 방법에 따라 삽입 단편의 염기 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다.
또한, pVTSPTG1을 KpnI과 XbaI을 사용하여 분해함으로써, 약 1.5kb의 tac 프로모터를 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단측 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수한다. 이러한 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써, pPTSPTG1을 작제한다. 플라스미드 pVTSPTG1 및 pPTSPTG1은 함께, 이. 콜라이 유래의 tac 프로모터, 씨. 암모니아게네스의 SlpA에 유래하는 시그널 펩타이드, 에스. 모바라엔세에 유래하는 프로트랜스글루타미나제 유전자로 구성되어 있다.
(4) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1 또는 pPTSPTG1을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 상기한 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1 또는 pPTSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MM 액체 배지에서 각각 30℃에서 48시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 문헌[참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행한다. 그 결과, pVC7 또는 pPK4의 어느 쪽의 벡터에서도거의 동량의 프로트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다. 대표적인 분비량을 표 2에 제시한다.
| 플라스미드 | 프로트랜스글루타미나제(mg/ℓ) |
| pPKSPTG1 | 102 |
| pPTSPTG1 | 74 |
(5) 디스파제 분해에 의한 프로트랜스글루타미나제의 절단과 활성의 검출
pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1 또는 pPTSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 배양 상등액에 프로테아제인 디스파제(제조원: Boeringer Manheim Co. Ltd.)를 기질:효소 = 1:1로 되도록 첨가하고, pH 7.5, 37℃에서 1시간 동안 반응을 수행한다. 디스파제 분해 반응 후, SDS-PAGE를 수행하여, 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 절단을 확인하고, 추가로 하이드록사메이트법으로 트랜스글루타미나제 활성을 확인한 바, 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 5: 에스. 모바라엔세의 배양액 및 균체에 의한 프로트랜스글루타미나제의 절단과 활성의 검출
(1) 에스. 모바라엔세 IFO13819주의 배양액에 의한 프로트랜스글루타미나제의 절단과 활성의 검출
에스. 모바라엔세 IFO13819주를 ISP2 액체 배지(효모 추출물 4g, 맥아 추출물 10g, 글루코스 4g, 물로 1L로 하고 pH 7.3으로 조정)에서 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 이러한 배양액 10ml에 실시예 4(5)에서도 사용한 프로트랜스글루타미나제가 축적되어 있는 pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1 또는 pPTSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 배양 상등액 10ml를 멤브레인 필터로 여과한 후에 첨가하고, 30℃에서 6시간 동안 유지시킨다. 이후, SDS-PAGE를 수행하여, 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 절단을 확인하고, 추가로 하이드록사메이트법으로 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는 트랜스글루타미나제 활성을 확인한다. 또한, SDS-PAGE를 수행한 다음, 폴리비닐리덴-디플루오라이드(PVDF) 막에 세미-드라이 블롯팅한다[참조: Structural analysis of proteins for gene cloning, Tokyo Kagaku Dojin (1993)]. 블롯팅한 다음, PVDF 막을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하고, 탈염, 공기 건조시킨다. 성숙 트랜스글루타미나제의 부분을 절단하여, 프로테인 시퀀서(모델 476A, Parkin Elmer Co. Ltd.)로 N-말단 아미노산 서열의 해석을 수행한다. 그 결과, 서열 5에 제시된 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 동일한 N-말단 아미노산 서열을 갖고 있는 것으로 확인된다.
(2) 에스. 모바라엔세 IFO13819주의 균체에 의한 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 절단과 활성의 검출
에스. 모바라엔세 IFO13819주를 ISP2 액체 배지에서 30℃에서 24시간 동안배양한다. 이러한 배양액 10ml를 원심분리에 의해 집균하여, 생리 식염수로 2회 세정한다. 최종적으로 집균한 균체를 10ml의 생리 식염수로 현탁하고, 실시예 4(5)에서도 사용한 프로트랜스글루타미나제가 축적되어 있는 pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1 또는 pPTSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 배양 상등액 10ml를 멤브레인 필터로 여과하여 첨가하여, 30℃에서 6시간 동안 유지시킨다. 이후, SDS-PAGE를 수행하여, 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 절단을 확인한 다음, 하이드록사메이트법으로 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는 트랜스글루타미나제 활성을 확인한다. 또한, SDS-PAGE를 수행한 다음, PVDF 막에 세미-드라이 블롯팅한다[참조: Structural analysis of proteins for gene cloning, Tokyo Kagaku Dojin (1993)]. 블롯팅한 다음, PVDF 막을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하며, 탈염, 공기 건조시킨다. 성숙 트랜스글루타미나제의 부분을 절단하여, 프로테인 시퀀서로 N-말단 아미노산 서열의 해석을 수행한다. 그 결과, 서열 5에 제시된 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 동일한 N-말단 아미노산 서열을 갖고 있는 것으로 확인된다.
실시예 6: 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열 및 스트렙토버티실리움 신나모네움 IFO12852 유래의 프로트랜스글루미타제를 암호화하는 서열을 갖는 융합 유전자를 사용하는 프로트랜스글루미타제의 분비 생산
(1) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열 및 에스. 신나모네움 IFO12852 유래의 프로트랜스글루타미나제를 암호화하는 서열을 갖는 융합 유전자의작제
에스. 신나모네움 IFO12852의 트랜스글루타미나제 유전자의 서열은 이미 결정되어 있다[참조: 일본 특허원 제(평)11-295649호]. 아미노산 서열의 1번째 내지 32번째가 프리 부분의 서열, 33번째 내지 86번째가 프로 부분의 서열, 87번째 내지 416번째가 성숙형 트랜스글루타미나제의 서열이라고 추정되어 있다. 추정되어 있는 프로 구조와 성숙 단백질의 아미노산 서열을 각각 서열 4와 서열 43에 제시한다. 또한, 당해 유전자를 함유하는 플라스미드 pUJ-MTG로 형질전환시킨 에스케리키아 콜라이 AJI3669는 1999년 10월 14일자로 FERM P-17602로서 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소(일본 ‡305-8566 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)에 기탁되어 있으며, 2000년 8월 28일자로 부다페스트 조약에 근거한 기탁으로 이관되고, 수탁번호 FERM BP-7287이 부여되어 있다.
우선 pUJ-MTG로부터 제한효소 BamHI로 프리프로트랜스글루타미나제 유전자의 전체 길이를 포함하는 영역 약 3.5Kb를 절단하고, 이것을 pUC19의 BamHI 부위에 삽입한 pUCSCTC를 작제한다.
pUCSCTG를 주형으로 하여 서열 44와 서열 45에 제시된 프라이머를 합성하고, 에스. 신나모네움 IFO12852 유래의 프로트랜스글루타미나제를 함유하는 유전자 영역을 지금까지와 동일하게 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 44) 5'-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3'
(서열 45) 5'-GGC GGA TCC TCG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 44 및 서열 45: PCR 프라이머
다음, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여, 서열 46과 서열 47의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열을 함유하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
서열 47에 제시된 프라이머는 스트렙토버티실리움 신나모네움 IFO12852 유래의 프로트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해, 스트렙토버티실리움 신나모네움 IFO12852 유래의 프로트랜스글루타미나제의 N-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 46) 5'-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3'
(서열 47) 5'-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GGC C-3'
<서열 프리 텍스트>
서열 46 및 서열 47: PCR 프라이머
다음, 증폭시킨 에스. 신나모네움 IFO12852 유래의 프로트랜스글루타미나제를 함유하는 유전자를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 역시 증폭시킨 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열을 함유하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 46과 서열 45를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열에 연결된 이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자 단편을 증폭시킨다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 EcoRI과 BaHI로 분해한 다음, 아가로스 겔로부터 회수하여, pUC19의 EcoRI- BamHI 부위에 삽입함으로써, pUKSPTG2'를 수득한다. 상기한 방법에 따라, 삽입 단편의 염기 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다. 이러한 pUKSPTG2'를 EcoRI로 분해한 다음, 블런팅 키트(Blunting Kit, 제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)로 평활 말단화하여, 5'-말단이 인산화된 5'-CTCTAGAG-3'의 서열을 갖는 XbaI 링커(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 삽입하고, 재환상화하여 pUKSPTG2를 작제한다. pUKSPTG2를 XbaI을 사용하여 분해함으로써, 약 1.8kb의 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자(프로트랜스글루타미나제 유전자는 에스. 신나모네움 IFO12852 유래)를 절단하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수한다. 이들 단편을 상기한 pPK4의 XbaI 부위에 삽입함으로써 pPKSPTG2를 작제한다.
다음, 프로 구조부의 N-말단측의 일부가 에스. 모바라엔세의 프로 구조부에 치환된 키메라 프로 구조부를 갖는 프리프로트랜스글루타미나제 유전자의 작제를 수행한다(성숙형 트랜스글루타미나제 유전자와 프로 구조부의 일부는 에스. 신나모네움 IFO12852 유래).
우선 실시예 4(2)에서 작제되어 있는 플라스미드 pPKSPTG1(에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 프로트랜스글루타미나제 발현용)로부터 EcoRI-BamHI의 약 1.8kb의 프리프로트랜스글루타미나제 유전자를 함유하는 단편을 절단하고, pUCl9의 EcoRI-BamHI 부위에 삽입한다(pUKSPTG1). pUKSPTG1을 AatII 분해하여 약 1.2kb의 단편을 절단하는 동시에, pUKSPTG2'에 관해서도 AatII 분해하여 약 1.2kb 단편을 제거한 약 3.3kb의 단편을 제조한다. 이러한 약 3.3kb의 단편과 pUKSPTG1 유래의 약 1.2kb의 AatII 단편을 연결하고, 통상적인 방법의 유전자 조작법에 근거하여 AatII 단편의 삽입된 클론을 선택한다. 이 중에서 AatII 단편이 삽입된 방향을 결정하기 위해 순차적으로 시퀀싱을 수행하고, 목적하는 방향(프리프로트랜스글루타미나제가 암호화되어 있다)으로 삽입된 것을 선택한다(pUKSPTG3'). 또한, pUKSPTG3'에 관해서도 먼저 pUKSPTG2'로 수행한 것과 동일하도록 이의 EcoRI 부위를 평활 말단화하여, XbaI 링커를 삽입하고, pUKSPTG3을 작제한다. 또한, pUKSPTG3으로부터 XbaI의 약 1.8kb 단편을 절단하고, pPK4의 XbaI 부위에 삽입함으로써, pPKSPTG3을 작제한다.
(2) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 사용하는 스트렙토버티실리움 신나모네움 IFO12852 유래 프로트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pPKSPTG2 및 pPKSPTG3을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 상기 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pPKSPTG2 및 pPKSPTG3을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지(글루코스 60g, 황산마그네슘7수화물 0.4g, 황산암모늄 30g, 인산2수소칼륨 1g, 황산철7수화물 0.01g, 황산망간5수화물 0.01g, 티아민 염산염 450㎍, 비오틴 450㎍, DL-메티오닌 0.15g, 탄산칼슘 50g, 물로 1L로 하고, pH 7.5로 조정)에서 각각 30℃, 3일 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 본 항체는 에스. 모바라엔세 유래의 트랜스글루타미나제에 대한 항체이지만, 에스. 신나모네움 유래의 트랜스글루타미나제에 대하여도 반응성을 나타낸다. 그 결과, 프로 구조부 부가 에스. 신나모네움 IFO12852 유래 트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다(약 30 내지 50mg/L).
실시예 7: 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 프로트랜스글루미타제의 프로 구조부를 에스. 신나모네움 IFO12852 유래 프로 구조부에 교체하는 것(하이브리드체 작제)에 의한 프로트랜스글루미타제의 분비 생산
pPKSPTG2 또는 pPKSPTG3으로부터 서열 14와 서열 48에 제시된 프라이머를 합성하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열, 및 에스. 신나모네움 IFO12852 유래의 트랜스글루타미나제의 프로 구조부 서열을 암호화하는 영역을 각각 PCR법으로 증폭시킨다.
또한, 서열 48에 제시된 프라이머는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열, 및 스트렙토버티실리움 신나모네움 IFO12852 유래의 트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 갖는 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 성숙트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 작제하기 위해, 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단측 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 48) 5'-GGG GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG GGG GCC CGG GAG GGC GCG CTG G-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 48: PCR 프라이머
한편, 실시예 1(1)에서 결정한 에스. 모바라엔세 유래 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열 8과 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 수득한 pUITG를 사용하여 에스. 모바라엔세 유래 성숙 트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 8) 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
(서열 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
<서열의 프리 텍스트>
서열 8 및 서열 9: PCR 프라이머
다음, 각각 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열 및 에스. 신나모네움 IFO12852 유래의 트랜스글루타미나제의 프로 구조부 서열을 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 역시 증폭시킨 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 성숙 트랜스글루타미나제 유전자를 암호화하는 영역의 PCR 반응액1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 14와 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그널 서열 및 스트렙토버티실리움 신나모네움 IFO12852 유래의 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 갖는 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 성숙 트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자 단편을 증폭시킨다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 제한효소 ScaI 및 Eco065I로 분해함으로써 생성된 약 800bp의 단편을 아가로스 겔로부터 회수하여, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1로부터의 ScaI과 Eco065I로 절단된 단편과 교체하는 것에 의해 pPKSPTG4 및 pPKSPTG5를 작제한다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
(2) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열 및 에스. 신나모네움 IFO12852 유래 프로 구조부를 사용하는 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래 트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pPKSPTG4 및 pPKSPTG5를 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pPKSPTG4 및 pPKSPTG5를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 각각 30℃, 3일 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 그 결과, 에스. 신나모네움 IFO12852 유래의 프로 구조부 부가 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래 트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다. 표 3에 프로트랜스글루타미나제의 생산량을 기재한다. pPKSPTG1은 대조군으로서 사용되고 있으며, 이의 유전자 구성상의 특색은 프로 구조부가 에스. 모바라엔세 유래인 점이다. pPKSPTG4는 프로 구조부가 에스. 신나모네움 유래라는 유전자 구성상의 특색이 있다. pPKSPTG5는 프로 구조부가 N-말단에서 16개 아미노산이 에스. 모바라엔세 유래이며, C-말단부 40개 아미노산이 에스. 신나모네움 유래의 키메라 프로 구조라는 유전자 구성상의 특색을 갖고 있다. 그 이외에 관해서는 3자 공통적인 특색을 갖는다. 결과는 프로 구조의 아미노산 서열의 상이함에 의해 분비량에 유의적인 차이가 보인다. 키메라 프로 구조를 갖는 것이 가장 분비량이 높다(ATCC13869/pPKSPTG5).
| 플라스미드 | 프로트랜스글루타미나제(mg/ℓ) |
| pPKSPTG1 | 235 |
| pPKSPTG4 | 130 |
| pPKSPTG5 | 270 |
실시예 8: 세린 프로테아제(SAMP45) 유전자의 클로닝과 발현 플라스미드의 작제 평가
(1) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 세린 프로테아제(SAMP45) 유전자[이종 융합 프리프로세린 프로테아제(SAMP45) 유전자]의 작제
에스. 알보그리세올루스가 생산하는 세린 프로테아제인 SAMP45의 유전자의 서열은 이미 결정되어 있다[참조: J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)]. 이러한 서열을 참고로 하여 서열 49와 서열 50에 제시된 프라이머를 합성하고, SAMP45의 N-말단 프로 구조, 성숙 SAMP45 및 C-말단 프로 구조를 함유하는 유전자 영역을 상기한 바와 동일한 방법에 따라 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 49) 5'-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3'
(서열 50) 5'-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 49 및 서열 50: PCR 프라이머
다음, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여, 서열 51과 서열 52의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA 유전자의 시그널 서열을 함유하는 영역을 동일하게 PCR법으로 증폭시킨다.
서열 52에 제시된 프라이머는 프로 구조부 부가 세린 프로테아제와의 융합 유전자를 작제하기 위해, 프로세린 프로테아제의 N-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 51) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTCAATTAGCTGA-3'
(서열 52) 5'-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3'
<서열 프리 텍스트>
서열 51 및 서열 52: 융합 프리프로세린 프로테아제 유전자 작제를 위한 PCR 프라이머
다음, 각각 증폭시킨 SAMP45의 N-말단 프로 구조, 성숙 SAMP45 및 C-말단 프로 구조를 함유하는 유전자를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 역시 증폭시킨 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열을 함유하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 51과 서열 50을 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열에 연결된 이종 융합 프리프로세린 프로테아제 유전자 단편을 증폭시킨다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 3.9kb의 증폭 단편을 검출한다. PCR 산물을 HindIII과 EcoRI로 분해한 다음, 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 약 3.9kb의 단편을 아가로스 겔로부터 회수하여, 상기한 pVC7의 HindIII-EcoRI 부위에 삽입함으로써, 각각 pVSS1을 수득한다. 상기한 방법에 따라 삽입 단편의 염기 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다.
(2) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 사용하는 세린 프로테아제의 분비
작제한 플라스미드 pVSS1을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVSS1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃, 70시간 동안 배양한다. 이러한 배양액 1ml를 원심분리에 의해 배양 상등액과 균체로 분리한다. 균체를 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁한다. 세린 프로테아제의 활성 측정은 하기와 같이 하여 수행한다. 0.25mM의 Bz-Phe-Val-Arg-pNA(제조원: Bachem Co. Ltd.)를 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 배양 상등액 또는 균체 현탁액 50㎕를 가하여, 총 액량 0.6ml로 30℃에서 20분 동안 반응시킨 다음, 50% 아세트산을 0.4ml 가하여 반응을 정지시킨다. 410nm의 흡광도를 측정하고, 유리된 pNA(p-니트로아닐라이드)의 양을 산출함으로써 활성을 결정한다. 또한, 효소 1단위는 1분 동안에 1μmol의 pNA를 유리시키는 효소량으로 한다. 그 결과, 배양 상등액에서는 세린 프로테아제의 활성은 검출되지 않으며, 균체 현탁액에서는 활성을 검출할 수 있다. 검출된 활성치와 문헌[참조: J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)]에 의한 비활성치로부터 계산한 결과, 약 9mg/ℓ 상당의 세린 프로테아제가 균체 표면에 분비 발현되고 있는 것으로 확인된다.
(3) 씨. 글루타미쿰 등 ATCC13869에 있어서 분비 발현된 세린 프로테아제에 의한 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 절단
작제한 플라스미드 pVSS1을 사용하여, 실시예 4(2)에 기재한 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 분비 발현 플라스미드 pPKSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVSS1 및 pPKSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃, 70시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 그 결과, SAMP45가 정상적으로 분비 발현하며, 역시 분비되고 있는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 프로 구조부가 절단되며, 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 거의 동일한 분자량을 갖는 트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다.
이러한 배양 상등액에 관해서 상기한 하이드록사메이트법으로 트랜스글루타미나제 활성을 확인한 바, 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
또한, SDS-PAGE를 수행한 다음, 상기한 방법에 따라 PVDF 막에 세미-드라이 블롯팅한다. 블롯팅한 다음, PVDF 막을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하고, 탈염, 공기 건조시킨다. 성숙 트랜스글루타미나제의 부분을 절단하여, 프로테인 시퀀서로 N-말단 아미노산 서열의 해석을 수행한다. 그 결과, 서열 5에 제시된 에스. 모바라엔세 유래의 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제에 프로 구조부의 C-말단측 아미노산의 Phe-Arg-Ala-Pro의 4개의 아미노산이 부여되어 있는 구조인 것으로 확인된다.
실시예 9: 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드 작제 평가
(1) 에스. 모바라엔세 IFO13819가 생산하는 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP)의 정제
ISP2 액체 배지(효모 추출물 4g, 말토스 추출물 10g, 글루코스 4g, 물로 1L로 하고, pH 7.3으로 조정)를 5L 경사구 플라스크에 800ml 희석하여 투입하고, 에스. 모바라엔세 IFO13819주를 플레이트에서 식균하여, 30℃에서 48시간, 120rpm으로 진탕 배양한다.
배양액을 원심분리하여, 배양 상등액을 제거하고, 균체를 회수한다. 25mg/L의 가나마이신을 함유하는 20mM 트리스-염산 완충액으로 세정한 다음, 수득된 균체를 25mg/L의 가나마이신을 함유하는 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁한다. 얼음 위에서 4시간 동안 진탕한 다음, 원심분리에 의해 수득된 상등액을 회수한다. 니트로셀룰로스 필터(세공 크기 0.22㎛, 제조원: Sartrius Co. Ltd.)를 사용하여 여과 멸균한 다음, FPLC(제조원: Amersham Pharmacia Co. Ltd.)를 사용하여 1.5M 황산암모늄/50mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 부틸-세파로즈 4FF(제조원: Amersham Pharmacia Co. Ltd.)의 칼럼(1.6ø×10cm)에 통과시키고, 상기 완충액 중, 황산암모늄 1.5M 내지 0M의 직선 농도 구배로 용출시킨다. 활성 성분을 함유하는 분획을 회수한 다음, 동일 조건에서 페닐-세파로즈 HP 칼럼(lmL, 제조원: Amersham Pharmacia Co. Ltd.)에 통과시켜, 활성 분획을 회수하고, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 밤새 4℃에서 투석한다. 이에 따라 부분 정제 효소액을 수득한다.
상기 각 단계에서 총 단백질량, 총 활성, 비활성, 수율 및 정제도를 표 4에 제시한다. 또한, 각 단계에서의 효소 활성의 측정은 요시모토(Yoshimoto) 등의 방법[참조: Tsuru and Funatsu eds., Seibutsukagaku Jikkenhou, 31 Proteolytic enzyme II, Gakkai Shuppan Center (1993), p187]에 따라 하기와 같이 수행한다.
0.25mM의 Ala-Ala-Pro-pNA(제조원: Bachem Co. Ltd.)를 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액에 효소 용액을 가하여, 총 액량 0.6ml로 30℃에서 5분 동안 반응시킨 다음, 50% 아세트산을 0.4ml 가하여 반응을 정지시킨다. 410nm의 흡광도를 측정하고, 유리된 pNA의 양을 산출함으로써 활성을 결정한다. 또한, 효소 1단위는 1분 동안에 1μmol의 pNA를 유리시키는 효소량으로 한다.
| 정제 단계 | 용량(ml) | 총활성(단위) | 총단백질(mg) | 비활성(단위/mg) | 수율(%) | 정제도(배) |
| 조효소 추출액 | 550 | 308 | 385 | 0.80 | 100 | 1 |
| 부틸-세파로즈 4FF | 45.6 | 213 | 8.98 | 23.7 | 69 | 30 |
| 페닐-세파로즈 HP | 5.8 | 136 | 3.83 | 35.5 | 44 | 44 |
(2) 에스. 모바라엔세 IFO13819가 생산하는 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP)의 N-말단 아미노산 서열 해석
부분 정제 효소액을 역상 크로마토그래피에 걸어 추가로 정제한다. 역상 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다.
HPLC 장치: 펌프: HITACHI L-6300, 검출기: L-4000H
칼럼: PROTEIN C4 214TP5410(VYDAC Co. Ltd.)
용출 조건: 24-40% 아세트니트릴 직선 구배/0.1% 트리플루오로아세트산(20분) 실온에서 용출
유속: 1.0ml/분
검출 파장: 280nm
상기 조건으로 정제한 효소 시료를 멤브레인 카트리지(제조원: Perkin Elmer Co. Ltd.)를 사용하여 폴리비닐리덴-디플루오라이드(PVDF) 막에 전사하고, 기상 프로테인 시퀀서 PPSQ-10(제조원: Shimazu Seisakusho Co., Ltd.)을 사용하여 N-말단 아미노산 서열을 해석한다. 그 결과, 서열 53에 제시된 20개 잔기의 N-말단 아미노산 부분 서열이 수득된다.
(서열 53) Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro
1 5 10
Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys
15 20
(3) 에스. 모바라엔세 IFO13819에 의해 생산된 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP)의 특성 평가
하기의 특성에 관해서 에스. 모바라엔세 IFO13819가 생산하는 프롤린 특이적 펩티다제를 평가한다.
(i) 기질 특이성
(a) 발색단 pNA 부가 펩타이드를 기질로 하는 경우: pNA를 부가한 각종 펩타이드 각 0.25mmol을 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)에 정제 효소액을 가하여, 총량 0.6ml로 37℃에서 5분 동안 반응시킨다. 50% 아세트산을 0.4ml 가하여 반응을 정지시키고, 410nm의 흡광도를 측정하여 절단 활성을 구한다.
(b) 발색단 βNA(β-나프틸아미드) 부가 펩타이드를 기질로 하는 경우: 0.3mmol의 각 펩타이드를 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)에 정제 효소액을 가하여, 총량 1.0ml로 37℃에서 5분 동안 반응시킨다. 패스트 가닛(Fast garnet) GBC 용액[l0% Triton X-100/1M 아세트산나트륨(pH 4.0)에 용해시켜 0.1%로 한 것]을 0.4ml 첨가하여 반응을 정지시키고, 550nm의 흡광도를 측정하여 절단 활성을 구한다.
(c) 펩타이드를 기질로 하는 경우: 1mg/ml로 제조한 펩타이드 용액을 기질로 하고 효소액을 첨가하여, 30℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 하기의 조건의 HPLC에서 절단 활성을 확인한다.
칼럼: YMC-PACK ODS-A 4.6×150mm(YMC)
용출액: 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)-아세트니트릴
유속: 1ml/분
검출 파장: UV 220nm
그 결과, 본 효소는 프롤린의 카복실측을 특이적으로 절단하는 효소이며, Ala-Ala-Pro-pNA, Phe-Arg-Ala-Xaa(서열 68)(식 중, Xaa는 Pro-pNA이며, pNA는 p-니트로아닐라이드이다) 및 Ala-Phe-Pro-pNA의 순서로 바람직하게 인식되며, N-말단에서 3번째 또는 4번째에서 프롤린을 함유하는 펩타이드에 강한 반응성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, N-말단에서 2번째 또는 5번째에 프롤린을 갖는 펩타이드에는 작용하지 않는 것으로 밝혀졌다(표 5).
| 펩타이드 기질 | 상대 활성(%) |
| P-pNA | 0.04 |
| DP-pNA | 0.00 |
| Z-GP-βNA | 0.04 |
| GP-βNA | 0.40 |
| AP-pNA | 0.53 |
| RP-pNA | 0.94 |
| Z-AGP-βNA | 0.78 |
| Z-GAP-βNA | 1.2 |
| Bz-FVR-pNA | 0.002 |
| AAF-pNA | 4.1 |
| AAA-pNA | 8.5 |
| AFP-pNA | 26.3 |
| AAP-pNA | 100 |
| AAPL-pNA | 0.3 |
| FRAP-pNA | 49.0 |
| Suc-AAPF-pNA | 0.01 |
| SFRAP-pNA | 1.23 |
| PSFRAP-pNA | 0.2 |
| pNA: p-니트로아닐라이드βNA: β-나프틸아미드 |
<서열목록 프리 텍스트>
서열 68: svPEP용 기질
(ⅱ) 최적 pH
pH 4 내지 6: 20mM 아세트산나트륨 완충액
pH 5.5 내지 8: 20mM 인산나트륨 완충액
pH 6.5 내지 9.5: 20mM 트리스-염산 완충액을 각각 사용하고, Ala-Ala-Pro-pNA를 기질로 하여 30℃에서 5분 동안 반응시킨다. 20mM 인산나트륨 완충액, pH 6.5에서 활성을 100%로 하여, 각 완충액을 사용하는 경우의 상대 활성을 산출한다. 그 결과, 최적 pH는 6 내지 6.5인 것으로 밝혀졌다.
(ⅲ) pH 안정성
pH 3 내지 10의 0.15M GTA 완충액(3,3-디메틸글루타르산, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올로 구성된 완충액)을 사용하고, 정제 효소 용액 20㎕에 각 pH의 완충액을 40㎕ 가하여, 4℃에서 밤새 방치한 다음, pH를 7.0으로 조정하고, 액량을 120㎕에 맞춘다. 이의 분액 50㎕를 사용하여, Ala-Ala-Pro-pNA를 가하고, 30℃에서 5분 동안 반응시킨다. pH가 7.0인 이외에는, 상기와 동일한 조건으로 보존하는 경우의 활성을 100%로 하여, 각 pH에서의 상대 기질 분해량을 잔존 활성으로 한다. 그 결과, pH 4 내지 9의 범위에서 안정적인 것으로 나타난다.
(iv) 최적 온도
정제 효소액 50㎕에 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 0.5ml 가하고, Ala-Ala-Pro-pNA를 0.25mM이 되도록 가하여, 20℃ 내지 60℃에서 5분 동안 분해한다. 25℃에서의 기질 분해량을 100%로 하는 경우에, 각 온도에서의 상대 분해량을 상대 활성으로 한다. 그 결과, 최적 온도는 25 내지 30℃인 것으로 나타난다.
(v) 온도 안정성
정제 효소액 50㎕에 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 0.5ml 가하고, 4℃ 또는 20℃ 내지 60℃에서 15분 동안 처리한 다음, 빙냉시키고 Ala-Ala-Pro-pNA를 0.25mM로 되도록 가하여, 30℃에서 5분 동안 반응시킨다. 상기에서 4℃로 처리한 경우의 활성을 100%로 하여 잔존 활성을 산출한다. 그 결과, 20℃ 이하에서 안정적인 것으로 나타난다.
(vi) 저해제
각종 화합물을 표 6에 제시된 농도로 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)에 정제 효소 용액을 가하여, 실온에서 10분 동안 방치한다. 이후, Ala-Ala-Pro-pNA를 가하여, 30℃에서 5분 동안 반응시킨다. 화합물 무첨가의 경우의 Ala-Ala-Pro-pNA에 대한 활성을 100%로 하여, 각종 화합물 첨가의 경우의 상대 기질 분해량을 상대 활성으로 한다. 그 결과, SH 효소 저해제인 p-클로로머큐리벤조산 등에 의해 약간의 저해를 받지만, 세린 프로테아제 저해제인 페닐메틸설포닐플루오라이드(제조원: Nakaraitesk Co. Ltd.) 및 아미노에틸벤젠설포닐플루오라이드 하이드로클로라이드(제조원: Boeringer Manheim Co., Ltd.)에 의해 비교적 강한 저해작용을 받는다.
| 화합물 | 농도(mM) | 상대 활성(%) |
| 저해제 무첨가 | 0 | 100 |
| 세린 효소 저해제페닐메틸설포닐플루오라이드아미노에틸벤젠설포닐플루오라이드 하이드로클로라이드키모스타틴 | 141 | 39.759.984.9 |
| SH-효소 저해제p-클로로머큐리벤조산N-에틸말레이미드요오도아세트아미드로이펩틴 | 1110.5 | 87.198.38779.6 |
| 아스파라긴 효소 저해제펩스타틴 | 1 | 165.7 |
| 메탈로프로테아제 저해제EDTA1,10-페난트롤린 | 101 | 105.292.5 |
| 아미노펩티다제 저해제벤스타틴 | 1 | 97.6 |
| 환원제디티오트레이톨 | 10 | 102.5 |
| 프롤릴엔도펩티타제 저해제Z-(S)Pro-(S)프롤리날Z-Pro-(S)프롤리날Z-Pro-프롤리날 | 111 | 111.2105.899.7 |
(3) 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자의 취득
결정한 svPEP의 N-말단 20개 아미노산 서열로부터 추정되는 염기 서열 중에서 축퇴가 적은 부위 Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-Glu-Glu-Lys를 선택하고, 서열 54에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드를 작제한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 하여, 통상적인 방법에 따라 제조한 에스. 모바라엔세 IFO13819의 염색체 DNA를 6개 염기 서열을 인식하는 각종 제한효소로 분해하여, 서던 블롯 하이브리드화에 의해 해석한 바, SacI 절단에 의해 약 6kb의 단일 밴드가 검출된다. 따라서, 전술한 방법에 의해 제조한 에스. 모바라엔세 IFO13819의 염색체 DNA를 SacI로 분해하고, 약 6kb의 단편을 EASYTRAP Ver. 2(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)를 사용하여, 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수한다. 회수 단편을 pUC18의 SacI 부위에 삽입한 다음, 에스케리키아 콜라이 JM 109(제조원: Takarashuzo Co. Ltd.)의 수용능 세포에 도입하여, 라이브러리를 작제한다. 작제한 라이브러리를 서열 54에 제시된 합성 올리고뉴클레오타이드의32P 라벨화물을 프로브로 하여, 콜로니 하이브리드화에 의해 라이브러리의 스크리닝을 수행하고, svPEP 유전자 단편이 클로닝된 플라스미드를 보유하는 균주를 스크리닝하여 목적하는 유전자를 수득한다. 이러한 균주로부터 회수한 플라스미드를 pUMP1로 명명한다.
(서열 54) 5'-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3'
<서열 프리 텍스트>
서열 54: svPEP용의 프로브
pUMP1로서 클로닝한 단편의 염기 서열을 결정한다. svPEP에 대응하는 svPEP 유전자 서열을 서열 41에 제시한다. 이러한 유전자에 암호화되는 아미노산 서열을 추정한 바, 먼저 정제 효소 단백질에서 결정한 N-말단 부분 아미노산 서열(20개 잔기)를 발견하고, 서열 40에 제시된 성숙형 svPEP의 아미노산 1차 서열을 결정한다. 또한, 서열 42에 제시된 바와 같은 svPEP의 시그널 서열 및 프로 구조로 상정되는 영역을 함유하는 전체 아미노산의 1차 서열을 결정한다.
pUMP1로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 AJ13691을 FERM BP-7160으로서,2000년 5월 15일자로 부다페스트 조약에 근거하여 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소[참조: 일본 ‡305-8566 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)에 기탁되어 있다.
(4) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 갖는 프로 구조부 부가 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자[이종 융합 프리프로프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자]의 작제
실시예 9(3)에서 결정한 svPEP의 서열을 참고로 하고, 실시예 9(3)에서 작제한 pUMP1을 주형으로 하여, 서열 55와 서열 56에 제시된 프라이머를 합성하고, svPEP의 프로 구조, 및 성숙 svPEP을 함유하는 유전자 영역을 지금까지와 동일한 방법으로 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 55) 5'-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3'
(서열 56) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'
<서열 프리 텍스트>
서열 55 및 서열 56: PCR 프라이머
다음, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여, 서열 51과 서열 57의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA 유전자의 시그널 서열을 함유하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
서열 57에 제시된 프라이머는 프로 구조부 부가 svPEP와의 융합 유전자를 작제하기 위해, svPEP의 N-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 51) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(서열 57) 5'-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 57: PCR 프라이머
다음, 각각 증폭시킨 svPEP의 프로 구조 및 성숙 svPEP을 함유하는 유전자를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 역시 증폭시킨 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열을 함유하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 51과 서열 56을 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열에 연결된 이종 융합 프리프로-svPEP 유전자 단편을 증폭시킨다.
(서열 51) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(서열 56) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 2.1kb의 증폭 단편을 검출한다. PCR 산물을 HindIII로 분해한 다음, 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 약 2.1kb의 단편을 아가로스 겔로부터 회수하여, 실시예 8(1)에 기재된 pVSS1의 HindIII 부위에 삽입함으로써, 각각 PVSSSP1을 수득한다. 통상적인 방법에 따라, 삽입 단편의 서열의 결정을 수행하여, 예상한 바와 같은 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인한다.
(5) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그널 서열을 사용하는 프롤린 특이적 펩티다제의 분비
작제한 플라스미드 pVSSSP1을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 상기 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVSSSP1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃, 70시간 동안 배양한다. 이러한 배양액 1ml를 원심분리에 의해 배양 상등액과 균체로 분리한다. 균체를 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁한다. svPEP의 활성 측정은 하기와 같이 하여 수행한다. 0.25mM의 Ala-Ala-Pro-pNA(제조원: Bachem Co. Ltd.)를 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 배양 상등액 또는 균체 현탁액 50㎕를 가하여, 총 액량 0.6ml로 30℃에서 20분 동안 반응시킨 다음, 50% 아세트산을 0.4ml 가하여 반응을 정지시킨다. 410nm의 흡광도를 측정하고, 유리된 pNA의 양을 산출함으로써, 활성을 결정한다. 또한, 효소 1단위는 1분 동안에 1μmol의 pNA를 유리시키는 효소량으로 한다. 그 결과, 배양 상등액에서는 svPEP의 활성은 검출되지 않으며, 균체 현탁액에서는 활성을 검출할 수 있다. 검출된 활성치와 실시예 9(1)에 의한 비활성치로부터 계산한 결과, 약 50mg/ℓ 상당의 svPEP가 균체 표면으로 분비 발현되고 있는 것으로 확인된다.
(6) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에서 분비 발현된 세린 프로테아제와 프롤린 특이적 펩티다제에 의한 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 절단
작제한 플라스미드 pVSSSP1을 사용하여 실시예 4(2)에 기재된 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 분비 발현 플라스미드 pPKSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVSSSP1 및 pPKSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃, 70시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 그 결과, SAMP45 및 svPEP가 정상적으로 분비 발현하며, 역시 분비되고 있는 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 프로 구조부가 절단되며, 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 거의 동일한 분자량을 갖는 트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다.
이러한 배양 상등액에 관해서 상기한 하이드록사메이트법으로 트랜스글루타미나제 활성을 확인한 바, 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
또한, SDS-PAGE 후, 상기한 방법에 따라 PVDF 막에 세미-드라이 블롯팅한다. 블롯팅한 다음, PVDF 막을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하고, 탈염, 공기 건조시킨다. 성숙 트랜스글루타미나제의 부분을 절단하여, 프로테인 시퀀서로 N-말단 아미노산 서열의 해석을 수행한다. 그 결과, 서열 5에 제시된 에스. 모바라엔세 유래의 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 동일한 Asp를 N-말단의 아미노산으로서 갖는 서열을 취하고 있는 것으로 확인된다.
실시예 10: 에스. 모바라엔세 IFO13819 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 부분 결실체 작제와 트랜스글루타미나제의 분비 생산
(1) 프로 구조부의 부분 결실형 트랜스글루타미나제 유전자의 작제
우선 프로 구조부의 C-말단측의 아미노산 잔기의 부분 결실형을 작제하기 위해, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열 8과 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 수득한 pUITG를 사용하여 성숙 트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 지금까지와 동일하게 PCR법으로 증폭시킨다.
다음, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여, 서열 14와 서열 58 또는 서열 14와 서열 59의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터를 함유하는 5'- 상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열 및 트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 함유하는 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
서열 58에 제시된 프라이머는 트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 C-말단 2개 아미노산 잔기의 서열 Ala-Pro를 결실형 서열 59에 제시된 프라이머는 C-말단 4개 아미노산 잔기의 서열 Phe-Arg-Ala-Pro를 결실한 유전자 서열을 갖고 있으며, 또한 성숙 트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해, 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 58) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC CGG AAC GAC GGG CCG GCG C-3'
(서열 59) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC GAC GGG CCG GCG CTC GAA G-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 58 및 서열 59: PCR 프라이머
각각 증폭시킨 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열 및 각각의 개질형의 프로 구조부를 함유하는 영역을 암호화하는 유전자 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 역시 증폭시킨 성숙 트랜스글루타미나제를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 14와 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 slpA의 시그널 서열 및 트랜스글루타미나제의 부분 결실형 프로 구조부에 연결된 성숙 트랜스글루타미나제 유전자 단편을 각각 증폭시킨다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 각각의 증폭 단편을 검출한다. 이들 단편을 제한효소 ScaI 및 Eco065I로 분해함으로써 생성된 약 800bp의 단편을 아가로스 겔로부터 회수하여, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1로부터의 ScaI과 Eco065I로 절단되는 단편과 교체함으로써 pPKSPTG1△AP(Ala-Pro 결실형) 및 pPKSPTG1△FRAP(Phe-Arg-Ala-Pro 결실형)를 작제한다.
다음, 프로 구조부의 N-말단측의 아미노산 잔기의 부분 결실형을 작제하기 위해, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열 60과 서열 61에 제시된 프라이머를, 서열 60과 서열 9 또는 서열 61과 서열 9의 조합으로 실시예 1(1)에서 취득한 pUITG를 사용하여 프로트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
(서열 60) 5'-AAT GGC GCG GGG GAA GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC T-3'
(서열 61) 5'-GAG ACG AAG TCC TAC GCC GAA ACC TAC CGC CTC ACG GCG G-3'
(서열 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 60 및 서열 61: PCR 프라이머
다음, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여, 서열 4와 서열 62 또는 서열 14와 서열 63의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열을 함유하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
서열 62에 제시된 프라이머는 트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 N-말단 1개 아미노산 잔기의 Asp를 결실형 또한 서열 63에 제시된 프라이머는 N-말단 6개 아미노산 잔기의 서열 Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu를 결실한 유전자 서열을 갖고 있으며, 또한 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열과의 융합 유전자를 작제하기 위해, 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열의 C-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 62) 5'-GTC TCT TCC CCC GCG CCA TTT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3'
(서열 63) 5'-TCG GCG TAG GAC TTC GTC TCT GCC GTT GCC ACA GGT GCG G-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 62 및 서열 63: PCR 프라이머
각각 증폭시킨 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열을 함유하는 영역을 암호화하는 유전자 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 역시 증폭시킨 프로 구조부의 N-말단을 부분 결실한 프로트랜스글루타미나제를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 4와 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열 및 트랜스글루타미나제의 부분 결실형 세균 프로 구조부에 연결된 성숙 트랜스글루타미나제 유전자 단편을 증폭시킨다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 각각의 증폭 단편을 검출한다. 이들 단편을 제한효소 ScaI 및 Eco065I로 분해함으로써 생성된 약 800bp의 단편을 아가로스 겔로부터 회수하여, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1로부터의 ScaI과 Eco065I로 절단되는 단편과 교체함으로써 pPKSPTG1△D(Asp 결실형) 및 pPKSPTG1△DNGAGE(Asp-Asn-Gly-Ala-Gly-Glu 결실형)를 작제한다.
(2) 프로 구조 부분 결실형 트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pPKSPTG1△AP, pPKSPTG1△FRAP, pPKSPTG1△D 또는 pPKSPTG1△DNGAGE를 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pPKSPTG1△AP, pPKSPTG1△FRAP, pPKSPTG1△D 또는 pPKSPTG1△DNGAGE를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 각각 30℃, 48시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 그 결과, 프로 구조부가 부분적으로 결실한 프로트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다. pPKSPTG1△AP, pPKSPTG1△FRAP 및 pPKSPTG1△D를 보유하는 재조합체는 각각 천연형(pPKSPTG1)과 동등한 분비성을 나타내지만, pPKSPTG1△DNGAGE를 보유하는 재조합체에 관해서는 천연형 세포(pPKSPTG1)의 것의 약 1/2의 분비량이다.
(3) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에 있어서 분비 발현된 세린 프로테아제에 의한 프로 구조 부분 결실형 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 절단
실시예 8(1)에서 작제한 플라스미드 pVSS1을 사용하여 실시예 10(2)에 기재된 프로 구조 부분 결실형 프로트랜스글루타미나제의 분비 발현 플라스미드pPKSPTG1△AP, pPKSPTG1△FRAP, pPKSPTG1△D 및 pPKSPTG1△DNGAGE를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVSS1과 pPKSPTG1△AP, pPKSPTG1△FRAP, pPKSPTG1△D 및 pPKSPTG1△DNGAGE를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃, 70시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다.
그 결과, SAMP45가 정상적으로 분비 발현하며, 역시 분비되고 있는 프로 구조 부분 결실 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부가 절단되며, 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 거의 동일한 분자량을 갖는 트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다.
또한, SDS-PAGE를 수행한 다음, 상기한 바와 동일한 방법으로 PVDF 막에 세미-드라이 블롯팅한다. 블롯팅한 다음, PVDF 막을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하고, 탈염, 공기 건조시킨다. 성숙 트랜스글루타미나제의 부분을 절단하여, 프로테인 시퀀서로 N-말단 아미노산 서열의 해석을 수행한다. 그 결과, pPKSPTG1△AP를 갖는 재조합체에서는 서열 5에 제시된 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단에 Phe-Arg가 부가된 것이, pPKSPTG1△FRAP를 갖는 재조합체에서는 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단에 Ser-Ala-Gly-Pro-Ser이 부가된 것이, pPKSPTG1△D 및 pPKSPTG1△DNGAGE를 갖는 재조합체에서는 성숙 트랜스글루타미나제에 Phe-Arg-Ala-Pro가 부가되어 있는 것으로 확인된다.
실시예 11: 에스. 모바라엔세 IFO13819 유래의 프로트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 개질체 작제와 트랜스글루타미나제의 분비 생산
(1) 프로 구조부 개질형 프로트랜스글루타미나제 유전자의 작제
실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열 8와 서열 9에 제시된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 취득한 pUITG를 사용하여 성숙 트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
다음, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여, 서열 14와 서열 64의 조합, 서열 14와 서열 65의 조합, 서열 14와 서열 66의 조합 또는 서열 14와 서열 67의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열 및 트랜스글루타미나제의 프로 구조부를 함유하는 영역을 PCR법으로 증폭시킨다.
서열 64에 제시된 프라이머는 트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 C-말단 3개 아미노산 잔기의 서열 Arg-Ala-Pro가 Gly-Pro-Lys로, 서열 65에 제시된 프라이머는 Arg-Ala-Pro가 Gly-Pro-Arg로 변환된 유전자 서열을 함유하고 있다. 또한, 서열 66에 제시된 프라이머는 프로 구조부의 C-말단 5개 아미노산 잔기의 서열 Ser-Phe-Arg-Ala-Pro가 Lys만으로, 서열 67에 제시된 프라이머는 Ser-Phe-Arg-Ala-Pro가 Arg만으로 변환된 유전자 서열을 함유하고 있다.
또한, 성숙 트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해, 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단측의 아미노산을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 64) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTG GGG CCG AAC GAC GGG C-3'
(서열 65) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGG GGG CCG AAC GAC GGG C-3'
(서열 66) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCC TTC GGG CCG GCG CTC GAA G-3'
(서열 67) 5'-GTG ACC CTG TCG TCG GAG TCG CGC GGG CCG GCG CTC GAA G-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열 64 내지 서열 67: PCR 프라이머
각각 증폭시킨 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열 및 개질형 프로 구조부를 함유하는 영역을 암호화하는 유전자 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 역시 증폭시킨 성숙 트랜스글루타미나제를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열 14와 서열 9를 사용하여 크로스오버 PCR을 수행하여, 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그널 서열 및 개질형 트랜스글루타미나제의 프로 구조부에 연결된 성숙 트랜스글루타미나제 유전자 단편을 증폭시킨다.
(서열 14) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열 9) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출한다. 이러한 단편을 제한효소 ScaI 및 Eco065I로 분해함으로써 생성된 약 800bp의 단편을 아가로스 겔로부터 회수하고, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1로부터의 ScaI과 Eco065I로 절단된 단편과 교체함으로써 pPKSPTG11(Gly-Pro-Lys 개질형) 및 pPKSPTG12(Gly-Pro-Arg 개질형), pPKSPTG13(△phe-Arg-Ala-Pro에서 Lys 삽입 개질형) 및 pPKSPTG14(△phe-Arg-Ala-Pro에서 Arg 삽입 개질형)를 작제한다.
(2) 프로 구조 개질형 트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pPKSPTG11, pPKSPTG12, pPKSPTG13 또는 pPKSPTG14를 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 형질전환시키고, 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pPKSPTG11, pPKSPTG12, pPKSPTG13 또는 pPKSPTG14를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 각각 30℃, 48시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 그 결과, 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다.
(3) 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에서 분비 발현된 세린 프로테아제에 의한 개질형 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 프로 구조부의 절단
실시예 8(1)에서 작제한 플라스미드 pVSS1을 사용하여 실시예 11(2)에 기재된 개질형 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 분비 발현 플라스미드 pPKSPTG11, pPKSPTG12, pPKSPTG13 또는 pPKSPTG14를 씨. 글루타미쿰 ATCC13869로 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택한다. 다음, 선택한 pVSS1과 pPKSPTG11, pVSS1과 pPKSPTG12, pVSS1과 pPKSPTG13 또는 pVSS1과 pPKSPTG14를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 가나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃, 70시간 동안 배양한다. 배양 종료 후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 다음, 상기한 항트랜스글루타미나제 항체를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 해석을 수행한다. 그 결과, SMP45가 정상적으로 분비 발현되며, 역시 분비되고 있는 개질형 프로 구조부 부가 트랜스글루타미나제의 개질형 프로 구조부가 절단되며, 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 거의 동일한 분자량을 갖는 트랜스글루타미나제의 분비가 확인된다.
또한, SDS-PAGE를 수행한 다음, 통상적인 방법대로 PVDF 막에 세미-드라이 블롯팅한다. 블롯팅한 다음, PVDF 막을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하고, 탈염, 공기 건조시킨다. 성숙 트랜스글루타미나제의 부분을 절단하여, 프로테인 시퀀서로 N-말단 아미노산 서열의 해석을 수행한다. 그 결과, pVSS1과 pPKSPTG11 또는 pVSS1과 pPKSPTG12를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에 관해서는 서열 5에 제시된 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 동일한 Asp를 N-말단의 아미노산으로서 갖는 서열을 취하는 것으로 확인된다. 한편, pVSS1과 pPKSPTG13 또는 pVSS1과 pPKSPTG14를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13869에 관해서는 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제에 Ser-Ala-Gly-Pro-Lys(서열 69) 또는 Ser-Ala-Gly-Pro-Arg(서열 70)을 부가한 것이다.
전자의 천연형 성숙 트랜스글루타미나제와 동일한 아미노산 서열을 갖는 배양 상등액에 관해서 하이드록사메이트법으로 트랜스글루타미나제 활성을 확인한 바, 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
<서열목록 프리 텍스트>
서열 69 및 서열 70: 천연의 트랜스글루타미나제에 부가된 서열
본 발명에 따라 코리네박테리움 속 세균에서 유용 단백질, 특히 트랜스글루타미나제를 다량으로 생산하여, 또한 효율적으로 균체외로 분비시킬 수 있다. 본 발명에 따라 생산되는 단백질은 배지 중에 방출되므로, 공지된 적절한 방법에 따라 간편하면서 또한 대규모로 배지로부터 직접 회수할 수 있다.
Claims (30)
- 코리네형 세균내에서 기능하는 프로모터 서열의 하류에 코리네형 세균 유래의 시그널 펩타이드 영역을 암호화하는 핵산 서열이 연결되며, 상기 시그널 펩타이드 영역을 암호화하는 핵산 서열의 하류에 프로 구조부를 함유하는 이종의 분비형 세균 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 연결된 발현 유전자 작제물을 갖는 코리네형 세균을 배양하는 단계,상기 이종의 분비형 단백질을 코리네형 세균에서 생산 및 분비시키는 단계 및이종의 분비형 단백질로부터 프로 구조부를 절단 및 제거하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 이종의 분비형 단백질의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 이종의 분비형 단백질이 트랜스글루타미나제인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 시그널 펩타이드가 코리네형 세균 유래의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 시그널 펩타이드가 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드인 방법.
- 제4항에 있어서, 시그널 펩타이드가 서열 1 또는 서열 29에 제시된 아미노산 서열을 갖는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 시그널 펩타이드가 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 유래의 세포 표층 단백질의 시그널 펩타이드인 방법.
- 제6항에 있어서, 시그널 펩타이드가 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 프로 구조부가 방선균 유래의 트랜스글루타미나제의 프로 구조부에 상당하는 방법.
- 제8항에 있어서, 프로 구조부가 서열 3 또는 서열 4에 제시된 서열을 갖는 방법.
- 제8항에 있어서, 프로 구조부가 서열 3 또는 서열 4에 제시된 아미노산 서열에 1종 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가, 또는 이들의 조합을 함유하는 방법.
- 제10항에 있어서, 프로 구조부의 아미노산 서열이 서열 30 내지 서열 38에 제시된 아미노산 서열 중의 어느 하나인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로 구조부의 절단 및 제거가 프로테아제에 의해 수행되는 방법.
- 제12항에 있어서, 이종의 분비형 단백질을 생산 및 분비하는 코리네형 세균이 프로테아제를 추가로 생산함을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 프로 구조부의 절단 및 제거가 프로테아제 및 펩티다제에 의해 수행되는 방법.
- 제14항에 있어서, 이종의 분비형 단백질을 생산 및 분비하는 코리네형 세균이 프로테아제 및 펩티다제를 추가로 생산함을 특징으로 하는 방법.
- 제12항 또는 제14항에 있어서, 프로테아제가 방선균 유래인 방법.
- 제12항 또는 제14항에 있어서, 프로테아제가 스트렙토마이세스 알보그리세올루스(Streptomyces albogriseolus) 유래인 방법.
- 제14항에 있어서, 펩티다제가 방선균 유래인 방법.
- 제14항에 있어서, 펩티다제가 스트렙토버티실리움 모바라엔세(Streptoverticillium mobaraense) 유래인 방법.
- 제2항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 방선균 유래 트랜스글루타미나제인 방법.
- 제20항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 스트렙토버티실리움 모바라엔세 유래 트랜스글루타미나제인 방법.
- 제21항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 방법.
- 제20항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 스트렙토버티실리움 신나모네움(Streptoverticillium cinnamoneum) 유래 트랜스글루타미나제인 방법.
- 제23항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 서열 43의 아미노산 서열을 갖는 방법.
- 코리네형 세균 유래의 시그널 펩타이드의 하류에 성숙형 트랜스글루타미나제가 연결된 융합 단백질을 코리네형 세균에서 생산 및 분비시킴을 특징으로 하는, 성숙형 트랜스글루타미나제를 분비 생산하는 방법.
- (1) 프롤린 함유 펩타이드인 Ala-Ala-Pro-pNA, Ala-Phe-Pro-pNA 및 Phe-Arg-Ala-Pro-pNA(여기서, pNA는 p-니트로아닐라이드이다) 중의 하나 이상에 대하여 작용하며, 프롤린의 카복실측에서 상기한 펩타이드를 절단하는 특성,(2) 최적 pH가 6.0 내지 6.5인 특성,(3) pH 4 내지 9에서 안정적인 특성,(4) 최적 온도가 25 내지 30℃인 특성,(5) 20℃ 이하에서 안정적인 특성,(6) 페닐메틸설포닐플루오라이드 및 아미노에틸벤젠설포닐플루오라이드 하이드로클로라이드에 의해 활성이 저해되는 특성,(7) 등전점이 10.2인 특성 및(8) 분자량이 약 50,000인 특성을 갖는 프롤린 특이적 펩티다제.
- 제26항에 있어서, 방선균 유래인 프롤린 특이적 펩티다제.
- 서열 40에 제시된 아미노산 서열을 함유하는, 제26항에 따른 프롤린 특이적펩티다제 활성을 갖는 폴리펩타이드.
- 서열 40에 제시된 아미노산 서열에 1종 이상의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가, 또는 이들의 조합을 함유하는, 제26항에 따른 프롤린 특이적 펩티다제 활성을 갖는 폴리펩타이드.
- 제28항 또는 제29항에 따르는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
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