KR102701898B1

KR102701898B1 - 바이오 복합체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102701898B1
Application number: KR1020210145229A
Authority: KR
Inventors: 최종훈; 김지원
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2024-09-02
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: KR20230060724A

Abstract

본 발명은 바이오 복합체 및 이의 제조방법을 개시한다. 본 발명의 바이오 복합체는 생체고분자 물질, 카테콜계 물질, 그래핀 산화물 및 금속 나노입자를 포함하며, 상기 카테콜계 물질의 첨가로 생체고분자 물질의 접착력을 높이고, 금속 이온의 방출을 제어하여 세포에 안정적이면서 우수한 항균효과를 제공하는 것을 특징으로 한다.

Description

바이오 복합체 및 이의 제조방법{BIOCOMPOSITE AND A METHOD FOR PRODUCING THEREOF}

본 발명은 상처 부위에 존재하는 박테리아를 사멸시켜 상처 감염 예방 및 치료할 수 있는 바이오 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

상처 감염은 상처 내부에 박테리아가 자람으로써 발생한다. 일반적으로 상처는 피부를 손상시켜 병원체가 조직 내부로 접근하기 쉽게 도와주며, 병원체에게 영양분을 공급하고 증식할 수 있는 환경을 제공한다. 따라서 상처 감염이 발생할 경우 상처 치료가 늦어질 수 있으며, 상처 감염균들이 항생제에 내성을 가지게 되어 치료의 효율성이 떨어질 가능성이 있다. 또한 상처 감염이 심화될 경우 패혈증과 같은 생명에 위협적인 합병증이 발생할 수 있다.

현재 상처 감염을 예방하기 위해 가장 널리 사용되는 것은 항균제이다. 예를 들면, 항균제는 알데하이드(aldehyde), 알코올(alcohol), 과산화물, 페놀 및 염소화 페놀, 금속 이온, 키토산, N-할라민(N-Halamines) 및 천연 물질 유래 항균제 등이 있다.

그 중 금속 이온 항균제는 금속 이온이 미생물의 단백질과 결합하여 단백질 내의 이황화 결합(disulfide bond)을 절단한 후 단백질을 침전시키고, 이로 인해 DNA의 결합하는 효소 및 단백질의 생성을 억제하여 박테리아의 성장을 방해한다.

그러나 과도하게 금속 이온이 방출되는 경우 반응 산소 종(Reactive oxygen species)을 발생시켜 세포의 지질을 과산화시켜, 단백질을 산화시키고 DNA 분해를 유도하여 오히려 주변 세포를 손상시키거나 파괴하는 문제점이 있다.

“preparation and characterization of gelatin-gallic acid/ZnO nanocomposite with antibacterial properties as a promising multi-functional bioadhesive for wound dressing applications.” Sonia Nohemi Ramirez-Barron et al., International Journal of Adhesion and Adhesives, 2021, vol. 104, no. 102749, pp.1-10

본 발명의 일 목적은 카테콜계 물질을 이용하여 금속 이온의 방출을 제어함으로써 세포에 안정적이면서 박테리아를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 바이오 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 워터-인-오일(water-in-oil) 방법을 이용한 바이오 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 목적을 위한 바이오 복합체는 생체고분자 물질, 카테콜계 물질, 그래핀 산화물 및 금속 나노입자를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 생체고분자 물질은 젤라틴(gelatin)일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 카테콜계 물질은 갈산(gallic acid)일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 젤라틴과 상기 갈산의 함량은 80:1 내지 210:1 중량비일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 금속 나노입자는 은(Ag), 구리(Cu), 아연(Zn) 및 티타늄(Ti)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 위한 바이오 복합체의 제조방법은 생체고분자 물질과 카테콜계 물질을 결합하여 제1 복합체를 제조하는 제1 단계, 그래핀 산화물이 분산된 용액에 금속 나노입자 전구체 용액과 환원제를 첨가하여 제2 복합체를 제조하는 제2 단계, 상기 제1 복합체가 용해된 용액에 제2 복합체를 첨가하여 제2 복합체가 분산된 혼합용액을 제조하는 제3 단계 및 상기 혼합용액을 워터-인-오일(water-in-oil)방법을 이용하여 바이오 복합체를 제조하는 제4 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 상기 카테콜계 물질은 갈산일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 젤라틴과 갈산의 함량은 80:1 내지 210:1 중량비일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 금속 나노입자 전구체는 CuCl₂, AgNO₃ 및 Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 따르면, 높은 항균 효과와 낮은 세포 독성을 갖는 바이오 복합체를 제공할 수 있으며, 카테콜계 물질을 이용하여 안정적으로 항균 물질의 방출을 제어할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 바이오 복합체 및 이의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 본 발명의 바이오 복합체의 제조방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 젤라틴-갈산의 복합체의 결합 확인을 위한 FT-IR과 ¹H NMR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 그래핀 산화물-구리 나노입자와 바이오 복합체의 형태를 분석하기 위한 TEM(Transmission Electron Microscopy) 이미지이다.
도 5는 갈산 첨가 유무에 따른 바이오 복합체의 안정성을 분석하기 위한 도면이다.
도 6은 갈산 함량에 따른 (a) 바이오 복합체(GA 4.5), (b) 바이오 복합체(GA 9) 및 (c) 바이오 복합체(GA 12)의 항균 물질의 방출 능력을 분석하기 위한 도면이다.
도 7은 본 발명의 바이오 복합체의 항균 능력을 평가하기 위한 도면이다.
도 8은 본 발명의 바이오 복합체의 세포 독성을 평가하기 위한 도면이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

도 1은 본 발명의 바이오 복합체 및 이의 제조방법을 설명하기 위한 도면이다.

도 1을 참조하면 본 발명의 바이오 복합체는 생체고분자 물질, 카테콜계 물질, 그래핀 산화물 및 금속 나노입자를 포함한다.

상기 생체고분자 물질은 세포 독성이 적거나 또는 없으며, 수상에 녹거나 분산될 수 있는 생체 적합성 고분자 물질로서, 예를 들어, 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan) 등일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 생체 고분자는 젤라틴일 수 있다. 상기 젤라틴은 천연 고분자 생체 재료로 생체 적합성, 생분해성 및 세포 부착성 등이 매우 높은 특징이 있다. 그러나 순수 젤라틴의 경우 온도가 높을 때 빠른 시간 내에 녹아버리기 때문에 항균 물질의 방출을 통제할 수 없다. 따라서 본 발명에서는 카테콜계 물질을 사용하여 조직 접착성을 향상시켰다.

상기 카테콜계 물질(catechol group material)은 접착성 물질로 여러 종류의 표면에 접착 가능하다. 본 발명에서는 카테콜계 물질을 이용하여 생체고분자 물질의 생체 접착성을 높이고 동시에 항균 물질을 생체고분자 물질 내에 안정적으로 탑재시킬 수 있다. 바람직하게, 상기 카테콜계 물질은 갈산(gallic acid)일 수 있다. 상기 갈산은 접착력 이외에도 항균, 항암, 항염증, 항산화 작용과 같은 다양한 생물학적 효과를 가질 수 있다.

일 실시예에서, 상기 생체고분자 물질로 젤라틴을 이용하고, 상기 카테콜계 물질로 갈산을 이용하는 경우, 상기 젤라틴과 갈산의 함량은 80:1 내지 210:1 중량비일 수 있다. 갈산의 함량을 제어함으로써 본 발명의 바이오 복합체의 금속 이온 방출 능력을 제어할 수 있다. 갈산의 함량이 증가할수록 본 발명의 바이오 복합체는 항균 물질이 서서히 방출되는 서방출형 특성을 가질 수 있다.

상기 그래핀 산화물(graphene oxide, GO)은 그래핀을 산화시킨 물질을 의미하는 것으로, 본 발명에서 상기 그래핀은 상기 금속 이온의 산화를 제어하여 자유 금속 입자에 비해 세포 독성을 낮출 수 있는 효과를 제공한다.

상기 금속 나노입자는 항균 효과를 제공하는 항균 물질로 사용될 수 있다, 상기 금속 나노입자는 산화되어 금속 이온을 방출함으로써, 미생물, 박테리아 등을 사멸시킬 수 있다. 그러나 상기 금속 나노입자는 표면적 대비 부비 비율이 매우 높아 방출되는 금속 이온의 양이 매우 많아 세포에 치명적일 수 있다. 그러나 상기 그래핀 산화물에 합성되어 존재하므로 상기 그래핀 산화물이 산화를 제어하여 금속 이온의 방출을 제어할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 금속 나노입자는 은(Ag), 구리(Cu), 아연(Zn) 및 티타늄(Ti) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 나노입자일 수 있다. 그러나 본 발명에서는 이에 반드시 한정하는 것은 아니며, 항균 특성을 갖는 금속 나노입자는 모두 사용가능하다.

본 발명의 바이오 복합체 제조방법은 생체고분자 물질과 카테콜계 물질을 결합하여 제1 복합체를 제조하는 제1 단계, 그래핀 산화물이 분산된 용액에 금속 나노입자 전구체 용액과 환원제를 첨가하여 제2 복합체를 제조하는 제2 단계, 상기 제1 복합체가 용해된 용액에 제2 복합체를 첨가하여 제2 복합체가 분산된 혼합용액을 제조하는 제3 단계 및 상기 혼합용액을 워터-인-오일(water-in-oil)방법을 이용하여 바이오 복합체를 제조하는 제4 단계를 포함한다.

상기 생체고분자 물질, 카테콜계 물질, 그래핀 산화물 및 금속 나노입자 구성은 도 1을 참조하여 설명한 바이오 복합체의 구성과 실질적으로 동일하므로, 이들에 대한 중복된 상세한 설명은 생략하고, 이하에서는 제조방법을 중심으로 설명한다.

상기 제1 단계는 가교제(crosslinker)를 사용하여 제1 복합체를 제조할 수 있다. 본 발명에서는 상기 가교제의 영향을 최소화하기 위해 제로링커(zero-linker)를 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 가교제는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 NHS(N-Hydroxysuccinimide) 일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 생체고분자 물질이 젤라틴이고, 상기 카테콜계 물질인 경우, 상기 젤라틴과 갈산의 함량은 80:1 내지 210:1 중량비일 수 있다.

일 실시예에서, 상기 생체고분자 물질은 젤라틴이고, 상기 카테콜계 물질은 갈산이며 및 상기 가교제로 EDC와 NHS를 이용하는 경우, 상기 제1 복합체는 다음과 같은 과정을 통해 제조될 수 있다.

도 2는 본 발명의 바이오 복합체의 제조방법의 일 실시예를 설명하기 위한 도면이다.

도 2를 참조하면, 갈산의 카르복시기(carboxyl group, -COOH)와 EDC가 반응하여 결합하여 중간체가 제조될 수 있다. 상기 중간체는 NHS에 의해 안정화되고, 이 때, 젤라틴을 첨가하게 되면, 젤라틴의 아민기(amine group, -NH₂)와 갈산이 아마이드 결합(amide bond)을 통해 결합될 수 있다. 상기 결합을 통해 제1 복합체가 제조될 수 있다. EDC/NHS 반응은 약산성 조건에서 수행되는 경우 높은 반응성을 보이므로, 약산성 조건을 맞추기 위해 추가적으로 버퍼가 첨가될 수 있다. 예를 들면, 상기 버퍼는 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)일 수 있다.

상기 제1 복합체는 추가적으로 세척 및 건조하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 복합체의 건조는 동결건조에 의해서 수행될 수 있다.

다시 도 1을 참조하면, 상기 제2 단계의 상기 그래핀 산화물이 분산된 용액은 그래핀 산화물을 탈이온수에 분산시킨 분산액일 수 있으며, 상기 그래핀 산화물의 균질한 분산을 위해 초음파를 분산액에 가하여 그래핀 산화물을 분산시킴으로서 제조될 수 있다.

상기 제2 단계는 상기 그래핀 산화물 분산액과 환원제 및 금속 나노입자의 전구체를 첨가하는 단계로, 상기 환원제가 첨가됨에 따라 상기 그래핀 산화물에 분산된 상기 금속 나노입자 전구체가 환원되어 상기 그래핀 산화물의 표면 또는 내부에 금속 나노입자가 결합된 제2 복합체가 제조될 수 있다.

상기 제2 복합체는 추가적으로 세척 및 건조하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제1 복합체의 건조는 동결건조에 의해서 수행될 수 있다.

상기 금속 나노입자의 전구체는 금속염일 수 있고, 일 실시예에서, 상기 금속 나노입자의 전구체는 CuCl₂, AgNO₃ 및 Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 그러나 본 발명에서는 이에 한정하는 것은 아니다. 마찬가지로, 상기 환원제로는 NaBH₄, LiAlH₄, KBH₄ 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는, 상기 환원제는 NaBH₄일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제3 단계는 상기 제1 단계에서 제1 복합체와 상기 제2 단계에서 제조된 제2 복합체를 결합하여 바이오 복합체를 제조하는 단계로, 워터-인-오일 방법을 이용하는 것을 특징으로 한다. 상기 워터-인-오일 방법은 워터를 한 방울 씩 적가하여 떨어뜨리는 식으로 수행하는 방법으로, 간단한 제작 과정 및 높은 입자 생성 속도로 인해 본 발명의 제조방법에서 사용될 수 있다.

본 발명에서는 상기 워터-인-오일 방법의 워터가 상기 혼합용액에 해당될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 오일은 계면활성제가 포함된 혼합물일 수 있다. 바람직하게는. 상기 오일은 계면활성제가 1 내지 2% 혼합된 오일일 수 있다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 친유성 계면활성제일 수 있고, 구체적으로 SPAN 80일 수 있다. 상기 오일은 파라핀 오일일 수 있다. 그러나 본 발명에서는 반드시 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법을 통해 제조된 바이오 복합체는 생체고분자 물질, 카테콜계 물질, 그래핀 산화물 및 금속 나노입자를 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 갈산의 첨가로 생체고분자 물질의 접착력을 강화시켜, 바이오 복합체의 형태를 종래 기술과 비교하여 장시간 동안 유지할 수 있으며, 항균 물질인 금속 나노입자를 안정적으로 바이오 복합체에 탑재할 수 있다. 또한, 갈산의 함량에 따라 바이오 복합체의 형태 유지를 제어할 수 있어 금속 이온의 제어된 방출을 통해, 정상 세포에 끼치는 영향을 최소화하면서 박테리아를 사멸시킬 수 있는 효과가 있다.

이하에서, 구체적인 실시예들 및 비교예를 통해서 본 발명의 바이오 복합체 및 이의 제조방법에 대해서 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 일부 실시 형태에 불과한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 바이오 복합체>

① 젤라틴-갈산 복합체 제조

젤라틴-갈산 복합체는 가교제(crosslinker)를 사용하여 제조하였다. 가교제의 영향을 최소화하기 위하여 제로-길이 가교제(zero-length crosslinker)인 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 사용하였다. 먼저, MES((2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)) 버퍼에 갈산 204mg 및 NHS 140mg을 첨가한 다음 EDC 232mg을 첨가하였다. EDC의 첨가로 EDC와 갈산의 카르복실기(carboxylic group)가 반응하게 된다. 이후에, 젤라틴 1g 용액을 넣어 젤라틴의 아민기(amine group)와 EDC를 반응을 유도하여, 젤라틴과 갈산을 결합시켰다. 충분히 반응시킨 후 결합하지 않은 갈산을 투석(dialysis)을 통해 제거한 뒤 동결 건조하여, 본 발명의 실시예 1에 따른 젤라틴-갈산 복합체를 얻었다.

도 3은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 젤라틴과 갈산의 복합체의 결합 확인을 위한 FT-IR과 ¹H NMR 분석 결과를 나타낸 도면이다.

도 3을 참조하면, FT-IR 분석 결과, 갈산은 1383cm^-1에서 피크를 나타내는 반면 젤라틴은 피크를 나타내지 않는다. 하지만 젤라틴-갈산 복합체에는 1383cm^-1 피크가 나타난다. 또한 1H NMR 분석 결과, 갈산의 7.1ppm 피크가 젤라틴에서는 나타나지 않았으나 젤라틴-갈산 결합체에서 나타남을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 젤라틴-갈산 복합체는 젤라틴에 없는 갈산의 피크가 발견되어 젤라틴과 갈산이 안정적으로 결합되었음을 알 수 있다.

② 그래핀 산화물-금속 나노입자 복합체 제조

1g 그래핀 산화물을 물에 넣고 초음파 처리(sonication)를 1시간하여 그래핀 용액을 제조하였다. 그래핀 용액에 0.02M의 CuCl₂ 용액을 첨가한 후, 1시간 동안 초음파 처리(sonication)하여 반응시킨 후, 환원제 NaBH₄를 첨가하여 구리 나노입자를 그래핀 표면에 환원시켰다. 그런 다음, 원심분리를 이용하여 남은 구리와 환원제를 워싱하고 동결 건조하여, 본 발명의 실시예 1에 따른 그래핀 산화물-구리 나노입자를 얻었다.

얻어진 그래핀 산화물에 합성된 구리 나노입자의 양은 유도 결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)을 통해 확인하였고, ICP-MS를 통해 확인한 결과 그래핀 산화물-구리 나노 입자에는 구리 나노입자가 약 50% 존재함을 확인하였다.

③ 바이오 복합체의 제조

먼저, 상기에서 제조된 동결 건조된 젤라틴-갈산 복합체를 물에 녹여 젤라틴-갈산 용액을 제조한 다음, 그래핀 산화물-구리 나노입자를 초음파 처리(sonication)를 통해 물에 분산시켜 젤라틴-갈산 용액에 첨가한 후 충분히 섞어 혼합용액을 제조하였다. 워터-인-오일(Water-in-Oil) 방법을 통해 바이오 복합체로 만들기 위해, 상기 혼합용액을 계면 활성제인 SPAN 80을 1% 섞은 파라핀 오일에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 그런 다음, 30분 동안 오일과 젤라틴 수용액을 균일하게 섞어준 후, 1시간 동안 4℃에서 냉각시켜 젤라틴 마이크로 입자를 제조하였다. 상기 젤라틴 마이크로 입자에 묻은 오일을 아세톤을 통해 워싱한 후, 잔여 아세톤을 기화시켜 그래핀 산화물-구리 나노입자를 포함하는 바이오 복합체를 얻었다,

<실험예 1: 구조 분석>

도 4는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 그래핀 산화물-구리 나노입자와 바이오 복합체의 형태를 분석하기 위한 TEM(Transmission Electron Microscopy),광학 현미경, SEM(Scanning Electron Microscope) 이미지이다.

도 4를 참조하면, (A) 그래핀 산화물에 구리 나노입자가 결합된 형태를 확인할 수 있으며, 육면체의 형태로 구리 나노입자가 제조되었음을 확인할 수 있다. (B) 그래핀 산화물-금속 나노입자가 포함되지 않은 바이오 복합체와 비교하여, (C) 본 발명의 바이오 복합체는 검정색 입자를 통해 그래핀 산화물-구리 나노입자를 포함하고 있음을 확인할 수 있다. (D) 본 발명의 바이오 복합체가 구형의 형태로 제조되었음을 확인할 수 있다.

<실험예 2: 갈산 첨가에 따른 바이오 복합체의 안정성 분석>

갈산의 존재에 따른 그래핀 산화물-구리 나노입자와 젤라틴의 접착력을 분석하기 위해, 본 발명의 바이오 복합체에 물을 첨가한 후 볼텍싱(vortexing) 또는 10초 동안의 초음파(sonication) 처리를 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타냈다.

도 5는 참조하면, 갈산이 존재하는 본 발명의 바이오 복합체("GA O"에 해당)의 경우에는 젤라틴 형태를 잘 유지하면서 내부에 그래핀 산화물-구리 나노입자 복합체의 형태를 또한 잘 유지하여 담지하고 있음을 확인할 수 있다. 반면, 갈산이 존재하지 않는 복합체("GA X"에 해당)의 경우에는 젤라틴 형태와 내부에 담지된 그래핀 산화물-구리 나노입자가 파괴됨을 확인할 수 있다. 따라서 갈산을 첨가함으로써 젤라틴에 접착력을 부여하여 항균 물질을 안정적으로 탑재할 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 3: 갈산 함량에 따른 방출 능력 분석>

젤라틴 1g당 갈산을 51, 102, 204, 408 mg을 첨가하여, 본 발명의 실시예 1과 동일한 공정을 수행하여 각각의 바이오 복합체를 얻었다. 갈산 함량에 따라 각각 제조된 바이오 복합체의 갈산 함량을 표 1에 나타냈다.

	초기에 첨가한 갈산의 양 (젤라틴 1g 당 갈산의 함량)	제조된 바이오 복합체의 첨가된 갈산의 양 (젤라틴 1g 당 갈산의 함량)
바이오 복합체 (GA 4.5)	51mg	4.42mg
바이오 복합체 (GA 9)	102mg	9.03mg
바이오 복합체 (GA 12)	204mg	12.04mg

도 6은 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 바이오 복합체(GA 4.5, GA 9 및 GA 12)의 항균 물질 방출 능력을 나타낸 도면이다.

도 6을 참조하면, (a) 바이오 복합체(GA 4.5)는 15분 이내로 바이오 복합체가 완전히 녹아 그래핀 산화물-구리 나노입자 복합체가 방출함을 확인할 수 있다. (b) 바이오 복합체(GA 9)는 천천히 녹아 약 3시간 동안 그래핀 산화물-구리 나노입자 복합체가 방출함을 확인할 수 있다. 이와 비교하여, (c) 바이오 복합체(GA 12)는 24시간 이상이 지난 상태에서도 바이오 복합체가 완전히 녹지 않고 그래핀 산화물-구리 나노입자 복합체를 방출하고 있음을 확인할 수 있다. 즉 본 발명은 갈산의 함량에 따라 금속 이온의 방출 속도를 제어할 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 4: 바이오 복합체의 항균 능력 평가>

그람 음성균(gram-negative bacteria) 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 그람 양성균(gram-positive bacteria) 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis) 2가지 박테리아를 대상으로 항균 능력을 평가하였다. 갈산(GA, 0 ~ 200 μg/mL), 그래핀 산화물-구리 나노입자(GO/Cu, 0 ~ 50 μg/mL) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 복합체(GO/Cu@GE-GA, 0 ~ 2 mg/mL)를 멸균된 생리식염수에 농도별로 넣고 분산시켰다. 하루 동안 액체 배지에서 배양된 박테리아에 앞서 준비한 각각의 샘플들을 각각 24시간 동안 투여였고, 이때 처음 박테리아의 농도는 적정 농도 5ㅧ10⁵ CFU/mL가 되도록 하였다. 24시간 후 샘플이 처리된 박테리아를 새 고체 배지에 스프레딩(spreading)하여 집락 형성 단위(colony forming unit)를 확인하였다. 항균 능력 평가는 아무 것도 처리 하지 않은 박테리아의 집락 개수 대비하여 항균 물질이 처리된 박테리아의 집락 개수를 측정하여 수행되었고, 그 결과를 도 7에 나타냈다.

도 7을 참조하면, 갈산(GA)과 그래핀 산화물-구리 나노입자(GO/Cu)와 비교하여, 바이오 복합체(GO/Cu@GE-GA)는 적은 농도의 박테리아 조건에서도 항균 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 4%의 그래핀 산화물-구리 나노입자를 포함하는 바이오 복합체는 그람 양성균은 0.25 mg/mL 이상, 그람 음성균은 0.5 mg/mL 이상부터 항균 효과를 보여, 1%의 그래핀 산화물-구리 나노입자를 탑재한 바이오 복합체와 비교하여 더 소량의 박테리아에서도 항균 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오 복합체는 그람 양성균과 그람 음성균 모두에 항균 효과가 있으며, 그람 음성균보다 그람 양성균에 좀 더 뛰어난 항균 효과를 보임을 알 수 있다.

<실험예 5: 바이오 복합체의 세포 독성 평가>

본 발명의 바이오 복합체의 세포 독성 평가는 다음과 같이 수행하였다. 갈산(GA), 그래핀 산화물-구리 나노입자(GO/Cu) 및 바이오 복합체(GO/Cu@GE-GA)의 세포 독성실험은 인간 진피 섬유아세포(Human dermal fibroblasts)를 대상으로 하였고, 인간 진피 섬유아세포의 농도는 1ㅧ10⁵cells/mL가 되도록 하였다. 24시간 동안 2차원으로 배양된 섬유아세포의 배양액에 갈산(GA, 0 ~ 200 μg/mL), 그래핀 산화물-구리 나노입자(GO/Cu, 0 ~ 50 μg/mL) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 복합체(GO/Cu@GE-GA, 0 ~ 2 mg/mL)를 투여하고, 24시간 동안 세포 독성을 확인하였다. 24시간 후, 존재하는 세포의 양은 상용화된 키트(cell counting kit-8)를 사용하여 정량적으로 확인하였다. 이 때 흡광도를 통해 정량적으로 확인해야 하는데, 그래핀이 들어 있는 경우 그래핀의 흡광도가 측정에 영향을 미치므로, 세포 배양액의 상단 부분의 50μL만 새로 담아 흡광도를 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타냈다.

도 8을 참조하면, 갈산(GA)과 그래핀 산화물-구리 나노입자(GO/Cu) 보다 바이오 복합체(GO/Cu@GE-GA)가 세포 독성이 적은 것을 확인할 수 있다. 4%의 그래핀 산화물-구리 나노입자를 포함하는 바이오 복합체의 경우 1 mg/mL까지는 세포 생존율이 약 80% 이상으로 세포 독성이 매우 적은 것을 확인할 수 있다.

상기 실험예들을 통해 본 발명의 바이오 복합체는 0.5 ~ 5 mg/mL의 농도에서도 그람 양성균과 그람 음성균에 항균 효과를 보이나 세포 독성이 매우 적은 것을 확인할 수 있다. (특히, 4%의 그래핀 산화물-구리 나노입자를 포함하는 바이오 복합체는 0.5 ~ 1 mg/mL 농도에서 항균 효과를 나타냈다.) 정리하면, 본 발명의 바이오 복합체는 세포에는 덜 치명적이지만, 박테리아를 살균 또는 멸균하기에는 충분한 효과를 제공할 수 있음을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 NHS(NHydroxysuccinimide) 가교제를 통해 젤라틴과 갈산이 결합된 제1 복합체 및
그래핀 산화물의 표면 또는 내부에 항균 특성을 갖는 금속 나노입자가 결합된 제2 복합체를 포함하고,
상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체를 워터-인-오일(water-in-oil)방법을 이용하여 결합하여 제조되며,
상기 젤라틴과 상기 갈산의 함량은 80:1 내지 210:1 중량비이고, 상기 갈산의 함량이 증가할수록 상기 금속 나노입자의 이온 방출 속도가 감소하는 것을 특징으로 하는,
바이오 복합체.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 금속 나노입자는 은(Ag), 구리(Cu), 아연(Zn) 및 티타늄(Ti)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인,
바이오 복합체.
젤라틴과 갈산을 결합하여 제1 복합체를 제조하는 제1 단계;
그래핀 산화물이 분산된 용액에 항균 특성을 갖는 금속 나노입자 전구체 용액과 환원제를 첨가하여 제2 복합체를 제조하는 제2 단계;
상기 제1 복합체가 용해된 용액에 제2 복합체를 첨가하여 제2 복합체가 분산된 혼합용액을 제조하는 제3 단계; 및
상기 혼합용액을 워터-인-오일(water-in-oil)방법을 이용하여 바이오 복합체를 제조하는 제4 단계를 포함하고,
상기 제1 단계에서 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 NHS(NHydroxysuccinimide) 가교제를 통해 젤라틴과 갈산이 결합하여 제 1 복합체가 제조되며,
상기 바이오 복합체는 상기 젤라틴과 갈산의 함량은 80:1 내지 210:1 중량비이고, 갈산의 함량이 증가할수록 상기 금속 나노입자의 이온 방출 속도가 감소하는 것을 특징으로 하는,
바이오 복합체의 제조방법.
삭제
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삭제
제6항에 있어서,
상기 금속 나노입자 전구체는 CuCl₂, AgNO₃ 및 Zn(CH₃COO)₂·2H₂O 으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인,
바이오 복합체의 제조방법.