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KR102323673B1 - HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물 - Google Patents

HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물 Download PDF

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KR102323673B1
KR102323673B1 KR1020210047255A KR20210047255A KR102323673B1 KR 102323673 B1 KR102323673 B1 KR 102323673B1 KR 1020210047255 A KR1020210047255 A KR 1020210047255A KR 20210047255 A KR20210047255 A KR 20210047255A KR 102323673 B1 KR102323673 B1 KR 102323673B1
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KR
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chaperone
htra
probiotics
lactic acid
acid bacteria
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KR1020210047255A
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English (en)
Inventor
송지원
김경민
양서진
이승훈
Original Assignee
주식회사 현대바이오랜드
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Abstract

본 발명은 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 종래의 연구에서는 유산균의 샤페론을 유도시키기 위해서 저온, 고온, 고농도의 염 또는 유기용매 처리 등 고강도의 충격(shock)을 단시간 가하는 방법을 사용함으로써 미생물 사멸로 인한 생산성 저하 및 유기용매 잔존 등의 문제로 산업적인 적용에 한계점이 존재하는 반면, 본 발명을 통해 유산균의 폐쇄계 배양 과정 중에 균체 손실없이 HtrA 샤페론의 발현을 유도하여 외부환경적 스트레스에 대한 저항성을 향상시켜 생균 단일제로서 유산균을 이용하여 염증성 장질환을 치료하고 나아가 장내 마이크로바이옴의 변화를 유도할 수 있는 차세대 샤페론 기반 파마바이오틱스 제제의 개발이 가능하다.

Description

HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물 {Manufacturing method for HtrA(high temperature requirement A) chaperone probiotics and composition manufactured through thereof having the effect of controlling the intestinal microbiome for the treatment of inflammatory bowel disease}
본 발명은 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
보다 자세하게는 본 발명은 장내 미생물 중 유산균을 대상으로 외부환경인자의 방어기작인 HtrA 샤페론(HtrA Chaperone)을 유도할 수 있는 스트레스인자를 발굴하여 이를 유산균 배양단계에서 유도하는 산업적 생산법을 개발하고 이렇게 개발한 유산균 원료를 이용한 인체 내 섭취 시, 유산균이 가지고 있는 위장관 생존율과 생균으로서의 장 점막 부착능, 기존 상재균총과의 경쟁적 배제(competitive exclusion)에서 상재균총이 분비하여 외래 균주를 장 점막 부착에서 배제시키는데 사용하는 알코올성 길항물질에 대한 저항성이 있는지 확인하고 나아가 HtrA 샤페론이 유도된 프로바이오틱스를 파마바이오틱스(pharmabiotics) 치료제로 사용하는데 필요한 기준을 병원성균주로 유발시킨 염증성 장질환 동물모델에서의 치료효과(경쟁적 배제치료효과)를 통해 HtrA 샤페론 파마바이오틱스가 생균단일제 치료제로 사용할 수 있는 제조방법을 도출할 수 있다.
프로바이오틱스는 라틴어로 '생명을 위한(for life)'의 뜻으로 2002년 WHO/FAO에서 적당량을 섭취하였을 때, 숙주의 건강에 도움을 주는 살아있는 미생물로 정의하였다. 프로바이오틱스의 대표적인 균종으로는 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.) 등이 있으며 대사과정에서 포도당을 이용하여 젖산(lactic acid)등의 유기산을 생산하기 때문에 유산균(lactic acid bacteria)으로 분류한다.
파마바이오틱스(Pharmabiotics)는 파마슈티컬(pharmaceutical)과 프로바이오틱스(probiotics)의 합성어로, 건강 또는 질병에 대하여 검증된 약학적 역할을 갖는 미생물 또는 미생물이 생산하는 대사산물로 정의한다(Hill, 2010). 예를 들면, 최근 프로바이오틱스는 장내 미생물의 조절 장애(dysbiosis)를 교정하고 이를 기반으로 알레르기 질환 조절을 위한 치료제 개발의 가능성이 높게 평가되고 있으며, 이에 대한 유효성 검증과 기능적 메커니즘에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다(Im, 2018).
프로바이오틱스가 파마바이오틱스로서 활용되기 위해서는 다음 조건을 선행 요건으로 갖추어야 한다. 첫번째, 의약품으로서 단일제제로 처방이 가능하여야 한다. 의약품에서는 유효한 효과에 대한 각 성분의 정성 및 정량 분석 결과가 제시되어야 하지만 외국의 제품사례에서 보면 동종(homogenous strain)이면서 다종(multi-strains)을 사용하여 특정질환의 치료효과를 광고하는 경우가 있다. 제품내에 동종의 유산균을 사용하는 경우, 각 유산균에 대한 정성 및 정량 분석이 불가능하기 때문에 이러한 기술적 장벽을 극복하기 위해서는 합성의약품과 같이 단일제제 처방을 통한 제품개발이 요구된다. 두번째, 섭취 안정성이 확보되어야 한다. 위산과 담즙산 등 장내 다양한 스트레스 요인에 의한 균주 사멸은 장내 균수 미달을 일으키고 치료제로서의 가능성을 낮추기 때문에 스트레스 요인에 대한 내성 향상을 통해 섭취 안정성이 확보되어야 한다.
세번째, 장 부착능 확보를 통해 장내 정착이 가능하여야 한다. 현재 장내 절대혐기성 균주들이 우수한 장 부착능을 바탕으로 치료제 개발에 이용되고 있는데, 프로바이오틱스의 장 부착능이 확보된다면 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주의 이점을 바탕으로 치료제 개발에 활발히 활용될 수 있다.
유산균의 장관 내에서 프로바이오틱스 활성은 크게 균(菌) 대 균(菌)과의 관계 (microbe to microbe relationship)와 균(菌) 대 조직과의 관계 (microbe to tissue relationship)로 구분된다. 균(菌) 대 균(菌)과의 관계는 유산균의 증식과 유해균의 억제효과를 식약처에서 고시 기능성으로 관리하고 있는 표시 기능성으로 균 상호간의 경쟁적 배제를 기본 메커니즘으로 한다. 균(菌) 대 조직과의 관계는 숙주인 인간의 면역세포와의 상호작용에 관한 메커니즘을 기반을 두고 밀접연접(tight junction)의 강화를 통해 유해균의 침입을 억제하고, 수지상 세포(dendritic cell)를 자극하여 항염 사이토카인(anti-inflammatory cytokines)분비를 통해 장관 내 염증을 완화시키고 유해균의 부착을 저해시켜 장관 내 상재균총의 균형을 유지시킴으로써 궁극적으로 인간의 건강을 구현하는 역할을 한다.
장내에서 균 상호간의 경쟁적 배제를 기반으로 병원성 균에 의해 유도된 염증성 장질환의 치료를 위해서는 일정균수 이상의 생균을 섭취해야 하는데 대부분의 경우 위장관을 통과하는 동안 위산과 담즙산에서 사멸되어 장내 도달하는 균수가 미달됨으로써 그 효과를 기대하기 어렵다. 또한 염증성 장질환을 일으키는 병원성균은 독소물질을 분비하여 장내 이온 채널을 교란시킴으로써 숙주의 설사증상을 동반하게 된다. 이러한 대장 내의 내강쪽의 수분유입에 기인한 설사증상은 유산균 생균이 장 점막에 부착할 수 있는 기회를 상실시켜 궁극적으로는 치료제로서의 가능성을 낮추는 요인이 된다.
염증성 장질환을 치료하기 위한 해결책으로 유산균제제를 사용할 하는 경우, 경구투여시 위장관에서의 생균제 사멸문제를 해결하기 위해 산업계에서는 세 가지 방법으로 진행해왔다.
첫번째는 유산균을 사균화시켜 위장관 통과시 균수 사멸을 해결하고 사균체 입자크기를 생균크기보다 작게 제작하여 장관내 상재균총 더미에서 상재균총과의 경쟁적 배제를 회피하여 장점막에 존재하는 수지상세포의 톨 유사 수용체(toll-like receptor)에 직접적으로 반응하게끔 함으로써 장관면역력을 높여 염증을 억제시키는 기전을 기대하는 치료제이다. 그러나 이 사균체 치료제의 오리지널 의약품이 동화약품의 락테올(LACTEOL)이었으나, 사균체 균주를 식약처 신고없이 임의로 변경하여 품목이 취소됨으로써 품목과 함께 균수를 측정하는 방법이 기재된 기준 및 시험법 또한 대한약전 외 의약품집(CODEX)에서 삭제되어 현재 유산균 사균체 원료는 의약품뿐만 아니라, 건강기능식품 원료로서도 사용할 수 없고 식품원료로 그 산업적 가치가 낮아져 있다. 특히, 사균체 정량법은 국내뿐만 아니라, 해외에서도 정립이 되어 있지 않아 이 제제의 치료제 개발시 가장 큰 문제점으로 지적되어왔다.
두번째는 다종의 미생물을 이용한 치료제 접근법으로 다종의 유산균인 Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis ssp. lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus helveticus를 복합제로 제조하여 장관면역이상에 의한 설사에 도움을 주는 방식으로 개발된 사례가 있다. 그러나 이 복합제는 구성에서 보듯이 동종의 유산균을 배합하는 방식이어서 단일제제 처방을 지향하는 의약품 배합에서는 각각 동종의 유산균의 함량을 정량화하여 분석할 수 있는 방법이 없기 때문에 의약품으로 사용할 수 없을 뿐더러 복방처방으로 특별히 사용한다 하더라도 각각의 성분을 구분할 수 있는 정성분석법과 그 함량을 규명해야 하는 정량분석법을 제시할 수 없기 때문에 의약품에서는 동종다종의 생균복합제 처방을 인정하고 있지 않으며, 효과적인 측면에서도 어느 균이 얼마나 양으로 처방할 때 유효한 작용을 하는지 확인이 어려워 제품개발의 실효성이 떨어진다.
세번째는 마이크로바이옴(microbiome)과 관련한 장내 절대혐기세균을 활용한 치료제개발로 Akkermensia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii를 주로 사용하며 그 가능성을 연구하고 있다. 그러나 이들 균주는 산소에 노출되면 사멸하는 균주 특성으로 인해 공기에 노출되는 일반적인 유산균 제조공정을 사용할 수 없으며 제품 내의 공기유입을 최소화하기 위해 오일등을 사용한 제제를 만들고 투여방식 또한 경구제제가 아닌 좌약식으로 개발하고 있어 사용자의 불편함이 가중되는 측면이 있다. 이와 함께 이들 균주를 이용한 치료제 개발이 어려운가장 중요한 문제점으로 지적되는 사항은 절대혐기성 장내세균은 장 점막과의 상호작용이 우수하여 염증성 질환을 치료하는데 유효한 효과를 낼 수 있지만, 아직까지 GRAS 균주로 인정되지 않아서 부작용이 다수 보고되는 등의 안전성(safety) 이슈가 해소되지 않았다.
생명과학분야에서 샤페론은 여러 종류의 스트레스로부터 단백질을 보호해주는 분자들을 의미하며 인체 섭취가능 한 단백질 성분이다. 유산균 등의 미생물에서 샤페론을 유도시키기 위한 종래의 기술은 외부환경의 고강도 충격(shock)을 짧은 시간 내에 가한다. 이로인해 생성된 샤페론은 특정 환경적 스트레스에 저항하는 특성을 가지게 된다. 대표적인 스트레스로는 열 충격요법(heat shock)이며 이로 인해 생성된 샤페론은 DnaK, GroEL 등이 대표적이며 이 샤페론이 생성된 미생물은 열 안정성을 야생균주(wild type strain)보다 높아지게 된다. 그러나 이러한 열 충격요법이 실험실에서는 활용될 수 있어도 산업용으로 적용되는 데는 한계점이 있다. 왜냐하면 미생물이 죽지 않을 정도의 온도로 수 초단위로 짧게 높은 열을 순식간에 준 다음 열을 빼서 정상적인 온도로 낮추는 과정이 있어야 하는데, 개방계(open system)인 실험실 조건에서는 열이 쉽게 빠져나가 가능한 모델이지만, 미생물을 발효시키는 발효조(fermenter)는 외부 미생물 오염을 방지하기 위해 설계된 폐쇄계(closed system)이므로 외부에서 공급된 열 에너지를 방출하는데 시간이 오래 걸려 이 시간 내에 유지된 열로 인해 발효 미생물 사멸이 발생되어 정상적인 생균제 배양생산이 어렵게 된다. 보다 상세하게는 발효조 외부 자켓에서 물에 의해 내부 배지온도를 제어하고 있어 상승된 내부 배지를 하강시키는데 1시간 이상 소요가 되어 발효시키는 유산균이 모두 사멸할 수 있어 산업용으로 적용할 수 없다. 또한, 유산균 사멸 수준을 감소시키기 위하여 약한 강도의 스트레스원을 통해 샤페론을 유발시킬 경우, 샤페론의 발현 유도에 한계를 나타내기 때문에 샤페론의 발현 유도를 통한 유산균의 안정성 향상 효과를 기대하기 어렵다.
이외에도 알코올과 같은 유기용매를 이용한 충격 (solvent shock)를 통해 샤페론의 발현을 유도하는 연구도 보고되었으나, 이 역시 유기용매가 미생물의 생존과 관련된 중요 단백질 구성성분의 변성을 야기시켜 비가역적인 단백질 변성이 미생물 사멸을 유도하고 이로 인한 생산성 저하와 유기용매 잔류 문제로 산업적 적용에 어려움이 있다.
본 발명에서는 종래의 기술적 한계로 지적되어온 폐쇄계로 분류되는 대용량 발효조에서 용암해수를 배양용수로서 사용하고, 고농도의 당 포함 배지로의 치환을 통해 HtrA 샤페론의 발현을 유도하면서 유산균의 생균 생산성이 떨어지지 않게 대량생산 방법을 최초로 제시하였으며, 나아가서 유도된 HtrA 샤페론 프로바이오틱스가 치료 목적의 파마바이오틱스로의 솔루션으로의 가능성을 질환동물모델에서 입증하였는데, 보다 상세하게는 유산균을 용암해수를 배양 용수로 사용하여 배양한 후 고농도의 당을 스트레스 원으로 유산균 발효과정에 노출시켜 HtrA 샤페론의 발현을 유발시켜 섭취안정성과 관련된 내산성, 내담즙산성을 확보하고 장 점막부착능과 균대균의 경쟁적 배제에 중요한 길항물질에 해당하는 알코올 류에 저항성을 갖는 특징을 갖게 하여 궁극적으로 하나의 유산균을 가지고도 염증성 장질환을 치료하고 나아가 장내 마이크로바이옴의 변화를 유도할 수 있는 차세대 샤페론 기반 파마바이오틱스 설계법을 도출하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-2188020호 (발명의 명칭: 락토바실러스 파라카제이 균주 및 그 용도, 출원인 : 고바이오랩(주), 등록일: 2020년12월01일)
Foucaud-Scheunemann C, Poquet I. (2003) HtrA is a key factor in the response to specific stress conditions in Lactococcus lactis. FEMS Microbiol Lett. 224(1):53-59. Mustapha M, Mohd A B, Synan F A, Khaled A E, Reyad S O, Tareq M O, Anas A A, Mark S T, Nagendra P S, Mutamed M A. (2020) Updates on understanding of probiotic lactic acid bacteria responses to environmental stresses and highlights on proteomic analyses. Compr Rev Food Sci Food Saf. 19(3), 1110-1124.
본 발명의 목적은 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다. 즉, 본 발명을 통해 위장관 생존율이 향상되고 장 점막 부착능이 우수하며, 알코올성 길항물질에 대한 저항성이 향상되어 장 마이크로바이옴 조절 기능이 뛰어난 염증성 장질환 치료제와 같은 파마바이오틱스의 특성을 갖는 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제공이 가능하다.
본 발명은 HtrA(high temperature requirement A) 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법에 관한 것이다.
보다 바람직하게는, 상기 제조방법은,
(제1단계) 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 이용하여 제조된 유산균 배양용 배지를 준비하는 단계;
(제2단계) 상기 유산균 배양용 배지에 유산균을 접종하고 배양하여 1차-HtrA 샤페론 프로바이오틱스가 포함된 배양액을 얻는 단계; 및,
(제3단계) 상기 배양액을 원심분리하여 얻은 1차 HtrA 샤페론 프로바이오틱스를 당이 포함된 배지로 치환 후 배양하여 2차-HtrA 샤페론 파마바이오틱스를 제조하는 단계;
를 포함할 수 있다.
상기 유산균 배양용 배지는 포도당, 효모추출물, 소이펩톤 및 카제인이 포함되고, 상기 구성성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 유산균 배양용 배지일 수 있다. 상기 배지는 총 부피 1ℓ 기준, 포도당 1~5%(w/v), 효모추출물 0.5~5%(w/v), 소이페톤 0.5~5%(w/v), 카제인 0.5~3%(w/v)가 되도록 각 성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 유산균 배양용 배지일 수 있다. 상기 배지 멸균은 121~123℃에서 30~60분간 수행하는 것이 좋다.
본 발명에서 프로바이오틱스를 고농도의 당을 포함하는 배지에서 배양할 경우, HtrA 샤페론의 발현 증강 효과를 더 현저하게 높일 수 있도록, 포도당, 과당, 수크로스, 말토오스, 트레할로스 중 단독 또는 2종 이상 혼합물을 사용할 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 락토코커스 속 (Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.), 페디오코커스 속 (Pediococcus sp.) 및 바이셀라 속 (Weissella sp.)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 당 첨가 농도는 10 g/L 내지 100 g/L인 것이 좋으며, 상기 당은 수크로스와 트레할로스의 혼합물인 것이 더 좋으며 그 혼합 중량비는 트레할로스의 함량이 20 내지 50 % (w/w)인 것이 바람직하다. 상기 당 첨가 후 배양 과정은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 15분에서 2시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 제조된 HtrA 샤페론 프로바이오틱스는 동결건조하는 것이 바람직하다. 동결건조를 위해, 동결보호제 및 코팅제를 처리할 수 있는데, 상기 동결보호제는 탈지분유, 콩가루, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스코르빈산 및 효모 추출물로부터 1종 이상이 선택될 수 있다. 동결 보호제는 향, 식감 등의 변화나 제품 생산 비용 등을 고려하여 적절히 조합하여 사용하는 것이 가능하다. 상기 코팅제는 키토산(chitosan), 말토덱스트린(malto-dextrin), 난소화성 덱스트린(indigestible dextrin), 잔탄검(xanthan gum, XG), 구아검(guar gum, GG), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrroridone, PVP), 카보폴(carbopol), 소듐알기네이트(sodium alginate), 프로필렌글리콜 알기네이트(propylene glycol alginate), 알지네이트(alginate), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴(triacetin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyl triethyl citrate) 및 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)로부터 1종 이상이 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물로 제공가능하다. 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명은 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법 및 이를 통해 제조된 장 마이크로바이옴 조절 효능이 있는 염증성 장질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 유산균의 용암해수 기반 배양을 통해 배양 중 HtrA 샤페론의 발현을 유도하여 장관 안정성 지표인 내산성 및 내담즙성이 현저히 증가시키며 고농도 당 함유 배지 치환을 통해 HtrA 샤페론의 발현을 더욱 강화하여 장 점막 부착능 및 알코올성 길항물질에 대한 저항성을 현저히 향상시키는 프로바이오틱스 제조방법과 상기 방법에 의해 제조된 HtrA 샤페론 프로바이오틱스를 제공한다. 종래의 연구에서는 유산균의 샤페론을 유도시키기 위해서 저온, 고온, 고농도의 염 또는 유기용매 처리 등 고강도의 충격(shock)을 단시간 가하는 방법을 사용함으로써 미생물 사멸로 인한 생산성 저하 및 유기용매 잔존 등의 문제로 산업적인 적용에 한계점이 존재하는 반면, 본 발명을 통해 유산균의 배양 과정 중에 HtrA 샤페론의 발현을 유도하여 외부환경적 스트레스에 대한 저항성을 향상시켜 생균 단일제로서 유산균을 이용하여 염증성 장질환을 치료하고 나아가 장내 마이크로바이옴의 변화를 유도할 수 있는 차세대 샤페론 기반 파마바이오틱스 제제의 개발이 가능하다.
도 1은 HtrA 샤페론 유도용 고농도 당 배지 치환 시, 첨가된 당 종류에 따른 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 HtrA 샤페론 발현 수준 변화 및 균체량의 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 HtrA 샤페론 유도용 고농도 당 배지 치환 시, 수크로스 농도에 따른 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 HtrA 샤페론 발현 수준 변화 및 균체량의 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 HtrA 샤페론 유도용 고농도 당 배지 치환 시, 트레할로오스 농도에 따른 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 HtrA 샤페론 발현 수준 변화 및 균체량의 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 HtrA 샤페론 유도용 고농도 당 배지 치환 시, 첨가된 수크로스와 트레할로스 혼합물에서 무게 기준 트레할로스의 혼합비에 따른 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 HtrA 샤페론 발현 수준 변화 및 균체량의 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법에 대한 모식도이다.
도 6은 염증성 장 질환(IBD) 쥐 모델에서의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취에 의한 대장 수축 완화 결과이다.
도 7은 염증성 장 질환(IBD) 쥐 모델에서의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취에 의한 대장 길이 변화 및 myeloperoxidase(MPO) 활성 변화 결과이다.
도 8은 염증성 장 질환(IBD) 쥐 모델에서의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취에 의한 대장의 염증성-비염증성 사이토카인 발현 변화 결과이다.
도 9는 염증성 장 질환(IBD) 쥐 모델에서의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취에 의한 장 마이크로바이옴 변화의 α-다양성 수치 결과이다.
도 10은 염증성 장 질환(IBD) 쥐 모델에서의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취에 의한 장 마이크로바이옴 변화의 β-다양성 수치 결과이다.
도 11은 염증성 장 질환(IBD) 쥐 모델에서의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취에 의한 장 마이크로바이옴 변화와 대장 사이토카인 발현 변화 간의 상관관계에 대한 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 제조예 1. 유산균의 기본 배지 제조 및 배양방법>
본 발명에서 유산균을 배양하기 위한 기본배지로서 Lactobacilli MRS Broth(BD)를 상수를 이용하여 제조하였으며, 121℃, 15분간 멸균하였다. 이렇게 멸균된 기본배지에 유산균 종배양액을 발효조의 멸균배지에 접종하고 100rpm, 37℃ 조건으로 20시간 동안 배양하였다. 그 후, 13,000 rpm, 4℃로 10분동안 원심분리하였으며, 상등액 제거 후 동량의 PBS(phosphate buffered saline, 인산완충용액)를 넣고 현탁하여 시료로 사용하였다.
* 유산균 종배양액: 락토바실러스 람노서스 균주를 Lactobacilli MRS Broth(BD)에서 37℃ 조건에서 24시간 배양한 것, 이하 유산균 종배양액이라 함은 이를 말함.
<실시예 1. 용암해수를 이용한 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조>
파마바이오틱스 내 HtrA 샤페론 발현 향상을 유도하기 위하여 용암해수 30%(v/v)가 포함된 물을 배양 용수로 준비하고, 제조예 1에서 이용한 기본 배지 제조 조건에서 상수 대신 사용하였다. 제조된 배지는 멸균 후, 유산균 종배양액을 접종하고 100rpm, 37℃ 조건으로 20시간 동안 배양하였다. 그 후, 13,000 rpm, 4℃로 10분동안 원심분리하였으며, 상등액 제거 후 동량의 PBS(phosphate buffered saline, 인산완충용액)를 넣고 현탁하여 시료로 사용하였다.
<실시예 2. 용암해수 배양 후 고함량 당 추가 배양을 이용한 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조>
용암해수 30%(v/v)가 포함된 물을 이용하여 유산균을 배양한 후 고농도의 당을 기반으로 하는 서스펜션 배지로 치환하여 더 높은 수준의 삼투스트레스를 통해 HtrA 샤페론의 발현을 유도하였다. 보다 상세하게는 실시예 1에서 같이 용암해수 30%(v/v)가 포함된 물을 배양용수로 사용하여 유산균 종배양액을 접종하고 100rpm, 37℃ 조건으로 20시간 동안 배양하였다. 이후 균체를 농축하고, 여기에 포도당, 글리세롤, 말토오스, 수크로스, 트레할로스를 포함하는 5종의 당류를 각각 30 g/L가 되도록 첨가하고 100rpm, 37℃ 조건으로 30분 동안 배양하였다. 그 후, 13,000 rpm, 4℃로 10분 동안 원심분리하였으며, 상등액 제거 후 동량의 PBS buffer를 넣고 현탁하여 이후 실험에 사용하였다. 또는 이 외에 각 당류로서 수크로오스 등을 0-100 g/L 농도 범위로 첨가하거나 트레할로오스와 수크로오스의 혼합 조건 등의 복합 당류 배양 조건 등을 다양하게 실험하였다.
<실험예 1. 생균수 확인>
제조예 1과 실시예 1의 배양액을 희석하여 페트리디쉬(petridish)에 1 ml 분주하고 멸균된 MRS agar(BD)배지 20 ml을 가하여 굳혔다. 37℃ 정치배양기에서 48시간 배양된 페트리디쉬의 콜로니를 개수하여 생균수를 확인하였다. [표 1]의 결과에 따르면 실시예 1의 용암해수를 이용하여 배양된 유산균이 대조군인 제조예 1에 비해 생균수의 감소가 일어나지 않는 것을 확인할 수 있다.
배양 완료 후 생균수 (CFU/ml)
제조예 1 1.10 x 108
실시예 1 1.35 x 108
< 실험예 2. HtrA 샤페론 발현양 확인>
용암해수 기반의 배양이 HtrA 샤페론의 mRNA 발현 수준에 미치는 효과를 확인하기 위하여 실시간 정량 PCR (real time quantitative PCR)을 수행하였다. 이를 위하여, 현탁액 1 ml을 5분 동안 13,000 rpm, 4℃로 원심분리하였고 상기 원심분리한 것은 RNeasy 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 총 RNA를 추출하였다. 추출한 총 RNA는 50 μl의 RNase-free water에 현탁시켰고, 상기 현탁시킨 용액의 RNA 농도는 ND-1000 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 확인하였다. HtrA 샤페론의 유전자(htrA)에 특이적인 프라이머와 대조군 gyrA 유전자의 프라이머는 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 디자인하였으며 (GenScript, Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool), 각 유전자에 대한 프라이머로는 하기 [표 2]에 나타낸 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머쌍을 사용하였다.
프라이머 서열 서열 번호
htrA 정방향 5’-CCGGAACGACCAAGATTTCC-3’ 1
역방향 5’-AAAGTATCCAGCCCATCGCT-3’ 2
gyrA 정방향 5’-GGTCTGATTGCGCTCAACTT-3’ 3
역방향 5’-ACCCATTGACCGAACATCCT-3’ 4
cDNA의 합성은 1 μg 총 RNA와 cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 이용하여 합성하였다. SYBR 그린계 정량 PCR 증폭은 2 μl의 cDNA와 10 p㏖의 프라이머를 SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)와 혼합한 후, CFX Connect Real-Time system(Bio-Rad)을 이용하여 수행하였다. PCR 프로그램은 다음과 같다. 95℃에서 3분간 유지한 후, 95℃에서 10초 및 55℃에서 30초를 40회 반복 수행하였다. 이후, 95℃에서 1분, 55℃에서 30초 및 95℃에서 30초간 유지하여 생성된 PCR 산물의 온도 해리 곡선(Melting curves)을 작성하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, PCR 데이터는 2-△△Ct 방법에 따라 분석하였다(Livak and Schmittgen, 2001). 이때, 제조예 1에 의해 배양된 유산균의 HtrA 샤페론의 발현 수준을 대조군으로 사용하였고, gyrA-normalized 2-△△Ct 데이터를 비교하여 차이를 확인하였다. 그 결과, [표 3]에서와 같이 대조군인 제조예 1에서는 HtrA 샤페론의 발현이 확인되지 않았으나 용암해수를 이용하여 배양 중 염삼투 스트레스를 유발한 경우, 균체 생성량의 감소 없이 HtrA 샤페론의 mRNA의 발현이 유도됨을 확인하였다.
분류 HtrA 샤페론 발현 여부**
제조예 1 -
실시예 1 +
-: HtrA 샤페론 미발현, +: HtrA 샤페론 발현 확인
< 실험예 3. 고농도 당 배지 치환에 따른 HtrA 샤페론 발현 확인>
실시예 2에서 수행한 다양한 고농도 당 배지 치환 조건에 따른 HtrA 샤페론 발현양을 확인하였다. 용암해수 배양 후, 고농도의 당을 기반으로 하는 서스펜션 배지(suspension media)로 치환하여 높은 수준의 삼투 스트레스를 통해 HtrA 샤페론의 발현을 유도한 조건에서의 각 실시간 정량 PCR (real time quantitative PCR)을 수행하였다. PCR 조건은 실험예 2와 동일하게 하였다.
그 결과, [표 4]과 [도 1]에서와 같이 고농도로 치환해주는 당의 종류에 따라 HtrA 샤페론의 발현 유도에 차이를 보였다. 갈락토스, 자일로스, 만노오스, 락토오스, 글리세롤 등을 첨가하였을 경우, 실시예 1의 용암해수 배양 유산균 대비 HtrA 샤페론의 발현 향상이 확인되지 않았으나, 포도당, 과당, 수크로스, 말토오스, 트레할로스와 같은 특정 당의 고농도 서스펜션 배지로 치환하여 배양된 유산균의 경우, HtrA 샤페론 발현이 높은 수준으로 유도됨을 확인하였다. 바람직하게는 수크로스를 첨가하였을 때 가장 높은 발현율을 보였다. 이를 통해 HtrA 샤페론 유도용 고농도 당 배지 치환을 통해 HtrA 샤페론 발현 수준이 상당히 강화되는 것을 확인하였다.
분류 HtrA 샤페론 발현 여부**
실시예 1 용암해수 배양 +
단당류 포도당 ++
과당 ++
갈락토오스 +
자일로스 +
만노오스 +
이당류 수크로스 +++
말토오스 ++
락토오스 +
트레할로스 +++
기타 글리세롤 +
** +: HtrA 샤페론 발현 유도 확인 및 실시예 1과 유사한 발현 수준, ++: 실시예 1 대비 HtrA 샤페론 발현 30% 이상 향상, +++: 실시예 1 대비 HtrA 샤페론 발현 60% 이상 향상
다음으로, 실시예 2에서 수행한 다양한 고농도 당 배지 치환 조건에 따른 HtrA 샤페론 발현 유도가 다른 유산균에도 적용되는지 확인하고자 락토바실러스 플랜타룸을 포함한 4종의 유산균주를 각각 배양하고, 이에 대한 HtrA 발현 유도 여부를 확인하기 위해 실시간 정량 PCR (real time quantitative PCR)을 수행하였다. 그 결과 [표 5]에서와 같이 실험에 이용한 모든 균주에서 HtrA 단백질의 발현이 유도됨을 확인할 수 있었다.
분류 균주 HtrA 샤페론 발현 여부**
제조예 1 락토바실러스 플랜타룸 -
락토바실러스 퍼멘텀 -
락토바실러스 파라카제이 -
락토코커스 락티스 -
실시예 1 락토바실러스 플랜타룸 +
락토바실러스 퍼멘텀 +
락토바실러스 파라카제이 +
락토코커스 락티스 +
실시예 2 락토바실러스 플랜타룸 +++
락토바실러스 퍼멘텀 ++
락토바실러스 파라카제이 ++
락토코커스 락티스 +++
** -: HtrA 샤페론 미발현, +: HtrA 샤페론 발현 유도 확인, ++: 실시예 1 대비 HtrA 샤페론 발현 30% 이상 향상, +++: 실시예 1 대비 HtrA 샤페론 발현 60% 이상 향상
< 실험예 4. 수크로스 및 트레할로스 농도에 따른 HtrA 샤페론 발현 수준>
HtrA 발현이 높은 수준으로 유도되었던 수크로스와 트레할로스의 최적 농도를 확인하고자 배양액을 농축한 후 농축액 대비 수크로스 및 트레할로스를 농도별로 처리한 후, HtrA 발현 수준을 비교하였다.
수크로스와 트레할로오스를 최대 100 g/L 농도 범위로 첨가하여 HtrA 발현 수준과 생균수를 비교한 결과, 50 g/L까지 늘려 첨가한 경우 HtrA 샤페론의 발현이 높은 수준으로 유도되며 생균수에 큰 차이가 없는 반면, 100 g/L 첨가 시, 균체량 및 HtrA 샤페론 발현과 생균수가 소폭 감소하는 것을 확인할 수 있었다[도 2 및 도 3].
이를 통해 HtrA 샤페론의 발현 유도를 위해 당 첨가량이 증가한다고 하여 무조건 샤페론 발현 수준이 증가하지 않으며, 균체 생성량에도 영향을 미친다는 것을 확인하였다.
<실험예 5. 복합당 사용에 따른 HtrA 샤페론 발현 수준>
높은 수준의 HtrA 샤페론 발현을 유도하는 일반당인 수크로스와 특수당인 트레할로스의 혼합물을 발현 HtrA 샤페론 발현 유도용 복합당으로 사용하였을 때, 이에 따른 영향을 알아보기 위해 트레할로스를 혼합 비율별로 첨가하여 HtrA 샤페론 발현 유도 수준을 비교하였다.
트레할로스는 포도당 2분자가 결합된 이탄당으로 세포가 다양한 스트레스원으로부터 공격을 받을 때 세포 보호를 위해 자체적으로 생산되는 물질로 알려졌으며, 세포 내 단백질의 분해와 변성을 막는 역할을 하는 것으로 보고되고 있어 수크로스와 트레할로스의 혼합물을 HtrA 샤페론 발현 유도용 복합당으로 이용하고, HtrA 샤페론의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다 (Jain and Roy, 2009).
이를 위하여 50 g/L의 수크로스와 트레할로스 혼합물을 제조하여 HtrA 발현 유도용 고농도 당 치환 배지로 이용하였으며, 이때 트레할로스 첨가 비율을 0 내지 100중량%로 하였다.
[도 4]에 따르면 트레할로스를 당류 총 무게 기준 50중량% 까지 증가시켜 혼합한 복합당 배지로 치환하였을 때, HtrA 샤페론 발현 수준이 향상되는 것을 확인하였으며, 20중량%(수크로스:트레할로스=4:1(w:w))로 혼합한 복합당 배지로 치환하였을 때, 가장 높은 HtrA 샤페론 발현 수준을 보였다. 50중량%를 초과하여 트레할로스의 혼합 비율이 증가시킨 경우, HtrA 샤페론의 발현 수준은 각 당을 단독으로 사용하였을 경우보다 증가하지 않았다. 이를 통해 고농도 당 치환배지 제조 시, 수크로스와 트레할로스를 단독으로 사용하는 경우보다 트레할로스를 일정 비율로 첨가하였을 때, HtrA 샤페론의 발현이 높은 수준으로 유도됨을 확인하였다.
따라서, 이후 섭취 및 장내 안정성 평가 실험에서는 HtrA 샤페론 단백질 발현에 최적화된 배양 조건인 무게 기준 4:1(w:w)로 혼합한 수크로스 및 트레할로스 50 g/L 첨가군을 HtrA 샤페론 프로바이오틱스로서 사용하였다.
<실험예 6. HtrA 프로바이오틱스의 섭취 안정성 향상>
유산균은 경구로 섭취된 이후 장에 정착하여 약효를 나타내기 전 인체 내에서 다양한 스트레스 요인에 노출되는데 HtrA 샤페론 발현 유도용 고농도 당 배지 치환 및 배양을 통한 HtrA 샤페론 발현을 유도하고 이에 따른 생존율의 변화를 평가하였다.
실험예 6-1. 내산성 평가
유산균은 섭취 후 위산에 노출되는데 이와 유사한 시험관 환경을 조성하고, 고농도 당 배지 치환 후 배양을 통해 유도된 HtrA 샤페론 발현 유도에 따른 생존율을 비교하여 내산성을 평가하였다. 보다 상세하게는 염산을 사용하여 Lactobacilli MRS broth(BD) 100 ml의 pH를 3.0으로 조절 후 멸균하고, 멸균된 MRS broth 100 ml에 펩신(Sigma P7000, 250 Units/mg) 0.4g을 혼합하여 인공위액 배지를 제조하였다. 제조한 인공위액 배지 100 ml에 제조예 1, 실시예 2를 통해 제조된 분무건조 전의 유산균 배양액을 각각 100배 희석하여 혼합하였다. 초기 생균수를 확인을 위하여 각 혼합액을 즉시 취하여 생리식염수로 희석 후 희석액을 페트리디쉬에 1 ml 분주하고 멸균된 MRS agar(BD)배지 20 ml을 가하여 굳혔다. 37℃ 정치배양기에서 48시간 배양된 페트리디쉬의 콜로니를 개수하였다. 이 후, 각 혼합액을 37℃, 2시간동안 인공위액에 노출시킨 후 노출된 혼합액을 취하여 생리식염수로 희석 후 희석액을 페트리디쉬에 1 ml 분주하고 멸균된 MRS(BD)배지 20 ml을 가하여 굳혔다. 37℃ 정치배양기에서 48시간 배양된 페트리디쉬의 콜로니를 개수하여 생균수를 확인하였다. 각 결과는 하기의 [표 6]에 나타내었다.
구분 내산성
초기 (CFU/ml) 배양후 (CFU/ml) 생존율 (%)
제조예 1 1.10x108 2.31x107 15
실시예 1 1.35x108 4.46x107 33
실시예 2 1.67x108 9.18x107 55
[표 6]의 결과에 따르면, 실시예 1과 실시예 2의 HtrA 샤페론 발현이 유도된 용암해수 배양된 유산균과 용암해수 배양 및 고농도 당 배지 치환을 통해 배양된 유산균이 제조예 1에 비해 내산성이 매우 우수함을 알 수 있다(실시예 2에서 약 55%의 생존율 확인, 제조예 1과 비교하여 40% 증가).
실험예 6-2. 내담즙성 평가
HtrA 샤페론이 발현된 유산균을 섭취한 후 노출되는 담즙산과 유사한 시험관 환경을 조성하여 담즙산에 대한 내성을 평가하였다. 멸균된 Lactobacilli MRS broth(BD) 100 ml에 제균된 oxgall 용액 0.3 ml을 혼합하여 인공담즙액 배지를 제조하였다. 이후 제조한 인공담즙액 배지 100 ml에 제조예 1, 실시예 2에 의해 배양된 유산균을 1%(v/v) 접종하고, 5시간 담즙산에 노출시킨 후의 생존율을 확인하였으며, 이를 [표 7]에 나타내었다.
구분 내담즙성
초기 (CFU/ml) 배양후 (CFU/ml) 생존율 (%)
제조예 1 1.03x108 1.34x108 130
실시예 1 1.15x108 2.07x108 180
실시예 2 1.29x108 3.03x108 235
그 결과, 실시예 2에 의해 배양되어 HtrA 샤페론의 발현이 유도된 유산균이 제조예 1에 비해 내담즙성이 105% 향상됨을 확인할 수 있다.
<실험예 7. HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 장내 안정성 평가>
실험예 7-1. 세포 소수성 및 뮤신 부착성 평가
유산균 세포표면은 장 점막과의 상호작용이 용이하도록 균주별로 상이한 극성(polarity)을 띄고 있다. 일반적으로 장 점막세포가 소수성(hydrophobicity)을 나타내기 때문에 이와 반응결합력이 좋으려면 유산균 세포표면이 높은 소수성을 나타내야 한다. 보다 상세하게는 유산균의 소수성 향상은 장 점막 세포인 소수성 특징을 갖는 뮤신과의 반응성에 영향을 미쳐 장 부착능을 증가시키는 역할을 한다. 따라서 HtrA 샤페론의 발현 유도가 유산균의 소수성에 미치는 영향과 이에 따른 뮤신 부착성의 변화를 평가하고자 하였다. 제조예 1 및 실시예 2를 통해 확보된 시료를 PBS로 O.D600nm=0.5±0.02에 맞춰 희석하였다. 이후, 희석액 3 ml과 용매(Xylene) 1 ml을 고르게 현탁한 후, 상온에서 30분간 정치시켰다. 정치 후, 정치액의 water 부분을 채취하여 측정한 O.D(optical density, 흡광도)값을 바탕으로 소수성(hydrophobicity)을 계산하여 [표 8]에 나타내었다. 그 결과 실시예 2에 의해 제조된 HtrA 샤페론의 발현이 유도된 프로바이오틱스가 제조예 1에 비해 소수성이 약 50% 향상된 결과를 나타냈다.
세포 표면 소수성 계산식
세포 표면 소수성(hydrophobicity)(%) = (1-(30분 후 흡광도값 / 초기 흡광도값)) x 100
구분 소수성 (%)
제조예 1 33
실시예 1 51
실시예 2 83
세포 표면 소수성이 향상된 HtrA 샤페론 파마바이오틱스의 뮤신 부착능을 평가하기 위하여 하기 실험을 진행하였다. Immunoplate(Nunc)의 well에 10 mg/ml mucin solution을 200 μl씩 분주하고 4℃에서 18시간 이상 반응하여 mucin을 well에 부착시켰다. 각 well의 mucin solution을 제거하고, PBS 200 μl씩 분주하여 1회 washing 하였다. 제조예 1, 실시예 2의 현탁액 100 μl를 미리 제조한 각 mucin well에 분주하고 37℃, 2시간 동안 정치시켰다. Well의 상등액을 제거하고, mucin에 부착하지 않은 균체를 PBS 200 μl로 5 회 washing 하여 제거하였다. 0.1% Triton X-100를 100 μl씩 분주하고 뚜껑을 덮어 1,000 rpm, 20분간 자동 교반하였다. 교반이 완료된 well로부터 pipetting하여 mucin에 부착된 균체를 회수하였다. 회수액을 0.85%(w/v) NaCl 수용액으로 serial dilution하여 hemocytometer로 부착된 균수를 측정하였으며, 이를 [표 9]에 나타내었다.
부착성 계산식
부착성 (%) = (부착균수)/(접종균수) x 100
상기 계산식에서 균수는 cells/ml으로 확인한다.
구분 뮤신 부착성 (%)
제조예 1 8
실시예 1 38
실시예 2 59
[표 9]의 결과를 보면, HtrA 샤페론의 발현이 유도됨에 따라 유산균의 소수성이 증가하여 소수성 표면을 갖는 뮤신에 대한 부착능이 증가하는 것으로 판단되며, 이를 통해 일반적인 방법으로 제조된 제조예 1과 비교하여 약 50% 증가함으로써 실제 면역활성을 일으키기 위한 전제조건인 뮤신 부착능이 향상되는 것을 확인할 수 있다. 선행연구에 따르면 세포막에 존재하는 HtrA 샤페론의 발현 수준은 세포 표면에 존재하는 다양한 막 단백질 발현 수준에 영향을 미치며, 특히 세포 표면 부착에 영향을 미칠 수 있는 막 단백질들이 제 기능을 할 수 있도록 적절한 단백질 접힘을 도움으로써 부착능이 향상될 수 있다고 보고되고 있다(Biswas and Biswas, 2005). 따라서, 본 발명에서 제조한 HtrA 샤페론의 발현이 유도된 유산균은 장내 면역세포의 점액질을 구성하는 상기 뮤신 부착능 향상을 통해 체내의 면역반응을 증강시킬 수 있는 가능성이 높음을 확인하였다.
실험예 7-2. 알코올 내성 평가
수많은 미생물이 공존하고 있는 장내 상황을 고려하면 미생물 간의 상호작용에 대한 연구가 매우 중요하며, 장내 위해 미생물들이 생산하는 대사산물에 대한 내성은 파마바이오틱스의 장내 정착에 큰 영향을 미치게 된다. 따라서, 균대균의 경쟁적 배제에 중요한 길항물질에 해당하는 알코올류에 대한 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 내성을 평가하였다. 에탄올 10%(v/v)가 함유된 MRS broth 100 ml에 제조예 1의 유산균 배양액 및 실시예 2의 HtrA 샤페론 발현 유도용 고농도 당 배지 치환 후 배양한 유산균 배양액을 1% 접종하였다. 초기 생균수 대비 30분 정치배양 후의 생균수를 확인하였으며, 이를 [표 10]에 나타내었다.
구분 알코올 내성
초기 (CFU/ml) 배양후 (CFU/ml) 생존율 (%)
제조예 1 1.14x108 3.64x107 32
실시예 1 1.16x108 8.12x107 70
실시예 2 1.20x108 1.32x108 110
[표 10]의 결과를 보면, HtrA 샤페론의 발현이 유도됨에 따라 알코올에 대한내성이 제조예 1에 비해 약 70% 이상 향상되는 결과를 나타내며, 이는 상재균총이 분비하여 외래 균주를 장 점막 부착에서 배제시키는데 사용하는 알코올성 길항물질에 대한 유산균의 저항성이 개선됨을 확인할 수 있고 궁극적으로는 치료제로서의 가능성을 향상시켰다.
<실험예 8. HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 대량생산>
HtrA 샤페론의 발현 유도한 배양 공정이 폐쇄시스템인 발효조를 통한 대량생산 공정에 적용 가능 여부를 알아보기 위하여 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 대량생산 공정을 진행하였다[도 5]. 생산규모는 3 ton 발효탱크에서 37℃에서 16시간 이상 배양을 하였다.
이를 위한 기본 배지로서 1L 당 포도당 3%(w/v), 효모추출물 2%(w/v), 소이펩톤 2%(w/v), 카제인 1%(w/v)가 되도록 각 성분을 각 성분을 용암해수가 30%(v/v) 함유된 물에 용해하여 121℃, 30분간 멸균하였다. 이렇게 멸균된 배지에 유산균 종배양액을 발효조의 멸균 배지에 접종하고 배양하되, 40%(w/v) 포도당 및 40%(w/v) 수산화나트륨이 동량으로 혼합된 수용액을 일정한 시간 간격으로 점적하면서 pH를 6.0~7.5로 유지하며 배양하였다. 상기 조건의 배양액을 원심분리하여 균체를 농축하였으며 포도당 또는 4:1의 비율로 혼합된 수크로스 및 트레할로스 혼합물을 50 g/L 첨가하여 교반기로 50 rpm, 60분간 배양하여 HtrA 샤페론의 발현을 유도하였다. 이후 회수된 약 100 kg의 프로바이오틱스 50 중량%, 히드록시프로필메틸셀루로오스 40 중량%(건조물 상태의 중량, 5배의 물에 용해된 상태)를 80 rpm, 20분간 교반하고 이어서 동결보호제 10 중량%를 혼합 후 동결건조하여 건조된 분말을 확보하였다. 이때, 동결보호제는 탈지분유를 사용하였다. 대조군인 HtrA 비활성 프로바이오틱스는 배양용수로 상수를 사용하여 통상적인 유산균 유가 배양 공정에 따라 조제하였다.
대량생산된 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 HtrA 샤페론 발현 유도 여부를 확인하기 위하여 실험예 2에서와 같은 조건으로 실시간 정량 PCR (real time quantitative PCR)을 수행하였다. 그 결과, [표 11]에서와 같이 대량 생산으로 이루어진 HtrA 샤페론의 발현 유도를 위해 고농도의 당 배지 치환된 HtrA 샤페론 프로바이오틱스에서도 원료 균체수에 감소없이 HtrA 샤페론 발현이 유도됨을 알 수 있으며, 이를 통해 고농도 당 배지 치환 기반 배양 공정이 실험실에서뿐만 아니라 산업용으로 적용 가능함을 확인할 수 있다.
분류 원료 생균수 (CFU/g) HtrA 샤페론 발현 여부***
HtrA 샤페론 비활성 프로바이오틱스 3.3x109 -
HtrA 샤페론 프로바이오틱스 2.7x1011 +
***-: HtrA 샤페론 미발현, +: HtrA 샤페론 발현 확인
한편, 대량생산된 프로바이오틱스의 동결건조시 동결보호제로서 탈지분유 대신 콩가루, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스코르빈산 및 효모 추출물로부터 1종을 선택하여 사용하였을 때도 이와 유사한 원료 생균수와 HtrA 샤페론 발현 정도를 확인하였다.
<실험예 9. HtrA 샤페론 파마바이오틱스의 염증성 장질환(IBD)에서의 치료 효과>
파마바이오틱스 특성을 갖는 HtrA 샤페론 프로바이오틱스인 HtrA 샤페론 파마바이오틱스로서 염증성 장질환(IBD)에서의 치료 효과를 확인하기 위하여 다음 실험을 진행하였다.
마우스를 5개 그룹으로 나누어 건강한 마우스 1개군에는 생리식염수를, 나머지 4개군은 장내 염증을 유발시키는 병원성균주인 Klebsiella oxytoca를 109 CFU씩을 하루 한 번씩 5일간 경구 투여하여 대장염을 유발시켰다. K. oxytoca의 경구투여로 대장염이 유발된 마우스 4개 그룹에 각각 생리식염수, Sulfasalazine 50mg/kg, 실시예 2의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 저농도 처리군 (1x108 CFU), 실시예 2의 HtrA 샤페론 파마바이오틱스 고농도 처리군 (1x109 CFU)를 하루 한 번씩 14 일 동안 경구 투여하였다.
실험동물을 희생시켜 대장 조직을 분리하여 길이를 측정한 후, 차가운RIPA lysis buffer에 균질화여 10,000 x g에서 10분간 원심분리하고 상등액을 조효소액으로써 사용하였다. 과산화수소와 tetramethylbenzidine이 함유된 반응액에 조효소액을 처리하여 반응시킨 후 650 nm에서 흡광도를 측정하여 myeloperoxidase 활성을 측정하였다.
염증성 사이토카인의 발현을 확인하기 위하여 RIPA lysis buffer에 균질화한 대장 조직 현탁액 일부를 단백질분해효소 inhibitor 처리한 후 원심분리하고 상등액을 얻었다. ELISA kit(Ebioscience)를 사용하여 사이토카인 TNF-α, IL-10의 발현을 확인하였다.
그 결과, [도 6]과 [도 7]에서와 같이, K. oxytoca 투여에 의한 대장염 유발군(음성대조군)에서 수축된 대장 조직의 길이가 실시예 2-저농도, 실시예 2-고농도 투여시 각각 대장염 치료제 Sulfasalazine 섭취군(양성대조군) 수준으로 회복되었다. 또한, [도 7]에서와 같이 염증성 대장염의 지표인 호중구의 과립에서 주로 발견되는 myeloperoxidase (MPO) 활성이 음성대조군에서 정상군 대비 2배 이상 증가하였으나, 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 저농도, 고농도 처리군의 결과에서 양성대조군과 함께 정상군 수준까지 염증성 효소 활성을 낮추었다.
특히, 염증성 지표로써 사이토카인 TNF-α의 발현량은 실시예 2-저농도, 실시예 2-고농도 처리군에서 음성대조군 대비 정상군 수준까지 감소한 반면, 항염증성 사이토카인 IL-10의 발현은 오히려 증가하였다. 또한, [도 8]에서와 같이 음성대조군은 TNF-α 대비 IL-10의 발현량이 정상군 대비 크게 감소하였으나, 양성대조군과 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 저농도, 고농도 처리군은 감소된 발현비율이 회복되어 정상군 수준까지 증가하였고, 특히 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 고농도 처리군에서 정상군보다 높은 발현비율을 보였다. 해당 결과를 통해 K. oxytoca 투여에 의해 유발된 염증성 대장염 증상은 실시예 2-저농도, 실시예 2-고농도 투여를 통하여 염증성 효소활성 및 염증성 사이토카인의 발현비율을 조절함으로써 완화됨을 확인할 수 있었다.
<실험예 10. HtrA 샤페론 파마바이오틱스 단일제의 장 마이크로바이옴 조절 효과>
C57BL/6 대장염 모델 마우스가 분비한 분변을 HtrA 샤페론 파마바이오틱스의 섭취전(0일차)과 섭취후(14일차)에 각각 회수하여 장 마이크로바이옴 변화를 확인하였다. 마우스 분변을 QIAamp DNA stool mini kit, QIAGEN 社)로 세균 DNA를 추출하고, 세균 16S rRNA 유전자의 V4 barcoded 프라이머를 사용하여 앰플리콘을 제작하였다. Illumina iSeq 100 장비를 사용하여 각 앰플리콘을 시퀀싱하였다. 증폭된 유전자로부터 OTUs를 기반으로 한 PIRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)의 소프트웨어를 이용하여 미생물군집의 메타 유전자분석을 시행하였다. 선형판별분석(Linear discriminant analysis, LDA)과 분지도(Cladogram) 분석은 LDA effect size(LefSe)를 사용하여 시행하였다. 사용된 프라이머 서열은 [표 12]과 같다.
프라이머 서열 서열 번호
515F 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' 5
806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' 6
이에, [도 9]와 같이 군 내의 미생물 균총 다양성 변화를 분석한 결과, K. oxytoca 섭취에 의해 정상군 대비 장 내 균총 다양성이 크게 감소하였음을 확인할 수 있었다. 그러나 감소된 다양성이 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스의 저농도와 고농도 처리군과 양성대조군에서 증가되지는 않아 α-다양성 수치에는 영향이 없었다. 한편, 군 간의 미생물균총 다양성을 비교하는 β-다양성 수치는 실시예2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취 시 증가하였다. 또한, [도 10]과 같이 정상군 대비 음성대조군에서 Verrucomicrobia 문(Phylum)의 비율이 크게 증가하고 Cyanobacteria 문과 Firmicutes 문이 감소하였으나, 양성대조군에서 정상군과 유사한 수준까지 변화되었다. 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스의 저농도와 고농도 처리군에서 대장염 모델에서 증가한 Verrucomicrobia 문이 감소하고, 감소했던 Cyanobacteria 문의 비율이 증가하여 정상군과 비슷한 구성으로 변화하였다. 미생물분류 과(Family) 수준에서 Erysipelotrichaceae는 음성대조군에서 감소경향이 있었으나, 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취군에서는 증가하였다. 분류 속(Genus) 수준에서 Muribaculaceae에 속하는 PAC001112_g와 PAC000198_g가 음성대조군에서 감소하였으나, 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 고농도 처리 시, 정상군 수준 이상으로 비율이 증가하였다. 음성대조군에서 증가경향을 보인 PAC0001068_g는 실시예2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 섭취군에서 오히려 정상군 수준으로 비율이 감소하는 경향을 보였다. 분류 종(Species) 수준에서 대장염 유발 시 PAC001070_s group은 증가, PAC001797_s는 감소하였으나, 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 처리군에서 비율이 정상군 수준과 유사하게 회복되었다. 결과적으로 K. oxytoca로 유발시킨 대장염 마우스 모델에서 실시예2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스를 섭취한 그룹은 K. oxytoca 섭취에 의해 변화된 마이크로바이옴 중 일부 상재균총을 정상군과 유사하게 비율을 회복시킨 것으로 확인되었다.
다음으로 항염증성 효과와 장 마이크로바이옴 변화 간의 상관관계를 분석하였을 때, 그 결과가 [도 11]과 같이 나타났다. 즉, 염증성 사이토카인 TNF-α에 대한 항염증성 사이토카인 IL-10의 비율(IL-10/TNF-α ratio) 변화는 미생물분류 과, 속, 종 수준에서 모두 상관관계를 나타내었다. IL-10/TNF-α ratio가 증가할수록 Erysipelotrichaceae(과), PAC001112_g(속), PAC000198_g(속), PAC001066_g(속), PAC001267_s(종), PAC001066_s(종), PAC001075_s(종), PAC001094_s(종)의 비율은 장내 미생물 균총 내에서 증가한 반면, Helicobacter(속), PAC001070_s_group(종), PAC001064_s(종)은 감소하였다. 이로써 K. oxytoca 경구섭취를 통해 유발된 대장염 마우스 모델에서 염증성 사이토카인 발현이 증가되면서 장 수축과 함께 장 내 마이크로바이옴에 변화가 유도되나, 실시예 2-HtrA 샤페론 파마바이오틱스 경구투여를 통해 장 수축 및 염증성 반응의 대장염 증상을 완화시키고 장 내 마이크로바이옴을 정상군과 유사하게 회복시킴으로써 대장염을 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이상과 같이, 본 발명에 대해 상기 제조예 및 실시예를 참조하고 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위의 기술적 사항에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (13)

  1. (제1단계) 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 이용하여 제조된 유산균 배양용 배지를 준비하는 단계;
    (제2단계) 상기 유산균 배양용 배지에 유산균을 접종하고 배양하여 1차-HtrA 샤페론 프로바이오틱스가 포함된 배양액을 얻는 단계; 및,
    (제3단계) 상기 배양액을 원심분리하여 얻은 1차-HtrA 샤페론 프로바이오틱스를 포도당, 과당, 수크로스, 말토오스, 트레할로스 중 단독 또는 2종 이상 혼합물의 10 g/L 내지 100 g/L의 고농도 당이 포함된 배지로 치환한 후 배양하여 2차-HtrA 샤페론 파마바이오틱스를 제조하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 HtrA(high temperature requirement A) 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    유산균 배양용 배지는 포도당, 효모추출물, 소이펩톤 및 카제인이 구성성분으로 포함되고, 상기 구성성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 배지인 것을 특징으로 하는 HtrA 샤페론 프로바이오틱스의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    2종의 혼합물 당으로서, 수크로스 및 트레할로스의 혼합물 당이 선택되고, 상기 혼합물 당에서 트레할로스의 비율이 총 당의 무게 기준 20 내지 50 %인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    HtrA 샤페론의 발현 유도용 고농도 당 배지로의 치환을 위해 당 첨가 후 배양이 15분에서 2시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    HtrA 샤페론의 발현 유도용 고농도 당 배지로의 치환 후 동결보호제 및 코팅제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항의 방법으로 제조하여 얻은 것을 특징으로 하는 HtrA 샤페론 프로바이오틱스.
  10. 제9항의 HtrA 샤페론 프로바이오틱스 분말을 함유하는 식품.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 식품은 배변활동 증진용 또는 면역조절용 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 식품.
  12. 제9항의 HtrA 샤페론 프로바이오틱스를 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 치료용 조성물.
  13. 제9항의 HtrA 샤페론 프로바이오틱스를 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 장질환 개선용 건강기능식품.
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