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KR102729701B1 - 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물 - Google Patents

불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물 Download PDF

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KR102729701B1
KR102729701B1 KR1020210079371A KR20210079371A KR102729701B1 KR 102729701 B1 KR102729701 B1 KR 102729701B1 KR 1020210079371 A KR1020210079371 A KR 1020210079371A KR 20210079371 A KR20210079371 A KR 20210079371A KR 102729701 B1 KR102729701 B1 KR 102729701B1
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botulinum toxin
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stem cells
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김윤배
최은경
김태명
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 기능성 조성물은 콜라겐 및 엘라스틴의 분해를 억제하는 동시에 합성을 촉진하고, 주름을 개선시키며, 세포의 재생을 촉진함으로써, 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제 및 주름발생 억제 등을 위한 기능성 소재나 창상 치료 용도에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물{FUNCTIONAL COMPOSITION COMPRISING EXOSOME-RICH CONDITIONED MEDIUM OF IMMORTALIZED STEM CELLS AND BOTULINUM TOXIN}
본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체를 보호하거나 방어하는 1차 기관이면서, 신체 표면을 전체로 덮고 있는 가장 넓은 기관으로 표피, 진피 및 피하조직으로 구성된다. 이 중에서도 표피의 가장 바깥층에 위치하는 각질층은 각질과 지질로 구성되어 있으면서 유해물질의 침투나 수분증발을 억제하고, 박테리아나 외부 자극으로부터 인체를 보호한다. 각질층은 2주를 주기로 탈피되어 새로 형성된다.
피부는 다양한 스트레스 요인이나 자외선과 같은 자극에 의해 손상이 종종 일어나는데, 이와 같이 피부손상을 유도하는 인자들에 의해 각질층 및 지질층이 손상되고 경피 수분손실이 급격히 증가한다. 뿐만 아니라, 피부건조, 주름생성, 가려움증, 세균감염에 따른 염증이 발생하기도 한다. 사람의 각질형성 세포는 외부의 자극에 의해 IL-1α를 시작으로 IL-6, IL-8, TNF-α 등 다양한 사이토카인을 만들어 방출할 수 있는데, 이러한 사이토카인은 피부의 자극유발이나 국소적인 염증반응을 매개한다.
특히 자외선과 같은 외부자극에 의한 각질층의 손상이 반복되거나, 정상적인 각질층의 복원이 지연되면 피부노화가 가속화되면서 피부질환으로 진행될 수 있다. 외부손상에 의한 각질층의 신속한 복원은 피부건조, 피부노화, 가려움 등을 경감시킬 수 있으며, 이는 사람 각질형성세포의 정상적인 분화 및 증식을 유도하는 피부재생을 촉진함으로써 예방할 수 있다. 피부재생은 조직의 손상 크기나 정도에 따라 그 치유 기간이 달라진다. 치유는 지혈, 염증, 증식 및 리모델링의 4가지 개발적 과정이 순차적으로 조절되어 일어나는 과정이며 다양한 세포의 상호작용, 성장인자 및 사이토카인이 요구된다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-2214378호는 피부 재생, 주름 개선, 항염증 또는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 컴플라나토사이드 에이(complanatoside A)가 피부 섬유아세포의 콜라겐 총량을 증가시키고, 콜라게나제 활성을 억제하며 피부 재생 또는 주름 개선 효과를 높이고, 산화질소 생성을 억제하여 항염증 효과를 나타내며, 멜라닌 총량을 감소시켜 미백 효과를 나타냄으로써, 약학적 조성물, 피부외용제, 화장료 조성물 또는 건강기능식품으로 사용할 수 있음을 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-2214378호
본 발명의 목적은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM) 및 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 유효성분으로 포함하는 제1 조성물, 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 제2 조성물을 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 기능성 조성물은 콜라겐 및 엘라스틴의 분해를 억제하는 동시에 합성을 촉진하고, 주름을 개선시키며, 세포의 재생을 촉진함으로써, 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제 및 주름발생 억제 등을 위한 기능성 소재나 창상 치료 용도에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀 표지자인 CD9을 확인한 결과 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자의 함량을 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 배양액 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 콜라겐 분해효소 MMP-1의 활성 억제 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 활성 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 엘라스틴 분해효소 MMP-12의 활성 억제 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 활성 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 배양 조건 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 엘라스틴 합성 촉진 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 배양 조건 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 피부 주름 개선 효과를 촬영한 결과 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 피부 주름 개선 효과를 정량적으로 나타낸 결과 그래프이다(*표시는 UVB로 유발된 피부주름 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 피부 재생 효과를 촬영한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM) 및 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, '줄기세포(stem cell)'는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로서 특정 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력을 기준으로 만능줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 또는 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)로 나눌 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 기원이 되는 세포에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 성체 줄기세포(adult stem cell) 또는 인간 체세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로 구분될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 용어, 성체 줄기세포는 성체의 조직 또는 기관에 존재하고, 원하는 세포로 분화가 가능하며 자기복제(self-renew)를 할 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 일례로, 본 발명에 따른 줄기세포는 양수 유래 성체줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '불멸화(immortalization)'는 세포의 계대배양 과정에서 정상적인 세포 노화 및 파멸의 과정을 거치지 않고 지속적으로 증식할 수 있는 세포를 의미한다. 일반적으로, 세포는 계대배양하는 과정에서 증식능이 떨어지고 배양액 내 유효성분의 함량이 감소하는데, 불멸화된 세포는 증식능 및 배양액 내 유효성분의 함량을 일정하게 유지할 수 있다. 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 제조는 원하는 불멸화 줄기세포의 특성을 최대화하기 위해 통상의 기술자에 의해 적절히 변형될 수 있다. 일례로, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포는 불멸화된 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로, 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)'은 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 불멸화 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액을 의미한다. 불멸화 줄기세포를 배양하여 엑소좀의 함량이 증가된 배양액을 수득하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다. 상기 용어, '엑소좀(exosome)'은 여러 종류의 세포로부터 분비되는 막 구조의 세포외소포체(extracellular vesicle, EV)를 의미한다. 상기 엑소좀은 다른 세포나 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 기능을 하며, 일반적으로 약 50 내지 200 ㎚의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 엑소좀은 이에 포함되는 마커 단백질을 이용하여 확인할 수 있다. 상기 마커 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 마커 단백질을 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 마커 단백질은 CD9일 수 있다.
일례로, 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 배양액은 TNF-α가 포함된 배양배지에서 불멸화 줄기세포를 배양함으로써 수득된 배양액일 수 있다. 이때, 상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/㎖, 3 내지 90 ng/㎖, 3 내지 80 ng/㎖, 3 내지 60 ng/㎖, 10 내지 100 ng/㎖, 10 내지 90 ng/㎖, 10 내지 80 ng/㎖, 10 내지 70 ng/㎖, 10 내지 60 ng/㎖, 20 내지 100 ng/㎖, 20 내지 90 ng/㎖, 20 내지 80 ng/㎖, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 30 내지 100 ng/㎖, 30 내지 90 ng/㎖, 30 내지 80 ng/㎖, 30 내지 70 ng/㎖, 30 내지 60 ng/㎖, 40 내지 100 ng/㎖, 40 내지 90 ng/㎖, 40 내지 80 ng/㎖, 40 내지 70 ng/㎖ 또는 40 내지 60 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 불멸화 줄기세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 상기 낮은 산소 농도는 통상적인 대기하에서의 평균 산소농도인 약 20%보다 낮은 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 낮은 산소 농도는 10% 이하, 0.1 내지 10%, 0.1 내지 8%, 0.1 내지 5%, 0.1 내지 3%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 8%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 3%, 1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 5% 또는 1 내지 3%일 수 있다. 또한, 상기 배양은 1 내지 80시간, 1 내지 70시간, 1 내지 60시간, 1 내지 50시간, 10 내지 80시간, 10 내지 70시간, 10 내지 60시간, 10 내지 50시간, 20 내지 80시간, 20 내지 70시간, 20 내지 60시간, 20 내지 50시간, 30 내지 80시간, 30 내지 70시간, 30 내지 60시간, 30 내지 50시간, 40 내지 80시간, 40 내지 70시간, 40 내지 60시간 또는 40 내지 50시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 엑소좀 풍부 배양액은 필요에 따라 불순물을 제거하기 위해 여과되거나, 농축될 수 있다.
상기 엑소좀 풍부 배양액은 성장인자 및 신경영양인자를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 성장인자 및 신경영양인자는 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 인자를 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 성장인자 및 신경영양인자는 bFGF (basic fibroblast growth factor), EFG (elongation factor G), IGF (insulin-like growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor) 및 TGF-β (transforming growth factor-β)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 성장인자 및 신경영양인자는 bFGF, EFG, IGF, VEGF, PDGF 및 TGF-β를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '보툴리눔 독소(botulinum toxin)'는 클로스트리디움 보툴리누스균(Clostridium botulinum)이라는 그람 양성 혐기성 박테리아에 의해 생성되는 약 150 kDa의 분자량을 갖는 독소 단백질을 의미한다. 상기 보툴리눔 독소는 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형의 총 7가지 혈청형(serotype)이 있으며, 각 혈청형에 따라 신경에서의 작용부위가 다를 수 있다. 구체적으로, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 더욱 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
상기 보툴리눔 독소 A형은 피부에 분포하는 콜린성 신경계(cholinergic nervous system)의 신경 말단으로부터 신경근 접합부(neuromuscular junction)로의 아세틸콜린 분비를 차단할 수 있다.
상기 보툴리눔 독소는 분리된 것, 추출된 것 또는 시판되는 것을 모두 포함할 수 있으며, 보툴리눔 독소의 변이체 또는 융합 단백질도 모두 포함할 수 있다. 상기 보툴리눔 독소의 변이체는 보툴리눔 독소의 활성을 갖는 한 이의 일부를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 변이체는 보툴리눔 독소의 하나 이상의 아미노산 잔기에 화학적 또는 기능적 변형이 수반된 것일 수 있다. 일례로, 상기 변형은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 변형된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 1 내지 200 유닛, 1 내지 150 유닛, 1 내지 100 유닛, 1 내지 50 유닛, 1 내지 30 유닛, 1 내지 10 유닛, 3 내지 200 유닛, 3 내지 150 유닛, 3 내지 100 유닛, 3 내지 50 유닛, 3 내지 30 유닛 또는 3 내지 10 유닛의 양으로 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 보툴리눔 독소를 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액과 혼합 또는 병용으로 사용함으로써, 소량의 사용으로도 유의적인 효과를 확인할 수 있고, 과량의 보툴리눔 독소에 의한 피부늘어짐, 국소마비, 근육 기능상실 등의 부작용을 없앨 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 피부 개선용 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 피부 개선은 자외선, 노화, 스트레스 등과 같은 다양한 자극인자에 의해 손상된 피부를 개선하는 것일 수 있다. 일례로, 상기 피부 개선은 피부재생, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 억제 및 주름발생 억제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능에 의해 피부를 개선시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 건강기능식품, 화장료 조성물 또는 피부외용제일 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 조성물은 피부 개선용 건강기능식품, 화장료 조성물 또는 피부외용제일 수 있다.
상기 건강기능식품은 이의 유효성분인 본 발명에 따른 조성물을 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
상기 건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 이의 유효성분인 본 발명에 따른 조성물을 0.1 내지 50 중량%, 구체적으로 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부개선을 목적으로 피부에 직접 도포될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 크림, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이트, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.
또한, 상기 피부외용제는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제는 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제 및 완충제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 부형제는 유당, 덱스트린, 전분, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 사카로스, 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 피부외용제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 적절히 제조될 수 있다. 상기 피부외용제는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 및 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '창상(wound)'은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 창상은 찰과상, 열상, 자상, 절상, 결출상, 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상, 총상, 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합부위, 화학적 창상 등을 포함할 수 있다.
상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 각각의 성분으로 제형화하거나, 이를 혼합하여 제형화하는 것을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 0.1 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 혈관내, 피하, 근육내, 복강내, 비강내, 직장내, 요도내, 질내, 척수강내, 뇌내, 안구내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다. 한편, 상기 약학적 조성물은 피부 도포 방식으로 투여될 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 유효성분으로 포함하는 제1 조성물, 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 제2 조성물을 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 치료용 키트에 유효성분으로 포함되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
또한, 상기 창상은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 제1 조성물 및 제2 조성물은 상기 서술한 바와 같은 약학적 조성물의 특징을 가질 수 있다. 또한, 이들은 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 후, 상기 보툴리눔 독소를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 보툴리눔 독소를 투여한 후, 상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 투여할 수 있다. 이때, 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 순차적 또는 역순으로 투여하는 경우, 투여 간격은 통상의 기술자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 준비
불멸화 줄기세포를 배양하여 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)을 다음과 같은 방법으로 수득하였다.
먼저, 1×106 cells/㎖의 불멸화 양수줄기세포(기탁번호 KCTC12634BP)는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양배지를 이용하여 5% CO2 및 37℃의 조건하에서 배양하였다. 24시간 후, 50 ng/㎖의 TNF-α를 배양배지에 첨가하고, 산소농도를 2%로 낮추어 48시간을 더 배양하였다. 배양 후, 배양액을 취하여 필터로 여과함으로써 세포 등의 불순물을 제거하고, 저온에서 30배 농축하여 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(이하, '엑소좀 풍부 배양액' 또는 'ERCM')을 수득하였다.
비교예 1. 불멸화 줄기세포 배양액의 준비
불멸화 양수줄기세포(기탁번호 KCTC12634BP)를 DMEM 배양배지에서 5% CO2 및 37℃의 조건하에서 배양한 배양액을 취하여 필터로 여과함으로써 세포 등의 불순물을 제거하고, 저온에서 30배 농축하여 불멸화 줄기세포 배양액(이하, '정상 배양액' 또는 'CM')을 수득하였다.
실험예 1. 엑소좀 함량 분석
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀의 함량을 엑소좀의 포지자인 CD9의 발현을 확인하여 분석하였다.
구체적으로, 6 ㎖의 엑소좀 풍부 배양액으로부터 토탈 엑소좀 분리 키트(total exosome isolation kit, Invitrogen)를 사용하여 엑소좀을 수집한 후, CD9에 대한 웨스턴 블롯팅을 통상적인 방법으로 수행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 비교예 1의 정상 배양액을 사용하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 엑소좀 풍부 배양액 내에서의 CD9 발현수준이 정상 배양액과 비교하여 약 50배 이상 유의적으로 높았다.
실험예 2. 성장인자 및 신경영양인자의 분석
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자를 다음과 같이 분석하였다. 실험은 통상적인 ELISA 방법으로 수행하였으며, 구체적으로, bFGF (basic fibroblast growth factor), EFG (elongation factor G), IGF (insulin-like growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor) 및 TGF-β (transforming growth factor-β) 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 정상 배양액을 사용하였고, 확인된 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준은 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 정상 배양액과 비교하여 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준이 유의적으로 높았다. 구체적으로, bGFG, EFG, IGF, VEGF 및 PDFG 단백질은 약 10배 이상 증가하였고, 특히 TGF-β 단백질은 그 발현 수준이 약 17배 이상 증가하였다.
실험예 3. 콜라겐 분해효소 억제 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 콜라겐 분해효소 억제 효과를 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 단백질의 활성 억제를 통해 확인하였다.
구체적으로, 기질(MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2) 및 재조합 인간 MMP-1 단백질(Cat. #M9195, Sigma-Aldrich)을 포함하는 반응액에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛(units)의 보툴리눔 독소 A형((주)메디톡스, 한국)을 첨가하였다. 이를 여기(excitation) 320 ㎚ 및 방출(emission) 405 ㎚에서 5분 동안 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, MMP-1 단백질의 활성을 정상 대조군의 활성을 기준으로 백분율로 계산하여 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 MMP-1 단백질의 활성을 억제하지 못했으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, MMP-1 단백질의 활성이 이들 각각을 처리한 경우에 비해 유의적으로 감소하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 유의적으로 높았다.
실험예 4. 엘라스틴 분해효소 억제 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 엘라스틴 분해효소 억제 효과를 MMP-12(matrix metalloproteinase-12) 단백질의 활성 억제를 통해 확인하였다.
구체적으로, 기질(N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide) 및 인간 호중구 엘라스타제(elastase, Cat. #MAK246, Sigma-Aldrich)를 포함하는 반응액에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 첨가하였다. 이를 ELISA 리더(reader)를 이용하여 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, MMP-12 단백질의 활성을 정상 대조군의 활성을 기준으로 백분율로 계산하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 MMP-12 단백질의 활성을 억제하지 못했으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, MMP-12 단백질의 활성이 이들 각각을 처리한 경우에 비해 유의적으로 감소하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 유의적으로 높았다.
실험예 5. 콜라겐 합성 촉진 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 콜라겐 합성 촉진 효과를 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 인간 진피 섬유아세포주인 CCD986SK(Thermo Fisher Scientific) 세포주는 미디엄 106(medium 106) 배양배지를 사용하여 통상적인 방법으로 배양하였다. 상기 준비된 세포를 6웰 플레이트에 웰당 5×104개가 되도록 분주하고, 여기에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 첨가하였다. 이를 72시간 동안 배양하고, 배양된 세포의 콜라겐 섬유를 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome)으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 또한, 세포 배양액을 채취하여 염소 항-제1형 콜라겐-UNLB 항체(Southern Biotech)를 사용하여 ELISA를 수행하고 450 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써, 제1형 콜라겐의 함량을 확인하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, 현미경 관찰 및 ELISA 분석 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 콜라겐 합성이 촉진되지 않았으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, 콜라겐 합성이 유의하게 증가하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 현저히 높았다.
실험예 6. 엘라스틴 합성 촉진 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 엘라스틴 합성 촉진 효과를 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, 실험예 3과 동일한 조건 및 방법으로 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형이 처리된 세포를 7일 동안 배양하였다. 배양된 세포의 엘라스틴 섬유를 토끼 항-인간 α-엘라스틴 항체(Bio-Rad)로 염색하여 통상적인 방법으로 면역염색을 수행하고 현미경으로 관찰함으로써 확인하였다. 또한, 세포 배양액을 채취하여 동일한 항체를 이용한 ELISA를 수행하고, 450 ㎚에서 흡광도를 측정함로써, 엘라스틴의 함량을 확인하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, 현미경 관찰 및 ELISA 분석 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 엘라스틴 합성이 촉진되지 않고 오히려 억제되는 경향을 보였으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, 엘라스틴 합성이 유의하게 증가하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 현저히 높았다.
실험예 7. 피부주름 개선 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 피부주름 개선 효과를 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 7주령의 수컷 무모(hairless) 마우스(SKH-1)의 등쪽 피부에 UVB 램프(월드코포레이션)를 이용하여 UVB를 조사하였다. 구체적으로, UVB는 첫 번째 주에 1 최소홍반량(minimun erythema dose, MED)으로 조사하고, 두 번째 주에는 2 MED 씩, 세 번째 주에는 3 MED 씩, 네 번째 주부터 열 번째 주까지는 4 MED 씩 조사하여 피부 주름을 유발하였다. 피부 주름이 유발된 마우스에 50 ㎕의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 혼합하여 피하주사하였다. 이때, 주사는 1 ㎝ 간격으로 총 5개 위치에 나눠서 원형으로 주사하였으며, 주사 후 1일, 2주 및 4주째에 주름을 관찰하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 피부군, UVB만 처리한 UVB 처리군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 이후, 실리콘폴리머(CharmFlex® Impression Material)를 이용하여 주름을 복제하고, 빛의 입사각을 20도로 고정하여 주름의 명암 영상을 카메라로 촬영하였다. 촬영된 사진으로부터 이미지 분석 프로그램(Skin Visiometer SV600 software)을 이용하여 거칠기(roughness)를 분석하였다. 그 결과, 촬영된 사진을 도 7에 피부의 거친 정도를 분석하여 주름 스코어(score)를 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7 및 8에 나타난 바와 같이, UVB 조사에 의해 형성된 주름은 관찰 4주 후까지 11.7점으로 지속되었다. 한편, 보툴리눔 독소만을 처리한 경우에는 처리 1일 후에 5.6점까지 크게 개선되었지만, 2주 및 4주 후에는 각각 7.5점 및 10.3점으로 다시 주름이 형성되었다. 그러나, 보툴리눔 독소를 엑소좀 풍부 배양액 또는 정상 배양액과 함께 처리한 경우에는 주름의 재형성이 상당히 차단되었고, 특히 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 처리한 경우에는 4주 후에도 6.4점으로 주름의 재형성이 완전히 차단되어 주름 개선 효과가 지속되었다.
따라서, 상기로부터 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 동시에 처리한 경우, 보툴리눔 독소를 단독으로 처리하거나, 이를 정상 배양액과 함께 처리한 경우보다 주름생성 억제 효과가 현저히 증가할 뿐 아니라 상기 효과를 장시간 유지시킴을 알 수 있었다.
실험예 8. 피부재생 효과 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 피부재생 효과를 창상 스크래치 시험(wound scratch assay) 방법으로 확인하였다.
먼저, 인간 표피 각질세포주인 NHEK 세포주(Guangdong BioCell Biotechnology Co., Ltd.)는 에피라이프(EpiLife, Gibco) 배양배지를 사용하여 통상적인 방법으로 배양하였다. 상기 준비된 세포를 6웰 플레이트에 웰당 3×105개가 되도록 분주하고, 100 ㎕ 파이펫 팁으로 스크래치 창상을 유발하였다. 여기에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 첨가하고, 24시간 동안 배양하며 관찰하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 세포의 재생 정도는 위상차 현미경(phase-contrast microscope)을 이용하여 촬영함으로써 정량적으로 평가하였다. 그 결과, 위상차 현미경으로 촬영된 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 정상 대조군에서는 약 20%, 보툴리눔 독소 처리군에서는 약 35%의 세포 재생이 확인되었다. 반면, 보툴리눔 독소를 엑소좀 풍부 배양액 또는 정상 배양액과 함께 처리한 경우에 세포 재생이 유의적으로 증가하였고, 특히 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시 처리한 경우에 약 85 내지 90%의 세포가 재생되었다.
따라서, 상기로부터 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 동시에 처리한 경우에 세포 재생 효과가 현저히 증가함을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12634BP 20140725

Claims (15)

  1. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM) 및 보툴리눔 독소를 포함하는 피부개선용 화장료 조성물로서,
    상기 피부개선은 피부재생인 피부개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래 줄기세포인, 피부개선용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된, 피부개선용 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된, 피부개선용 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/㎖의 농도로 포함되는, 피부개선용 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 10% 이하의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 피부개선용 화장료 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 1 내지 5%의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 피부개선용 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 피부개선용 화장료 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형인, 피부개선용 화장료 조성물.
  10. 삭제
  11. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 피부개선용 피부외용제로서,
    상기 피부개선은 피부재생인 피부개선용 피부외용제.
  12. 삭제
  13. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 유효성분으로 포함하는 제1 조성물, 및
    보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 제2 조성물을 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소가 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여되는, 창상의 예방 또는 치료용 키트.
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