KR102206536B1

KR102206536B1 - 디코토민류 또는 베타-시토스테롤-3-o-글리코시드를 포함하는 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102206536B1
Application number: KR1020190059128A
Authority: KR
Inventors: 김수남; 김진철; 최용수; 이욱빈; 봉심규; 박상아; 박노준; 이진우
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2039-05-20
Also published as: KR20200133629A

Abstract

본 발명은 은시호 추출물로부터 분리한 화합물인 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 유효성분으로 포함하여 피부염을 예방, 개선 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 자연에서 얻어진 천연물을 유효성분으로 포함하여 인체에 적용 시 부작용이 적을 뿐만 아니라 장기간 사용으로 인한 내성이 생길 가능성이 낮다. 아울러 본 발명의 조성물은 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 유용한 약학적 조성물, 식품 및 화장료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

디코토민류 또는 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 포함하는 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating dermatitis containing dichotomines or beta-sitosterol-3-O-glycoside}

본 발명은 은시호(Gypsophila oldhamiana)로부터 분리한 화합물인 디코토민류 또는 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 유효성분으로 함유하는 피부염을 예방 또는 개선하기 위한 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 가려움증을 동반하는 만성적인 염증성 피부질환을 말한다. 유아의 경우 안면과 사지의 펼쳐지는 부분에서 시작되어 사지가 굽혀지는 부위로 특징적인 습진이 나타나는 양상이 나타나며, 소양증, 피부건조증, 피부감염의 증가 및 모공각화증 등을 보인다. 성인의 경우 관절이 접히는 부위의 피부가 두꺼워지는 태선화(lichenification)가 나타나며 유소아기에 비하여 얼굴에 습진이 생기는 경우가 많다.

'아토피 피부염'의 용어를 통상적으로 '아토피'로 축약하여 말하기도 하지만 의학적으로는 두 용어의 정의가 분명히 다르다. 아토피 질환은 아토피에 의해 임상적 증상으로 발현되는 경우를 의미하며, 아토피 피부염, 천식, 알레르기 비염, 알레르기 결막염 등의 질환이 모두 포함된다. 아토피 질환은 상호작용하면서 동시에 또는 시간차를 두고 발현되는 경향을 보이기 때문에 '알레르기 행진'이라는 특성으로 설명하기도 한다.

알레르기 행진은 어린 영아가 성장하면서 아토피 피부염, 식품 알레르기, 천식 및 알레르기 비염의 순서로 알레르기 질환을 앓게 되는 현상을 말하며, 알레르기 유발원에 대한 감작의 진행과 관련이 있다. 특히 아토피 피부염은 알레르기 행진이 일어나는 첫 번째 질환으로 인식되고 있으며, 아토피성 질환이 발생할 것임을 예측할 수 있는 지표로 이용되고 있다. 아토피 피부염 시기에 면역반응을 조절하지 않을 경우 알레르기 행진이 가속화되는 것으로 추정되며, 나아가 천식이나 비염 등을 예방하기 위해서라도 아토피 피부염의 조절이 필요하다.

아토피 피부염은 임상 증상이 다양하게 나타나 발병의 원인이 어느 한 가지로만 설명될 수는 없으나 환경적 요인, 유전적 요인 및 면역학적 반응 등이 주요 원인으로 여겨지고 있다. 환경적인 요인으로는 산업화로 인한 환경 공해, 식품첨가물 사용의 증가, 실내 온도 상승으로 인한 집먼지 진드기 등 알레르기를 일으키는 원인의 증가 등이 있다. 국내의 연구에 의하면, 아토피 피부염의 발생률은 부모 모두 아토피 질환이 있는 경우 41.7%, 부모 모두 알레르기 병력이 없을 경우 14.7%로 나타나 아토피 피부염의 발생과 유전적인 알레르기 질환력 사이의 연관성 또한 보고되어 있다.

면역학적으로는 아토피 피부염의 병변 시 림프구 CD4:CD8의 비가 7:1 정도로 증가되어 있고, interleukin-4(IL-4)에 강한 반응성을 보여 T helper2(Th2)세포에 의한 면역 반응이 우세하여 진다. Th2 세포에 의해 분비되는 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5) 및 인터루킨-13(IL-13)은 T세포의 과다 활성화를 유발시키고, 혈청 immunoglobulin E(IgE)의 합성을 조절하게 되므로 아토피 피부염의 시작에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

최근에는 면역학적 이상 외에도 피부장벽기능의 손상이 아토피 피부염의 중요한 발병 원인 중 하나로 생각되고 있다. 장벽기능의 손상은 각질층 지질 중 세라마이드의 감소에서 기인하며, 피부의 수분유지기능과 피부장벽기능이 저하되어 알레르기 유발 물질이나 자극성 물질의 피부 투과성을 높여 피부의 염증반응을 유발 또는 악화시켜 피부건조 및 소양증 등의 발생으로 이어질 수 있다. 또한 역으로 면역학적 이상에 의해 발생한 피부염이 피부장벽기능을 손상시킬 수 있어 이와 같은 악순환을 차단하는 것이 아토피 피부염 치료의 중요한 과제 중 하나가 된다.

현재 사용 중인 아토피 질환 치료제는 알레르기 반응의 최종 산물인 히스타민 분비를 억제하거나 알레르기 증상 중 하나인 염증반응을 억제하는 효과를 가진 스테로이드제 및 항히스타민제에 치중되며, 일부에서는 면역억제제와 광선치료법이 사용되고 있다. 기존 치료제의 경우 알레르기 증상 완화에 효과가 있으나 근본적인 치료 방법이 아니며, 장기적으로 사용시 약물의 효능이 감소하거나 다양한 부작용이 발생할 위험이 있다.

스테로이드제의 부작용은 비만, 당뇨, 고혈압, 우울증 등이 있고, 항히스타민제의 부작용은 우울증, 집중력 장애, 무기력증, 졸림, 성기능 장애 등이 있으며, 면역억제제의 부작용은 국소자극, 고혈압, 신장독성 등이 있다. 따라서 스테로이드제, 항히스타민제, 면역억제제를 대체할 수 있는, 혹은 기존의 치료제의 사용을 줄일 수 있고 장기간 사용에도 부작용이 적은 신개념 치료 소재 개발의 필요성이 대두되고 있다.

은시호는 석죽과 식물인 대나물(Gypsophila oldhamiana)의 뿌리를 가을이나 봄에 채집하여 말린 것이다. 중국에서는(Stellaria dichotoma L. var. lanceolate Bge)의 뿌리를 사용한다. 예로부터 은시호는 열을 내리고 뼈의 염증을 낫게 하며 가래를 삭이는 데 사용되었으며, 현대에서는 은시호의 약리작용으로 동맥경화 예방, 콜레스테롤 축적 방지, 해열 등이 보고되었다. 또한 은시호에 함유되어 있는 사포닌, 플라보노이드 및 스테롤 등이 약리활성을 나타낸다고 보고되어 있다.

디코토민 비 및 디코토민 에이치를 포함한 디코토민류 화합물을 포함하는 은시호 추출물에서는 항-비만 활성이 보고되어 있으며, 은시호로부터 분리된 디코토민 C를 포함하는 일부 디코토민류 화합물에서는 항-알레르기 효과가 있음이 보고되어 있으나 디코토민 B를 포함하는 나머지는 항-알레르기 효과가 나타나지 않았다. 베타 시토스테롤 글리코시드는 Th1 면역 반응을 방어적으로 유도하는 면역 조절 활성이 보고되어 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 천연물의 피부염에 대한 약리활성에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(KR 등록특허 10-1789446).
본 발명자들은 해열의 약리작용을 가지는 은시호의 에탄올 추출물로부터 분리한 화합물이 아토피 피부염의 완화에 효과가 있음을 발견한 바, 본 발명을 완성하게 되었다.

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본 발명에서는 은시호(Gypsophila oldhamiana)의 에탄올 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 데 있다.

일 양상에 따르면, 유효 성분으로써, 디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 군에서 선택되는 두 종 이상의 화합물을 포함하는 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상에 따르면, 유효 성분으로써, 디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 군에서 선택되는 두 종 이상의 화합물을 포함하는 피부염의 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한 식품용 조성물을 제공한다.

다른 양상에 따르면, 유효 성분으로써, 디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성되는 군에서 선택되는 두 종 이상의 화합물을 포함하는 피부염의 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한 화장료 조성물을 제공한다.

다른 양상에 따르면, 디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 혼합 중량비는 1: 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5인 약학적 조성물을 제공한다.

다른 양상에 따르면, 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 피부염의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 은시호 추출물로부터 분리한 화합물인 디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 자연으로부터 얻어진 천연물을 유효성분으로 포함하여 인체에 적용 시 부작용이 적을 뿐 아니라, 장기간 사용으로 인한 내성이 생길 가능성이 낮다. 아울러 본 발명의 조성물은 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 유용한 약학적 조성물, 식품 및 화장료에 이용될 수 있다.

도 1은 EL4 세포에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리 후 Th0 세포에서 Th2 헬퍼 세포로의 분화 억제를 그 마커인 IL-4의 발현 변화로 나타낸 것이다.
도 2는 RBL-2H3 세포에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리 후 IL-4 발현변화를 나타낸 것이다.
도 3은 RBL-2H3 세포에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리 후 활성화된 비만세포에서 일어나는 탈과립에 대한 억제효과를 나타낸 것이다.
도 4는 RBL-2H3 세포에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리 후 히스타민 분비 정도를 나타낸 것이다
도 5은 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리 후 시간 경과에 따른 등 피부의 변화를 나타낸 것이다.
도 6는 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리 후 시간 경과에 따른 경피수분손실량(TEWL)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 수분 함유량(hydration)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8 은 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 혈청내 IgE 의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 는 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 혈청내 IL-4 의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 표피변화를 확인하기 위해 헤마톡실린과 에오신으로 조직염색한 것이다.
도 11는 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 표피 두께를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12은 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 진피내로 침윤된 비만세포를 확인하기위해 톨루이딘 블루로 조직 염색한 것이다.
도 13은 무모 마우스에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 비만세포의 수를 나타낸 것이다.
도 14는 EL4 세포에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 동일한 비율로 배합하여 처리 후 Th0 세포에서 Th2 헬퍼 세포로의 분화 억제를 그 마커인 IL-4의 발현 변화로 나타낸 것이다.
도 15는 RBL-2H3 세포에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 동일한 비율로 배합하여 처리 후 IL-4 발현변화를 나타낸 것이다.
도 16은 RBL-2H3 세포에서 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 동일한 비율로 배합하여 처리 후 활성화된 비만세포에서 일어나는 탈과립에 대한 억제효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 관점에서 은시호(銀柴胡, Gypsophila oldhamiana) 추출물로부터 분리한 화합물인 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 '은시호(Gypsophila oldhamiana)'는 쌍떡잎식물 석죽과의 여러해살이풀인 대나물의 뿌리를 말한다. 분포지역은 대한민국 전역으로, 산이나 들의 초원에 자생한다. 대나물은 전체에 털이 없고 높이 1m 정도로 줄기는 곧게 서며 윗부분에서 가지가 갈라진다. 잎은 마주나기 하며 피침형으로 3개의 잎맥이 뚜렷하고 끝이 뾰족하며 가장자리는 밋밋하다. 꽃은 6~7월에 피고 흰색의 산방상 취산꽃차례를 이루며 많은 꽃이 달린다. 꽃받침은 짧은 종의 모양으로 끝이 5개로 갈라지며, 꽃잎은 5장이다. 수술은 10개, 암술은 1개, 암술대는 2개로 갈라진다. 열매는 둥근 모양의 삭과로 4개로 갈라진다. 뿌리는 길이 15~40 cm, 지름 1~2.5 cm으로 원기둥 모양에 가깝고 가지가 갈려 있다. 바깥면은 옅은 노란색에서 황백색이고 꼬여 있는 세로주름 및 곁뿌리 자국이 있으며 구멍 모양으로 오목하게 패여 있다. 위쪽 끝에는 줄기가 붙었던 자국인 촘촘하게 사마귀 모양의 돌기가 있다. 질은 단단하지만 부서지기 쉽고 자르기 쉬우며, 자른 면에는 틈새가 있고 목부에는 노란색과 흰색이 엇갈리는 방사상의 무늬가 있다. 냄새가 약간 있으며 맛은 달다.

본 발명의 '유효성분'은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미하는 것이다.

본 발명의 일 관점인 아토피 피부염의 예방 또는 개선을 위한 조성물에 있어 상기의 은시호 추출물은 은시호의 C₁-C₆ 알코올 추출물을 포함할 수 있고, 구체적으로 은시호의 에탄올 추출물 또는 메탄올 추출물일 수 있다.

본 명세서에서 상기 '은시호 추출물'은 C₁-C₆ 알코올 및 이들이 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 용매의 조추출물일 수 있다. 상기 C₁-C₆ 알코올은 구체적으로 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 은시호를 용매로 추출할 시 건조된 은시호 중량의 약 5 내지 15배 정도에 해당하는 용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하다. 구체적으로 약 10배의 용매를 가하여 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출은 가열 추출, 냉침 추출, 환류냉각 추출 또는 초음파 추출 등이 이용될 수 있으며, 당업자에게 자명한 추출법이라면 제한이 없다. 상기 추출은 실온에서 수행할 수도 있으나, 보다 효율적인 추출을 위해서는 가온 조건 하에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 약 40 내지 100 ℃, 더욱 바람직하게는 약 80 ℃의 온도에서 추출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출시간은 바람직하게는 약 2 내지 4시간, 더욱 바람직하게는 약 3시간 동안 수행할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 추출 용매 및 추출 온도 등의 조건에 따라 달라질 수 있다. 상기 추출은 유효활성성분을 보다 다량으로 수득하기 위하여 1회 이상 여러 번 추출할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5회, 더욱 바람직하게는 3회 연속 추출하여 합한 추출액을 이용할 수 있다.

본 명세서에서 은시호 추출물은 상기와 같이 은시호의 조추출물을 포함할 수 있고, 상기 조추출물을 극성이 낮은 유기 용매로 더욱 추출하여 얻어진 유기 용매의 가용성 분획물을 포함할 수도 있다. 상기 유기 용매로는 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, n-부탄올 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 방법으로 추출한 추출물 또는 그 추출물의 가용성 분획물은 그대로 사용할 수도 있으나, 여과 후 농축하여 엑기스 형태로 사용할 수 있으며, 농축 후 동결 건조하여 동결건조물의 형태로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 일 관점인 아토피 피부염의 예방 또는 개선을 위한 조성물에 있어서, 상기 은시호 추출물 또는 그의 분획물은 디코토민 비(Dichotomine B), 디코토민 에이치(Dichotomine H) 및 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드(β-Sitosterol-3-O-glycoside)로 구성된 군에서 하나 이상의 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 포함할 수 있다.

[화학식 1] 디코토민 비(Dichotomine B)

[화학식 2] 디코토민 에이치(Dichotomine H)

[화학식 3] 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드(β-Sitosterol-3-O-glycoside)

본 명세서에서 '유도체'는 상기 화합물들의 치환 가능한 위치에서 다른 치환기로 변경되는 모든 화합물을 의미한다. 이러한 치환기의 종류에는 제한이 없으며, 예를 들어 각각 독립적으로 히드록실, 알킬알코올, 알키디알코올, 페톡시, 푸릴, 티에닐, 피리딜, 시클로헥실 또는 임의 치환된 페닐로 치환될 수 있는 C_1-10 비사이클릭 탄화수소기; 메틸, 히드록실, 히드록시메틸 또는 아미노로 치환될 수 있는 C_5-6 사이클릭 탄화수소기; 또는 당 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 상기 '당 잔기'는 다당류 분자로부터 1개의 수소 원자의 제거 시의 기를 의미하며, 예로써 단당류 또는 올리고당으로부터 유래된 잔기를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 '약학적으로 허용 가능'이란 통상의 의약적 복용량(medicinal dosage)으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용 가능하다는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 승인을 받을 수 있거나, 승인을 받거나, 약전에 열거 또는 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 '약학적으로 허용 가능한 염'은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물(parent compound)의 바람직한 약리 활성을 갖는 본 발명의 일측면에 따른 염을 의미한다. 상기의 염은 (1) 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산 등과 같은 무기산으로 구성되거나; 또는 아세트산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 신남산, 만델산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 3-페닐프로파이온산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 글루코헵톤산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다. 아울러, 본 명세서에 따른 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 상기 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 조성물 총 중량에 대하여 0.000025~0.25 중량%로 함유할 수 있다. 화합물의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 그들의 염이 0.000025 중량% 미만으로 함유되면 피부염을 예방하거나 치료하는 효과가 미미하며, 0.25 중량%를 초과하여 함유되면 다른 성분의 함량 및 제형화에 있어서 적절하지 못하다. 상기와 같은 관점에서, 본 발명의 일 관점인 피부염 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 상기 화합물, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 그들의 염을 조성물 총 중량에 대하여 0.00005~0.2 중량%, 0.000075~0.15 중량%, 0.0001~0.1 중량% 또는 0.000125~0.05 중량%의 농도로 포함할 수 있다.

상기 은시호로부터 유래한 화합물인 디코토민 비 및 디코토민 에이치는 베타-카르볼린(β-Carboline) 형 알칼로이드계 화합물이다. 베타-카르볼린은 식물 및 동물에서 널리 분포하는 인돌 알칼로이드계 화합물로, 경련성, 정신 자극 및 기억 증진의 효력이 있어 진정제로 사용되는 벤조디아제핀(benzodiazepines) 수용체의 역작용제로 사용되기도 한다.

상기 은시호로부터 유래한 화합물인 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 베타-시토스테롤(β-Sitosterol)의 배당체 화합물이다. 베타-시토스테롤은 대부분의 식물에 풍부하게 들어있는 식물성 스테롤(피토스테롤, phytosterols)의 일종이다. 특히 쌀겨, 땅콩, 콩류, 호박씨, 옥수수유 무, 배추 등에 많이 함유되어 있으며, 자연에서 주로 에스터 또는 글리코시드 형태로 발견된다. 베타-시토스테롤은 혈액에서 저밀도 지방단백질(Low density Lipoprotin; LDL)과 경쟁적으로 작용하여 콜레스테롤이 침착하는 것을 억제하여 심혈관 기능을 높여주는 역할을 한다. 또한 암세포의 사멸(apoptosis)을 유도하여 암세포의 증식을 억제하며, 항산화, 항염증, 혈당 강하, 면역 증진 효과도 보고되어 있다. 또한 최근에는 그 안전성과 효용성이 미국이나 유럽 등에서 인정되어 유럽에서는 전립선 비대증 치료제로 사용되고 있다.

본 발명에 따른 조성물은 ThO 세포의 Th2 세포로의 분화를 억제하여 피부염을 예방, 개선 또는 치료하는 것일 수 있다.

상기 은시호 추출물로부터 분리한 화합물은 면역세포의 과활성화를 억제시켜 면역기능을 안정화 또는 회복시키거나, 인터루킨-4(interleukin-4, IL-4)의 발현을 저해함으로써 피부염을 예방, 개선 또는 치료하는 것일 수 있다.

상기의 피부염은 피부 소양증, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 당뇨병성 피부염, 모낭염, 여드름, 알레르기성 피부염 및 신경성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 조성물은 in vitro 또는 개체 중의 세포에서 Th2 세포로의 분화를 억제시키거나, IL-4의 발현을 억제시키기 위한 것일 수 있다. 개체 중의 세포는 예를 들면 IL-4 발현 증가에 의하여 피부염이 진행되고 있는 부위, 또는 IL-4의 침적에 의하여 염증이 과도하게 진행되어 외부적으로 피부염 증상을 보이는 부위일 수 있다. 상기의 피부염은 아토피 피부염일 수 있으며, 또한 아토피성 피부염 환자에서 피부장벽기능 약화로 인한 피부 감염증일 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 조성물은 IL-4의 발현을 억제시키거나, 피부염을 개선시키거나, 특히 아토피성 피부염을 개선시키기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 유효한 양은 상기 조성물은 투여 단위 당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 0.1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5 mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10 mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg일 수 있다.

디코토민 B, 이의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H, 이의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드, 이의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 혼합 중량비는 1: 1~5: 1~5일 수 있다. 바람직하게는 1:1~3:1~3. 1:0.5~1.5:0.5~1.5 또는 1:1:1의 혼합 중량비로 혼합될 수 있다.

디코토민 B, 이의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H, 이의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드, 이의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로 구성된 군에서 선택되는 두 종의 화합물을 포함하는 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있으며 이의 혼합 중량비는 1~3:1~3, 1~2:1~2 및 1:1의 중량비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로, 식품학적으로 또는 화장품학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 있어서 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 의약품에 적용할 경우에는, 상기 조성물을 유효성분으로 하여 상용되는 무기 또는 유기의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 유당, 미결정 셀룰로오즈, 저치환도 히드록시셀룰로오즈 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 무수인산일수소 칼슘, 전분글리콜산 나트륨 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 히드록시프로필셀룰로오즈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 폴리비닐피롤리돈 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 탈크, 이산화규소, 스테아린산 마그네슘 또는 그 조합일 수 있다.

상기의 조성물은 경구 또는 비경구 투여제로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 정제, 산제, 환제, 과립제, 세립제, 연 또는 경 캡슐제, 시럽제 등일 수 있다. 비경구 투여제형은 주사제, 연고, 스프레이, 유제, 좌제 등일 수 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화 하기 위해서는 상법에 따라 실시하면 용이하게 제제화 가능하며, 계면활성제, 착색료, 향신료, 보존료, 부형제, 안정제, 완충제, 기타 상용하는 보조제 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 또한 상기 유효 성분의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리의 상태, 질환 또는 병리의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 수 있다. 일반적인 투여량은 0.001 ㎍/kg/일 내지 2000 ㎍/kg/일, 보다 구체적으로는 0.5 ㎍/kg/일 내지 1500 ㎍/kg/일이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 개체의 피부염을 효율적으로 개선시키기 위하여 스테로이드, 항염증제, 항히스타민제, 항생제 및 항진균제와 같은 다른 약물과 함께 투여될 수 있다. 상기 투여는 순차적, 동시적 또는 개별적으로 개체에 투여되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 관점인 피부염 예방 또는 개선용 조성물에 있어서, 상기의 조성물은 식품 조성물일 수 있다.

상기의 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 예로는 육류, 빵, 초콜릿, 캔디류, 껌류, 과자류, 스낵류, 면류, 낙농제품, 스프류, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함한다.

상기 식품 조성물은 은시호 추출물 유래의 화합물을 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성의 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외의 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분 또한 포함 가능하다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 적절히 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다.

일반적으로 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취 시에는 상기의 양이 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서는 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 건강기능식품 조성물인 경우, 조성물의 제형은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 유효성분 이외의 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되거나 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료적 처치의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부염을 예방 또는 개선하기 위한 화장용 조성물일 수 있다. 상기 화장용 조성물은 피부 보습용일 수 있으며, 피부 염증이 없는 영역에 국소적으로 적용하는 것일 수 있다. 상기 화장용 조성물은 피부염 치료용 약학 조성물과는 별개로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 화장료 조성물로 적용할 경우, 유효성분 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 또는 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 피부 외용제로써 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대, 스프레이 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부 외용제는 통상적으로 화장품 등에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제 등을 필요에 따라 적절하게 배합할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.

본 발명에서 사용된 은시호는 중국산 은시호를 구매하여 사용하였다.

실시예 1. 디코토민 B의 제조

건조된 은시호(Gypsophila oldhamiana의 지하부) 20 kg을 95% 에탄올 200 L에 담구어 3시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 422.91 g을 얻었다. 상기 은시호 에탄올 추출물을 500 mL의 물에 현탁한 후 극성지향적 분리기법에 따라 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 수포화 부탄올 분획물을 제조하였다. 각 분획 용매는 한 회에 500 mL를 가하여 3회 반복 분획하였으며, 분획한 액은 감압 농축하였다. 분획 결과 n-헥산 분획은 39.85 g(수율: 0.20%), 메틸렌클로라이드 분획은 23.18 g(수율: 0.12%), 에틸아세테이트 분획은 17.37 g(수율: 0.09%) 및 수포화 부탄올 분획은 53.05 g(수율: 0.30%)이 수득되었다. 상기 은시호 에탄올 추출물의 수포화 부탄올 분획 45 g을 대상으로 100% 메탄올을 가하여 메탄올에 녹지 않는 적갈색의 결정을 분리하였다. 이 결정을 거름종이로 거르고 메탄올로 수회 세척하여 완전히 건조 시킨 후 스파츌라를 이용하여 2.80 g을 수집하였다. 분리된 성분의 구조는 NMR 및 MS를 사용하여 디코토민 비(Dichotomine B)로 규명하였다.

[화학식 1] 디코토민 비(Dichotomine B)

Chemical formula : C₁₄H₁₂N₂O₄

실시예 2. 디코토민 H의 제조

건조된 은시호(Gypsophila oldhamiana의 지하부) 20 kg을 95% 에탄올 200 L에 담구어 3시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 422.91 g을 얻었다. 상기 은시호 에탄올 추출물을 500 mL의 물에 현탁한 후 극성지향적 분리기법에 따라 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 수포화 부탄올 분획물을 제조하였다. 각 분획 용매는 한 회에 500 mL를 가하여 3회 반복 분획하였으며, 분획한 액은 감압 농축하였다. 분획 결과 n-헥산 분획은 39.85 g(수율: 0.20%), 메틸렌클로라이드 분획은 23.18 g(수율: 0.12%), 에틸아세테이트 분획은 17.37 g(수율: 0.09%) 및 수포화 부탄올 분획은 53.05 g(수율: 0.30%)이 수득되었다. 상기 은시호 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획 16 g을 대상으로 메틸렌클로라이드-메탄올 그레디언트 시스템(30:1 → 20:1 → 10:1→ 5:1 → 3:1 → 2:1 → 1:1 → 100% 메탄올)을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 시행하여 9개의 소분획(GREA1 ~ GREA9)으로 나누었다. 이 중 7번째 소분획(4.60 g)을 메틸렌클로라이드-메탄올 그레디언트 시스템(20:1 → 10:1 → 5:1 → 100% 메탄올)을 적용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 10개의 소분획(GREA7-1 ~ GREA7-10)으로 나누었다. 이 중 10번째 소분획(747.1 mg)은 다시 메틸렌클로라이드-메탄올 그레디언트 시스템(3:1 → 2:1 → 1:1 → 100% 메탄올) 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 적갈색의 결정인 디코토민 에이치 191.9 mg을 분리하였다. 분리된 성분의 구조는 NMR 및 MS를 사용하여 규명하였다.

[화학식 2] 디코토민 에이치(Dichotomine H)

Chemical formula: C₁₉H₁₇N₃O₆

실시예 3. β-시토스테롤-3- O -글리코시드의 제조

건조된 은시호(Gypsophila oldhamiana의 지하부) 20 kg을 95% 에탄올 200 L에 담구어 3시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압 건조하고 농축하여 농축물 422.91 g을 얻었다. 상기 은시호 에탄올 추출물을 500 mL의 물에 현탁한 후 극성지향적 분리기법에 따라 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 수포화 부탄올 분획물을 제조하였다. 각 분획 용매는 한 회에 500 mL를 가하여 3회 반복 분획하였으며, 분획한 액은 감압 농축하였다. 분획 결과 n-헥산 분획은 39.85 g(수율: 0.20%), 메틸렌클로라이드 분획은 23.18 g(수율: 0.12%), 에틸아세테이트 분획은 17.37 g(수율: 0.09%) 및 수포화 부탄올 분획은 53.05 g(수율: 0.30%)이 수득되었다. 상기 은시호 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획 16 g을 대상으로 메틸렌클로라이드-메탄올 그레디언트 시스템(30:1 → 20:1 → 10:1→ 5:1 → 3:1 → 2:1 → 1:1 → 100% 메탄올)을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 시행하여 9개의 소분획(GREA1 ~ GREA9)으로 나누었다. 이 중 8번째 소분획(1.87 g)에 100% 메탄올을 가하여 메탄올에 녹지 않는 연노란색 결정 217.1 mg을 분리하였다. 이 결정은 거름종이로 걸러내어 메탄올로 수회 세척한 뒤 완전히 건조 시킨 후 스파츌라로 수집하였다. 분리된 결정은 NMR 및 MS를 사용하여 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드로 규명하였다.

Chemical formula: C₃₆H₆₀O₆

실시예 4. 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3- O -글리코시드가 Th2 헬퍼 세포로의 분화에 미치는 영향

본 실험에서 사용한 마우스 T 세포주인 EL4 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. EL4 세포는 마우스 유래 림프종 세포로 Th0에서 Th2 헬퍼 세포로의 분화를 조절하는 연구를 하는데 사용된다. 분화 마커는 IL-4이다. EL4 세포를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토미신이 첨가된 DMEM 배지 중에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. EL4 세포(KCLB No. 40039, 마우스 T 세포 림포마(lymphoma), 한국세포주은행)를 Th2 헬퍼 세포로의 분화를 확인하기 위하여 6-웰 플레이트의 웰에 5x10⁵ cells/well 밀도로 분주하여 16시간 배양하여 웰에 부착시켰다. 다음으로, 양성대조군으로 면역억제제로 사용되는 1uM의 시클로스포린(Cyclosporine A: CyA)과 시료를 농도대로 첨가하고 1시간 뒤 세포를 면역학적으로 활성화시키기 위해 1ng/ml의 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(phorbol-12-myristate-13-acetate: PMA)(Sigma, #P8139)와 5uM/ml의 4-tert-옥틸페놀(4-tert-Octylphenol: OP)(Sigma, #442858)를 첨가하고 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양하였다. RNA는 QIAQube(Qiagen)를 이용하여 초고속으로 분리하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 견고성(integrity)을 확인하였다. cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 1 ㎍의 RNA를 cDNA로 합성하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응은 0.02 ㎕ Ex taq 폴리머라제(TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2 ㎕ Ex taq 폴리머라제 버퍼, 1.6 ㎕ dNTP(10 mM), 2 ㎕ 포워드 프라이머(20 uM), 2 ㎕ 리버스 프라이머(20 uM), 11.38 ㎕ 물과 1 ㎕의 합성한 제1 가닥 cDNA를 잘 섞어 총 20 ㎕ 용량의 반응 혼합물에 대하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 IL4 및 베타-actin 유전자 증폭을 위하여 각각 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4의 폴리뉴클레오티드를 사용하였다. IL-4의 PCR 조건은 94 ℃에서 4분(1 회), 94 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초 그리고 72 ℃에서 30 초(25 회), 72 ℃에서 5 분(1 회)이었고, 베타-액틴 조건은 94 ℃에서 4 분 (1 회), 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초 그리고 72 ℃에서 30 초(20 회), 72 ℃에서 5 분(1 회)이었다. RT-PCR 결과는 QIAxcel advanced (Qiagen) 기기를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [PMA + OP](PO) 처리군의 비율을 100으로 하여 이와 비교하여 결정하였다. 표 1 및 도 1은 은시호 추출물로부터 분리한 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드가 IL-4 발현에 미치는 영향을 PO 처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 IL-4가 저해되는 정도를 나타낸 것이다.

시료	IL-4 발현 (%)
무처리군	43.9
PO	100
PO + CsA 1 uM	84.5
PO + 디코토민 비 10 uM	59.0
PO + 디코토민 에이치 10 uM	51.5
P0 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	60.8

표 1에서, CsA는 시클로스포린 A를 나타낸다. 표 1과 도 1에 나타낸 바와 같이, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 EL4 세포에서 IL-4의 발현을 저해시켰으며 이는 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 5. 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3- O -글리코시드가 IL-4 발현에 미치는 영향

본 실험에서 사용한 랫트 호염기성 백혈병 세포(rat basophilic leukemia cell)인 RBL-2H3 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. RBL-2H3 세포를 웰당 5x10⁵개 농도로 6-웰 플레이트의 각 웰에 접종하여 10% 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Dulecco' Modified Eagle Medium) 배지 중에서 37℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양하고, 16 시간 후에 1 μM의 시클로스포린 A와 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 10 μM의 농도로 각각 첨가하고 1 시간 동안 배양하여 전처리하였다. 다음으로, PMA 50 ng/ml와 이오노미신(ionomycin) 1 μM을 첨가하고 동일한 조건에서 9 시간 동안 배양하였다. PMA와 이오노미신은 인터페론, 페르포린, IL-2, 및 IL-4와 같은 시토킨의 세포내 생산을 자극하기 위하여 사용된다. 대조군으로서, 시클로스포린 A, 디코토민 비, 디코토민 에이치, PMA 및 이오노미신을 첨가하지 않은 무처리군, 및 PMA 및 이오노미신를 첨가하지 않은 것(이하 "PI 군"이라 함)을 사용하였다. 세포는 RNeasy mini kit(Qiagen)을 사용하여 QIAsymphony 또는 QIAQube (Qiagen) 기기에 장착하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 견고성(integrity)을 확인하였다. cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 1 ㎍의 RNA를 cDNA로 합성하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응은 0.02 ㎕ Ex taq 폴리머라제(TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2 ㎕ Ex taq 폴리머라제 버퍼, 1.6 ㎕ dNTP(10 mM), 2 ㎕ 포워드 프라이머(20 uM), 2 ㎕ 리버스 프라이머(20 uM), 11.38 ㎕ 물과 1 ㎕의 합성한 제1 가닥 cDNA를 잘 섞어 총 20 ㎕ 용량의 반응 혼합물에 대하여 PCR을 수행하였다. IL-4의 PCR 조건은 94℃에서 4분(1회), 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초(25회), 72℃에서 5 분(1회)이었고, 베타-액틴 조건은 94℃에서 4분(1회), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초(20회), 72℃에서 5분(1회)이었다. RT-PCR 결과는 QIAxcel advanced (Qiagen) 기기를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [PMA + 이오노미신](PI) 처리군의 비율을 100으로 하여 이와 비교하여 결정하였다. 표 2 및 도 2는 은시호 추출물로부터 분리한 화합물 이 IL-4 발현에 미치는 영향을 PI 처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 IL-4가 저해되는 정도를 나타낸 것이다.

시료	IL-4 발현 (%)
무처리군	28.19
PI	100.00
PI + CsA 1 uM	57.6
PI + 디코토민 비 10 uM	57.74
PI + 디코토민 에이치 10 uM	36.5
PI + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	28.5

표 2 및 도 2에서, CsA는 시클로스포린 A를 나타낸다. 표 2와 도 2에 나타낸 바와 같이, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 RBL-2H3 세포에서 IL-4의 발현을 저해시켰으며 이는 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 6. 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3- O -글리코시드가 탈과립에 미치는 영향

RBL-2H3 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM(HYCLONE,#sh30284.01)에 현탁시킨 후 24well plate에 5x10⁵ cells/well 밀도로 분주하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양한다. 배양 16시간 후 DNP-IgE(Sigma, #D8406)를 100 ng/ml 농도로 가한 후 37℃, 5% CO₂의 조건에서 4시간 배양하였다. 4시간 후 siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH)로 2회 세척하고, siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH, 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl₂, and 0.1% BSA)를 이용하여 시료를 농도 별로 1시간 동안 37℃ 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 1시간 배양 후 DNP-BSA를 100ng/ml의 농도로 처리하여 1시간 반응시키고 ice bath에서 10분간 방치하여 반응을 종결시켰다. 이 후 배지를 채취하고 2,000 RPM에서 원심분리하여 상등액을 취하여 substrate(1 mM 4-Nitrophenyl N-acetyl-

-D-glucosaminide, sigma, #N9376)와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃ solution을 넣어 반응을 정지시켰다. microplate spectrophotometer(biotek) 로 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표 3은 은시호 추출물로부터 분리한 화합물이 탈과립에 미치는 영향을 무처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 탈과립이 저해되는 정도를 나타낸 것이다.

시료	β-헥소아미니다제
무처리군	100
IgE + DNP-BSA	282.85
IgE + DNP-BSA + Ketotifen 30 uM	120.75
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 10 uM	250.25
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 30 uM	207.7
IgE + DNP-BSA + 디코토민 에이치 10 uM	272.75
IgE + DNP-BSA + 디코토민 에이치 30 uM	177.05
IgE + DNP-BSA + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	250.05
IgE + DNP-BSA + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 30 uM	226.25

도 3에서, Keto는 케토티펜을 나타낸다. 표 3과 도 3에 나타낸 바와 같이, 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드는 RBL-2H3 세포에서 탈과립을 저해시켰으며 이는 탈과립에 의한 급격한 알레르기 반응이나 가려움증 등의 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 7. 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3- O -글리코시드가 히스타민 분비에 미치는 영향

디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드의 존재하에서 면역세포가 히스타민을 분비하는 정도를 측정하였다. 히스타민을 염증을 야기하는 물질이다. 구체적으로, 면역 세포인 RBL-2H3 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM(HYCLONE,#)에 현탁시킨 후 24-웰 플레이트에 5x10⁵ cells/well 밀도로 분주한 후 항-DNP-IgE(Sigma, #D8406)를 50 ng/ml 농도로 첨가한 후 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25mM PIPES, 40mM NaOH)로 세포를 2회 세척하고, 표 4에 지정된 농도의 케토티펜 또는 은시호 추출물로부터 분리한 화합물을 함유하는 siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25mM PIPES, 40mM NaOH, 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl₂, and 0.1% BSA) 200 ul를 첨가하고 1시간 동안 37℃ 5% CO₂의 조건에서 배양한다. 1시간 배양 후 항원으로서 DNP-BSA을 200 ng/ml 농도로 첨가하고 1시간 반응시킨 후 얼음조에서 10분간 방치하여 반응을 종결시켰다. 이후 반응액 즉, 버퍼를 채취해 2000 RPM에서 원심분리하여 Histamine ELISA kit(abcam, #ab213975)를 이용해 microplate spectrophotometer (biotek)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 4 및 도 4는 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드가 히스타민 분비에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

시료	히스타민 (pg/mL)
무처리군	300.1
IgE + DNP-BSA	689.5
IgE + DNP-BSA + Ketotifen 30 uM	391.7
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 10 uM	592.5
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 30 uM	510.3
IgE + DNP-BSA + 디코토민 에이치 10 uM	685.1
IgE + DNP-BSA + 디코토민 에이치 30 uM	487.3
IgE + DNP-BSA + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	550.1
IgE + DNP-BSA + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 30 uM	482.5

도 4에서, keto는 Ketotifen을 나타낸다. 표 4와 도 4에 나타낸 바와 같이, 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드는 RBL-2H3 세포에서 히스타민 분비를 저해시켰으며 이는 히스타민에 의한 급격한 알레르기 반응이나 가려움증 등의 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 8. 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3- O -글리코시드가 DNCB에 의하여 아토피 피부염 유도된 무모 마우스(hairless mouse)에서 피부 장벽기능에 미치는 영향

아토피 피부염 유도-무모 마우스(hairless mouse)에 은시호 추출물로부터 분리한 화합물을 처리하는 경우 질병 마우스의 피부 수분 함유량을 증진시켜 피부장벽 기능을 개선시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 6주령(암컷, 23-27 g) 무모 마우스(hairless mouse, 오리엔트바이오에서 구입)를 3개의 군으로 분리하였다: 무처리군, 2,4-디니트로클로로벤젠(2,4-dinitrochlorobenzene: DNCB) 유도 후 비히클 처리군, DNCB 유도 후 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 처리군(0.5%). DNCB는 물 중 99 % 아세톤과 올리브 오일을 부피 기준으로 3:1로 섞은 용액을 용매로 사용하였다. 비히클은 프로필렌 글리콜과 에탄올을 부피 기준으로 7:3으로 섞은 것을 사용하였다. 군 분리 후 7일 동안 1일 1회 1(w/v/)% DNCB 용액을 마우스 등에 200 ㎕씩 도포하였다. 마지막 도포 후 일주일 간 처리하지 않고 일주일 후 2일 간격으로 총 7번 0.1(w/v)% DNCB 용액을 위와 같은 방법으로 도포하였다. 0.1(w/v)% DNCB 용액을 도포하며 14일 동안 비히클을 용매로 한 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 0.5(w/v)% 용액과 비히클을 오전 및 오후로 나누어 1일 2회로 마우스 등에 200 ㎕씩 각각 도포하였다. 시료가 도포된 마우스 피부에 대하여, 경피수분손실량(TEWL, Trans Epidermal Water Loss)은 AquaFlux (Biox, London, UK)를 이용해서 측정하였고, 피부 수분 함유량(hydration)은 Skin-O-Mat(COSMOMEP, Berlin, Germany)를 이용하여 측정하였다. 처음 DNCB에 의하여 아토피 피부염을 유도하기 전, 유도 후 7일 후, 14일 후 및 21일 후 측정하였다. 실험이 끝난 후 외형적인 모습은 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보이는 것처럼, DNCB 처리군보다 화합물 처리군에서 외관상으로 태선화, 부종, 홍반, 과각질화 등의 피부염 증상들이 개선된 것을 확인할 수 있었다. 표 5 및 도 6은 무모 마우스에서 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 처리 후 시간 경과에 따른 경피수분손실량(TEWL)(g/m2/h)을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 표 6 및 도 7은 무모 마우스에서 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 수분함유량(hydration)(%)을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 경피수분손실량이 50% 이상 낮아진 것을 확인할 수 있다. 따라서, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드가 무모 마우스에서 비히클에 비해 확연하게 피부장벽 기능이 강화시키는 것을 알 수 있다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드가 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 수분함유량(hydration)을 높이는 것을 확인하였다.

	0 일	7 일	14 일	21 일
CON	30.55	33.13	30.52	24.33
비히클	25.08	103.15	69.94	61.27
디코토민 비	29.60	98.40	67.85	48.36
디코토민 에이치	29.71	93.83	65.50	44.99
베타-시토스테롤-3-O-글리코시드	29.26	95.95	56.80	48.37

	0 일	7 일	14 일	21 일
CON	49.08	50.38	47.85	51.83
비히클	47.58	13.68	15.33	17.83
디코토민 비	45.53	10.90	17.90	31.78
디코토민 에이치	44.93	12.83	21.03	36.33
베타-시토스테롤-3-O-글리코시드	46.28	11.38	21.95	27.70

실시예 9. 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3- O -글리코시드가 IgE와 IL-4의 단백질 양에 미치는 영향

또한, 상기 마우스의 혈액 중 혈장에서 아토피 피부염의 마커로 쓰이며 아토피 피부염에서 가장 중요한 요인 중 하나인 면역글로불린E(IgE)와 면역세포의 시토킨 중 하나인 인터루킨-4(IL-4)의 단백질 양을 ELISA 실험법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 마우스 마취시킨 후에 0.18 M EDTA 30 ㎕가 들어있는 주사기를 이용하여 복부대동맥에서 혈액을 채취하였다. 원심분리기를 이용하여 4℃ 8,000 rpm에서 15 분간 원심분리한 후 혈장과 혈구를 분리하였다. 이중 혈장에 대하여 마우스 IgE ELISA quantitation kit(Bethy Laboratories, Montgomery, TX, USA)와 마우스 IL-4 ELISA quantitation kit(Bethy Laboratories, Montgomery, TX, USA)를 사용하였다.

표 7 및 도 8; 및 표 8 및 도 9는 무모 마우스에서 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 혈청 내 IgE 및 IL-4의 단백질 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

	IgE (ng/mL)
CON	52.75
비히클	222.83
디코토민 비	169.36
디코토민 에이치	157.59
베타-시토스테롤-3-O-글리코시드	156.44

	IL-4 (pg/mL)
CON	17.25
비히클	64.89
디코토민 비	49.05
디코토민 에이치	35.85
베타-시토스테롤-3-O-글리코시드	44.41

도 8과 9에 나타낸 바와 같이 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 혈장 내 IgE 단백질 양과 IL-4 단백질 양을 감소시키는 경향을 확인하였다.

실시예 10. 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3- O -글리코시드가 마우스의 표피 두께와 조직학적 변화에 미치는 영향

마우스의 표피 두께와 조직학적 변화를 확인하기 위하여 마우스 조직을 10% 포르말린으로 고정한 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 염색한 조직을 도립현미경(TE-2000U, Nikon)을 이용하여 촬영하였고, Leica application suite 프로그램을 이용하여 표피층의 두께를 측정하였다.

도 10는 무모 마우스에서 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 표피변화를 확인하기 위해 헤마톡실린과 에오신으로 조직염색한 것이다.

표 9 및 도 11은 무모 마우스에서 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 표피 두께(Epidermal thickness)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

	표피 두께 (μm)
CON	30.24
비히클	75.25
디코토민 비	57.72
디코토민 에이치	48.1
베타-시토스테롤-3-O-글리코시드	51.6

그 결과 도 9와 10에 나타낸 바와 같이 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 피부 두께와 표피층의 두께도 감소하였으며, 병변부위의 면역 세포수도 감소하였다.

마우스 병변 부위의 비만세포가 침윤된 정도를 확인하기 위하여 마우스 조직을 10% 포르말린으로 고정한 후 톨루이딘 블루로 염색하였다. 염색한 조직을 도립현미경(TE-2000U, Nikon)을 이용하여 촬영하였고, Image J 프로그램을 이용하여 비만세포의 수를 측정하였다.

도 12은 무모 마우스에서 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 비만세포를 확인하기위해 톨루이딘 블루로 조직 염색한 것이다.

표 10 및 도 13는 무모 마우스에서 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 처리한 후 비만세포의 수를 나타낸 것이다.

	비만 세포
CON	27.75
비히클	72.5
디코토민 비	52.12
디코토민 에이치	43.62
베타-시토스테롤-3-O-글리코시드	43.5

도 11과 12에 나타낸 바와 같이, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 무모 마우스에서 대조군인 비히클에 비해 병변부위로 침윤된 비만세포의 수가 감소하였다.

실시예 11. 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3- O -글리코시드를 혼합한 혼합물이 Th2 헬퍼 세포로의 분화에 미치는 영향

본 실험에서 사용한 마우스 T 세포주인 EL4 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. EL4 세포는 마우스 유래 림프종 세포로 Th0에서 Th2 헬퍼 세포로의 분화를 조절하는 연구를 하는데 사용된다. 분화 마커는 IL-4이다. EL4 세포를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토미신이 첨가된 DMEM 배지 중에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. EL4 세포(KCLB No. 40039, 마우스 T 세포 림포마(lymphoma), 한국세포주은행)를 Th2 헬퍼 세포로의 분화를 확인하기 위하여 6-웰 플레이트의 웰에 5x105 cells/well 밀도로 분주하여 16시간 배양하여 웰에 부착시켰다. 시료처리는 각각 10μM 농도의 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 1:1 또는 1:1:1 비율로 배합하여 처리하였다. 다음으로, 양성대조군으로 면역억제제로 사용되는 1uM의 시클로스포린(Cyclosporine A: CyA)과 시료를 농도대로 첨가하고 1시간 뒤 세포를 면역학적으로 활성화시키기 위해 1ng/ml의 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(phorbol-12-myristate-13-acetate: PMA)(Sigma, #P8139)와 5uM/ml의 4-tert-옥틸페놀(4-tert-Octylphenol: OP)(Sigma, #442858)를 첨가하고 5% CO2, 37℃에서 24시간 배양하였다. RNA는 QIAQube(Qiagen)를 이용하여 초고속으로 분리하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 견고성(integrity)을 확인하였다. cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 1 ㎍의 RNA를 cDNA로 합성하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응은 0.02 ㎕ Ex taq 폴리머라제(TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2 ㎕ Ex taq 폴리머라제 버퍼, 1.6 ㎕ dNTP(10 mM), 2 ㎕ 포워드 프라이머(20 uM), 2 ㎕ 리버스 프라이머(20 uM), 11.38 ㎕ 물과 1 ㎕의 합성한 제1 가닥 cDNA를 잘 섞어 총 20 ㎕ 용량의 반응 혼합물에 대하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 IL4 및 베타-actin 유전자 증폭을 위하여 각각 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4의 폴리뉴클레오티드를 사용하였다. IL-4의 PCR 조건은 94 ℃에서 4분(1 회), 94 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초 그리고 72 ℃에서 30 초(25 회), 72 ℃에서 5 분(1 회)이었고, 베타-액틴 조건은 94 ℃에서 4 분 (1 회), 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 30 초 그리고 72 ℃에서 30 초(20 회), 72 ℃에서 5 분(1 회)이었다. RT-PCR 결과는 QIAxcel advanced (Qiagen) 기기를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [PMA + OP](PO) 처리군의 비율을 100으로 하여 이와 비교하여 결정하였다.

표 11 및 도 14는 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 혼합한 혼합물들이 IL-4 발현에 미치는 영향을 PO 처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 IL-4가 저해되는 정도를 나타낸 것이다.

시료	IL-4 발현 (%)
무처리군	75.63
PO	100
PO + CsA 1 uM	40.62
PO + 디코토민 비 10 uM	74.13
PO + 디코토민 에이치 10 uM	59.21
P0 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	54.77
PO + 디코토민 비 + 디코토민 에이치 10 uM	66.60
PO + 디코토민 비 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	65.55
PO + 디코토민 에이치 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	50.65
PO + 디코토민 비 + 디코토민 에이치 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	42.97

표 11에서, CsA는 시클로스포린 A를 나타낸다. 표 11과 도 14에 나타낸 바와 같이, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 EL4 세포에서 IL-4의 발현을 저해시켰으며, 세가지 화합물을 1:1:1로 배합하여 처리한 경우 각각 화합물의 단독 처리군보다 IL-4의 발현이 감소하였다. 이는 세가지 화합물의 혼합물이 Th2 세포로의 분화를 억제함으로써 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 12. 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3- O -글리코시드를 혼합한 혼합물이 IL-4 발현에 미치는 영향

본 실험에서 사용한 랫트 호염기성 백혈병 세포(rat basophilic leukemia cell)인 RBL-2H3 세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank; Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. RBL-2H3 세포를 웰당 5x10⁵개 농도로 6-웰 플레이트의 각 웰에 접종하여 10% 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Dulecco' Modified Eagle Medium) 배지 중에서 37℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양하고, 16 시간 후에 1 μM의 시클로스포린 A를 처리하였고, 시료처리는 각각 10μM 농도의 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 1:1 또는 1:1:1 비율로 배합하여 각각 첨가하고 1 시간 동안 배양하여 전처리하였다. 다음으로, PMA 50 ng/ml와 이오노미신(ionomycin) 1 μM을 첨가하고 동일한 조건에서 9 시간 동안 배양하였다. PMA와 이오노미신은 인터페론, 페르포린, IL-2, 및 IL-4와 같은 시토킨의 세포내 생산을 자극하기 위하여 사용된다. 대조군으로서, 시클로스포린 A, 디코토민 비, 디코토민 에이치, PMA 및 이오노미신을 첨가하지 않은 무처리군, 및 PMA 및 이오노미신를 첨가하지 않은 것(이하 "PI 군"이라 함)을 사용하였다. 세포는 RNeasy mini kit(Qiagen)을 사용하여 QIAsymphony 또는 QIAQube (Qiagen) 기기에 장착하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Agilent 2100 BioAnalyzer(Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA)를 사용하여 견고성(integrity)을 확인하였다. cDNA는 ImProm-II Reverse Transcription System(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 1 ㎍의 RNA를 cDNA로 합성하였다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응은 0.02 ㎕ Ex taq 폴리머라제(TAKARA, Otsu, Shiga, Japan), 2 ㎕ Ex taq 폴리머라제 버퍼, 1.6 ㎕ dNTP(10 mM), 2 ㎕ 포워드 프라이머(20 uM), 2 ㎕ 리버스 프라이머(20 uM), 11.38 ㎕ 물과 1 ㎕의 합성한 제1 가닥 cDNA를 잘 섞어 총 20 ㎕ 용량의 반응 혼합물에 대하여 PCR을 수행하였다. IL-4의 PCR 조건은 94℃에서 4분(1회), 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초(25회), 72℃에서 5 분(1회)이었고, 베타-액틴 조건은 94℃에서 4분(1회), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초(20회), 72℃에서 5분(1회)이었다. RT-PCR 결과는 QIAxcel advanced (Qiagen) 기기를 사용하여 밴드의 강도를 측정하였다. 효능에 대한 분석은 [PMA + 이오노미신](PI) 처리군의 비율을 100으로 하여 이와 비교하여 결정하였다.

표 12 및 도 15는 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 혼합한 혼합물들이 IL-4 발현에 미치는 영향을 PI 처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 IL-4가 저해되는 정도를 나타낸 것이다.

시료	IL-4 발현 (%)
무처리군	65.63
PI	100
PI + CsA 1 uM	59.30
PI + 디코토민 비 10 uM	38.26
PI + 디코토민 에이치 10 uM	47.68
PI + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	33.15
PI + 디코토민 비 + 디코토민 에이치 10 uM	31.97
PI + 디코토민 비 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	54.03
PI + 디코토민 에이치 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	25.18
PI + 디코토민 비 + 디코토민 에이치 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	21.19

표 12 및 도 15에서, CsA는 시클로스포린 A를 나타낸다. 표 12와 도 15에 나타낸 바와 같이, 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드는 RBL-2H3 세포에서 IL-4의 발현을 저해시켰으며, 세가지 화합물을 1:1:1로 배합하여 처리한 경우 각각 화합물의 단독 처리군보다 IL-4의 발현이 감소하였다. 이는 세가지 화합물의 혼합물이 IL-4의 발현을 억제함으로써 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 13. 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3- O -글리코시드를 배합한 혼합물이 탈과립에 미치는 영향

RBL-2H3 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM(HYCLONE,#sh30284.01)에 현탁시킨 후 24well plate에 5x10⁵ cells/well 밀도로 분주하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양한다. 배양 16시간 후 DNP-IgE(Sigma, #D8406)를 100 ng/ml 농도로 가한 후 37℃, 5% CO₂의 조건에서 4시간 배양하였다. 4시간 후 siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH)로 2회 세척하고, siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH, 5.6 mM glucose, 1 mM CaCl₂, and 0.1% BSA)를 이용하여 각각 10μM 농도의 디코토민 비, 디코토민 에이치, 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드를 1:1 또는 1:1:1 비율로 배합하여 시료를 처리하여 1시간 동안 37℃ 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 1시간 배양 후 DNP-BSA를 100ng/ml의 농도로 처리하여 1시간 반응시키고 ice bath에서 10분간 방치하여 반응을 종결시켰다. 이 후 배지를 채취하고 2,000 RPM에서 원심분리하여 상등액을 취하여 substrate(1mM 4-Nitrophenyl N-acetyl-

-D-glucosaminide, sigma, #N9376)와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 0.1M Na₂CO₃/NaHCO₃ solution을 넣어 반응을 정지시켰다. microplate spectrophotometer(biotek) 로 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

표 13 및 도 16은 디코토민 B, 디코토민 H 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드를 혼합한 혼합물들이 탈과립에 미치는 영향을 무처리군을 100으로 하여 그에 대한 비율로 탈과립이 저해되는 정도를 나타낸 것이다.

시료	β-헥소아미니다제(%)
무처리군	100
IgE + DNP-BSA	357.78
IgE + DNP-BSA + Ketotifen 30 uM	120.25
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 10 uM	230.21
IgE + DNP-BSA + 디코토민 에이치 10 uM	240.38
IgE + DNP-BSA + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	210.47
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 + 디코토민 에이치 10 uM	220.53
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	255.12
IgE + DNP-BSA + 디코토민 에이치 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	227.61
IgE + DNP-BSA + 디코토민 비 + 디코토민 에이치 + 베타-시토스테롤-3-O-글리코시드 10 uM	185.23

표 13과 도 16에서, Keto는 케토티펜을 나타낸다. 표 13과 도 16에 나타낸 바와 같이, 은시호 추출물로부터 분리한 화합물은 RBL-2H3 세포에서 탈과립을 저해시켰으며, 세가지 화합물을 1:1:1로 배합하여 처리한 경우 IL-4의 발현이 각각 화합물의 단독 처리군 보다 감소하였다. 이는 탈과립에 의한 급격한 알레르기 반응이나 가려움증 등의 아토피 증상 완화에 도움이 될 수 있음을 보여주는 결과이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition for preventing, improving or treating dermatitis containing dichotomines or beta-sitosterol-3-O-glycoside <130> PN126328 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 ccaccttgct gtcaccctgt tctgct 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gtgttgtgag cgtggactca ttcacg 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 accgtgaaaa gatgacccag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 tgtcagctgt ggtggtgaag 20

Claims

디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 1: 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5의 혼합 중량비로 포함하는 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 투여 단위당 0.1 ~ 1000 mg/체중kg의 화합물을 포함하는 것인 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 Th2 세포로의 분화억제, 면역기능의 안정화 또는 IL-4의 발현을 저해하는 것인 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 피부염은 피부 소양증, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 당뇨병성 피부염, 아토피 피부염, 모낭염, 여드름, 알레르기성 피부염 및 신경성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것인 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 1: 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5의 혼합 중량비로 포함하는 피부염의 예방 또는 개선용 식품용 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 식품용 조성물의 식품학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것인 피부염의 예방 또는 개선용 식품용 조성물.
디코토민 B 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 디코토민 H 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 β-시토스테롤-3-O-글리코시드 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 1: 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5의 혼합 중량비로 포함하는 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 화장료 조성물의 화장품학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것인 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물이 정제, 과립제 또는 캅셀제의 단일투여 제제로 제형화되는 것인 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하로 투여되는 것인 피부염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
청구항 1의 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 피부염의 치료 방법.