ES2999308T3

ES2999308T3 - Means and methods for aav gene therapy in humans

Info

Publication number: ES2999308T3
Application number: ES18737622T
Authority: ES
Inventors: Bart Antonius Nijmeijer; Valerie Ferreira
Original assignee: Uniqure IP BV
Current assignee: Uniqure IP BV
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2025-02-25
Anticipated expiration: 2038-07-10
Also published as: JP7764129B2; WO2019011893A1; EP4488288A3; EP3652326A1; IL271957B1; CN111344412A; AU2018299865A1; US12285451B2; CA3069194A1; KR20240170979A; IL271957A; JP2020526203A; US20190008909A1; US11452749B2; ZA202000152B; KR102736053B1; JP2023123836A; AU2024278563A1; PL3652326T3; EP3652326B1

Abstract

La presente invención se refiere a medios y métodos para terapias génicas basadas en AAV en seres humanos. En particular, la presente invención se refiere al tratamiento de pacientes humanos de los que se pueda sospechar que tienen anticuerpos dirigidos contra el AAV que se pretende utilizar en dicho tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Medios y métodos para la terapia génica con AAV en seres humanos

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a medios y métodos para terapias génicas basadas en AAV en seres humanos. En particular, la presente invención se refiere al tratamiento de pacientes humanos que se sospecha que tienen anticuerpos dirigidos contra el AAV destinado a usarse en dicho tratamiento.

Antecedentes de la invención

[0002] El virus adenoasociado (AAV) se considera uno de los vectores virales más prometedores para la terapia génica humana. El AAV tiene la capacidad de infectar con eficacia células humanas en división y no en división. El genoma viral del AAV natural se integra en un único sitio cromosómico en el genoma de la célula hospedadora, y lo más importante es que, aunque el AAV está presente en muchos seres humanos, no se ha asociado con ninguna enfermedad. En vista de estas ventajas, el virus adenoasociado recombinante (rAAV) se está evaluando en ensayos clínicos de terapia génica para hemofilia B, melanoma maligno, fibrosis quística y otras enfermedades. Numerosos ensayos clínicos y la aprobación de medicamentos de terapia génica en Europa, tales como Alipogén tiparvovec (Glybera®, uniQure) son prometedores de cara a que el AAV se vuelva de uso habitual de la práctica clínica.

[0003] Un reto importante para una administración exitosa del vector AAV es superar la presencia de anticuerpos neutralizantes (inmunoglobulinas) (NAb) que se han desarrollado después de la exposición a vectores AAV o basados en AAV naturales. En ambos casos, los anticuerpos neutralizantes específicos para un serotipo dirigidos a las proteínas de la cápside viral pueden reducir la eficiencia de la transferencia génica con AAV del mismo serotipo.

[0004] La práctica actual en la clínica con respecto a la inmunidad preexistente implica el cribado de pacientes humanos (Leebeek y col. Blood 2016, 128:2314) para la exclusión de pacientes que tengan anticuerpos neutralizantes contra la cápside del AAV (Halble y col. Expert Opin Biol Ther 2016, 16(1):79-92; Biomarin, NCT02576795, 14 de junio de 2017-ISBN: 978-1-118-00490-6; y Boutin y col. Hum Gene Ther 2010, 21:704-712). Se han probado regímenes inmunosupresores con el fin de reducir la formación de NAb después de la primera administración para permitir una segunda administración (Corti y col., Mol Ther - Meth Clin Dev (2014) 1, 14033; Mingozzi y col. Mol Ther vol. 20 no 7, 1410-1416; McIntosh y col. Gene Ther 2012, 19, 78-85; Mingozzi y High, Blood 2013, 122(1):23-36)). Además, se han sugerido estrategias para superar el obstáculo de los anticuerpos preexistentes, que incluyen la plasmaféresis y el uso de regímenes inmunosupresores (por ejemplo. Chicoine y col., Mol Ther 2014, vol. 22 n.° 2338-347; Hurlbut y col. Mol Ther 2010, vol. 18 n.° 11 1983-1984 y Mingozzi y col. Mol Ther vol. 20 no 7, 1410-1416; Mingozzi y High, Blood 2013, 122(1):23-36). Estas estrategias se han ensayado en modelos animales, obteniendo un éxito limitado.

[0005] Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de permitir la administración de vectores de terapia génica de rAAV en pacientes humanos que tienen, o se puede sospechar que tienen, anticuerpos neutralizantes de AAV.

Breve descripción de la invención

[0006] Los inventores actuales han descubierto ahora sorprendentemente que, en particular para los vectores de terapia génica AAV5, y en contraste con las sugerencias del estado de la técnica, los pacientes humanos que tienen anticuerpos anti AAV5 preexistentes endémicos (es decir, anticuerpos anti AAV5 preexistentes resultantes de la exposición endémica) pueden considerarse aptos para el tratamiento. Esto contrasta con lo que se cree en la técnica anterior de que la presencia de anticuerpos neutralizantes debe considerarse como un criterio de exclusión, por ejemplo, para pacientes que participan en ensayos clínicos. En otrass palabras, en el estado de la técnica se cree que los pacientes que tienen anticuerpos contra AAV5, más en particular anticuerpos preexistentes endémicos contra AAV5, no se consideran aptos para el tratamiento con un vector de terapia génica AAV5. El sorprendente hallazgo descrito en la presente memoria de que los pacientes humanos que tienen anticuerpos anti AAV5 preexistentes endémicos pueden considerarse aptos para el tratamiento no solo se refiere a una subpoblación de pacientes humanos que, por ejemplo, se descubre que tienen niveles muy bajos de anticuerpos anti AAV5 preexistentes, sino que se ha descubierto que se refiere esencialmente a la mayoría, si no a todos, los pacientes de la población humana que dan positivo para anticuerpos anti AAV5 preexistentes y que no se han sometido previamente a ninguna terapia génica con AAV5.

[0007] En un aspecto, se proporciona un vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano, donde dicho ser humano se somete a un cribado previo con un ensayo para determinar los anticuerpos anti AAV5 y donde dicho ser humano no se ha sometido a ningún tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 antes de dicho tratamiento médico, donde dicho ser humano tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 correspondiente a como máximo el percentil 95 de los niveles de anticuerpo anti AAV5 observados en la población humana, y donde dicho paciente humano dio positivo para anticuerpos anti AAV5. Descripción de las figuras

[0008]

Figura 1: Resultados del ensayo de NAb de muestras de pretratamiento. A: Resultados de neutralización de las diez muestras antes de la administración de la dosis. El valor del cincuenta por ciento se muestra como una línea de puntos. B: Resultados de ajuste de curva de tres muestras positivas 3, 4, 5. Se ajustó una curva de cuatro parámetros por medio de regresión no lineal. Los títulos se calcularon como la dilución teórica a la que la curva ajustada superó el 50 % (mostrada por encima del eje horizontal).

Figura 2A: anticuerpos neutralizantes de AAV5 frente a anticuerpos anti AAV5 totales. Resultados de ELISA para neutralizantes (NAb) frente a totales (TAb) como se informa en el estudio de cribado de poblaciones. Cada símbolo abierto representa resultados emparejados de NAb y TAb de un individuo sano. Los resultados de NAb y TAb de los pacientes tratados se muestran superpuestos (A, con los sujetos de estudio 3, 4 y 5 como se especifica).

Figura 2B: Título de NAb de AAV5 frente a los niveles de FIX. El porcentaje de actividad de FIX en la cohorte 1 después de la administración de la dosis se representa frente al título de NAb antes de la administración de la dosis.

Figura 3: Escala de titulación de NAb de AAV. Los percentiles de la población humana (50 sujetos) se representan para los títulos de NAb frente a AAV5. Obsérvese que los títulos de NAb observados en la población humana divergen mucho de los títulos de NAb observados en pacientes humanos tratados con AAV5.

Definiciones

[0009] Un "vector AAV" se refiere a un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante que se deriva del AAV natural usando métodos moleculares. Un vector AAV es distinto de un vector AAV natural (wt), ya que al menos una parte del genoma viral se ha reemplazado por un transgén, que es un ácido nucleico no natural con respecto a la secuencia de ácido nucleico de AAV natural.

[0010] El vector AAV, incluyendo combinaciones de cápside de AAV e ITR del genoma del AAV, se puede producir utilizando métodos conocidos en la técnica, como se describe en Pan y col. (J. of Virology (1999) 73: 3410-3417), Clark y col. (Human Gene Therapy (1999) 10: 1031-1039), Wang y col. (Methods Mol. Biol. (2011) 807: 361-404) y Grimm (Methods (2002) 28(2): 146-157). Alternativamente, los vectores AAV pueden producirse en células de insecto usando un sistema de expresión de baculovirus (BEVS). El sistema de baculovirus inicial para la producción de rAAV fue descrito por Urabey col.(Urabe y col. [2002] Human Gene Therapy 13(16):1935-1943) y consiste en tres baculovirus, a saber, Bac-Rep, Bac-cap y Bac-vec, cuya coinfección en células de insecto, por ejemplo, SF9, dio como resultado la generación de rAAV. Las propiedades de dicho rAAV producido, a saber, la característica física y molecular incluyendo la potencia, no difirieron significativamente del rAAV generado en células de mamífero (Urabe [2002]supra).El sistema inicial de baculovirus de Urabe (2002,supra)se ha seguido desarrollando (véase, por ejemplo, Kohlbrenner y col. (2005) Molecular Therapy 12 (6): 1217 1225; Urabe y col. (2006) Journal of Virology 80(4):1874-1885; WO 2007/046703; WO 2007/148971; WO 2009/014445 y WO 2009/104964).

[0011] El término transgén se usa para referirse a un ácido nucleico no natural con respecto a la secuencia de ácido nucleico de AAV. Se usa para referirse a un polinucleótido que se puede introducir en una célula u organismo. Los transgenes incluyen cualquier polinucleótido, tal como un gen que codifica un polipéptido o proteína, un polinucleótido que se transcribe en un polinucleótido inhibidor, o un polinucleótido que no se transcribe (por ejemplo, que carece de un elemento de control de la expresión, tal como un promotor que dirige la transcripción). Un transgén es 1039), Wang y col. (Methods Mol. Biol. (2011) 807: 361-404) y Grimm (Methods (2002) 28(2): 146-157), que se incorporan en el presente documento por referencia. Alternativamente, los vectores AAV pueden producirse en células de insecto usando un sistema de expresión de baculovirus (BEVS). El sistema de baculovirus inicial para la producción de rAAV fue descrito por Urabe y col. (Urabe y col. [2002] Human Gene Therapy 13(16):1935-1943) y consiste en tres baculovirus, a saber, Bac-Rep, Bac-cap y Bac-vec, cuya coinfección en células de insecto, por ejemplo, SF9 dio como resultado la generación de rAAV. Las propiedades de dicho rAAV producido, es decir, las características físicas y moleculares, incluyendo la potencia, no diferían significativamente del rAAV generado en células de mamífero (Urabe [2002]supra).El sistema inicial de baculovirus de Urabe (2002,supra)se ha seguido desarrollando (véase, por ejemplo, Kohlbrenner y col. (2005) Molecular Therapy 12 (6): 1217-1225; Urabe y col. (2006) Journal of Virology 80(4):1874-1885; WO 2007/046703; WO 2007/148971; WO 2009/014445 y WO 2009/104964).

[0012] El término transgén se usa para referirse a un ácido nucleico no natural con respecto a la secuencia de ácido nucleico del AAV. Se usa para referirse a un polinucleótido que puede introducirse en una célula u organismo. Los transgenes incluyen cualquier polinucleótido, tal como un gen que codifica un polipéptido o proteína, un polinucleótido que se transcribe en un polinucleótido inhibidor o un polinucleótido que no se transcribe (por ejemplo, que carece de un elemento de control de la expresión, tal como un promotor que dirige la transcripción). Un transgén se inserta preferiblemente entre secuencias repetidas terminales invertidas (ITR). Un transgén también puede ser una construcción de expresión que comprende un elemento regulador de la expresión tal como un promotor o secuencia reguladora de la transcripción operativamente unido a una secuencia codificante y una secuencia de terminación 3'.

[0013] "Transducción" se refiere a la transferencia de un transgén a una célula hospedadora receptora por un vector viral. La transducción de una célula diana por un vector rAAV de la invención conduce a la transferencia del transgén contenido en ese vector a la célula transducida. "Célula hospedadora" o "célula diana" se refiere a la célula en la que tiene lugar la administración de ADN, tal como, por ejemplo, los sinoviocitos o células sinoviales de un individuo. Los vectores AAV son capaces de transducir células tanto en división como no en división.

[0014] "Gen" o "secuencia codificante" se refiere a una región de ADN o ARN que "codifica" una proteína particular. Una secuencia codificante se transcribe (ADN) y se traduce (ARN) en un polipéptido cuando se pone bajo el control de una región reguladora apropiada, tal como un promotor. Un gen puede comprender varios fragmentos unidos operativamente, tales como un promotor, una secuencia líder 5', un intrón, una secuencia codificante y una secuencia 3' no traducida, que comprende un sitio de poliadenilación o una secuencia señal. Un gen quimérico o recombinante es un gen que no se encuentra normalmente en la naturaleza, tal como un gen en el que, por ejemplo, el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o toda la región de ADN transcrita. "Expresión de un gen" se refiere al proceso en el que un gen se transcribe en un ARN y/o se traduce en una proteína activa.

[0015] La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" se pueden determinar mediante la alineación de dos péptidos o dos secuencias de nucleótidos usando algoritmos de alineación globales o locales, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento global (por ejemplo, Needleman Wunsch) que alinea las secuencias de manera óptima a lo largo de toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineamiento local (por ejemplo, Smith Waterman). De este modo, las secuencias pueden denominarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando (al alinearse de manera óptima, por ejemplo, mediante los programas GAP o BESTFIT usando parámetros por defecto) comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define a continuación). GAP usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias a lo largo de toda su longitud (longitud completa), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. Se usa adecuadamente un alineamiento global para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares. Por lo general, se usan los parámetros por defecto de GAP, con una penalización por creación de hueco = 50 (nucleótidos) / 8 (proteínas) y una penalización por extensión de hueco = 3 (nucleótidos) / 2 (proteínas). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación por defecto usada es nwsgapdna, y para las proteínas la matriz de puntuación por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Los alineamientos de secuencia y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencia pueden determinarse usando programas informáticos, tales como el paquete gcG Wisconsin, versión 10.3, disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121 3752 EE.UU., o usandosoftwarede código abierto, tal como el programa "needle" (usando el algoritmo global Needleman Wunsch) o "water" (usando el algoritmo local de Smith Waterman) en la versión 2.10.0 de EmbossWIN, usando los mismos parámetros que para GAP descritos anteriormente, o usando los ajustes por defecto (tanto para "needle" como para "water" y para alineamientos tanto de proteínas como de ADN, la penalización por apertura de hueco por defecto es 10,0 y la penalización por extensión de hueco por defecto es 0,5; Las matrices de puntuación por defecto son Blossum62 para proteínas y DNAFull para DNA). Cuando las secuencias tienen longitudes globales sustancialmente diferentes, los alineamientos locales requieren claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa, por lo tanto, "al menos un/a”.

[0016] La palabra "aproximadamente" o "alrededor de", cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10, alrededor de 10), significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado de 10 más o menos un 10 % del valor.

[0017] Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.

Descripción detallada de la invención

[0018] Como se ha dicho, sorprendentemente se descubrió que, en particular para los vectores de terapia génica AAV5, los pacientes humanos que tienen anticuerpos anti AAV5 preexistentes endémicos pueden considerarse aptos para el tratamiento. Esto contrasta con la creencia general de que la presencia de anticuerpos anti AAV preexistentes contra un serotipo particular descarta el tratamiento por terapia génica con dicho serotipo. Sin ceñirse a la teoría, AAV5 puede ser un serotipo para el cual los títulos de anticuerpos anti AAV5 preexistentes endémicos como se encuentran en la población humana son relativamente bajos en comparación con otros serotipos. Esto puede deberse a la vía de infección, que puede ser diferente entre serotipos, y/o puede ser con o sin coinfección de un virus auxiliar. Además, AAV5 es más divergente de otros serotipos de a Av de primate y está mas separado de estos desde el punto de vista filogenético, lo que también puede contribuir a ello. Independientemente de lo que se encuentre en la raíz de la presente invención, esta permite que la mayoría, si no toda, la población humana sea apta para el tratamiento con terapias génicas basadas en serotipos de AAV5 o similares. Esto incluye el subconjunto de la población humana que da negativo con respecto a los anticuerpos anti AAV5, y también el subconjunto de la población humana que da positivo con respecto a los anticuerpos anti AAV5, sin incluir el subconjunto (actualmente) muy menor de la población humana que se ha sometido a un tratamiento de terapia génica con AAV5 o similar. En la población humana que se ha sometido a un tratamiento de terapia génica con AAV5, se observan títulos tan altos de anticuerpos anti AAV5 (aproximadamente 104 o más en comparación con los seres humanos infectados por AAV5 endémicamente) que se cree que no son aptos para el tratamiento con vectores de terapia génica AAV5 o similares.

[0019] Se ha secuenciado el genoma completo de AAV5 y otros serotipos de AAV (Chiorini y col. 1999, J. of Virology Vol. 73, N.° 2, p1309-1319) y la secuencia de nucleótidos está disponible en GenBank (N.° de acceso. AF085716; 23 de febrero de 2015; SEQ ID N.°: 7). Se entiende que los vectores de terapia génica basados en AAV5 naturales comprenden al menos proteínas de la cápside de AAV5 que comprenden las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 correspondientes a dicha secuencia de aminoácidos o al menos sustancialmente idénticas. Sustancialmente idénticas incluye que tengan al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con ella. Tales secuencias pueden ser secuencias de origen natural de virus AAV que, desde una perspectiva filogenética, pertenecen al clado AAV5.

[0020] Un "serotipo" se define tradicionalmente sobre la base de una falta de reactividad cruzada entre anticuerpos para un virus en comparación con otro virus. Tales diferencias de reactividad cruzada normalmente se deben a diferencias en las secuencias de proteínas de la cápside/determinantes antigénicos (por ejemplo, debido a las diferencias de secuencias de VP1, VP2 y/o VP3 de los serotipos de AAV). Según la definición tradicional, un serotipo significa que el virus de interés se ha probado con suero específico para todos los serotipos existentes y caracterizados para detectar la actividad neutralizante y no se han encontrado anticuerpos que neutralicen el virus de interés. A medida que se descubren más aislados de virus de origen natural y se generan mutantes de la cápside, puede haber o no diferencias serológicas con cualquiera de los serotipos existentes actualmente. Por conveniencia, los serotipos de AAV5 incluyen AAV con modificaciones de la secuencia de la cápside que no se han caracterizado por ser un serotipo distinto, que también puede constituir un subgrupo o variante del serotipo de AAV5. Tales variantes tienen en general una identidad de secuencia sustancial.

[0021] También pueden contemplarse secuencias de la cápside no naturales de acuerdo con la invención, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos expuestas al suero (expuestas al mundo exterior) pueden derivarse de un serotipo, mientras que las secuencias de aminoácidos no expuestas dentro de una cápside pueden ser de otros serotipos y/o permitir más variación. Como la estructura cristalina de AAV5 (por ejemplo, Govindasamy y col. J. Virol. Oct. 2013, vol. 87 no 20; 11187-11199) es conocida, las secuencias que no están expuestas y, por ejemplo, en el interior de la cápside de AAV5, pueden intercambiarse por secuencias de otros serotipos y/o permitir más variación de secuencia. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de VP1 no contenida en VP2 y VP3 está situada en el interior. Esta secuencia puede ser, por ejemplo, del serotipo 2, mientras que las secuencias de aminoácidos de VP2 y VP3 pueden basarse completamente en AAV5. Dicha cápside de vector de terapia génica AAV5 es indistinguible desde una perspectiva de serotipo y una perspectiva de anticuerpo neutralizante de una cápside de tipo completamente natural (véase, entre otros, W02000028004 y Urabe y col. J Virol, febrero de 2006, vol. 80, N.° 4 pp.1874-1885). Tales secuencias de la cápside no naturales son secuencias híbridas, y también se entiende que tales vectores híbridos son vectores de terapia génica AAV5 de acuerdo con la invención.

[0022] Se entiende que los vectores AAV5, o vectores de terapia génica AAV5, de acuerdo con la invención se refieren a una cápside de vector AAV5, que abarca un genoma de vector que tiene un gen de interés comprendido entre repeticiones invertidas de AAV, que pueden ser ITR de AAV5, pero no necesariamente. Por lo tanto, los vectores AAV5 de acuerdo con la invención son vehículos de administración que deben administrar su carga útil, un genoma de vector que tiene un transgén, por ejemplo, un transgén que debe ser beneficioso para el ser humano, en sus células diana, por ejemplo, células hepáticas o células del músculo cardíaco. Por lo tanto, los vectores AAV5 pueden considerarse de uso en un tratamiento médico de un ser humano, por ejemplo, un paciente humano que padece una enfermedad que puede mejorar gracias a la administración del transgén. Como se muestra en los ejemplos, el transgén puede ser FIX, o variantes, tales como el mutante de Padua de este, pero el transgén no es limitativo de ninguna manera y se pueden contemplar transgenes adicionales en la invención como se describe en el presente documento. Además, en una forma de realización adicional, el paciente humano puede ser un paciente humano de sexo masculino.

[0023] Puede contemplarse que el tratamiento previo con un tratamiento de terapia génica con AAV puede no estar restringido únicamente a AAV5, sino que puede incluir también el tratamiento con otros serotipos, por ejemplo, el serotipo 8. Para tales sujetos, puede contemplarse incluir un ensayo o prueba de NAb o TAb como se describe en la sección de ejemplos para confirmar que el título de NAb o TAb en el suero se mantiene dentro del rango que se observa en pacientes humanos sin tratamiento previo.

[0024] En otra forma de realización, se proporciona un vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano, donde dicho ser humano se somete a un cribado previo con un ensayo para determinar sus anticuerpos anti AAV5 y donde dicho ser humano no se ha sometido a ningún tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 antes de dicho tratamiento médico, donde dicho ser humano tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 correspondiente a como máximo el percentil 95 de los niveles de anticuerpo anti AAV5 observados en la población humana, y donde dicho ser humano dio positivo para anticuerpos anti AAV5. En esta forma de realización, un paciente humano que puede beneficiarse de un tratamiento de terapia génica se preselecciona con un ensayo de anticuerpos anti AAV5. Como se muestra en la sección de ejemplos, el rango de niveles de anticuerpos anti AAV5 observados en la población humana, es decir, el rango de niveles de anticuerpos anti AAV5 observados es de aproximadamente 0, o aproximadamente 1, a aproximadamente 10000.

[0025] El n-ésimo percentil en el presente documento se define normalmente como la proporción de la población humana, n %, que está dentro de una distribución del 0 % al n % que tiene un nivel de anticuerpo anti AAV5 determinado mediante un ensayo de NAb o ensayo de TAb tal como, por ejemplo, se describe en los ejemplos. Por ejemplo, cuando un paciente humano de una población (no antes de ser tratado con un vector AAV5) tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 determinado mediante un ensayo de NAb como se describe en los ejemplos, el nivel de anticuerpos anti AAV5 detectado en toda la población debe ser como máximo de 10000, ya que se estima que se incluirá hasta aproximadamente el 100 % de la población humana. Puede preferirse tratar a un paciente humano cuando tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 de hasta el percentil 95, que corresponde a un nivel de NAb determinado mediante un ensayo tal como se describe en los ejemplos de como máximo 4500. Puede preferirse tratar a un paciente humano cuando tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 de hasta el percentil 93 o el percentil 90, que corresponde a un nivel de NAb determinado mediante un ensayo tal como se describe en los ejemplos de como máximo 3000 o 1000, respectivamente (véase la figura 3). De acuerdo con otra forma de realización, puede preferirse tratar a un paciente humano cuando tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 de hasta el percentil 94, 93, 92, 91, 90, 80 o 70. Sin embargo, puede anticiparse que la mayoría de la población, si no la totalidad, es apta para el tratamiento independientemente del título de anticuerpos anti AAV5. Como se muestra en la sección de ejemplos, cualquier ensayo de anticuerpos anti AAV5 es suficiente, es decir, se puede utilizar un ensayo de NAb o un ensayo de TAb o similares para determinar los títulos de anticuerpos de la población humana para determinar el percentil 95, 93 o 90. La población humana seleccionada sigue siendo la misma, mientras que los valores reales en los títulos pueden variar (hasta 10000 para el ensayo de NAb de los ejemplos o hasta 5 para el ensayo de TAb). Esto se debe a que los valores de los títulos observados son simplemente un número que solo tiene relevancia cuando se pone en perspectiva de los títulos en una población. Se entiende que, en cualquier caso, los niveles de títulos de anticuerpos anti AAV5 determinados en la población se refieren a una población humana de al menos 50 seres humanos, como se describe en la sección de ejemplos.

[0026] Por lo tanto, en una forma de realización adicional, se proporciona un vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano, donde dicho ser humano se somete a un cribado previo con un ensayo para determinar anticuerpos anti AAV5 y donde dicho ser humano no se ha sometido a ningún tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 antes de dicho tratamiento médico, donde dicho ser humano tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 determinado mediante un ensayo ELISA de NAb tal como se describe en los ejemplos correspondiente a como máximo el percentil 95 de los niveles de anticuerpos anti AAV5 tal como se observan en la población humana, y donde dicho ser humano dio positivo para anticuerpos anti AAV5. De acuerdo con otra forma de realización, puede preferirse tratar a un paciente humano cuando tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 de hasta el percentil 94, 93, 92, 91 , 90, 80 o 70.

[0027] Se entiende que, de acuerdo con la invención, ahora la subpoblación de la población humana que previamente no se había considerado apta para el tratamiento con AAV5 se consideraría apta para el tratamiento con un vector de terapia génica AAV5, a pesar de dar positivo en las pruebas en un ensayo de anticuerpos anti AAV5. Por lo tanto, en una forma de realización adicional, se proporciona un vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano, donde dicho ser humano dio positivo para cuerpos anti AAV5, y donde dicho ser humano no se ha tratado previamente con AAV5 o similares.

[0028] Se conocen medios y métodos en la técnica que pueden reducir los niveles de anticuerpos en la sangre y, de este modo, reducir también los niveles de anticuerpos anti AAV5. Tales tratamientos extracorpóreos de la sangre en los que se eliminan anticuerpos de la sangre pueden emplearse para reducir los títulos de anticuerpos anti AAV5 en la sangre para conseguir los mismos niveles observados a partir de la exposición endémica, es decir, en población humana endémica sin tratar. Tales métodos son conocidos en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, la plasmaféresis (Chicoine y col., Mol Ther 2014, vol. 22 n.° 2338-347).

[0029] En otro aspecto de la invención, dicho vector de terapia génica AAV5 como se ha descrito anteriormente se administra en una dosis correspondiente a al menos 1012 cápsides/kg de peso corporal. Se entiende que la observación que se ha hecho con respecto a la presencia de anticuerpos anti AAV5 puede ser dependiente de la dosis. En otras palabras, a las dosis empleadas, la concentración y/o cantidad de anticuerpos anti AAV5 no perjudica la transducción. La cantidad de vector de terapia génica AAV5 administrada a un paciente humano en un tratamiento con el fin de obtener, por ejemplo, un nivel significativo de expresión transgénica está muy por encima de los anticuerpos anti AAV5 presentes en la sangre. Desde esta perspectiva, puede no plantearse un límite superior. Sin embargo, un límite superior que puede plantearse es a una dosis correspondiente a como máximo 1016 cápsides/kg de peso corporal. Se entiende que las dosis pueden establecerse en dosis por paciente o dosis por volumen sanguíneo. Una dosis de al menos 1012 cápsides/kg de peso corporal se traduce en aproximadamente 1014 cápsides por paciente o aproximadamente 1013 cápsides/L volumen sanguíneo de un paciente, basado en un peso corporal medio de aproximadamente 85 kg y un volumen sanguíneo medio de 5 l. Por lo tanto, cualquiera que sea el rango de dosis contemplado, puede recalcularse fácilmente en función de estos parámetros. Preferiblemente, la dosis corresponde a al menos 1 x 1012 cápsides/kg de peso corporal, al menos 5 x 1012 cápsides/kg de peso corporal o al menos 1 x 1013 cápsides/kg de peso corporal. La dosis usada en la sección de ejemplos es de aproximadamente 5 x 1013 cápsides/kg de peso corporal y aproximadamente 2 x 1014 cápsides/kg de peso corporal. La cuantificación de AAV de los títulos de partículas de cápside de AAV se determina fácilmente y es ampliamente conocida en la técnica (entre otros, Kohlbrenner y col., Hum Gene Ther Meth. Junio de 2012, Vol. 23, N.° 3: 198-203; Grimm y col., Gene Ther., Vol. 6, N.° 7, p, 1322-1330, 1999).

[0030] La dosis seleccionada también puede basarse en copias genómicas. Copias genómicas (gc) significa la cantidad de genomas de vector contenidos en la preparación de AAV5. El título de gc de una preparación de vector AAV5 puede determinarse fácilmente usando una qPCR que cuantifica una secuencia genómica de vector. Preferiblemente, dicho vector de terapia génica AAV5 se usa a una dosis correspondiente a al menos 1012 gc/kg de peso corporal. Una dosis de al menos 5 x 1011cápsides/kg de peso corporal se traduce en aproximadamente 5 x1012 gc por paciente o aproximadamente 1012 gc/l de volumen sanguíneo de un paciente, basado en un peso corporal medio de aproximadamente 85 kg y un volumen sanguíneo medio de 5 l. Por lo tanto, cualquiera que sea el rango de dosis contemplado, puede recalcularse fácilmente en función de estos parámetros. La dosis seleccionada puede ser de al menos 1 x 1012 gc/kg de peso corporal, al menos 2 x 1012 gc/kg de peso corporal o 4 x 1012 gc/kg de peso corporal. La dosis usada en la sección de ejemplos es de aproximadamente 5 x 1012 gc/kg de peso corporal y aproximadamente 2 x 1013 gc/kg de peso corporal. Aunque puede no haber un límite superior, este puede establecerse de modo que corresponda a una dosis correspondiente con como máximo 1015 gc/kg de peso corporal.

[0031] Como se ha dicho, el vector de terapia génica AAV5 de acuerdo con la invención es para su uso en un tratamiento médico. El transgén contenido dentro del vector viral de AAV de acuerdo con la invención puede no ser una limitación de esta invención. Sin embargo, preferiblemente, y de acuerdo con los ejemplos, el gen terapéutico codifica el factor IX humano, como se describe en Nathwani y col. N Engl J Med 2011; 365(25): 2357 65 y Nathwani y col. B. N Engl J Med 2014; 371(21): 1994-200 y puede incluir variantes de este como se describe en WO2010029178, WO1999003496, WO2015086406 y WO2010012451. En particular, se ha demostrado en la sección de ejemplos que pueden obtenerse cantidades terapéuticamente significativas de proteína con vectores AAV5 que codifican FIX en pacientes humanos. Estos pueden ser útiles, por ejemplo, en el tratamiento de la hemofilia A o la hemofilia B.

[0032] Por consiguiente, para un vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano de acuerdo con la invención, donde dicho vector de terapia génica AAV5 es para su uso en el tratamiento de la hemofilia B, la cantidad de proteína FIX transgénica obtenida en el plasma puede estar en el rango entre aproximadamente 0,02 microgramos/ml hasta aproximadamente 5 ug/ml. El límite superior puede establecerse de modo que corresponda a una dosis correspondiente a como máximo 1015 gc/kg de peso corporal.

[0033] Como se ha dicho, el vector de terapia génica AAV5 de acuerdo con la invención es para su uso en un tratamiento médico. El transgén contenido dentro del vector viral de AAV de acuerdo con la invención puede no ser una limitación de esta invención. Sin embargo, preferiblemente, y de acuerdo con los ejemplos, el gen terapéutico codifica el factor IX humano, como se describe en Nathwani y col. N Engl J Med 2011; 365(25): 2357 65 y Nathwani y col. B. N Engl J Med 2014; 371(21): 1994-200 y puede incluir variantes de este tal como se describe en WO2010029178, WO1999003496, WO2015086406 y WO2010012451, que se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. En particular, se ha demostrado en la sección de ejemplos que se pueden obtener cantidades terapéuticamente significativas de proteína con vectores AAV5 que codifican FIX en pacientes humanos. Estos pueden ser útiles, por ejemplo, en el tratamiento de la hemofilia A o la hemofilia B.

[0034] Por consiguiente, para un vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano de acuerdo con la invención, donde dicho vector de terapia génica AAV5 se usa en el tratamiento de la hemofilia B, la cantidad de proteína FIX transgénica obtenida en el plasma puede estar en el rango de entre aproximadamente 0,02 microgramos/ml hasta aproximadamente 5 ug/ml. Alternativamente, con dicho vector de terapia génica AAV5, cuando se usa en el tratamiento de pacientes con hemofilia B que tienen un fenotipo grave, después del tratamiento se obtiene un fenotipo moderado o leve o incluso un fenotipo como el que se observa en individuos sanos. La hemofilia B puede clasificarse en tres clases, cada una de las cuales se caracteriza por la presencia de diferentes concentraciones plasmáticas de FIX. En la hemofilia B grave, los niveles plasmáticos de actividad de FIX están por debajo del 1 % de lo normal; en la forma moderada, los niveles están entre el 1 % y el 5 %; en la forma leve, entre el 5 y el 25 % de los niveles normales. Existen individuos portadores sanos que tienen niveles medios de actividad FIX, entre el 25 % y el 50 % de los normales, pero muchos portadores pueden tener niveles que superan incluso el 50 %.

[0035] Asimismo, se puede esperar que las cantidades terapéuticamente eficaces de otros genes de interés estén dentro del alcance del experto. Por lo tanto, se prevé que la invención sea útil con cualquier transgén. Los transgenes adecuados adicionales para la administración a un paciente en un vector viral para terapia génica pueden ser seleccionados por los expertos en la técnica. Estas secuencias terapéuticas de ácido nucleico codifican típicamente productos (por ejemplo, proteínas o ARN) para la administración y expresión en un pacientein vivooex vivopara tratar un defecto genético heredado o no heredado, por ejemplo, reemplazando o corrigiendo la deficiencia, para tratar un trastorno o enfermedad epigenética, o para tratar una afección asociada con la desregulación de un producto génico. Tales genes terapéuticos que son deseables para la forma de realización de terapia génica incluyen, sin limitación, un gen receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL-R) para el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar o la hiperlipidemia familiar combinada, el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) para el tratamiento de la fibrosis quística, el alelo de Becker de la DMD para el tratamiento de distrofia muscular de Duchenne y varios otros genes que puede seleccionar fácilmente un experto en la técnica para tratar un trastorno o enfermedad particular. En una forma de realización preferida, el vector de rAAV comprende un transgén que codifica una proteína terapéutica, o un ARN, tal como un miARN. Preferiblemente, la proteína terapéutica se selecciona del grupo que consiste en factor IX (preferiblemente factor IX humano), factor VIII (preferiblemente factor VIII humano), lipoproteína lipasa (LPL; incluyendo mutantes tales como, por ejemplo, LPLS447X; véase WO 01/00220 A2), porfobilinógeno desaminasa (PBGD), receptor de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL-R), regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), el alelo de Becker de la distrofia muscular de Duchenne (DMD), hipoxiluria (AGXT), N-acetil-alfa-D-glucosaminidasa (NaGlu), factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF), S100A1 (también conocido como proteína A1 de unión al calcio S100, que en los seres humanos está codificada por el genS100A1).En una forma de realización preferida, la proteína terapéutica es el factor IX, más preferiblemente el factor IX humano.

[0036] Alternativamente, o en combinación con cualquiera de las formas de realización anteriores, en una forma de realización preferida, la terapia génica es para tratar, prevenir, curar y/o revertir una afección o enfermedad, preferiblemente una denominada enfermedad huérfana, que en el presente documento se entiende que es una enfermedad rara que afecta a un pequeño porcentaje de la población, por ejemplo, a menos de 1 de cada 1500 personas de la población, potencialmente mortal, debilitante de manera crónica y/o sin tratamiento adecuado. Generalmente, una enfermedad huérfana es una enfermedad genética y, por lo tanto, una enfermedad de larga duración incluso si los síntomas no aparecen inmediatamente. En una forma de realización preferida, dicha afección o enfermedad se selecciona del grupo que consiste en deficiencia de lipoproteína lipasa (LPLD), hemofilia B, porfiria aguda intermitente (PAI), síndrome de Sanfilippo B, enfermedad de Parkinson (EP), insuficiencia cardíaca congestiva (ICC), hemofilia A, enfermedad de Huntington, distrofia muscular de Duchenne (DMD), amaurosis congénita de Leber, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (SCID), inmunodeficiencia combinada grave por deficiencia de adenosina desaminasa (ADA-SCID), torrente sanguíneo. De hecho, las vías de administración convencionales y aceptables desde el punto de vista farmacéutico que pueden contemplarse incluyen la administración directa al órgano, tejido o sitio diana (por ejemplo, hígado o el SNC), por vía intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, oral y otras vías de administración parenterales. Sin embargo, un tejido diana preferido que puede contemplarse es el hígado. Por lo tanto, de la manera más preferida, el vector de terapia génica AAV5 administra su transgén al hígado a través de una vía de administración a través del torrente sanguíneo. Como se ha dicho, el vector viral de AAV5 se administra en cantidades suficientes para transfectar las células deseadas y proporcionar niveles suficientes de transducción y expresión del transgén seleccionado para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos o fisiológicos médicamente aceptables que pueden determinar los expertos en las técnicas médicas. Las vías de administración también pueden combinarse, si se desea. Las dosis del vector de rAAV (es decir, el vector de terapia génica de VAA5) dependerán principalmente de factores tales como la afección que se está tratando, el gen seleccionado, la edad, el peso y la salud del paciente y, por tanto, pueden variar entre pacientes.

[0037] El vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano de acuerdo con la invención es preferiblemente un vector de terapia génica AAV5 producido en células de insecto. Sin ceñirse a la teoría, el método de producción puede desempeñar un papel en el perfil de inmunidad asociado con un vector AAV, ya que las cápsides de AAV pueden diferir cuando se producen en células de insecto a partir de cápsides de AAV producidas en células de mamífero. Esta diferencia puede ser con respecto a la glicosilación u otra modificación postraduccional. Además, la producción basada en células de mamífero puede tener la desventaja de que las construcciones de expresión de rep y cap estén contenidas dentro de cápsides de AAV que se administran a los pacientes, dando como resultado la transferencia de construcciones de expresión de rep y cap, aunque en cantidades muy bajas, a los sujetos humanos. La expresión de rep y cap de AAV en un paciente humano puede ser perjudicial desde una perspectiva de inmunidad, en particular en el caso de pacientes humanos que darían positivo con respecto a anticuerpos anti AAV5. Por lo tanto, puede preferirse que el vector viral AAV5 que se va a administrar a pacientes humanos se produzca en células de insecto. La producción basada en células de insecto está ampliamente establecida e incluye, pero no se limita a, medios y métodos como se describe en WO2007046703, WO2007148971, WO2009014445, WO2009104964, WO03042361, WO2008024998, WO2010114948.

[0038] En otra forma de realización, se proporciona un método para determinar pacientes humanos aptos para un tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 que comprende los pasos de:

- proporcionar una muestra de suero de un paciente humano;

- determinar el título de anticuerpos anti AAV5;

- donde los pacientes pueden considerarse aptos para un tratamiento médico si el título de anticuerpos anti AAV5 total tiene un valor en el rango de 0,02-5 determinado mediante un ensayo de anticuerpo anti AAV5 (TAb) total como se describe en los ejemplos.

[0039] Opcionalmente, dicho método comprende posteriormente el paso de:

- administrar al paciente humano apto un vector de terapia génica AAV5. Se entiende que cualquiera de las medidas y límites descritos anteriormente con respecto a las formas de realización relacionadas con el uso médico de los factores de terapia génica de AAV5 también se aplican a cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, para métodos de administración de un vector de terapia génica AAV5 o para la determinación de la aptitud. Preferiblemente, dicho título de anticuerpo anti AAV5 total tiene un valor en el rango de 0,02 - 4, 0,02 - 3 o 0,02 - 2 según se determina con un anticuerpo anti AAV5 (TAb) total según se describe en los ejemplos.

[0040] En otra forma de realización, un método para determinar pacientes humanos aptos para un tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 comprende los pasos de:

- proporcionar una muestra de suero de un paciente humano;

- determinar el título de anticuerpos anti AAV5;

- donde los pacientes pueden considerarse aptos para un tratamiento médico si el título de anticuerpos neutralizantes anti AAV5 tiene un valor en el rango de 3 - 5000 determinado mediante un ensayo de anticuerpos neutralizantes anti AAV5 (NAb) como se describe en los ejemplos.

[0041] Opcionalmente, dicho método comprende posteriormente el paso de:

- administrar a un paciente humano apto un vector de terapia génica AAV5. Preferiblemente, dicho título de anticuerpos anti AAV5 tiene un valor en el rango de 3 - 5000, 3 - 3000 o 3 - 1000 según se determina con un anticuerpo neutralizante anti AAV5 (NAb) según se describe en los ejemplos.

[0042] Se entiende que el criterio de aptitud descrito anteriormente no es el único criterio que puede usarse para seleccionar un tratamiento de terapia génica de AAV5. Por lo tanto, cuando el paciente humano cumple con todos los demás criterios, el criterio del anticuerpo anti AAV5 determina la aptitud del paciente humano.

[0043] En otra forma de realización adicional, se proporciona un método para tratar a un ser humano que comprende administrar una cantidad efectiva de un vector de terapia génica AAV5 a un ser humano que lo necesite;

donde dicho ser humano se somete a un cribado previo con un ensayo para determinar anticuerpos anti AAV5;

donde dicho ser humano no se ha sometido a ningún tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 antes de dicho tratamiento médico;

y donde dicho ser humano tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 correspondiente a como máximo el percentil 95 de los niveles de anticuerpos anti AAV5 observados en la población humana, y donde dicho ser humano dio positivo para anticuerpos anti AAV5.

[0044] En otra forma de realización adicional, se proporciona un método para administrar un gen a un ser humano que comprende administrar una cantidad eficaz de un vector de terapia génica AAV5 a un ser humano que lo necesite;

donde dicho ser humano se somete a un cribado previo con un ensayo para determinar los anticuerpos anti AAV5;

[0045] Alternativamente, o en combinación con cualquiera de las formas de realización anteriores, en una forma de realización preferida, la composición de vector AAV5 comprende además un vehículo, diluyentes, solubilizante, carga, conservante y/o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. El vector de rAAV que lleva un gen terapéutico puede administrarse a un paciente, preferiblemente suspendido en una solución biológicamente compatible o vehículo de administración aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril. Para este fin, pueden emplearse otras soluciones inyectables estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que se sabe que son vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico y son ampliamente conocidas por los expertos en la técnica. El vector viral se administra a un paciente humano en cantidades suficientes como se ha descrito anteriormente para transfectar las células deseadas y proporcionar niveles suficientes de transducción y expresión del transgén seleccionado para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos o fisiológicos aceptables desde el punto de vista médico que pueden determinar los expertos en el ámbito de la medicina.

Ejemplos

Diseño del estudio y participantes

[0046] Se llevó a cabo un estudio de fase 1/2 con aumento escalonado de la dosis, sin enmascaramiento y multinacional que incluía hombres adultos con hemofilia B grave (FIX <1 Ul/dl) o moderada-grave (FIX <2 Ul/dl) que requerían: 1) profilaxis continua con FIX, o 2) FIX a demanda y que tenían >4 sangrados al año o artropatía hemofílica. Pueden encontrarse detalles adicionales del ensayo en el sitio web del NIH clinicaltrials.gov (NCT02396342). El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Revisión/Comité Institucional de Ética de cada centro. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y los principios de la buena práctica clínica.

[0047] Vector AAV5 que incorpora un gen hFIX natural optimizado por codones bajo el control de un promotor específico para el hígado LP1 (Nathwani y col. N Engl J Med 2011; 365(25):

Ejemplos

Diseño del estudio y participantes

[0048] Se llevó a cabo un estudio de fase 1/2 con aumento escalonado de la dosis, sin enmascaramiento y multinacional que incluía hombres adultos con hemofilia B grave (FIX <1 UI/dl) o moderada-grave (FIX <2 UI/dl) que requerían: 1) profilaxis continua con FIX, o 2) FIX a demanda y tenían >4 sangrados al año o artropatía hemofílica. Pueden encontrarse detalles adicionales del ensayo en el sitio web del NIH clinicaltrials.gov (NCT02396342). El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Revisión/Comité Institucional de Ética de cada centro. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y los principios de la buena práctica clínica.

[0049] En el estudio se utilizó un vector AAV5 que incorporaba un gen hFIX natural optimizado por codones bajo el control de un promotor específico para el hígado LP1 (Nathwani y col. N Engl J Med 2011; 365(25): 2357-65 y Nathwani y col. B. N Engl J Med 2014; 371(21): 1994-2004. El vector se fabricó usando un sistema de expresión de baculovirus de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación. Los títulos de copias genómicas del vector (gc) se determinaron usando qPCR. La relación de cápside a gc fue de aproximadamente 10, es decir, la cantidad de cápside fue de aproximadamente diez veces la cantidad de copias genómicas. El título de la cápside se puede determinar mediante cromatografía líquida de exclusión por tamaño de alta resolución (HPL-SEC) con detección de absorción de UV. El método se basa en una columna SEC, que se elige por su capacidad para separar partículas de AAV de componentes de la matriz más pequeños. En el método, se genera una curva de calibración usando una preparación de vector AAV con una concentración de partículas totales conocida. En la curva de calibración, las cantidades de partículas totales inyectadas se representan frente a los datos de respuesta. Usando el área de pico de AAV devuelto y la curva de calibración, la cantidad de partículas de muestra inyectadas se calcula mediante interpolación. El vector AAV5 se administró como una infusión intravenosa periférica única de 30 minutos. Los participantes se trataron en dos cohortes consecutivas con aumento de la dosis: la cohorte 1 (n=5, participantes 1-5) recibió 5*1012 gc/kg y la cohorte 2 (n=5, participantes 6-10) 2*1013 gc/kg. La cohorte 1 consistió en hombres adultos con una edad media de 69 años (35-72) y un peso corporal medio de 84,5 kg (71,2-89,1), la cohorte 2 consistió en hombres adultos con una edad media de 35 años (33-46) y un peso corporal medio de 84,0 kg (71,4-96,0). Las medidas de resultado de la eficacia incluyeron medidas de la actividad plasmática de FIX. Además, se obtuvieron sueros de los sujetos para analizar la titulación de anticuerpos neutralizantes de AAV5 (titulación de NAb) y la titulación de anticuerpos totales de AAV5 (TAb).

[0050] Los sueros de control de donantes sanos se obtuvieron comercialmente de SeraLab (West Sussex, Reino Unido). Toda la información proporcionada relativa a estos sueros se enumera a continuación.

Tabla 1. Donantes sanos.

Título de anticuerpos neutralizantes de AAV5 (NAb)

[0051] La medición de los NAb en suero humano se evaluó basándose en un ensayoin vitrode alta sensibilidad usando AAV5 que llevan el transgén luciferasa (AAV5-luc) y la línea celular de riñón embrionario humano HEK293T (ATCC 11.268). La expresión transgénica se revela mediante la adición de un análogo de luciferina. Materiales utilizados:

[0052]

- Células HEK293T (HEK293T/ATCC 11.268)

- DMEM con rojo fenol (Gibco, REF# 31966)/FBS al 10 % (Greiner, REF# 758093)/PenStrep al 1% (Gibco, REF# 15140)

- DMEM sin rojo fenol (Gibco, REF# 21063) /1% Pen-Strep (Gibco, REF# 15140)

- 1xPBS-/- (Gibco, REF# 14190)

- 1x Tripsina-EDTA (Gibco, REF# 25200)

- Solución de poli-L-lisina (PLL) (2,5 %) (Sigma-Aldrich, REF# 8920-100)

- Placas de cultivo negras de fondo plano de 96 pocillos (costar, REF # 3916)

- Placas transparentes de fondo plano de 96 pocillos (corning, REF # 3596)

- Sistema de ensayo de luciferasa ONE-Glo (Promega, REF# E610)

- Tampón de lisis Glo, 1x (Promega, REF# E2661)

- Se usó AAV5-CMV-luc (por ejemplo, AAV5-CMV-73QlucHtt de PKO, título: 4e13 gc/ml)

[0053] Básicamente, las células se sembraron en placas negras de 96 pocillos y placas transparentes de 96 pocillos añadiendo 100 pl/pocillo de células HEK293T en DMEM (con rojo fenol/FBS al 10 % y P/S (penicilina/estreptomicina) al 1 %) a una concentración de 0,5 x 105células/pocillo. Las células se incubaron durante la noche.

[0054] Al día siguiente, se prepararon diluciones en serie de plasma en placas transparentes de 96 pocilios en medio (DMEM/PS al 1% sin rojo fenol/FBS al 10 %). Las diluciones de plasma finales, después de la adición de virus (véase más adelante), que se obtuvieron fueron 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 y 1024.

[0055] Se prepararon diluciones añadiendo 140 pl de medio a los pocillos designados A2-A1 1 (pocillos de control negativo), y se añadieron 70 pl de medio al resto de las filas en las columnas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 de la placa y a la fila H2-H11 (control positivo). Se añadieron muestras de plasma a los pocillos B2, C2, D2, E2, F2, G2 (140 pl/pocillo), lo que dio como resultado la primera dilución: 1. A continuación, se realizaron diluciones en serie de plasma a través de la placa transfiriendo 70 pl de la columna 2 a la columna 3 (dilución 2), de la 3 a la 4 (4), de la 4 a la 5 (8), de la 5 a la 6 (16), de la 6 a la 7 (32), de la 7 a la 8 (64), de la 8 a la 9 (128), de la 9 a la 10 (256), de la 10 a la 11 (512) y después se desecharon 70 pl de la columna 11. Se preparó AAv5-CMV-73QlucHtt en medio (DMEM/PS al 1% sin rojo fenol/FBS al 10 %) a 6*109 gc/ml. A continuación, se añadieron 70 pl/pocillo de 6*109 gc/ml de dilución del virus AAV5(160)-CMV-73QlucHtt a las placas de dilución de plasma, excluyendo los pocillos A2-A11 (controles negativos). Las placas se colocaron con cuidado en un agitador de placas durante 2 min a 300 r.p.m. Las placas se incubaron después durante 1 h a 4 grados Celsius.

[0056] El medio de cultivo se retiró de las placas negras de 96 pocillos que se habían preparado los días anteriores (con las células HEK293T) y se reemplazaron las diluciones de plasma preparadas pipeteándolas desde las placas transparentes hasta placas negras con células Hek293T a un volumen de 100 pl/pocillo. Estas placas se incubaron durante 16-20 h a 37 °C. Al día siguiente, las células se equilibraron a temperatura ambiente y se retiró el medio. Las células se enjuagaron una vez con PBS-/- 1X (100 pl/pocillo) después de lo cual se añadieron 100 pl/pocillo de tampón de lisis Glo a las placas y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir que se produjera la lisis. Después de esto, se añadieron 100 pl/pocillo de reactivo del sistema de ensayo de luciferasa ONE-Glo (el reactivo se preparó según las instrucciones del fabricante). Después de al menos 3 minutos, las placas se midieron usando el protocolo ONE-Glo en la máquina GloMax Discover. El título de anticuerpos neutralizantes anti AAV5 se determinó con el uso de análisis desoftwareLabKey, que calcula el porcentaje de neutralización para cada dilución en suero después de restar la actividad de fondo, y luego ajusta una curva al perfil de neutralización. A continuación, usa esta curva para calcular los títulos de anticuerpos neutralizantes para las estimaciones de punto de referencia elegido, área bajo la curva (AUC) y errores. El método de cuatro parámetros se usó para calcular los ajustes de curva. LabKey calcula la CI50, la dilución a la que los anticuerpos inhiben la transducción en un 50 %. LabKey también calcula títulos "basados en puntos" de acuerdo con Johnson y Byington, Techniques in HIV Research. Nueva York, N.Y.: Stockton Press, 1990: 71-76. Esto se hace interpolando linealmente entre las dos réplicas a cada lado del porcentaje de neutralización elegido como referencia. Cada serie incluía controles positivos (pocillos sin suero de muestra pero con AAV5-LUC), controles negativos (pocillos que solo tenían medio, sin suero de muestra y sin AAV5-LUC) y suero de muestra de control negativo (F<b>S inactivado por calor) para evaluar la especificidad de la neutralización de AAV5-LUC. El FBS no debe tener propiedades neutralizantes anti AAV5 cuando se mide como muestra.

Título de anticuerpos anti AAV5

[0057] La cuantificación de Abs humanos totales contra AAV5 se basó en un ensayo ELISA usando la cápside específica para recubrir la placa. La presencia de Abs humanos totales específicos contra la cápside de AAV5 se reveló usando Proteína A Peroxidasa. Se recubrieron placas ELISA (placa Nunc MaxiSorp. Ref: 456537, Thermo Scientific) con antígeno (cap de AAV5) a razón de 100 ng/pocillo en tampón carbonato durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con PBS tween-20 (PBSt) para eliminar el resto del antígeno y se bloquearon con solución de bloqueo (PBS FBS al %) para evitar la unión no específica. Después de lavarlas tres veces con 200 pl de PBSt, se añadieron diluciones de suero humano en PBSt, comenzando con 1:9 seguido de una serie de diluciones de 1:3 en un volumen final de 100 pl. Todas las muestras se analizaron por duplicado. Se incluyeron controles negativos sin suero humano en cada placa. Las diluciones de suero se incubaron durante 2 h a 37 °. Después de esto, se retiró el suero, la placa se lavó tres veces con PBSt y se añadieron 100 pl de proteína A peroxidasa diluida a 1:10000 en solución de bloqueo durante una hora. La placa se lavó tres veces con PBSt y la reacción se reveló con sustrato TMB y se detuvo 30 min más tarde con H2SO42N. La absorbancia se leyó a 450 nm en un lector de microplacas. El título total de anticuerpos se calculó como la dilución en suero, que tenía una absorbancia cinco veces mayor que el control negativo.

Resultados y comentarios

[0058] Los pacientes humanos de ambas cohortes presentaron todos mejoras significativas en la actividad de FIX, con la mayoría de los pacientes humanos mejorando por un cambio en el fenotipo de grave a leve (tabla 2), dando como resultado una reducción sustancial o incluso la ausencia de uso de la administración profiláctica de proteína FIX. Se observó variación entre los niveles de actividad de FIX observados entre pacientes y entre cohortes. La variación en los niveles de actividad de FIX no se correlacionó con el estado de NAb o TAb de los pacientes humanos.

[0059] La prevalencia de TAb contra AAV5 que se había hecho constar previamente (40 %, Boutin y col. Hum Gene Ther. junio de 2010 21(6):704-712) corresponde aproximadamente a los resultados del análisis actual (30 %). Los resultados obtenidos con el ensayo de NAb basado en luciferasa (véanse las figuras 1 y 2) sugieren que la prevalencia de anticuerpos AAV5 (neutralizantes) es similar, ya que se devolvió una señal positiva para 14 de los 50 sueros de control cribados (28 %) que corresponde con estudios recientes (Li C y col.Gene Ther. Marzo de 2012; 19(3):288-94). Los resultados de los sueros obtenidos de los pacientes humanos antes del tratamiento de terapia génica también corresponden con estos, con 3 de 10 sueros dando positivos tanto en el ensayo de NAb como en el ensayo de Tab (30 %). Los anticuerpos totales evaluados por ELISA y los anticuerpos neutralizantes evaluados por el ensayo basado en luciferasa se correlacionan estrechamente, lo que sugiere que ambos ensayos detectan la misma entidad (véase la figura 2A).

[0060] Además, también se analizó la presencia de títulos de anticuerpos neutralizantes después del tratamiento y se observó que estaban en el rango de aproximadamente 106 y por encima. Por lo tanto, los títulos de anticuerpos que se encontraron en seres humanos sin tratar, adquiridos endémicamente, divergen mucho del rango de títulos observados en pacientes humanos que se sometieron a una terapia génica basada en AAV5. Además, los pacientes con NAb de AAV5 preexistentes demostraron un rápido aumento en la IgG tras la administración de AAV-FIX característico de un refuerzo inmunitario, en contraste con los pacientes sin NAb, que mostraron un aumento rápido y transitorio de la IgM seguido de un aumento en la IgG típico de la primera exposición a un antígeno. Además, no hubo evidencia de un aumento de AFT (alanina aminotransferasa) o activación de linfocitos T específicos de la cápside en pacientes tratados con NAb preexistentes. Por lo tanto, la administración de terapia génica basada en AAV5 en pacientes con NAb preexistentes adquiridos endémicamente se toleró bien sin aumento de ALT o activación de linfocitos T.

[0061] Para concluir, la presencia de anticuerpos anti AAV5, detectadain vitrotanto mediante el ensayo de NAb como mediante el ensayo de TAB, no fue predictiva ni indicativa de alteración de la transducciónin vivo.No hubo correlación evidente entre la presencia de Nab antes de la terapia y los niveles de FIX después de la terapia resultante de la transferencia génica de FIX de AAV5. Sorprendentemente, el respondedor más alto de la cohorte 1, que recibió la dosis más baja del vector AAV5, también tuvo el nivel más alto de anticuerpos NAb y TAb detectado. El rango de títulos anti AAV5 observados en la población sana indica que los niveles de anticuerpos en la población sana, que no se ha sometido a un tratamiento de terapia génica con AAV5, no perjudican a la transducción con AAV5in vivo.Esto se debe a que el título más alto observado en la población sana está cerca del rango del título más alto observado en el paciente 5 de la cohorte 1. Por lo tanto, se considera factible que no se requiera la prueba de la presencia o ausencia de anticuerpos anti AAV5 en una población no tratada antes del tratamiento con un vector de terapia génica AAV5.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano, donde dicho ser humano se somete a un cribado previo con un ensayo para determinar los anticuerpos anti AAV5, donde dicho ser humano no se ha sometido a ningún tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 antes de dicho tratamiento médico, donde dicho ser humano tiene un nivel de anticuerpos anti AAV5 correspondiente a como máximo el percentil 95 de los niveles de anticuerpos anti AAV5 observados en la población humana, y donde dicho ser humano dio positivo para anticuerpos anti AAV5.

2. Vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano según la reivindicación 1, donde dicho vector de terapia génica AAV5 se administra a una dosis correspondiente a al menos 1012 cápsides/kg.

3. Vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano según la reivindicación 1 o 2, donde dicho vector de terapia génica AAV5 se usa a una dosis correspondiente a al menos 1012 gc/kg de peso corporal.

4. Vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho vector de terapia génica AAV5 se usa en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en hemofilia A o hemofilia B.

5. Vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho vector de terapia génica AAV5 se usa en el tratamiento de la hemofilia, donde el vector de terapia génica AAV5 codifica una proteína FIX o una variante de la misma.

6. Vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho uso comprende la administración en el torrente sanguíneo.

7. Vector de terapia génica AAV para su uso en un tratamiento médico de un ser humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho uso comprende la administración del vector al hígado.

8. Vector de terapia génica AAV5 para su uso en un tratamiento médico de un ser humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho vector de terapia génica AAV5 se produce en células de insecto.

9. Método para determinar pacientes humanos aptos para un tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 que comprende los pasos de:

- determinar el título de anticuerpos anti AAV5 en una muestra de suero obtenida de un paciente humano - donde los pacientes pueden considerarse aptos para un tratamiento médico si el título de anticuerpos anti AAV5 totales tiene un valor en el rango de 0,02-5 determinado mediante un ensayo anti AAV5 (TAb) total como se describe en los ejemplos.

10. Método para determinar pacientes humanos aptos para un tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5 que comprende los pasos de:

- determinar el título de anticuerpos anti AAV5 en una muestra de suero obtenida de un paciente humano - donde los pacientes pueden considerarse aptos para un tratamiento médico si el título de anticuerpos anti AAV5 tiene un valor en el rango de 3 - 5000 determinado mediante un ensayo de anticuerpos anti AAV5 neutralizantes como se determina por el ensayo de NAb como se describe en los ejemplos.

11. Método para determinar pacientes humanos aptos para un tratamiento médico con un vector de terapia génica AAV5, donde el método comprende seleccionar un paciente humano que no se ha sometido a ningún tratamiento de terapia génica de AAV5 previo y que no se ha sometido a ningún cribado previo con un ensayo para determinar los anticuerpos anti AAV5.