KR102066684B1

KR102066684B1 - 개비자나무 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102066684B1
Application number: KR1020180019258A
Authority: KR
Inventors: 송윤재; 김선여; 김정은; 박가영
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2018-02-19
Filing date: 2018-02-19
Publication date: 2020-01-15
Anticipated expiration: 2038-02-19
Also published as: KR20190099613A

Abstract

본 발명의 개비자나무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물은 1형 인터페론의 경로의 신호 전달 경로를 방해하므로 상기 경로와 관계된 자가면역질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

개비자나무 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{A Composition comprising extracts or isolated compounds of Cephalotaxus koreana for prevention or treatment of autoimmune diseases}

본 발명은 개비자나무 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역 체계는 바이러스, 박테리아 및 기생충과 같은 외래 병원체를 인식하고 다양한 신호 전달 경로를 활성화시켜 염증 반응을 일으키게 된다. 그 중 세포질 DNA의 인식은 숙주 방어 기전을 활성시키고, 특히 I 형 인터페론(type I interferon; IFN) 생산을 촉발시킨다. 신호 분자의 네트워크에서, 소포체(endoplasmic reticulum; ER)에 존재하는 단백질(resident protein)인 STING(stimulator of interferon genes) 단백질은 세포질 DNA에 반응하여 I 형 IFN 신호 전달 경로(signaling pathway)를 활성화시키는 필수 어댑터 단백질이다. STING은 대식세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell), 내피 세포(endothelial cell), T 세포(T cell) 및 섬유 아세포(fibroblast)에서 주로 발현된다. 세포질 DNA를 인식한 후에, STING은 IRF3의 인산화를 촉진하여 I 형 IFN 생산을 유도하는 TBK1와 함께 핵 내로 재위치(relocalization)된다. STING의 카르복실 말단은 TBK1을 활성화시키고 IRF3을 리쿠르트 하는데 중요하다.

박테리아에 의해 생성되는 2차 메신저인 cyclic di-GMP는 STING과 직접 결합하는 것으로 알려져 있다. 세포 내 DNA를 인식하는 과정에서 cGAMP(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate) 합성 효소(cGAS)는 세포질 DNA 센서로 기능하여 GTP와 ATP의 반응을 활성화시켜, STING에 결합하고 1형 IFN의 합성을 자극하는 내인성 2차 메신저인, cGAMP 형성을 유도한다.

자기 DNA(self-DNA)에 대한 인식 오류는 자가 항체(autoantibody)의 생성과 CXCL10, IFN-β 및 TNF-α를 포함한 사이토카인의 과잉 생산을 유발한다. 리소좀의 기능 결핍에 의해 세포 사멸(apoptosis) 및 괴사(necrosis)하는 세포로부터 불완전하게 분해된 DNA는 TLR-독립 경로(TLR-independent pathway)를 통한 선천성 면역 반응의 조절 장애와 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus; SLE) 및 만성 다관절염(chronic polyarthritis)과 같은 자가면역질환 및 인터페론성 질환(interferonopathy)을 매개한다. 초기 연구에서 IFN-ß를 비롯한 다른 사이토카인의 레벨이 현저히 증가된 DNase II 녹아웃 마우스는 사망하거나 관절염의 징후를 나타냈다. Dnase II와 STING 이중 넉아웃 마우스에서 사이토카인 레벨과 다관절염 병변이 현저히 감소되기 때문에 STING은 자기 DNA에 의한 염증성 사이토카인의 과잉 생산에 관여하는 것으로 여겨진다. 또한 과거에 Dnase III로 알려진 TREX1(3' repair exonuclease 1)의 돌연변이도 STING과의 상호 작용을 통해 자가면역질환을 유발하는 것으로 보인다. TREX1은 세포 내 이중 가닥 DNA를 분해하고 STING 의존성 선천적 면역 반응을 음성적으로(negatively) 조절한다. TREX1의 기능적 결핍은 DNA의 축적 및 면역 반응의 활성화를 유발하며, TREX1 유전자의 돌연변이에 의한 IFN 관련 자가면역질환의 예로는 아이카디-구티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres Syndrome; AGS)이 있다. 이러한 TREX1 돌연변이로 인한 자가면역질환은 IRF3 또는 I 형 인터페론 수용체(IFNR)의 기능적 결핍에 의해 극복(rescue)될 수 있다. 이에, STING을 표적으로 하여 자기 DNA에 대한 I 형 인터페론 반응을 억제하는 방법은 자가면역질환을 치료하는데 있어서 효과적인 전략이 될 수 있다.

개비자나무(Cephalotaxus koreana)는 중국, 동인도, 타이, 일본 및 한국에 분포하는 식물로 토향비(土香榧)로도 불린다. 한의학에서는 개비자나무를 이용해 기생충이 쌓여 생기는 충적(蟲積)이나 폐의 진액이 말라서 일어나고 생긴다는 폐조해수(肺燥咳嗽)등의 질환의 치료에 이용하였으며, 현대에 들어 다양한 연구를 통해 개비자나무를 감염과 종양등의 치료에 활용하고 있다. 개비자나무속(Cephalotaxus) 식물에는 호모해링토닌(Homoharringtonine; HHT), 해링토닌(Harringtonine; HT) 및 세팔로탁신(Cephalotaxine; CET) 등의 알칼로이드 성분이 함유된 것으로 알려져 있다. 세팔로탁신의 에스터인 호모해링토닌과 해링토닌은 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia; CML)이나 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML), 골수형성이상증후군(myelodysplastic syndrome; MDS)과 같은 백혈병의 치료에 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다.

유럽 등록특허 제0203386호

본 발명의 목적은 개비자나무(Cephalotaxus koreana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 개비자나무(Cephalotaxus koreana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 개비자나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 자가면역질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 호모해링토닌(Homoharringtonine; HHT) 화합물, 해링토닌(Harringtonine; HT) 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 호모해링토닌 화합물, 해링토닌 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 개비자나무(Cephalotaxus koreana) 추출물 또는 이로부터 분리된 에스터 알칼로이드(ester alkaloid) 화합물인 호모해링토닌(Homoharringtonine; HHT) 또는 해링토닌(Harringtonine; HT)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 1형 인터페론 경로를 방해하며, STING 단백질과 TBK1 단백질의 상호작용을 방해할 수 있음을 확인하였다. 이에, 개비자나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 1형 인터페론 경로와 관계된 자가면역질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 개비자나무 추출물에 의한 STING에 의해 유도되는 IFN-β 프로모터의 활성화를 나타낸 도이다:
A: 루시퍼라아제 리포터 분석; 및
B: 웨스턴 블롯.
도 2는 호모해링토닌(Homoharringtonine; HHT), 해링토닌(Harringtonine; HT) 및 세팔로탁신(Cephalotaxine; CET)에 의한 STING에 의해 유도되는 IFN-β 프로모터의 활성화를 나타낸 도이다.
도 3은 호모해링토닌, 해링토닌 및 세팔로탁신 처리 농도에 따른 STING, TBK1 및 IRF3의 단백질 레벨 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 호모해링토닌, 해링토닌 및 세팔로탁신의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 5는 호모해링토닌, 해링토닌 및 세팔로탁신에 의한 cGAMP에 의해 유도되는 ISG(IFN-stimulated gene)인 IFNB1 및 CXCL10 유전자의 전사 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 호모해링토닌, 해링토닌 및 세팔로탁신에 의한 STING 단백질과 TBK1 단백질의 상호작용을 나타낸 도이다:
A: 세포파쇄물(lysate)의 웨스턴 블롯 결과;
B: 면역침강 및 세포파쇄물의 웨스턴 블롯 결과.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 개비자나무(Cephalotaxus koreana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출법인 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출법을 이용한 것 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출물은 개비자나무를 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 추출 용매로 저급 알코올을 사용하는 경우 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 것이 더 바람직하다.

아울러 본 발명의 상기 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 다른 추출 방법을 통해 얻어진 추출물 내지 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의해 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

상기 개비자나무는 야생 또는 시판되는 것 어느 것을 사용할 수 있고, 개비자나무의 뿌리, 줄기, 잎 및 꽃으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로는 뿌리일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 분획물은 개비자나무 추출물을 물, n-헥산. 디클로로메탄, 부탄올 또는 에틸아세테이트로 추가적으로 추출하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 상기 분획물은 상술한 용매에 의한 분획뿐만 아니라, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의해 분리 등, 다양한 분획 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 포함한다.

상기 조성물은 1형 인터페론 경로(type I interferon; IFN) 경로를 방해하고, STING 단백질과 TBK1 단백질의 상호작용을 방해하는 특징을 가지는 것일 수 있다.

상기 자가면역 질환은 SAVI(STING-associated vasculopathy with onset in infancy), 가족성 동창 루푸스(Familial Chilblain Lupus; FCL), 다발성 관절염(polyarthritis) 및 VAPS(vascular and pulmonary syndrome)으로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

"STING-associated vasculopathy with onset in infancy(SAVI)"는 STING 단백질을 만드는 TMEM173 유전자의 변이, 구체적으로는 N154S 또는 V155E/L170Q 이형 접합(heterozygous) 돌연변이에 의해 기능 활성화 돌연변이(gain of function)에 의해 유발되는 것으로 알려져있다(F Kara Eroglu, et al., 2015, Pediatr Rheumatol Online J. 13(Suppl 1): O85). 상기 SAVI 환자에서는 STING 단백질의 과잉 활성화로 인해 생후 몇 달 이내에 혈관병증(vasculopathy) 및 조직 손상이 일어나 발진(rash)이 나타나며, 궤양(ulcer) 및 괴사(necrosis)로까지 이어지게 된다. SAVI환자들은 단백질 분해효소인 PSMB8의 돌연변이에 의해 발생하는 자가면역 질환인 Chronic atypical neutrophilic dermatosis with lipodystrophy and elevated temperature (CANDLE) 신드롬과 그 증상이 비슷하다(Liu Y, et al., 2014, N Engl J Med., 371(6):507-518.).

"가족성 동창 루푸스(Familial Chilblain Lupus)"는 추위에 의해 유도되어 말단부에 홍반성 병변이 발생하는 특징을 갖는 질환으로, TMEM173 유전자의 엑손 중 G166E 등의 돌연변이에 의한 IFN-I 활성화 신호에 의해 발병되는 것으로 보고되었다(Nadja Konig, et al., 2017, Ann Rheum Dis., 76(2): 468-472).

"다발성 관절염(polyarthritis)"은 과잉생산된 항체에 의하여 5개소 이상의 관절에서 통증, 종창(swelling) 및 발적(redness)을 비롯한 증상이 나타나는 다발성 손상을 나타내는 질환으로, STING에 의한 신호전달 억제가 다발성 관절염의 치료 표적임이 보고되어 있다(Jeonghyun Ahn, 2012, PNAS, 109(47): 19386-19391).

"vascular and pulmonary syndrome(VAPS)"는 TMEM173 유전자의 엑손 중 N154S, V155M 및 V147L의 변이에 의해 STING 단백질의 과활성화가 일어나, 전신성 염증 및 손가락, 발가락, 코, 뺨 및 귀의 자색(violaceous) 병변과 말단부 괴사(acral necrosis)를 일으키는 질환이다(Liu Y, et al., 2014, N Engl J Med., 371(6): 507-518). TMEM173의 V155M 돌연변이는 type I IFN을 지속적으로 발현시켜 만성 염증을 일으키며, SLE와 비슷하게 혈관병, 폐섬유증 또는 자가항체를 동반한다(Jeremiah N, et al., 2014, J Clin Invest., 124(12): 5516?5520.).

"Systemic lupus erythematosus(SLE)"는 항핵항체가 축적되며 복합적인 조직과 장기의 손상을 동반하는 자가면역 질환이다. Toll-like receptors와 RIG-I, DAI와 같이 핵산을 인지하는 sensor 혹은, 인터페론 조절 인자(interferon regulatory factors)의 돌연변이에 의해 발병하는 것으로 알려져있다. STING 단백질은 다른 자가면역 질환과 달리 SLE에 있어 염증을 일으키는 인자들을 억제하는 능력이 있다(Sharma S, et al, 2015, PNAS, 112(7):E710-7). 따라서 STING의 활성을 억제하는 물질을 치료제로 활용함에 있어 이러한 몇몇의 자가면역 질환에서의 부작용을 고려해야 할 것이다.

상기로부터 SAVI, 가족성 동창 루푸스, 다발성 관절염, VAPS 및 SLE와 같은 자가면역 질환들은 STING 단백질의 과도한 활성으로 유발되는 질환으로, 본 발명의 개비자나무 조성물은 상기 자가면역 질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 개비자나무 추출물 또는 분획물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 19th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제로 제형화될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 경구 투여용 제형은 정제, 구내정(troche), 함당정제(lozenge), 수용성 또는 우성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixir)로 제제화 될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 소르비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마르네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 이외에도 제형으로 제제하기 위해 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일을 추가 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 개비자나무 추출물과 함께 물에서 혼합하여 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 인체에 사용시 안전성 및 효율성을 함께 고려하게 되며, 동물 실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어 있다.경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg 당 본 발명의 개비자나무 추출물을 0.0001~500 mg의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 0.001~100 mg의 양으로 투여하는 것이 바람직하다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 식품으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 음료, 환, 정제(tablet), 캡슐제(capsule), 산제 중에서 선택된 어느 하나의 제형인 것이 바람직하지만 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 카라멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 개비자나무 추출물이 STING에 의해 유도되는 IFN-β 프로모터의 활성을 저해하는 것을 확인하였으므로, 이를 통해 매개되는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다(도 1 참조).

또한, 본 발명은 하기 화학식으로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

[호모해링토닌(Homoharringtonine)]; 또는

[화학식 2]

[해링토닌(Harringtonine)].

상기 화합물들은 1형 인터페론 경로(type I interferon; IFN) 경로를 방해하고, STING 단백질과 TBK1 단백질의 상호작용을 방해하는 특징을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물을 모두 포함한다.

본 발명의 상기 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화 수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, -하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 본 발명의 상기 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수 혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 화학식 1 또는 2로 표시되는 상기 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과 시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약 상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

아울러, 본 발명은 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 자가면역질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 개비자나무에 함유된 것으로 알려진 화합물인 Homoharringtonine(HHT) 및 Harringtonine(HT)는 인터페론 경로에 필요한 STING(stimulator of interferon gene)-유도 IFN-β 프로모터의 활성을 저해할 수 있으며(도 2), cGAMP-유도 ISG(IFN-stimulated gene)인 IFNB1 및 CXCL10의 전사를 억제하는 것으로 나타났다(도 5). HHT 및 HT는 STING 단백질과 TBK1 단백질의 양에 유의미한 영향을 주지는 않으나, STING 단백질과 TBK1 단백질의 상호작용을 방해하고, TBK1 단백질의 활성화를 저해시키는 것으로 확인되어(도 6) 자가면역 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물과 자가면역 질환 개선용 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.

단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

개비자나무 추출물 및 분획물의 제조

전라남도에서 채집한 개비자나무(Cephalotaxus koreana)를 이용하였으며, 성균관대학교 생명과학과의 식물표본과 대조해 채집된 개체가 개비자나무임을 확인하였다. 수집된 개비자나무로부터 2013년에 발표된 논문(Kang et al., PLoS One, vol8(11), e82688.)에서 기재된 방법을 이용해 추출물을 수득하였다.

구체적으로 건조시킨 개비자나무 1.2kg을 분쇄하고, 70% 에탄올 5L를 가하여 72 시간 동안 실온에서 추출한 후, 감압시키면서 용매를 40℃를 미만에서 증발시켜 추출물을 수득하였다. 상기 추출물은 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

< 실험예 1> 개비자나무 추출물의 IFN -β 활성 억제 효과 확인

실험예1 -1. 개비자나무 추출물에 의한 IFN -β 프로모터 활성 억제 효과 확인

개비자나무 추출물이 STING에 의해 매개되는 IFN-β 프로모터의 활성화에 미치는 영향을 확인하고자 루시퍼라아제-리포터 분석(luciferase-reporter assay)을 수행하였다.

LR Clonase^TM enzyme mix(Invitrogen)를 이용해 인간 STING(hSTING) 유전자, TBK1 유전자 및 IRF3 유전자를 pENTR-hSTING(human STING), pENTR-HBK1 및 pENTR-IRF3 벡터로부터 pEF-기반 destination vector에 클로닝해 발현 벡터를 제조했으며, 반딧불(firefly) 루시퍼라아제를 이용하여 IFN-β 프로모터에 의해 조절되는 루시퍼라아제 리포터(IFN-β promoter-driven luciferase reporter) 벡터를 제조했다. 상기 발현벡터와 리포터를 각각 HEK293T cell에 형질 전환(transfection)시켰다. 형질전환된 HEK293T(Human embryonic kidney 293T) cell들에 상기 실시예 1에서 제조한 개비자나무 추출물을 각각 0, 10, 25, 50 및 100 ㎍/ml씩 처리한 후, Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

그 결과, 개비자나무 추출물(CKE)은 STING에 의한 IFN-β 프로모터의 활성화를 억제하였으나, TBK1 및 IRF3에 의한 IFN-β 프로모터의 활성화의 억제에는 유의미한 효과를 나타내지 않았다(도 1의 A). 개비자나무 추출물의 STING에 의한 IFN-β 프로모터 활성화의 50% 억제농도(IC₅₀)는 35.13±3.51 ㎍/ml이었다.

실험예1 -2. 개비자나무 추출물에 의한 IFN -β 활성 조절 단백질 합성 여부 확인

상기 실험예 1-1에서 확인한 개비자나무 추출물의 STING에 의한 IFN-β 프로모터의 활성화 억제 효과가 IFN-β 프로모터 활성화를 억제시킬 수 있는 STING, TBK1 및 IRF3 단백질의 발현량 감소에 의한 것인지를 알아보기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다.

NP40 1%, NaCl 150mM, Tris(pH 7.4) 50mM, 0.25% Na-deoxycholate, 0.1% SDS, EDTA 1mM, PMSF 1mM, NaF 50mM 및 protease inhibitor cocktail(Roche)을 포함한 버퍼 용액에서 ultrasonic homogenizer를 이용하여 30%의 강도로 세포를 파쇄한 후 원심분리 하였다. 상층액을 새로운 tube로 옮긴 후, 단백질 정량을 하였다. 이를 Tris-Cl(pH6.8) 100mM, 4% SDS, 2% β-mercapto EtOH, 2% BPB가 포함된 buffer와 1:1 비율로 섞고 100℃에서 5분간 가열하였다. SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 크키별로 분리한 뒤, nitrocellulose membrane으로 이를 옮겼다. 항-STING 항체(Cat. #13647., Cell Signaling Technology, 1:1000 희석), 항-TBK1 항체(Cat. #05-856., Thermo Fisher Scientific, 1:5000 희석), 항-IRF3 항체(Cat. #4302., Cell Signaling Technology, 1:1000 희석) 및 대조군인 항-Tubulin 항체(Cat. #T5168., Sigma-Aldrich, 1:5000 희석)를 4℃에서 밤새 처리하였다. TBST로 3회 세척한 후 2차 항체로 항-mouse IgG 항체(Cat. #., 115-035-003)와 항-rabbit IgG 항체(Cat. #111-035-003)(각 1:10000 희석)를 상온에서 1시간 처리하였다.

그 결과, 개비자나무 추출물 처리에 의한 STING 단백질의 양에는 차이가 없는 것으로 나타나 개비자나무 추출물에는 IFN-β 프로모터를 활성화시키는 STING의 단백질 발현에는 영향을 주지 않으면서 STING의 작용을 억제함을 알 수 있었다(도 1의 B).

< 실험예 2> 개비자나무 유래 화합물의 STING에 의한 IFN -β 프로모터 활성 억제 효과 비교

개비자나무는 세팔로탁신(evphalotaxine; CET)과 이의 에스테르 류인 호모해링토닌(homoharringtonine; HHT) 및 해링토닌(harringtonine; HT)과 같은 알칼로이드 성분을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 세팔로탁신(CET), 호모해링토닌(HHT) 또는 해링토닌(HT)이 STING에 의한 IFN-β 프로모터 활성화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

실험예 2-1. 개비자나무 함유 화합물의 IFN -β 프로모터 활성 억제 효과 확인

세팔로탁신(CET), 호모해링토닌(HHT) 또는 해링토닌(HT)이 STING에 의한 IFN-β 프로모터 활성화에 미치는 영향을 조사하였다. 실험예 1-1에 개시된 방법을 이용하였으며, 각 화합물은 각각 0, 5, 50 및 500 ng/ml씩 처리하였다.

그 결과, HHT 및 HT는 STING에 의한 IFN-β 프로모터 활성화에 용량-의존적(dose-dependent)으로 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다. IC₅₀은 HHT가 0.267±0.06 ㎍/ml로 나타났으며, HT가 0.663±0.11 ㎍/ml로 나타났다. 또한 TBK1 및 IRF3에 유도되는 IFN-β 프로모터 활성화에서는 용량 의존적인 억제효과는 나타나지 않았으나, HHT 500 ng/ml 처리군에서 TBK1에 의한 IFN-β 프로모터 활성이 27%, IRF3에 의한 IFN-β 프로모터 활성이 38% 감소되는 것으로 나타났다(도 2).

실험예 2-2. 개비자나무 함유 화합물의 IFN -β 활성 조절 단백질 합성 여부 확인

상기 실험예 2-1에서 확인된 화합물의 IFN-β 활성 억제 효과가 IFN-β 프로모터 활성화를 억제시킬 수 있는 STING, TBK1 및 IRF3 단백질의 발현량 감소에 의한 것인지를 알아보기 위해 실시예 1-2와 같이 웨스턴 블롯을 실시하였다.

그 결과, HHT 500 ng/ml 처리시 TBK1의 단백질이 소량 감소하였으나, 전체적으로는 HHT, HT 및 CET 처리시 단백질의 양에 유의미한 감소가 없는 것으로 나타났다(도 3).

실험예 2-3. 개비자나무 함유 화합물의 세포 독성 비교

상기 실험예 2-1에서 나타난 활성 억제 효과가 세포독성에 의한 것인지 확인하기 위하여 HHT, HT 및 CET의 세포독성을 비교하였다.

HEK293T cell 및 THP-1 cell에 HHT, HT 및 CET를 각각 0, 1, 5, 50, 500 ng/mL 및 5 ㎍/ml씩 처리한 후, 12, 24, 36 및 48 시간째에 세포를 수득, 제조사의 프로토콜에 따른 CellTiter-Glo 분석(Promega. Madison, WI)으로 세포 생존율을 조사하였다.

그 결과, HEK293T 세포의 생존은 HTT 및 HT 처리에 의해 영향을 받지 않은 바. HTT 및 HT의 IFN-β 활성화 억제 효과는 세포독성에 의한 것이 아닌 것임을 확인할 수 있었다(도 4).

< 실험예 3> IFN -stimulated gene 발현에 있어서 HHT 및 HT의 영향 확인

STING에 의한 type I IFN 활성화 경로에서 HTT와 HT의 영향을 알아보기 위해 qRT-PCR을 수행하였다.

구체적으로는, THP-1 세포에 HHT, HT 및 CET를 각각 0, 5, 50 ng/mL씩 전처리하고, STING의 작용제(agonist)인 2'3'-cGAMP를 형질전환(transfection)시켰다. 형질전환 6시간 후 제조사의 프로토콜에 따라 Total RNA Prep kit(BioFact)를 이용해 RNA를 분리한 후, QuantiTect reverse transcription kit(Qiagen)로 역전사시켜 cDNA를 제작하였다. cDNA 1μg와 1X HOT FIREPol® EvaGreen® PCR mix Plus(Solis BioDyne) 및 하기 표 1의 프라이머(Forward, Reverse 각 250nM)와 함께 Real-time PCR을 수행하여 IFN-stimulated 유전자들(IFN-stimulated genes; ISG)의 발현 정도를 측정하였다.

유전자	방향	서열
IFNβ1	Forward	ATGACCAACAAGTGTCTCCTCC(서열번호 1)
IFNβ1	Reverse	GCTCATGGAAAGAGCTGTAGTG(서열번호 2)
CXCL10	Forward	TCCACGTGTTGAGATCATTGC(서열번호 3)
CXCL10	Reverse	TCTTGATGGCCTTCGATTCTG(서열번호 4)
GAPDH	Forward	CATGAGAAGTATGACAACAGCCT(서열번호 5)
GAPDH	Reverse	AGTCCTTCCACGATACCAAAGT(서열번호 6)

그 결과, 2'3'-cGAMP 처리에 의해 IFNβ1의 전사 수준은 6.6배, CXCL10의 전사 수준은 249배 증가하였으나, HHT 또는 HT 처리시 용량-의존적(dose-dependent)으로 감소, HHT 및 HT가 2'3'-cGAMP에 의해 유도되는 ISG 유전자들의 발현을 억제함을 알 수 있었다(도 5).

< 실험예 4> HHT 및 HT 처리시 STING과 TBK1의 작용 확인

실험예 4-1. cGAS와 STING에 대한 HHT 및 HT의 효과 확인

HHT와 HT는 c-Myc, Mcl-1 및 cyclin D1과 같은 반감기가 짧은 단백질의 번역을 억제하는 것으로 보고되어 있어 cGAS와 STING에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로는, THP-1 세포에 HHT, HT 및 CET를 각각 50 ng/mL씩 처리하고, 18시간 후 실험예 2-2와 같이 웨스턴 블롯을 실시했다. 1차 항체로는 cGAS(Cyclic GMP-AMP(cGAMP) synthase, Cat. #ABF124, Merck Millipore, 1:1000 희석)와 STING(Cat. #13647, Cell Signaling Technology, 1:1000 희석)을 이용하고, 대조군으로는 Tubulin(Cat. #T5168, Sigma-Aldrich, 1:5000 희석)을 이용했다.

그 결과, 단백질 발현 수준에는 유의미한 변화가 확인되지 않았다(도 6A).

실험예 4-2. STING과 TBK1 상호작용에 대한 HHT 및 HT의 효과 확인

STING 단백질 양의 유의미한 변화는 관찰되지 않은 바, STING와 TBK1 상호작용에 있어서 HHT, HT 및 CET가 미치는 영향을 알아보았다.

구체적으로, hSTING을 발현시키는 벡터를 형질전환시킨 HEK293T cell에 STING과 TBK1 사이의 반응을 유도하도록 2'3'-cGAMP를 처리하고 실험예 2-2에 기재된 것과 같이 면역침강법(Immunoprecipitation; IP)을 수행하였다. 세포에 1% NP40, NaCl 150mM, Tris (pH7.5) 50mM, EDTA 1mM, PMSF 1mM, NaF 50mM, protease inhibitor cocktail을 포함한 buffer를 처리한 뒤 단백질을 정량하였다. 그 후, 비특이적인 결합을 최소화하기 위해 정상 혈청과 A/G 세파로오스 비즈를 넣은 뒤, 4℃에서 30분간 회전시켰다. 원심분리를 통해 상층액만 새로운 tube로 옮긴 뒤, 항 STING 항체(Cat. #13647., Cell Signaling Technology, 1:100 희석)를 4℃에서 밤새 처리하였다. 이튿날 세파로오스 비즈를 넣어주고 씻어준 뒤, SDS-PAGE를 통해 STING과 TBK1의 결합 정도를 확인하였다. 아울러 세포 파쇄물(lysate)에 대하여 STING과 TBK1 외에도 TBK1 단백질의 활성화를 항 p-TBK 항체(Cat. #5483., Cell Signaling Technology, 1:1000 희석)를 이용하여 웨스턴 블롯법으로 조사하였다.

그 결과, STING이 과발현된 HEK293T 세포에서 2'3'-cGAMP를 처리한 경우 STING 및 TBK1의 상호결합 및 이에 따른 TBK1의 인산화가 유도되었으나, HHT나 HT를 처리한 경우 상기 과정이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이는 HHT나 HT가 STING 및 TBK1의 상호 작용을 방해하여 2'3'-cGAMP에 의한 신호 전달 경로(signaling pathway)를 억제할 수 있음을 나타낸다(도 6B).

<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation <120> A Composition comprising extracts or isolated compounds of Cephalotaxus koreana for prevention or treatment of autoimmune diseases <130> 2018P-01-031 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-b-F <400> 1 agtccttcca cgataccaaa gt 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-b-R <400> 2 gctcatggaa agagctgtag tg 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL10-F <400> 3 tccacgtgtt gagatcattg c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL10-R <400> 4 tcttgatggc cttcgattct g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 5 catgagaagt atgacaacag cct 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 6 agtccttcca cgataccaaa gt 22

Claims

개비자나무(Cephalotaxus koreana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, STING(stimulator of interferon genes) 단백질의 과도한 활성으로 유발되는 자가면역질환으로서 SAVI(STING-associated vasculopathy with onset in infancy), 가족성 동창 루푸스(Familial Chilblain Lupus), 다발성 관절염(polyarthritis), 및 VAPS(vascular and pulmonary syndrome)로 이루어진 군에서 선택된 하나의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 개비자나무를 물, C₁내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 개비자나무는 개비자나무의 뿌리, 줄기, 잎 및 꽃으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 1형 인터페론(type I interferon; IFN) 신호 전달 경로를 방해하는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 STING 단백질과 TBK1 단백질의 상호작용을 방해하는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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개비자나무(Cephalotaxus koreana) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, STING(stimulator of interferon genes) 단백질의 과도한 활성으로 유발되는 자가면역질환으로서 SAVI(STING-associated vasculopathy with onset in infancy), 가족성 동창 루푸스(Familial Chilblain Lupus), 다발성 관절염(polyarthritis), 및 VAPS(vascular and pulmonary syndrome)로 이루어진 군에서 선택된 하나의 개선용 건강기능식품.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 하기 화학식으로 기재되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]

[호모해링토닌(Homoharringtonine)]; 또는
[화학식 2]

[해링토닌(Harringtonine)].
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