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KR102630558B1 - 아포지질단백질의 검출 방법 - Google Patents

아포지질단백질의 검출 방법 Download PDF

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KR102630558B1
KR102630558B1 KR1020187015716A KR20187015716A KR102630558B1 KR 102630558 B1 KR102630558 B1 KR 102630558B1 KR 1020187015716 A KR1020187015716 A KR 1020187015716A KR 20187015716 A KR20187015716 A KR 20187015716A KR 102630558 B1 KR102630558 B1 KR 102630558B1
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마틴 안드레스 로드리게즈
라라 미구엘 깔레로
루에다 올가 깔레로
알베르트 루이스 가르시아
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바이오크로스 에스.엘.
인스티투토 데 살루드 카를로스 Ⅲ
센트로 데 인베스티가시온 바이오메디카 엔 레드 데 엔페르메다데스 뉴로데헤네라티바스
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Abstract

본 발명은 샘플에서 아포지질단백질 및 이의 이소형을 검출 및 정량하는 방법 뿐만 아니라 본 발명의 검출 방법으로 결정된 아포지질단백질의 수준에 기초하여 신경퇴행성 질환 또는 심혈관 질환의 발병 가능성을 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

아포지질단백질의 검출 방법
본 발명은 샘플 내의 아포지질단백질 및 이의 이소형의 검출 방법 및 정량 방법, 및 본 발명의 검출 방법에 의해 결정된 아포지질단백질의 수준에 기초한 신경퇴행성 또는 심혈관성 질환의 발병 가능성을 예측하는 예측 방법에 관한 것이다.
아포지질단백질 E (apoE)는 지질 대사에 관여하는 34 kDa의 당단백질이다. 이 단백질을 코딩하는 인간 APOE 유전자는 다형체이며, 19번 염색체에 위치한다. apoE 단백질 이소형 3종, E2, E3 및 E4를 코딩하는 3가지의 일반적인 공-우성 대립유전자 (ε2, ε3 및 ε4)가 존재한다. 이들 이소형은 아미노산 잔기 112 및 158 위치에서 차이가 있다. 이소형 E2는 상기한 양쪽 위치에 시스테인 잔기를 가지며, E4는 상기 양쪽 위치에 아르기닌 잔기를 가지고 있지만, 가장 흔한 형태인 E3는 112번 위치에 시스테인과 158번 위치에 아르기닌을 가진다. 이러한 차이는 apoE의 생물학적 기능에 상당한 영향을 미친다. 이들 이소형은 지질-결합 활성에 차이를 보인다: E2 및 E3는 고-밀도 지단백질 (HDL)에 우선적으로 결합하지만, E4는 저-밀도 지단백질 (VLDL)에 우선적으로 결합한다. 이러한 생화학적 차이로 인해 이들 이소형은 서로 다른 병리학적 프로세스와 연관될 수 있다. 이소형 E4는 고 수준의 콜레스테롤, 및 관상 심장 질환 및 알츠하이머 질환의 위험도 증가와 연관되어 있다. 반면, 이소형 E2는 알츠하이머 질환에 대한 예방 효과를 나타내지만, III형 가족성 고지질단백혈증과 연관되어 있다. 따라서, 역학 연구, 임상 실험에서 환자의 분류 (stratification) 및 위험성이 증가된 개체의 동정 및 예방에 있어, APOE 유전자형 또는 apoE 이소형에 대한 관심이 높다.
APOE의 주된 3가지 하플로타입 (haplotype)의 유전자형을 동정하기 위해 몇가지 방법들이 일반적으로 사용된다. 흔히 사용되는 방법은 다음과 같다: PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism), 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis), PCR + 서열분석 또는 질량 분광측정, ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System-PCR) 및 SSP-PCR (Simple Sequence Specific Primer-PCR), 형광 용융 곡선에 의한 실시간 PCR 검출, FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer), 대립유전자 특이적인 RT-PCR 및 TaqMan® 프로브. 그러나, 이들 APOE 유전자-기반의 방법들 모두 DNA 추출 및 유전자 정보 분석을 위해 사전 동의가 필요하지만, 임상 분석 절차에서 쉽게 입수할 수 없다.
주로 연구 목적으로, apoE 이소형을 민감하게 식별하기 위한 몇가지 대안적인 생화학적 (비-유전자) 방법들이 사용된다. 가장 많이 사용되는 방법은, 혈장 또는 CSF와 같은 생물 체액 유래의 aopE의 특징에 의존하는, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing, IEF)과 샌드위치 ELISA이다. apoE를 분석하기 위한 IEF의 경우, 고정된 pH 구배 조건에서 단백질의 등전점 전기영동을 수행한 다음 분리된 이소형에 대해 anti-apoE 항체를 사용해 면역검출을 수행한다. 특이적인 apoE-밴드 패턴은 샘플에 존재하는 여러가지 apoE 이소형들의 검출을 가능하게 해준다. 이 기법은, apoE E2, E3 및 E4 이소형 이외의 다른 드문 apoE 변이체들을 검출할 수 있는 장점이 있지만, 기술적으로 어렵고 시간이 걸린다.
ELISA (효소-연계된 면역흡착 분석) 기법은 타겟 단백질을 포획하기 위해 항체를 이용한다. 샌드위치 ELISA를 이용해 apoE E4 이소형의 존재를 체크할 수 있으며, 2가지 항체 (포획 항체 및 리포터 항체)의 사용에 의존하는데, 이 항체 중 하나는 E4 이소형에 특이적이어야 한다. apoE E4를 검출하기 위한 시판 ELISA 키트들이 수종 존재하지만 (예, ApoE4/pan-ApoE ELISA 키트, MBL #7635), 본질적인 기술적 한계로 인해 이 방법은 임상적인 통상의 조건에서는 구현된 바가 없다.
아포지질단백질의 수준에 기초하여 질환 발병을 예측하는 방법들이 당해 기술 분야에 개시되어 왔다. US5945289A는 PCR을 이용한 ApoE 대립유전자의 유전자형 식별에 기초하여 개체의 전립선암 발병 성향을 분석하는 방법에 관한 것이다.
그러나, 샘플에서 아포지질단백질을 신속하고 신뢰할 수 있게 결정할 수 있는, 믿을 수 있고 정확한 아포지질단백질 검출 방법 및 아포지질단백질 이소형 식별 방법에 대한 개발 필요성이 당해 기술 분야에 여전히 존재한다. 이러한 방법들은, 아포지질단백질 또는 특히 이의 이소형의 존재 또는 부재와 관련된 일부 질환의 발병을 예측하는데 유익할 것이다.
본 발명의 발명자들은 아포지질단백질 및 이의 이소형을 검출, 정량 및 분석하는 방법을 개발하게 되었다. 이 방법은 표면, 특히 폴리스티렌 표면에 아포지질단백질이 결합하는 특별한 특성에 기반하여, 검출 또는 정량에 있어 포획 항체 또는 사전 단리 공정의 필요성을 생략한다. 본 발명자들은 아포지질단백질, 특히 apoE가 폴리스티렌 표면 (ELISA 플레이트, 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드 등)에 의해 특이적으로 포획된다는 것을 밝혀냈다. 특정 아포지질단백질 이소형, 예를 들어, apoE E4는, 이것이 표면에 결합되면, anti-apoE4 항체에 의해 검출할 수 있으며, 따라서 샘플내 apoE4 이소형의 검출 및 정량화를 달성할 수 있다. 이러한 정량 결과는 이형접합체 (ε2/ε4, ε3/ε4) 또는 동형접합체 (ε4/ε4)에서 APOE ε4 유전자형의 존재와 상관관계가 존재할 수 있다. 상기한 결합이 다른 아포지질단백질들에도 공통적이라는 것을 감안하면, 이 방법은 물론 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII 및 apoJ (클루스테린) 등의 다른 아포지질단백질에도 이용할 수 있다.
이에, 제1 측면에서, 본 발명은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질 또는 이들의 이소형을 검출 및/또는 정량하는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 이 방법은,
(i) 샘플을 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 표면에 결합시키기에 적절한 조건 하에 접촉시키는 단계로서, 상기 표면은 이 표면에 결합되는 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합된 표면에, 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를, 상기 항체와 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,
상기 폴리스티렌 표면 또는 상기 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 처리되지 않거나, 또는 샘플과의 접촉 전에 알부민으로 차단 처리된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 샘플에서 아포지질단백질의 전체 함량에 대해 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 아포지질단백질의 이소형의 상대적인 함량을 측정하는 시험관내 방법에 관한 것으로, 이 방법은
(i) 아포지질단백질을 표면에 결합시키기에 적절한 조건 하에 샘플을 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 접촉시키는 단계로서, 상기 표면은 이 표면에 결합되는 아포지질단백질에 특이적인 항체를 함유하지 않는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면에, 샘플에 존재하는 아포지질단백질 이소형에 특이적인 제1 항체 및 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체를 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉은 제1 항체 및 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 상기 제2 항체와 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건 하에 수행되는, 단계; 및
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체를 검출하는 단계; 및
(iv) 단계 (iii)에서 수득한 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준을 기초로 상기 아포지질단백질 전체 함량에 대한 상기 아포지질단백질 이소형의 상대적인 함량을 측정하는 단계를 포함하며,
상기 폴리스티렌 표면 또는 상기 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 처리되지 않거나, 또는 샘플과의 접촉 전에 알부민으로 차단 처리된다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질의 아포지질단백질 이소형의 발현과 관련있는 하플로타입 (haplotype)의 대립유전자량 (allelic dosage)을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은,
(i) 아포지질단백질 이소형이 발현되는 조직으로부터 유래되는, 상기 개체 유래의 단백질-함유 샘플을, 표면에 아포지질단백질 이소형을 결합시키기에 적절한 조건 하에, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 접촉시키는 단계로서, 이때 표면은 이 표면에 결합되는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면에, 아포지질단백질 이소형에 특이적인 하나 이상의 항체를, 항체와 아포지질단백질 이소형 간에 복합체를 형성시키기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체의 양과 유전자 변이체를 코딩하는 대립유전자의 수의 상관관계에 의해, 상기 아포지질단백질 이소형의 대립유전자량을 결정하는 단계를 포함하며,
상기 폴리스티렌 표면 또는 상기 폴리카르보네이트 표면은, 샘플과의 접촉 전에 처리되지 않거나, 또는 샘플과의 접촉 전에 알부민으로 차단 처리된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 개체 유래 샘플에서 apoE E4 이소형의 수준을 본 발명의 임의 방법에 따른 방법에 의해 결정하는 단계를 포함하며, apoE E4의 수준이 기준값 보다 높을 경우, 이는 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는, 개체에서 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 개체에서 apoE E4 이소형을 코딩하는 하플로타입의 대립유전자량을 본 발명의 임의 방법에 따른 방법에 의해 결정하는 단계를 포함하며, 개체의 게놈에 1 또는 2개의 apoE E4 대립유전자의 존재가 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것이고, 개체의 게놈에 apoE E4 대립유전자가 존재하지 않는다는 것은 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 낮다는 것을 의미하는, 개체에서 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 임의 방법에 따른 방법으로 아포지질단백질 이소형의 수준을 개체 유래 샘플에서 결정하는 단계를 포함하며, 아포지질단백질 이소형의 수준이 기준값 보다 높을 경우, 이는 그 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것인, 개체에서 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 임의 방법에 따른 방법으로 아포지질단백질 이소형을 코딩하는 하플로타입의 대립유전자량을 개체에서 결정하는 단계를 포함하며, 개체의 게놈에서 아포지질단백질 이소형의 대립유전자 1개 또는 2개가 존재하는 경우, 이는 그 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것이고, 개체의 게놈에 아포지질단백질 이소형의 대립유전자가 없을 경우, 이는 그 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 낮다는 것을 의미하는, 개체에서 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면; 및 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 포함하며, 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 제2 항체를 포함하지 않는, 키트에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 알부민으로 차단 처리된, apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한, 상기한 키트의 용도에 관한 것이다.
도 1은 apoE4 이소형을 함유하지 않는 혈장 샘플 157개와 apoE4를 함유한 샘플 73개에서 apoE E4 이소형의 존재를 분석하여 도시한 것이다.
도 2는 유전자형에 따라 분류된 apoE E4를 함유한 샘플 73개 (도 1)의 ELISA 흡광 결과를 도시한 것이다.
도 3은 APOE 유전자형에 따라 분류된, 분석 샘플 230개의 평균 흡광 결과를 도시한 것이다. 에러 막대는 평균의 표준 오차이다.
도 4는 APOE e4 비-보유체 (E3/E3), 및 이형접합체 (E3/E4) 및 동형접합체성 (E4/E4) APOE e4 보유체에서 여러가지 혈장 희석 수준에서의 apoE E4 / 총 apoE 흡광도 (4E4/pan-apoE) 비율을 도시한 것이다.
도 5는 ELISA 플레이트 포맷에서 폴리스티렌 표면에 대한 혈장 샘플 유래 아포지질단백질 (1:200)의 결합성을 도시한 것이다.
도 6은 ELISA 플레이트에 대한 ApoE의 결합에 있어 염 (NaCl 0-2.4 M)이 함유된 여러 완충제 또는 디터전트 (폴리소르베이트 20 -Tween 20- 또는 Triton X-100, 0-0.5%)의 효과를 도시한 것이다. 진회색 및 연회색 막대는 각각 BSA- 또는 Superblock 차단 용액으로 차단된 웰에서 샘플 분석 결과를 표시한다.
도 7은 ApoE의 ELISA 플레이트 결합에 대한 pH (2-10) 효과를 도시한 것이다. 연회색 및 진회색 막대는 각각 BSA- 또는 Superblock 차단 용액으로 차단된 웰에서 샘플 분석 결과를 표시한다.
도 8은 ApoE의 ELISA 플레이트 결합에 있어 엄격 조건의 효과를 도시한 것이다.
도 9는 여러가지 시점에 LEIT에 의한 apoE e3/e3 및 apoE e4/e4 샘플의 예비 분석 결과를 도시한 것이다.
본 발명의 발명자들은, 생물 체액 유래의 아포지질단백질, 특히 아포지질단백질 apoE, 보다 구체적으로 apoE의 이소형 4 (apoE E4)가 폴리스티렌 표면에 대해 안정적인 고-친화성 결합성을 가진다는 것을 발견하였다. 이러한 특성을 토대로, 본 발명자들은 등전점 전기영동 또는 포획 항체가 필요없는 아포지질단백질을 검출 및 정량하는 방법을 개발하였다. 본 발명은 연구소 뿐만 아니라 임상 분석 환경에서 쉽게 구현할 수 있는 간단하고, 믿을 수 있고, 비용-효율적인 방법을 기술한다. 아포지질단백질은 심혈관성 및 신경혈관성 위험과 신경퇴행과 연관되어 있으므로, 본원에 제공되는 방법은 알츠하이머 질환 (AD) 및 심혈관 장애에 대한 위험성이 증가된 환자를 분류 및 동정하기 위한 유용한 정보를 제공한다. 또한, 이 방법은 단백질 바이오마커로서 다른 아포지질단백질, 즉 apoCI, apoCII, apoCIII, apoAI 및 클루스테린을 식별하는데 활용할 수 있으며, 이는 혈액 또는 뇨 등의 쉽게 입수가능한 생물 체액을 분석하는데 적합하다.
정의
용어 "대립유전자"는, 본원에서, 유전자, 유전자좌 또는 유전자 다형성의 2가지 이상의 형태들 중 한가지를 지칭한다. 때때로, 서로 다른 대립유전자가 서로 다른 형질을 발현시킬 수 있지만, 어떤 경우에는 서로 다른 대립유전자가 유전자의 발현에 동일한 결과를 달성하게 될 것이다. 대부분의 다세포 유기체는 2세트의 염색체를 가지는데, 즉, 이배체이다. 이들 염색체를 상동성 염색체라 지칭한다. 이배체 유기체는 각 염색체에 각 유전자 (및 하나의 대립유전자)를 한 카피씩 가진다. 양쪽 대립유전자가 동일한 경우, 이는 동형접합체이다. 대립유전자들이 상이할 경우, 이는 이형접합체이다.
용어 "대립유전자량 (allelic dosage)"은, 본원에서, 이배체 유기체에서 0-2 범위의 특정 대립유전자 변이체의 카피 수를 의미한다.
용어 "알츠하이머 질환" 또는 "AD"는, 본원에서, 노인성 반점, 신경 다발 및 임상적으로 점진적인 기억 손상 (memory deficit)으로 나타나는 점진적인 뉴론 소실 (neuronal loss), 혼동, 거동 문제, 자기 관리 불능, 점진적인 육체적 쇠퇴 및 궁극적으로 사망으로 특정되는 특수 퇴행성 뇌 질환과 관련있는 정신적 피폐를 지칭한다. 본원에서, 이 용어는 질환의 모든 단계를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "항체", "면역글로불린" 및 유사 용어들은, 분석물 (항원)에 특이적으로 결합하여 인지하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 코딩되는 폴리펩타이드, 또는 이의 단편을 지칭한다. 인지되는 면역글로불린 유전자로는 κ, λ, α, γ, δ, ε 및 μ 유전자 뿐만 아니라 다수의 면역글로불린 가변부 유전자들을 포함한다. 경쇄는 κ 또는 λ로 분류된다. 중쇄는 γ, μ, α, δ 또는 ε으로서 분류되며, 이는 면역글로불린 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 각각 정의된다. 예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는, 각 쌍이 하나의 "경"쇄 (약 25 kD) 및 하나의 "중"쇄 (약 50-70 kD)를 가지는, 2쌍의 폴리펩타이드 체인으로 구성된다. 각 체인의 N-말단은 일차적으로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 구성된 가변부를 구성한다. 용어 가변성 경쇄 (VL) 및 가변성 중쇄 (VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 지칭한다. 각 중쇄의 C-말단들은 서로 이황화 결합하여, 항체의 불변부를 형성한다. 이들 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 서로 다른 "클래스"로 배정될 수 있다. 항체에는 주요 클래스 5종이 존재하며: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 몇몇은 "서브클래스" (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 전장 면역글로불린 "경쇄" (약 25 kDa 또는 약 214개의 아미노산)는 NH2-말단에 아미노산 약 1-10개로 된 가변부와 COOH-말단에 κ 또는 λ 불변부를 포함한다. 전장 면역글로불린 "중쇄" (약 50 kDa 또는 약 446개의 아미노산) 역시 가변부 (아미노산 약 116개)와 전술한 중쇄 불변부 또는 클래스 중 하나, 예를 들어, γ (아미노산 약 330개)를 포함한다. 여러 클래스들의 면역글로불린의 서브유닛 구조와 3차원 구조는 잘 알려져 있다.
용어 "아포지질단백질"은, 본원에서, 지질에 결합하여 지단백질을 형성한 단백질이다. 이 단백질은 효소 조인자, 수용체 리간드 및 단백질의 대사와 조직내 흡수를 조절하는 지질 이송 캐리어로서 작용할 수 있다. 이 용어는 apoA (이소형 apoA-I, apoA-II, apoA-IV 및 apoA-V 등), apoB (이소형 apoB48 및 apoB100 등), apoC (이소형 apoC-I, apoC-II, apoC-III 및 apoC- IV 등), apoD, apoE (이소형 apoE2, apoE3 및 apoE4 등), apoH 및 apoJ (클루스테린), 뿐만 아니라 apoF, apoG, apoL, apoM, apoN 및 apoO와 같이 다수의 아포지질단백질 클래스를 포괄한다. 특정 구현예에서, 아포지질단백질은 apoE이다.
용어 "아포지질단백질 A-I" 또는 "Apo A-I" 또는 "ApoAI"은, 본원에서, 혈장내 고밀도 지단백질 (HDL)의 주 단백질 구성 요소인 단백질이다. ApoAI은, 대부분의 혈장 콜레스테릴 에스테르의 형성을 담당하는 레시틴 콜레스테롤아실트랜스퍼라제 (LCAT)의 조인자이다. 인간에서, apoAI은 APOAI 유전자에 의해 코딩된다. apoA-I은 임의 기원, 예를 들어, 인간, 소, 뮤라인, 말, 개 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, apo A-I은 UniProt 등재번호 P026547 (2014년 5월 16일 공개)의 인간 단백질이다.
용어 "아포지질단백질 A-IV" 또는 "Apo A-IV" 또는 "ApoAIV"는, 본원에서, 잔기 306개로 된 프로단백질의 1차 번역 산물에 대한 단백질분해 후 수득되는 단백질을 지칭한다. apo A-IV는 임의 기원, 예를 들어, 인간, 소, 뮤라인, 말, 개 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, Apo A-IV는 UniProt 등재번호 P06727 (2014년 5월 16일 공개)의 인간 단백질이다. 인간 apoA-IV 이소형은 apoA-IV-1a (T347S) 및 apoA-IV-2 (Q360H)를 포함한다.
용어 "아포지질단백질 C-I" 또는 "Apo C-I" 또는 "ApoCI"은, 본원에서, 정상적으로 혈장에서 발견되며, 지단백질들 간의 에스테르화 콜레스테롤의 교환과 조직으로부터 콜레스테롤을 제거하는데 중요한 역할을 하는 에스테르화 레시틴 콜레스테롤의 활성화를 담당하는, 단백질이다. 인간에서, apoC-I은 APOC1 유전자에 의해 코딩된다. Apo C-I은 임의 기원으로부터, 예를 들어 인간, 소, 뮤라인, 말, 개 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, apoC-I은 UniProt 등재번호 P02654 (2014년 5월 16일 공개)의 인간 단백질이다. ApoC-I 이소형은 이의 계산되는 등전점을 기준으로 산성 이소형 (apoC-IA)과 염기성 이소형 (apoC-IB)을 포함한다.
용어 "아포지질단백질 C-II" 또는 "Apo C-II" 또는 "Apo CII"는, 본원에서, 정상적으로 혈장에서 발견되는 초저밀도 지단백질 (VLDL) 및 킬로미크론 (chylomicron)의 구성 성분인 단백질이다. 인간에서, apoC-II는 APOC2 유전자에 의해 코딩된다. apoC-II는 임의 기원으로부터, 예를 들어 인간, 소, 뮤라인, 말, 개 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, apoC-II는 UniProt 등재번호 P02655 (2014년 5월 16일 공개)의 인간 단백질이다.
용어 "아포지질단백질 C-III" 또는 "Apo C-III" 또는 "Apo CIII"는, 본원에서, 초저밀도 지단백질 (VLDL)의 구성 성분으로서 발견되는 단백질이다. ApoCIII는 트레오닌-74에서 당화될 수 있는 79개의 아미노산을 포함하는 상대적으로 작은 단백질이다. 이는 지단백질 리파제와 간 리파제를 저해한다. 인간에서, apo C-III는 APOC3 유전자에 의해 코딩된다. Apo C-III는 임의 기원으로부터, 예를 들어 인간, 소, 뮤라인, 말, 개 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, apo C-III는 UniProt 등재번호 P02656 (2014년 5월 16일 공개)의 인간 단백질이다. ApoC-III는, 단백질의 올리고사카라이드 영역의 말단에 위치한 시알산 분자의 개수 (0-2)에 따라, apoC-III0, apoC-III1 및 apoC-III2로 지칭되는 3가지 이소형으로 존재한다. 각 이소형은 순환계에서 전체 apoC-III 수준의 각각 약 10, 55 및 35%를 차지하는 것으로 알려져 있다.
용어 "아포지질단백질 -E" 또는 "Apo-E" 또는 "ApoE"는, 본원에서, 트리글리세라이드-풍부 지단백질 성분들의 정상적인 이화작용에 필수적인, 중간밀도 지단백질 (IDL) 및 킬로미크론에서 발견되는 단백질이다. 인간에서, 아포지질단백질 E는 유전자 ApoE에 의해 코딩되며, 이 유전자는 이소형 ApoE2 (cys112, cys158), ApoE3 (cys112, arg158) 및 ApoE4 (arg112, arg158)를 코딩하는, 3가지 주된 대립유전자 ε2, ε3 및 ε4를 가지는 다형성 유전자이다. 아포지질단백질 E는 임의 기원으로부터, 예를 들어 인간, 소, 뮤라인, 말, 개 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, Apo E는 UniProt 등재번호 P02649 (2014년 5월 16일 공개)의 인간 단백질이다.
용어 "아포지질단백질 E 2형 이소형" 또는 "apo E2"는, 본원에서, 아미노산 서열의 112 및 158번 위치에 시스테인 잔기가 존재하는 것으로 정의되는 단백질 아포지질단백질 E의 이소형 E2를 지칭한다.
용어 "아포지질단백질 E 3형 이소형" 또는 "apo E3"는, 본원에서, 아미노산 서열의 112번 위치에 시스테인 잔기와 158번 위치에 아르기닌 잔기가 존재하는 것으로 정의되는 단백질 아포지질단백질 E의 이소형 E3를 지칭한다.
용어 "아포지질단백질 E 4형 이소형" 또는 "apo E cod variable" 또는 "apo E4"는, 본원에서, 아미노산 서열의 112번 및 158번 위치에 아르기닌 잔기가 존재하는 것으로 정의되는 단백질 아포지질단백질 E의 이소형 E4를 지칭한다.
용어 "아포지질단백질 -J" 또는 "Apo-J" 또는 "ApoJ" 또는 "클루스테린 (clusterin)" 또는 "보체 세포용해 저해제 (complement lysis inhibitor)" 또는 "CLI" 또는 "황산화 당단백질 2" 또는 "SGP2" 또는 "SP-40,40" 또는 "테스토스테론-억제된 전립선 메시지 2 (testosterone-repressed prostate message 2)" 또는 "TRPM2"는, 본원에서, 면역 조절, 세포 부착, 형질변환 (transformation), 지질 수송, 조직 리모델링, 막 재이용 (membrane recycling) 및 세포-세포 상호작용에 영향을 미치는, 분비성 헤테로다이머 당단백질을 지칭한다. 클루스테린은, Arg227과 Ser228 간에 내부 결합이 번역 후 절단된, 아미노산 449개로 구성된 폴리펩타이드로서 합성된다. 아포지질단백질 J는 임의 기원으로부터, 예를 들어 인간, 소, 뮤라인, 말, 개 등으로부터 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, Apo J는 UniProt 등재번호 P10909 (2014년 5월 16일 공개)의 인간 단백질이다.
용어 "심혈관 질환" 또는 "심혈관 장애"는, 본원에서, 비-제한적인 예로, 허혈증, 부종성 병태 (edematous condition), 동맥경화증, 관상 심장 질환, LDL 산화, 내피 세포에 단핵세포의 부착, 포말 세포 (foam-cell) 형성, 지방선 발생, 혈소판 부착 및 응집, 평활근 증식, 재관류 손상, 고혈압, 혈전성 질환, 부정맥 (동맥 또는 심실성, 또는 이 둘다); 심박 장애; 심근 허혈증; 심근경색; 심장 또는 혈관 동맥류; 혈관염, 뇌졸증; 하지, 장기 또는 조직의 말초 폐색성 동맥병증; 뇌, 심장 또는 그외 장기 또는 조직의 허혈증, 내독소 쇼크, 외과적 쇼크 또는 외상성 쇼크로 인한 재관류 손상; 고혈압, 심장 판막 질환, 심부전, 이상 혈압; 쇼크; 혈관 수축 (편두통 관련 혈관 수축 등); 혈관 이상, 염증 및 단독 장기 또는 조직에 한정된 부전 (insufficiency) 등의, 심장 또는 혈관 또는 이 둘다에 발병하거나, 또는 심폐 및 순환 시스템과 관련있는 질환을 지칭한다.
용어 "디터전트 (detergent)"는, 본원에서, "계면활성제"라고도 하며, 액체에 첨가되었을 때, 디터전트가 첨가되지 않은 동일 액체와 비교해 액체의 표면 장력을 감소시키는, 양친매성의 표면-활성제를 지칭한다. 디터전트는 또한 단백질의 응집을 방지하고, 대상 단백질에 대한 비-특이적인 상호작용을 방지하거나 또는 오염물의 결합을 방지할 수 있다. 본 발명에 따른 디터전트는, 비-제한적인 예로, 비-이온성 (중성), 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성 디터전트를 포함한다.
비-이온성 또는 중성 디터전트의 예로는, 비-제한적인 예로, Tween® 20 (폴리소르베이트 20), Tween® 21 (폴리소르베이트 21), Tween® 40 (폴리소르베이트 40), Tween® 60 (폴리소르베이트 60), Tween® 61 (폴리소르베이트 61), Tween® 65 (폴리소르베이트 65), Tween® 80 (폴리소르베이트 80), Tween® 81 (폴리소르베이트 81), Tween® 85 (폴리소르베이트 85)와 같은 Tween 시리즈 (폴리소르베이트)의 디터전트, Span® 20과 같은 Span® 시리즈의 디터전트; Tergitol Type 15-S-12와 같은 Tergitol 시리즈의 디터전트; Brij® 35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P와 같은 Brij® 시리즈의 디터전트; Tween® 20, Tween® 21, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 61, Tween® 65, Tween® 80, Tween® 81, Tween® 85와 같은 Tween 시리즈의 디터전트; Triton® X-100, Triton® X-114, Triton® CF-21, Triton® CF-32, Triton® DF-12, Triton® DF-16, Triton® GR-5M, Triton® X-102, Triton® X-15, Triton® X-151, Triton® X-207, Triton® X-165, Triton® X-305, Triton® X-405, Triton® X-45, Triton® X-705-70과 같은 Triton® 시리즈의 디터전트, 또는 상기한 디터전트 하나 이상의 비-이온성 보존 유도체 (non-ionic conservative variant) 등이 있다.
음이온성 디터전트의 예로는, 비-제한적인 예로, 콜산 및 이의 유도체, 타우로콜린산, Triton X-200, Triton W-30, Triton-30, Triton-770, 다이옥틸설포 숙시네이트, N5N-다이메틸도데실아민 N-옥사이드, 소듐 1-알킬설포네이트, N-라우로일사르코신 또는 이의 지방산 염 등이 있다.
양이온성 디터전트의 예로는, 비-제한적인 예로, 모노 및 다이-메틸 지방 아민, 알킬 트리메틸 암모늄 염, 다이알킬 다이메틸 암모늄 염, 알킬 아민 아세테이트, 트리알킬암모늄 아세테이트, 알킬다이메틸벤질 암모늄 염, 다이알킬메틸벤질 암모늄 염, 알킬피리디늄 할라이드 및 알킬 (알킬 치환된) 피리디늄 염, 알킬티오메틸피리디늄 염, 알킬아미도메틸피리디늄 염, 알킬퀴놀리늄 염, 알킬이소퀴놀리늄 염, N,N-알킬메틸피롤리도늄 염, 1,1-다이알킬피페리디늄 염, 4,4-다이알킬티아모르폴리늄 염, 4,4-다이알킬티아모르폴리늄-1-옥사이드 염, 메틸 his (알킬 에틸)-2-알킬 이미다졸리늄 메틸 설페이트 (및 그외 염), 메틸 비스(알킬아미도 에틸)-2-하이드록시에틸 암모늄 메틸 설페이트 (및 그외 염), 알킬아미도프로필-다이메틸벤질 암모늄 염, 카르복시알킬-알킬다이메틸 암모늄 염, 알킬아민 옥사이드, 알킬다이메틸 아민 옥사이드, 폴리(비닐메틸피리디늄) 염, 폴리(비닐피리딘) 염, 폴리에틸렌이민, 트리알킬포스포늄 바이카보네이트 (및 그외 염), 트리알킬메틸포스포늄 염, 알킬에틸메틸설포늄 염, 및 알킬다이메틸설폭소늄 염 등이 있다.
양쪽성 디터전트의 예로는, 비-제한적인 예로, 3-[(3-콜라미도프로필)다이메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (CHAPS); 3-[(3-콜라미도프로필)다이메틸암모니오]-2-하이드록시-1-로로판설포네이트 (CHAPSO); N-(알킬 C10-C16)-N,N-다이메틸글리신베타인 (EMPIGEN BB); 카프릴릴설포베타인 (SB3-10); 3-[N,N-다이메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판설포네이트(아미도설포베타인-14; ASB-14); N-테트라데실-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트(3-14 디터전트; ZWITTERGENT); N-도데실-N,N'-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트; N-옥타데실-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트; N-데실-N,N-다이메틸-3-암모늄-1-프로판설포네이트; Mirataine CB; Mirataine BB; Mirataine CBR; Mirataine ACS; Miracare 2MHT 및 Miracare 2MCA 등이 있다.
본원에서, 표현 "가능성을 확인하는" 또는 "가능성의 예측" 또는 이와 유사한 용어들은 "가능성을 평가하는" 또는 "가능성의 평가"라는 표현과 동의어이고, 본 발명으로 환자의 질환, 특히 신경퇴행성 질환 또는 심혈관 질환 발병 가능성을 예측, 추정 또는 평가할 수 있다는 것을 의미한다. 가능성의 예측은 일반적으로 가능성의 증가 또는 감소를 내포한다. 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 예측은 평가할 개체에 대해 100% 정확한 것이 바람직하지만, 반드시 그런 것은 아니다. 그러나, 이 용어는, 통계학적으로 유의한 수준의 환자들을 질환, 특히 신경퇴행성 질환 또는 심혈관 질환을 앓을 가능성이 높은 것으로 동정할 수 있어야 한다. 개체가 통계학적으로 유의한 지는, 다양한 잘 공지된 통계학적 툴을 사용해, 예를 들어, 신뢰 구간 결정, p 값 결정, 스튜던트 t 검정, 만-휘트니 검정 등에 의해. 당해 기술 분야의 당업자에 의해, 과도한 노력없이, 결정할 수 있다. 상세 내용은 Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983에서 찾아볼 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다. p-값은, 바람직하게는 0.05, 0.025, 0.001, 0.0001 또는 그 이하이다.
본원에서 용어 "하플로타입 ( haplotype )"은, 본원에서, 부모 한쪽으로부터 자손에 유전되는 특정 유전자 그룹을 지칭한다. 구체적으로, 하플로타입은, 함께 유전될 가능성이 높은, 염색체 상의 특정 대립유전자들의 콜렉션을 포함한다. 하프로타입은 2 이상의 대립유전자를 포함할 수 있다.
용어 "면역비탁법 ( immunoturbidimetry )"은, 본원에서, 석출되어 샘플의 탁도를 높이는 항체-항원 면역 복합체가 분석물과 항체 간에 형성되게 유도하는, 분석물과 항체의 반응을 토대로 샘플내 분석물을 검출하는 기법을 지칭한다. 그 결과, 빛을 반응 용액에 투사시키면, 일부 빛은 샘플에 의해 분산되고, 일부 빛은 샘플에 의해 흡수되고, 나머지는 샘플을 통과한다. 흡광량은 분석물 농도와 직접 비례하거나, 또는 통과된 빛 신호는 분석물의 농도와 직접적으로 비례한다. 본 발명에 따르면, 면역비탁법에 의해 검출할 분석물은 아포지질단백질 또는 이의 이소형이며, 특히, apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린) 및 이들의 이소형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질이며, 보다 상세하게는 apoE 및/또는 apoE 이소형, 즉 apoE2, apoE3 및 apoE4이며, 더 바람직하게는 apoE4이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 면역비탁 분석은 LEIT (Latex-Enhanced Immunoturbidimetry Technology)이다.
용어 "신경퇴행성 질환"은, 본원에서, 신경 조직, 특히 뉴런의 퇴행 또는 퇴화로 야기되어, 시간 경과에 따라 부전 또는 불능으로 진행되는 질환을 지칭하며; 용어 변성은 세포 생존성 감소, 세포 기능 감소 및/또는 세포 (뉴런 또는 기타)의 수 감소를 포함한다. 신경퇴행성 질환의 예시적인, 비-제한적인 예로는 알츠하이머 질환 (AD), 헌팅턴 질환, 파킨슨 질환, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 다발성 경화증 등이 있다. 구체적인 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 AD이다.
용어 "산화제"는, 본원에서, 레독스 (산화-환원) 반응에서 다른 종으로부터 전자를 취하는 화학 종을 지칭한다.
용어 "폴리카르보네이트"는, 본원에서, 화학 구조에 카보네이트 기 (-O-(C=O)-O-)를 가진 열가소성 폴리머 그룹을 지칭한다.
용어 "폴리스티렌"은, 본원에서, 모노머 스티렌으로 구성된 합성, 방향족, 열가소성 폴리머를 지칭한다. 폴리스티렌은 고체이거나 또는 폼 (foam) 형태일 수 있다.
용어 "프로테아제"는, 본원에서, 또한 단백질의 펩타이드 가수분해를 촉매하는 효소를 지칭한다. 프로테아제에 대한 예시적인, 비-제한적인 예로는 세린 펩티다제, 트레오닌 펩티다제, 시스테인 펩티다제, 아스파르틸 펩티다제, 메탈로펩티다제 및 글루타밀 펩티다제를 포함한다. 특정 구현예에서, 프로테아제는 펩신, 트립신 또는 키모트립신이다. 본원에서 사용되는, 용어 "펩신"은 소수성 아미노산과 바람직하게는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신과 같은 방향족 아미노산 간에 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매하는 프로테아제를 지칭한다.
용어 "환원제"는, 본원에서, 레독스 (산화-환원) 화학 반응에서 다른 화학 종 (산화제)에게 전자를 주는 화합물을 지칭한다. 환원제에 의한 전자 상실은 산화 반응을 발생시킨다.
용어 "기준 값"은, 본원에서, 개체로부터 수집된 샘플에서 수득된 데이타 또는 값을 평가하기 위한 기준으로서 사용되는 미리 정해진 기준을 의미한다. 기준 값 또는 기준 수준은 절대값; 상대값; 상한 또는 하한을 가진 값; 값들의 범위; 평균 값; 중앙값; 중간값; 또는 특정 대조군 또는 베이스라인 값과 비교되는 값일 수 있다. 기준 값은, 예를 들어, 테스트 중인 개체 샘플에서 수득되지만, 이 보다 조기 시점에 수득된 값과 같이, 개체 샘플 값을 토대로 할 수 있다. 기준 값은 생활 연령이 일치되는 그룹의 개체 집단으로부터 유래되는 등의 많은 수의 샘플에 또는 테스트할 샘플을 포함 또는 제외한 샘플의 풀에 기반할 수 있다.
용어 "염"은, 본원에서, 이온 형태이거나, 또는 카운터-이온 (양이온 또는 음이온)에 커플링된 하전된 형태, 또는 용액 중의 임의의 화합물 형태를 지칭한다. 이 정의는 특히 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
용어 "샘플"은, 본원에서 개체로부터 분리된 생물 물질을 지칭하며, 따라서 생물 샘플을 포함한다. 샘플은 원하는 마커를 검출하는데 적합한 임의의 생물 물질을 포함할 수 있으며, 개체 유래의 세포 및/또는 비-세포성 물질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 샘플은 임의의 적절한 생물 조직 또는 유체로부터 분리될 수 있다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 샘플로는, 비-제한적인 예로, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨 및 뇌척수액 (CSF) 등이 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 샘플은 혈장 샘플이다.
용어 "개체", 또는 "대상" 또는 "동물" 또는 "환자"는 치료를 원하는 임의의 개체, 특히 포유류 개체를 포함한다. 포유류 개체는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 기니아피그, 토끼, 랫, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 개체는 인간이다.
본 발명의 아포지질단백질 검출 및 정량 방법
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샘플에서 아포지질단백질 또는 이들의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한 시험관내 방법 (본 발명의 제1 방법)에 관한 것이다:
(i) 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 표면에 결합시키기에 적절한 조건 하에, 샘플을 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 접촉시키는 단계로서, 상기 표면은 이 표면에 결합되는 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합된 표면에, 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를, 항체 및 아포지질단백질 또는 이의 이소형 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계.
특정 구현예에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질 또는 이들의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로,
(i) 샘플을 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과, 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 표면에 결합시키기에 적절한 조건 하에 접촉시키는 단계로서, 상기 표면은 이 표면에 결합되는 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 형성된 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합된 표면에, 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를, 항체 및 아포지질단백질 또는 이의 이소형 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계,
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,
상기 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 처리되지 않거나, 또는 상기 샘플과의 접촉 전에 알부민으로 차단 처리된다.
본 발명의 제1 방법에 따라 검출 및/또는 정량할 아포지질단백질은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)를 포함한다. 검출 및/또는 정량할 아포지질단백질 이소형은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린) 이소형을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 제1 방법에 따라 검출 및/또는 정량할 아포지질단백질은 apoE이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 제1 방법에 따라 검출 및/또는 정량할 아포지질단백질 이소형은 apoE2, apoE3 및 apoE4로 이루어진 군으로부터 선택되는 apoE 이소형이다. 보다 특정한 구현예에서, 아포지질단백질은 apoE이며, 보다 상세하게는, 아포지질단백질 이소형은 apoE4이다.
즉, 본 발명의 제1 방법의 제1 단계에서, 샘플은 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 샘플내 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면에 결합하기에 적절한 조건 하에 접촉되며, 여기서 표면은 이에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는다.
샘플과 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면 간의 접촉은, 샘플내 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면에 결합하기에 적절한 조건에서의 직접 접촉에 의해 수행될 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 조건은 아포지질단백질 또는 이의 이소형과 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면 간의 상호작용에 적절한 조건, 바람직하게는 아포지질단백질 또는 이의 이소형과 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면 간의 정전기적 및/또는 소수성 상호작용에 적절한 조건일 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 표면은 폴리스티렌 표면이다. 결합에 적절한 조건은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 적정 온도, 인큐베이션 시간, pH, 샘플 농도 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 온도는 4 내지 40℃, 특히 10 내지 35℃, 보다 상세하게는 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃ (실온) 범위이다. 특정 구현예에서, 접촉 단계에서 pH는 pH 2 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 10 범위이다. 특정 구현예에서, 샘플은 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 표면과 접촉된 상태로, 1분 이상, 바람직하게는 5분 이상, 더 바람직하게는 30분 이상, 보다 더 바람직하게는 60분 이상 동안 인큐베이션된다. 본 발명에 따른 아포지질단백질-함유 샘플은 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 표면과, 사전 희석 또는 희석없이, 접촉되게 놓일 수 있으며, 희석은 적어도 1:2, 바람직하게는 적어도 1:5, 더 바람직하게는 적어도 1:10, 보다 더 바람직하게는 적어도 1:100, 보다 더 바람직하게는 적어도 1:200이다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 샘플의 희석에는 여러가지 완충제들이 적합하다. 특정 샘플의 경우, 샘플의 희석은 포스페이트-완충화된 염수 (PBS) 또는 카보네이트/바이카보네이트 완충제, 더 바람직하게는 PBS 중에 수행된다.
특정 구현예에서, 아포지질단백질 또는 이의 이소형과 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면의 결합은 임의의 펩타이드, 임의의 폴리펩타이드, 임의의 지질 또는 임의의 가교제에 의해 매개되지 않는다. 특히, 결합을 매개하지 않는 펩타이드가 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 결합될 수 있으며, 이러한 것으로는, 비-제한적인 예로, 아밀로이드 펩타이드를 포함한다. 아밀로이드 펩타이드는, 비-제한적인 예로, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 베타-아밀로이드 펩타이드 [알츠하이머 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크의 주요 구성 성분으로서 아밀로이드 알츠하이머 질환에 중요하게 관여하는, 36-43개의 아미노산으로 구성된 펩타이드, Aβ(1-5), Aβ(1-6), Aβ(1-12), Aβ(1-40), Aβ(1-42), Aβ(12-28), Aβ(13-28), Aβ(25-35), Aβ(35-42), Aβ(33-42) 및 Aβ(33-40) (Aβ(X-Υ)라는 표현은 X 위치의 아미노산과 Y 위치의 아미노산으로 구성된 베타-아밀로이드 펩타이드로부터 유래되는 펩타이드를 지칭함), αβ40 및 αβ42 등]를 포함한다. 상기한 결합을 매개하지 않는 지질로는, 비-제한적인 예로, 인지질 및 지방산 등이 있다.
특정 구현예에서, 검출 및/또는 정량할 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 함유한 샘플은 생물 샘플이다. 본 발명에 따른 생물 샘플은, 비-제한적인 예로, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 뇨 및 뇌척수액 (CSF)과 같은 생물 유체를 포함한다. 샘플 분리 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 특정 구현예에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 본 발명의 제1 방법에 따른 혈장 샘플의 적절한 희석 비율은 1:10 내지 1:100000, 바람직하게는 1:100 내지 1:1000 범위이며, 더 바람직하게는 혈장 샘플의 희석 비율은 1:200이다.
본 발명에 따른, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 표면은, 검출 및/또는 정량을 수행하기 위해, 이에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 임의의 항체를 함유하지 않는다. 본 발명에 따른 폴리스티렌 표면은 샘플, 특히 생물 샘플과 접촉될 수 있는 임의의 폴리스티렌 표면을 포함하며, 비-제한적인 예로, 상업적으로 입수가능한 플레이트, 튜브, 비드 및 어레이를 포함하며, 일반적으로 미체유체-기반한 분석에 적합한 임의의 폴리스티렌 표면을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면은 ELISA 플레이트, 비탁 비드 (turbidimetric bead), 루미넥스 비드 또는 일반적으로 미세유체-기반한 분석에 적합한 임의 폴리스티렌 표면으로 구성된다. 본 발명에 따른 폴리카르보네이트 표면은 샘플, 특히 생물 샘플과의 접촉을 허용하는 임의의 폴리스티렌 표면을 포함하며, 비-제한적인 예로, 모두 상업적으로 입수가능한 플레이트, 튜브, 비드 및 어레이 등이 있다. 임의 경우에, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 표면에 결합시킬 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 폴리스티렌 플레이트는 예를 들어 Nunc, Fisher Scientific, VWR, Greiner 및 Corning 사로부터 구입가능한 ELISA 폴리스티렌 플레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 폴리스티렌 비드는, 비-제한적인 예로, Sigma Aldrich 사로부터 구입가능한 비드를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 비드는 50 nm - 1 ㎛, 바람직하게는 100 nm - 500 nm, 더 바람직하게는 150 nm - 400 nm, 보다 더 바람직하게는 200 - 300 nm 범위의 평균 입자 크기를 가진다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 비드는 아민-변형된 폴리스티렌 비드이다. 또 다른 구현예에서, 폴리스티렌 비드는 카르복실레이트-변형된 폴리스티렌 비드이다. 본 발명에 따른 폴리스티렌 비드는, 비-제한적인 예로, luminex® 비드 및 비탁용 비드를 포함한다. 루미넥스 비드는 Luminex 사에서 구입가능한 미소구이다.
특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 처리된다. 다른 바람직한 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 차단 처리되며, 즉, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 본 발명의 제1 방법의 결합 단계 (i) 전에 차단 처리된다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 아포지질단백질이 아닌 다른 단백질 및/또는 디터전트에 의해 결합 단계 전에 차단 처리된다. 결합 단계 전에, 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 표면을 차단시키는데 적합한 단백질로는, 비-제한적인 예로, 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 알부민, 카제인 및 젤라틴, 뿐만 아니라 Superblock (Pierce)과 같이 상업적으로 구입가능한 차단 용액 등을 포함한다. 특히 바람직한 차단 단백질은 BSA, 카제인 및 젤라틴이며, 더 바람직하게는, BSA, 보다 더 바람직하게는, 1% 내지 3% 범위의 BSA, 더 바람직하게는 BSA 1%이다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 알부민으로 차단되며, 더 바람직하게는 알부민은 BSA이다. 특정 구현예에서, 표면은 BSA 1%에 의해 차단된다. 아포지질단백질이 아닌 다른 단백질과 더불어 또는 다른 예로, 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 표면은 결합 단계 이전에 디터전트에 의해 차단된다. 결합 단계 전에 폴리스티렌 표면을 차단시키기에 적합한 디터전트로는, 비-제한적인 예로, 폴리비닐피롤리돈-40 (PVP-40), 폴리소르베이트 20 (Tween 20), Nonidet-P40 및 Triton X-100 등이 있다. 특정 구현예에서, 디터전트는 폴리소르베이트 20이다. 특정 구현예에서, 표면은 폴리소르베이트 20에 의해 차단 처리된다.
본 발명의 일 구현예에서, 폴리스티렌 또는 폴리카르보네이트, 바람직하게는 폴리스티렌 표면은 샘플과의 접촉 후 세척 용액으로 처리되며, 즉, 표면은 본 발명의 제1 방법의 결합 단계 (i) 이후에 세척 용액으로 처리된다. 바람직하게는, 표면에 세척 용액의 처리는 본 발명의 제1 방법의 결합 단계 (i) 이후에, 그리고 단계 (ii) 이전에 수행된다. 특정 구현예에서, 세척 용액은 하나 이상의 염을 포함한다. 바람직하게는, 세척 용액에 포함되는 염은 Tris 완충제 (TBS) 또는 포스페이트 완충제 (PBS)에 포함되는 NaCl이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 하나 이상의 디터전트를 포함한다. 바람직하게는, 디터전트는 폴리소르베이트 20 (Tween 20) 및 Triton X-100으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 산을 포함한다. 바람직하게는, 산은 HCl 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 산은 HCl 2M 및 포름산 70%로부터 선택된다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 염기를 포함한다. 바람직하게는, 염기는 NaOH이며, 더 바람직하게는 2M NaOH이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 환원제를 포함한다. 바람직하게는, 환원제는 2-머캅토에탄올이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 효소 디터전트 (예, 프로테아제), 산화제 (예, 차아염소산나트륨) 또는 이의 조합을 포함하지 않는다.
본 발명의 제1 방법의 제2 단계에서, 본 방법의 제1 단계의 결과로서, 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합된, 폴리스티렌 또는 폴리카르보네이트, 바람직하게는 폴리스티렌 표면은, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체와 접촉된다. 이 단계는 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형과 항체 간의 복합체를 형성하는데 적절한 조건 하에 수행된다.
아포지질단백질-특이 항체는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 상업적으로 구입가능하다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는, 예시적인, 비-제한적인 항체는, 하기를 포함한다:
- apoAI 검출 및/또는 정량: Santa Cruz Biotechnology 사의 토끼 다클론 apoAI 항체 (FL-267, 카탈로그 번호 # sc-30089), Santa Cruz Biotechnology 사의 마우스 단일클론 anti-apoAI 항체 (069-01, 카탈로그 번호 # sc- 58230), Santa Cruz Biotechnology 사의 마우스 단일클론 anti-apoAI 항체 (B10, 카탈로그 번호 # sc- 376818), Abcam 사의 토끼 다클론 anti-apoAI 항체 (카탈로그 번호 # ab64308), 및 Abcam 사의 염소 다클론 anti-apoAI 항체 (카탈로그 번호 # ab7613).
- apoAII 검출 및/또는 정량: LifeSpan Biosciences 사의 마우스 단일클론 anti-apoAII 항체 (카탈로그 번호 # LS-B4281), 및 OriGene 사의 토끼 다클론 anti-apoAII 항체 (카탈로그 번호 # TA328111).
- apoAIV 검출 및/또는 정량: Abcam 사의 염소 다클론 anti-인간 apoAIV (카탈로그 번호 # ab59036), 및 Sigma-Aldrich 사의 토끼 다클론 anti-인간 apoAIV (카탈로그 번호 # HPA001352).
- apoCI 검출 및/또는 정량: Abcam 사의 토끼 다클론 anti-apoCI 항체 (카탈로그 번호 # ab20793), 및 Abcam 사의 염소 다클론 anti-apoCI 항체 (카탈로그 번호 # ab104446).
- apoCII 검출 및/또는 정량: Abcam 사의 토끼 다클론 anti-apoCII 항체 (카탈로그 번호 # ab76452), Sigma-Aldrich 사의 토끼 다클론 anti- apoCII 항체 (카탈로그 번호 # SAB1300917), 및 Novus-Biologicals 사의 마우스 단일클론 anti-apoCII 항체 (3E4, 카탈로그 번호 # H00000344-M01).
- apoCIII 검출 및/또는 정량: Abcam 사의 염소 다클론 anti-apoCIII 항체 (카탈로그 번호 # ab7619), 및 Sigma-Aldrich 사의 토끼 다클론 anti- apoCIII 항체 (카탈로그 번호 # A0734).
- apoE 검출 및/또는 정량: 전체 apoE에 대한 토끼 다클론 항체 (SantaCruz Biotechnology, Inc., # sc-98573), 및 TaKaRa Clontech 사의 토끼 IgG anti-인간 apoE (카탈로그 번호s #18171A 및 #18171B), 및 Abcam 사의 토끼 다클론 anti-인간 apoE 항체 (카탈로그 번호 # ab72398).
- apoE2 이소형 검출 및/또는 정량: Biolegend 사의 마우스 단일클론 anti-인간 apoE2 (3C2 clone, 카탈로그 번호 # 815001; 클론 8G3, 카탈로그 번호 # 812701).
- apoE3 이소형 검출 및/또는 정량: Preprotech 사의 토끼 다클론 anti-인간 apoE3 (카탈로그 번호 # 350-02).
- apoE4 이소형 검출 및/또는 정량: Merck Millipore 사의 마우스 단일클론 anti-인간 apoE4 (클론 4E4, 카탈로그 번호 # MABN43), BioLegend 사의 마우스 단일클론 anti-인간 apoE4 (클론 5B5, 카탈로그 번호 # 811601), apoE E4, 클론 4E4에 특이적인 마우스 단일클론 항체 (Novus Biologicals, #NBP1-49529), apoE E4, 클론 5B5에 특이적인 마우스 단일클론 항체 (IBL #10025), apoE E4, 클론 1F9에 특이적인 마우스 단일클론 항체 (MBL, #M067-3), 및 anti-apoE4, 클론 4E4에 특이적인 마우스 단일클론 항체 (Thermo Scientific, 카탈로그 번호 #MA5-16146).
- apoJ 검출 및/또는 정량: Abcam 사의 마우스 단일클론 anti-apoJ 항체 (CLI-9, 카탈로그 번호 # ab16077), 및 Sigma-Aldrich 사의 염소 다클론 anti-apoJ 항체 (카탈로그 번호 # SAB2500251).
단계 (i)의 결과로서 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합된 표면과 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체의 접촉은, 항체와 아포지질단백질 또는 이의 이소형 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에 수행된다. 이러한 복합체를 형성하기에 적절한 조건은 당업자들에 의해 결정될 수 있으며, 적정 온도, 인큐베이션 시간 및 pH를 포함한다. 특정 구현예에서, 온도는 4 내지 40℃, 특히 10 내지 35℃, 보다 상세하게는 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃ (실온)의 범위이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 방법의 단계 (i) 및 (ii)에서 온도는 실질적으로 동일하다. 특정 구현예에서, pH는 pH 2 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 10 범위이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제1 방법의 단계 (i) 및 (ii)에서 pH는 실질적으로 동일하다. 특정 구현예에서, 항체는 표면에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형과, 1분 이상, 바람직하게는 5분 이상, 더 바람직하게는 30분 이상, 보다 더 바람직하게는 60분 이상 동안 인큐베이션된다.
본 발명의 제1 방법의 제3 단계에서, 본 방법의 제2 단계의 결과로서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형과, 상기한 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 대한 특이 항체 간에 형성된 복합체를, 검출한다.
아포지질단백질 또는 이의 이소형은 그 자체적으로 검출가능한 분자가 아니므로, 검출 단계는, 특정 구현예에서, 검출가능한 분자 또는 복합체를 이용하여 수행된다. 복합체 아포지질단백질-항체 또는 아포지질단백질 이소형-항체는 당업자에게 공지된 여러가지 방법에 의해 검출할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 복합체 아포지질단백질-항체 또는 복합체 아포지질단백질 이소형-항체의 검출은, 복합체 아포지질단백질-항체 또는 복합체 아포지질단백질 이소형-항체에 특이적으로 결합한 검출가능한 시약을 이용해 수행되며, 검출가능한 시약은 측정될 수 있는 신호를 발생시킴으로써 복합체의 검출을 용이하게 한다. 생물 분자, 예를 들어 폴리펩타이드 및 항체를 표지하는 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
매우 다양한 검출가능한 임의 시약이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 적합한 검출가능한 시약으로는, 비-제한적으로 하기 물질을 포함한다: 다양한 리간드, 방사핵종, 형광 염료, 화학발광제, 미세입자 (예, 양자점, 나노결정, 인광물질 등), 효소 (예, ELISA에 사용되는 효소, 즉, 호스래디시 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제), 비색 표지 물질 (colorimetric label), 자기 비드 및 바이오틴, 디옥시게닌 또는 항혈청 또는 단일클론 항체를 이용이용가능한 그외 합텐 및 단백질.
광 영상 (optical imaging)을 검출할 수 있는 시약으로는, 예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 유도체, 인도시아닌 그린 (indocyanine green), 오레곤 그린 (Oregon green), 오레곤 그린의 유도체, 로다민 그린, 로다민 그린의 유도체, 에오신, 에리트로신, 텍사스 레드, 텍사스 레드의 유도체, 말라카이트 그린, 나노골드 설포숙신이미딜 에스테르, 케스케이드 블루, 쿠마린 유도체, 나프탈렌, 피리딜옥사졸 유도체, 케스케이드 옐로우 염료, 다폭실 염료 (dapoxyl dye) 및 다양한 그외 형광 화합물, 예를 들어, Cy3, Cy2, Cy5, Alexa Fluor® 형광 표지물질 패밀리 (Molecular Probes, Inc.), 카르복시플루오레세인 (FAM) 및 플루오레세인 i이소티오시아네이트 (FITC) 등이 있다.
특정 구현예에서, 검출가능한 시약은 단백질이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "단백질"은 하나 이상의 아미노산 체인으로 구성된 거대 분자를 지칭한다. 단백질은 다른 분자에 대한 특이적인 결합력에 기초하여 다양한 일군의 세포 기능을 수행하는 역할을 한다. 단백질은 다른 단백질 뿐만 아니라 소형 물질 분자에 결합할 수 있다. 검출가능한 시약으로서 적합한 단백질에 대한 비-제한적인 예로는, 효소, 형광 단백질, 발광 단백질 및 항원을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 단백질은 효소이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "효소"는 선택성이 높은 촉매로서 작동하여, 특이적인 대사 반응의 속도 및 특이성 둘다를 가속화하는, 단백질을 지칭한다. 본 발명에 적합한 효소에 대한 비-제한적인 예로는, 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 및 알칼리 포스파타제 등을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명에 사용하기 적합한 효소는 비색법, 화학발광 또는 형광측정법에 의해 검출가능한 화합물에서 기질의 변형을 촉매하는 촉매 작용의 결과로서 간접적으로 검출될 수 있다. 적합한 기질의 예로는, 비-제한적인 예로, p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP), 2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산] (ABTS), o-페닐렌다이아민 (OPD) 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 등이 있다.
특이적인 보결기 (prosthetic group)에서 화학 반응을 수행하여, 사전 여기 없이도 광 방출을 발생시킬 수 있는, 산화성 효소의 구체적인 예로는 생발광 단백질 또는 광단백질 등이 있다. 생발광 단백질에 대한 비-제한적인 예로는 반딧불이 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제 및 에쿼린 등이 있다.
다른 구현예에서, 단백질은 형광 단백질이다. 용어 "형광 단백질"은 본 발명의 맥락에서 여기에 적합한 파장에서 여기되었을 때 빛을 방출할 수 있는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 복합체에 사용될 수 있는 형광 단백질에 대한 비-제한적인 예로는, GFP, GFPuv, BFP, CFP, YFP, EBFP2, mCerulean, mCerulean3, mVenus, mTurquoise, T-Sapphire, citrine, amFP486, zFP506, zFP538, drFP, DsRed, mCherry, dTomate, mTFP1, TagRFP-T, mKO2, mRuby, mKate, mAmetrine, REACh, R-피코에리트린 (R-PE) 및 알로피코시아닌 (APC) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 구현예에서, 단백질은 발광 단백질이다. 용어 "발광 단백질"은, 본 발명의 맥락에서, 여기에 적합한 파장에서 여기되었을 때 빛을 방출할 수 있는 단백질을 지칭한다.
다른 구현예에서, 단백질은 항원이다. 용어 "항원"은 본 발명의 맥락에서 신체에서 면역 반응을 유도하는 분자를 지칭한다. 즉, 항원은 이를 인지하여 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 항원에 대한 비-제한적인 예로는, 특히 종양 항원, 예를 들어 암태아성 항원 (CEA), HER2, 전립선 특이 항원 (PSA) 및 조직 플라스미노겐 활성인자 및 이의 재조합 변이체, 예로 Activase® 뿐 아니라 박테리아 항원, 알레르겐 등이 있다. 당해 기술 분야의 당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명에 사용하기 적합한 항원은 항체에 의해 특이적으로 인지될 수 있는 능력의 결과로서 간접적으로 검출가능하다.
다른 구현예에서, 검출가능한 시약은 합텐이다. 용어 "합텐"은 본 발명의 맥락에서 항원성이지만 스스로 특이적인 면역 반응에 의해 유도할 수 없는, 소 분자 크기 (< 10,000 Da)를 가진 화학적 화합물 군을 지칭한다. 캐리어로 지칭되는 거대 면역원성 단백질에 합텐의 화학적 커플링은 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 합텐-면역원성 캐리어 접합체를 만들어낸다. 비타민에 대한 비-제한적인 예로는 바이오틴 (비타민 B7), 디곡시게닌, 다이니트로페놀 (DNP) 및 니트로-요오도페놀 (NIP) 등이 있다. 특정 구현예에서, 비타민은 바이오틴이다. 용어 "바이오틴"은, 본 발명의 맥락에서, 지금까지 개시된 최대 친화성 Kd = 10-15 M으로 아비딘에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 비타민 H 및 비타민 B7으로도 지칭되는, 수용성 및 알코올-용해성의 열-안정적인 비타민을 지칭한다. 당해 기술 분야의 당업자가 인지하는 바와 같이, 바이오틴은 아비딘 또는 이의 변이체, 예로, 스트렙타비딘 및 뉴트라비딘에 의해 특이적으로 인지되는 이의 능력의 결과로서 간접적으로 검출가능하다.
검출가능한 시약의 검출은, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된, 시약의 타입 및 샘플의 타입에 적합한 장치를 사용해 형광측정법 또는 비색법을 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 복합체의 아포지질단백질이 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 표면에 부착된, 아포지질단백질-항체 복합체를, 아포지질단백질과 이미 복합체를 형성한 항-아포지질단백질 항체에 특이적인 이차 항체 (리포터 항체)와 인큐베이션한다. 즉, 본 발명의 제1 방법에 대한 특정 구현예에서, 본 방법의 단계 (ii)에서 형성된 아포지질단백질-항체 복합체는, 항-아포지질단백질 항체에 특이적인 리포터 항체를 이용하여 검출한다. 특정 구현예에서, 항-아포지질단백질 항체 및 리포터 항체는 동일한 항체이다. 바람직한 구현예에서, 제2 항체 (리포터 항체)는, 표면과 아포지질단백질의 인큐베이션 및/또는 아포지질단백질에 특이적인 항체와 표면에 결합된 아포지질단백질의 인큐베이션하는 경우의 조건와 유사한 조건에서, 효소와 접합된다. 표면에 결합된 복합체 항체-아포지질단백질은, 예를 들어, 형광 현미경에서의 형광측정법을 이용해 또는 분광광도계에서 비색법에 의해, 효소에 의해 검출가능한 산물로 변환되는 기질을 첨가함으로써, 검출한다. 다른 구현예에서, 검출은 검출가능한 시약으로 적절하게 표지된 아포지질단백질에 특이적인 프로브를 사용함으로써 유사한 방식으로 행해질 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 아포지질단백질-항체 복합체 또는 아포지질단백질 이소형-항체 복합체는 전술한 바와 같이 검출가능한 분자 또는 복합체를 이용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 복합체 아포지질단백질-항체 또는 아포지질단백질 이소형-항체는 비탁법에 의해, 특히 면역비탁 분석을 이용하여 검출한다. 아포지질단백질 또는 아포지질단백질 이소형이 분석할 샘플에 존재할 경우, 복합체 아포지질단백질-항체 또는 복합체 아포지질단백질 이소형-항체는 아포지질단백질 또는 아포지질단백질 이소형이 함유되지 않은 샘플의 탁도 (turbidity)와 비교해 탁도를 증가시키며, 탁도 변화를 (예를 들어 분광광도측정기를 이용해) 측정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 면역비탁측정 분석은 LEIT (Latex-Enhanced Immunoturbidimetry Technology)이다.
특정 구현예에서, 복합체 검출은 ELISA에 의해 수행된다. 다른 구현예에서, 복합체 검출은 면역비탁 분석에 의해 수행된다.
아포지질단백질 이소형의 상대량을 측정하는 방법
본 발명의 발명자들은, 개체 유래 혈장 샘플에 대한 더블 ELISA 분석에 기초하여 특정 아포지질단백질 이소형이 개체에 존재하거나 또는 존재하지 않는 지를 확인하는 방법을 개발하였으며, 더블 분석에서 한가지 분석은 특정 아포지질단백질 이소형의 수준을 측정하는 것이고, 또 다른 분석은 전체 아포지질단백질의 수준을 측정하는 것이다. 그런 후, 아포지질단백질 이소형/전체 아포지질단백질의 비율을 계산한다. 실시예 1, "혈장 샘플에서 이형접합성/동형접합성 APOE ε4 보유체 식별" 및 도 4를 참조한다. 또한, apoE의 아포지질단백질 이소형의 양은 면역비탁 분석에 의해 측정된다. 실시예 2, "비탁 분석에 의한 ApoE4 검출"을 참조한다.
이에, 다른 구현예에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 아포지질단백질의 전체 함량에 대해 주어진 아포지질단백질의 이소형의 상대량을 측정하는 시험관내 방법 (본 발명의 제2 방법)에 관한 것이다:
(i) 샘플을 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과, 표면에 아포지질단백질을 결합시키기에 적절한 조건 하에 접촉시키는 단계를 포함하며, 이때 표면은 이에 결합된 아포지질단백질에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계,
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면에, 상기 샘플에 존재하는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 제1 항체 및 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체를 접촉시키고, 접촉은 제1 항체 및 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 제2 항체와 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건 하에 수행되는, 단계,
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체를 검출하는 단계, 및
(iv) 단계 (iii)에서 수득된 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준에 기초하여, 아포지질단백질의 전체 함량에 대한 상기 이소형의 상대량을 결정하는 단계.
특정 구현예에서, 본 발명은 샘플에서 아포지질단백질의 전체 함량에 대해 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 주어진 아포지질단백질의 이소형의 상대량을 측정하는 시험관내 방법에 관한 것으로서, 상기 시험관내 방법은,
(i) 샘플을 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과, 표면에 아포지질단백질을 결합시키기에 적절한 조건하에 접촉시키고, 상기 표면은 이에 결합된 아포지질단백질에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계,
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면을, 샘플에 존재하는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 제1 항체 및 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체와 접촉시키고, 접촉은 제1 항체 및 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 제2 항체와 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건 하에 수행되는, 단계,
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체를 검출하는 단계, 및
(iv) 단계 (iii)에서 수득된 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준에 기초하여, 아포지질단백질의 전체 함량에 대한 상기 이소형의 상대량을 측정하는 단계를 포함하며,
상기 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 처리되지 않거나, 또는 상기 샘플과의 접촉 전에 알부민으로 차단 처리된다.
본 발명의 제2 방법에 따라 측정할 아포지질단백질 이소형은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린) 이소형을 포함한다. 특정 구현예에서, 측정할 아포지질단백질 이소형은 apoE2, apoE3 및 apoE4로 이루어진 군으로부터 선택되는 apoE 이소형, 바람직하게는 apoE4이다. 보다 특정한 구현예에서, 아포지질단백질은 apoE이고, 아포지질단백질 이소형은 apoE4이다.
본 발명의 제2 방법의 제1 단계에서, 샘플은, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과, 샘플내 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합하기에 적절한 조건 하에, 접촉되며, 이때 표면은 이에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는다.
샘플내 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 폴리스티렌 또는 폴리카르보네이트, 바람직하게는 폴리스티렌 표면에 결합시키기에 적절한 조건은 본 발명의 제1 방법에서 이미 기술되었으며, 본 내용에 통합된다.
특정 구현예에서, 측정할 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 함유한 샘플은 생물 생플이다. 적절한 생물 샘플은 본 발명의 제1 방법에서 이미 기술되었으며, 본 내용에 통합된다. 바람직한 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 뇨 및 뇌척수액 (CSF)과 같은 생물 체액을 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 혈장 샘플의 적절한 희석 비율은 1:10 - 1:100000, 바람직하게는 1:100 - 1:1000이며, 더 바람직하게는, 혈장 샘플의 희석 비율은 1:200이다.
본 발명에 따른 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은, 이에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적이며 검출 수행을 위한, 임의 항체를 함유하지 않는다. 본 발명에 따른 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 전술한 바와 같으며, 본 내용에 통합된다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면은 ELISA 플레이트, 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드로 구성된다. 임의 경우에, 이러한 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 이 표면에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 제2 방법에 따른 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 단일 엔티티 (only entity)에 의해 형성되며, 이 단일 엔티티는 아포지질단백질의 결합에 필수적인 표면, 예를 들어, 싱글 ELISA 플레이트와 같은 싱글 플레이트 또는 ELISA 플레이트의 싱글 웰을 제공한다. 이러한 구현예는, 제1 항체 및 제2 항체를 서로 다른 검출가능한 마커를 이용하여 검출하는 경우에 적용될 수 있으며, 그래서 각각의 항체로부터 발생되는 신호는 제2 항체에 의해 제공되는 신호에 의해 간섭없이 정확하게 검출할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 제2 방법에 따른 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 복수의 엔티티들에 의해 형성되며, 즉, 아포지질단백질을 표면에 결합시키기 위해 이용가능한 표면을 제공하는 2 유닛 이상의 엔티티에 의해, 예를 들어, 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드와 같은 복수의 비드들에 의해 형성된다. 본 발명의 제2 방법에 대한 특정 구현예에서, 표면에 샘플내 아포지질단백질을 결합시키기에 적절한 조건 하에 샘플과 접촉시킬 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은, 복수의 엔티티에 의해 형성된다. 바람직하게는, 상기 표면은 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드에 의해 형성된다. 이러한 구현예는, 단계 (i)에서 형성된 복합체가 각각의 검출가능한 시약에 의해 제공되는 신호에 의해 2가지 항체를 구분할 수 있는 검출 시약으로 추가로 처리되지 않을 경우에, 이용가능하다. 예를 들어, 비탁 검출의 경우, 아포지질단백질과 항체 간의 복합체 형성은 샘플의 탁도 증가에 의해 검출된다. 이 경우, 탁도 증가가 아포지질단백질 이소형과 제1 항체의 복합체 또는 전체 아포지질단백질과 제2 항체의 복합체의 형성으로 인한 것인지를 확인하는 것은 불가능하다. 이 경우, 접촉 단계는 복수의 엔티티에 의해 형성된 표면 (예, 미세입자의 형태)을 이용해 행해져야 하며, 그래서 각 타입의 항체와 접촉된 엔티티는 서로 다른 용기에 이를 배치시킴으로써 분리시켜 검출할 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과 접촉되기 전에 처리되지 않는다. 다른 바람직한 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과 접촉되기 전에 차단 처리되며, 즉, 표면은 본 발명의 제2 방법의 결합 단계 (i) 전에 차단 처리된다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은, 아포지질단백질 이외의 다른 단백질에 의한 및/또는 디터전트에 의해, 결합 단계 전에 차단 처리된다. 본 발명에 따라 표면을 차단시키기에 적합한 단백질 및 디터전트는 전술한 바와 같으며, 원용에 의해 본 내용에 포함된다. 특히 바람직한 차단용 단백질은 BSA, 카제인 및 젤라틴이며, 더 바람직하게는, BSA, 보다 더 바람직하게는, 1% 내지 3% 범위의 BSA, 더 바람직하게는 1% BSA이다. 결합 단계 전에 표면 차단에 적합한 디터전트로는, 비-제한적인 예로, 폴리비닐피롤리돈-40 (PVP-40), 폴리소르베이트 20 (Tween 20), Nonidet-P40 및 Triton X-100 등이 있다.
특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 이후에 세척 용액으로 처리되며, 즉, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 본 발명의 제2 방법의 결합 단계 (i) 이후에 세척 용액으로 처리된다. 바람직하게는, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면의 세척 용액의 처리는 본 발명의 제2 방법의 결합 단계 (i) 이후에, 그리고 단계 (ii) 이전에 수행된다. 적절한 세척 용액들은 전술한 바와 같으며, 본 내용에 포함된다. 특정 구현예에서, 세척 용액은 하나 이상의 염을 포함한다. 바람직하게는, 세척 용액에 포함된 염은 NaCl이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 하나 이상의 디터전트를 포함한다. 바람직하게는, 디터전트는 폴리소르베이트 20 (Tween 20) 및 Triton X-100으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 산을 포함한다. 바람직하게는, 산은 HCl 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 산은 HCl 2M 및 포름산 70%로부터 선택된다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 염기를 포함한다. 바람직하게는, 염기는 NaOH, 더 바람직하게는 2M NaOH이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 환원제를 포함한다. 바람직하게는, 환원제는 2-머캅토에탄올이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 효소 디터전트 (예, 프로테아제), 산화제 (예, 차아염소산나트륨) 또는 이들의 조합을 포함하지 않는다.
본 발명의 제2 방법의 제2 단계에서, 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면은 샘플에 존재하는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 제1 항체 및 상기 아포지질단백질 이소형의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체와 접촉되며, 이때 접촉은 제1 항체와 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체 및 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 복합체를 형성하는데 적절한 조건 하에 수행된다.
아포지질단백질에 특이적인 항체와 특정 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체는 본 발명의 제1 방법에서 언급된 바 있으며, 본원에 포함된다.
본 발명의 제2 방법에서, 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면은 제1 항체 및 제2 항체와 접촉되며, 여기서 제1 항체는 검출한 아포지질단백질 이소형에 특이적이며, 제2 항체는 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 아포지질단백질이 결합되고; 제1 항체와 접촉되는, 표면은, 아포지질단백질이 결합되고; 제2 항체와 접촉되는, 표면과 동일한 표면이며, 즉, 접촉은 단일 용기 (single container)에서, 예를 들어, ELISA 플레이트와 같은 플레이트의 하나의 웰에서 수행된다. 따라서, 아포지질단백질이 결합된 표면과 제1 항체 간의 접촉은, 제2 항체와의 접촉이 수행되는 것과 동일한 용기에서 수행된다. 다른 구현예에서, 아포지질단백질이 결합된 제1 표면은 제1 항체와 접촉되고, 아포지질단백질이 결합된 제2 표면은 제2 항체와 접촉되며, 여기서 제1 표면과 제2 표면은 서로 다른 표면이며, 예를 들어, 플레이트 (예, ELISA 플레이트)에서 서로 다른 웰, 서로 다른 비드 (예, 비탁용 비드의 루미넥스 비드) 또는 서로 다른 입자이다. 따라서, 아포지질단백질이 결합된 표면과 제1 항체 간의 접촉은, 아포지질단백질이 결합된 표면과 제2 항체 간의 접촉이 수행되는 용기와는 다른 용기에서 수행되며, 즉, 별개의 용기들이 사용된다. 보다 특정한 구현예에서, 별개의 용기들이 사용되는 경우, 각각의 용기는 복수의 엔티티, 예를 들어, 별개의 2세트의 비드 (예, 비탁용 비드들 중 루미넥스 비드) 또는 별개의 2 세트의 입자를 포함한다.
본 발명의 제2 방법에 대한 바람직한 구현예에서, 단계 (i)에서 사용되는 표면은 복수의 엔티티에 의해 형성되며, 단계 (ii)에서 제1 항체와의 접촉과 제2 항체와의 접촉은, 각각의 용기에 표면을 형성하는 복수의 엔티티 중 일부가 포함된, 별개의 용기에서 수행된다.
단계 (i)의 결과로서 아포지질단백질 이소형이 결합된 표면과 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 제1 항체 및 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체 간의 접촉은, 제1 항체와 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건 하에 수행된다. 상기 복합체들을 형성하기에 적절한 조건은 당업자들에 의해 결정될 수 있으며, 적정 온도, 인큐베이션 시간 및 pH를 포함한다. 특정 구현예에서, 온도는 4 내지 40℃, 특히 10 내지 35℃, 보다 상세하게는 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃ (실온) 범위이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제2 방법에서 단계 (i)과 (ii)의 온도는 실질적으로 동일하다. 특정 구현예에서, pH는 pH 2 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 10 범위이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제2 방법에서 단계 (i)과 (ii)에서, pH는 실질적으로 동일하다. 특정 구현예에서, 제1 항체는 표면에 결합된 측정할 아포지질단백질 이소형과 적어도 1분, 바람직하게는 적어도 5분, 더 바람직하게는 적어도 30분, 보다 더 바람직하게는 적어도 60분간 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 제2 항체는 표면에 결합된 측정할 아포지질단백질의 이소형과 적어도 1분, 바람직하게는 적어도 5분, 더 바람직하게는 적어도 30분, 보다 더 바람직하게는 적어도 60분간 인큐베이션된다.
본 발명의 제2 방법의 제3 단계에서, 본 방법의 제2 단계에서 형성된 제1 및 제2 복합체를 검출한다.
전술한 바와 같이, 아포지질단백질이 결합되고 제1 항체와 접촉되는 표면은, 아포지질단백질이 결합되고 제2 항체와 접촉되는 표면과, 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 표면이 서로 다른 표면이고; 접촉이 별개의 용기에서 수행되는 경우, 본 발명의 제2 방법의 단계 iii)에서 검출은 각각의 용기에서 분리되어 수행된다.
본 발명의 제2 방법에 대한 바람직한 구현예에서, 단계 (i)에서 사용되는 표면은 복수의 엔티티에 의해 형성되며, 단계 (ii)에서 제1 항체와 그리고 제2 항체와의 접촉은 각 용기가 표면을 형성하는 복수의 엔티티의 일부를 포함하는 별개의 용기들에서 수행되며, 단계 (iii)에서 검출은 각각의 용기에서 분리되어 수행된다. 이 구현예는, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 비드에 의해, 바람직하게는 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드에 의해 구성되고; 검출이 면역비탁법에 의해 수행되는 경우에, 특히 바람직하다. 따라서, 본 발명의 상기한 구현예에서, 본 방법의 제2 단계에서 형성된 제1 복합체와 제2 복합체는 비탁법에 의해, 특히 면역비탁 분석에 의해 검출된다. 복합체 아포지질단백질 (이의 모든 이소형)-항체 또는 복합체 아포지질단백질 이소형-항체의 형성은, 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 분석할 샘플에 존재할 경우, 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 함유되지 않은 샘플에서의 탁도와 비교해, 탁도를 증가시키게 되며, 이때 탁도 변화를 (예, 분광광도계를 이용해) 측정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 비탁 분석은 LEIT이다.
대안적인 특정 구현예에서, 본 방법의 제2 단계에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체는 검출가능한 시약을 이용해 검출된다. 본 발명의 내용에서 적절한 검출가능한 시약은 본 발명의 제1 방법에서 기술된 바와 같으며, 본 내용에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 본 방법의 제2 단계에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체는, 항-아포지질단백질 항체 및/또는 항-아포지질단백질 이소형 항체에 특이적인, 리포터 항체를 이용해 검출된다. 바람직한 구현예에서, 제2 항체 (리포터 항체)는, 표면과 아포지질단백질 이소형의 인큐베이션 조건 및/또는 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체와 표면에 결합된 아포지질단백질 이소형의 인큐베이션 조건과 유사한 조건에서, 효소와 접합된다. 이 구현예는, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 플레이트, 바람직하게는 ELISA 플레이트에 의해 구성되며; 검출이 ELISA 분석을 이용해 수행되는 경우에, 특히 바람직하다.
본 발명의 제2 방법의 제4 단계에서, 단계 (iii)에서 수득되는 제1 복합체와 제2 복합체의 수준에 기초하여 아포지질단백질 전체 함량에 대한 이소형의 상대적인 함량을 측정한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 제2 방법의 단계 (iii)에서 검출되는 제1 복합체 및 제2 복합체의 검출로부터 유래되는 신호들 간의 비율을 검출한다. 이로써, 아포지질단백질의 전체 함량에 대한 특정 아포지질단백질의 이소형의 상대량을 측정한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 비율은 0 (특정 아포지질단백질 이소형이 분석할 샘플에 존재하지 않을 경우) 내지 1 (특정 아포지질단백질 이소형이 분석할 샘플에 존재하는 아포지질단백질의 유일한 이소형일 경우) 범위일 수 있다.
본 발명의 대립유전자량 측정
본 발명의 발명자들은, 개체 샘플에 대한 더블 분석에 기초하여 개체가 특정 아포지질단백질 이소형에 대해 동형접합체 보유체인지 또는 이형접합체 보유체인지를 확인하는 방법을 개발하였는데, 한가지 분석은 특정 아포지질단백질 이소형의 수준을 측정하는 것이고, 또 다른 분석은 전체 아포지질단백질의 수준을 측정하는 것이다. 그런 다음, 아포지질단백질 이소형/전체 아포지질단백질의 비율을 계산하고, 이 비율로부터 대립유전자량을 유추할 수 있다. 실시예 1을 참조한다. 또한, 아포지질단백질 이소형의 함량을 면역비탁 분석으로 측정한다. 실시예 2를 참조한다.
이에, 추가적인 측면에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 개체에서 아포지질단백질 이소형의 발현과 관련된 하플로타입의 대립유전자량을 결정하는 방법 (본 발명의 제3 방법)에 관한 것이다:
(i) 아포지질단백질 이소형이 발현되는 조직으로부터 유래되는, 상기 개체 유래의 단백질-함유 샘플을, 표면에 아포지질단백질 이소형을 결합시키기에 적절한 조건 하에, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 접촉시키는 단계로서, 이때 표면은 이 표면에 결합되는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체를 포함하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면에, 아포지질단백질 이소형에 특이적인 하나 이상의 항체를, 항체와 아포지질단백질 이소형 간에 복합체를 형성시키기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체의 양과 유전자 변이체를 코딩하는 대립유전자의 수의 상관관계에 의해, 상기 아포지질단백질 이소형의 대립유전자량을 결정하는 단계.
특정 구현예에서, 본 발명은 개체에서 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질의 아포지질단백질 이소형의 발현과 연관된 하플로타입의 대립유전자량을 결정하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
(i) 아포지질단백질 이소형이 발현되는 조직으로부터 유래되는, 상기 개체 유래의 단백질-함유 샘플을, 표면에 아포지질단백질 이소형을 결합시키기에 적절한 조건 하에, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 접촉시키는 단계로서, 이때 표면은 이 표면에 결합되는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체를 포함하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면에, 아포지질단백질 이소형에 특이적인 하나 이상의 항체를, 항체와 아포지질단백질 이소형 간의 복합체를 형성시키기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체의 양과 유전자 변이체를 코딩하는 대립유전자의 수의 상관관계에 의해, 상기 아포지질단백질 이소형의 대립유전자량을 결정하는 단계를 포함하며,
상기 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 전에 처리되지 않거나, 또는 상기 샘플과의 접촉 전에 알부민으로 차단 처리된다.
본 발명의 제3 방법에 따라 측정할 아포지질단백질 이소형은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린) 이소형을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 제3 방법에 따라 측정할 아포지질단백질 이소형은 apoE2, apoE3 및 apoE4로 이루어진 군으로부터 선택되는 apoE 아포지질단백질 이소형이다. 보다 특정한 구현예에서, 본 발명의 제3 방법에 따라 측정할 아포지질단백질 이소형은 apoE4이다.
본 발명의 제3 방법의 제1 단계에서, 아포지질단백질 이소형이 발현되는 조직으로부터 유래되는 단백질-함유 샘플은, 샘플내 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합하기에 적절한 조건 하에, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 접촉되며, 이때 표면은 이에 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는다.
폴리스티렌 또는 폴리카르보네이트, 바람직하게는 폴리스티렌 표면에 샘플내 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 결합시키기에 적절한 조건은 본 발명의 제1 방법에 기술된 바와 같으며, 본 내용에 포함된다.
샘플은 아포지질단백질 이소형이 발현되는 조직으로부터 유래되는 단백질-함유 샘플이다. 적절한 샘플은, 전술한 바와 같이, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 뇨 및 뇌척수액 (CSF)과 같은 생물 유체를 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 혈장 샘플의 적절한 희석 비율은 1:10 내지 1:100000, 바람직하게는 1:100 내지 1:1000 범위이며, 더 바람직하게는 혈장 샘플의 희석 비율은 1:200이다.
본 발명에 따른, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은, 결합된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적이며 검출을 수행하기 위한 임의의 항체를 함유하지 않는다. 본 발명에 따른 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 전술한 바와 같으며, 본 내용에 포함되지 않는다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면은 ELISA 플레이트, 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드에 의해 구성된다. 임의 경우에, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 표면에 결합시킬 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 제3 방법에 따른 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 단일 엔티티 (only entity)에 의해 형성되며, 이 단일 엔티티는 아포지질단백질의 결합에 필수적인 표면, 예를 들어, 싱글 ELISA 플레이트와 같은 싱글 플레이트를 제공한다. 대안적인 구현예에서, 본 발명의 제3 방법에 따른 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 복수의 엔티티들에 의해 형성되며, 즉, 아포지질단백질을 표면에 결합시키기 위해 이용가능한 표면을 제공해주는 2 유닛 이상의 엔티티에 의해, 예를 들어, 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드와 같은 복수의 비드들에 의해 형성된다. 본 발명의 제3 방법에 대한 특정 구현예에서, 샘플내 아포지질단백질을 표면에 결합시키기에 적절한 조건 하에, 샘플과 접촉시킬 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은, 복수의 엔티티들에 의해 형성된다. 바람직하게는, 상기 표면은 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드에 의해 형성된다.
특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과 접촉되기 전에 처리되지 않는다. 다른 바람직한 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과 접촉되기 전에 차단 처리되며, 즉, 표면은 본 발명의 제2 방법의 결합 단계 (i) 전에 차단 처리된다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은, 아포지질단백질 이외의 다른 단백질에 의해 및/또는 디터전트에 의해 결합 단계 이전에 차단 처리된다. 본 발명에 따라 표면을 차단시키기에 적합한 단백질 및 디터전트는 전술한 바와 같으며, 본 내용에 포함된다. 특히 바람직한 차단용 단백질은 BSA, 카제인 및 젤라틴이며, 더 바람직하게는, BSA, 보다 더 바람직하게는, 1% 내지 3% 범위의 BSA, 더 바람직하게는 1% BSA이다. 결합 단계 전에 표면을 차단하는데 적합한 디터전트로는, 비-제한적인 예로, 폴리비닐피롤리돈-40 (PVP-40), 폴리소르베이트 20 (Tween 20), Nonidet-P40 및 Triton X-100 등이 있다.
특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 샘플과의 접촉 후 세척 용액으로 처리되며, 즉, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 본 발명의 제3 방법의 결합 단계 (i) 이후에 세척 용액으로 처리된다. 바람직하게는, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면에 대한 세척 용액의 처리는 본 발명의 제3 방법의 결합 단계 (i) 이후에, 그리고 단계 (ii) 이전에 수행된다. 적절한 세척 용액들은 전술한 바와 같으며, 본 내용에 포함된다. 특정 구현예에서, 세척 용액은 하나 이상의 염을 포함한다. 바람직하게는, 세척 용액에 포함된 염은 NaCl이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 하나 이상의 디터전트를 포함한다. 바람직하게는, 디터전트는 폴리소르베이트 20 (Tween 20) 및 Triton X-100으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 산을 포함한다. 바람직하게는, 산은 HCl 및 포름산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 산은 HCl 2M 및 포름산 70%로부터 선택된다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 염기를 포함한다. 바람직하게는, 염기는 NaOH, 더 바람직하게는 2M NaOH이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 환원제를 포함한다. 바람직하게는, 환원제는 2-머캅토에탄올이다. 부가적으로 또는 다른 예로, 세척 용액은 효소 디터전트 (예, 프로테아제), 산화제 (예, 차아염소산나트륨) 또는 이들의 조합을 포함하지 않는다.
본 발명의 제3 방법의 제2단계에서, 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면은, 아포지질단백질 이소형에 특이적인 하나 이상의 항체와, 상기 항체와 아포지질단백질 이소형 간에 복합체를 형성하는데 적절한 조건 하에, 접촉된다.
바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 제3 방법의 제2 단계는, 표면을, 샘플에 존재하는 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함하며, 이때 접촉은 제1 항체와 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건에서 수행된다.
아포지질단백질에 특이적인 항체 및 특정 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체는 본 발명의 제1 방법에 대한 내용에서 이미 기술되었으며, 본 내용에 포함된다.
제1 항체와 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 및 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건은, 당업자들에 의해 결정될 수 있으며, 전술한 바와 같이 적정 온도, 인큐베이션 시간 및 pH를 포함한다. 특정 구현예에서, 온도는 4 내지 40℃, 특히 10 내지 35℃, 보다 상세하게는 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃ (실온) 범위이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제3 방법에서 단계 (i)과 (ii)의 온도는 실질적으로 동일하다. 특정 구현예에서, pH는 pH 2 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 10 범위이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제3 방법에서 단계 (i)과 (ii)에서, pH는 실질적으로 동일하다. 특정 구현예에서, 제1 항체는 표면에 결합된 측정할 아포지질단백질 이소형과 적어도 1분, 바람직하게는 적어도 5분, 더 바람직하게는 적어도 30분, 보다 더 바람직하게는 적어도 60분간 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 제2 항체는 표면에 결합된 측정할 아포지질단백질의 이소형과 적어도 1분, 바람직하게는 적어도 5분, 더 바람직하게는 적어도 30분, 보다 더 바람직하게는 적어도 60분간 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 아포지질단백질이 결합되고 제1 항체와 접촉되는 표면은, 아포지질단백질이 결합되고 제2 항체와 접촉되는 표면과 동일하며, 즉, 접촉은 하나의 용기에서, 예를 들어, ELISA 플레이트와 같은 플레이트의 하나의 웰에서 수행된다. 즉, 아포지질단백질이 결합된 표면과 제1 항체 간의 접촉은, 제2 항체와의 접촉이 수행되는 것과 동일한 용기에서 수행된다. 다른 바람직한 구현예에서, 아포지질단백질이 결합된 제1 표면은 제1 항체와 접촉되고, 아포지질단백질이 결합된 제2 표면은 제2 항체와 접촉되며, 여기서 제1 표면과 제2 표면은 서로 다른 표면이며, 예를 들어, 플레이트 (예, ELISA 플레이트)에서 서로 다른 웰, 서로 다른 비드 (예, 비탁용 비드의 루미넥스 비드) 또는 서로 다른 입자이다. 따라서, 아포지질단백질이 결합된 표면과 제1 항체 간의 접촉은, 아포지질단백질이 결합된 표면과 제2 항체 간의 접촉이 수행되는 용기와는 다른 용기에서 수행되며, 즉, 별개의 용기들이 사용된다. 보다 특정한 구현예에서, 별개의 용기들이 사용되는 경우, 각각의 용기는 복수의 엔티티, 예를 들어, 별개의 2세트의 비드 (예, 비탁용 비드의 루미넥스 비드) 또는 별개의 2 세트의 입자를 포함한다.
본 발명의 제2 방법에 대한 바람직한 구현예에서, 단계 (i)에서 사용되는 표면은 복수의 엔티티에 의해 형성되며, 단계 (ii)에서 제1 항체와 그리고 제2 항체와의 접촉은 각 용기가 표면을 형성하는 복수의 엔티티의 일부를 포함하는 별개의 용기들에서 수행된다.
본 발명의 제3 방법의 제3 단계에서, 단계 (ii)에서 형성된 복합체의 양과 유전자 변이체를 코딩하는 대립유전자의 수의 상관관계에 의해 결정된다.
특정 구현예에서, 아포지질단백질의 전체 함량에 대한 이소형의 상대량 측정은 단계 (ii)에서 수득되는 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준을 기반으로 수행되며, (iii)에서 측정된 상대량으로부터 아포지질단백질 이소형의 발현과의 상관관계에 의해 하플로타입의 대립유전자량이 결정된다.
특정 구현예에서, 단계 (ii)에서 검출되는 제1 복합체 및 제2 복합체의 검출로부터 유래되는 신호들 간의 비율을 검출한다. 그 결과, 아포지질단백질의 전체 함량에 대한 특정 아포지질단백질의 이소형의 상대량이 측정된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 비율은 0 (특정 아포지질단백질 이소형이 분석할 샘플에 부재할 경우) 내지 1 (특정 아포지질단백질 이소형이 분석할 샘플에 존재하는 아포지질단백질의 유일한 이소형일 경우) 범위일 수 있다. 즉, 비율 0은 분석되는 샘플내 아포지질단백질 이소형의 부재를 의미한다. 비율 1은, 여기서 1은 임의 단위 (arbitrary unit)의 임의 값임, 아포지질단백질 이소형에 동형접합성 개체를 의미한다. 비율 0.5는, 여기서 0.5는 임의 단위의 임의 값임, 아포지질단백질 이소형에 이형접합성 개체를 의미한다. 복합체를 검출하는 방법은 상기에 기술되어 있으며, 본 내용에 포함된다.
본 발명의 제2 방법에 대한 바람직한 구현예에서, 단계 (i)에서 사용되는 표면은 복수의 엔티티에 의해 형성되며, 단계 (ii)에서 제1 항체와 그리고 제2 항체와의 접촉은 각 용기가 표면을 형성하는 복수의 엔티티의 일부를 포함하는 별개의 용기들에서 수행되며, 단계 (iii)에서 검출은 각각의 용기에서 분리되어 수행된다. 이 구현예는, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 비드에 의해, 바람직하게는 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드에 의해 구성되고; 검출이 면역비탁법에 의해 수행되는 경우에, 특히 바람직하다. 따라서, 본 방법의 제2 단계에서 형성된 제1 복합체와 제2 복합체는 비탁법에 의해, 특히 면역비탁 분석에 의해 검출된다. 복합체 아포지질단백질 (이의 모든 이소형)-항체 또는 복합체 아포지질단백질 이소형-항체의 형성은, 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 분석할 샘플에 존재할 경우, 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 함유되지 않은 샘플에서의 탁도와 비교해, 탁도를 증가시키게 되며, 이때 탁도 변화를 (예, 분광광도계를 이용해) 측정할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 비탁 분석은 LEIT이다.
대안적인 특정 구현예에서, 본 방법의 제2 단계에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체는 검출가능한 시약을 이용해 검출된다. 본 발명의 내용에서 적절한 검출가능한 시약은 상기에서 기술되었으며, 본 내용에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 본 방법의 제2 단계에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체는, 항-아포지질단백질 항체 및/또는 항-아포지질단백질 이소형 항체에 특이적인, 리포터 항체를 이용해 검출된다. 바람직한 구현예에서, 제2 항체 (리포터 항체)는, 표면과 아포지질단백질 이소형의 인큐베이션 조건 및/또는 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체와 표면에 결합된 아포지질단백질 이소형의 인큐베이션 조건과 유사한 조건에서, 효소와 접합된다. 이 구현예는, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 플레이트, 바람직하게는 ELISA 플레이트에 의해 구성되며; 검출이 ELISA 분석을 이용해 수행되는 경우에, 특히 바람직하다.
그 결과, 비율 0은 분석되는 샘플내 아포지질단백질 이소형의 부재를 의미하며, 즉, 유전자 변이체를 코딩하는 특정 대립유전자의 양은 0이다. 비율 1은 아포지질단백질 이소형에 동형접합성인 개체를 의미하며, 즉, 유전자 변이체를 코딩하는 특정 대립유전자의 양은 2이다. 비율 0.5는 아포지질단백질 이소형에 이형접합성인 개체를 의미하며, 즉, 유전자 변이체를 코딩하는 특정 대립유전자는 함량 1로 존재하는 것이다.
본 발명의 제3 방법에 대한 바람직한 특정 구현예에서, 단계 (i)에서 사용되는 표면은 복수의 엔티티에 의해 형성되며, 단계 (ii)는 샘플에 존재하는 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체와 표면을 접촉시키는 단계를 더 포함하며, 이때 접촉은 제1 항체와 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건 하에 수행되며, 제1 항체와 그리고 제2 항체와의 접촉은 각 용기가 표면을 형성하는 복수의 엔티티의 일부를 포함하는 별개의 용기들에서 수행되며, 아포지질단백질 전체 함량을 기준으로 이소형의 상대량 측정은 단계 (ii)에서 수득되는 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준에 기초하여 수행되며, 아포지질단백질 이소형의 발현과 상관관계에 있는 하플로타입의 대립유전자량은 단계 (iii)에서 측정된 상대량으로부터 결정된다.
신경퇴행성 질환의 발병을 예측하는 방법
개체에서 19번 염색체에 ApoE ε4 유전자가 존재하는 것은 개체에서 알츠하이머 질환 (AD)의 발병 위험성을 높이는 것으로 알려져 있다. 이에, 개체에 apoE4 대립유전자의 존재는 apoE4 대립유전자가 없는 개체 보다 4배 높은 AD 발병 가능성과 상관관계가 있으며, 개체에 apoE4 대립유전자 2개의 존재는 apoE4 대립유전자를 보유하지 않은 개체 보다 15-20배 높은 AD 발병 가능성과 상관관계를 가진다. 즉, apoE4 등의 아포지질단백질 이소형을 검출하는 본 발명의 방법은 개체에서 AD의 발병을 예측하는 방법에도 적용될 수 있다.
따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은, 전술한 본 발명의 임의 방법 (제1, 제2 및 제3 방법)에 의해 apoE4 이소형을 개체 유래 샘플에서 확인하는 단계를 포함하며, apoE4 수준이 기준 값 보다 높을 경우, 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 더 높다는 것을 의미하는, 개체에서 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하기 위한 본 발명의 방법에 따른 기준 값은 apoE4 대립유전자를 보유하지 않은 개체 유래 샘플에서 결정되는 apoE4의 수준이다.
본 발명의 방법에 따른 기준 값 또는 기준 수준은 절대값; 상대값; 상한 또는 하한을 가진 값; 값들의 범위; 평균 값; 중앙값; 중간값; 또는 특정 대조군 또는 베이스라인 값과 비교되는 값일 수 있다. 기준 값은, 예를 들어, 테스트 중인 개체 샘플에서 수득되지만, 보다 조기에 수득된 값과 같이, 개체 샘플 값을 토대로 할 수 있다. 기준 값은 생활 연령이 일치되는 그룹의 개체 집단으로부터 유래되는 등의 많은 수의 샘플에 기반하거나, 또는 테스트할 샘플을 포함 또는 제외한 샘플의 풀에 기반할 수 있다. 마커의 기준 값을 결정할 때 여러가지 고려 인자들이 고려된다. 이러한 고려 인자들로는 환자의 나이, 체중, 성별, 전체적인 건강 상태 등이 있다. 예를 들어, 바람직하게는 상기한 고려 인자들에 따라, 예를 들어 다양한 연령 범주에 따라 분류된, 개체 2명 이상, 10명 이상, 100명 이상 내지 바람직하게는 1000명 이상으로 구성된 그룹과 동수가 기준 그룹으로 간주된다.
신경퇴행성 질환의 발병 가능성이 높다는 것은, 개체가 이러한 질환의 발병 또는 앓을 가능성이 경시적으로 적어도 5 %, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%로 나타내는 경우이다. 특정 구현예에서, 높은 가능성은 적어도 100%이다. 다른 구현예에서, 높은 가능성은 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900% 및 적어도 1000%이다. 그러나, 본 발명을 규명하기 위해 당해 기술 분야의 당업자에게 적절한 것으로 간주되는 그외 컷-오프 또는 범위 역시 고려되며, 이 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 예측 방법에서, 개체의 신경퇴행성 질환의 높은 발병 가능성은 개체의 게놈내 apoE4 대립유전자 하나 또는 두개의 존재와 관련 있으며, apoE4 대립유전자의 확인은 전술한 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 방법에 의해 수행된다.
신경퇴행성 질환의 발병 가능성이 낮다는 것은, 개체가 이러한 질환의 발병 또는 앓지 않을 가능성이 경시적으로 적어도 5 %, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%로 나타내는 경우이다. 특정 구현예에서, 낮은 가능성은 적어도 100%이다. 다른 구현예들에서, 낮은 가능성은 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900% 및 적어도 1000%이다. 본 발명을 규명하기 위해 당해 기술 분야의 당업자에게 적절한 것으로 간주되는 그외 컷-오프 또는 범위 역시 고려되며, 이 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 예측 방법에서, 개체의 신경퇴행성 질환의 낮은 발병 가능성은 개체의 게놈내 apoE4 대립유전자가 없는 것과 관련 있으며, apoE4 대립유전자의 확인은 전술한 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 방법에 의해 수행된다.
특정 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환 (AD), 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 다운 증후군성 치매, 혈관성 치매, 파킨슨 질환, 루이소체 치매 및 크로이츠펠트-야콥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 특정한 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환 (AD)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제3 방법에 의해 apoE4 이소형을 코딩하는 하플로타입의 대립유전자량을 개체에서 결정하는 단계를 포함하며, 개체의 게놈에서 apoE4 대립유전자 하나 또는 2개의 존재는 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하며, 개체의 게놈에 apoE4 대립유전자의 부재는 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 낮다는 것을 의미하는, 개체에서 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환 (AD), 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 다운 증후군성 치매, 혈관성 치매, 파킨슨 질환, 루이소체 치매 및 크로이츠펠트-야콥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환 (AD)이다.
심혈관 질환의 발병을 예측하는 방법
아포지질단백질 결핍증 (apolipoprotein deficiency)은 심혈관 질환의 발병과 연관되어 있다. 따라서, 본 발명의 아포지질단백질 및 아포지질단백질 이소형을 확인하는 방법은 심혈관 질환의 발병 위험성을 예측하는 방법에도 물론 이용될 수 있다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은, 전술한 본 발명의 임의 방법 (제1, 제2 및 제3 방법)에 의해 아포지질단백질 이소형의 수준을 개체 유래 샘플에서 확인하는 단계를 포함하며, 아포지질단백질 이소형 수준이 기준 값 보다 높을 경우, 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는, 개체에서 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 제3 방법에 의해 아포지질단백질 이소형을 코딩하는 하플로타입의 대립유전자량을 개체에서 결정하는 단계를 포함하며, 개체의 게놈에서 아포지질단백질 이소형 대립유전자 하나 또는 2개의 존재는 상기 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하며, 개체의 게놈에 아포지질단백질 이소형의 대립유전자의 부재는 상기 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 낮다는 것을 의미하는, 개체에서 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 심혈관 질환을 예측하는 방법에 대한 일 구현예에서, 확인할 아포지질단백질 이소형은 apoE 이소형이며, 구체적으로 apoE 이소형 apoE E2, apoE E3 및 apoE E4로 이루어진 군으로부터 선택되는 apoE 이소형이며, 심혈관 질환은 III형 고지방단백혈증 (이상베타지질단백혈증 또는 광베타병 (broad beta disease), 지질, 특히 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 부적절한 대사로 인해 체내 지질이 비정상적으로 축적되거나 고지혈증을 발생시키는 것을 특징으로 하는 희귀 유전 장애), 아포지질단백질 e-d 결함으로 인한 이상베타지질단백혈증 (dysbetalipoproteinemia), 가족성 고베타지질단백혈증 (저밀도 지단백질 또는 베타-지단백질의 혈액내 축적 증가) 및 전-베타지질단백혈증 (prebetalipoproteinemia) (혈중 초고밀도 지단백질 또는 전-베타 지단백질의 과잉), 고지혈증을 동반한 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증성 황색종증을 동반한 고지혈증 (혈중 콜레스테롤-풍부 축적의 침착), 광-베타지질단백혈증 (신체 여러 곳에 지방이 과다 축적된 부위가 발생하여, 손바닥, 손가락, 무릎, 팔꿈치 및 팔 등의 신체 전역의 비정상적인 위치에 지방이 저장되는 것을 특징으로 하는 병태), 플로팅-베타지질단백혈증 (floating-betalipoproteinemia) 및 관상 동맥 질환 (심근에 혈액을 공급하는 동맥이 좁아지고 경화되어 죽상동맥경화증, 심지어 협심증 또는 심장 마비)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 심혈관 질환의 예측 방법에 대한 다른 구현예에서, 검출할 아포지질단백질은 apoAI이며, 심혈관 질환은 저알파지질단백혈증 (hypoalphalipoproteinemia) (HDL 결핍, 상염색체 우성 방식으로 유전됨)이다.
본 발명의 심혈관 질환의 예측 방법에 대한 다른 구현예에서, 결정할 아포지질단백질은 apoCII이며, 심혈관 질환은 Ib형 고지질단백혈증 (높은 수준의 킬로미크론을 특징으로 하는 낮은 수준의 apoCII로 인해 유발되는 희귀 유전 질환)이다.
본 발명의 심혈관 질환의 예측 방법에 대한 다른 구현예에서, 결정할 아포지질단백질은 apoCIII이며, 심혈관 질환은 고트리글리세라이드혈증 (hypertriglycidemia) (혈중 트리글리세라이드 수치 증가)과 관련된 apoCIII 결핍증이다.
본 발명의 키트 및 이의 이용
다른 측면에서, 본 발명은 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면 및 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 포함하는 키트에 관한 것으로서, 키트는 상기한 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 제2 항체를 포함하지 않는다.
즉, 본 발명의 키트에서 제1 요소는 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이다. 본 발명에 따른 폴리스티렌 및 폴리카르보네이트 표면은 본 발명의 제1 방법에 대한 내용에서 이미 설명되었으며, 본 내용에 포함된다. 바람직하게는, 표면은 폴리스티렌 표면이다. 특정 구현예에서, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 ELISA 플레이트, 루미넥스 비드, 비탁용 비드 또는 단백질 어레이에 의해 구성된다. 특히 바람직한 표면은 폴리스티렌 표면이며, 비-제한적인 예로, ELISA 플레이트와 같은 플레이트, 루미넥스 비드 및 비탁용 비드와 같은 비드 및 입자 등을 포함한다.
본 발명의 키트에서 제2 요소는 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체이다. 본 발명의 키트에 따른 아포지질단백질은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)를 포함한다. 본 발명의 키트에 따른 아포지질단백질 이소형은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린) 이소형을 포함한다. 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체는 상기에서 이미 설명되었으며, 본 내용에 포함된다. 특정 구현예에서, 아포지질단백질은 apoE이고, 항체는 anti-apoE 항체이다. 특정 구현예에서, 아포지질단백질 이소형은 apoE2, apoE3 및 apoE4로 이루어진 군으로부터 선택되는 apoE 이소형이며, 항체는 anti-apoE2, anti-apoE3 및 anti-apoE4 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 키트에서 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체는 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면, 바람직하게는 폴리스티렌 표면에 결합된다.
본 발명의 키트는, 키트에 포함되는 항체의 특이 대상인 특정 아포지질단백질 또는 이의 특정 이소형에 특이적인 제2 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 특정 구현예에서, 키트에 포함되는 항체가 특정 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체일 경우, 키트는 이러한 특정 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체를 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 키트는 리포터 항체를 더 포함하며, 리포터 항체는 키트에 포함된 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체에 특이적이다. 대안적인 특정 구현예에서, 본 발명의 키트에서 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체는 검출가능한 시약을 포함한다. 본 발명의 내용에서 적합한 검출가능한 시약은 본 발명의 제1 방법에 대한 내용에서 이미 설명되었으며, 본 내용에 포함된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 샘플에서 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한, 샘플에서 아포지질단백질의 전체 함량에 대해 소정의 아포지질단백질의 이소형의 상대량을 측정하기 위한, 개체에서 아포지질단백질 이소형의 발현과 연관된 하플로타입의 대립유전자량을 결정하기 위한, 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하기 위한, 또는 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하기 위한, 전술한 키트의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한 전술한 키트의 용도에 관한 것이다. 보다 특정한 구현예에서, 본 발명은 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한 전술한 키트의 용도에 관한 것으로서, 이때 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면은 알부민으로 차단 처리되며, 보다 더 바람직하게는 알부민은 BSA이다. 이들 한정에 대한 구체적인 상세 내용들은 본원에 설명되어 있으며, 본 내용에 포함된다.
즉, 본 발명은 하기 측면들에 관한 것이다:
1. 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한 시험관내 방법:
(i) 샘플을, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과, 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 표면에 결합시키기에 적절한 조건 하에 접촉시키는 단계로서, 상기 표면은 이 표면에 결합되는 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형이 결합된 표면에, 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를, 상기 항체 및 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형 간에 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계.
2. 제1 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질이 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (clusterin)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
3. 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 아포지질단백질의 전체 함량에 대해 소정의 아포지질단백질의 이소형의 상대량을 측정하는 시험관내 방법:
(i) 샘플을, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과, 표면에 아포지질단백질을 결합시키기에 적절한 조건하에 접촉시키고, 상기 표면이 이 표면에 결합되는 상기 아포지질단백질에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면을, 샘플에 존재하는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 제1 항체 및 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 접촉이 제1 항체와 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건 하에 수행되는, 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체를 검출하는 단계; 및
(iv) 단계 (iii)에서 수득된 상기 제1 복합체 및 상기 제2 복합체의 수준에 기초하여 아포지질단백질의 전체 함량에 대한 상기 아포지질단백질 이소형의 상대량을 측정하는 단계.
4. 제3 측면에 따른 방법으로서, 단계 (i)에서 사용되는 표면이 복수의 엔티티 (entity)에 의해 형성되며, 단계 (ii)에서 상기 제1 항체와의 접촉과 상기 제2 항체와의 접촉이 상기 표면을 형성하는 복수의 엔티티 중 일부를 각각 함유한 별개의 용기에서 수행되며, 단계 (iii)에서 검출이 각각의 용기에서 개별적으로 수행되는, 방법.
5. 제3 측면 또는 제4 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질 이소형이 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질의 이소형인, 방법.
6. 제5 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질이 apoE이고, apoE 이소형이 apoE2, apoE3 및 apoE4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
7. 하기 단계를 포함하는, 아포지질단백질 이소형의 발현과 연관된 하플로타입의 대립유전자량을 결정하는 방법:
(i) 아포지질단백질 이소형이 발현되는 조직으로부터 유래되는, 상기 개체 유래의 단백질-함유 샘플을, 표면에 아포지질단백질 이소형을 결합시키기에 적절한 조건 하에, 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면과 접촉시키는 단계로서, 상기 표면은 이 표면에 결합되는 상기 아포지질단백질 이소형에 특이적인 항체를 함유하지 않는, 단계;
(ii) 단계 (i)에서 형성된 아포지질단백질이 결합된 표면에, 아포지질단백질 이소형에 특이적인 하나 이상의 항체를, 항체와 아포지질단백질 이소형 간에 복합체를 형성시키기에 적절한 조건 하에, 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 형성된 복합체의 양과 유전자 변이체를 코딩하는 대립유전자의 수의 상관관계에 의해, 상기 아포지질단백질 이소형의 대립유전자량을 결정하는 단계.
8. 제7 측면에 따른 방법으로서, 단계 (i)에서 사용되는 표면이 복수의 엔티티에 의해 형성되며, 단계 (ii)가 샘플에 존재하는 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체를 상기 표면과 접촉시키는 단계를 더 포함하며, 상기 접촉이 제1 항체와 아포지질단백질 이소형을 포함하는 제1 복합체의 형성 및 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체의 형성에 적절한 조건 하에 수행되며, 상기 제1 항체와 제2 항체와의 접촉이 상기 표면을 형성하는 복수의 엔티티의 일부를 각각 포함하는 별개의 용기에서 수행되며, 상기 아포지질단백질의 전체 함량에 대한 상기 이소형의 상대량의 측정이 단계 (ii)에서 수득된 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준에 기초하여 수행되며, 상기 아포지질단백질 이소형의 발현과 연관된 하플로타입의 대립유전자량이 단계 (iii)에서 측정된 상대량으로부터 결정되는, 방법.
9. 제7 또는 제8 측면에 따른 방법으로서, 아포지질단백질 이소형을 코딩하는 유전자 변이체가 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질의 이소형을 코딩하는 유전자인, 방법.
10. 제9 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질 이소형을 코딩하는 유전자가 apoE4를 코딩하는 유전자인, 방법.
11. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 뇨 및 뇌척수액 (CSF)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
12. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 샘플이 혈장이고, 바람직하게는 1:10 - 1:100000, 바람직하게는 1:100 - 1:1000, 더 바람직하게는 1:200 범위의 희석 비율의 혈장인, 방법.
13. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 결합 단계 (i) 전에 차단 처리되는, 방법.
14. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 표면이 아포지질단백질 이외의 다른 단백질 및/또는 디터전트에 의해 차단 처리되는, 방법.
15. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 표면이 BSA, 카제인 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 사용해 차단 처리되며, 상기 디터전트는 폴리비닐피롤리돈-40 (PVP-40), 폴리소르베이트20, Nonidet-P40 및 Triton X-100으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
16. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 표면이 BSA, 바람직하게는 1% BSA로 차단 처리되는, 방법.
17. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 폴리스티렌 표면이 결합 단계 (i) 이후에 세척 용액으로 처리되는, 방법.
18. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 세척 용액이 하나 이상의 염을 포함하는, 방법.
19. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 염이 NaCl인, 방법.
20. 제17-19 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 세척 용액이 하나 이상의 디터전트를 포함하는, 방법.
21. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 하나 이상의 디터전트가 폴리소르베이트 20 및 Triton X-100으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
22. 제17-21 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 세척 용액이 산을 포함하는, 방법.
23. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 산이 2M HCl 또는 70% 포름산인, 방법.
24. 제17-21 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 세척 용액이 염기를 포함하는, 방법.
25. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 염기가 2M NaOH인, 방법.
26. 제17-25 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 세척 용액이 환원제를 포함하는, 방법.
27. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 환원제가 2-머캅토에탄올인, 방법.
28. 제17-27 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 세척 용액이 프로테아제, 산화제 또는 이의 조합물을 포함하지 않는, 방법.
29. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 ELISA 플레이트, 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드에 의해 구성되는, 방법.
30. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 단계 (iii)에서 복합체 검출이 ELISA에 의해 또는 면역비탁 분석 (immunoturbidimetric assay)에 의해 수행되는, 방법.
31. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 면역비탁 분석이 LEIT (Latex-Enhanced Immunoturbidimetry Technology)인, 방법.
32. 제1-30 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 단계 (iii)에서 형성된 복합체의 검출이 항-아포지질단백질 항체에 특이적인 리포터 항체를 이용해 수행되는, 방법.
33. 개체의 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법으로서, 제1-32 측면들 중 임의 측면에 따른 방법에 의해 apoE4 이소형의 수준을 개체 유래 샘플에서 결정하는 단계를 포함하며, apoE4 수준이 기준값 보다 높을 경우, 이는 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것인, 방법.
34. 개체의 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법으로서, 제7-32 측면들 중 임의 측면에 따른 방법에 의해 apoE E4 이소형을 코딩하는 하플로타입의 대립유전자량을 개체에서 결정하는 단계를 포함하며, 개체의 게놈에 apoE E4 대립유전자 하나 또는 2개의 존재는 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것이고, 개체의 게놈에 apoE4 대립유전자의 부재는 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 낮다는 것을 의미하는 것인, 방법.
35. 제33 또는 제34 측면에 따른 방법으로서, 상기 신경퇴행성 질환이 알츠하이머 질환 (AD), 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (CAA), 다운 증후군성 치매, 혈관성 치매, 파킨슨 질환, 루이소체 치매 및 크로이츠펠트-야콥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
36. 전술한 측면들 중 임의 측면에 따른 방법으로서, 상기 신경퇴행성 질환이 알츠하이머 질환 (AD)인, 방법.
37. 개체에서 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법으로서, 제1-31 측면들 중 임의 측면에 따른 방법에 의해 아포지질단백질 이소형의 수준을 개체 유래 샘플에서 결정하는 단계를 포함하며, 상기 아포지질단백질 이소형의 수준이 기준값 보다 높을 경우, 이는 그 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것인, 방법.
38. 개체에서 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법으로서, 제7-30 측면들 중 임의 측면에 따른 방법에 의해 아포지질단백질 이소형을 코딩하는 하플로타입의 대립유전자량을 개체에서 측정하는 단계를 포함하며, 개체의 게놈에 아포지질단백질 이소형의 대립유전자 하나 또는 2개의 존재는 상기 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것이고, 개체의 게놈에 아포지질단백질 이소형 대립유전자의 부재는 상기 개체가 심혈관 질환을 앓을 가능성이 낮다는 것을 의미하는 것인, 방법.
39. 제37 또는 제38 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질 이소형이 apoE 이소형이고, 상기 심혈관 질환이 III형 고지방단백혈증, 아포지질단백질 e-d의 결함으로 인한 이상베타지질단백혈증, 가족성 고베타-지질단백혈증, 전-베타지질단백혈증, 고지혈증을 동반한 가족성 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증성 황색종증을 동반한 고지혈증, 광-베타지질단백혈증, 플로팅-베타지질단백혈증 (floating-betalipoproteinemia) 및 관상 동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
40. 제37 또는 제38 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질 이소형이 apoAI이고, 상기 심혈관 질환이 저알파지질단백혈증 (hypoalphalipoproteinemia)인, 방법.
41. 제37 또는 제38 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질 이소형이 apoCII이고, 상기 심혈관 질환이 Ib형 고지질단백혈증 (hyperlipoproteinemia type Ib)인, 방법.
42. 제37 또는 제38 측면에 따른 방법으로서, 상기 아포지질단백질 이소형이 apoCIII이고, 상기 심혈관 질환이 고트리글리세라이드혈증과 관련된 apoCIII 결핍증인, 방법.
43. 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면; 및 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 포함하며, 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 제2 항체를 더 포함하지 않는, 키트.
44. 제43 측면에 따른 키트로서, 상기 키트에 존재하는 항체가 아포지질단백질 이소형에 특이적일 경우, 상기 키트는 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체를 더 포함하는, 키트.
45. 제43 또는 제44 측면에 따른 키트로서, 상기 아포지질단백질이 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 아포지질단백질 이소형이 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ (클루스테린)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질의 이소형인, 키트.
46. 제45 측면에 따른 키트로서, 상기 아포지질단백질이 apoE이고, 상기 apoE 이소형이 apoE2, apoE3 및 apoE4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
47. 제43-46 측면들 중 임의 측면에 따른 키트로서, 상기 폴리스티렌 표면 또는 폴리카르보네이트 표면이 ELISA 플레이트, 루미넥스 비드 또는 비탁용 비드에 의해 구성되는, 키트.
48. 제43-47 측면들 중 임의 측면에 따른 키트로서, 리포터 항체를 더 포함하며, 상기 리포터 항체가 상기 키트의 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체에 특이적인, 키트.
49. 제43-47 측면들 중 임의 측면에 따른 키트로서, 상기 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체가 검출가능한 시약을 포함하는, 키트.
50. 샘플에서 아포지질단백질 또는 이의 이소형을 검출 및/또는 정량하기 위한, 샘플에서 아포지질단백질의 전체 함량에 대해 소정의 아포지질단백질의 이소형의 상대량을 측정하기 위한, 개체에서 아포지질단백질 이소형의 발현과 연관된 하플로타입의 대립유전자량을 결정하기 위한, 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하기 위한, 또는 심혈관 질환의 발병 가능성을 확인하기 위한, 제43-49 측면들 중 임의 측면에 따른 키트의 용도.
본 발명은 하기 실시예들을 들어 아래에서 상세히 설명되나, 하기 실시예들은 단지 예이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 해석된다.
실시예
실시예 1. ELISA에 의한 ApoE4 검출
재료 및 장치
· 고-결합성 ELISA 플레이트 (Nunc MaxiSorp® flat-bottom 96 웰 플레이트. 대체가능한 ELISA 플레이트 타입 및 브랜드가 사용될 수 있으며, 비슷한 결과를 수득할 수 있다.
· Superblock / TBS (Thermo-Fisher, # PI-37535). 특히 젤라틴, BSA, 카제인, Tween-20 등의 대체가능한 차단 시약이 사용되며, 비슷한 결과가 수득된다.
· apoE E4, 클론 4E4 (Novus Biologicals, #NBP1-49529)에 특이적인 마우스 단일클론 항체.
apoE E4에 특이적인 대체가능한 항체가 사용됨 (apoE E4, 클론 5B5에 특이적인 마우스 단일클론 항체 (IBL #10025); apoE E4, 클론 1F9에 특이적인 마우스 단일클론 항체 (MBL, #M067-3)).
· 전체 apoE에 대한 토끼 다클론 항체 (SantaCruz Biotechnology, Inc., # sc- 98573)
· 폴리소르베이트-20 (Tween-20), Sigma-Aldrich
· 퍼옥시다제 접합된, 다클론 항체 항-마우스 IgG.
· TMB 퍼옥시다제 EIA 기질 (Biorad)
· ELISA 세척 스테이션 (TECAN)
· ELISA 분광광도계 (TECAN)
검출 방법
· Tris-완충화된 염수 (TBS) 중의 Superblock (SB) 200 ㎕를 첨가함으로써 실온 (RT)에서 16시간 동안 ELISA 플레이트 차단 처리.
· ELISA 세척 스테이션 중의 TBS 0.1% Tween20 300 ㎕으로 2번 세척.
· TBS + 20% SB 중의 1:200 희석 혈장 100 ㎕를 첨가하여, RT에서 1시간 동안 인큐베이션.
· ELISA 세척 스테이션 중의 TBS 0.1% Tween20 300 ㎕으로 4번 세척.
· TBS + 20% SB 중의 1:2,000으로 희석한 리포터 항체: 4E4 항체 50 ㎕를 첨가하여, RT에서 45분간 인큐베이션.
· ELISA 세척 스테이션 중의 TBS 0.1% Tween20 300 ㎕으로 4번 세척.
· TBS + 20% SB 중의 항-마우스 IgG -퍼옥시다제 (1:10,000) 50 ㎕를 첨가하여 30분간 인큐베이션.
· ELISA 세척 스테이션 중의 TBS 0.1% Tween20 300 ㎕으로 4번 세척.
· 암 조건에서 TMB 100 ㎕을 첨가하여 10분간 두어 발색시킴.
· 2.15 N H2SO4 100 ㎕을 첨가하여 반응 정지.
· 분광광도계를 사용해 450 nm에서 플레이트를 판독하고, 기준 파장으로 750 nm를 사용함.
혈장 샘플을 1:20 내지 >1:80000 범위의 여러 희석 비율에서 분석한다. 최상의 식별 결과는 1:100 - 1:1,000 범위에서 수득된다. 본원에 기술된 분석에서, 사용된 혈장 희석율은 달리 언급되지 않은 한 1:200이다.
다른 예로, 5B5 및 1F9 등의 apoE E4 특이적인 다른 단일클론 항체가 사용되었지만, 최상의 결과는 4E4 클론에서 수득되었다.
인큐베이션 시간은 결과에 중요한 변동없이 단축될 수 있다.
여러가지 생물 체액을 본원에 기술된 프로토콜에 의해 분석할 수 있지만, 샘플의 최적 희석율은 apoE 출발 농도에 따라 결정되어야 한다.
결과
혈장 샘플에서 apoE E4의 부재/존재 식별
ApoE4의 부재/존재는, E4 이소형에 특이적인 단일클론 항체 및 폴리스티렌 플레이트를 이용함으로써 전술한 프로토콜에 의해 검출하였다. 실시간 PCR에 의해 기존에 유전자형 (e2/e3, n=16; e2/e4, n=4; e3/e3, n=141; e3/e4, n=59; e4/e4, n=10) 확인된 개체 유래의 혈장 샘플 230개를 분석하였다. 분석에 대한 검증은 (ApoE4 보유체 73건, ApoE4 비-보유체 157건), 실시간 PCR에 의한 ApoE 유전자형 동정 결과와 100% 일치하는 것으로 확인되었다 (도 1 및 표 1 참조).
표 1. apoE4 이소형 동정을 위해 분석한 혈장 샘플 230개에 대한 유전자형 분포 및 ELISA 판독 결과.
표 1 및 도 2에 나타낸 결과에 따르면, 동형접합성 APOE e4/4 유래의 혈장 샘플은 APOE e3/e4 및 e2/e4 이형접합체 보다 높은 흡광 결과를 나타내는 경향이 있으며, 이는 그룹 간에 일부 중첩되지만, e4 동형접합체를 이형접합체와 구분하는 것이 가능함을 시사해준다.
혈장 샘플에서 이형접합성/동형접합성 APOE ε4 보유체 식별
다른 예로, 이형접합제 샘플과 동형접합체 샘플에 대한 추가적인 구별은, apoE E4에 특이적인 분석과 전체 apoE의 수준을 결정하기 위한 또 다른 분석인 더블 ELISA 분석을 각 샘플에 대해 수행함으로써 달성할 수 있다 (리포터 항체: pan-apoE 항체, 예컨대 다클론-pan-apo, SantaCruz Biotech., H-223, #sc-98573). 도 4에 나타낸 바와 같이, apoE E4/전체 apoE의 비율은 apoE ε4 대립유전자량에 대한 양호한 대리인자 (proxy)이다. 식별력은 조사한 3가지 희석 비율에서 양호하다 (도 4).
폴리스티렌 표면에 여러가지 아포지질단백질의 결합
폴리스티렌 표면에 대한 다른 아포지질단백질의 결합성을 조사하기 위해, 전술한 ELISA 프로토콜을 수행하였으며, 이때 특정 아포지질단백질에 특이적인 여러가지 리포터 항체들을 사용하였다. 분석 결과, apoCI, apoAI, apoCIII, 전체 apoE 및 클루스테린은 apoE E4와 비슷한 양상으로 플레이트에 결합할 수 있는 것으로, 나타났다 (도 5 참조).
폴리스티렌 표면에 안정적인 apoE 결합
apoE-폴리스티렌 결합 특성을 추가로 규명하기 위해, 염 (NaCl 0-2.4 M) 또는 디터전트 (폴리소르베이트 20 또는 Triton X-100 0-0.5%)를 함유한 여러가지 완충제의, 폴리스티렌 플레이트에 결합된 apoE를 제거하는 제거력을 분석하였다. 이를 위해, 혈장 (희석율 1:200)에 존재하는 apoE와의 결합 후, 여러가지 대상 완충제를 첨가하여 RT에서 1시간 동안 웰을 인큐베이션하고, 세척한 다음, 전술한 바와 같이 분석을 계속 수행하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, NaCl 또는 디터전트의 농도를 증가시키면 염 또는 디터전트가 무첨가된 대조군과 비교해 apoE의 검출이 증가되었다. 이러한 결과는, 결합이 정전기적 및 소수성 상호작용의 조합에 의해 매개된다는 것을, 시사한다 (도 6).
apoE-폴리스티렌 결합의 안정성을 또한 BSA를 이용한 차단 용액 또는 Superblock로 차단된 웰에서 pH 2 - 10 범위의 pH에 따라 분석하였다 (도 7). BSA-차단된 폴리스티렌 웰에 apoE의 결합은, 검사한 pH 범위에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 흥미롭게도, Superblock-차단된 폴리스티렌 웰에의 apoE의 결합은 pH 5 미만에서는 불안정적이었는데 (도 7), 이는 BSA가 존재하는 것이 이의 완충력으로 인해 보다 안정적인 미세환경을 유지시키는데 도움이 될 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 추가적인 안정성 분석은 BSA 용액으로 차단된 웰에서 수행하였다.
또한, 56℃에서 1시간 동안 하기를 처리함으로써, 보다 엄격한 조건에서 분석하였다 (도 8 참조):
- 강산 (2 M HCl 또는 70% 포름산),
- 강염기 (2 M NaOH),
- 음이온성 디터전트와 환원제의 조합 (2% SDS 및 0.7% 2-머캅토에탄올, "스트리핑 완충제"),
- 차아염소산나트륨 (20,000 ppm), 및
- 효소 디터전트 (Coulter Clenz® cleaning agent, Beckman Coulter)
흥미롭게도, 플레이트에 결합된 apoE를 완전히 제거할 수 있었던 유일한 시약은 효소 절단 (효소 디터전트) 또는 산화 (차아염소산나트륨)에 의해 단백질을 파괴하는 것이다 (도 8).
이러한 결과들은, apoE-폴리스티렌 결합 상호작용이 매우 안정적이어서, 강한 디터전트, 강산 및 강염기 세척에 내성을 나타낸다는 것을, 의미한다. 이러한 특성들은 고 엄격성의 특정 조건에서 면역분석, 단백질-마이크로어레이 분석, 비탁 분석 등을 수행하여, 추가적인 정제, 분획화 (fractionation) 또는 농축 공정의 필요성을 생략가능하게 해준다.
유사 결과들은 폴리스티렌에 대한 다른 아포지질단백질의 결합에서도 관찰되었으며, 비슷한 결과들이 여러 아포지질단백질에 대한 또 다른 공정에서도 확인되었다.
실시예 2. 비탁 분석에 의한 ApoE4 검출
재료 및 장치
- 혈장 샘플: APOE e3/e3 샘플 11종 및 APOE e4/e4 샘플 6종.
- Superblock, Prot. 20141222143CM, #143CM1로 코팅된, LEIT 백색 미소구-NH2
- 분광광도계, Ref. UV-3100PC (VWR), Code: PDX-1004
- Finnpipette F1 2-20 ㎕, Ref. 4641060 (Thermoscientific, VWR), Code: PDX- 1009
- Finnpipette F1 20-200 ㎕, Ref. 4641080 (Thermoscientific, VWR), Code: PDX- 1010
- MILI-Q ReferenceA+, Ref. Z00QSVC01
- Combifridge Liebherr, Ref. CN4056, Code: PDM-1000
- Vortex Mixer, Ref. VX200 (Labnet, Era biotech), Code: PDX-1013
- 옵티마 가열 순환조 (Optima heated circulating bath), Ref. TC120-ST12 (Grant, VWR), code: PDX- 1028.
LEIT (Latex-Enhanced Immunoturbidimetry Technology)에 기초한 비탁 분석에서는 폴리스티렌 비드를 사용한다. 즉, 본 발명자들은, ELISA 플레이트에서 확인된 바와 같이, 폴리스티렌과의 안정성 및 친화성이 모두 높은 상호작용을 이용하는, 상기한 기법을 apoE E4 및 기타 아포지질단백질의 분석에 이용하였다.
LEIT는 ELISA 보다 민감도가 낮지만, 흥미롭게도 아포지질단백질과 같은 상대적으로 고 농도의 분석물에는 상당히 유익하다. LEIT는 5-20분간 완전-자동화된 랜덤 액세스 커먼 클리니컬 케미스트리 애널라이저 (fully-automated random access common Clinical Chemistry analyzer)에서 검사를 수행할 수 있다. ELISA와 비교해 LEIT에 사용되는 원료가 더 비싸지만, 임상 실험실에서의 기법의 시간 단축, 용이성 및 유용성으로 완전히 보완된다. 그래서, LEIT는 apoE를 식별하는데 유용한 기법으로 간주된다.
LEIT 기법 및 단일클론 4E4를 이용한 APOE e3/e3 샘플 및 APOE e4/e4 샘플 6종에 대한 예비 분석 결과, 이 공정이 비-보유체를 apoE E4 보유체와 구분할 수 있는 것으로 나타났다 (도 9).
검출 방법 (검사 1)
작동 용액 준비:
- PBS 10 mM pH 7.3 중의 단일클론 항체 anti-apoE 4 0.176 mg/mL 용액 0.5 mL.
- 단일클론 항체 88 ㎕를 412 ㎕에 용해한다.
프로토콜:
1. LEIT 백색 미소구-NH2 14.6 ㎕를 에펜도르프 튜브에 넣고, PBS + Tween20 0.01% 131.4 ㎕를 첨가한다. 마이크로파이펫으로 균질화하고, 2분간 37℃에서 인큐베이션한다.
2. apoE 샘플 용액 3.85 ㎕를 동일 에펜도르프 튜브에 넣고, 마이크로파이펫으로 균질화한 다음 2분간 37℃에서 인큐베이션한다.
3. 단일클론 항체 용액 50 ㎕를 첨가하고, 마이크로파이펫으로 균질화한 다음 석영 큐벳으로 전량 이동시킨다.
4. 최소 5분간, 최대 10분간 흡광도를 판독한다.
검출 방법 (검사 2)
작동 용액 준비:
- PBS 10 mM pH 7.3 중의 단일클론 항체 anti-apoE 4 0.044 mg/mL 용액 0.5 mL.
- 단일클론 항체 22 ㎕를 478 ㎕에 용해한다.
프로토콜:
1. LEIT 백색 미소구-NH2 14.6 ㎕를 에펜도르프 튜브에 넣고, PBS + Tween20 0.01% (#144CM1) 131.4 ㎕를 첨가한다. 마이크로파이펫으로 균질화하고, 2분간 37℃에서 인큐베이션한다.
2. apoE 샘플 용액 3.85 ㎕를 동일 에펜도르프 튜브에 넣고, 마이크로파이펫으로 균질화한 다음 2분간 37℃에서 인큐베이션한다.
3. 단일클론 항체 용액 50 ㎕를 첨가하고, 마이크로파이펫으로 균질화한 다음 석영 큐벳으로 전량 이동시킨다.
4. 최소 5분간, 최대 10분간 흡광도를 판독한다.
결과
검사 1
여러 시간대에 LEIT에 의해 apoE를 분석하기 위한 검사 1 및 2의 결과를 각각 표 2 및 3에 나타낸다.
표 2. 여러 시간대에 LEIT에 의한 e4/e4 샘플 3종, e3/e4 샘플 3종 및 e3/e3 샘플 3종에 대한 검사 1의 분석 결과
표 3. 여러 시간대에 LEIT에 의한 e4/e4 샘플 6종 및 e3/e3 샘플 11종에 대한 검사 2의 분석 결과
검사 1의 결과로부터, 본 발명의 발명자들은, LEIT 분석으로 3/4 혈장 샘플 1종을 제외하고는, 여러 apoE 혈장 샘플들을 구분할 수 있다는, 결론에 도달하였다 (표 2). 즉, ApoE4 라텍스 비탁 분석에 대한 실험의 최적 조건이 확립되었다 (표 4):
o 2,75 ㎍ Anti-ApoE4/검사
o 3,85 ㎕ 혈장 샘플
o 총 분석 부피 200 ㎕.

Claims (17)

  1. 샘플에서 apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질을 검출 및/또는 정량하기 위한 시험관내 방법으로서,
    (i) 샘플을 폴리스티렌 표면과 접촉시켜, 아포지질단백질과 폴리스티렌 표면 사이의 직접적인 정전기적 및/또는 소수성 상호작용을 통해 아포지질단백질을 폴리스티렌 표면에 결합시키는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 형성된 상기 아포지질단백질이 결합된 표면에, 상기 아포지질단백질에 특이적인 항체를 접촉시켜, 상기 항체 및 상기 아포지질단백질 간에 복합체를 형성하는 단계; 및
    (iii) 단계 (ii)에서 형성된 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,
    상기 폴리스티렌 표면이 상기 샘플과의 접촉 전에 알부민, 카제인, 젤라틴 또는 디터전트로 이루어진 목록에서 선택되는 화합물로 차단되는, 방법.
  2. 샘플에서 아포지질단백질의 전체 함량에 대해, apoAI, apoAIV, apoCI, apoCII, apoCIII, apoE 및 apoJ 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아포지질단백질의 이소형의 상대적인 함량을 측정하기 위한 시험관내 방법으로서,
    (i) 샘플을 폴리스티렌 표면과 접촉시켜, 아포지질단백질과 폴리스티렌 표면 사이의 직접적인 정전기적 및/또는 소수성 상호작용을 통해 아포지질단백질을 폴리스티렌 표면에 결합시키는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 형성된 상기 아포지질단백질이 결합된 표면에, 상기 샘플에 존재하는 상기 아포지질단백질의 이소형에 특이적인 제1 항체 및 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체를 접촉시켜, 상기 제1 항체 및 상기 아포지질단백질의 이소형을 포함하는 제1 복합체 및 상기 제2 항체와 상기 아포지질단백질의 모든 이소형을 포함하는 제2 복합체를 형성하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)에서 형성된 상기 제1 복합체 및 제2 복합체를 검출하는 단계; 및
    (iv) 단계 (iii)에서 수득한 상기 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준을 기초로 아포지질단백질 전체 함량에 대한 상기 아포지질단백질의 이소형의 상대적인 함량을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 폴리스티렌 표면이 상기 샘플과의 접촉 전에 알부민, 카제인, 젤라틴 또는 디터전트로 이루어진 목록에서 선택되는 화합물로 차단되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아포지질 단백질의 이소형이 apoE E4인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 알부민이 소 혈청 알부민 (BSA)인, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 디터전트가 비-이온성 디터전트인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아포지질 단백질이 apoE E4 이고, 알부민이 소 혈청 알부민 (BSA)인, 방법.
  7. 제2항에 있어서,
    단계 (i)에서 사용되는 상기 표면이 복수의 엔티티 (entity)에 의해 형성되며,
    단계 (ii)에서 상기 제1 항체 및 제2 항체를 접촉시키는 단계는, 상기 형성하는 복수의 엔티티의 일부를 각각 함유한, 별개의 용기에서 수행되며,
    단계 (iii)에서 검출 단계는 각각의 용기에서 개별적으로 수행되는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 폴리스티렌 표면이 상기 단계 (i) 이후에 세척 용액으로 처리되는, 방법.
  9. 개체에서 신경퇴행성 질환의 발병 가능성을 확인하는 방법으로서,
    상기 개체 유래 샘플에서 apoE E4 이소형의 수준을 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 의해 결정하는 단계를 포함하며,
    상기 apoE E4의 수준이 기준값 보다 높을 경우, 이는 상기 개체가 신경퇴행성 질환을 앓을 가능성이 높다는 것을 의미하는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환이 알츠하이머 질환 (AD), 대뇌 아밀로이드 혈관병증 (cerebral amyloid angiopathy, CAA), 다운 증후군성 치매, 혈관성 치매, 파킨슨 질환, 루이소체 치매 및 크로이츠펠트-야콥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  11. 키트로서,
    i) 알부민으로 차단된 폴리스티렌 표면; 및
    ii) 아포지질단백질 또는 이의 이소형에 특이적인 항체를 포함하는,
    제1항 또는 제2항의 방법에 따른 아포지질단백질 apoE의 검출 및/또는 정량화를 위한 시험관내 사용을 위한 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 키트는 상기 아포지질단백질의 모든 이소형에 결합할 수 있는 제2 항체를 더 포함하는, 키트.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 알부민이 소 혈청 알부민 (BSA)인, 키트.
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