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KR102736053B1 - 인간에서의 ａａｖ 유전자 요법을 위한 수단 및 방법 - Google Patents

인간에서의 ａａｖ 유전자 요법을 위한 수단 및 방법 Download PDF

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KR102736053B1
KR102736053B1 KR1020207002329A KR20207002329A KR102736053B1 KR 102736053 B1 KR102736053 B1 KR 102736053B1 KR 1020207002329 A KR1020207002329 A KR 1020207002329A KR 20207002329 A KR20207002329 A KR 20207002329A KR 102736053 B1 KR102736053 B1 KR 102736053B1
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바트 안토니우스 니즈메이제르
발레리 페레이라
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유니큐어 아이피 비.브이.
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Abstract

본 발명은 인간에서의 AAV 기반 유전자 요법을 위한 수단 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 치료에서 사용하기 위한 것으로 의도되는 AAV에 대한 항체를 갖는 것으로 의심될 수 있는 인간 환자의 치료에 관한 것이다.

Description

인간에서의 ＡＡＶ 유전자 요법을 위한 수단 및 방법
발명의 기술 분야
본 발명은 인간에서의 AAV 기반 유전자 요법을 위한 수단 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 치료에서 사용하기 위한 것으로 의도되는 AAV에 대한 항체를 갖는 것으로 의심될 수 있는 인간 환자의 치료에 관한 것이다.
발명의 배경
아데노 연관 바이러스 (AAV)는 인간 유전자 요법용으로서 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나로서 간주될 수 있다. AAV는 비분열 인간 세포 뿐만 아니라, 분열 인간 세포도 효율적으로 감염시킬 수 있는 능력을 갖는다. 야생형 AAV 바이러스 게놈은 숙주 세포의 게놈 내의 단일 염색체 부위 내로 통합되며, 가장 중요하게는, 비록 AAV가 많은 인간에 존재하기는 하지만, 이는 어떠한 질환과도 연관이 없었다. 이러한 이점의 견지에서, 재조합 아데노 연관 바이러스 (rAAV)는 B형 혈우병, 악성 흑색종, 낭성 섬유증, 및 기타 질환을 위한 유전자 요법 임상 시험에서 평가되고 있다. 유럽에서의 예컨대, 알리포젠 티파보벡(Alipogene tiparvovec) (글리베라(Glybera)®, 유니큐어(uniQure))과 같은, 유전자 요법용 의약에 대한 다수의 임상 시험과 승인은 AAV가 임상 수행의 중심이 될 수 있는 가능성을 가지고 있다.
AAV 벡터의 성공적인 투여를 위한 한 주요 도전과제는 야생형 AAV 또는 AAV 기반 벡터에의 노출 후 발생하는 중화 항체 (면역글로불린) (NAb)의 존재를 극복하는 것이다. 상기 두 사례 모두에서, 바이러스 캡시드 단백질에 대한 중화 혈청형-특이적 항체가 동일한 혈청형의 AAV를 이용한 유전자 전달의 효율을 감소시킬 수 있다.
인간에서는 다른 혈청형과 비교하였을 때 AAV5 혈청형에 대하여 비교적 더 낮은 유행성 NAB 역가가 관찰되었다 (문헌 [Boutin et al. Hum Gene Ther 2010, 21:704-712]). AAV를 이용한 인간 치료에서, 상기와 같은 낮은 유행성 NAB 역가는 형질도입에 영향을 미치고, 트랜스진(transgene) 발현을 크게 감소시킨다고 이미 보고된 바 있다 (문헌 [Manno et al., Nature Medicine, 2006, 12(3), 342-347]). 이에, 본 분야에서의 전반적인 합의 내용은 전체적으로 NAB 역가(titer)를 갖는 환자를 치료하는 것은 피하는 것이다. 따라서, 기존 면역과 관련하여 임상 진료소에서 실행되는 현 관행은 AAV 캡시드에 대한 중화 항체를 갖고 있는 환자를 배제시켜야 하는 것에 관하여 인간 환자를 스크리닝하는 것을 포함한다 (문헌 [Brimble et al. Expert Opin Biol Ther 2016, 16(1):79-92] 및 [Boutin et al. Hum Gene Ther 2010, 21:704-712]). 2차 투여를 허용하기 위해 1차 투여시 NAb 형성을 감소시키기 위하여 면역억제 요법을 시도하였다 (문헌 [Corti et al., Mol Ther - Meth Clin Dev (2014) 1, 14033]; [Mingozzi et al. Mol Ther vol. 20 no. 7, 1410-1416]; [McIntosh et al. Gene Ther 2012, 19, 78-85]). 추가로, 기존 항체를 극복하기 위해 혈장 교환 및 면역억제 요법 사용을 포함하는 전략이 제안되어 왔다 (예컨대, [Chicoine et al., Mol Ther 2014, vol. 22 no.2 338-347]; [Hurlbut et al. Mol Ther 2010, vol. 18 no. 11 1983-1984] 및 [Mingozzi et al. Mol Ther vol. 20 no. 7, 1410-1416]). 이들 전략은 동물 모델에서 시험되어 왔으며, 제한적인 성공을 거두었다.
이에, 당업계에서는 AAV 중화 항체를 갖고 있거나, 또는 가질 것으로 의심될 수 있는 인간 환자에서 rAAV 유전자 요법 벡터의 투여를 가능하게 하는 것이 요구되고 있다.
발명의 간단한 설명
이제, 본 발명자들은 놀랍게도 특히, AAV5 유전자 요법 벡터의 경우, 및 현 시점에서의 기술 수준에서 제안된 내용과는 대조적으로, 유행성 기존 항-AAV5 항체 (즉, 유행성 노출로부터 생성된 기존 항-AAV5 항체)를 갖는 인간 환자가 치료의 자격이 있는 것으로 간주될 수 있음을 발견하게 되었다. 이는 중화 항체의 존재는 배제 기준, 예컨대, 임상 시험에 참여할 수 있는 환자에 대한 배제 기준으로서 간주되어야 하는 선행 기술에서의 생각과는 대조를 이룬다. 다시 말해, 현 시점에서의 기술 수준에서의 생각은 AAV5에 대한 항체, 더욱 특히, AAV5에 대한 유행성 기존 항체를 갖고 있는 환자는 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주되지 않는다. 유행성 기존 항-AAV5 항체를 갖고 있는 인간 환자는 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주될 수 있다는 본원에 개시된 놀라운 관찰결과는 예컨대, 매우 낮은 수준의 기존 항-AAV5 항체를 갖는 것과 관찰된 인간 환자의 하위집단에 관한 것일 뿐만 아니라, 본질적으로는, 기존 항-AAV5 항체에 대해 양의 값의 점수를 받고, 이전에 어떤 AAV5 유전자 요법도 받지 않은 인간 집단 중 모두는 아니지만, 대부분의 환자에 관한 것임을 발견하게 되었다.
이에, 한 측면에서, 본 발명은 인간 환자의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 상기 인간 환자는 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받지 않고, 여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없는 것인, AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다. 다시 말해, 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 여기서, 항-AAV5 항체 상태는 알려져 있지 않고, 여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없는 것인, AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다. 한 측면에 따라, 본 발명은 항-AAV5 항체의 존재에 대해 스크리닝하면서, 의학적 치료 전에, 그를 수행하지 않고, 그 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터로 치료받은 적인 없는 환자를 치료할 수 있거나, 또는 그러한 환자를 임상 시험에 포함시킬 수 있게 할 수 있다.
추가 측면에서, 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받고, 여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없고, 상기 인간은 인간 집단에서 관찰되는 것과 같은 최대 100번째 백분위수, 바람직하게, 최대 95번째 백분위수의 항-AAV5 항체 수준에 상응하는 항-AAV5 항체 수준을 갖는 것인 AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다. 바람직하게, 상기 인간 환자는 항-AAV5 항체에 대하여 양성으로 시험된 환자이다.
도면 설명
도 1: 전처리 샘플의 NAb 검정법 결과. a: 10개의 사전 투약 샘플의 중화 결과. 50% 마크(fifty-percent mark)는 점선으로 표시되어 있다. b: 3개의 양성 샘플 3, 4, 5의 곡선 피팅 결과. 비선형 회귀에 의해 4-파라미터 곡선을 피팅하였다. 피팅된 곡선이 (가로축 위에 표시된) 50% 마크를 통과하는 지점에서의 이론상의 희석률로서 역가를 계산하였다.
도 2a: AAV5-중화 항체 대 전체 항-AAV5 항체. 집단 스크리닝 연구에서 보고된 바와 같은 중화 (NAb) 역가 대 전체 (TAb) ELISA 결과. 각각의 오픈형 기호는 한 건강한 개체의 쌍별 NAb 및 TAb 결과를 나타낸다. 처리된 환자의 NAb 및 TAb 결과는 중첩 상태로 표시되어 있다 (▲, 명시된 바와 같이, 연구 대상체 3, 4 및 5).
도 2b: AAV5 NAb 역가 대 FIX 수준. 투약 후 코호트(cohort) 1에서의 FIX 활성의 비율(%)이 투약 전 NAb 역가 대비로 플롯팅되어 있다.
도 3: AAV NAb 역가 스케일. 인간 집단 (50명의 대상체)의 백분위수가 AAV5에 대한 NAb 역가에 대하여 도시되어 있다. 인간 집단에서 관찰된 NAb 역가는 AAV5로 처리된 인간 환자에서 관찰된 NAb 역가 범위를 훨씬 벗어난다는 것에 주의한다.
도 4. 야생형 AAV5의 VP1 아미노산 서열이 도시되어 있다. VP2의 아미노산 출발 위치 (T, ACG 개시 부위에 기인하여), 및 VP3의 아미노산 출발 위치 (M)는 밑줄체로 표시되어 있다.
도 5. AAV5 유래 VP2 및 VP3 코딩 서열과 연결된 N-말단 AAV2 유래 VP1 서열 (밑줄체로 표시)로 구성된 하이브리드 VP1 서열의 VP1 아미노산 서열이 도시되어 있다. 따라서, VP1 단백질은 하이브리드 AAV2/AAV5 캡시드 단백질이다. 상기 하이브리드 VP1을 코딩하는, AAV 캡시드에 사용되는 발현 작제물(construct)은 VP2 및 VP3 서열도 코딩할 수 있으며, 이는 하이브리드 VP2 및 VP3 캡시드 단백질이 아니라, 야생형 서열 AAV5 VP2 및 VP3 단백질이 될 것이다.
도 6. 야생형 AAV5 서열의 1번 및 2번 위치 사이에 Ala가 삽입되어 있는, 야생형 AAV5의 VP1 아미노산 서열이 제시되어 있다. 이에, VP1 캡시드는 아미노산이 삽입된 AAV5 야생형 서열로 구성되고, 코딩된 VP2 및 VP3 단백질은 변형되지 않은 야생형 AAV5 VP2 및 VP3 단백질이다.
정의
"AAV 벡터"란, 분자 방법을 이용함으로써 야생형 재조합 아데노 연관 바이러스 (AAV)로부터 유래된, 재조합 AAV를 지칭한다. AAV 벡터는 야생형 (wt) AAV 벡터와는 구별되는데, 그 이유는 바이러스 게놈의 적어도 일부가, 야생형 AAV 핵산 서열과 비교하여 비-천연 핵산인 것인 트랜스진으로 대체되어 있는 것이기 때문이다.
AAV 캡시드 및 AAV 게놈 ITR의 조합을 포함하는 AAV 벡터는 문헌 [Pan et al. (J. of Virology (1999) 73: 3410-3417)], [Clark et al. (Human Gene Therapy (1999) 10: 1031-1039)], [Wang et al. (Methods Mol. Biol. (2011) 807: 361-404)], 및 [Grimm (Methods (2002) 28(2): 146-157) (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, AAV 벡터는 배큘로바이러스 발현 시스템 (BEVS)을 사용하여 곤충 세포에서 제조될 수 있다. rAAV 제조를 위한 최초의 배큘로바이러스 시스템은 우라베(Urabe) 등에 의해 기술되었고 (문헌 [Urabe et al. [2002] Human Gene Therapy 13(16):1935-1943]), 이는 3개의 배큘로바이러스, 즉, Bac-Rep, Bac-cap 및 Bac-vec로 구성되며, 그가 곤충 세포, 예컨대, SF9로 공동 감염됨으로써 rAAV가 생성되었다. 상기 제조된 rAAV의 특성, 즉, 효능을 비롯한, 물리적 및 분자적 특징은 포유동물 세포에서 생성된 rAAV와 크게 다르지 않았다 (문헌 [Urabe [2002] 상기 문헌 동일]). 우라베 (문헌 [2002, 상기 문헌 동일])에 의한 최초의 배큘로바이러스 시스템은 추가로 개발되었다 (예컨대, 문헌 [Kohlbrenner et al. (2005) Molecular Therapy 12 (6):1217-1225]; [Urabe et al. (2006) Journal of Virology 80(4):1874-1885]; WO 2007/046703; WO 2007/148971; WO 2009/014445 및 WO 2009/104964 참조).
"트랜스진"이라는 용어는 AAV 핵산 서열과 관련하여 비-천연 핵산을 지칭하는 데 사용된다. 세포 또는 유기체 내로 도입될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 데 사용된다. 트랜스진은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자, 억제성 폴리뉴클레오티드로 전사되는 폴리뉴클레오티드, 또는 전사되지 않는 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 발현 제어 요소, 예컨대, 전사를 구동시키는 프로모터가 없는 것)를 포함한다. 트랜스진은 바람직하게, 역위 말단 반복부 (ITR) 서열 사이에 삽입된다. 트랜스진은 또한 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 발현 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 또는 전사 조절 서열, 및 3' 종결 서열을 포함하는 발현 작제물일 수 있다.
"형질도입"이란, 바이러스 벡터에 의한 트랜스진의 수용자 숙주 세포 내로의 전달을 지칭한다. 본 발명의 rAAV 벡터에 의해 표적 세포의 형질도입이 이루어지면, 상기 벡터에 함유되어 있던 트랜스진이 형질도입된 세포로 전달된다. "숙주 세포" 또는 "표적 세포"란, 그 안으로 DNA 전달이 이루어지는 세포, 예컨대, 예를 들어, 개체의 활막세포 또는 윤활막 세포를 지칭한다. AAV 벡터는 분열 세포 및 비분열 세포, 둘 모두를 형질도입시킬 수 있다.
"유전자" 또는 "코딩 서열"이란, 특정 단백질을 "코딩하는" DNA 또는 RNA 영역을 지칭한다. 코딩 서열은 적절한 조절 영역, 예컨대, 프로모터의 제어하에 배치되었을 때, 전사되고 (DNA), 폴리펩티드로 번역된다 (RNA). 유전자는 수개의 작동가능하게 연결된 단편, 예컨대, 프로모터, 5' 리더 서열, 인트론, 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 부위 또는 신호 서열을 포함하는 3' 비번역 서열을 포함할 수 있다. 키메라 또는 재조합 유전자는 보통 자연상에서는 발견되지 않는 유전자, 예컨대, 예를 들어, 프로모터가 자연상에서는 전사된 DNA 영역의 일부 또는 그 모두와 회합되어 있지 않은 유전자이다. "유전자의 발현"이란, 유전자가 RNA로 전사되고/거나, 활성 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 두 서열의 길이에 따라, 전역 또는 국소 정렬 알고리즘을 사용하여 두 펩티드 또는 두 뉴클레오티드 서열을 정렬함으로써 측정될 수 있다. 길이가 유사한 서열은 바람직하게, 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는, 전역 정렬 알고리즘 (예컨대, 니들만 운치(Needleman Wunsch))을 사용하여 정렬되는 반면, 길이가 실질적으로 상이한 서열은 바람직하게, 국소 정렬 알고리즘 (예컨대, 스미스 워터만(Smith Waterman))을 사용하여 정렬된다. 이어서, (예를 들어, 디폴트 파라미터를 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되었을 때) 서열이 적어도 특정의 최소 비율의 서열 동일성 (하기에서 정의되는 바와 같은 동일성(%))을 공유할 때, 서열은 "실질적으로 동일" 또는 "본질적으로 유사"한 것으로 지칭될 수 있다. GAP는 매치 개수는 최대화하고, 갭 개수는 최소화하면서, 두 서열을 그의 전체 길이 (전장)에 걸쳐 정렬하기 위해 니들만 및 운치 전역 정렬 알고리즘을 이용한다. 전역 정렬은 두 서열의 길이가 유사할 때 서열 동일성을 측정하는 데 적합하게 사용된다. 일반적으로, 갭 생성 패널티 = 50 (뉴클레오티드)/8 (단백질) 및 갭 연장 패널티 = 3 (뉴클레오티드)/2 (단백질)인 GAP 디폴트 파라미터(default parameter)가 사용된다. 뉴클레오티드의 경우, 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 nwsgapdna이고, 단백질의 경우, 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62 이다 (문헌 [Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919]). 퍼센트(%)서열 동일성에 대한 서열 정렬 및 스코어는 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 엑설리스 인크.(Accelrys Inc.: 미국 캘리포니아주 92121-3752 샌디에고 스크란톤 로드 9685 소재)로부터 이용가능한 GCG 위스콘신 패키지, 버전 10.3(GCG Wisconsin Package, Version 10.3), 또는 EmbossWIN 버전 2.10.0의 오픈 소스 소프트웨어, 예컨대, 프로그램, "니들" (전역 니들만 운치 알고리즘 사용), 또는 "워터" (국소 스미스 워터만 알고리즘 사용)를 이용하거나, 상기 GAP에 관한 동일한 파라미터를 이용하거나, 또는 디폴트 세팅 ('니들' 및 '워터' 둘 모두, 및 단백질 및 DNA 정렬 둘 모두, 디폴트 갭 오프닝 패널티는 10.0이고, 디폴트 갭 연장 패널티는 0.5이고; 디폴트 스코어링 매트릭스는 단백질의 경우, Blossum62이고, DNA의 경우 DNAFull이다)을 이용하여 측정될 수 있다. 서열의 전체 길이가 실질적으로 상이할 때, 국소 정렬, 예컨대, 스미스 워터만 알고리즘을 사용하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 유사성(%) 또는 동일성(%)은 알고리즘, 예컨대, FASTA, BLAST를 이용하여 공용 데이터베이스에 대해 검색함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "유전자 요법"은 핵산 서열 (예컨대, 본원에 정의된 바와 같은 트랜스진)을 질환을 치료하고자 하는 개체의 세포 및/또는 조직 내로 삽입하는 것이다. 트랜스진은 결함성인 것을 대체하거나, 또는 보충하는 기능성 돌연변이체 대립유전자일 수 있다. 유전자 요법은 또한 사실상 억제성인, 즉, 내인성 유전자 또는 단백질, 예컨대, 바람직하지 않은 또는 비정상적인 (예컨대, 병원성인) 유전자 또는 단백질의 발현, 활성, 또는 기능을 억제, 저하, 또는 감소시키는 트랜스진을 삽입하는 것을 포함한다. 상기 트랜스진은 외인성일 수 있다. 외인성 분자 또는 서열은 보통 치료하고자 하는 세포, 조직 및/또는 개체에는 존재하지 않는 분자 또는 서열인 것으로 이해된다. 후천성 및 선천성 질환, 둘 모두 유전자 요법에 의해 치료될 수 있다. 따라서, AAV5 유전자 요법 벡터는 유전자 요법에서 사용하기 위한 AAV5 벡터를 지칭한다.
본 명세서에서 및 그의 청구범위에서, "포함하다"라는 동사 및 그의 동사 활용형은 상기 단어에 후속하는 아이템들이 포함되나, 특별히 언급되지 않은 아이템들이 배제되지 않음을 의미하는 것으로 비제한적 관점으로 사용된다.
추가로, "하나"("a" 또는 "an")라는 부정관사에 의한 요소에 대한 언급은 문맥상 명백하게 하나 및 단 하나의 요소가 존재함이 요구되지 않는 한, 하나 이상의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, "하나"("a" 또는 "an")라는 부정관사는 보통 "적어도 하나"를 의미한다.
수치 값과 관련하여 사용될 때, "대략" 또는 "약"이라는 단어 (대략 10, 약 10)는 바람직하게, 상기 값은 그 주어진 값 10 ± 상기 값의 10%일 수 있다는 것을 의미한다.
발명의 상세한 설명
언급한 바와 같이, 놀랍게도, 특히, AAV5 유전자 요법 벡터의 경우, 유행성 기존 항-AAV5 항체를 갖는 인간 환자가 치료의 자격이 있는 것으로 간주될 수 있음을 발견하게 되었다. 이는 특정 혈청형에 대한 기존 항-AAV 항체의 존재는 상기 혈청형을 이용하는 유전자 요법 치료를 방해한다는 일반적인 믿음과는 대조를 이룬다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, AAV5는, 인간 집단에서 발견되는 것과 같은 그에 대한 유행성 기존 항-AAV5 항체 역가가 다른 혈청형과 비교하여 상대적으로 낮은 혈청형일 수 있다. 이는 혈청형마다 다를 수 있고/거나, 헬퍼 바이러스와의 공동 감염이 함께 이루어지거나, 또는 그의 부재하에서 이루어질 수 있는 감염 경로 때문일 수 있다. 추가로, AAV5는 다른 영장류 AAV 혈청형으로부터 가장 분기된 것이고, 그로부터 계통 발생적으로 분리된 것이며, 이 또한 그의 원인이 될 수 있다. 본 발명의 근저를 이루는 것이 무엇인지와는 상관없이, 모두는 아니지만, 대부분의 인간 집단이 AAV5 혈청형 기반 유전자 요법 등을 이용하는 치료에 대하여 자격을 가질 수 있게 한다. 이는 항-AAV5 항체와 관련하여 음성인 인간 집단의 서브세트, 및 또한 항-AAV5 항체와 관련하여 양성이었던 것으로 관찰된 인간 집단의 서브세트를 포함하며, AAV5 유전자 요법 치료 등을 받았던 (현재의) 극소수의 인간 집단의 서브세트는 포함하지 않는다. AAV5 유전자 요법 치료를 받았던 인간 집단에서, 상기와 같인 높은 역가의 항-AAV5 항체가 관찰되는데 (유행성으로 AAV5 감염된 인간과 비교하여 약 104 이상), 이는 AAV5 유전자 요법 벡터 등을 이용하는 치료에 대해여 자격이 없는 것으로 간주된다.
이에, 본 발명의 제1 측면에서, 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받지 않고, 여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없는 것인, AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다.
AAV5 및 다른 AAV 혈청형의 완전한 게놈은 서열 분석되어 있고 (문헌 [Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No.2, p1309-1319]), 뉴클레오티드 서열은 진뱅크(GenBank) (수탁 번호 AF085716; 2015년 2월 23일)에서 이용가능하다. 야생형 AAV5 기반 유전자 요법 벡터는 상기 아미노산 서열 서열에 상응하거나, 또는 적어도 실질적으로 동일한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 적어도 AAV5 캡시드 단백질을 포함하는 것으로 이해된다. 그와 실질적으로 동일하다는 것은 그와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 포함한다. 서열 동일성의 측정 기준이 될 수 있는 AAV5 캡시드 VP1 단백질 서열은 도 4에 제시되어 있다. 상기 서열은 AAV5 클레이드에서의 계통 발생적 관점으로부터 볼 때 AAV 바이러스의 자연적으로 발생된 서열일 수 있다 (예컨대, 도 4에 도시).
"혈청형"이란, 전통적으로 또 다른 바이러스와 비교하여 한 바이러스에 대한 항체 사이의 교차 반응성이 없는 것에 기초하여 정의된다. 상기 교차 반응성의 차이는 보통 캡시드 단백질 서열/항원성 결정기에 기인한다 (예컨대, AAV 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열 차이에 기인한다). 전통적 정의하에, 혈청형은 관심의 대상이 되는 바이러스를 존재하는 모든 것에 대해 특이적인 혈청에 대해 시험하고, 중화 활성에 대해 혈청형을 특징화하고, 관심의 대상이 되는 바이러스를 중화시키는 항체는 발견되지 않는 것을 의미한다. 더 많은 자연적으로 발생된 바이러스 단리물이 발견되고, 캡시드 돌연변이체 생성됨에 따라, 현재 존재하는 혈청형 중 어느 것과의 혈청학적 차이가 존재할 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수도 있다. 편의상, AAV5 혈청형은, 또한 AAV5 혈청형의 서브군 또는 변이체를 구성할 수도 있는 상이한 혈청형으로 특징화되지 않는 캡시드 서열 변형을 갖는 AAV를 포함한다. 상기 변이체는 일반적으로 실질적인 서열 동일성을 갖는 것이다.
비-천연 캡시드 서열 또한 본 발명에 따라 고려될 수 있으며, 예컨대, (외부에서 노출된) 혈청에 노출된 아미노산 서열은 한 혈청형으로부터 유래될 수 있는 반면, 캡시드 내의 비-노출된 아미노산 서열은 다른 혈청형으로부터의 것일 수 있고/거나, 더 많은 변이를 허용할 수 있다. AAV5의 결정 구조가 알려져 있는 바 (예컨대, 문헌 [Govindasamy et al. J. Virol. Oct. 2013, vol. 87 no. 20; 11187-11199]), 노출되지 않고, 예컨대, AAV5 캡시드 내부에 있는 서열은 다른 혈청형으로부터의 서열로 교환될 수 있고/거나, 더 많은 서열 변이를 허용할 수 있다. 예를 들어, VP2 및 VP3에는 함유되어 있지 않은 VP1 아미노산 서열은 내부에 위치해 있다. 상기 서열은 예컨대, 혈청형 2로부터의 것일 수 있는 반면, VP2 및 VP3 아미노산 서열은 전적으로 AAV5에 기초하는 것일 수 있다 (예컨대, 도 5 참조). 상기 AAV5 유전자 요법 벡터 캡시드는 혈청형 측면에서 및 중화 항체 측면에서 완전한 야생형 캡시드와 구별하기 어렵다 (그 중에서도 특히, WO2000028004 및 문헌 [Urabe et al. J Virol, Feb. 2006, Vol. 80, No. 4 p. 1874-1885] 참조). 상기 비자연적 캡시드 서열은 하이브리드 서열이고, 상기 하이브리드 벡터 또한 본 발명에 따른 AAV5 유전자 요법 벡터인 것으로 이해된다. 추가로, AAV5 캡시드 서열 또한 예컨대, WO2015137802에 기술된 바와 같이, 예컨대, 도 6에 제시된 바와 같이, 벡터의 제조 및/또는 효능을 증진시키기 위해 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 상기와 같이 소량 변형된 AAV5 캡시드 또한 AAV5 혈청형인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명에 따른 AAV5 벡터, 또는 AAV5 유전자 요법 벡터는, AAV5 ITR일 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없는, AAV 역위 반복부 사이에 포함되어 있는 관심의 대상이 되는 유전자를 갖는 벡터 게놈을 포함하는 AAV5 벡터 캡시드에 관한 것으로 이해된다. 이에, 본 발명에 따른 AAV5 벡터는 그의 페이로드(payload), 인간에게 유익한 트랜스진과 같은 트랜스진을 갖는 벡터 게놈을 그의 표적 세포, 예컨대, 간 세포, 또는 심장 근육 세포로 전달하는 전달 비히클이다. 이에, AAV5 벡터는 인간, 예컨대, 트랜스진의 전달에 기인하여 호전될 수 있는 질환을 앓는 인간 환자의 의학적 치료에서 유용한 것으로 간주될 수 있다. 본 실시예에 제시된 바와 같이, 트랜스진은 FIX, 또는 그의 변이체, 예컨대, 파두아(Padua) 돌연변이체일 수 있지만, 트랜스진은 어느 방식으로든 제한되지 않으며, 추가의 트랜스진이 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에서 고려될 수 있다. 또한, 한 추가의 실시양태에서, 인간 환자는 남성 인간 환자일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 여기서, 항-AAV5 항체 상태는 알려져 있지 않고 (예컨대, 측정된 바 없고), 여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없는 것인, AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다. 언급한 바와 같이, 상기 환자에서는 AAV5에 대한 항체의 존재에 대하여 시험할 필요가 없을 수도 있다. 본 실시예 단락에서 제시된 바와 같이, 인간 집단 중 약 30%는 혈청 중 TAb 또는 NAb의 존재와 관련하여 양성인 것으로 나타난다. 혈청 중 TAb 또는 NAb에 대하여 시험할 필요가 없을 수도 있기 때문에, 치료에 대하여 자격이 있는 집단 크기는 상당부 증가하고, 또한, 치료를 개시하기 이전에 NAb 또는 TAb 검정법을 수행해야 할 필요가 없기 때문에, 자격이 있는 환자의 치료 및 선택은 더욱 편리해진다. 필요할 수도 있는 것은 모두 인간 환자가 이전에 AAV5 유전자 요법을 받은 적이 있는지 여부를 아는 것이다. AAV 유전자 요법 치료를 이용하는 선행 치료가 단지 AAV5로만 제한되지 않고, 다른 혈청형도, 예컨대, 혈청형 8도 이용하는 치료를 포함할 수 있다는 것도 고려될 수 있다. 상기 대상체의 경우, 혈청 중 NAb 또는 TAb 역가가 나이브 비처리 인간 환자에서 관찰되는 것과 같은 범위 내로 유지되도록 하기 위해, 본 실시예 단락에서 기술된 바와 같이 NAb 또는 TAb 검정법 또는 시험을 수행하는 것을 포함하는 것도 고려될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받지 않고, 여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없고, 상기 인간은 인간 집단에서 관찰되는 것과 같은 최대 95번째 백분위수의 항-AAV5 항체 수준에 상응하는 항-AAV5 항체 수준을 갖는 것인 AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다. 본 실시양태에서, 유전자 요법 치료가 도움이 될 수 있는 인간 환자는 항-AAV5 항체 검정법을 이용하여 사전 스크리닝된다. 본 실시예 단락에 제시된 바와 같이, 인간 집단에서 관찰되는 항-AAV5 항체 수준의 범위, 즉, 관찰되는 항-AAV5 항체 수준의 범위는 약 0, 또는 약 1 내지 약 10,000이다.
본원에서 n번째 백분위수는 전형적으로 예컨대, 본 실시예에 기술된 바와 같이 NAb 검정법 또는 TAb 검정법을 사용하여 측정된 항-AAV5 항체 갖는, 0% 내지 n% 분포의 범위 내에 있는 인간 집단의 비율, n%로 정의된다. 예를 들어, (전에 AAV5 벡터를 이용하는 치료를 받지 않은) 집단 중 인간 환자가 본 실시예에 기술된 바와 같이 NAb 검정법을 사용하여 측정된 바, 항-AAV5 항체 수준을 가질 경우, 이는 인간 집단의 최대 약 100%가 포함될 것으로 추정할 때, 전체 집단에서 검출되는 항-AAV5 항체는 최대 10,000이 된다. 본 실시예에 기술된 바와 같은 검정법을 사용하여 측정된 바, NAb 수준이 최대 4,500인 것에 상응하는, 최대 95번째 백분위수인 항-AAV5 항체 수준을 가질 때, 인간 환자를 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 본 실시예에 기술된 바와 같은 검정법을 사용하여 측정된 바, NAb 수준이 각각 최대 3,000 또는 1,000 (도 3 참조)인 것에 상응하는, 최대 93번째 백분위수 또는 90번째 백분위수인 항-AAV5 항체 수준을 가질 때, 인간 환자를 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 실시양태에 따라, 최대 99번째, 98번째, 97번째, 96번째, 95번째, 94번째, 93번째, 92번째, 91번째, 90번째, 80번째, 또는 70번째 백분위수인 항-AAV5 항체 수준을 가질 때, 인간 환자를 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 모두는 아니지만, 집단 대부분은 항-AAV5 항체 역가와 상관 없이 치료에 대해 자격이 있다고 예상될 수 있다. 본 실시예 단락에 제시된 바와 같이, 어느 항-AAV5 항체 검정법이든 충분하고, 즉, 95번째 백분위수, 93번째 백분위수 또는 90번째 백분위수를 측정하기 위해 인간 집단의 항체 역가를 측정하는 데 NAb 검정법 또는 TAb 검정법 등이 사용될 수 있다. 선택된 인간 집단은 동일하게 그대로 유지될 수 있지만, 실제 역가 값는 달라질 수 있다 (실시예의 NAb 검정법의 경우, 최대 10,000 또는 TAb 검정법의 경우, 최대 5). 이는 관찰되는 역가 값은 집단에서의 역가 관점에서 볼 때, 오직 관련성을 갖는 단지 수치에 불과하기 때문이다. 어느 경우에서든, 집단에서 측정된 항-AAV5 항체 역가 수준은 본 실시예 단락에 기술된 바와 같이 적어도 50명의 인간으로 이루어진 인간 집단에 관한 것임을 이해한다.
이에, 추가 실시양태에서, 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받지 않고, 여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없고, 상기 인간은 인간 집단에서 관찰되는 것과 같은 최대 95번째 백분위수의 항-AAV5 항체 수준에 상응하는, 본 실시예에서 기술된 바와 같이 NAb ELISA 검정법으로 측정된 바와 같은 항-AAV5 항체 수준을 갖는 것인 AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다. 또 다른 실시양태에 따라, 최대 99번째, 98번째, 97번째, 96번째, 95번째, 94번째, 93번째, 92번째, 91번째, 90번째, 80번째, 또는 70번째 백분위수인 항-AAV5 항체 수준을 가질 때, 인간 환자를 치료하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따라, 이제, 이전에는 AAV5를 이용하는 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주되지 않았던 인간 집단의 하위집단은, 항-AAV5 항체 검정법에서 양성으로 시험되었음에도 불구하고, 이제는 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주될 것으로 이해된다. 이에, 추가 실시양태에서, 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터로서, 여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체에 대하여 양성으로 시험되었고, 여기서, 상기 인간은 이전에 AAV5 등을 이용하여 치료를 받은 적이 없는 것인 AAV5 유전자 요법 벡터를 제공한다.
상이한 실시양태에서, 유행성 비처리된 인간 집단에서 AAV5 항체 수준이 효율적인 AAV5 유전자 요법 치료를 허용하는 것으로 나타난 본 실시양태에서와 같이, 본 발명은 또한 AAV 유전자 요법 치료, 즉, AAV5를 받은 적이 있는 인간 환자의 치료를 허용할 수 있다. 예를 들어, 혈액 중 항체 수준을 감소시켜 항-AAV5 항체 수준도 감소시킬 수 있는 수단 및 방법은 당업계에 공지되어 있다. 항체가 혈액으로부터 제거되는, 상기와 같은 혈액의 체외 치료는 혈액 중 항-AAV5 항체 역가를 감소시켜 유행성 노출로부터, 즉, 유행성 비처리된 인간 집단에서 관찰되는 것과 가은 수준을 달성하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 혈장반출법 (문헌 [Chicoine et al., Mol Ther 2014, vol. 22 no.2 338-347])을 포함할 수 있다. 이에, 혈액 중 항-AAV5 항체를 비롯한 항체를 저하시키는 데 사용될 수 있는 임의의 방법이 본 발명에서 항-AAV5 항체 역가를, 이전에 AAV5 기반 유전자 요법 치료를 받은 적이 있기 때문에 이전에는 치료에 대한 자격이 없었던 인간 환자가 유행성 인간 집단에서 관찰되는 것과 같은 항-AAV5 항체 역가를 수득하고, AAV5 기반 유전자 요법을 받을 수 있게 하는 정도로 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기술된 바와 같은 상기 AAV5 유전자 요법 벡터는 적어도 1011 캡시드/kg 체중에 상응하는 투여량으로 투여된다. 항-AAV5 항체의 존재와 관련하여 본 발명자들에 의해 관찰된 결과는 용량에 의존하는 것일 수 있음을 이해한다. 다시 말해, 사용되는 투여량에서 항-AAV5 항체의 농도 및/또는 양은 형질도입을 손상시키지 않는다. 예컨대, 의미있는 수준의 트랜스진 발현을 수득하기 위해 치료에서 인간 환자에게 투여되는 AAV5 유전자 요법 벡터의 양은 혈액 중에 존재하는 항-AAV5 항체를 훨씬 초과한다. 이러한 관점으로부터, 상한은 고려되지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 고려될 수 있는 상한은 최대 1016 캡시드/kg 체중에 상응하는 투여량이다. 투여량은 환자당 투여량으로 또는 혈액 부피당 투여량으로 설정될 수 있음을 이해한다. 적어도 1012 캡시드/kg 체중인 투여량은 평균 체중이 약 85 kg이고, 평균 혈액 부피가 5 L인 것에 기초하여, 환자당 약 1014 캡시드, 또는 환자의 혈액 부피 1 L당 약 1013 캡시드로 해석된다. 이에, 고려되는 용량 범위가 무엇이든, 상기 파라미터에 기초하여 쉽게 다시 계산될 수 있다. 바람직하게, 투여량은 적어도 1 x 1012 캡시드/kg 체중, 적어도 5 x 1012 캡시드/kg 체중, 또는 적어도 1 x 1013 캡시드/kg 체중에 상응한다. 본 실시예 단락에서 사용되는 투여량은 약 5 x 1013 캡시드/kg 체중 내지 약 2 x 1014 캡시드/kg 체중이다. AAV 캡시드 입자 역가의 AAV 정량화는 쉽게 측정되고, 당업계에 널리 공지되어 있다 (그 중에서도 특히 문헌 [Kohlbrenner et al., Hum Gene Ther Meth. June 2012, Vol. 23, No. 3: 198-203]; [Grimm et al., Gene Ther., Vol. 6, Nr. 7, p, 1322-1330, 1999] 참조).
선택되는 투여량은 또한 게놈 카피수(genomic copies)에 기초할 수 있다. 게놈 카피수는 AAV5 제제 중에 함유되어 있는 벡터 게놈의 양을 의미한다. AAV5 벡터 제제 중의gc 역가는 벡터 게놈 서열을 정량화하는 qPCR을 사용하여 쉽게 측정될 수 있다. 바람직하게, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터는 적어도 5 x 1011 gc/kg 체중에 상응하는 투여량으로 사용된다. 적어도 5 x 1011 캡시드/kg 체중인 투여량은 평균 체중이 약 85 kg이고, 평균 혈액 부피가 5 L인 것에 기초하여, 환자당 약 5 x1012 gc, 또는 환자의 혈액 부피 1 L당 약 1012 gc로 해석된다. 이에, 고려되는 용량 범위가 무엇이든, 상기 파라미터에 기초하여 쉽게 다시 계산될 수 있다. 선택되는 투여량은 적어도 1 x 1012 gc/kg 체중, 적어도 2 x 1012 gc/kg 체중, 또는 4 x 1012 gc/kg 체중일 수 있다. 본 실시예 단락에서 사용되는 투여량은 약 5 x 1012 gc/kg 체중 내지 약 2 x 1013 gc/kg 체중이다. 비록 상한이 존재하지 않을 수 있지만, 상한은 최대 1015 gc/kg 체중에 상응하는 투여량에 상응하도록 설정될 수 있다.
언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 AAV5 유전자 요법 벡터는 의학적 치료에서 사용하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 AAV 바이러스 벡터 내에 함유되어 있는 트랜스진이 본 발명을 제한하는 것이 아닐 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바람직하게, 및 본 실시예에 따라, 치료 유전자는 문헌 [Nathwani et al. N Engl J Med 2011; 365(25): 2357-65] 및 [Nathwani et al. B. N Engl J Med 2014; 371(21): 1994-200]에 기술된 바와 같이, 인간 인자 IX를 코딩하고, 예컨대, WO2010029178, WO1999003496, WO2015086406 및 WO2010012451 (상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같이, 그의 변이체를 포함할 수 있다. 특히, 치료학상 의미있는 양의 단백질이 인간 환자에서 FIX 코딩 AAV5 벡터 이용으로 수득될 수 있다는 것이 본 실시예 단락에 제시되어 있다. 이는 예컨대, 혈우병 A 또는 혈우병 B 치료에서 유용할 수 있다.
이에, 따라서, AAV5 유전자 요법 벡터는 본 발명에 따른 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 것으로서, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터는 혈우병 B의 치료에서 사용되며, 혈장에서 수득되는 트랜스제닉 FIX 단백질의 양은 0.02 ㎍/ml 내지 최대 약 5 ug/ml 범위일 수 있다. 대안적으로, 중증 표현형을 갖는 혈우병 B 환자 치료에서 사용될 때 상기 AAV5 유전자 요법 벡터는 치료 후 중간 정도 또는 경미한 표현형, 또는 심지어는 건강한 개체에서 관찰되는 표현형을 수득한다. 혈우병 B는 각각 FIX가 상이한 혈장 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 것이 3개 부류로 분류될 수 있다. 중증 혈우병 B에서, FIX 활성의 혈장 수준은 정상의 1% 미만이고; 중간 정도 형태에서, 수준은 1% 내지 5%이고; 경미한 형태에서, 정상 수준의 5 내지 25%이다. 정상의 25% 내지 50%인 중간 FIX 활성 수준을 갖는 건강한 보인자 개체(healthy carrier individual)도 있으며, 다수의 보인자는 심지어 50%를 초과하는 수준을 가질 수도 있다.
유사하게, 치료 유효량의 다른 관심의 대상이 되는 유전자도 충분히 당업자가 생각할 수 있는 범위 내에 있다. 이에, 본 발명은 임의의 트랜스진을 이용하는 경우에도 유용할 것으로 기대된다. 유전자 요법을 위해 바이러스 벡터로 환자에게 전달하기 위한 추가의 적합한 트랜스진은 당업자에 의해 선택될 수 있다. 상기 치료 핵산 서열은 전형적으로 예컨대, 결핍을 대체 또는 보정함으로써 선천성 또는 비선천성 유전자 결합을 치료하기 위한, 후생적 장애 또는 질환을 치료하기 위한, 또는 유전자 생성물의 탈조절과 연관된 병태를 치료하기 위한 생체내 또는 생체외에서 환자에서의 투여 및 발현을 위한 생성물 (예컨대, 단백질 또는 RNA)을 코딩한다. 유전자 요법 수행에 바람직한 상기 치료 유전자로는 제한 없이, 가족성 고콜레스테롤혈증 또는 가족성 복합 고지혈증(familial combined hyperlipidemia) 치료를 위한 초저밀도 지질단백질 수용체 유전자 (VLDL-R), 낭성 섬유증 치료를 위한 낭성 섬유증 막횡단 조절인자 유전자 (CFTR), 뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy) 치료를 위한 DMD 베커(DMD Becker) 대립유전자, 및 특정 장애 또는 질환 치료를 위해 당업자에게 쉽게 선택될 수 있는 다수의 다른 유전자를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, rAAV 벡터는 치료 단백질을 코딩하는 트랜스진, 또는 RNA, 예컨대, miRNA를 포함한다. 바람직하게, 치료 단백질은 인자 IX (바람직하게, 인간 인자 IX), 인자 VIII (바람직하게, 인간 인자 VIII), 지질단백질 리파제 (LPL; 예를 들어, LPLS447X와 같은 돌연변이체 포함; WO 01/00220 A2 참조), 포르포빌리노겐 데아미나제 (PBGD), 초저밀도 지질단백질 수용체 (VLDL-R), 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절인자 (CFTR), 뒤시엔느 근위축증 (DMD) 베커 대립유전자, 고수산뇨증 (AGXT), N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제 (NaGlu), 신경교세포 유래 신경영양 인자 (GDNF), S100A1 (S100 칼슘 결합 단백질 A1로도 공지, 이는 인간에서는 S100A1 유전자에 의해 코딩)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 치료 단백질은 인자 IX, 더욱 바람직하게, 인간 인자 IX이다.
대안적으로, 또는 상기 실시양태들 중 어느 하나와의 조합으로, 바람직한 실시양태에서, 유전자 요법은 예컨대, 집단의 1,500명의 사람 중 1명 미만으로 집단 중 소수가 이환되고, 생명을 위협하고/거나, 만성적으로 쇠약하게 하고/거나, 부적당하게 치료되는 병태 또는 질환, 바람직하게는, 본원에서는 희귀 질환으로 이해되고 있는, 소위 고아병(orphan disease)으로 불리는 병태 또는 질환을 치료, 예방, 치유 및/또는 역전시키기 위한 것이다. 일반적으로, 고아병은 유전 질환인 바, 이에 심지어 증상이 즉시 출현하지 않더라도, 평생 앓게 되는 질환이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 병태 또는 질환은 지질단백질 리파제 결핍증 (LPLD), 혈우병 B, 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria: AIP), 산필리포 B 증후군(Sanfilippo B syndrome), 파킨슨병 (PD), 울혈성 심부전 (CHF), 혈우병 A, 헌팅톤병, 뒤시엔느 근위축증 (DMD), 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis), X 염색체 관련 중증 복합 면역결핍증(X-linked severe combined immunodeficiency: SCID), 아데노신 데아미나제 결핍증 중증 복합 면역결핍증(adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency: ADA-SCID), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 만성 림프구 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 다발성 골수종, 낭성 섬유증, 낫형 세포병(sickle cell disease), 고지방단백혈증 타입 I, 지중해빈혈증(thalassemia), 알츠하이머병, 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 뇌전증, 프레드릭 실조증(Friedreich's ataxia), 판코니 빈혈(Fanconi anemia), 배턴 질환(Batten disease), 습성 AMD, 알파-항트립신-1, 폼페 질환(Pompe disease), SMA-1, 약물 내성 비소세포 폐암, GM1 강글리오시드증(GM1 gangliosidosis), 망막 색소변성증(retina pigmentosa), 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증(homozygous Familial Hypercholesterolemia), 리소좀 저장병(lysosomal storage disease), 구리 또는 철 축적병 (예컨대, 윌슨병(Wilson's disease), 또는 멘케스병(Menkes disease)), 리소좀 산 리파제 결핍증(lysosomal acid lipase deficiency), 고수산뇨증(hyperoxaluria), 고쉐병(Gaucher's disease), 헐러병(Hurler's disease), 아데노신 데아미나제 결핍증, 글리코겐 저장병 및 망막 퇴행 질환 (예컨대, RPE65 결핍증, 맥락막결손(choroideremia))으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시양태에서, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터는 본 발명에 따른 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 것으로서, 여기서, 상기 사용은 혈류 내로의 투여, 예컨대, AAV5 유전자 요법 벡터의 혈류로의 투여를 포함한다. 혈액은 항-AAV5 항체를 함유할 수 있고, 특히 혈류를 통한, 예컨대, 혈관내 주입 또는 주사를 통한 전달 경로가 고려된다. 혈류를 통해 전달함으로써 AAV5 벡터를 표적 조직으로 전달할 수 있다. 그러한 표적 조직으로의 전달은 전신 전달에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명은 혈류 내로의 투여로 제한되지 않는다. 실제로, 고려될 수 있는 통상의 제약상 허용되는 투여 경로로는 표적 기관, 조직 또는 부위 (예컨대, 간 또는 CNS)로의 직접 전달, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 경구 및 다른 비경구적 투여 경로를 포함한다. 그러나, 고려될 수 있는 바람직한 표적 조직은 간이다. 이에, 가장 바람직하게, AAV5 유전자 요법 벡터는 그의 트랜스진을 혈류를 통한 투여 경로를 통하여 간으로 전달한다. 언급한 바와 같이, AAV5 바이러스 벡터는 원하는 세포를 형질감염시키고, 선택된 트랜스진의 형질도입 및 발현을 충분한 수준으로 제공하여 의학 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있는, 과도한 유해 효과 없이, 또는 의학적으로 허용되는 생리적 효과를 가진 치료적 이익을 제공하는 데 충분한 양으로 투여된다. 원하는 경우, 투여 경로는 또한 조합될 수 있다. rAAV 벡터(즉, AAV5 유전자 요법 벡터)의 투여량은 주로 인자, 예컨대, 치료되는 병태, 선택된 유전자, 환자의 연령, 체중 및 건강에 의존하게 될 것이며, 따라서, 환자마다 다를 수 있다.
본 발명에 따라 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한 AAV5 유전자 요법 벡터는 바람직하게, 곤충 세포에서 제조된 AAV5 유전자 요법 벡터이다. 이론에 의해 제한하고자 하지 않으면서, AAV 캡시드는 그가 곤충 세포에서 제조되었을 때에는 포유동물 세포에서 제조된 것과 상이할 수 있기 때문에, 제조 방법은 AAV 벡터와 연관된 면역 프로파일에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 차이는 글리코실화 또는 다른 번역 후 변형에 관한 것일 수 있다. 추가로, 포유동물 세포 기반 제조는 환자에게 투여된 AAV 캡시드 내에 rep 및 cap 발현 작제물이 함유되어 있고, 그 결과로, 비록 극소량이기는 하지만, rep 및 cap 발현 작제물이 인간 대상체에게 전달된다는 단점을 가질 수 있다. 인간 환자에서의 AAV rep 및 cap의 발현은 특히, 항-AAV5 항체와 관련하여 양성으로 시험되는 인간 환자의 경우, 면역 관점에서 유해한 것일 수 있다. 이에, 인간 환자에게 투여되는 AAV5 바이러스 벡터는 곤충 세포에서 제조되는 것이 바람직할 수 있다. 곤충 세포 기반 제조는 잘 확립되어 있으며, WO2007046703, WO2007148971, WO2009014445, WO2009104964, WO03042361, WO2008024998, WO2010114948 (본원에서 참조로 포함된다)에 기술된 바와 같은 수단 및 방법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서,
- 인간 환자로부터의 혈청 샘플을 제공하는 단계;
- 항-AAV5 항체 역가를 측정하는 단계로서;
- 여기서, 본 실시예에 기술된 바와 같이 전체 항-AAV5 항체 (TAb) 검정법으로 측정하였을 때, 전체 항-AAV5 항체 역가 값이 0.02 - 5의 범위일 경우, 환자는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주될 수 있는 것인 단계를 포함하는, AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 인간 환자를 결정하는 방법을 제공한다.
임의적으로, 상기 방법은 후속하여
- 자격이 있는 인간 환자에게 AAV5 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.
AAV5 유전자 요법 인자의 의학적 사용에 관한 실시양태와 관련하여 상기 기술된 바와 같은 수단 및 한계 중 임의의 것이 본원에 기술된 바와 같은 방법 중 임의의 것, 예컨대, AAV5 유전자 요법 벡터의 전달 방법, 또는 자격 결정 방법에도 적용된다는 것을 이해한다. 바람직하게, 상기 전체 항-AAV5 항체 역가 값은 본 실시예에 기술된 바와 같이 전체 항-AAV5 항체 (TAb)를 이용하여 측정하였을 때, 0.02 - 4, 0.02 - 3, 또는 0.02 - 2의 범위이다.
또 다른 실시양태에서,
- 인간 환자로부터의 혈청 샘플을 제공하는 단계;
- 항-AAV5 항체 역가를 측정하는 단계로서;
- 여기서, 본 실시예에 기술된 바와 같이 중화 항-AAV5 항체 (NAb) 검정법으로 측정하였을 때, 중화 항-AAV5 항체 역가 값이 3 - 10,000의 범위일 경우, 환자는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주될 수 있는 것인 단계를 포함하는, AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 인간 환자를 결정하는 방법을 제공한다.
임의적으로, 상기 방법은 후속하여
- 자격이 있는 인간 환자에게 AAV5 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 상기 항-AAV5 항체 역가 값은 본 실시예에 기술된 바와 같이 중화 항-AAV5 항체 (NAb)로 측정하였을 때, 3 - 5,000, 3 - 3,000, 또는 3 - 1,000의 범위이다.
상기 기술된 적격성 기준은 AAV5 유전자 요법 치료를 선택하는 데 사용될 수 있는 유일의 기준은 아님을 이해한다. 이에, 인간 환자가 모든 다른 기준에 부합할 때, 항-AAV5 항체 기준이 인간 환자의 적격성을 결정한다.
또 다른 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 인간에게 유효량의 AAV5 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계를 포함하고;
여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받지 않고;
여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없는 것인, 인간을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 인간에게 유효량의 AAV5 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계를 포함하고;
여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝(pre-screening)을 받지 않고;
여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없고;
상기 인간은 인간 집단에서 관찰되는 것과 같은 최대 95번째 백분위수의 항-AAV5 항체 수준에 상응하는 항-AAV5 항체 수준을 갖는 것인, 인간을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 유전자 전달을 필요로 하는 인간에게 유효량의 AAV5 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계를 포함하고;
여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받지 않고;
여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없고;
상기 인간은 인간 집단에서 관찰되는 것과 같은 최대 95번째 백분위수의 항-AAV5 항체 수준에 상응하는 항-AAV5 항체 수준을 갖는 것인, 인간에게 유전자를 전달하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 유전자 전달을 필요로 하는 인간에게 유효량의 AAV5 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계를 포함하고;
여기서, 상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받지 않고;
여기서, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없는 것인, 인간에게 유전자를 전달하는 방법을 제공한다.
대안적으로, 또는 상기 실시양태들 중 어느 하나와의 조합으로, 바람직한 실시양태에서, AAV5 벡터 조성물은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 가용제, 충전제, 보존제, 및/또는 부형제를 추가로 포함한다. 치료 유전자를 보유하는 rAAV 벡터는 바람직하게, 생물학적으로 적합성(compatible)인 용액 또는 제약상 허용되는 전달 비히클 중에 현탁되어 환자에게 투여될 수 있다. 적합한 비히클로는 멸균 염수를 포함한다. 제약상 허용되는 담체인 것으로 알려져 있고, 당업자에게 널리 공지되어 있는 다른 수성 및 비-수성 등장성 멸균 주사액 및 수성 및 비-수성 멸균 현탁액이 본 목적을 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 상기 기술된 바와 같이 원하는 세포를 형질감염시키고, 선택된 트랜스진의 형질도입 및 발현을 충분한 수준으로 제공하여 의학 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있는, 과도한 유해 효과 없이, 또는 의학적으로 허용되는 생리적 효과를 가진 치료적 이익을 제공하는 데 충분한 양으로 인간 환자에게 투여된다.
실시예
연구 설계 및 참가자
1) 연속적인 FIX 예방, 또는 2) 요구시 FIX를 필요로 하고, 연간 ≥4회 출혈하거나, 또는 혈우병성 관절증을 앓는, 중증 (FIX < 1 IU/dL) 또는 중간 정도-중증 (FIX ≤2 IU/dL) 혈우병 B을 앓는 성인 남성을 포함하는 다국가, 개방 표지, 용량 증가 1/2 상 연구를 수행하였다. 본 시험에 관한 추가의 상세한 설명은 NIH clinicaltrials.gov 웹사이트 (NCT02396342)에서 살펴볼 수 있다. 본 연구는 각 센터의 기관 심사 위원회(Institutional Review Board)/기관 생명 윤리 위원회(Institutional Ethics Committee)의 승인을 받은 것이었다. 모든 참가자는 사전 동의서를 제공하였다. 시험은 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki) 및 임상 시험 관리 기준(Good Clinical Practice)의 원리에 따라 수행하였다.
간 특이적 프로모터 LP1의 제어하의 코돈 최적화된 야생형 hFIX 유전자를 도입한 AAV5 벡터 (문헌 [Nathwani et al. N Engl J Med 2011; 365(25): 2357-65] 및 [Nathwani et al. B. N Engl J Med 2014; 371(21): 1994-2004])를 본 연구에서 사용하였다. 벡터는 의약품 제조 및 품질관리 기준(Good Manufacturing Practices)에 따라 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 제조하였다. qPCR을 이용하여 벡터 게놈 카피수 역가 (gc)를 측정하였다. gc 대비 캡시드의 비는 약 10이었고, 즉, 캡시드의 양이 게놈 카피수의 양의 약 10배 정도였다. 캡시드 역가는 UV 흡수 검출과 함께 고성능 액체 크기 배제 크로마토그래피 (HPL-SEC)에 의해 측정될 수 있다. 본 방법은, AAV 입자를 더 작은 매트릭스 성분으로부터 분리할 수 있는 그의 능력에 대해 선택되는 것인 SEC 칼럼을 기반으로 하였다. 본 방법에서는 공지된 전체 입자 농도와 함께 AAV 벡터 제제를 이용하여 검정 곡선을 작성하였다. 검정 곡선에서, 주사된 전체 입자의 양을 반응 데이터 대비로 플롯팅하였다. 복귀된 AAV 피크 면적 및 검정 곡선을 사용하여 주사된 샘플 입자의 양을 내삽에 의해 계산하였다. AAV5 벡터를 단일, 30분, 말초 정맥내 주입으로서 투여하였다. 참가자는 2개의 연속, 용량 증가 코호트로 처리되었다: 코호트 1 (n=5, 참가자 1-5)은 5x1012 gc/kg를 받았고, 코호트 2 (n=5, 참가자 6-10)는 2x1013 gc/kg를 받았다. 코호트 1은 평균 연령이 69세 (35-72)이고, 평균 체중이 84.5 kg (71.2 - 89.1)인 성인 남성으로 구성되었고, 코호트 2는 평균 연령이 35세 (33-46)이고, 평균 체중이 84.0 kg (71.4 - 96.0)인 성인 남성으로 구성되었다. 효능 결과 측정은 FIX 혈장 활성 측정을 포함하였다. 추가로, 중화 AAV5 항체 역가 (NAb 역가) 및 전체 AAV5 항체 역가 (TAb) 분석을 위해 대상체로부터의 혈청을 수득하였다.
건강한 기증자로부터의 대조군 혈청은 세라랩(SeraLab: 영국 웨스트서식스)으로부터 상업적으로 구입하였다. 상기 혈청에 관하여 제공된 모든 정보는 하기에 열거되어 있다.
Figure 112020007728369-pct00001
중화 AAV5 항체 ( NAb ) 역가
인간 혈청 중 NAb의 측정은 트랜스진 루시페라제를 보유하는 AAV5 (AAV5-luc) 및 인간 배아 신장 세포주 HEK293T (ATCC 11.268)를 이용하여 고감도 시험관내 검정법에 기초하여 평가하였다. 트랜스진 발현은 루시페린 유사체의 첨가에 의해 나타났다.
사용된 물질:
- HEK293T 세포 (HEK293T/ATCC 11.268)
- 페놀 레드 (기브코(Gibco), REF# 31966)/10% FBS (그라이너(Greiner), REF# 758093)/1% PenStrep (기브코, REF# 15140)를 포함하는 DMEM
- 페놀 레드 (기브코, REF# 21063) /1% Pen-Strep (기브코, REF# 15140)를 포함하지 않는 DMEM
- 1xPBS-/- (기브코, REF# 14190)
- 1x 트립신 EDTA (기브코, REF# 25200)
- 폴리-L-리신 (PLL) 용액 (2.5 %) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), REF# 8920-100)
- 96-웰 평평한 바닥의 검은색 배양 플레이트 (코스타(costar), REF # 3916)
- 투명한 96-웰 평평한 바닥의 플레이트 (코닝(corning), REF # 3596)
- 원-글로 루시페라제 어세이 시스템(ONE-Glo Luciferase Assay System) (프로메가(Promega), REF# E6120)
- 글로 라이시스 버퍼(Glo Lysis Buffer), 1x (프로메가, REF# E2661)
- AAV5-CMV-luc (예컨대, PKO로부터의 AAV5-CMV-73QlucHtt를 사용, 역가: 4e13 gc/ml).
기본적으로, DMEM (페놀 레드/10% FBS 및 1%P/S (페니실린/스트렙토마이신) 포함) 중 100 ㎕/웰의 HEK293T 세포를 0.5 x105개의 세포/웰 농도로 첨가함으로써 세포를 검은색 96-웰 플레이트 및 투명한 96-웰 플레이트에 시딩(seeding)하였다. 세포를 밤새도록 인큐베이션(incubation)시켰다.
다음날, 배지 (페놀 레드/10% FBS를 포함하지 않는, DMEM/1% PS) 중 투명한 96-웰 플레이트 상에서 혈장의 연속 희석액을 제조하였다. 바이러스 첨가 후 (하기 참조) 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 및 1024인 최종 혈장 희석액을 수득하였다.
140 ㎕의 배지를 A2-A11로 지명된 웰 (음성 대조군 웰)에 첨가하여 희석액을 제조하고, 70 ㎕의 배지를 플레이트의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11열의 나머지 행 및 H2-H11 행 (양성 대조군)에 첨가하였다. 혈장 샘플을 웰 B2, C2, D2, E2, F2, G2 (140 ㎕/웰)에 첨가하여 제1 희석액을 수득하였다: 1. 그 결과로, 70 ㎕를 2열에서 3열로 (희석률 2), 3열에서 4열로 (4), 4열에서 5열로 (8), 5열에서 6열로 (16), 6열에서 7열로 (32), 7열에서 8열로 (64), 8열에서 9열로 (128), 9열에서 10열로 (256), 10열에서 11열로 (512) 옮겨 플레이트 간에 혈장의 연속 희석을 수행한 후, 11열의 70 ㎕를 폐기하였다. AAV5-CMV-73QlucHtt를 배지 (페놀 레드/10% FBS를 포함하지 않는, DMEM/1% PS) 중에서 6x109 gc/ml로 제조하였다. 이어서, 70 ㎕/웰의 6x109 gc/ml의 AAV5(160)-CMV-73QlucHtt 바이러스 희석액을 웰 A2-A11 (음성 대조군)을 제외한, 혈장 희석액 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 300 rpm으로 2 min 동안 플레이트 진탕기 위해 조심히 배치하였다. 이어서, 플레이트를 4℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다.
전날 제조된 검은색 96-웰 플레이트 (HEK293T 세포 포함)로부터 배양 배지를 제거하고, 100 ㎕/웰 부피의 Hek293T 세포를 이용하여 투명한 플레이트로부터 검은색 플레이트로 피펫팅함으로써 제조된 혈장 희석액으로 대체시켰다. 상기 플레이트를 37℃에서 16-20 h 동안 인큐베이션시켰다. 다음날, 세포를 실온으로 평형화시키고, 배지를 제거하였다. 세포를 1X PBS-/- (100 ㎕/웰)로 1회 세정한 후, 100 ㎕/웰의 글로 라이시스 버퍼를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켜 용해가 진행되도록 하였다. 이후, 100 ㎕/웰의, 원-글로 루시페라제 어세이 시스템으로부터의 시약을 첨가하였다 (시약은 제조사의 설명서에 따라 제조하였다). 적어도 3분 경과 후, 플레이트를 글로맥스 디스커버(GloMax Discover) 장치 상에서 원-글로 프로토콜(ONE-Glo Protocol)을 이용하여 측정하였다. 배경 활성을 감산한 후, 각 혈청 희석액에 대한 중화율(%)을 계산한 후, 이어서, 중화 프로파일로 곡선을 피팅하는 랩키(LabKey) 소프트웨어 분석을 이용하여 항-AAV5 중화 항체 역가를 측정하였다. 이어서, 상기 곡선을 이용하여 선택된 벤치마크, 곡선하 면적 (AUC), 및 오차 추정치를 계산한다. 4-파라미터 방법을 이용하여 곡선 피트를 계산하였다. 랩키는 항체가 형질도입을 50%만큼 억제시키는 희석률인 IC50을 계산하였다. 랩키는 또한 문헌 [Johnson and Byington, Techniques in HIV Research. New York, N.Y.: Stockton Press, 1990: 71-76]에 따라 "지점 기반" 역가를 계산하였다. 이는 표적 중화율(%) 양측의 두 복제물 사이를 선형으로 내삽함으로써 수행되었다. 각 실행은 AAV5-LUC 중화의 특이성을 평가하기 위해 양성 대조군 (샘플 혈청은 포함하지 않지만, AAV5-LUC는 포함하는 웰), 음성 대조군 (샘플 혈청도 포함하지 않고, AAV5-LUC도 포함하지 않는, 오직 배지만을 포함하는 웰) 및 음성 대조군 샘플 혈청 (열 불활성화된 FBS)을 포함하였다. FBS는 그가 샘플로서 측정되었을 때에는 항-AAV5 중화 특성을 가지지 않아야 한다.
항- AAV5 항체 역가
AAV5에 대한 전체 인간 Ab의 정량화는 플레이트를 코팅하는 특이적 캡시드를 이용하여 ELISA 검정법을 기반으로 하였다. AAV5 캡시드에 대해 특이적인 전체 인간 Ab의 존재는 단백질 A 퍼옥시다제의 사용으로 나타난다. ELISA 플레이트 (눈크 맥시소르프(Nunc MaxiSorp) 플레이트, Ref: 456537, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 4℃에서 밤새도록 카르보네이트 완충제 중 100 ng/웰로 항원 (AAV5 캡)으로 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS 트윈-20 (PBSt)으로 3회에 걸쳐 세척하여 남은 항원을 제거하고, 차단 용액 (PBS+3% FBS)으로 차단하여 비특이적인 결합을 막았다. 200 ㎕ PBSt로 3회에 걸쳐 세척한 후, 1:9를 시작으로 하여 최종 부피 100 ㎕ 중 1:3의 희석액 시리즈인 PBSt 중 인간 혈청 희석액을 첨가하였다. 모든 샘플을 이중으로 시험하였다. 인간 혈청을 포함하지 않는 음성 대조군을 각 플레이트에 포함시켰다. 혈청 희석액을 37℃에서 2 h 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 혈청을 제거하고, 플레이트를 PBSt로 3회에 걸쳐 세척하고, 차단 용액 중 1:10,000으로 희석된 100 ㎕의 단백질 A 퍼옥시다제를 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBSt로 3회에 걸쳐 세척하고, 반응을 TMB 기질을 이용하여 나타내고, 30 min 후 H2SO4 2 N을 이용하여 정지시켰다. 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군보다 5배 더 높은 흡광도를 보인 혈청 희석률로서 전체 항체 역가를 계산하였다.
결과 및 논의
두 코호트 모두의 인간 환자는 모두 의미있는 FIX 활성 개선을 보였는데, 대부분의 인간 환자의 표현형은 중증에서 경미한 정도로 변화함으로써 개선된 것으로 나타났고 (하기 표 2), 그 결과, FIX 단백질의 예방적 투여는 상당부 감소하였거나, 심지어는 그러한 예방적 투여를 사용할 필요가 없었다. 환자 사이 및 코호트 사이에 관찰되는 FIX 활성 수준 사이에는 차이가 관찰되었다. FIX 활성 수준의 변화는 인간 환자의 NAb 또는 TAb 상태와 상관관계가 없었다.
앞서 보고된 AAV5에 대한 TAb의 빈도 (40%, 문헌 [Boutin et al. Hum Gene Ther. 2010 Jun 21(6):704-712])는 본 분석 결과 (30%)와 대략적으로 일치하였다. 루시페라제 기반 NAb 검정법으로 수득한 결과 (도 1 및 2 참조)는, 최근의 연구와 일치하는 (문헌 [Li C et al. Gene Ther. 2012 Mar;19(3):288-94]) 50개의 스크리닝된 대조군 혈청 중 14개 (28%)의 경우에 양성 신호로 복귀된 것과 같이, AAV5 (중화) 항체의 빈도는 유사하다는 것을 시사한다. 유전자 요법 치료 이전의 인간 환자로부터 수득된 혈청으로부터 얻은 결과는 NAb 검정법 및 Tab 검정법, 둘 모두에서 10개의 혈청 중 3개가 (30%) 양성인 것으로 나타난 것과도 일치한다. ELISA에 의해 평가된 전체 항체 및 루시페라제 기반 검정법에 의해 평가된 중화 항체는 밀접한 상관관계를 가지며, 이는 두 검정법 모두 동일한 엔티티를 검출한다는 것을 시사한다 (도 2a 참조).
추가로, 처리 후의 중화 항체 역가의 존재 또한 시험하였고, 범위가 약 106 이상인 것으로 나타났다. 이에, 유행성으로 획득된, 비처리 인간에서 발견된 항체 역가는 AAV5 기반 유전자 요법을 받은 인간 환자에서 관찰된 역가 범위를 훨씬 벗어난 것이었다. 추가로, 항원에의 최초 노출인 경우에 전형적인, 빠르고 일시적인 IgM 증가 이후, IgG 상승을 보인, NAb가 없는 환자와는 대조적으로, 기존 AAV5 NAb를 이용하였을 때 환자는 면역 부스트의 특징인, AAV-FIX 투여시 IgG의 빠른 증가를 나타내었다. 추가로, 기존 NAb를 이용하여 처리된 환자에서 ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제) 상승 또는 캡시드 특이적 T 세포 활성화의 증거는 없었다. 이에, 유행성으로 획득된 기존 Nab를 갖는 환자에서 AAV5 기반 유전자 요법의 투여는 ALT 상승 또는 T 세포 활성화 없이 우수한 내성을 보였다.
결론적으로, 시험관내에서 NAb 검정법 또는 TAB 검정법에 의해 검출된 항-AAV5 항체의 존재는 생체내 형질도입 손상을 예측하지도, 나타내지도 못했다. 요법 이전의 Nab의 존재와 요법 이후의, AAV5 FIX 유전자 전달로부터 초래되는 FIX 수준 사이에 뚜렷한 상관관계는 없었다. 놀랍게도, 더 낮은 저용량의 AAV5 벡터를 받은 코호트 1 중의 최고 반응자는 또한 검출된 NAb 및 TAb 항체의 수준이 최고인 것으로 나타났다. 건강한 집단에서 관찰된 항-AAV5 역가 범위는, AAV5 유전자 요법 치료를 받지 않은 건강한 집단에서의 항체 수준은 생체내에서 AAV5에 의한 형질도입을 손상시키지 않는 것을 나타낸다. 이는 건강한 집단에서 관찰된 최고 역가는 코호트 1의 환자 5에서 관찰된 최고 역가의 범위 내에 가깝게 존재하기 때문이다. 이에, 비처리 집단에서 항-AAV5 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험하는 것은 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 치료 이전이어야 할 필요는 없다는 것이 실현가능한 것으로 간주된다.
Figure 112020007728369-pct00002
SEQUENCE LISTING <110> uniQure IP B.V. <120> Means and methods for AAV gene therapy in humans <130> P6069265PCT <150> EP 17180601.1 <151> 2017-07-10 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 724 <212> PRT <213> adeno-associated virus 5 <400> 1 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe 115 120 125 Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile 130 135 140 Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser 145 150 155 160 Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln 165 170 175 Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr 180 185 190 Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala 195 200 205 Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp 210 215 220 Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro 225 230 235 240 Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp 245 250 255 Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr 260 265 270 Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln 275 280 285 Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val 290 295 300 Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr 305 310 315 320 Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp 325 330 335 Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys 340 345 350 Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr 355 360 365 Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser 370 375 380 Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn 385 390 395 400 Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser 405 410 415 Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp 420 425 430 Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln 435 440 445 Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp 450 455 460 Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly 465 470 475 480 Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu 485 490 495 Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr 500 505 510 Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile 515 520 525 Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu 530 535 540 Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg 545 550 555 560 Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser 565 570 575 Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro 580 585 590 Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp 595 600 605 Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met 610 615 620 Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn 625 630 635 640 Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser 645 650 655 Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu 660 665 670 Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln 675 680 685 Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp 690 695 700 Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu 705 710 715 720 Thr Arg Pro Leu <210> 2 <211> 725 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 / AAV5 VP1 hybrid <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg 130 135 140 Ile Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp 145 150 155 160 Ser Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser 165 170 175 Gln Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp 180 185 190 Thr Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly 195 200 205 Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr 210 215 220 Trp Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu 225 230 235 240 Pro Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val 245 250 255 Asp Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly 260 265 270 Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp 275 280 285 Gln Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg 290 295 300 Val Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser 305 310 315 320 Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr 325 330 335 Asp Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly 340 345 350 Cys Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly 355 360 365 Tyr Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser 370 375 380 Ser Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly 385 390 395 400 Asn Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser 405 410 415 Ser Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val 420 425 430 Asp Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val 435 440 445 Gln Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn 450 455 460 Trp Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser 465 470 475 480 Gly Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met 485 490 495 Glu Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met 500 505 510 Thr Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met 515 520 525 Ile Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu 530 535 540 Glu Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn 545 550 555 560 Arg Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser 565 570 575 Ser Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val 580 585 590 Pro Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile 595 600 605 Trp Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala 610 615 620 Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys 625 630 635 640 Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val 645 650 655 Ser Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met 660 665 670 Glu Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile 675 680 685 Gln Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro 690 695 700 Asp Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr 705 710 715 720 Leu Thr Arg Pro Leu 725 <210> 3 <211> 725 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV5 - insertion of ala between AA1 and AA2 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> ala insertion <400> 3 Met Ala Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly 1 5 10 15 Glu Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg 130 135 140 Ile Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp 145 150 155 160 Ser Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser 165 170 175 Gln Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp 180 185 190 Thr Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly 195 200 205 Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr 210 215 220 Trp Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu 225 230 235 240 Pro Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val 245 250 255 Asp Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly 260 265 270 Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp 275 280 285 Gln Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg 290 295 300 Val Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser 305 310 315 320 Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr 325 330 335 Asp Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly 340 345 350 Cys Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly 355 360 365 Tyr Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser 370 375 380 Ser Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly 385 390 395 400 Asn Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser 405 410 415 Ser Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val 420 425 430 Asp Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val 435 440 445 Gln Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn 450 455 460 Trp Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser 465 470 475 480 Gly Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met 485 490 495 Glu Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met 500 505 510 Thr Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met 515 520 525 Ile Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu 530 535 540 Glu Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn 545 550 555 560 Arg Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser 565 570 575 Ser Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val 580 585 590 Pro Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile 595 600 605 Trp Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala 610 615 620 Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys 625 630 635 640 Asn Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val 645 650 655 Ser Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met 660 665 670 Glu Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile 675 680 685 Gln Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro 690 695 700 Asp Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr 705 710 715 720 Leu Thr Arg Pro Leu 725

Claims (12)

  1. 인간의 의학적 치료에서 사용하기 위한, AAV5 유전자 요법 벡터를 포함하는 제약 조성물로서,
    상기 인간은 항-AAV5 항체를 측정하는 검정법을 이용하는 사전 스크리닝을 받고, 상기 인간은 상기 의학적 치료 이전에 AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료를 받은 적이 없고, 상기 인간은 인간 집단에서 관찰되는 항-AAV5 항체 수준의 최대 95번째 백분위수에 상응하는 항-AAV5 항체 수준을 갖고, 상기 인간이 항-AAV5 항체에 대해 양성으로 시험된 것인, 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터가 적어도 1012 캡시드/kg에 상응하는 투여량으로 투여되는 것인, 제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터가 적어도 1012 gc/체중 kg에 상응하는 투여량으로 사용되는 것인, 제약 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터가 혈우병 A 또는 혈우병 B로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료에서 사용되는 것인, 제약 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터가 혈우병의 치료에서 사용되고, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터가 FIX 단백질 또는 그의 변이체를 코딩하는 것인, 제약 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 사용이 혈류 내로의 투여를 포함하는 것인, 제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 사용이 벡터의 간으로의 전달을 포함하는 것인, 제약 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 AAV5 유전자 요법 벡터가 곤충 세포에서 생산되는 것인, 제약 조성물.
  9. 하기 단계를 포함하는, AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 인간 환자를 결정하는 방법:
    - 인간 환자로부터의 혈청 샘플을 제공하는 단계;
    - 항-AAV5 항체 역가를 측정하는 단계;
    - 여기서, 전체 항-AAV5 항체 역가가 인간 집단에서 관찰되는 전체 항-AAV5 항체 역가의 최대 95번째 백분위수에 상응하는 값을 갖는 경우, 환자는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주될 수 있음.
  10. 하기 단계를 포함하는, AAV5 유전자 요법 벡터를 이용하는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 인간 환자를 결정하는 방법:
    - 인간 환자로부터의 혈청 샘플을 제공하는 단계;
    - 항-AAV5 항체 역가를 측정하는 단계;
    - 여기서, 중화 항-AAV5 항체 역가(neutralising anti-AAV5 antibody titer)가 인간 집단에서 관찰되는 중화 항-AAV5 항체 역가의 최대 95번째 백분위수에 상응하는 값을 갖는 경우, 환자는 의학적 치료에 대하여 자격이 있는 것으로 간주될 수 있음.
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