KR102601550B1

KR102601550B1 - 항-cd38 항체 및 서바이빈 억제제를 사용한 헴 악성종양에 대한 병용 요법

Info

Publication number: KR102601550B1
Application number: KR1020187001610A
Authority: KR
Inventors: 파룰 도시; 헨크 엠. 로크포어스트; 투나 무티스
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2015-06-22
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2036-06-22
Also published as: CR20170587A; HK1250666A1; CO2017013331A2; HK1250928A1; JP6816038B2; WO2016209921A1; AU2016282674A1; MX391068B; IL256242B1; CN107708734B; PH12017502342A1; PE20181323A1; EP3310386B1; EP3310386A1; NZ777133A; JP2018522857A; EA036789B1; UA125115C2; EP3310386A4; PH12017502342B1

Abstract

본 발명은 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 사용한 헴 악성종양에 대한 병용 요법에 관한 것이다.

Description

항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 사용한 헴 악성종양에 대한 병용 요법

본 발명은 헴(heme) 악성종양에 대한 병용 치료에 관한 것이다.

다발성 골수종(MM)은 증식 지수가 낮고 수명이 연장된 골수에서의 분비성 혈장 세포의 잠재된 축적을 특징으로 하는 B 세포 악성종양이다. 질환은 궁극적으로 뼈와 골수를 공격하여, 골격계 전체에 걸쳐 많은 종양과 병변을 일으킨다. 모든 암의 약 1% 및 모든 혈액 악성종양의 10%를 약간 넘는 정도가 MM에 기인할 수 있다. MM의 발병률은 노령화 인구에서 증가하며, 진단 당시 중위 연령은 약 61세이다.

현재 이용가능한 MM의 요법에는 화학요법, 줄기 세포 이식, 탈로미드(THALOMID)® (탈리도마이드(thalidomide)), 레블리미드(REVLIMID)® (레날리도마이드(lenalidomide)), 포말리스트(POMALYST)® (포말리도마이드(pomalidomide)), 벨케이드(VELCADE)® (보르테조밉(bortezomib)), 키프롤리스(KYPROLIS)® (카필조밉(carfilzomib)), 파리닥(FARYDAK)® (파노비노스타트(panobinostat)), 아레디아(AREDIA)® (파미드로네이트(pamidronate)) 및 조메타(ZOMETA)® (졸레드론산(zoledronic acid))이 포함된다. 빈크리스틴(vincristine), BCNU, 멜팔란(melphalan), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 아드리아마이신(adriamycin) 및 프레드니손(prednisone) 또는 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 화학요법제의 병용을 포함하는 현재의 치료 프로토콜은 단지 약 5%의 완전 관해율을 생성하며, 중위 생존기간은 진단 시점으로부터 약 36 내지 48개월이다. 고용량 화학요법에 이어서 자가 골수 또는 말초 혈액 단핵 세포 이식을 사용하는 최근의 발전은 완전 관해율과 관해 기간을 증가시켰다. 그럼에도 불구하고, 전체 생존기간은 약간만 연장되었고, 치료에 대한 증거는 아직 없다. 결국, 인터페론-알파(IFN-α)를 단독으로 또는 스테로이드와 병용하여 사용하는 요법을 유지하는 경우에도 모든 MM 환자가 재발한다.

MM에 대한 이용가능한 약물 치료 요법의 효능은 최대 90%의 환자에서의 약물 내성 발달 및 낮은 세포 증식 속도에 의해 제한된다. 염색체 전좌, 암유전자 돌연변이, 항-아포토시스 및 생존 경로와 같은 이상조절된 신호전달 경로 및 골수 니치(niche)는 MM에서 약물 내성에 기여하는 것으로 보여진다(검토를 위해, 문헌[Abdi et al., Oncotarget 4:2186-2207, 2013]을 참조한다). 골수(BM) 니치는 악성 혈장 세포의 증식, 생존, 분화, 이동 및 약물 내성에 관련되어 있다(문헌[Manier et al., J Biomed Biotechnol 2012; published online 2012 October 3, doi:_10.1155/_2012/_157496]).

II형 막관통 당단백질인 CD38은 다발성 골수종을 포함하는 다양한 헴 악성종양에 대한 항체 치료제에 매력적인 표적이다. 항-CD38 항체가, 예를 들어, 국제 특허 출원 WO2008/037257호, 국제 특허 출원 WO2008/047242호 및 국제 특허 출원 WO2007/042309호에 기재되어 있으며, 다발성 골수종 및 다른 헴 악성종양에서 이들의 효능에 대한 임상 실험에서 평가되고 있는 중이다.

본 발명은 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 CD38-양성 혈액학적 악성종양의 치료를 필요로 하는 대상에게 CD38-양성 혈액학적 악성종양을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는 CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

도 1a. 골수 기질 세포(BMSC)는 MM 세포주에서 항-CD38 항체 다라투무맙(daratumumab)에 의해 유도된 ADCC에 의한 다발성 골수종(MM) 세포 사멸에 대한 보호를 매개한다. 루시페라제 형질도입된 CD38⁺ UM9 MM 세포를 건강한 공여자 BMSC(HD-BMSC)의 존재 또는 부재 하에 16시간 동안 배양한 후, 30:1의 PBMC:MM 세포비로 일련의 농도의 다라투무맙 및 HD-PBMC와 인큐베이션하였다. MM 세포 생존율을 생물발광 이미징(BLI)에 의해 4시간 후에 측정하였다. 다라투무맙이 없는 세포 생존율에 비례하여 ADCC 백분율(%)을 계산하였다. 오차 막대는 3회 측정의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. BMSC가 있거나 없는 배양물 사이에 차이를 독립표본 t 검정(unpaired t test)를 사용하여 시험하였다. *= p<0.05.
도 1b. 골수 기질 세포(BMSC)는 MM 세포주에서 항-CD38 항체 다라투무맙에 의해 유도된 ADCC에 의한 다발성 골수종(MM) 세포 사멸에 대한 보호를 매개한다. 루시페라제 형질도입된 CD38⁺ RPMI8226 MM 세포를 HD-BMSC의 존재 또는 부재 하에 16시간 동안 배양한 후, 30:1의 PBMC:MM 세포비로 일련의 농도의 다라투무맙 및 HD-PBMC와 인큐베이션하였다. MM 세포 생존율을 BLI에 의해 4시간 후에 측정하였다. 다라투무맙이 없는 세포 생존율에 비례하여 ADCC %를 계산하였다. 오차 막대는 3회 측정의 SEM을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. BMSC가 있거나 없는 배양물 사이에 차이를 독립표본 t 검정을 사용하여 시험하였다. *= p<0.05.
도 2a. BMSC는 1차 MM 환자 샘플에서 항-CD38 항체 다라투무맙에 의해 유도된 ADCC에 의한 MM 세포 사멸에 대한 보호를 매개한다. 자가 골수 기질 세포의 존재(흰색 막대) 또는 부재(검은색 막대) 하에 MM 환자 1로부터 얻은 모든 골수 흡인물을 배양한 후, 지시된 농도의 다라투무맙으로 처리하였다. 흡인물에 존재하는 자가 세포를 이펙터 세포로 사용하였다. BM-MNC가 이펙터 세포로 NK 세포를 이미 함유하고 있기 때문에, 추가의 이펙터 세포를 첨가하지 않았다. 배양물에서 CD138⁺ MM 세포의 생존율을 유세포 분석법에 의해 24시간 후에 측정하였다. 오차 막대는 3회 측정의 SEM을 나타낸다. BMSC가 있거나 없는 배양물 사이에 차이를 독립표본 t 검정을 사용하여 시험하였다. *= p<0.05. 상부 패널: 환자 #1, 하부 패널; 환자 #2. BMSC: 골수 기질 세포. ADCC: 항체 의존성 세포 독성.
도 2b. BMSC는 1차 MM 환자 샘플에서 항-CD38 항체 다라투무맙에 의해 유도된 ADCC에 의한 MM 세포 사멸에 대한 보호를 매개한다. 자가 골수 기질 세포의 존재(흰색 막대) 또는 부재(검은색 막대) 하에 MM 환자 2로부터 얻은 모든 골수 흡인물을 배양한 후, 지시된 농도의 다라투무맙으로 처리하였다. 흡인물에 존재하는 자가 세포를 이펙터 세포로 사용하였다. BM-MNC가 이펙터 세포로서 NK 세포를 이미 함유하고 있기 때문에, 추가의 이펙터 세포를 첨가하지 않았다. 배양물에서 CD138⁺ MM 세포의 생존율을 유세포 분석법에 의해 24시간 후에 측정하였다. 오차 막대는 3회 측정의 SEM을 나타낸다. BMSC가 있거나 없는 배양물 사이에 차이를 독립표본 t 검정을 사용하여 시험하였다. *= p<0.05. 상부 패널: 환자 #1, 하부 패널; 환자 #2. BMSC: 골수 기질 세포. ADCC: 항체 의존성 세포 독성.
도 3. YM155는 NK 세포 용해를 유도하지 않는다. HD-PBMC 및 환자 골수 단핵 세포(BMMNC)를 지시된 농도의 YM155와 24시간 동안 인큐베이션하였다. 생존 CD3^-CD56⁺ NK 세포의 수를 유세포 분석법에 의해 측정하고, 미처리 샘플을 음성 대조군으로 사용하여 % 용해를 계산하였다.
도 4a. YM155와 병용한 다라투무맙은 기질 세포의 존재 하에 ADCC에 의한 MM 세포 사멸에 상승 효과를 제공한다. HD-BMSC의 존재 또는 부재 하에 루시페라제 형질도입된 RPMI8226 MM 세포를 배양하였다. 다라투무맙 및 YM155를 지시된 농도로 첨가하였다. NK 세포의 공급원으로서 모든 웰에 HD-PBMC를 40:1의 PBMC:MM 비로 첨가하여 ADCC를 유도하였다. RPMI8226 세포 생존율을 BLI에 의해 4시간 후에 측정하였다. % 용해를 어떤 치료도 받지 않은 RPMI8226 세포의 생존에 비례하여 계산하였다. YM155와 다라투무맙의 병용물의 경우, 누적 효과가 부가적이나 상승적이지 않다고 가정하여, 예상 용해값을 다라투무맙 및 YM155 단독 처리로부터 추정하였다. 예상 결과와 관찰 결과 사이의 통계적 차이를 대응표본 t 검정으로 측정하였다. *** =P<0.005, *= P<0.05 DARA: 다라투무맙.
도 4b. YM155와 병용한 다라투무맙은 기질 세포의 존재 하에 ADCC에 의한 1차 MM 세포 사멸에 상승 효과를 제공한다. MM 환자 1의 모든 BM 흡인물을 자가 MM-BMSC의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 다라투무맙 및 YM155를 지시된 농도로 첨가하였다. BM-MNC가 충분한 NK 세포(두 경우 모두 약 30:1의 NK: MM 세포 비로)를 함유하기 때문에, 추가의 이펙터 세포를 첨가하지 않았다. 24시간 후, 유세포 분석법을 통해 각각의 조건에서 생존 CD138⁺ MM 세포를 계수하였다. 동일한 조건에서 배양하였지만 어떤 치료도 받지 않은 BM-MNC에서의 MM 세포의 생존율에 비례하여 % 용해를 계산하였다. 예상 결과와 관찰 결과 사이의 통계적 차이를 대응표본 t 검정으로 측정하였다. *= P<0.05.
도 4c. YM155와 병용한 다라투무맙은 기질 세포의 존재 하에 ADCC에 의한 1차 MM 세포 사멸에 상승 효과를 제공한다. MM 환자 2의 모든 BM 흡인물을 자가 MM-BMSC의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 다라투무맙 및 YM155를 지시된 농도로 첨가하였다. BM-MNC가 충분한 NK 세포(두 경우 모두 약 30:1의 NK: MM 세포 비로)를 함유하기 때문에, 추가의 이펙터 세포를 첨가하지 않았다. 24시간 후, 유세포 분석법을 통해 각각의 조건에서 생존 CD138⁺ MM 세포를 계수하였다. 동일한 조건에서 배양하였지만 어떤 치료도 받지 않은 BM-MNC에서의 MM 세포의 생존율에 비례하여 % 용해를 계산하였다. 예상 결과와 관찰 결과 사이의 통계적 차이를 대응표본 t 검정으로 측정하였다. *= P<0.05.
도 4d. YM155와 병용한 다라투무맙은 기질 세포의 존재 하에 ADCC에 의한 1차 MM 세포 사멸에 상승 효과를 제공한다. 자가 MM-BMSC의 존재 또는 부재 하에 CD138⁺ MM 세포를 함유하는 4명의 MM 환자(환자 1 내지 환자 4에 있어서 각각 45%, 5.5% 10.2%, 21.6%)로부터의 골수 단핵 세포(BM-MNC)를 배양하였다. 다라투무맙(1 ng/ml) 및 YM155의 적절한 준최대(sub maximal) 농도(환자 1 내지 환자 4에 있어서 각각 125, 62, 75 및 50 ng/ml)를 첨가하였다. BM-MNC가 충분한 NK 세포(각각 7.9%, 7.9%, 10.3% 및 9.5%)를 함유하기 때문에, 추가의 이펙터 세포를 첨가하지 않았다. 24시간 후, 유세포 분석법을 통해 각각의 조건에서 생존 CD138⁺ MM 세포를 계수하였다. 동일한 조건에서 배양하였지만 어떤 치료도 받지 않은 BM-MNC에서의 MM 세포의 생존율에 비례하여 % 용해를 계산하였다. 예상 결과와 관찰 결과 사이의 통계적 차이를 대응표본 t 검정으로 측정하였다. *= P<0.05. ns: 유의하지 않음. DARA: 다라투무맙.
도 5. 다라투무맙 및 YM155 병용 요법의 항종양 효과. UM9 세포가 이식된 RAG2^-/-γc^-/-마우스에서 처리군 당 종양 부하 분석 인간 MSC로 코팅되고 루시페라제 형질도입된 MM 세포주 UM9로 로딩된 혼성 스캐폴드를 RAG2^-/-γc^-/-마우스(마우스 당 4개의 스캐폴드)의 등에 피하 이식하였다. 이식 10일 후, 성장하는 종양을 BLI에 의해 가시화하고 정량화하였다. 이어서, 상이한 군의 마우스(n=4)를 비히클 대조군(대조군)으로 처리하거나, 지시된 바와 같이 다라투무맙, YM155 또는 다라투무맙 + YM155로 처리하였다. YM155(또는 이의 비히클인 PBS)를 1 mg/㎏/d YM155의 속도로 10일 동안 피하 주입 펌프로 전달하였다. 대조군의 것들을 포함하는 각각의 마우스는 인간 NK 세포의 공급원으로서 T 세포 고갈된 HD-PBMC(5×10⁶개의 세포)를 투여받아ADCC를 유도하였다. 마우스를 BLI에 의해 매주 모니터링하였다. 결과를 각각의 스캐폴드의 평균 종양 부하로서 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 다라투무맙으로 처리된 마우스와 다라투무맙 + YM155로 처리된 마우스 사이의 통계적 차이를 만-휘트니 U-검정(Mann-Whitney U-test)을 사용하여 계산하였다.
*** P<0.001.

"CD38"은 인간 CD38 단백질(동의어: ADP-리보실 사이클라제 1, cADPr 하이드롤라제 1, 고리형 ADP-리보스 하이드롤라제 1)을 말한다. 인간 CD38은 서열 번호: 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. CD38은 세포질 도메인을 나타내는 아미노산 잔기 1 내지 21, 막관통 도메인을 나타내는 아미노산 잔기 22 내지 42 및 CD38의 세포외 도메인을 나타내는 잔기 43 내지 300을 갖는 단일 관통 II형 막단백질인 것으로 잘 알려져 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되며, 쥣과 단일클론 항체, 인간 단일클론 항체, 인간-적응화(human-adapted) 단일클론 항체, 인간화 단일클론 항체 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체, 항체 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성 또는 다량체성 항체, 및 단일쇄 항체를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다.

면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형(isotype) IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위 분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.

용어 "항체 단편"은 중쇄 및/또는 경쇄 항원 결합 부위, 예컨대 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역)1, 2 및 3, LCDR(경쇄 상보성 결정 영역)1, 2 및 3, 중쇄 가변 영역(VH), 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 보유하는 면역글로불린 분자의 일부분을 말한다. 항체 단편은 VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 경첩(hinge) 부위에서 이황화 결합으로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)₂ 단편; VH 및 CHI 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 도메인 항체(dAb) 단편(문헌[Ward et al., Nature 341:544- 546, 1989])을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 유전자 조작되고(engineered) 합성 링커를 통해 연결되어, 다양한 유형의 단일쇄 항체 설계를 형성할 수 있으며, 여기서 VH/VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 별도의 단일쇄 항체 작제물에 의해 발현되는 경우에 분자간에서 또는 분자내에서 쌍을 이루어서 1가 항원 결합 부위, 예컨대 단일쇄 Fv(scFv) 또는 이중항체(diabody)를 형성한다(예를 들어, 국제 특허 출원 WO1998/44001호, WO1988/01649호, WO1994/13804호 및 WO1992/01047호에 기재되어 있음). 이러한 항체 단편은 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하여 얻어지며, 이러한 단편을 전장(full length) 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝한다.

어구 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 또는 항체 단편을 말한다(예를 들어, CD38에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 인간 CD38 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, CD38에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 인간 CD38의 오르토로그(ortholog), 예컨대 마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis)(원숭이(cynomolgus)) CD38과의 교차-반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

항체 가변 영역은 3개의 "항원 결합 부위"가 개재된 "프레임워크(framework)" 영역으로 이루어진다. 항원 결합 부위는 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDR) - VH에 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL에 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3) -은 서열 가변성에 기초한다(문헌[Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970]; 문헌[Kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]). (ii) "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV" - VH에 3개(H1, H2, H3) 및 VL에 3개(L1, L2, L3) -는 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조 내에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 말한다(문헌[Chothia and Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987]). 다른 용어는 "IMGT-CDR"(문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]) 및 "특이성 결정 잔기 용법(Specificity Determining Residue Usage)"(SDRU)을 포함한다(문헌[Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004]). 인터내셔널 이뮤노진틱스(International ImMunoGeneTics, IMGT) 데이터베이스(http://www_imgt_org)는 항원 결합 부위의 표준화된 넘버링과 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 도해 사이의 관련성이 문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "초티아 잔기"는 알-라지카니(Al-Lazikani)에 따라 넘버링된 항체 VL 및 VH 잔기이다(문헌[Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997]).

"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원 결합 부위인 것으로 정의된 것 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 항원 결합 부위가 전술된 바와 같은 다양한 용어에 의해 정의될 수 있기 때문에, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원 결합 부위가 어떻게 정의되는지에 따라 달라진다.

"인간화 항체"는 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되고 가변 영역 프레임워크가 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 항체를 말한다. 인간화 항체는 프레임워크 영역에서의 치환을 포함할 수 있으므로, 프레임워크는 발현된 인간 면역글로불린 또는 생식세포계열 유전자 서열의 정확한 복사본(copy)이 아닐 수 있다.

"인간 항체"는 프레임워크 및 항원 결합 부위 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 말한다. 이 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 인간 기원의 서열로부터 유래된다.

인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 시스템은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 담지하는 유전자삽입 인간외 동물, 예컨대 마우스를 포함한다. 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 서열과 비교할 때 "인간 항체"는, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 프레임워크 또는 항원 결합 부위에서의 치환의 의도적 도입에 기인하는 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 전형적으로, 인간 항체는 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같이, 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 공통 프레임워크 서열을 함유하거나, 예를 들어 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010] 및 국제 특허 출원 WO2009/085462호에 기재된 바와 같이, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리로 도입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다. 항원 결합 부위가 인간외 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.

단리된 인간화 항체는 합성 항체일 수 있다. 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 인간 항체는, 합성 CDR 및/또는 합성 프레임워크를 도입시킨 파지 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 생성될 수 있거나, 시험관내(in vitro) 돌연변이생성(mutagenesis)으로 항체 특성을 개선하여, 그 결과 생체내(in vivo)에서 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리에는 천연적으로 존재하지 않는 항체를 생성할 수 있다.

"재조합 항체"는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입 또는 염색체도입된(transchromosomal) 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마(hybridoma)(하기에 추가로 기술됨), 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 재조합 조합 항체 라이브러리(recombinant, combinatorial antibody library)로부터 단리된 항체, 및 다른 DNA 서열의 인간 면역글로불린 유전자 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체, 또는 Fab 아암 교환을 사용하여 시험관내에서 생성되는 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 모든 항체를 포함한다.

"단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제조를 말한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프(epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내거나, 이중특이성 단일클론 항체의 경우에는, 2개의 별개의 에피토프에 대해 이중 결합 특이성을 나타낸다. 따라서, "단일클론 항체"는 항체 중쇄로부터 C-말단 라이신의 제거와 같은 가능한 잘 알려진 변경을 제외하고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄에 단일 아미노산 조성을 갖는 항체 집단을 말한다. 단일클론 항체는 항체 집단 내에서 이종성 글리코실화를 가질 수 있다. 단일클론 항체는 단일특이성 또는 다중특이성, 또는 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이중특이성 항체는 용어 단일클론 항체에 포함된다.

"에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 말한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특성뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘(folding)을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다.

"변이체"는 하나 이상의 변형(modification), 예를 들어 치환, 삽입 또는 결실에 의해 기준 폴리펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

"병용하여"는 둘 이상의 치료제가 혼합물 상태로 함께 투여되거나, 단일 제제로서 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 대상에게 투여될 수 있음을 의미한다.

"치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 모두를 말하며, 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 종양 또는 종양 세포의 발생 또는 확산을 예방하거나 둔화(감소)시키는 것이 목적이다. 유익하거나 바람직한 임상 결과에는 검출가능하든 검출 불가능하든 간에, 증상의 완화, 질환 정도의 저하, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 경감 및 관해(remission)(부분적이거나 전체적인), 및 치료를 받지 않을 경우에 예측되는 생존과 비교하여 연장되는 생존이 포함된다. 치료가 필요한 사람은 이미 병태 또는 장애를 가진 사람뿐만 아니라 병태 또는 장애를 갖기 쉬운 사람, 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람을 포함한다.

"치료적 유효량"은 필요한 투여량으로 필요한 기간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는 데 유효한 양을 말한다. 치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 치료제 또는 치료제의 병용물이 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 내성과 관련하여 감소되거나 약화될 수 있는 유효한 치료제 또는 치료제의 병용물의 예시적인 지표에는, 예를 들어 환자의 웰빙의 개선, 종양 부하(tumor burden)의 감소, 종양의 정지성 또는 지연성 성장 및/또는 체내 다른 위치로의 암 세포의 전이의 부재가 포함된다.

"상승효과", "상승작용" 또는 "상승적"은 병용물의 예측된 부가적 효과보다 더 높은 것을 의미한다.

(예를 들어, 종양 세포와 같은 세포 언급시) "성장을 억제한다"는 당업자에게 잘 알려진 적절한 제어 조건에서 성장한 동일한 세포의 성장과 비교하여, 치료제, 또는 치료제 또는 약물의 병용물과 접촉될 때 시험관내에서 또는 생체내에서 세포 성장의 측정가능한 감소를 말한다. 시험관내에서 또는 생체내에서 세포 성장의 억제는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 이상 또는 100%일 수 있다. 세포 성장의 억제는 다양한 기전, 예를 들어, ADCC, 아포토시스(apoptosis), 괴사에 의해, 또는 세포 증식의 억제에 의해 일어날 수 있다.

"대상"에는 인간 또는 인간외 동물이 포함된다. "인간외 동물"에는 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 포유류가 아닌 동물, 예컨대 인간외 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등이 포함된다. 용어 "대상" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "서바이빈"은 서열 번호: 22에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 서바이빈 단백질을 말한다. 서바이빈은 아포토시스 억제제(IAP) 패밀리의 구성원이다. 서바이빈은 아포토시스 억제제 및 세포 주기 조절제로 역할을 하는 이중 기능성 단백질이다. 서바이빈의 과발현은 인간의 악성종양에서 관찰되며, 좋지 않은 예후, 종양 재발 및 치료 내성과 양의 상관관계가 있다(문헌[Liu et al., Cancer Biol. Ther., 7:1053-1060, 2008]; 문헌[Mita et al., Clin Cancer Res., 14:5000-5005, 2008]).

서열 번호: 22

"서바이빈 억제제"는 서바이빈 활성을 억제하거나, 길항하거나, 감소시키거나, 저해하는 분자, 예를 들어, 세포에서 서바이빈의 항-아포토시스 활성을 억제하는 분자를 말한다. 서바이빈 억제제는 서바이빈의 항-아포토시스 활성을 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 100%로 억제할 수 있다. 서바이빈 억제제는 소분자, 펩티드, 백신, 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 RNA 분자일 수 있다.

본 발명은 BM 니치에 위치한 골수 기질 세포(BMSC)가 적어도 부분적으로 서바이빈을 상향 조절함으로써 항체-유도된 ADCC에 대하여 MM 세포를 보호한다는 발견 및 서바이빈 억제제가 MM 세포의 항체-매개 ADCC를 개선하고 BMSC에 의해 유도된 ADCC 내성을 방해한다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. BMSC가 세포 부착-매개 면역 내성을 통해 세포독성 T-림프구(CTL)-의존성 용해로부터 MM 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌고, 서바이빈이 용해-내성 MM 세포에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다(문헌[de Haart et al., Clin Cance Res 19:5591-5601, 2013]).

본 발명은 또한 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 다발성 골수종 세포의 성장 또는 증식의 억제를 필요로 하는 대상에게 다발성 골수종 세포의 성장 또는 증식을 억제하기 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 다발성 골수종 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

"CD38-양성 혈액학적 악성종양"은 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함한, CD38을 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 혈액학적 악성종양을 말한다. 이러한 CD38-양성 혈액학적 악성종양의 예는 전구 B-세포 림프아구성 백혈병/림프종 및 B-세포 비호지킨 림프종; 급성 전골수구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 및 성숙 B-세포 신생물, 예컨대 B-세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B-세포 급성 림프구성 백혈병, B-세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 외투 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL) -저등급, 중간등급 및 고등급 FL을 포함함-, 피부 소포 중심 림프종, 번연부 B-세포 림프종(MALT 유형, 림프절 및 비장 유형), 모발상 세포 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 버킷 림프종(BL), 형질세포종, 다발성 골수종(MM), 형질 세포 백혈병, 이식 후 림프증식성 장애, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 형질 세포 백혈병 및 역형성 대세포 림프종(ALCL)이다.

CD38은 다양한 악성 혈액학적 질환에서 발현되는데, 이러한 질환에는 다발성 골수종, 백혈병 및 림프종, 예컨대 B-세포 만성 림프구성 백혈병, T- 및 B-세포 급성 림프구성 백혈병, 발덴스트롬(Waldenstrom's macroglobulinemia) 거대글로불린혈증, 원발성 전신성 아밀로이드증, 외투-세포 림프종, 전림프구성/골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 여포성 림프종, 버킷 림프종, 대과립 림프구성(LGL) 백혈병, NK-세포 백혈병 및 형질-세포 백혈병이 포함된다. 전립선에서의 선상피(glandular epithelium), 췌장에서의 췌도 세포, 이하선을 포함한 선에서의 도관 상피, 기관지 상피 세포, 고환 및 난소에서의 세포 및 결직장 선암종에서의 종양 상피를 포함한 상이한 기원의 상피/내피 세포 상에서의 CD38의 발현이 기재되어 있다. CD38 발현에 관여할 수 있는 다른 질환에는, 예를 들어, 폐의 기관지-상피암종, 유방암(유방의 도관 및 소엽 안을 덮고 있는 상피의 악성 증식으로부터 발달됨), β-세포로부터 발달된 췌장 종양(인슐린종), 장에서의 상피로부터 발달된 종양(예를 들어, 선암종 및 편평 세포 암종), 전립선에서의 암종 및 고환에서의 고환종 및 난소암이 포함된다. 중추 신경계에서는, 신경아세포종이 CD38을 발현한다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 다발성 골수종(MM), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 버킷 림프종(BL), 여포성 림프종(FL), 외투-세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 MM이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 ALL이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 NHL이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 DLBCL이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 BL이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 FL이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 MCL이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 AML이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 CLL이다.

일부 실시 형태에서, CD38-양성 혈액학적 악성종양은 혈장 세포 질환이다.

일부 실시 형태에서, 혈장 세포 질환은 경쇄 아밀로이드증(AL), 다발성 골수종(MM) 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증이다.

일부 실시 형태에서, 혈장 세포 질환은 AL이다.

일부 실시 형태에서, 혈장 세포 질환은 MM이다.

일부 실시 형태에서, 혈장 세포 질환은 발덴스트롬 거대글로불린혈증이다.

B-세포 비호지킨 림프종의 예는 림프종양 육아종증, 원발성 삼출액 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 종격 거대 B-세포 림프종, 중쇄 질환(γ, μ, 및 a 질환을 포함함), 면역억제제를 사용하는 요법에 의해 유도된 림프종, 예컨대 사이클로스포린-유도 림프종 및 메토트렉세이트-유도 림프종이다.

일 실시 형태에서, CD38을 발현하는 세포와 관련된 장애는 비호지킨 림프종이다.

CD38을 발현하는 세포와 관련된 장애의 다른 예에는 하기를 포함한 성숙 T 세포 및 NK 세포 신생물을 포함한 T 및 NK 세포로부터 유래된 악성종양이 포함된다: T-세포 전림프구성 백혈병, T-세포 대과립 림프구성 백혈병, 공격적 NK 세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/림프종, 림프절외 NK/T 세포 림프종, 비형(nasal type), 78 장병증형(enteropathy-type) T-세포 림프종, 간비장 T-세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T-세포 림프종, 아구성 NK 세포 림프종, 균상 식육종/세자리 증후군(Mycosis Fungoides/Sezary Syndrome), 원발성 피부 CD30 양성 T-세포 림프증식성 장애(원발성 피부 역형성 대세포 림프종 C-ALCL, 림프종양 구진증, 경계 병변), 혈관면역아구성 T-세포 림프종, 상세불명의 말초 T-세포 림프종 및 역형성 대세포 림프종.

골수 세포 유래 악성종양의 예에는 급성 전골수구성 백혈병을 포함하는 급성 골수성 백혈병 및 만성 골수성 백혈병을 포함하는 만성 골수증식성 질환이 포함된다.

임의의 항-CD38 항체가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 항-CD38 항체의 가변 영역은 기존의 항-CD38 항체로부터 얻어지고, 임의로 표준 방법을 사용하여 전장 항체로서 클로닝될 수 있다. 사용될 수 있는 CD38에 결합하는 가변 영역의 예가, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO05/103083호, WO06/125640호, WO07/042309호, WO08/047242호, WO12/092612호, WO06/099875호 및 WO11/154453A1호에 기재되어 있다.

사용될 수 있는 예시적인 항-CD38 항체는 다잘렉스(DARZALEX)™(다라투무맙)이다. 다잘렉스™(다라투무맙)는 각각 서열 번호: 4 및 5에 나타낸 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열, 각각 서열 번호: 6, 7 및 8에 나타낸 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역)1, HCDR2 및 HCDR3 아미노산 서열, 및 각각 서열 번호: 9, 10 및 11에 나타낸 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하고, IgG1/κ 아형을 갖는다. 다잘렉스™(다라투무맙) 중쇄 아미노산 서열을 서열 번호: 12에 나타내고, 경쇄 아미노산 서열을 서열 번호: 13에 나타낸다.

서열 번호: 1

서열 번호: 2

서열 번호: 3

서열 번호: 4

서열 번호: 5

서열 번호: 6

서열 번호: 7

서열 번호: 8

서열 번호: 9

서열 번호: 10

서열 번호: 11

서열 번호: 12

서열 번호: 13

사용될 수 있는 다른 예시적인 항-CD38 항체는 각각 서열 번호: 14 및 15의 VH 및 VL 서열을 포함하는 미국 특허 제7,829,693호에 기재된 mAb003이다.

서열 번호: 14

서열 번호: 15

사용될 수 있는 다른 예시적인 항-CD38 항체는 각각 서열 번호: 16 및 17의 VH 및 VL 서열을 포함하는 미국 특허 제7,829,693호에 기재된 mAb024이다.

서열 번호: 16

서열 번호: 17

사용될 수 있는 다른 예시적인 항-CD38 항체는 각각 서열 번호: 18 및 19의 VH 및 VL 서열을 포함하는 미국 특허 제8,088,896호에 기재된 MOR-202 (MOR-03087)이다.

서열 번호: 18

서열 번호: 19

사용될 수 있는 다른 예시적인 항-CD38 항체는 각각 서열 번호: 20 및 21의 VH 및 VL 서열을 포함하는 미국 특허 제8,153,765호에 기재된 이사툭시맙(isatuximab)이다. 이사툭시맙의 VH 및 VL은 IgG1/κ로 발현될 수 있다.

서열 번호: 20

서열 번호: 21

본 발명의 방법에 사용되는 항-CD38 항체는 또한, 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 드 노보(de novo)로 선택될 수 있으며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 또는 그의 부분들, 예컨대 Fab, 단일쇄 항체(scFv), 또는 쌍을 이루지 않거나 쌍을 이룬 항체 가변 영역들을 발현하도록 조작된다(문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]; 문헌[Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84, 2001]; 문헌[Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996]; 문헌[Sheets et al., PITAS (USA) 95:6157-6162, 1998]; 문헌[Hoogenboom and Winter, J Mol Biol 227:381, 1991]; 문헌[Marks et al., J Mol Biol 222:581, 1991]). CD38 결합 가변 도메인은 문헌[Shi et al (2010) J. Mol . Biol. 397:385-96] 및 국제 특허 출원 WO09/085462호에 기재된 바와 같이 박테리오파지 pIX 외피 단백질과의 융합 단백질로서 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 라이브러리는 인간 CD38 세포외 도메인과의 결합을 스크리닝하고, 얻어진 양성 클론은 추가로 특성화되며, Fab가 클론 용해물로부터 단리된 후, 전장 항체로서 클로닝될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법이 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제5,403,484호; 및 미국 특허 제5,571,698호, 미국 특허 제5,427,908호, 미국 특허 제5, 580,717호, 미국 특허 제5,969,108호, 미국 특허 제6,172,197호, 미국 특허 제5,885,793호; 미국 특허 제6,521,404호; 미국 특허 제6,544,731호; 미국 특허 제6,555,313호; 미국 특허 제6,582,915호 및 미국 특허 제6,593,081호를 참조한다.

본 발명은 또한 서열 번호: 4의 VL 및 서열 번호: 5의 VL을 포함하는 항체와 CD38에 결합하기 위해 경쟁하는 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 CD38-양성 혈액학적 악성종양의 치료를 필요로 하는 대상에게 CD38-양성 혈액학적 악성종양을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는 CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 서열 번호: 4의 VH 및 서열 번호: 5의 VL을 포함하는 항체와 CD38에 결합하기 위해 경쟁하는 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 다발성 골수종을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는 다발성 골수종을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3)에 결합하는 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 CD38-양성 혈액학적 악성종양의 치료를 필요로 하는 대상에게 CD38-양성 혈액학적 악성종양을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는 CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3)에 결합하는 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제를 다발성 골수종의 치료를 필요로 하는 대상에게 다발성 골수종을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는 다발성 골수종을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 각각 서열 번호: 6, 7 및 8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 각각 서열 번호: 9, 10 및 11의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 각각 서열 번호: 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 서열 번호: 4의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 서열 번호: 4의 VH 및 서열 번호: 5의 VL을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 서열 번호: 14의 VH 및 서열 번호: 15의 VL을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 서열 번호: 16의 VH 및 서열 번호: 17의 VL을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 서열 번호: 18의 VH 및 서열 번호: 19의 VL을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 서열 번호: 20의 VH 및 서열 번호: 21의 VL을 포함한다.

항체는 잘 알려진 시험관내 방법을 사용하여 CD38에 결합하기 위한 기준 항체, 예를 들어, 다잘렉스™(서열 번호: 4의 VH 및 서열 번호: 5의 VL을 갖는 다라투무맙)와의 이들의 경쟁에 대해 평가될 수 있다. 예시적인 방법에서는, CD38을 재조합적으로 발현하는 CHO 세포를 표지되지 않은 기준 항체와 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 과량의 형광 표지된 시험 항체와 4 ℃에서 45분 동안 인큐베이션할 수 있다. PBS/BSA에서 세정한 후에, 표준 방법을 사용하여 유세포측정에 의해 형광을 측정할 수 있다. 다른 예시적인 방법에서는, 인간 CD38의 세포외 부분을 ELISA 플레이트의 표면 상에 코팅할 수 있다. 과량의 표지되지 않은 기준 항체를 약 15분 동안 첨가한 후, 비오티닐화 시험 항체를 첨가할 수 있다. PBS/트윈(Tween)에서 세정한 후에, 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합 스트렙타비딘(streptavidin) 및 표준 방법을 사용하여 검출된 신호를 사용하여 비오티닐화 시험 항체의 결합을 검출할 수 있다. 경쟁 검정에서, 기준 항체가 표지되고 시험 항체가 표지되지 않을 수 있음이 매우 명백하다. 시험 항체는, 기준 항체가 시험 항체의 결합을 억제하거나 시험 항체가 기준 항체의 결합을 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 억제할 경우 기준 항체와 경쟁한다. 시험 항체의 에피토프는, 예를 들어 알려진 방법을 사용하여 펩티드 맵핑 또는 수소/중수소 보호 검정에 의해, 또는 결정 구조의 결정에 의해 추가로 규정될 수 있다.

항-CD38 항체는, 항체가 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3 내의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 잔기에 결합하는 경우, 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3)에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 내의 적어도 하나의 아미노산 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3) 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 내의 적어도 2개의 아미노산 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3) 내의 적어도 2개의 아미노산에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 내의 적어도 3개의 아미노산 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3) 내의 적어도 3개의 아미노산에 결합한다.

인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3)에 결합하는 예시적인 항체는 다잘렉스™ (다라투무맙)이다.

인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3)에 결합하는 항체는, 예를 들어, 표준 방법을 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 서열 번호: 2 및 3에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 마우스를 면역화하고 얻은 항체를, 예를 들어 ELISA 또는 돌연변이생성 연구를 사용하여 펩티드에 대한 결합에 대해 특성화함으로써 생성될 수 있다.

항체의 Fc 부분은, 더욱 상세히 후술되는 바와 같이, 항체-의존성 세포-매개성 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)과 같은 항체 이펙터 기능을 매개할 수 있다. 그러한 기능은 식세포작용 또는 용해 활성을 갖는 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 또는 보체 시스템의 성분에 대한 Fc 이펙터 도메인(들)의 결합에 의해 매개될 수 있다. 전형적으로, Fc-결합 세포 또는 보체 성분에 의해 매개된 효과(들)는 표적 세포, 예를 들어 CD38-발현 세포의 억제 및/또는 고갈을 가져온다. 인간 IgG 동종형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4는 이펙터 기능에 대해 차별적인 능력을 나타낸다. ADCC는 IgG1 및 IgG3에 의해 매개될 수 있고, ADCP는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 의해 매개될 수 있고, CDC는 IgG1 및 IgG3에 의해 매개될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 IgG1 동종형을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 IgG2 동종형을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 IgG3 동종형을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 IgG4 동종형을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 항체 의존성 세포성 독성(ADCC), 항체 의존성 세포성 식세포작용(ADCP), 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 아포토시스에 의해 CD38-발현 세포의 사멸을 유도한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 ADCC에 의해 CD38-발현 세포의 사멸을 유도한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 ADCP에 의해 CD38-발현 세포의 사멸을 유도한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 CDC에 의해 CD38-발현 세포의 사멸을 유도한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 아포토시스에 의해 CD38-발현 세포의 사멸을 유도한다.

"항체-의존성 세포성 세포독성", "항체-의존성 세포-매개성 세포독성" 또는 "ADCC"는, 이펙터 세포 상에서 발현되는 Fc 감마 수용체(FcγR)를 통한, 항체-코팅된 표적 세포와 용해 활성을 갖는 이펙터 세포, 예컨대 자연 살해 세포, 단핵구, 대식세포 및 호중구의 상호작용에 의존하는 세포사를 유도하기 위한 기전이다. 예를 들어, NK 세포는 FcγRIIIa를 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIa를 발현한다. 항체-코팅된 표적 세포, 예컨대 CD38-발현 MM 세포의 죽음은 막 세공-형성 단백질 및 프로테아제의 분비를 통한 이펙터 세포 활성의 결과로서 일어난다. 항-CD38 항체의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 항체는 면역 이펙터 세포와 병용한 CD38-발현 세포에 첨가될 수 있으며, 이는 항원 항체 복합체에 의해 활성화되어 표적 세포를 세포용해시킬 수 있다. 세포용해는 용해된 세포로부터의 표지(예를 들어, 방사성 기질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 방출에 의해 탐지될 수 있다. 이러한 검정을 위한 예시적인 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. CD38을 발현하는 다발성 골수종 세포주 또는 1차 MM 세포가 표적 세포로 사용될 수 있다. 예시적인 분석에서, 루시페라제를 발현하도록 유전자 조작된 MM 세포주를 항-CD38 항체와 인큐베이션한다. 새로 단리된 PBMC 이펙터 세포를 40:1의 표적:이펙터 세포 비로 첨가한다. PBMC을 첨가한지 4시간 후, 루시페린을 첨가하여, 결과로서 생성된, 생존 MM 세포로부터 방출된 생물발광 신호를 발광 측정기(스펙트라맥스(SpectraMax), 몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 20분 내에 측정하고, 하기 식: % ADCC = 1 - (PBMC 부재 하에 평균 생물발광 신호 / PBMC의 존재 하에 평균 생물발광 신호) ×100%를 사용하여 MM 세포의 % ADCC를 계산할 수 있다. 항-CD38 항체는 상술한 바와 같은 시험관내 검정에서 % ADCC가 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 100%인 경우 "시험관내 ADCC를 유도한다."

"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 표적-결합된 항체의 Fc 이펙터 도메인이 보체 성분 C1q에 결합하여 이를 활성화하고, 이는 다시 보체 캐스케이드(cascade)를 활성화하여 표적 세포 사멸을 초래하는 세포사 유도 기전을 말한다. 보체의 활성화는 또한 표적 세포 표면 상에의 보체 성분의 침착을 가져올 수 있는데, 이는 백혈구 상의 보체 수용체(예를 들어, CR3)에 결합함으로써 ADCC를 용이하게 한다. 예시적인 분석에서, B-세포 악성종양을 갖는 환자로부터 단리된 1차 BM-MNC 세포는 1시간 동안 0.3-10 ㎍/ml의 농도의 항-CD38 항체 및 보체 유래의 10% 혼주 인간 혈청으로 처리될 수 있으며, 1차 CD138+ MM 세포의 생존이 문헌[van der Veer et al., Haematologica 96:284-290, 2011]; 문헌[van der Veer et al., Blood Cancer J 1(10):e41, 2011]에 기재된 기술을 사용하는 유세포 분석법으로 측정될 수 있다. MM 세포 용해의 백분율은 본 명세서에 기재된 바와 같은 동종형 대조군에 대하여 측정될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항-CD38 항체는 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 CDC를 유도할 수 있다.

"항체 의존성 세포 식세포작용"("ADCP")은 식세포, 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포에 의한 내재화에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 제거의 기전을 말한다. ADCP는, 이펙터 세포로서 단핵구-유래 대식세포를, 그리고 GFP 또는 다른 표지된 분자를 발현하도록 조작된 표적 세포로서 다우디 세포(ATCC^® CCL-213™) 또는 CD38을 발현하는 B 세포 백혈병 또는 림프종 종양 세포를 사용함으로써 평가될 수 있다. 이펙터:표적 세포 비는, 예를 들어 4:1일 수 있다. 이펙터 세포는 항-CD38 항체 있거나 없이 4시간 동안 표적 세포와 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 후에, 세포는 아큐타제를 사용하여 탈착될 수 있다. 대식세포는 형광 표지에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체로 확인될 수 있으며, % 식세포작용은 표준 방법을 사용하여 CD11⁺CD14⁺ 대식세포에서의 % GFP 형광에 기초하여 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 항-CD38 항체는 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 ADCP를 유도할 수 있다.

항-CD38 항체에 의해 유도되는 ADCC는 항체 Fc내에서의 소정의 치환에 의해 향상될 수 있다. 예시적인 치환은, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호에 기재된 바와 같은 아미노산 위치 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430에서의 치환이다(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름).

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 항체 Fc 내의 아미노산 치환을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 항체 Fc 내의 아미노산 위치 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430에서의 치환을 포함한다(잔기 넘버링은 EU 인덱스에 따름).

항-CD38 항체에 의해 유도된 ADCC는 또한 항체 올리고당 성분을 유전자 조작함으로써 향상될 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 바이안테나리(biantennary) G0, G0F, G1, G1F, G2 또는 G2F 형태의 글리칸의 대부분에 의해 Asn297에서 N-글리코실화된다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 전형적으로 약 85% 이상의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 바이안테나리 복합형(complex-type) 올리고당으로부터의 코어(core) 푸코스의 제거는, 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서, 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 이러한 변형된 항체는 바이안테나리 복합형의 Fc 올리고당을 담지하는 비교적 고도로 탈푸코실화된 항체의 성공적인 발현으로 이어지는 것으로 보고된 상이한 방법들을 사용하여 달성될 수 있는데, 이러한 방법에는, 예컨대 다음과 같은 것이 있다: 배양물 오스몰랄 농도(osmolality)의 제어(문헌[Konno et al., Cytotechnology 64:249-65, 2012]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 Lec13의 적용(문헌[Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 EB66의 적용(문헌[Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; Epub ahead of print; PMID:20562582]), 숙주 세포주로서의 래트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용(문헌[Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003]), 특이적으로 α 1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자에 대한 짧은 간섭(small interfering) RNA의 도입(문헌[Mori et al., Biotechnol Bioeng88:901-908, 2004]), 또는 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III과 골지(Golgi) α-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 억제제인 키푸넨신(kifunensine)의 공발현(문헌[Ferrara et al., J Biol Chem281:5032-5036, 2006], 문헌[Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006]; 문헌[Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008]).

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 푸코스 함량이 약 0% 내지 약 15%, 예를 들어, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%인 바이안테나리 글리칸 구조를 갖는다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 푸코스 함량이 약 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11% 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0%인 바이안테나리 글리칸 구조를 갖는다.

Fc 내의 치환 및 감소된 푸코스 함량은 항-CD38 항체의 ADCC 활성을 향상시킬 수 있다.

"푸코스 함량"은 Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코스 단당의 양을 의미한다. 푸코스의 상대량은 모든 당구조(glycostructure)에 대한 푸코스-함유 구조의 백분율이다. 이들은, 예를 들어 하기와 같은 다수의 방법에 의해 특성화 및 정량화될 수 있다: 1) 국제 특허 출원 공개 WO2008/077546 2호에 기재된 바와 같이 N-글리코시다제 F 처리된 샘플(예를 들어, 복합, 혼성 및 올리고- 및 고-만노스 구조)의 MALDI-TOF를 사용하는 방법; 2) Asn297 글리칸의 효소적 방출을 행하고, 이어서, 유도체화하고, 형광 검출/정량화를 사용하는 HPLC (UPLC) 및/또는 HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 검출; 3) 엔도(Endo) S, 또는 제1 GlcNAc 단당과 제2 GlcNAc 단당 사이를 절단하여 푸코스가 제1 GlcNAc에 부착된 상태로 남겨 두는 다른 효소로 Asn297 글리칸을 처리하거나 처리하지 않고서, 천연 또는 환원된 mAb의 온전한 단백질을 분석하는 방법; 4) 효소적 분해(예를 들어, 트립신 또는 엔도펩티다제 Lys-C)에 의해 항체를 구성 펩티드들로 효소분해한 후, HPLC-MS(UPLC-MS)에 의해 분리, 검출 및 정량화하는 방법; 5) Asn297에서의 PNGase F에 의한 특이적인 효소적 탈글리코실화에 의해 항체 단백질로부터 항체 올리고당을 분리하는 방법. 이렇게 방출된 올리고당은 형광단으로 표지되고, 하기를 가능하게 하는 다양한 상보적 기법에 의해 분리 및 확인될 수 있다: 실험 질량과 이론 질량의 비교에 의한 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 질량 분석에 의한 글리칸 구조의 미세한 특성화, 이온 교환 HPLC(글리코셉(GlycoSep) C)에 의한 시알릴화도(degree of sialylation)의 결정, 순상 HPLC(글리코셉 N)에 의한 친수성 기준에 따른 올리고당 형태의 분리 및 정량화, 및 고성능 모세관 전기영동-레이저 유도 형광(high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence, HPCE-LIF)에 의한 올리고당의 분리 및 정량화.

본 출원에 사용되는 바와 같은 "저 푸코스" 또는 "저 푸코스 함량"은 푸코스 함량이 약 0% 내지 15%인 항체를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정상 푸코스" 또는 "정상 푸코스 함량"은 푸코스 함량이 약 50% 초과, 전형적으로 약 80% 초과 또는 85% 초과인 항체를 말한다.

서열 번호: 12의 중쇄 및 서열 번호: 13의 경쇄를 포함하는 항체와 실질적으로 동일한 항체가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 비교되는 2개의 항체 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열이 동일하거나 또는 "미미한(insubstantial) 차이"를 갖는 것을 의미한다. 미미한 차이는, 항체 특성에 불리한 영향을 주지 않는, 항체 중쇄 또는 경쇄 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산의 치환이다. % 동일성은, 예를 들어 벡터(Vector) NTI v.9.0.0의 얼라인엑스(AlignX) 모듈(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠(Invitrogen))의 기본 설정을 사용하여 쌍별 정렬(pairwise alignment)에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 단백질 서열을 질의 서열(query sequence)로 사용하여, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스 또는 특허 데이터베이스에 대한 검색을 수행할 수 있다. 그러한 검색을 수행하기 위해 사용되는 예시적인 프로그램은, 기본 설정을 사용하는 XBLAST 또는 BLASTP 프로그램(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), 또는 게놈퀘스트(GenomeQuest)™(미국 매사추세츠주 웨스트보로우 소재의 게놈퀘스트) 스위트(suite)이다. 본 발명의 방법에 사용되는 항-CD38 항체에 대해 이루어질 수 있는 예시적인 치환은, 예를 들어 유사한 전하, 소수성, 또는 입체화학 특성을 갖는 아미노산으로의 보존적 치환이다. 보존적 치환은 또한 항체 특성, 예를 들어 안정성 또는 친화성을 개선하거나, 항체 이펙터 기능을 개선하도록 이루어질 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산 치환이, 예를 들어 항-CD38 항체의 중쇄 또는 경쇄에 대해 이루어질 수 있다. 더욱이, 중쇄 또는 경쇄 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성(alanine scanning mutagenesis)에 대해 이전에 기재된 바와 같다(문헌[MacLennan et al., Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67, 1998]; 문헌[Sasaki et al., Adv Biophys 35:1-24, 1998]). 원하는 아미노산 치환은 이러한 치환이 요구되는 때에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, PCR 돌연변이생성에 의해 아미노산 치환을 할 수 있다(미국 특허 제4,683,195호). 변이체의 라이브러리를, 예를 들어, 무작위(NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어, DVK 코돈 -이는 11개의 아미노산(Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 암호화함- 을 사용하는 잘 알려진 방법을 사용하고, 원하는 특성을 갖는 변이체에 대한 라이브러리를 스크리닝하여 생성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, CD38에 대한 생성된 변이체의 결합 및 ADCC를 유도하는 이들의 능력에 대해 시험할 수 있다.

"보존적 변형"은 그 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 상당한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 말한다. 보존적 변형에는 아미노산 치환, 첨가 및 결실이 포함된다. 보존적 치환은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것들이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 잘 정의되어 있으며, 이는 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판), 방향족 측쇄(예를 들어, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 티로신), 지방족 측쇄(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌), 아미드(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 황-함유 측쇄(시스테인, 메티오닌)를 갖는 아미노산을 포함한다. 더욱이, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있는데, 이는 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 대해 이전에 기재된 바와 같다(문헌[MacLennan et al., (1988) Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67]; 문헌[Sasaki et al., (1988) Adv Biophys 35:1-24]) 본 발명의 항체에 대한 아미노산 치환은 알려진 방법, 예를 들어 PCR 돌연변이생성(미국 특허 제 4,683,195호)에 의해 만들어질 수 있다. 대안적으로, 변이체의 라이브러리를, 예를 들어, 무작위(NNK) 또는 비무작위 코돈, 예를 들어 11개의 아미노산(Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp)을 암호화하는 DVK 코돈을 사용하여 생성할 수 있다. 결과로서 생성된 항체 변이체를 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 이들의 특성에 대해 시험할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 다양한 친화도(K_D)로 인간 CD38에 결합할 수 있다. 일 실시 형태에서, 항-CD38 항체는, 당업자에 의해 실시되는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 또는 킨엑사(Kinexa) 방법에 의해 결정될 때, 약 1×10^-8 M 이하, 예를 들어 5×10^-9 M, 1×10^-9M, 5×10^-10M, 1×10^-10M, 5×10^-11M, 1×10^-11M, 5×10^-12M, 1×10^-12M, 5×10^-13M, 1×10^-13 M, 5×10^-14M, 1×10^-14 M 또는 5×10^-15M, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 K_D로 CD38에 결합한다. 예시적인 친화도는 1×10^-8 M 이하이다. 다른 예시적인 친화도는 1×10^-9 M 이하이다.

킨엑사 기기, ELISA 또는 경쟁적 결합 분석이 당업자에게 알려져 있다. 특정 항체/ CD38 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 오스몰 농도, pH) 하에서 측정된다면 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 결합 파라미터(예를 들어, K_D, K_on, K_off)의 측정은 전형적으로 표준화된 조건 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 실행된다. 예를 들어, 바이아코어 3000 또는 프로테온을 사용하는 친화도 측정에 대한 내부 오차(표준 편차, SD로서 측정됨)는 전형적인 검출 한계 내에서의 측정에 대해 전형적으로 5 내지 33% 이내일 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, K_D와 관련하여 용어 "약"은 이 검정에서의 전형적인 표준 편차를 반영한다. 예를 들어, 1×10^-9 M의 K_D에 대한 전형적인 SD는 최대 ±0.33×10^-9M이다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 이중특이성 항체이다. 기존의 항-CD38 항체의 VL 및/또는 VH 영역 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 드 노보로 확인된 VL 및 VH 영역은 이중특이성 전장 항체 내로 조작될 수 있다. 이러한 이중특이성 항체는 미국 특허 제 7,695,936호; 국제 특허 출원 공개 WO04/111233호; 미국 특허 출원 공개 US2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 US2007/0287170호; 국제 특허 출원 공개 WO2008/119353호; 미국 특허 출원 공개 US2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 US2010/0286374호; 미국 특허 출원 공개 US2011/0123532호; 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호; 국제 특허 출원 공개 WO2011/143545호; 또는 미국 특허 출원 공개 US2012/0149876호에 기재된 것들과 같은 기술을 사용하여 항체 Fc 내의 CH3 상호작용을 조절하여 이중특이성 항체를 형성함으로써 제조될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 이중특이성 항체는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모(parent) 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 이러한 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체(예를 들어, 항-CD38 항체) 및 제2 단일특이성 2가 항체는 유전자 조작되어 CH3 도메인에서 이종이량체 안정성을 촉진하는 소정의 치환을 가지며; 이러한 항체를 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화 결합 이성질화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에서 함께 인큐베이션함으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.

이중특이성 항체의 제1 중쇄에 그리고 제2 중쇄에 사용될 수 있는 예시적인 CH3 돌연변이는 K409R 및/또는 F405L이다.

본 발명의 항체의 VL 및/또는 VH 영역이 도입될 수 있는 추가의 이중특이성 구조는, 예를 들어 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD)(국제 특허 출원 공개 WO2009/134776호), 또는 상이한 특이성을 갖는 2개의 항체 아암을 연결시키기 위한 다양한 이량화 도메인, 예컨대 류신 지퍼 또는 콜라겐 이량화 도메인을 포함하는 구조(국제 특허 출원 공개 WO2012/022811호, 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 제6,833,441호)이다. DVD는 구조 VH1-링커-VH2-CH를 갖는 중쇄 및 구조 VL1-링커-VL2-CL을 갖는 경쇄를 포함하는 전장 항체이며; 링커는 선택적이다.

일부 실시 형태에서, 항-CD38 항체는 독소에 접합된다. 접합 방법 및 적합한 독소는 잘 알려져 있다.

일부 실시 형태에서, MM을 갖는 대상은 CD16의 위치 158에서 페닐알라닌에 대해 동형접합성(FcγRIIIa-158F/F 유전자형)이거나, 또는 CD16의 위치 158에서 발린 및 페닐알라닌에 대해 이형접합성(FcγRIIIa-158F/V 유전자형)이다. CD16은 또한 Fc 감마 수용체 IIIa(FcγRIIIa) 또는 저친화도 면역글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III-A 동형(isoform)으로 알려져 있다. FcγRIIIa 단백질 잔기 위치 158에서의 발린/페닐알라닌(V/F) 다형성(polymorphism)은 인간 IgG에 대한 FcγRIIIa 친화도에 영향을 주는 것으로 밝혀져 있다. FcγRIIIa-158F/F 또는 FcγRIIIa-158F/V 다형성을 갖는 수용체는 FcγRIIIa-158V/V와 비교할 때 감소된 Fc 관여 및 이에 따른 감소된 ADCC를 보여준다. 인간 N-연결된 올리고당 상의 결여된 또는 낮은 양의 푸코스는 인간 FcγRIIIa(CD16)에 대한 항체의 개선된 결합으로 인해 ADCC를 유도하는 항체의 능력을 개선한다(문헌[Shields et al., J Biol Chem 277:26733-40, 2002]). 환자는 일상적인 방법을 사용하여 이의 FcγRIIIa 다형성에 대해 분석될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 서바이빈 억제제는 소분자이다.

일부 실시 형태에서, 서바이빈 억제제는 폴리뉴클레오티드이다.

서바이빈 억제제는 임의의 기전, 예컨대 서바이빈 유전자 전사 또는 단백질 발현을 억제하거나, 서바이빈 단백질 이량체화를 억제하거나, 불안정화를 높이거나, 이의 분해를 유도하는 등에 의해 서바이빈-유도된 아포토시스를 억제할 수 있다.

예시적인 서바이빈 소분자 억제제는 YM155이다. YM155는 서바이빈 프로모터에 결합하여 이의 전사를 억제한다. 다른 예시적인 서바이빈 소분자 억제제는, 예를 들어, 미국 특허 제6,608,108호에 기재된 바와 같은 노르다이하이드로구아이아레트산 유도체 및 미국 특허 출원 공개 US2012/0122910호에 기재된 분자이다. 다른 서바이빈 폴리뉴클레오티드 억제제가, 예를 들어, 미국 특허 제6,838,283호, 국제 특허 출원 WO01/057059호, WO09/114476호 및 WO09/044793호에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드 억제제는 마이크로RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 대립유전자 특이적 올리고(ASO) 및 본 기술 분야에 알려진 다른 폴리뉴클레오티드 억제제를 포함한다.

투여/약제학적 조성물

본 발명의 방법에서, 항-CD38 항체는 항-CD38 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 적합한 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 담체는 항-CD38 항체와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클일 수 있다. 이러한 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 종래의 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 분자 또는 항체의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 약 1 중량% 이상까지, 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.

본 발명의 방법에서의 항-CD38 항체의 투여 방식은 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐, 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장) 또는 당업자에 의해 이해되는 다른 수단과 같은 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다.

본 발명의 방법에서 항-CD38 항체는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내(IV) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 환자에게 투여될 수 있다. IV 주입은, 예를 들어 15, 30, 60, 90, 120, 180, 또는 240분, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간에 걸쳐 제공될 수 있다.

CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 환자에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하고("치료적 유효량"), 때때로 0.005 mg 내지 약 100 mg/㎏, 예를 들어 약 0.05 mg 내지 약 30 mg/㎏ 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg/㎏, 또는 약 4 mg/㎏, 약 8 mg/㎏, 약 16 mg/㎏ 또는 약 24 mg/㎏, 또는, 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 높을 수 있으며, 예를 들어 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏일 수 있다.

고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적에 기초해서, 예를 들어 500, 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m²일 수 있다. MM을 치료하기 위해 통상 1 내지 8회(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 또는 그 이상의 용량이 제공될 수 있다.

본 발명의 방법에서의 항-CD38 항체의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서의 항-CD38 항체는 정맥내 주입에 의해 8주 동안 매주 간격으로 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 추가 16주 동안 2주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여된 후, 4주마다 8 mg/㎏으로 또는 16 mg/㎏으로 투여될 수 있다.

항-CD38 항체는 본 발명의 방법에서, 유지 요법에 의해, 예컨대 6개월 이상의 기간 동안 주 1회 투여될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법에서의 항-CD38 항체는 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40일 중 적어도 하나에 대해, 또는 대안적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 중 적어도 하나에 대해, 24, 12, 8, 6, 4 또는 2시간마다, 또는 이들의 임의의 조합으로, 단회 또는 분할 용량을 사용하여, 1일 약 0.1 내지 100 mg/kg, 예컨대 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg, 또는 이들의 임의의 조합의 투여량으로 제공될 수 있다.

본 발명의 방법에서의 항-CD38 항체는 또한 암 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 암 진행에서의 사건의 발생의 개시를 지연시키고/시키거나, 암이 관해기에 있을 때 재발 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다. 이는 다른 생물학적 인자들로 인해 존재하는 것으로 알려진 종양의 위치를 찾는 것이 어려운 환자에서 특히 유용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 항-CD38 항체는 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 잘 알려진 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 항-CD38 항체는 서바이빈 억제제와 병용하여 투여된다.

본 발명의 방법에서, 항-CD38 항체는 서바이빈 억제제 YM155와 병용하여 투여된다.

본 발명의 방법에서 사용되는 YM155는 국제 간행물 국제 특허 출원 WO01/60803호 및 WO2004/092160호에 개시된 바와 같은 제조 방법에 따라 용이하게 이용가능하다.

YM155는 경구 또는 비경구, 또는 정맥내 투여될 수 있다. 이런 이유로, 정맥내 투여용 주사 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 함유하는 것들을 포함한다. 수성 용매에는, 예를 들어, 주사용 증류수 및 생리학적 염수가 포함된다. 비수성 용매에는, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 알코올, 예컨대 에탄올, 폴리소르베이트 80 등이 포함된다. 이러한 조성물은 추가로 장성 조절제(tonicity adjusting agent), 소독제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제 및 가용화제를 함유할 수 있다. 이들은, 예를 들어, 박테리아 필터를 통한 여과, 살균제의 블렌딩 또는 조사에 의해 멸균될 수 있다. 대안적으로, 무균 고체 조성물을 제조하고, 이를 사용하기 바로 전에 멸균수 또는 멸균 용매에서 용해하거나 현탁시키는 것이 가능하다.

정맥내 투여에서, YM155는, 예를 들어, 0.1 내지 20 mg/m²/일로, 예컨대 1 내지 10 mg/m²/일로, 1일 1회 또는 복수 용량으로 나누어, 또는 주입(연속 주입)에 의해 연속적으로 투여될 수 있다. YM155는 3 내지 10 mg/m²/일로 4일 내지 20일, 예를 들어 4일 내지 14일, 또는 5일, 7일, 10일 또는 14일 동안 및/또는 7일 동안 연속적으로 주입될 수 있다. 투여가 추가로 계속되는 경우, 상기 약물 투여 기간의 종료 후 1 일 내지 2개월, 7일 내지 21일 또는 14일의 휴약 기간을 포함하는 약물 주기를 사용할 수 있다. 대안적으로, YM155는 3 내지 8 mg/m²/일의 용량으로 7일 동안 연속적으로 주입에 의해 투여된 후, 14일의 휴약 기간을 가질 수 있다; 이러한 주기를 하나의 주기로 하여 조건에 따라 반복한다. 투여 빈도, 투여량, 주입 시간, 약물 주기 등을 항암제의 종류, 환자의 상태, 연령, 성별 등을 고려한 각각의 경우에 따라 적절히 결정할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 항-CD38 항체와 서바이빈 억제제의 병용물은 임의의 편리한 기간(timeframe)에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제는 같은 날 환자에게 투여될 수 있다. 그러나, 항-CD38 항체 및 서바이빈은 또한 하루씩 교대로, 또는 1주씩 또는 1개월씩 교대로 등으로 투여될 수 있다. 일부 방법에서, 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제는 치료되고 있는 환자에서 이들이 검출가능한 수준으로(예를 들어, 혈청 중에) 동시에 존재하기에 충분한 시간 근접성을 두고서 투여될 수 있다. 일부 방법에서, 일정 기간에 걸쳐 다회의 용량들로 이루어진 항-CD38 항체에 의한 전체 치료 과정 이후에 또는 이전에는 다회의 용량들로 이루어진 서바이빈 억제제에 의한 치료 과정을 수행한다. 항-CD38 항체와 서바이빈 억제제의 투여 사이에 1일, 2일 또는 수 일 또는 1주 2주 또는 수 주의 회복 기간을 사용할 수 있다.

서바이빈 억제제와 병용한 항-CD38 항체는 외부 빔 조사, 세기 변조 방사선 치료(IMRT) 및 임의의 형태의 방사선 수술 - 감마 나이프(Gamma Knife), 사이버나이프(Cyberknife), 리낙(Linac), 및 조직내 방사(interstitial radiation)(예를 들어, 이식된 방사성 시드, 글리아사이트 벌룬(GliaSite balloon))를 포함함 - 을 포함하는 임의의 형태의 방사선 요법과 함께 및/또는 수술과 함께 투여될 수 있다.

CD38에 특이적으로 결합하는 항체 및 히알루로니다아제를 포함하는 약제학적 조성물의 피하 투여

항-CD38 항체는 항-CD38 항체 및 히알루로니다아제를 포함하는 약제학적 조성물로서 피하 투여될 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물 중 항-CD38 항체의 농도는 약 20 mg/ml일 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,200 mg 내지 1,800 mg의 항-CD38 항체를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,200 mg의 항-CD38 항체를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,600 mg의 항-CD38 항체를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,800 mg의 항-CD38 항체를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 30,000 U 내지 45,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,200 mg의 항-CD38 항체 및 약 30,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,800 mg의 항-CD38 항체 및 약 45,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,600 mg의 항-CD38 항체 및 약 30,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 약 1,600 mg의 항-CD38 항체 및 약 45,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다.

피하 투여되는 약제학적 조성물은 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 갖는 히알루로니다아제 rHuPH20를 포함할 수 있다.

rHuPH20은 재조합 히알루로니다아제(하일레넥스(HYLENEX)® 재조합)이고, 국제 특허 출원 공개 WO2004/078140호에 기재되어 있다.

히알루로니다아제는 히알루론산(EC 3.2.1.35)을 분해하고, 세포외 기질에서 히알루론산의 점도를 낮추어 조직 투과성을 증가시키는 효소이다.

서열 번호: 23

항-CD38 항체 및 히알루로니다아제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 항-CD38 항체 및 히알루로니다아제를 포함하는 약제학적 조성물은 8주 동안 매주, 이어서 16주 동안 2주마다, 이어서 4주마다 투여될 수 있다. 투여될 약제학적 조성물은 약 1,200 mg의 항-CD38 항체 및 약 30,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있는데, 여기서 약제학적 조성물 중 CD38에 특이적으로 결합하는 항체의 농도는 약 20 mg/ml이다. 투여될 약제학적 조성물은 약 1,800 mg의 항-CD38 항체 및 약 45,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다. 투여될 약제학적 조성물은 약 1,600 mg의 항-CD38 항체 및 약 30,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다. 투여될 약제학적 조성물은 약 1,600 mg의 항-CD38 항체 및 약 45,000 U의 히알루로니다아제를 포함할 수 있다.

항-CD38 항체 및 히알루로니다아제를 포함하는 약제학적 조성물은 복부 영역에 피하 투여될 수 있다.

항-CD38 항체 및 히알루로니다아제를 포함하는 약제학적 조성물은 약 80 ml, 90 ml, 100 ml, 110 ml 또는 120 ml의 총 부피로 투여될 수 있다.

투여를 위해, 대상에게 혼합물을 투여하기 전에 pH 5.5의 25 mM 아세트산나트륨, 60 mM 염화나트륨, 140 mM D-만니톨, 0.04% 폴리소르베이트 20 중의 20 mg/ml의 항-CD38 항체와 pH 6.5의 rHuPH20, 10 mM L-히스티딘, 130 mM NaCl, 10 mM L-메티오닌, 0.02% 폴리소르베이트 80 중의 1.0 mg/mL(75-150 kU/mL)를 혼합할 수 있다.

본 발명의 추가의 실시 형태

1. 서바이빈 억제제와 병용하여, CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 대상을 치료하는 데 사용하기 위한 항-CD38 항체.

2. 항-CD38 항체와 병용하여, CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 대상을 치료하는 데 사용하기 위한 서바이빈 억제제.

3. CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 대상을 치료하는 데 사용하기 위한 항-CD38 항체와 서바이빈 억제제의 병용물.

4. CD38-양성 혈액학적 악성종양이 다발성 골수종(MM), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종(NHL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 버킷 림프종(BL), 여포성 림프종(FL), 외투-세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)인, 실시 형태 1에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3에 따른 병용물.

5. CD38-양성 혈액학적 악성종양이 혈장 세포 질환인, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태4에 따른 병용물.

6. 혈장 세포 질환이 경쇄 아밀로이드증(AL), 다발성 골수종(MM) 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증인, 실시 형태 1, 실시 형태 4 또는 실시 형태 5에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2, 실시 형태 4 또는 실시 형태 5에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3, 실시 형태 4 또는 실시 형태5에 따른 병용물.

7. 혈장 세포 질환이 MM인, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 6 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 6 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 6 중 어느 하나에 따른 병용물.

8. 항-CD38 항체가 항체 의존성 세포성 독성(ADCC), 항체 의존성 세포성 식세포작용(ADCP), 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 아포토시스에 의한 CD38-양성 세포 사멸을 유도하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 7 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 7 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 7 중 어느 하나에 따른 병용물.

9. 항-CD38 항체가

a. IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형을 갖거나;

b. IgG1 동종형을 갖는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 8 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 8 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 8 중 어느 하나에 따른 병용물.

10. 항-CD38 항체가

a. 서열 번호: 4의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 5의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체와 CD38에 결합하기 위해 경쟁하거나;

b. 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR (서열 번호: 2) 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3)에 결합하거나;

c. 각각 서열 번호: 6, 7 및 8의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) 및 3 (HCDR3) 서열을 포함하거나;

d. 각각 서열 번호: 9, 10 및 11의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) 및 3 (LCDR3) 서열을 포함하거나;

e. 각각 서열 번호: 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하거나;

f. 서열 번호: 4의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열과 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나;

g. 서열 번호: 4의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 5의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하거나;

h. 하기를 갖는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하거나: :

i. 서열 번호: 14의 VH 및 서열 번호: 15의 VL;

ii. 서열 번호: 16의 VH 및 서열 번호: 17의 VL;

iii. 서열 번호: 18의 VH 및 서열 번호: 19의 VL; 또는

iv. 서열 번호: 20의 VH 및 서열 번호: 21의 VL;

i. 하기를 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 9 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 병용물:

i. 서열 번호: 14의 VH 및 서열 번호: 15의 VL;

ii. 서열 번호: 16의 VH 및 서열 번호: 17의 VL;

iii. 서열 번호: 18의 VH 및 서열 번호: 19의 VL; 또는

iv. 서열 번호: 20의 VH 및 서열 번호: 21의 VL.

11. 항-CD38 항체가 서열 번호: 4의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호: 5의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 따른 병용물.

12. 서바이빈 억제제가 소분자, 폴리뉴클레오티드 또는 백신인, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 11 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 11 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 11 중 어느 하나에 따른 병용물.

13. 서바이빈 억제제가 YM155인, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 12 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 12 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 12 중 어느 하나에 따른 병용물.

14. 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제가 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여되는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 13 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체, 실시 형태 2 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 13 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 서바이빈 억제제, 또는 실시 형태 3 또는 실시 형태 4 내지 실시 형태 13 중 어느 하나에 따른 병용물.

15. 항-CD38 항체가 각각 서열 번호: 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열을 포함하는, 서바이빈 억제제와 병용하여, CD38-양성 혈액학적 악성종양을 갖는 대상을 치료하는 데 사용하기 위한 항-CD38 항체.

16. 항-CD38 항체가 서열 번호: 4의 VH 및 서열 번호: 5의 VL을 포함하는, 실시 형태 15에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

17. 항-CD38 항체가 IgG1 동종형을 갖는, 실시 형태 15 또는 실시 형태 16에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

18. 항-CD38 항체가 서열 번호: 12의 중쇄 및 서열 번호: 13의 경쇄를 포함하는, 실시 형태 15 내지 실시 형태 17 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

19. 항-CD38 항체 및 서바이빈 억제제가 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여되는, 실시 형태 15 내지 실시 형태 18 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

20. 항-CD38 항체가 정맥내 투여되는, 실시 형태 15 내지 실시 형태 19 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

21. 항-CD38 항체가 항-CD38 항체 및 히알루로니다아제를 포함하는 약제학적 조성물로 피하 투여되는, 실시 형태 15 내지 실시 형태 19 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

22. 히알루로니다아제가 서열 번호: 23의 rHuPH20인, 실시 형태 21에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

23. CD38-양성 혈액학적 악성종양이 다발성 골수종인, 실시 형태 15 내지 실시 형태 22 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 항-CD38 항체.

본 발명을 일반적인 개념으로 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이며, 이때 실시예는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

재료 및 방법

세포 및 세포 배양

골수 단핵 세포(BM- MNC ) 및 말초 혈액 단핵 세포( PBMC )

MM 환자 또는 건강한 개체로부터의 BM 흡인물뿐만 아니라, 건강한 개체로부터의 PB를 헬싱키선언(declaration of Helsinki)에 따라 기관의 의료 윤리 위원회(institutional medical ethical committee)에 의해 승인된 프로토콜 및 절차를 사용하여 수집하였다. 건강한 공여자(HD)-PBMC 및 BM-MNC를 각각 PB 샘플 또는 BM 흡인물로부터 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도-구배 원심분리에 의해 단리하였다. ADCC 실험에서 PBMC를 이펙터 세포로 바로 사용하고, BM-MNC를 사용하기 전까지 동결보존하였다.

다발성 골수종(MM) 세포주

10% 소태아 혈청(FBS; 인테그로(Integro) BV) 및 항생제(페니실린/스트렙토마이신; 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))가 보충된 루시페라제(Luc)-형질도입된 인간 MM 세포주 RPMI-8226 및 UM9를 RPMI1640(인비트로겐) 중에 37℃에서 5% CO₂를 함유하는 가습된 분위기에서 유지하였다.

골수 기질 세포(BMSC)

부착성 기질 세포를 건강한 개체(hBMSC) 또는 MM 환자(pBMSC)의 BM-MNC로부터 단리하고, 플라스틱 부착에 의해 배양하였다. 세포를 5% 혈소판 용해물, 헤파린 및 항생제를 포함하는 옵티멤(Optimem)(인비트로겐) 중에 배양하였다. hBMSC를 6 계대까지 실험에 사용하고, pBMSC를 계대 1 또는 계대 2 후에 사용하였다.

시약

YM155(세판트로늄(Sepantronium) 브로마이드; 4,9-다이하이드로-1-(2-메톡시에틸)-2-메틸-4,9-다이옥소-3-(2-피라지닐메틸)-1H-나프트[2,3-d]이미다졸륨 브로마이드; CAS 781661-94-7)(셀렉 케미칼스(Selleck Chemicals))를 1mM의 농도로 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고, 사용하기 전까지 보관을 위해 분취하였다. YM155를 배양 배지에서 각각의 실험에서 지시된 농도로 희석시켰다.

YM155; 화학식 I:

다발성 골수종 세포주에 대한 항체 의존성 세포-매개 독성(ADCC)에 기반 구획별 생물발광("구획별 BLI-기반 독성 분석")

hBMSC를 100μl 배양 배지에서 흰색 불투명 평평한 바닥 96-웰 플레이트(코스타(Costar))에 1×10⁴개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 6시간의 부착 후, luc-형질도입된 MM 세포주를 BMSC-코팅되거나 코팅되지 않은 웰에 1×10⁴개의 세포/웰의 밀도로 첨가하였다. YM155를 시험한 실험에서, YM155를 MM 세포와 함께 지시된 농도로 첨가하였다. 16 내지 20시간 후, 다라투무맙을 지시된 농도로 첨가하고, 15분 동안 실온에 두었다. 이어서, 건강한 개체로부터 새로 단리된 PBMC를 지시된 이펙터 표적 비로 이펙터 세포로서 첨가하였다. PBMC를 첨가한지 4시간 후, 125 ㎍/ml 딱정벌레 루시페린(프로메가(Promega))를 첨가하고, 생존한 MM 세포로부터 방출된 생물발광 신호를 발광 측정기(스펙트라맥스, 몰레큘러 디바이시스)를 사용하여 20분 내에 측정하였다. MM 세포의 % 생존을 하기 식: % 생존 = (PBMC 부재 하에 평균 생물발광 신호 / PBMC의 존재 하에 평균 생물발광 신호) ×100%를 사용하여 계산하였다. 이러한 분석에서, MM 세포의 생존은 ADCC 매개 용해의 직접적인 반영이며, 문헌[McMillin et al., Nat Med 16:483-489, 2010]에 기재된 바와 같은 고전적인 크롬 방출 검정과 상관관계가 있다.

다발성 골수종 BM- MNC에서 FACS 기반 ADCC 분석

15 내지 35% CD138⁺ MM 세포를 갖는 MM 환자로부터의 동결 BM-MNC를 FACS-기반 ADCC 분석에서 사용하였다. 세포를 해동하고, RPMI 중의 10% HS에서 배양하였다. 16 내지 20시간 후에, BM-MNC를 트리판 블루 제외로 계수하고, 4×10⁴개의 세포/웰을 96 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 다라투무맙 및/또는 YM155를 시험에 따라 지시된 바와 같이 웰에 첨가하였다. 24시간 후, 세포를 형광 접합된 항-CD138, 항-CD38, 항-CD56 및 항-CD3 항체로 염색하고, BM-MNC에서 1차 CD138⁺ MM 세포의 생존을 이전에 기재된 바와 같이 FACS에 의해 측정하였다(문헌[Groen et al., Blood 120:e9-e16, 2012]). MM 세포의 % 용해를 하기 식: % 용해 세포 = 1- (처리된 웰에서 생존한 CD138⁺ 세포 수/대조군 웰에서 생존한 CD138⁺ 세포의 수) × 100%를 사용하여 추론하였다.

유세포 분석법

MM 세포에서 CD38 발현 수준을 측정하기 위해, MM 세포를 단독으로 또는 BMSC와 함께 배양하고, CD38 플루오레세인 접합된 항체로 인큐베이션하였다. 세포를 BMSC에 대한 마커로서 CD105와 추가로 염색하였다. CD105 음성 세포에서 CD38 발현을 기재된 바와 같이 FACS에 의해 측정하였다(문헌[de Haart et al., Clin Cancer Res 19:5591-601, 2013]).

생체내 종양 표적 실험

HD-BMSC로 코팅된 2- 내지 3-mm 2상 인산칼슘 입자 3개로 이루어진 혼성 스캐폴드를 이전에 기재된 바와 같이 RAG2^-/-γc^-/- 마우스로 피하 이식되기 전에 시험관내에서 Luc⁺ MM 세포주 UM9(1×10⁶개의 세포 /스캐폴드)로 로딩하였다(문헌[Groen et al., Blood 120:e9-e16, 2012]). 이식 10일 후, 스캐폴드에서 성장하는 종양을 가진 마우스를 비히클 대조군, 다라투무맙 + PBS 또는 다라투무맙+ YM155로 처리하였다. 대조군을 포함하는 각각의 마우스에 인간 NK 세포의 공급원으로서 T 세포-고갈된 HD-PBMC(5×10⁶개의 세포)를 추가로 투여하여 ADCC를 유도하였다. 1 mg/㎏/d의 약물을 연속적으로 전달하는 피하 주입 펌프(알젯(Alzet) 1007D)를 사용하여 PBS 및 PBS에서 희석된 YM155를 투여하였다. 10일 후에 펌프를 제거하였다. 이전에 기재된 바와 같이 BLI를 수행하였다(문헌[Spaapen et al., Clin Cancer Res 16:5481-88, 2010]; 문헌[Rozemuller et al., Haematologica 93:1049-57, 2008]).

그랜자임 B 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)

무세포 상청액의 그랜자임 B(GzB) 함량을 제조업체의 지침서에 따라 시판용 ELISA 키트(네덜란드 암스테르담 소재, 상킨(Sanquin)의 펠리페어(Pelipair))를 사용하여 측정하였다.

실시예 1. 골수 기질 세포는 다발성 골수종 세포의 항체 의존성 세포성 독성에 대한 보호를 부여한다.

골수(BM) 미세환경의 기질 세포가 CTL 및 NK 매개 독성으로부터 MM 세포를 보호하기 때문에, 다라투무맙에 의해 유도된 항체 의존성 세포성 독성(ADCC)에 대한 유사한 보호 효과가 발생하는지 여부를 평가하였다.

2가지 CD38⁺ 루시페라제 형질도입된 MM 세포주인 UM9 및 RPMI에 대한 건강한 공여자 BMSC에 의한 ADCC의 유도를 구획별 BLI-기반 독성 분석에서 이펙터 세포로서 HD-PBMC의 존재 또는 부재 하에 일련의 농도의 다라투무맙으로 시험하였다. BMSC의 부재 하에, 다라투무맙은 용량 의존성 방식으로 두 MM 세포주 모두에서 ADCC를 매개하였다. 두 세포주는 모두 BMSC의 존재 하에서 다라투무맙-유도된 ADCC에 덜 민감하였다. 도 1a는 UM9 세포에서 다라투무맙-유도된 ADCC에 대한 BMSC의 영향을 나타내고, 도 1b는 RPMI-8226 세포에서 다라투무맙-유도된 ADCC에 대한 BMSC의 영향을 나타낸다.

1차 MM 세포를 다라투무맙-유도된 ADCC로부터 보호하는 BMSC의 능력을 또한 상술한 방법을 사용하여 FACS-기반 ADCC 분석으로 평가하였다. 분석에서, 적어도 15%의 CD138⁺ 악성 혈장 세포 및 충분한 수의 자가 이펙터 NK 세포를 함유하는 BM-MNC를 다라투무맙과 인큐베이션하여 ADCC를 유도하였다. BM-MNC를 단독으로 또는 자가 BMSC와 공동배양하여 BMSC의 영향을 평가하기 위해 시험하였다. 24시간 배양한 후 FACS-기반 생존율 분석을 수행하여, CD138⁺ 생존 세포를 측정하고 용해를 계산하였다. 시험한 두 공여자 모두에서, 자가 MM-BMSC의 존재 하의 1차 MM 세포의 ADCC 유도가 (도 2a 및 도 2b) 덜 효율적이었는데, 이는 종양 미세환경의 기질 세포가 다라투무맙 요법에 대한 내성을 유도함을 나타낸다.

실시예 2. BMSC-유도된 ADCC의 억제는 CD38 하향조절 또는 NK 세포 억제에 의해 유발되지 않는다.

ADCC에 대한 BMSC-매개 보호의 기전을 이해하기 위해 CD38 표면 발현 및 NK 세포 활성화의 가능한 변화를 평가하였다.

건강한 공여자의 BMSC의 존재 또는 부재 하에 MM 세포주 UM9 및 RPMI-8226를 배양하였다. MM 세포와 BMSC의 공동배양은 둘 중 하나의 MM 세포주에 대해서도 CD38 발현 수준을 하향조절하지 않았다(데이터 미도시).

BMSC가 몇몇 면역억제 인자, 예컨대 IDO, TGF-β 또는 PGE-2를 생성하는 것으로 알려져 있으므로, BMSC에 의한 ADCC에 대한 보호는 NK-세포 활성화의 억제에 기인할 수 있으며, 이는 면역 시냅스에서 그랜자임 B 및 퍼포린을 탈과립하고 방출하는 이들의 표적을 사멸시키는 능력을 감소시킬 것이다. 그 결과, 다라투무맙에 의한 NK 세포 활성화에 대한 BMSC의 영향을 NK 세포 활성에 대한 마커로서 다라투무맙-매개 그랜자임 B 분비를 사용하여 측정하였다. 그랜자임 B의 수준은 일반적으로 BMSC의 존재 하에 상청액에서 더 높았다(데이터 미도시). 따라서, ADCC에 대한 BMSC-매개 보호는 NK 세포 억제에 기인하지 않을 수 있다.

실시예 3. 서바이빈 억제는 ADCC에 대한 BMSC-매개 보호를 방해하고, 다라투무맙을 사용하여 다발성 골수종 세포의 상승적인 ADCC-매개 사멸을 제공한다.

BMSC는 MM 세포에서 서바이빈의 상향조절에 의해 CTL 용해에 대해 MM 세포를 보호하는 것으로 나타났다. 서바이빈의 소분자 억제제인 YM155를 사용하여, 다라투무맙에 의해 유도된 BMSC-매개 ADCC에 대한 보호의 가능한 기전으로서 서바이빈의 조절을 평가하였다.

NK 세포 생존율에 대한 YM155의 영향을 먼저 평가하였다. MM 환자의 BM-MNC를 상이한 용량의 YM155의 존재 하에 24시간 동안 배양하였다. MM 세포(CD138⁺ 세포) 및 NK 세포(CD3^-CD138^-CD56⁺ 세포)의 생존율을 FACS에 의해 측정하였다. NK 세포는 이미 MM 세포에 약간의 독성을 보이는 YM155 용량에서는 영향을 받지 않는다(도 3).

다라투무맙, YM155, 또는 다라투무맙과 YM155의 병용물의 효과를 NK 세포에 독성이 없는 것으로 밝혀진 YM155의 농도를 사용하여 RPMI-8226 세포 및 2명의 MM 환자 샘플에서 평가하였다.

분석에서, 다라투무맙 및 YM155를 각각 RPMI-8226 세포의 경우 0.3 ㎍/ml 및 1 nM의 농도로, MM 환자 샘플의 경우 각각 1 ㎍/ml 및 120 nM의 농도로 사용하였다. 이펙터 세포로서 건강한 공여자의 PBMC를 RPMI-8226 세포의 경우 40:1의 이펙터: 표적 세포 비로 MM 환자 샘플의 경우 30:1의 비로 사용하였다.

RPMI-8226 세포에서, BMSC의 부재 하에 다라투무맙 단독 또는 YM155 단독은 약 20%의 세포의 용해를 유도하였다. BMSC의 존재 하에, 다라투무맙은 약 10%의 세포의 용해를 유도한 반면에, YM155는 효과가 없었다. 다라투무맙과 YM155의 병용물은 BMSC의 부재 하에 약 50%의 세포의 용해를 유도하고, BMSC의 존재 하에 약 45%의 세포의 용해를 유도하는 상승 효과를 제공하였다(도 4a). BMSC에서 다라투무맙과 YM155의 병용물의 상승 효과는 약 5배였다. 유사하게, 다라투무맙과 YM155의 병용물은 120 nM의 YM155(도 4b)를 사용하여 MM 환자 샘플 1에서 상승 효과를, 적은 양의 YM155(64 nM)(도 4c)를 사용하여 MM 환자 샘플 2에서 그리고 4명의 환자로부터 유래된 MM 세포의 병용 샘플에서(도 4d) 적당한 상승 효과를 제공하였다. 따라서, YM155는 MM 세포 및 세포주에서 다라투무맙-매개 ADCC에 대한 BMSC의 보호 효과를 방해하였다.

따라서, 서바이빈 상향조절은 서바이빈의 약리학적 조절에 의해 예방할 수 있는 MM 세포의 ADCC-매개 사멸의 억제의 중요한 기전일 수 있다.

실시예 4. 다라투무맙과 YM155 병용 요법의 생체내 항종양 효과

MM 종양을 인간 BMSC로 코팅된 세라믹 스캐폴드의 피하 이식에 의해 생성된 인간화 BM형 니치(BM-like niche)에서 성장시킨 RAG2^-/-gc^-/-마우스의 임상전의 이종이식편 모델에서 다라투무맙과 YM155의 병용물의 생체내 관련성을 시험하였다. 인간 MSC로 코팅되고 루시페라제 형질도입된 MM 세포주 UM9로 로딩된 혼성 스캐폴드를 RAG2^-/-γc^-/-마우스(마우스 당 4개의 스캐폴드)의 등에 피하 이식하였다. 이식 10일 후, 성장하는 종양을 BLI에 의해 가시화하고 정량화하였다. 이어서, 상이한 군의 마우스(n=4)를 비히클 대조군 (대조)으로 처리하거나, 다라투무맙, YM155 또는 다라투무맙+ YM155로 처리하였다. YM155 또는 이의 비히클인 PBS를 1 mg/㎏/d YM155의 속도로 10일 동안 피하 주입 펌프로 전달하였다. 대조군을 포함하는 각각의 마우스는 인간 NK 세포의 공급원으로서 T 세포 고갈된 HD-PBMC(5×10⁶개의 세포)를 투여받아ADCC를 유도하였다. 마우스를 BLI에 의해 매주 모니터링하였다. 도 5는 각각의 군에 대한 상대적인 종양 성장을 나타낸다. 다라투무맙으로 처리된 마우스와, 다라투무맙 + YM155로 처리된 마우스 사이의 통계적 차이를 만-휘트니 U-시험을 사용하여 계산하였다. 다라투무맙은 종양 성장에 거의 영향을 미치지 않았다. 항-MM 효과는 YM155에서 더 두드러졌으며, 이는 심지어 다라투무맙과 강한 상승작용을 보여 항-MM 효과를 상당히 향상시켰다. 이러한 결과는 다라투무맙과 서바이빈 억제제 YM155의 병용물로부터 임상적 이익이 예상될 수 있음을 시사하였다.

제시된 결과는 소분자 YM155로 서바이빈 수준을 억제하는 것은 BMSC의 부재 하에 다라투무맙-매개 ADCC를 개선시킬 뿐만 아니라, BMSC에 의해 유도된 ADCC 내성을 중대하게 감소시켰음을 입증하였다.

YM155을 다라투무맙에 첨가하면 BMSC의 부재 하에서도 항종양 효과가 향상되는데, 이는 혈장 세포 백혈병에서와 같이 MM 세포가 BMSC와 직접 접촉하지 않은 경우에도, YM155-다라투무맙 병용 요법의 잠재적 이익을 시사하였다. 또한, BMSC의 존재 하에 MM 세포 용해가 최대 4배 개선된 ADCC의 상당한 개선은 다라투무맙 요법을 YM155와 병용하면 BM에 위치한 MM 세포의 경우 더 큰 이익을 얻을 수 있음을 시사하였다. 또한 YM155 치료가 NK 세포 기능 또는 생존율을 부정적으로 방해하지 않는다는 것이 증명되었는데, 이는 이러한 병용 요법의 임상 적용을 고려하기 위한 전제 조건이다.

YM155와 병용한 다라투무맙의 효능이 다발성 골수종에서 입증되었지만, 병용 요법이 또한 CD38을 발현하는 다른 혈액 종양, 특히 주로 BM에 위치하는 것들에서도 유용할 수 있음을 추정할 수 있다. 이러한 관점에서, AML 세포가 높은 수준의 CD38뿐만 아니라 높은 수준의 서바이빈을 발현하므로(이는 좋지 않은 임상 결과의 예측인자임), AML은 강력한 후보이다. CLL 세포는 BM에서 서바이빈 발현이 높고, 일부 환자에서는 CD38이 발현되므로 CLL은 병용 요법의 다른 잠재적인 후보일 수 있다. 약 50%의 비호지킨 림프종에서의 CD38 및 서바이빈의 고발현은 이 질환을 YM155-다라투무맙 병용 요법의 효능 평가와도 관련이 있게 한다. 전체적으로, 다라투무맙과 YM155의 병용물은 광범위한 혈액학적 종양에 광범위하게 적용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Doshi, Parul Lokhorst, Henk Mutis, Tuna <120> COMBINATION THERAPIES FOR HEME MALIGNANCIES WITH ANTI-CD38 ANTIBODIES AND SURVIVIN INHIBITORS <130> JBI5045WOPCT <140> TO BE ASSIGNED <141> <150> 62/182699 <151> 2015-06-22 <150> 62/319036 <151> 2015-04-06 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 300 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys 1 5 10 15 Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val 20 25 30 Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln 35 40 45 Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu 50 55 60 Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val 65 70 75 80 Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys 85 90 95 His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu 100 105 110 Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile 115 120 125 Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val 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Claims

항-CD38 항체를 포함하는, CD38-양성 혈액학적 악성종양을 치료하기 위한 약제로서,
a) 항-CD38 항체가 IgG1 동종형(isotype)이고,
b) 항-CD38 항체의 HCDR(중쇄 상보성 결정 영역)1, HCDR2 및 HCDR3 서열이 각각 서열 번호: 6, 7 및 8로 구성되고,
c) 항-CD38 항체의 LCDR(경쇄 상보성 결정 영역) 1, LCDR2 및 LCDR3 서열이 각각 서열 번호: 9, 10 및 11로 구성되고,
d) 상기 약제가 세판트로늄 (Sepantronium) 브로마이드 (YM155, 화학식 I)와 병용하여 투여되는 것인 약제:
[화학식 I]
.
제1항에 있어서, CD38-양성 혈액학적 악성종양이 다발성 골수종(MM), 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma; NHL), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma; BL), 여포성 림프종(FL), 외투-세포 림프종(MCL), 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)인 약제.
제1항에 있어서, CD38-양성 혈액학적 악성종양이 혈장 세포 질환인 약제.
제3항에 있어서, 혈장 세포 질환이 경쇄 아밀로이드증(AL), 다발성 골수종(MM) 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia)인 약제.
제4항에 있어서, 혈장 세포 질환이 MM인 약제.
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제1항에 있어서, 항-CD38 항체가 인간 CD38(서열 번호: 1)의 영역 SKRNIQFSCKNIYR(서열 번호: 2) 및 영역 EKVQTLEAWVIHGG(서열 번호: 3)에 결합하는 약제.
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제1항에 있어서, 항-CD38 항체의 중쇄 가변 영역 (VH)이 서열 번호: 4로 구성되고, 항-CD38 항체의 경쇄 가변 영역 (VL)이 서열 번호: 5로 구성되는 것인 약제.
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제1항에 있어서, 항-CD38 항체가 항체 의존성 세포성 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC), 항체 의존성 세포성 식세포작용(ADCP), 보체 의존성 세포독성(CDC) 또는 아포토시스(apoptosis)에 의한 CD38-양성 세포 사멸을 유도하는 약제.
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제1항에 있어서, 항-CD38 항체 및 세판트로늄 브로마이드가 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 투여되는 약제.
제18항에 있어서, 항-CD38 항체가 정맥내 투여되는 약제.
제18항에 있어서, 히알루로니다아제를 추가로 포함하며, 항-CD38 항체가 피하 투여되는 약제.
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