ES2621377T3

ES2621377T3 - Anticuerpo marcado radiactivamente y usos del mismo

Info

Publication number: ES2621377T3
Application number: ES13788728.7T
Authority: ES
Inventors: Markus Essler
Original assignee: Morphosys AG
Current assignee: Morphosys AG
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2013-11-04
Publication date: 2017-07-03
Anticipated expiration: 2033-11-04
Also published as: US9486547B2; US20150283275A1; EP2914302B1; WO2014068114A1; DK2914302T3; EP2914302A1

Abstract

Un radioconjugado que comprende un anticuerpo específico de CD38 que comprende una región HCDR1 con la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 con la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una HCDR3 con la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 con la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 con la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 con la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6).

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

La descripción contempla que el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo se puede marcar con un radioisótopo utilizando cualquier método y proceso químico disponible. Una asociación o conjugación del radioisótopo puede ser directa o a través de un agente de acoplamiento o enlazador, por ejemplo, un agente quelante.

Una composición farmacéutica incluye un agente activo, por ejemplo, un anticuerpo para uso terapéutico en seres humanos. Una composición farmacéutica puede incluir vehículos o excipientes aceptables.

"Administrado" o "administración" incluye pero no se limita a la entrega a través de una forma inyectable, tal como, por ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea o una vía mucosa, por ejemplo, tal como una pulverización nasal o un aerosol para inhalación o como una solución ingerible, una cápsula o un comprimido.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto o una combinación, se refiere a una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clínicas de una enfermedad o un trastorno dado y sus complicaciones. La cantidad que es eficaz para un fin terapéutico particular, dependerá de la gravedad de la enfermedad o la lesión, así como del peso y del estado general del sujeto. Se entenderá que la determinación de una dosificación apropiada se puede lograr utilizando una experimentación rutinaria, construyendo una matriz de valores y sometiendo a ensayo diferentes puntos en la matriz, todo ello está dentro de los conocimientos ordinarios de un médico capacitado o un científico clínico.

6. REALIZACIONES

Un aspecto de la presente descripción comprende un radioconjugado de un anticuerpo específico de CD38 y un radioisótopo, para uso en el tratamiento de mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin.

En realizaciones, el radioconjugado comprende un anticuerpo específico de CD38 que comprende una región HCDR1 con la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 con la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 con la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 con la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 con la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 con la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y un radioisótopo para el tratamiento del mieloma múltiple y/o el linfoma no Hodgkin.

En ciertas realizaciones, el radioconjugado comprende un isótopo que muestra un intervalo corto en el tejido, p. ej., un intervalo de aproximadamente 40-100 µm, combinado con una energía elevada, p. ej., aproximadamente 4-9 MeV. En realizaciones particulares, un isótopo de este tipo es un isótopo que emite partículas α, por ejemplo, 213Bi o

225Ac.

En realizaciones, el radioconjugado comprende un radioisótopo seleccionado a partir de yodo-131, itrio-90, lutecio177, cobre-67, astato-211, bismuto-212, bismuto-213 y actinio-225.

En una realización, el radioisótopo es bismuto-213.

En realizaciones, el anticuerpo específico de CD38 comprende una región HCDR1 con la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o con la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 con la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 con la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 con la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 con la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 con la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y el radioisótopo es bismuto-213.

En un aspecto, el radioconjugado es para uso en el tratamiento de mieloma múltiple y/o linfoma no Hodgkin.

Un aspecto se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el radioconjugado. En realizaciones, la composición comprende un vehículo aceptable. En realizaciones, la composición se administra en una cantidad eficaz.

Un aspecto se refiere a un radioconjugado que comprende un anticuerpo específico de CD38 que comprende una región HCDR1 con la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o con la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 con la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 con la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 con la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 con la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 con la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y 213Bi para el tratamiento del mieloma múltiple y/o el linfoma no Hodgkin.

En una realización adicional, el anticuerpo comprende una cadena pesada variable con la secuencia

imagen6

y una cadena ligera variable con la secuencia:

imagen7

En realizaciones, el anticuerpo tiene una región Fc de IgG1. En realizaciones, el anticuerpo comprende una región 5 Fc modificada, en donde dicha modificación mejora la actividad ADCC.

En otro aspecto, el radioconjugado de un anticuerpo específico de CD38 que comprende una región HCDR1 con la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o con la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 con la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 con la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 con la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 con la secuencia

10 GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 con la secuencia de QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y 213Bi, es capaz de mediar en la destrucción de células OPM2 que expresan CD38 con una eficacia que es al menos dos veces, tres veces, cuatro veces o cinco veces mejor que 213Bi solo.

En otro aspecto, el radioconjugado de un anticuerpo específico de CD38 que comprende una región HCDR1 con la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o con la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 con la

15 secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 con la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 con la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 con la secuencia GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 con la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y 213Bi, inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de mieloma múltiple en ratón.

Otro aspecto comprende un radioconjugado para uso en un método para tratar el mieloma múltiple y/o el linfoma no

20 Hodgkin en un individuo que lo requiere, en donde el método comprende la administración de un radioconjugado que comprende un anticuerpo específico de CD38 que comprende una región HCDR1 con la secuencia GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1) o con la secuencia SYYMN (SEQ ID NO: 14), una región HCDR2 con la secuencia GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), una región HCDR3 con la secuencia DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), una región LCDR1 con la secuencia SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), una región LCDR2 con la secuencia

25 GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) y una región LCDR3 con la secuencia QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) y 213Bi, a un individuo que tiene mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin.

7. EJEMPLOS

Ejemplo 1: Expresión de CD38 en la superficie de diversas líneas celulares

Las líneas celulares de la Tabla 1 se sometieron a ensayo para determinar los niveles de expresión de CD38.

30 Tabla 1

Línea celular: Suministrada por: Cultivada en:

AMO-1: línea celular de mieloma múltiple: DSMZ nº ACC 538 RPMI1640, con L-Glutamina, (PAN Biotech GmbH, nº de Cat.: medio P04-16500)

LP1: línea celular de mieloma múltiple: DSMZ nº ACC 41 Medio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) con GlutaMAX® (Invitrogen, nº de Cat.: 31980-048)

NCI-H929: línea celular de mieloma múltiple: DSMZ nº ACC 163 RPMI1640 (igual que AMO-1), complementado con Napiruvato 1 mM, ß-mercaptoetanol 50 µM

RPMI8226: línea celular de mieloma múltiple: DSMZ nº ACC 402 RPMI1640 (igual que AMO-1)

OPM-2: línea celular de mieloma múltiple: DSMZ nº ACC 50 RPMI1640 (igual que AMO-1)

Plasmocitoma, células plasmáticas malignas: Hospital “Klinikum rechts der Isar” RPMI1640 (igual que AMO-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Las muestras de médula ósea (4-10 ml de aspirado) procedentes de pacientes con mieloma múltiple y las muestras de plasmacitoma tumoral extramedular se obtuvieron después del consentimiento informado a partir del Hospital “Klinikum rechts der Isar” ("KrdI") (Múnich, Alemania). Las muestras se sometieron a centrifugación, y se consiguió un mayor enriquecimiento de las células plasmáticas a través de una clasificación de las células activadas de forma magnética.

Las células se tiñeron con un anticuerpo CD38-PE de QuantiBRITE® marcado directamente (Becton Dickinson GmbH, Clon HB7, nº de cat. 342371), que es específico de CD38. Los "anticuerpos unidos por célula" (ABCs) se determinaron utilizando el sistema basado en citometría de flujo de QuantiBRITE®, que mide la media geométrica (GeoMean) por célula. La conversión de la GeoMean medida con la cantidad correlativa de ABC por célula se realizó con el programa informático GraphPad PRISM®. Los valores de ABC se considera que se correlacionan con el número de moléculas de CD38 por célula, ya que CD38-PE de QuantiBRITE® es portador de una molécula de PE por anticuerpo. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Línea celular: Número absoluto de ABC (expresión de CD38)

AMO-1: 25.000

LP-1: 125.000

NCI-H929: 195.000

RPMI-8226: 670.000

OPM-2: 38.000

Plasmocitoma: 30.000

Ejemplo 2: Unión de conjugado 213Bi-anti-CD38-MAb con líneas celulares de MM

Se cultivaron líneas celulares de mieloma OPM2, ARH77, RPMI8226, U266 y células madre mesenquimales de médula ósea (BM-MSC) (proporcionadas por T. Dechow, Technische Universität München) en medio RPMI 1640 (Biochrom, Berlín, Alemania) complementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 1% de L-glutamina (todos de Biochrom). Células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC; PromoCell, Heidelberg, Alemania) se mantuvieron en medio de crecimiento de células endoteliales (PromoCell, Heidelberg, Alemania). Todas las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Se aislaron células de mieloma primario a partir de la médula ósea de dos pacientes que padecían mieloma múltiple. La solución Histopaque-1077 en gradiente de ficol se cubrió con médula ósea y se centrifugó a 445 g durante 35 min (20°C). A partir de la interfase que contenía células mononucleares, se aislaron magnéticamente las células de mieloma usando microperlas anti-CD138, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania). Se extrajeron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de la sangre total, de acuerdo con el protocolo para la extracción de células de mieloma primario.

Se sembraron 3x105 células (en 200 µl de medio de cultivo) en cada pocillo (recubiertos con poli-D-lisina) de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 1 h a 37°C. Posteriormente, las células se incubaron con el anti-CD38-MAb MOR03087 (2 µg/ml) durante otra hora a 37°C y se lavaron tres veces con PBS/10% de FCS sobre hielo. Las células se fijaron después durante 10 minutos en 4% de formaldehído (en PBS) y se permeabilizaron durante 10 min con 1% de Triton-X100 (en TBS). Después de lavar (tres veces con PBS) y bloquear durante 1 h con PBS/10% de FCS, las células se incubaron con un anticuerpo anti-IgG humano conjugado con HRP (1:5000 en TBS/10% de FCS). Las células se lavaron tres veces con PBS y después se incubaron con sustrato de TMB lento (Thermo Scientific Pierce, EE.UU.) durante 1 h. La reacción de color se detuvo con H2SO4 0,5 M y la absorbancia se midió a 450 nm.

El ácido SCN-CHX-A"-dietilenetriaminpentaacético (DTPA), agente quelante de 213Bi (Macrocyclics, EE.UU.) se acopló covalentemente al anti-CD38-MAb como se ha descrito anteriormente en Mirzadeh et al., 1990, Bioconjug Chem. 1(1):59-65. El 213Bi emisor de α eluyó a partir de un sistema generador de 225Ac/213Bi proporcionado por el Instituto de Elementos Transuránicos (Comisión Europea, JRC, Alemania) (Apostolidis et al., 2005, AnalChem. 77:6288-6291; Morgenstern et al., 2012, Curr. Radiopharm. 5(3):221-227). El anti-CD38-MAb quelado (100 µg) se incubó con la especie aniónica 213BiI4-/213BiI52-, tal y como eluyó del generador, durante 7 min en tampón de acetato de amonio 0,4 M a pH 5,3. Los iones de 213Bi no unidos se separaron de los inmunoconjugados 213Bi-anti-CD38-MAb mediante cromatografía de exclusión por tamaño (columnas PD-10, GE Healthcare, Alemania). La pureza de los inmunoconjugados 213Bi-anti-CD38 se comprobó mediante cromatografía en capa fina instantánea (Nikula et al. 1995, Nucl. Med. Biol. 22:387-390). La unión de los inmunoconjugados 213Bi-anti-CD38 a las células OPM2, se analizó como se ha descrito anteriormente (Huber et al 2003, Clin. Cancer Res. 9(10Pt2):3922S-3982S). La CE50 del

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

los períodos de tiempo indicados. Las células se lavaron en PBS y se fijaron en 0,5 ml de etanol al 80%. Para el análisis del ciclo celular, las células fijadas se incubaron con ARNasa (0,1 mg/ml; 5 min TA), se trataron con pepsina (5 mg/ml en HCl 50 mM; 10 min 37°C), se tiñeron con PI (50 µg/ml) y se sometieron a un análisis por citometría de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson).

El porcentaje de células OPM2 detenidas en la fase G2 aumentó 12 h, 18 h y 24 h después del tratamiento y alcanzó un máximo del 55% a las 48 h. Al mismo tiempo, el porcentaje de células OPM2 en fase G1 cayó por debajo del 15% a las 48 h. Por el contrario, el nivel de células OPM2 no tratadas (controles) en la fase G2 y G1 se mantuvo constante aproximadamente en un 20% y 50%, respectivamente, durante todo el período de observación (Fig. 7A7B). Los resultados se ilustran empleando histogramas representativos que muestran las proporciones de células en fase G1, S y G2 en células OPM2 sin tratar y tratadas con 213Bi-anti-CD38-MAb (Fig. 7C).

Para caracterizar mejor la fase del ciclo celular en la que se detenían las células, se realizó una citometría de flujo con parámetro doble con tinción de la fosfo-histona H3. En particular, las células OPM2 (2x106 por pocillo de una placa de 6 pocillos) se incubaron con o sin inmunoconjugados 213Bi-anti-CD38 (0,74 MBq/ml). Al cabo de 120 h después del tratamiento, las células se lavaron una vez con PBS y se fijaron en etanol helado al 70%. Las células se lavaron de nuevo con PBS y se incubaron con anticuerpo anti-fosfo-histona-H3 (1:200; Cell Signaling Technology/New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) en 1% de BSA durante 3 h a temperatura ambiente (TA). Después de lavar con PBS, las células se incubaron con el anticuerpo secundario anti-IgG acoplado con FITC (de conejo, 1:1000; Abcam, Cambridge, GB) durante 1 h a TA. Finalmente, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en 5 µg/ml de yoduro de propidio (PI) + 0,1% de ARNasa. La fluorescencia de PI y FITC de las células se analizó mediante citometría de flujo de doble parámetro.

La histona H3 se fosforila en la serina 10 después de que las células entren en mitosis y la fosforilación se correlaciona con una condensación de cromosomas mitóticos (Wei Y, et al, 1999, Cell 97(1):99-109). Como se muestra en la Fig. 8A, 120 h después del tratamiento con 213Bi-anti-CD38-MAb (0,74 MBq/ml), las células OPM2 se detuvieron con un contenido en ADN 4n, que es indicativo de una detención en G2/M, y como se muestra en la Fig. 8B, demuestra un fuerte aumento de la fosforilación de las histonas H3, lo que indica que las células habían entrado en mitosis a pesar del tratamiento con radiación α que dañaba el ADN.

Una caracterización adicional se realizó mediante inmunotransferencia de extractos celulares. Los eventos que activan el punto de control principal G2/M como la estabilización con claspina y Wee1, así como la desestabilización con Plk1 (Bassermann, F, et al., 2008, Cell 134(2):256) estaban ausentes a pesar de la presencia de un daño en el ADN, como se evidenciaba por la fosforilación de la histona H2AX (γH2AX) (Fig. 8C). En lugar de ello, las células entraron en mitosis (mostrada por la fosforilación de la histona H3) y se sometieron a una apoptosis posterior como se muestra por la escisión de PARP y la pro-caspasa 3 (Fig. 8D). Téngase en cuenta que se observó una estabilización sustancial de BimEL pro-apoptótico (mediador de la muerte celular que interacciona con Bcl-2, forma larga extra), (Fig. 8D) lo que, sin desear estar ligado a ninguna teoría o mecanismo particular, es consistente con que BimEL está implicado en este evento de muerte celular mitótica.

Las observaciones descritas en el presente documento indican que un tratamiento de las células OPM2 con 213Bianti-CD38-MAb induce un daño significativo en el ADN, lo que sin embargo no da lugar a la activación del punto de control G2 como respuesta al daño del ADN, pero en su lugar da como resultado una detención mitótica y un fallo mitótico posterior.

La inmunotransferencia se realizó del modo siguiente: las células OPM2 (2x106 por pocillo de una placa de 6 pocillos) se incubaron con 213Bi-anti-CD38-MAb (0,74 MBq/ml). En diferentes puntos de tiempo después del inicio de la incubación, es decir, a las 0, 5, 9, 24, 48, 72, 96 y 120 h, las células se lavaron en PBS y posteriormente se lisaron (Tris 50 mM, pH 7,5; NaCl 250 mM; 0,1% de Triton X-100; EDTA 1 mM; NaF 50 mM + inhibidores de proteasas) a 4°C durante 10 min. Los lisados se centrifugaron (13.500 rpm, 4°C, 10 min) y el material sobrenadante (que contenía 25 µg de cada proteína; kit de ensayo de proteínas BCA, Pierce, EE.UU.) se sometió a SDS-PAGE. La transferencia Western que empleaba diferentes anticuerpos contra la clapsina (regalo de Michele Pagano), cdc20 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), p27 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania), Plk1 (Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt, Alemania), wee1, ciclina B1, p-HH3, BimEL, Bax, PARP escindida (todos de Cell Signaling Technology/New England Biolabs, Frankfurt, Alemania), γH2AX, caspasa-3 activa (todos de Millipore, Schwalbach/Ts, Alemania), anticuerpo monoclonal anti-β-actina conjugado con peroxidasa (clon 8226, Abcam, Cambridge, GB) y anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa (GE Healthcare, Hatfield, GB), se realizó como se ha descrito previamente (Vallon, M, et al., 2010. Exp Res. 316(3):412-421).

Ejemplo 6: Conjugado 213Bi-anti-CD38-MAb en un modelo en ratón con xenoinjerto de MM

Las células OPM2-Luc-GFP (2,5x107 en 100 µl de PBS) se inocularon por vía intraperitoneal en ratones SCID de 6-8 semanas de edad (Charles River, Alemania). Veinticinco días después de que se inició el tratamiento fraccionado de inoculación de células, los animales portadores de tumores (n = 9) recibieron seis aplicaciones intraperitoneales de 213Bi-anti-CD38-MAb (1,85 MBq cada una en 100 µl de PBS) cada tercer o cuarto día (véase la Fig. 9), de acuerdo con un esquema terapéutico que se había aplicado con éxito en estudios previos (Drecoll et al., 2009, PLoS One

Claims

imagen1

imagen2