KR102311835B1

KR102311835B1 - 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102311835B1
Application number: KR1020200119988A
Authority: KR
Inventors: 김수; 이원종; 최은욱; 박병순; 최혜인
Original assignee: (주)프로스테믹스
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2020-09-17
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2038-11-20
Also published as: KR20200110728A

Abstract

본 발명은 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀을 포함하며, 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료의 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀은 피부 투과도가 우수하면서, 흡수 시 피부 보습, 피부 미백, 주름 개선 및 노화 방지 등의 피부 개선 효과가 우수할 뿐만 아니라, 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다. 또한, 본 발명에서 제공하는 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀은 발모 및 육모 효과가 우수하여 탈모의 방지 및 치료 효과가 뛰어나며, 이를 섭취하거나 피부에 도포하여도 부작용이 없이 안전하다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법{Composition for improving skin and preventing hairloss and method for preparing the same}

본 발명은 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀을 포함하며, 상처 치료, 피부 개선 및 탈모 방지 또는 치료의 효과를 갖는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있는데, 첫째는 수정란으로부터 발생한 배아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고 둘째는 성인이 된 우리 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 배아줄기세포는 분화능력이 매우 뛰어나고 텔로미어가 긴 장점이 있으나, 윤리적인 문제를 안고 있고 세포를 다량 획득하는 것이 어려운 단점이 있는 반면, 성체줄기세포는 세포 수를 많이 얻을 수는 있으나 타인에게 이식할 때 감염의 위험이나 분화능력이 상대적으로 떨어지는 단점이 있다.

성체 줄기세포는 의학적으로 적용하기에 대단히 안전하다는 특징이 있다. 구체적으로, 장기 재생을 위해 몸 안에 이식하여도 암이 발생하지 않으며, 성인의 몸 속에 있었기 때문에 면역거부반응이 발생하지 않아 자기 자신의 세포를 사용하는 자가 이식(autologous transplantation)이 가능하다. 또한, 주변 조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화능력(site-specific differentiation)이 있고, 미분화 상태에서 주입하여도 암을 유발하지 않기 때문에 이식된 이후 당장 필요한 세포를 만들어내는 것 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어서 저장하는 자가 재생산(self-renewal) 능력이 있는 장점이 있다. 따라서 성체줄기세포는 최근에 그 중요성이 부각되고 있으며, 그 유용성을 밝히기 위한 여러 가지 연구가 진행 중에 있다.

최근 전세계적으로 대머리 및 탈모 방지를 위한 많은 발모제들이 시판되고 있으나 아직도 치료효과를 만족할 수 있는 약물이나 기술은 미미한 실정이다. 미국 식품의약청인 FDA가 임상실험을 거쳐 발모제로 유일하게 승인한 약물은 미녹시딜(minoxidil)로 원래 고혈압 치료제로써 개발되어 발견된 부작용의 일종인 발모를 상품화한 것이며 전세계에서 최초로 미국 연방정부가 공인한 최초의 대머리 및 탈모증 치료약이다. 또한, 현재 사용되는 다른 약물로 프로페시아(Propecia)가 있는데 이는 탈모의 원인 중 호르몬설에 근거를 둔 것으로 남성호르몬은 5-알파환원효소의 작용을 받아 대사산물인 디하이드로테스토스테론(DHT)으로 바뀌는데 이 물질이 모낭을 위축, 소멸시키는 것으로 알려져 있다. 상기 프로페시아는 5-알파환원효소를 차단함으로써 DHT생성을 억제하여 남성형 탈모가 진행되는 것을 최대한 늦추는 효과가 있는 것으로 이 약물의 효과는 발모가 아니라 탈모의 추가방지에 있는 것이다.

그 외에도 발모 및 탈모 방지에 효과 있다고 알려진 물질들이 보고되고 있으다. 예를 들어, 화합물로는 사이클로스포린(Cyclosporin) 유도체(대한민국 등록특허 10-0439467, 대한민국 등록특허 10-0695611), N-헤테로사이클릭 카복실산 및 카르밤산염(대한민국 공개특허 10-2001-0052502), 퀴나졸리논 유도체(대한민국 공개특허10-1999-0023754), 크라이신 7-Ｏ-크로토네이트(대한민국 공개특허 10-2001-0009474) 및 1,2-이치환벤젠카르복사미드 유도체(대한민국 공개특허 10-1999-0037394) 등이 보고된 바 있다.

그러나 이와 같은 탈모 치료 또는 발모 개선용 조성물은 화학성분에 의한 조성물로서 여성이나 유아에게 치명적인 부작용이 일어날 수 있으며, 남성에게 있어서도 피부염증에 의한 탈모 가속 등의 부작용 등이 나타나고 있고, 많은 경우 평생에 걸쳐 사용해야 하며 장기간의 사용시에 나타날 수 있는 부작용들도 환자의 고통을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 목적은 줄기세포 또는 배양액 유래 엑소좀을 이용하여 안정적으로 상처를 치료 또는 촉진할 수 있는 상처 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀을 이용하여 안전하면서도 피부 보습, 피부 미백, 주름 개선 및 노화 방지 등의 효과가 우수한 피부 개선용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀을 이용하여 안전하면서도 육모 및 발모 효과가 우수한 탈모 방지 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

상처는 창상(創傷)이라고 칭해지기도 하며, 그 원인에 따라 절창(切創), 자창(刺創), 할창(割創), 좌창(挫創), 열창(裂創), 사창(射創), 교창(咬創) 등으로 나뉘고, 형상에 따라 선상창(線狀創), 판상창(瓣狀創), 결손창 등으로 나뉜다. 상처에 따른 증세로는 통증, 출혈, 기능장애 등이 있으며, 상처를 입는 경우, 생체는 이를 치유하기 위하여 다양한 생리적 반응을 나타낸다. 통상, 상해를 받은 세포의 변성(變性), 사멸 과정을 거처 주위의 조직으로부터의 유주세포(遊走細胞), 조직액의 유출되고, 섬유소의 석출과 육아조직(肉芽組織)이 형성되어 상처를 치유하게 된다.

일반적으로 EGF(Epidermal Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor), TGF-α(Transforming Growth Factor-α), TGF-β, IGF-I (Insulin-like Growth Factor-1) 등의 성장인자들이 상처를 치료하거나 상처치료를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

그러나, EGF 등의 특정 성장인자를 분리하여 임상에 적용할지라도 아직까지 만족할만한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 효과를 기대하기가 곤란하다. 또한, MSC 등의 줄기세포를 직접 사용할 경우에는 세포의 생존율을 높게 유지하면서 제제화하는 것이 곤란할 뿐만 아니라 세포의 원천(source)에 따라 다양한 개체편차를 나타내어 목적하는 치료효과를 동일하게 나타내는 것이 여전히 곤란하다.

최근 의료기술 및 공중위생 혜택이 개선됨에 따라 초고령화 사회가 급속히 도래하고 있다. 이에 따라, 생활의 질적인 향상이 도모되고 있으며 젊음의 유지에 대한 욕구도 증가하고 있다. 외모, 특히 피부에서 가장 먼저 나타내게 되는 노화를 지연시키고 예방하기 위하여 여러 영역에서 많은 연구가 진행되고 있다.

피부(skin)는 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하조직(subcutaneous tissue)으로 이루어진다. 피부의 바깥층인 표피는 중층편평상피(stratified squamous epithelium)로 구성되며, 외부 환경에 대한 신체의 보호 장벽으로 작용한다. 표피는 바깥에서부터 각질층(stratum corneum), 투명층(stratum lucidum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum) 및 기저층(stratum basale)으로 나뉜다. 진피는 표피와 피하조직(subcutaneous tissue) 사이의 층으로서, 유두층(papillary dermis) 및 망상층(reticular dermis)으로 나뉘며, 표피에는 없는 혈관, 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 모공, 입모근, 피지선, 한선, 여러 가지 감각신경, 섬유아세포 및 대식세포 등이 존재하며 피부 중 가장 많은 부위를 차지한다.

진피는 주로 콜라겐과 엘라스틴 섬유로 이루어지는데, 이들은 피부를 지지하는 역할을 한다. 따라서 이러한 진피에 문제가 발생하면 주름이 생기고 피부탄력이 없어져서 피부노화가 진행된다. 콜라겐은 피부재생, 피부 함수율, 상처치유 및 주름개선 등에 있어서 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 섬유아세포로부터 생성된다. 콜라겐은 수분을 다량 함유할 수 있는 기능이 있어서 진피에 수분을 공급하는 역할을 하는데, 노화가 되면 콜라겐의 수분 함유 기능이 떨어지게 되어 주름이 늘어나게 된다. 콜라겐은 또한 상처가 생겼을 때 섬유아세포의 지속적인 콜라겐 생성으로 상처 부위를 메워주어 상처치유 작용도 한다.

또한, 현대 사회는 많은 스트레스로 인해 생체가 서서히 손상을 받고 있으며 이로 인한 모발손실이 커다란 사회 이슈가 되고 있다. 모발 손실은 모발 성장의 부진과 모근 세포의 성장촉진을 하는 성장인자의 결핍 등 다양한 인자에 의해 유발된다.

이러한 탈모는 정신적 스트레스로 삶의 질을 저하시키며 대인관계나 사회생활에 많은 지장을 준다. 사회생활에 있어서 외모에서 풍기는 이미지는 매우 인상적으로 다가가며, 그 외모의 중요성이 자존감이나 사회생활의 보이지 않는 활력소가 된다는 점에서 탈모 원인과 치료에 관심이 날로 높아지고 있다.

본 발명의 발명자들은 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀은 피부 투과도가 우수하고, 흡수 시 상처 치료, 피부 보습, 피부 미백, 주름 개선 및 노화 방지 등의 효과가 우수하며, 그 외에 발모 및 육모 효과 또한 뛰어난 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 엑소좀은 1 ~ 100㎍/ml, 또는 1 ~ 50㎍/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 엑소좀이 1㎍/ml 미만의 양으로 포함되는 경우 상처 치료 효과가 미미할 수 있고, 100㎍/ml를 초과하여 포함되는 경우 경제적으로 문제될 수 있다.

또한, 상기 엑소좀은 1 X 10⁷~ 1 X 10¹²/ml의 입자수로 포함될 수 있다. 상기 엑소좀의 입자수가 1 X 10⁷/ml 미만인 경우 상처 치료 효과가 미미할 수 있고, 입자수가 1 X 10¹²/ml를 초과하는 경우 경제적으로 문제될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기한 상처 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 성체 줄기세포 배양액을 100~500g에서 5~30분 동안 1차 원심 분리하는 단계; 상기 1차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 1,000~3,000g에서 10~30분 동안 2차 원심 분리하는 단계; 상기 2차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 5,000~20,000 g에서 20~60분 동안 3차 원심 분리하는 단계; 상기 3차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 100,000~120,000 g에서 60~120분 동안 4차 원심 분리하는 단계; 및 상기 4차 원심 분리 후 펠렛을 회수하여 50,000~150,000 g에서 60~120분간 5차 원심 분리하여 펠렛을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명은 5단계의 원심 분리 공정을 통하여 상처 치료 효과가 뛰어난 엑소좀을 높은 순도 및 함량으로 획득할 수 있다.

본 발명에서 상기 성체 줄기세포 배양액은 성체 줄기세포를 800~1,200 mg/L의 D 글루코스, 500~600 mg/L의 L-글루타민, 100~200 mg/L의 소디움피루베이트, 5~15 부피%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 및 0.5~1.5부피%의 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 접종한 뒤 80~95 %의 습도 및 30~40 ℃ 온도 조건 하에서 5~10 % CO₂ 배양기에서 계대 배양하는 단계; 및 계대 배양된 배양물을 350~400 mg/L의 L-글루타민, 10~20 mM의 HEPES 및 50~60 mg/L의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM와 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:0.5~2 중량비의 혼합 배지에 접종한 뒤 1~5부피%의 산소를 포함하는 저산소(Hypoxia) 조건으로 60~120 시간 동안 배양하는 단계에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기한 피부 개선용 화장료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 성체 줄기세포 배양액을 100~500g에서 5~30분 동안 1차 원심 분리하는 단계; 상기 1차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 1,000~3,000g에서 10~30분 동안 2차 원심 분리하는 단계; 상기 2차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 5,000~20,000 g에서 20~60분 동안 3차 원심 분리하는 단계; 상기 3차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 100,000~120,000 g에서 60~120분 동안 4차 원심 분리하는 단계; 및 상기 4차 원심 분리 후 펠렛을 회수하여 50,000~150,000 g에서 60~120분간 5차 원심 분리하여 펠렛을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명은 5단계의 원심 분리 공정을 통하여 피부 개선 효과가 뛰어난 엑소좀을 높은 순도 및 함량으로 획득할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 상기한 탈모 방지 또는 치료용 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 성체 줄기세포 배양액을 100~500g에서 5~30분 동안 1차 원심 분리하는 단계; 상기 1차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 1,000~3,000g에서 10~30분 동안 2차 원심 분리하는 단계; 상기 2차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 5,000~20,000 g에서 20~60분 동안 3차 원심 분리하는 단계; 상기 3차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 100,000~120,000 g에서 60~120분 동안 4차 원심 분리하는 단계; 및 상기 4차 원심 분리 후 펠렛을 회수하여 50,000~150,000 g에서 60~120분간 5차 원심 분리하여 펠렛을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명은 5단계의 원심 분리 공정을 통하여 발모 및 육모 효과가 뛰어난 엑소좀을 높은 순도 및 함량으로 획득할 수 있다.

본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.

상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다.

본 발명에서 엑소좀(exosome)은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30 ~ 1,000 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀의 대표적인 발현 마커는 HSP70, CD63 및 CD9에 해당한다.

또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에서 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명에서 유효 성분으로 포함되는 엑소좀이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.

여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.

그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.

상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명에서 제공하는 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀은 상처 부위로 세포 이동을 촉진하여 우수한 상처 치료 또는 상처 치료 촉진 활성을 갖는다.

피부 투과도가 우수하면서, 흡수 시 피부 보습, 피부 미백, 주름 개선 및 노화 방지 등의 피부 개선 효과가 우수할 뿐만 아니라, 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다.

또한, 본 발명에서 제공하는 줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀은 발모 및 육모 효과가 우수하여 탈모의 방지 및 치료 효과가 뛰어나며, 이를 섭취하거나 피부에 도포하여도 부작용이 없이 안전하다.

도 1의 (a)는 실험예 1에서 엑소좀의 TEM 사진을 도시한 것이고, (b)는 엑소좀 내 존재하는 입자의 크기 별 분석을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 실험예 1에서 웨스턴 블럿을 이용하여 엑소좀의 HSP70, CD63 및 CD9 마커의 발현 여부를 확인한 사진이고, (b)는 실시간 PCR을 이용하여 엑소좀의 CD24 및 AQP2 마커의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이며, (c)는 FACS를 이용하여 엑소좀의 CD63, CD9 및 CD81 마커의 발현 여부를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 2에서 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 비교예 1에서 얻어진 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액의 처리 후 상처 부위로 인간 피부 섬유아세포의 이동 변화를 나타낸 사진이다.
도 4는 실험예 2에서 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 비교예 1에서 얻어진 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액의 처리 후 상처 부위로 이동한 인간 피부 섬유아세포의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 3에서 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 비교예 1에서 얻어진 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액의 처리 후 프로콜라겐, KGF 및 CD34의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6의 (a) 및 (b)는 실험예 4에서 실시예 3에서 얻어진 엑소좀의 처리 후 농도 별 프로콜라겐 및 엘라스틴의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7의 (a) 내지 (c)는 실험예 5에서 실시예 3에서 얻어진 엑소좀 처리 후 농도 별 KGF, CD34 및 VEGF의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 6에서 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 비교예 1에서 얻어진 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액의 처리 후 LEF-1, PTC-1 및 KGF 의 발현 정도를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

[실시예 1] 지방 유래 줄기세포의 수득

피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방 흡인(liposuction) 방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 지방조직의 세포외 기질을 약 37℃, 약 5% CO₂ 배양기에서 45분간 0.075% 콜라게나아제로 처리한 다음, 얻어진 지방조직을 약 1200g에서 5분간 원심 분리하여 고밀도의 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 얻어진 분획을 PBS로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 다른 조직을 제거한 후 Histopaque-1077(Sigma Co.)로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵 세포를 분리하였다.

분리된 단핵세포를 10% 소 태아 혈청((fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 배지로 사용하여 약 37℃, 약 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 비접착성 세포들을 제거하여 지방유래 줄기세포를 단리하였다.

[실시예 2] 지방 유래 줄기세포의 배양

실시예 1에서 얻어진 지방유래 줄기세포 1.25 X 10⁵ cells를 1000 mg/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트, 10 부피% FBS, 1부피% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90 %의 습도 및 약 37℃의 온도 조건 하에서 5부피% CO₂ 배양기에서 30일 동안 계대 배양하였다.

파이펫을 사용하여 계대 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 3 회 세척한 후, 365 mg/L의 L-글루타민, 15mM의 HEPES, 55 mg/L의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM 및 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:1 (중량비) 혼합 배지 중에서 1.2 X 10⁶ cell/dish의 농도로 접종하여 저산소(Hypoxia) 조건으로 72 시간 동안 배양하였다.

[실시예 3] 지방 유래 줄기세포 배양액 유래 엑소좀 분리

실시예 2에서 얻어진 지방 줄기세포 배양액 50ml를 원심분리기 튜브에 옮긴 후, 4℃, 300g에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 모아서 새로운 원심분리기 튜브에 옮긴 후, 이를 다시 4℃, 2,000 g에서 20분간 원심 분리하고 얻어진 상등액을 새로운 고속원심분리기가 가능한 튜브에 옮겨 다시 4℃, 10,000 g에서 30분간 고속원심분리를 하였다. 상등액을 새로운 초고속원심분리용 폴리카보네이트 보틀(bottle)에 옮기고, 이를 4℃ 110,000 g에서 70분간 Beckman Coulter 사의 OPTIMA XE-90 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하여 초고속원심분리를 실시하여 상등액을 제거하였다. 가라앉은 펠렛을 1000 ㎕ PBS로 튜브내에서 마이크로피펫을 이용하여 재현탁시켰다. 재현탁시킨 튜브를 Beckman Coulter 사의 OPTIMA MAX-XP 초원심분리기를 이용하여 4℃, 100,000 g에서 70분간 원심 분리하고, 가능한 상등액을 전부 제거하고 펠렛을 회수하였다. 회수된 펠렛에 소량의 PBS를 추가하고 재현탁한 뒤 100 ㎕로 분액하여 -80 ℃에 보관한 후 필요한 경우 녹여 사용하였다.

[비교예 1] 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀의 제거

실시예 2에서 얻어진 지방 줄기세포 배양액 50ml를 원심분리기 튜브에 옮긴 후, 4℃, 300g에서 10분간 원심분리를 하였다. 상등액을 모아서 새로운 원심분리기 튜브에 옮긴 후 이를 다시 4℃, 2,000 g에서 20분간 원심분리를 하였다. 4℃, 2,000g에서 20분간 원심분리를 마친 상등액을 새로운 고속원심분리기가 가능한 튜브에 옮겨 다시 4℃, 10,000g에서 30분간 고속원심분리를 하였다. 상등액을 새로운 초고속원심분리기용 폴리카보네이트 보틀에 옮기고, 이를 4℃ 110,000 g에서 70분간 Beckman Coulter 사의 OPTIMA XE-90 초원심분리기를 사용하여 초고속원심분리를 한 후, 펠렛을 제거하고 상등액 만을 취하여 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 준비하였다.

[실험예 1] 지방 유래 줄기세포 배양액 유래 엑소좀의 특성 분석

실시예 3에서 얻어진 엑소좀을 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 관찰하고, 그 사진을 도 1의 (a)에 나타내었고, NTA(Nanoparticle tracking analysis)를 통해 상기와 같이 얻어진 엑소좀 내에 존재하는 입자의 크기 별 분포를 분석해 그 결과를 도 1의 (b)에 그래프로 나타내었다.

웨스턴 블럿(Western blot)을 이용하여 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 대조군으로 지방 유래 줄기세포의 용해물에 대하여 대표적인 엑소좀 마커인 HSP70, CD63 및 CD9의 발현을 확인하여 그 결과를 도 2의 (a)에 나타내었다. 또한, 실시간 PCR을 이용하여 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 대조군으로 지방 유래 줄기세포에 대하여 대표적인 엑소좀 마커인 CD24과 AQP2의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 2의 (b)에 나타내었다. 마지막으로, 유세포분석기 (FACS)를 이용하여 실시예 3에서 얻어진 엑소좀에 대하여 엑소좀 표면 마커인 CD63, CD9 및 CD81의 발현 여부를 확인해 그 결과를 도 2의 (c)에 나타내었다.

도 1의 (a)에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포 배양액에서 분리된 엑소좀은 나노미터 단위의 미세한 구형 구조를 갖는 것을 확인할 수 있고, 도 1의 (b)에서 보는 바와 같이, 그 직경 크기는 주로 30 ~ 150nm에 분포하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 2의 (a) 내지 (c)에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포 배양액에서 분리된 엑소좀은 엑소좀의 대표적인 마커를 모두 갖고 있는 것을 확인할 수 있다.

이를 통해 상기 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀은 전형적인 엑소좀의 특성을 갖는 것을 알 수 있다.

[실험예 2] 상처 부위에서 인간 피부 섬유아세포의 이동(migration) 효과

인간 피부 섬유아세포를 5 X 10⁴세포/웰의 농도로 배양 접시에 부착시키고 일정한 거리 간격으로 상처(scratch)를 만든 뒤, 상처 부분에 상기 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 비교예 1에서 얻어진 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 처리한 후, 48시간 후에 세포 이동 정도를 확인하여 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 처리한 경우보다 엑소좀을 처리한 경우 많은 세포가 상처 부위로 이동함을 시각적으로 확인할 수 있다.

또한, 도 4에서도 엑소좀을 처리한 경우, 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 처리한 경우보다 세포 이동 효과가 2배 이상 증가됨을 확인할 수 있다.

[실험예 3] 피부 노화방지 및 재생 관련 유전자 발현 증가 효과

인간 피부 섬유아세포를 5 X 10⁴세포/웰의 농도로 배양 접시에 부착시킨 후 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 비교예 1에서 얻어진 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 처리하였다. 48시간 배양 후에 각 군의 세포에서 RNA를 추출한 후 인트론 프레믹스(intron premix)를 이용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 이를 이용하여 실시간 PCR(Real-time PCR)을 수행하였다. 각각의 처리 군의 세포에서 피부 노화방지 및 재생 관련하는 유전자로, 프로콜라겐, KGF 및 CD34의 발현을 확인하여 그 결과를 도 5에 그래프로 나타내었다.

단, 상기 프로콜라겐은 피부 탄력을 유지하여 주며, 피부의 주된 단백질 형성에 필요한 콜라겐 합성에 관련된 유전자에 해당한다. KGF(keratinocyte growth factor)는 피부세포의 분화와 성장 및 생리활성을 자극하는 주요한 성장인자로 피부 노화를 방지하고 콜라겐을 합성하며, 피부 재생을 조절하고, 항노화에 관여하는 유전자에 해당한다. 마지막으로 CD34는 혈관 재생에 관여하는 인자로서 피부 재생에 관여하는 유전자에 해당한다.

도 5에서 보는 바와 같이, 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 처리한 경우보다 엑소좀을 처리한 경우 프로콜라겐, KGF 및 CD34의 발현율이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.

[실험예 4] 피부 탄력 관련 유전자의 발현 증가 효과

인간 피부 섬유아세포를 5 X 10⁴세포/웰의 농도로 배양 접시에 부착시킨 후, 실시예 3에서 얻어진 엑소좀을 5 및 10㎍/ml의 농도로 각각 처리하였다. 48시간 배양 후에 각 군의 세포에서 RNA를 추출한 후 인트론 프레믹스를 이용하여 cDNA를 합성하고 이를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 각각의 처리 군의 세포에서 피부 노화방지 탄력 증가에 관여하는 유전자로, 프로콜라겐과 엘라스틴의 발현 정도를 확인하여 그 결과를 도 6에 그래프로 나타내었다. 단, 대조군으로는 엑소좀을 처리하지 않았다.

도 6의 (a) 및 (b)에서 보는 바와 같이, 엑소좀을 처리한 경우 대조군 대비 프로콜라겐과 엘라스틴의 mRNA 발현 수준이 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있고, 처리 농도가 증가할수록 발현 수준이 더욱 높아지는 것을 확인할 수 있다.

이를 통하여 본 발명에 따르는 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 얻어진 엑소좀은 피부 탄력 유지 및 노화 방지에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

[실험예 5] 피부 재생 관련 유전자의 발현 증가 효과

인간 피부 섬유아세포를 5 X 10⁴세포/웰의 농도로 배양접시에 부착시킨 후 실시예 3에서 얻어진 엑소좀을 5 및 10㎍/ml의 농도로 각각 처리하였다. 48시간 배양 후에 각 군의 세포에서 RNA를 추출한 후 인트론 프레믹스를 이용하여 cDNA를 합성하고 이를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 각각의 처리 군의 세포에서 피부 재생에 관여하는 유전자로, KGF, CD34 및 VEGF의 발현 정도를 확인하여 그 결과를 도 7에 그래프로 나타내었다. 단, 대조군으로는 엑소좀을 처리하지 않았다.

도 7의 (a) 내지 (c)에서 보는 바와 같이, 엑소좀을 처리한 경우 대조군 대비 KGF, CD34 및 VEGF의 mRNA 발현 수준이 현저히 높아지는 것을 확인할 수 있고, 처리 농도가 증가할수록 발현 수준이 더욱 높아지는 것을 확인할 수 있다.

이를 통하여 본 발명에 따르는 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 얻어진 엑소좀은 피부 재생에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

[실험예 6] 모유두 세포의 모낭 성장 및 발달 관련 유전자의 발현 증가 효과

인간 모유두세포 5 X 10⁵개를 60 mm (SPL, Korea) 배양 접시에 부착시킨 후, 실시예 3에서 얻어진 엑소좀과, 비교예 1에서 얻어진 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 처리하였다. 48시간 배양 후, 세포를 회수하여 RNA 분리 키트(Quiagen, USA)를 사용해 RNA를 분리하고, cDNA 합성 키트(Intronbio, Korea)를 사용하여 분리된 RNA 1ug에 대해 cDNA를 합성하였다. 각각의 프라이머는 코스모진텍에서 합성하였고, 프라이머는 10 pmol/ul의 농도로 사용하였으며, 실시간 PCR은 2X 사이버 그린 마스터 믹스(Takara, Japan)를 첨가하여 검출하였다. 각각의 처리 군의 세포에서 모낭의 성장 및 발달에 관여하는 유전자로, LEF-1, PTC-1 및 KGF 의 발현 정도를 확인하여 그 결과를 도 8에 그래프로 나타내었다.

단, 상기 LEF-1(lymphoid enhancer-binding factor-1)은 모낭의 형태 형성과 분화를 촉진하는 유전자이고, PTC-1(patched protein, Sonic Hedgehog(Shh) receptor)는 모낭의 형태를 형성하고 그 성장을 조절하는 유전자이고, KGF(keratinocyte growth factor)는 모낭의 성장, 발달 및 분화에 중요한 영향을 미치는 유전자에 해당한다.

도 8에서 보는 바와 같이, 엑소좀이 제거된 지방 유래 줄기세포 배양액을 처리한 경우보다 엑소좀을 처리한 경우 LEF-1, PTC-1 및 KGF의 발현율이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.

이를 통하여 본 발명에 따르는 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 얻어진 엑소좀은 모낭의 성장, 발달 및 분화에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시 예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.

Claims

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성체 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 획득하는 단계를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법으로,
상기 성체 줄기세포는 지방 유래인 것이고,
상기 피부 개선은 피부 노화 방지, 재생 또는 탄력 개선이고,
상기 성체 줄기세포 배양액은 성체 줄기세포를 800~1,200 mg/L의 D 글루코스, 500~600 mg/L의 L-글루타민, 100~200 mg/L의 소디움피루베이트, 5~15 부피%의 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 및 0.5~1.5부피%의 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 접종한 뒤 80~95 %의 습도 및 30~40 ℃온도 조건 하에서 5~10 % CO₂ 배양기에서 계대 배양하는 단계; 및 계대 배양된 배양물을 350~400 mg/L의 L-글루타민, 10~20 mM의 HEPES 및 50~60 mg/L의 소듐 피루베이트로 보충된 DMEM와 Ham's F-12 영양소 혼합액의 1:0.5~2 중량비의 혼합 배지에 접종한 뒤 1~5부피%의 산소를 포함하는 저산소(Hypoxia) 조건으로 60~120 시간 동안 배양하는 단계에 의하여 제조되는, 제조방법.
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제9항에 있어서,
상기 엑소좀을 획득하는 단계는,
상기 성체 줄기세포 배양액을 100~500g에서 5~30분 동안 1차 원심 분리하는 단계;
상기 1차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 1,000~3,000g에서 10~30분 동안 2차 원심 분리하는 단계;
상기 2차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 5,000~20,000 g에서 20~60분 동안 3차 원심 분리하는 단계;
상기 3차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 100,000~120,000 g에서 60~120분 동안 4차 원심 분리하는 단계; 및
상기 4차 원심 분리 후 펠렛을 회수하여 50,000~150,000 g에서 60~120분간 5차 원심 분리하여 펠렛을 회수하는 단계를 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
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