JP7060500B2

JP7060500B2 - 薬学的組成物の製造方法、医薬部外品組成物の製造方法、飼料組成物の製造方法、及び、飲用水添加剤の製造方法

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Publication number: JP7060500B2
Application number: JP2018502085A
Authority: JP
Inventors: ムンチュアルリョ; スンウンイ; ウーソンイ; サンヒュンキム; ソヤンイ; スンンジェイ; キュンソクジュン
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2036-07-15
Also published as: WO2017014502A1; EP3326638A4; KR101825179B1; KR20170010303A; EP3326638B1; JP2018529637A; JP2022023067A; EP3326638A1

Description

本発明は、ハマナス（Rosa rugosa）花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６（interleukin-6）媒介性疾患の予防又は治療用薬学的組成物及び前記組成物をＩＬ－６媒介性
疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、ＩＬ－６媒介性疾患の治療方法に関する。また、本発明は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用食品組成物、医薬部外品組成物、飼料組成物及び飲用水添加剤に関する。

インターロイキン-６（ＩＬ－６）は、Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ２）又はインターフェロンβ２（ＩＮＦ-β２）とも呼ばれるサイトカインであって、Ｂリンパ球の活性化に
関与する分化因子として発見された（非特許文献１）。ＩＬ－６は、細胞膜上の２種類のタンパク質を媒介としてその生物学的活性を伝達するが、そのうちの一つは、ＩＬ－６が結合するタンパク質であるＩＬ－６受容体であり、細胞膜を貫通して発現される、分子量約８０ｋＤの膜結合型タンパク質である。他の一つは、非リガンド結合性のシグナル（signal）伝達系に属する、分子量約１３０ｋＤの膜タンパク質であるｇｐ１３０である。ＩＬ－６とＩＬ－６受容体は、ＩＬ－６/ＩＬ－６受容体複合体を形成し、続いてｇｐ１３
０と結合する（非特許文献２）。リガンドと受容体が結合すると、細胞内では、ＪａｎｕｓＫｉｎａｓｅｓ２（ＪＡＫ２）がリン酸転移反応（transphosphorylation）によって活性化される。また、前記活性化されたＪＡＫ２によって受容体の細胞質ドメインの様々なチロシン残基（tyrosine residues）がリン酸化（phosphorylation）され、これはＳＨ２や、他のリン酸チロシン結合モチーフ（phosphotyrosine binding motif）を有してい
るＳＴＡＴ３（signal transducers and activators of transcription 3）のような細胞質内タンパク質のドッキングサイト（docking site）の役割を果たす。受容体の細胞質ドメインに結合したＳＴＡＴ３はＪＡＫ２によってリン酸化（phosphorylation）された後
、受容体から離れて出てくる。活性化されたＳＴＡＴ３は、細胞質内に互いに結合してホモ（homo-）又はヘテロダイマー（heterodimer）を成した後、核内に入って目的遺伝子の認識配列（recognition sequence）に結合して転写を増加させる（非特許文献３及び非特許文献４）。

ＳＴＡＴ３（signal transducers and activators of transcription 3）は、関節リウマチを含む自己免疫疾患又は骨粗しょう症のＮＦ-κＢとは異なるもう一つの重要な転写
因子としての役割を果たすことが知られている。特に、ＳＴＡＴ３はサイトカインであるＩＬ－６によって活性化されることがよく知られており、表皮成長因子（Epidermal growth factor、EGF）もＩＬ－６によって活性化されると知られている。最近、骨粗しょう症とＩＬ－６との関連性についての研究結果が多く報告されているが、特に、ＩＬ－６により誘導されるＳＴＡＴ３活性が破骨細胞の分化と骨の生成に重要な役割を果たすということが、動物モデルを用いて証明され（非特許文献５）、ＳＴＡＴ３欠乏マウス（ＳＴＡＴ３-deficient mice）の場合、骨密度及び骨体積が減少し、骨粗しょう症に悪影響を与え
る破骨細胞数が増加されることが観察されたことがある（非特許文献６）。一方、ＩＬ－６により誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害する化合物であるマジンドリンＡ（madindoline A）を閉経期の骨粗しょう症の実験のための動物モデルであるＯＶＸマウスに処
理すると、骨の再吸収を阻害し（非特許文献７）、エストロゲン欠乏の骨粗しょう症モデルでは、ＩＬ－６による破骨細胞の分化が骨髄細胞から増加し（非特許文献８）、ＩＬ－６-/-マウスモデルでは、エストロゲン枯渇による骨の損失と破骨細胞の前駆体数の増加
などの変化が現われないことも報告された（非特許文献９）。前記のようなことは、ＩＬ－６が、特に、ＳＴＡＴ３のリン酸化を介して骨の形成及び再吸収に重要に作用すること
を示す。

これに関連し、ＩＬ－６により誘導されるシグナル伝達システムと骨粗しょう症などの骨代謝性疾患、炎症性疾患、又は自己免疫疾患との関連性について様々な研究が活発に行われているが、特に、ＩＬ－６のシグナル伝達システムの抑制について抗ＩＬ－６Ｒ抗
体（anti-ＩＬ－６ receptor antibody）を用いたことが最も広く知られている。具体的
には、抗ＩＬ－６Ｒ抗体を用いた関節リウマチに対する滑液細胞の成長阻害剤（特許文
献１）、抗ＩＬ－６Ｒ抗体を用いた形質球増加症、超免疫グロブリン血症、貧血、腎炎
、悪液質、関節リウマチ、牧畜業者の疾病及び脈管増殖腎炎のようなＩＬ－６産物に起因する疾病の治療などが既に知られている（特許文献２）。また、抗ＩＬ－６Ｒ抗体が多
発性硬化症、ブドウ膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性過敏症及びアトピー性皮膚炎のような敏感Ｔ細胞関連疾患（特許文献３）、全身性エリテマトーデスの治療、クローン病の治療（特許文献４）、膵臓炎の治療（特許文献５）、乾癬の治療（特許文献６）及び若年性慢性関節炎の治療（特許文献７）に適用されうることも報告された。しかし、前記抗ＩＬ－６
Ｒ抗体が個体内に導入される場合には、外来タンパク質として認知されうる部分である
エピトープを有することがあるため、治療剤として用いられる場合は、まだ免疫原として作用するという問題点がある。前記のような問題点を解決するために、免疫システムに認識できないタンパク質ではなく、小分子化合物（small molecule compound）を用いて、
ＩＬ－６によって媒介される疾患の治療剤を開発するために、多くの研究がなされている。

国際特許公開第９６/０１１０２０号国際公開特許第９６/０１２５０３号国際特許公開公報第９８/０４２３７７号国際特許公開公報第９９/０４７１７０号国際特許公開公報第００/０１０６０７号国際特許公開公報第０２/０３４２９２号国際特許公開公報第０２/０８０９６９号

Nature 1986, 324, 73-76 J. Exp. Med 1987, 166, 967 Nat Rev Mol Cell Biol 2002, 3, 651-62 Science 1997, 277, 1630-1635 Bone 2006, 39, 505-512 BBRC 2005, 328, 800-807 PNAS, 2002, 99(23), 14728-14733 Science, 1992, 257, 88-91 EMBO J 1994, 13, 1189-1196 Namba (1994) The encyclopedia of Wakan-yaku(traditional Sino-Japanese Medicines) which color pictures Vol (II). Hoikuaha, Tokyo. p.118 韓資植誌23(2):157～164(2010) Korean J. Plant Res. (2010.04.16.) Kim K et al., J Immunol. 2007 May 1;178(9):5588-94. Clin Exp Immunol. 2006 Nov;146(2):262-9. Rheumatology, 2014, 53(1), 56-64

このような背景下、本発明者らはＩＬ－６によって活性化されるＳＴＡＴ３経路を目標としてＩＬ－６媒介性疾患に治療効果のある天然物を検索するために鋭意努力した結果、ハマナス抽出物、特にハマナスの花抽出物が細胞毒性を示すことなく、ＩＬ－６により誘導される転写因子であるＳＴＡＴ３の転写活性及びリン酸化を阻害してＩＬ－６によって媒介されるシグナル伝達システムを効果的に阻害し、破骨細胞の分化を阻害する、優れた活性を有することを確認することにより、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記組成物の使用を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、前記薬学的組成物をＩＬ－６媒介性疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、ＩＬ－６媒介性疾患の治療方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用食品組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用医薬部外品組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用飼料組成物を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用飲用水添加剤を提供することにある。

本発明は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関するもので、ＩＬ－６により誘導されるシグナル伝達システムを阻害し、破骨細胞の分化を抑制することにより、ＩＬ－６媒介性疾患、具体的には、骨代
謝性疾患、炎症性腸疾患、又はアトピー性皮膚炎の予防又は治療に有用に用いられる。特に、ハマナスの花抽出物は、他の部位の抽出物とは異なり細胞毒性がなく、長い間、食品に用いられてきた天然物に由来し副作用がなく、前記の疾患の治療に用いられるという利点がある。

ハマナスの花エタノール抽出物、ハマナスの花水抽出物、及びハマナスの果実エタノール抽出物のＩＬ－６誘導ルシフェラーゼ発現を阻害する活性に関する。ハマナスの花エタノール抽出物、ハマナスの花水抽出物、及びハマナスの果実エタノール抽出物の細胞毒性の比較に関する。ハマナスの花エタノール抽出物とハマナスの果実エタノール抽出物のＲＡＮＫＬ誘導破骨細胞の分化を抑制する活性に関する。炎症性骨粗しょう症のマウスモデルを用いて、ハマナスの花抽出物の骨粗しょう症誘導の抑制効果に関する。ＤＳＳ誘導の炎症性腸疾患の動物モデルにおいて、ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物の炎症性腸疾患の抑制効果に関する。ＤＳＳ誘導の炎症性腸疾患の動物モデルにおいて、ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物の炎症性サイトカインの抑制効果に関する。ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物の細胞毒性の比較に関する。ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物の炎症性サイトカインの抑制効果に関する。ハマナスの花水抽出物の炎症性サイトカインの抑制効果に関する。ハマナスの花水抽出物のＳＴＡＴ１とＮＫ-κＢタンパク質活性化の抑制効果に関する。

前記目的を達成するための本発明の一つの態様は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６（interleukin-6）媒介性疾患の予防又は治療用薬学的組成物及び前記
組成物の使用を提供する。

本発明で用語、「ハマナス（Rosa rugosa Thunberg）」は、バラ科の落葉低木であり、ロサムルチン（rosamultin）、クェルセチン（quercetin）、クエン酸（citric acid）
、リンゴ酸（malic acid）、リコペン（lycopene）、トルメント酸（tormentic acid）、オイスカフ酸（euscaphic acid）、ｂｉｓａｂｏｒｏｓａｏｌＡなどの様々な成分を含有し、観賞用及び香水の原料や、吐血、下痢、月経不順、赤痢、疲労回復、又は糖尿病の治療の民間療法で用いられると知られている。しかし、ハマナスの抽出物、特に、ハマナスの花抽出物がＩＬ－６媒介性疾患、具体的には、炎症性腸疾患、骨粗しょう症などの骨代謝性疾患、又はアトピー性皮膚炎の治療用途については知られておらず、本発明者らによって初めて究明された。本発明で、ハマナスは商業的に販売されるものを購入したり、自然から採取又は栽培されたりしたものを用いてもよい。

本発明で用語、「ハマナスの花抽出物」は、ハマナスの花から抽出して収得した抽出物を意味する。本発明は、ハマナスの多様な部位のうち、ハマナスの花抽出物がＩＬ－６媒介のＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ阻害活性に顕著な効果があることを確認したもので、具体的には、ハマナスの果実抽出物と比較して、その優秀さを確認した。

前記ハマナスの花抽出物は、乾燥重量の約２～２０倍、具体的には、約３～５倍に達する体積の水、メタノール、エタノール又はブタノールなどの炭素数１（Ｃ１）～４（Ｃ４）の低級アルコールの極性溶媒又はこれらの約１：０．１～１：１０の混合比を有する混合溶媒を溶出溶媒として用い、抽出温度は２０～１００℃、具体的には、室温で、抽出期
間は約１２時間～４日間、熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出又は超音波抽出などの抽出方法を用いて抽出してもよいが、ＩＬ－６媒介性疾患の治療活性のある物質を抽出する方法であれば、制限なく用いてもよい。具体的には、１回～５回連続抽出して減圧ろ過し、そのろ過抽出物を真空回転濃縮機で２０～１００℃、より具体的には、室温で減圧濃縮して、水、低級アルコール又はこれらの混合溶媒に可溶なハマナスの花抽出物を収得した結果物になってもよいが、本発明のＩＬ－６媒介性疾患の治療効果を示すことができる限り、これに限定されず、抽出液、抽出液の希釈液又は濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物又は精製物をすべて含む。前記ハマナスの花抽出物は、天然、雑種、変種植物から抽出されてもよく、単独で、又は他の薬学的活性抽出物、分画物又は化合物との結合だけでなく、適切な集合で用いてもよい。本発明の一実施例では、粉末化されたハマナスの花にエタノール又は水を入れ、室温で抽出した（実施例１）。

本発明のハマナスの花抽出物は、ＳＴＡＴ３（signal transducers and activators of
transcription 3）の活性を阻害して、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は治療に効果的に用いられる。

本発明で用語、「ＩＬ－６媒介性疾患」は、ＩＬ－６によるシグナル伝達経路が活性化されて発病する疾患を総称する意味で、具体的には、ＩＬ－６によってＳＴＡＴ３がリン酸化されて活性化されることによって発病する疾病を意味する。本発明の目的上、前記ＩＬ－６媒介性疾患は、本発明のハマナスの花抽出物によって予防又は治療されうる疾患であれば、制限なく含まれ、その例として骨代謝性疾患、炎症性腸疾患、又はアトピー性皮膚炎であってもよいが、これに限定されない。具体的に、ＩＬ－６は、ｇｐ１３０、ｇｐ８０のような受容体に結合して、ＳＴＡＴ３タンパク質のリン酸化をもたらし、これにより活性化されたＳＴＡＴ３タンパク質は核内に入って標的遺伝子を発現させることにより、骨代謝性疾患、炎症性腸疾患、又はアトピー性皮膚炎の発病又は進行をもたらすことができる。

本発明で用語、「骨代謝性疾患」には、過剰な破骨細胞の骨吸収による骨粗しょう症、関節リウマチ、歯周疾患、パジェット病及び転移性がんなどの病理学的骨疾患があり、骨破壊を促進する疾患が含まれるが、ＩＬ－６によるシグナル伝達経路が活性化されて発病する骨疾患であれば、制限なく含まれてもよい。具体的に、「骨粗しょう症」は、骨の量が減少し、質的な変化により骨の強度が弱くなって骨折が起こる可能性が高い状態を意味する。骨は人体内の多様な器官を保護し、カルシウムのような体内に必要な物質を保管する保管所として機能し、骨組織に存在する骨を分解する破骨細胞（Osteoclast）及び骨を生成する骨芽細胞（Osteoblast）の間のバランスにより恒常性が維持される。骨粗しょう症の場合には、両方の細胞活性のバランスが崩れて破骨細胞による過度の骨の破壊が起きて発症及び進行される。骨粗しょう症における主な分子としてはＲＡＮＫＬ（Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand）があり、ＲＡＮＫＬがその受容体に結合
して多様な転写因子を活性化させて破骨細胞の分化を促進し、特に、ＩＬ－６は、ＲＡＮＫＬによって媒介される破骨細胞の分化を促進させることが知られている（非特許文献１２）。したがって、ＩＬ－６によって活性化されるシグナル伝達を抑制し、破骨細胞の分化を抑制させて、破骨細胞による骨の破壊を減少させることができる物質の場合、骨粗しょう症の治療剤として用いてもよい。本発明のハマナスの花抽出物は、ＲＡＮＫＬによって誘導される破骨細胞の分化抑制を効果的に抑制させるため、骨粗しょう症の予防又は治療に有効に用いられることが確認された。

本発明で用語、「炎症性腸疾患（inflammatory Bowel Disease、IBD）」は、腸の粘膜
細胞で外部の微生物と抗原提示細胞によってＣＤ４＋Ｔリンパ球の異常な活性化が起こ
り、これに伴う炎症性サイトカイン（ＴＮＦ-α、ＩＬ－６、ＩＬ-１２、ＩＬ-１７、Ｉ
Ｌ-２３及びＩＬ-２７）が持続的に発現されて誘発される病気で、本発明では、ＤＳＳ処
理によって誘導される炎症性腸疾患の動物モデルで予防又は治療効果を確認した。

本発明で用語、「アトピー性皮膚炎」は、皮膚疾患の一種であり、皮膚の腫物、湿疹、かゆみを伴う病気である。前記アトピー性皮膚炎の発症には、環境的な要因及び遺伝学的要因の両方が関与することが知られているが、正確な発症機序は究明されていない。前記アトピー性皮膚炎は、ケラチン細胞又は内皮細胞から由来するタンパク質を抗原として認識し、免疫反応を引き起こす症状を現すことがあるが、これに限定されない。既存の報告によると、アトピー性皮膚炎は、ＣＤ２８に対する自己抗体を有することを特徴とし、前記ＣＤ２８自己抗体は、Ｔ細胞の活性化をもたらすことだけではなく、アトピー性皮膚炎及び他の炎症性皮膚疾患と区別できる特徴と提示されたことがある（非特許文献１３）。最近、アトピー性皮膚炎は乳幼児だけでなく、成人にも頻繁に発症し、その予防又は治療が重要な社会的な問題となっているが、その原因が明確であり、また、既存に用いられているステロイド製剤などの効果が不備で、副作用の問題があるため、効果に優れて、乳幼児にも使用可能な安全なアトピーの治療剤の開発が要求されている実情である。本発明の組成物は、天然物から由来したもので、ステロイド製剤などに比べて乳幼児に適用するのに安全な利点があり、前記組成物を用いてＩＬ－６媒介経路を遮断し、ＩＬ－６媒介シグナル伝達経路による浮腫をはじめとするアトピー性皮膚炎に伴う様々な炎症現象を緩和させることにより、アトピー性皮膚炎を効果的に治療することができることを確認した。

本発明の骨代謝性疾患、炎症性腸疾患及びアトピー性皮膚炎は、ＩＬ－６により誘発されるものであってもよい。

本発明のハマナスの花抽出物は、破骨細胞の分化を抑制し、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は治療に効果的に用いてもよい。具体的に、前記ハマナスの花抽出物は、ＲＡＮＫＬ（Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand）によって誘導される破骨細胞
の分化を抑制することができる。

本発明で用語、「破骨細胞」は、造血細胞から由来する骨吸収に関与する細胞であって、骨の再形成において重要な役割を果たす。破骨細胞による骨吸収は破骨細胞前駆体への分化、融合による多核性破骨細胞の形成、及び骨吸収のための成熟した破骨細胞の活性化を含むいくつかのステップで構成される。成熟した多核性破骨様細胞（OCL）は、骨の再
吸収の間に正常的なアクチン細胞骨格の構造、波状の端、及び酸性条件を維持する。

本発明で用語、「ＲＡＮＫＬ」はreceptor activator of nuclear factor kappa－B ligandの略語であり、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー（tumor necrosis
factor ligand superfamily member 11、TNFSF11）、ＴＮＦ関連活性化誘導性サイトカ
イン（TNF-related activation-induced cytokine、TRANCE）、オステオプロテゲリンリ
ガンド（osteoprotegerinligand、OPGL）、及び破骨細胞分化因子（osteoclast differentiation factor、ODF）としても知られている。ＲＡＮＫＬはＴＮＦＳＦ１１遺伝子によってコードされるヒトのタンパク質であって、タイプIIの膜タンパク質であり、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor、TNF）スーパーファミリーの一構成として知られている。

本発明で用語、「予防」は、前記組成物の投与によりＩＬ－６媒介疾患を抑制したり、発病を遅延させるすべての行為を意味し、「治療」は、前記組成物の投与によりＩＬ－６媒介疾患による症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味する。

本発明のハマナスの花抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤、及び希釈剤をさらに含んでもよい。具体的に、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用してもよい。この
際、前記組成物に含まれるハマナスの花抽出物の含量は、特に限定されないが、組成物の総重量に対して、０．０００１～１０重量％で含まれてもよく、より具体的には、０．００１～１重量％で含まれてもよい。

前記薬学的組成物は、担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を含んでもよい。前記組成物を剤形化する場合は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製してもよい。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれてもよく、これらの固形製剤は、ハマナスの花抽出物を含み、一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（calcium carbonate）、スクロ
ース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤してもよい。また、単純な賦形剤の他にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当してもよく、一般的に用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれてもよい。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼ
ラチンなどが用いられてもよい。

本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与されてもよい。

本発明で用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット/リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及
び重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されてもよい。本発明の組成物は、個々の治療薬として投与するか、他の治療薬と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次的又は同時に投与されてもよい。そして、単一又は複数に投与されてもよい。前記要素をすべて考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されてもよい。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、病気の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、好ましい効果のために、本発明のハマナスの花抽出物は、１日０．０００１～１００ｍｇ/ｋｇで
あり、好ましくは０．００１～１００ｍｇ/ｋｇで投与されてもよく、より具体的には、
０．００１～５００ｍｇ/ｋｇが投与されてもよい。投与は、１日に１回投与してもよく
、数回に分けて投与してもよい。前記組成物は、ラット、家畜、ヒトなどの様々な哺乳動物に多様な経路で投与してもよく、投与の方式は、当業界の通常の方法であれば、制限なく含まれ、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜又は脳血管内注射によって投与されてもよい。

本発明の具体的な一実施例では、ハマナスの花エタノール抽出物と水抽出物がＩＬ－６により誘導されるＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ活性を効果的に抑制し、ハマナスの果実エタノール抽出物より著しく優れた活性を示し（図１）、前記ハマナスの花抽出物で示される細胞毒性は、果実抽出物に比べて顕著に低いことを確認した（図２）。また、本発明のハ
マナスの花抽出物が破骨細胞の分化に影響を与えるかどうかをハマナスの果実抽出物と比較した結果、ハマナスの花エタノール抽出物は、６０及び３０μｇ/ｍｌ濃度でＲＡＮＫ
Ｌによって誘導される破骨細胞の分化を抑制する活性が優れた反面、ハマナスの果実抽出物はその効果が微々たることを確認した（図３）。

又はマナスの花抽出物がＩＬ－６媒介性疾患における影響を確認したが、具体的に、炎症性骨粗しょう症のマウスモデルにハマナスの花抽出物を投与すると、ＬＰＳ誘導グループでの低下した骨密度及び骨質量が有意に回復し（図４）、炎症性腸疾患のマウスモデルにハマナスの花抽出物を投与すると（５００ｍｇ/ｋｇ）、ＤＳＳ処理により誘導される
ＩＢＤの症状が治療されて、また炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ-１７、ＩＦＮ-γ）も効果的に抑制されることを確認した（図５及び６）。アトピー性皮膚炎の場合、前記皮膚炎の誘発時に重要なＨａＣａＴ細胞から１０００μｇ/ｍｌ濃度でも毒性を示すこと
なく、また炎症性サイトカインであるＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、ＩＬ－６、ＣＣＬ１７を抑制する効果があった（図７及び８）。

特に、ハマナスの水抽出物の場合は、エタノール抽出物よりも炎症性サイトカインの抑制効果が非常に優れており、濃度依存的に阻害し（図９）、１００μｇ/ｍｌ濃度でＴＮ
Ｆ-α/ＩＮＦ-γによって活性化されるＳＴＡＴ１のリン酸化及びIκBα分解抑制を介し
てＮＫ-κＢを減少する効果があることも確認された（図１０）。

本発明の他の一つの態様は、前記組成物をＩＬ－６媒介疾患の疑いのある個体に投与する段階を含む、ＩＬ－６媒介疾患の治療方法を提供する。

前記組成物、ＩＬ－６媒介性疾患及び治療については、前記で説明したとおりである。

具体的には、本発明の治療方法は、前記薬学的組成物を薬学的有効量でＩＬ－６媒介疾患の疑いのある個体内に投与することを含む。前記個体は犬、牛、馬、ウサギ、マウス、ラット、鶏又はヒトを含む哺乳類全体を意味し、前記の例により本発明の哺乳類が限定されるものではない。前記薬学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内に投与されてもよく、局部的免疫抑制治療のために、必要であれば病巣内投与を含む、適切な方法により投与されてもよい。本発明の前記薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されてもよい。

本発明のもう一つの態様は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用食品組成物を提供する。

前記ハマナスの花抽出物及びＩＬ－６媒介性疾患については、前記で説明したとおりである。

具体的に、本発明の抽出物をＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善を目的に、具体的には、骨代謝性疾患、炎症性腸疾患、又はアトピー性皮膚炎の改善を目的に、食品組成物に添加してもよい。

本発明の抽出物を食品添加物として用いる場合、前記ハマナスの花抽出物をそのまま添加したり、他の食品又は食品成分と一緒に用いたりしてもよく、通常の方法に従って適切に用いてもよい。有効成分の混合量は使用目的（予防、健康又は治療的処置）に基づいて適切に決定されてもよく、食品学的に許容可能な食品補助添加剤をさらに含んでもよい。本発明の組成物は、天然物から由来した抽出物を有効成分とするため、安定性の面での問題がなく、混合量に大きな制限はない。また、本発明の食品組成物は、通常の意味の食品
をすべて含んでもよく、機能性食品、健康機能食品などの当業界に知られている用語と混用してもよい。

本発明の用語、「機能性食品」は、健康機能食品に関する法律第６７２７号による人体への有用な機能性を有する原料や成分を用いて製造及び加工した食品を意味し、「機能性」とは、人体の構造及び機能についての栄養素を調節したり、生理学的作用などの保健の用途に有用な効果を得る目的で摂取したりすることを意味する。また、「健康機能食品」は、健康補助の目的で、特定の成分を原料にしたり、食品の原料に含まれている特定の成分を抽出、濃縮、精製、混合などの方法で製造、加工したりした食品をいい、前記成分によって生体防御、生体リズムの調節、疾病の防止と回復など生体調節機能を生体に対して十分に発揮できるように設計されて加工された食品をいい、前記健康食品用組成物は、病気の予防及び病気の回復などに関連した機能を行うことができる。

本発明の組成物が使用できる食品の種類には制限がない。また、本発明のハマナスの花抽出物を有効成分として含む組成物は、当業者の選択により食品に含有してもよい適切なその他の補助成分と公知の添加剤を混合して製造してもよい。添加してもよい食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、本発明に係る抽出物を主成分として製造した汁、お茶、ゼリー及びジュースなどに添加して製造してもよい。

また、本発明に適用してもよい食品には、例えば、特殊栄養食品（例えば、調製油、乳幼児食など）、食肉加工品、魚肉製品、豆腐類、こんにゃく類、麺類（例えば、ラーメン類、麺類など）、健康補助食品、調味食品（例えば、醤油、味噌、コチュジャン、混合ジャンなど）、ソース類、お菓子類（例えば、スナック類）、乳加工品（例えば、発酵乳、チーズなど）、その他の加工食品、キムチ、漬物食品（各種キムチ類、ピクルスなど）、飲料（例えば、果実、野菜類飲料、豆乳類、発酵飲料類など）、天然調味料（例えば、ラーメンスープなど）など、すべての食品を含んでもよい。

本発明の健康機能食品組成物が飲料の形態で用いられる場合は、通常の飲料のように様々な甘味料、香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。前記の他、本発明の健康機能食品組成物は様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有してもよい。他の天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。

本発明の他の一つの態様は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用医薬部外品組成物を提供する。

具体的に、本発明のハマナスの花抽出物をＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善を目的として医薬部外品組成物に添加してもよい。

本発明で用語、「医薬部外品」は、人や動物の病気を治療、軽減、処置又は予防する目的で用いられる繊維、ゴム製品、又はこれに類似したもの、人体に対する作用が弱いか、人体に直接作用せず、器具又は機械ではないものとこれと類似したもの、感染予防のため
に殺菌、殺虫及びこれらと類似する用途に用いられる製剤のいずれかに該当する物品であって、人や動物の病気を診断、治療、軽減、処置又は予防の目的で使用する物品の中で、器具、機械又は装置でないもの及び人や動物の構造と機能に薬理学的な影響を与える目的で使用する物品の中で、器具、機械又は装置でないものを除く物品を意味し、皮膚外用剤及び個人衛生用品も含む。

本発明のハマナスの花抽出物をＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善を目的として医薬部外品組成物に添加する場合、前記抽出物をそのまま添加したり、他の分画物や他の医薬部外品の成分と一緒に用いてもよく、通常の方法によって適切に用いてもよい。有効成分の混合量は、使用目的に応じて適切に決定してもよい。

前記皮膚外用剤は、特にこれに限定されないが、好ましくは、軟膏剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、クリーム剤、散剤、懸濁剤、ゲル剤又はゲルの形態で製造されて用いてもよい。前記個人衛生用品には、特にこれに限定されないが、好ましくは、石鹸、化粧品、ウェットティッシュ、ティッシュペーパー、シャンプー、スキンクリーム、顔クリーム、歯磨き粉、口紅、香水、メイクアップ、ファンデーション、チーク、マスカラ、アイシャドウ、日焼け止めローション、毛髪手入れ製品、エアフレッシュナーゲル又は洗浄ゲルであってもよい。また、本発明の医薬部外品組成物の別の例として、消毒清潔剤、シャワーフォーム、カグリン、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドソープ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤又はフィルタ充填剤がある。

本発明のもう一つの態様は、ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用飼料組成物を提供する。また、前記ハマナスの花抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善用飲用水添加剤を提供する。

前記ハマナスの花抽出物のＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善については、前記で説明したとおりである。

本発明の目的上、ハマナスの花抽出物はＩＬ－６媒介性疾患の改善のための目的で用いることができるため、飼料や飲用水の添加剤として含まれてもよい。

本発明で用語、前記「飼料組成物」は、栄養的又は特定の目的のために飼料に微量に添加される物質を総称するもので、本発明ではＩＬ－６媒介性疾患の改善を目的として添加される物質を意味し、「飲用水添加剤」は、栄養的又は特定の目的のために動物を対象とする飲用水に微量に添加される物質を総称するもので、本発明ではＩＬ－６媒介性疾患の予防又は改善を目的として添加される物質を意味する。

本発明のハマナスの花抽出物は、前記飼料組成物に飼料添加物として含まれてもよく、前記飼料は、動物に供給されるすべての食品を総称する意味で使用されてもよい。
本発明で用語、「動物」は、家畜及びペットを含む概念であり、具体的には、犬、猫などのペットと豚、牛などであってもよいが、これに限定されたものではない。本発明の飼料組成物又は飲用水添加剤には、品質の低下を防止するために添加される結着剤、乳化剤、保存剤などをさらに含んでもよく、効用増大のために添加されるアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、プロバイオティクス、香味剤、非タンパク態窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴ糖などをさらに含んでもよく、その他にも飼料の混合剤などをさらに含んでもよく、これに限定されるものではない。
（実施例）
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：ハマナスの部位別抽出物の製造
ハマナスの花と果実を水できれいに洗浄して日陰で乾燥した後、ワーリンブランドで粉末化させた。粉末化されたハマナスの花と果実５００ｇをエタノール５ｌに入れて抽出器により１０時間、７０℃で抽出した後、ろ紙（ワットマン社、アメリカ）で減圧ろ過した後、ろ過抽出物は、真空回転濃縮機で室温にてエタノール溶媒を除去した後、抽出された残渣としてハマナスの花と果実のエタノール抽出物を得た。また、粉末化されたハマナスの花５００ｇを蒸留水５ｌに入れ、常温で２４時間抽出した後、ろ紙（ワットマン社、アメリカ）で減圧ろ過した後、ろ過抽出物は真空回転濃縮機で室温にて水を除去した後、抽出された残渣としてハマナスの花の水抽出物を収得した。

実施例２：ハマナスの花抽出物のＩＬ－６により誘導されるＳＴＡＴ３の転写活性の抑制効果の確認
ハマナスの部位別抽出物のＩＬ－６により誘導されるＳＴＡＴ３の発現抑制効果を測定するために、次のような実験を行った。

２-１．形質転換体の製造
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣＨＢ-８０６４）にｐＳＴＡＴ３-ＬｕｃとｐｃＤＮＡ３．
１（＋）（Clontech laboratories、Palo Alto、CA）をリポフェクタミンプラス（Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA）で一緒に形質転換させた。２日後からハイグロマイシン（hygromycin）を処理（１００μｇ/ｍｌ）してルシフェラーゼ（luciferase）が安定して発現されるクローン（clone）を得た。このクローンからルシフェラーゼが安定して発現さ
れるかは、ルシフェラーゼ分析によって確認した。

２-２．ＩＬ－６反応性ＳＴＡＴ３レポーター遺伝子の検査
前記形質転換した細胞をＤＭＥＭ（GIBCO 119950965）で無血清培養（serum starvation）し、試料を下記のように１時間処理した後、１０ｎｇ/ｍｌＩＬ－６（R＆D system、USA）を添加して１２時間培養した。

１：陰性対照群（非処理群）;
２：陽性対照群（ＩＬ－６１０ｎｇ/ｍｌ）;
３：抽出物（１０、３０、６０μｇ/ｍｌ）
前記反応した細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μｌの溶解緩衝液（luciferase assay system、promega、USA）を入れて２０分間攪拌した後、３０-１００μｌのルシフェラーゼ基質（luciferase assay system、promega、USA）を入れて発色程度をルミノメーター（luminometer; EG＆G BERTHOLD、USA）で５分以内に測定した。薬物陽性対照群では、ＩＬ－６
活性阻害効果を有する化合物であるＯｌｅａｎｏｌｉｃＡｃｉｄＡｃｅｔａｔｅ（ＯＡＡ）を用いた（非特許文献１４）。実験の結果、ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物は、濃度依存的にＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ活性を阻害し、特に、ハマナスの花抽出物が６０μｇ/ｍｌの時、９７．９％の阻害効果が示されるほど顕著な効果があることを
確認した。これに対し、ハマナスの果実エタノール抽出物は、ハマナスの花抽出物と比較するとやや弱い活性を示した（図１）。

これらの結果を通じて、ハマナスの花抽出物は、ＩＬ－６により誘導される炎症性疾患のシグナル伝達過程で重要な媒介であるＳＴＡＴ３ルシフェラーゼの転写活性を著しく阻害することにより、ＩＬ－６媒介性疾患の予防又は治療に著しい効果を示すことが分かった。

実施例３：ハマナスの花抽出物の細胞毒性効果の確認
前記形質転換した細胞を９６ウェルプレート（96-well plate）にＤＭＥＭ（GIBCO 119
950965）で無血清培養（serum starvation）して、試料を下記のように処理した後、２４時間培養した。

１：陰性対照群（非処理群）;
２：陽性対照群（ＩＬ－６１０ｎｇ/ｍｌ）;
３：抽出物（１０、３０、６０μｇ/ｍｌ）
２４時間を反応した後、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ/ｍｌ）を２０μｌずつ各ウェル（well）
に入れた後、４時間培養した。培養後、上澄液を除去した後、１００μｌのＤＭＳＯを入れて、ＭＴＴ反応で生じたホルマザンクリスタル（formazan crystal）を溶かした。その後、発色程度をプレートリーダー（plate reader、Model 680、BIO-RAD）を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。実験の結果、ハマナスの花エタノール抽出物では、花の抽出物が６０μｇ/ｍｌのときも、細胞の生存率が８０％以上となり、深刻な細胞毒性を示さな
いが、ハマナスの果実エタノール抽出物の場合は、全体的に細胞毒性が大きいだけでなく、６０μｇ/ｍｌのときに６６．８％の生存率を示し、花抽出物より細胞毒性がはるかに
大きいことが確認できた（図２）。これにより、ハマナスの花抽出物は、果実抽出物に比べて安全な物質であることが分かり、前記実施例２の結果と組み合わせてハマナス果実抽出物の結果を見ると、前記ハマナスの果実抽出物が、実施例２でのＩＬ－６により誘導されるＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ阻害活性を有することは細胞毒性によって誘導されたものであることを予測できた。

実施例４：ハマナスの花エタノール抽出物のＲＡＮＫＬによって誘導される破骨細胞の分化抑制効果の確認
前記実施例２で骨粗しょう症に関連されるＩＬ－６により誘導されたＳＴＡＴ３転写活性の抑制効果を確認したところ、ハマナスの花エタノール抽出物がより直接的に骨粗しょう症の治療効果を有することを確認した。

ハマナスの花エタノール抽出物のＲＡＮＫＬによって誘導される破骨細胞の分化抑制効果を測定するために、次のような実験を行った。５週齢のマウスの大腿骨とすねの骨を
分離し、骨髄スペースを１ｃｃ注射器で水洗し、骨髄細胞を得た。分離された骨髄細胞は、１０％ＦＢＳ、抗生剤、Ｍ-ＣＳＦ（３０ｎｇ/ｍｌ）が含まれたａ-ＭＥＭ（a-minimum
essential medium）培地で３日間培養した。３日後、付着された細胞を捕食細胞（bone marrow macrophage、BMM）として用いた。捕食細胞は、Ｍ-ＣＳＦ（３０ｎｇ/ｍｌ）と
ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ/ｍｌ）を添加して培養し、ハマナスの花エタノール抽出物を６０
、３０、１０μｇ/ｍｌで処理した。４日後、培養した細胞は、ＴＲＡＰ溶液（Sigma Aldrich、USA）で染色して、赤色に染色された細胞を分化した骨破骨細胞と判断した。その結果、ハマナスの花エタノール抽出物は、６０、３０μｇ/ｍｌ濃度でＲＡＮＫＬによっ
て誘導される破骨細胞の分化を抑制する活性が優れていた。これに対し、ハマナスの果実エタノール抽出物は、破骨細胞の分化抑制活性が微々たることを確認した（図３）。

これらの結果を介してハマナスの果実抽出物は、骨粗しょう症に対する効果が非常に微々たる反面、ハマナスの花抽出物は優れた骨粗しょう症の治療効果を有することがわかった。

実施例５：炎症性骨粗しょう症のマウスモデルを用いたハマナスの花エタノール抽出物の骨粗しょう症誘導抑制の効果
ハマナスの花エタノール抽出物の骨粗しょう症誘導抑制の効果を確認するために、炎症性骨粗しょう症のマウスモデルを作成した。７週齢Ｃ５７ＢＬ/６雌マウスの頭蓋骨の皮
下部分にＬＰＳ２５ｍｇ/ｋｇを１週間に１回ずつ、計３回にわたって皮下注射した。実験群は、ＰＢＳ、ＬＰＳ、ＬＰＳ+ アレンドロネート（２ｍｇ/ｋｇ）、ＬＰＳ＋ハマナ
スの花エタノール抽出物（１００ｍｇ/ｋｇ、３００ｍｇ/ｋｇ、６００ｍｇ/ｋｇ）の６
グループに分けた。ＰＢＳ群は、ＬＰＳを投与してない正常対照群、残りのグループはＬＰＳ誘導骨粗しょう症のグループであり、骨粗しょう症の治療剤であるアレンドロネート（alendronate）投与群は、陽性対照群及びハマナス試験群は、４週間、１日１回、それ
ぞれの薬物を経口投与した。

４週間の経口投与が終了した後、二重エネルギーＸ線分析（Dual energy X-ray analysis、DEXA）を実施して骨密度（Bone mineral density、BMD）及び骨質量（bone mineral contents、BMC）を測定することにより、骨粗しょう症に対するハマナスの花エタノール
抽出物の治療効果を評価した。その結果、ＬＰＳ誘導グループで低下した骨密度及び骨質量は骨粗しょう症治療剤の投与群で有意に回復され、ハマナスの花エタノール抽出物投与群（３００ｍｇ/ｋｇ、６００ｍｇ/ｋｇ）でも有意な回復効果が確認された（ＬＰＳグループと比較すると、* ｐ <０．０５）（図４）。

実施例６：炎症性腸疾患のマウスモデルを用いたハマナスの花エタノール及び水抽出物の炎症性腸疾患の抑制効果
ハマナスの花エタノール及び水抽出物の炎症性腸疾患の抑制効果を確認するために、炎症性腸疾患のマウスモデルを作成した。４週齢のＩＣＲ雄マウス（オリエントバイオ購入）を１２時間、暗光周期（dark-light cycle）に適応させ、実験開始前の７日間の適応期をもった。対照群のグループを除いて、残りのグループは蒸留水にＤＳＳを添加して３％ＤＳＳ溶液を作り、１４日間任意量（ad libitum）を摂取させ、ＩＢＤ動物モデルを作製した。３％ＤＳＳを添加させる２日前から対照群、３％ＤＳＳグループはＰＢＳ、スルファサラジン（sulfasalazine、SS）グループは、スルファサラジン５０ｍｇ/ｋｇ、ハマ
ナスの花エタノール及び水抽出物のグループは、５００ｍｇ/ｋｇを毎日経口投与した。
１６日後、マウスは頚椎脱臼でサクリファイスして、血液、脾臓、腸の部位を切断して状態を確認した。腸は盲腸から直腸まで切断して長さを測定し、結腸部位と直腸部位を組織学に用いた。

その結果、ハマナスの花エタノール及び水抽出物５００ｍｇ/ｋｇを処理した実験群で
は、ＤＳＳ処理により誘導されるＩＢＤ症状を治療する効果が優れており、（図５）、ハマナスの花エタノール及び水抽出物を処理した実験群では、ＤＳＳ処理により誘導される炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ-１７、ＩＦＮ-γ）を効果的に抑制することを確認した（図６）。

実施例７：ハマナスの花エタノール及び水抽出物の抗アトピー効能の検証実験
７-１：ＨａＣａＴ細胞を用いたハマナスの花エタノール及び水抽出物の抗アトピー効
果
ヒトケラチン細胞株（human keratinocyte cell line）であるＨａＣａＴ細胞を用いて、ハマナスの花エタノール及び水抽出物の抗アトピー効果を確認した。前記ＨａＣａＴ細胞は、１０%の熱非活性化された（heat-inactivated）ＦＢＳと１％ペニシリン-ストレプトマイシン（penicillin-streptomycin）が添加されたＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle Medium）培地で３７℃及び５％のＣＯ_２の条件下で培養した。培養が終わった細胞
の生存率は、ＭＴＴ [３-（４,５-ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ-２-ｙｌ）-２,５-ｄｉｐｈｅｎｙｌ-ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ]還元方法を用いて測定した
。ＭＴＴ溶液は、生きている細胞でミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ（dehydrogenases）によってホルマザン（formazan）を形成し、細胞の生存有無を確認することができる。細胞毒性を確認するために、ＨａＣａＴ細胞を９６ウェルプレートに５×１０^４細胞/ウ
ェルで３７℃にて培養した後、ハマナスの花エタノール抽出物を１００～２０００μｇ/
ｍｌ、水抽出物を１００～１００００μｇ/ｍｌで処理し、２４時間培養した。２４時間
が経過した後、各ウェルに２０μｌのＭＴＴ溶液を添加して２時間さらに培養した後、培養液を除去して、１００μｌのジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide）を添加して
５７０ｎｍで吸光度を測定した。ハマナスの花エタノール抽出物及び水抽出物は、ＨａＣａＴ細胞において５００μｇ/ｍｌ以下の濃度では細胞毒性を示さなかった（図７）。

アトピー性皮膚炎関連サイトカインを確認するために、培養されたＨａＣａＴ細胞にＴＮＦ-α/ＩＮＦ-γを処理して、アトピー類似環境を誘導した後、ハマナスの花エタノー
ル抽出物、水抽出物をそれぞれ１０００μg/ｍｌで処理して培養し、細胞からＲＮＡを抽出した。この時、デキサメタゾン（Dexamethasone）１０μｇ/ｍｌは抗アトピー効果を有するもので、陽性対照群として用いた。ＲＮＡ分離キット（RNAiso Plus reagent、Takarabio社）を用いて細胞から全ＲＮＡを分離し、分離された全ＲＮＡの吸光度を測定して定量した後、２μgのＲＮＡでｃＤＮＡを合成した。各チューブあたり２μｌのｃＤＮＡ、
１μｌのセンス及びアンチセンスプライマー溶液（０．４μＭ）、１２．５μｌのＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ（Takarabio社）と９．５μｌのｄＨ_２Ｏを一緒に混合して、合計２５μｌになるようにした。ＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、ＩＬ－６及びＣＣＬ１７ｍＲＮＡの発現程度はＴＰ８５０ソフトウェアを使用してリアルタイムＰＣＲを介して測定した。ＨａＣａＴ細胞でアトピー誘発時に発現するＴＮＦ-α、ＩＬ-１β、ＩＬ－６及びＣＣＬ１７サイトカインを確認した。

その結果、１０００μｇ/ｍｌの濃度でハマナスの花エタノール抽出物より水抽出物が
サイトカインの抑制効果がより優れており（図８）、ハマナスの水抽出物を濃度別に１、１０、１００μｇ/ｍｌで処理した結果、濃度依存的にサイトカイン発現量を抑制するこ
とを確認した（図９）。

実施例７-２：ハマナスの花水抽出物が炎症誘発性サイトカインの発現を抑制する過程
に関与するシグナル伝達機序
ハマナスの花水抽出物が炎症誘発性サイトカインの発現を抑制する過程に関与するシグナル伝達機序を明らかにするために、ＳＴＡＴ１のリン酸化と炎症性サイトカインの転写を調節する因子として重要なシグナル伝達物質であるＮＦ-κＢの活性化について測定し
た。非活性状態のＮＦ-κＢは、内因性抑制タンパク質であるＩκＢαに結合して非活性
化状態を維持して、活性化されるとＩκＢαがリン酸化されて分解され、これらから遊離して核に移動し、転写因子として活動するため、ＩκＢαに対する分解の影響を併せて測定した。ＨａＣａＴ細胞を０．５ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（Phenylmethanesulfonyl fluoride、Sigma社、Cat No. P7626）と５μｇ/ｍｌのロイペプチン（leupeptin、Sigma社、Cat No. L2884）を含有した抽出緩衝液（０．５％ｔｒｉｔｏｎＸ-
１００、１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４などを含有したＰＢＳ溶液）で溶解させた後、超音波処理
（sonication）してＤＮＡを切断した。タンパク質の量は、ウシ血清アルブミン（bovine
serum albumin）を標準とし、Ｂｉｏ-Ｒａｄ社のｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ（Cat No. 500-0002）を用いて測定した。細胞の総タンパク１０～５０μgを０．１％ＳＤＳを含有した８～１２％（ｗ/ｖ）ポリアクリルアミドゲル（polyacrylamide gel）で電気
泳動し、ゲルに存在するタンパク質をエレクトロブロッティング（electroblotting）の
方法でニトロセルロース（nitrocellulose、NC）フィルタに移した後、非特異的な結合を遮断するためにニトロセルロースフィルターを５％脱脂粉乳を含有したtris-buffered saline-tween（TBS-tween、Sigma社）溶液に入れ、室温で１時間反応させた。フィルタを標的タンパク質に対する抗体を含有したＴＢＳ-ｔｗｅｅｎ溶液に入れ、４℃で１２時間放
置した後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase、Sigma社、Cat No. P0889）で標識された２次抗体で標識し、ＥＣＬ（Enhanced chemiluminescence、Thermo scientific社、Cat No.
34080）を用いてバンドを測定した。その結果、ハマナスの花水抽出物は、ＴＮＦ-α/ＩＮＦ-γによって活性化されたＳＴＡＴ１のリン酸化を阻害してIκBαの分解を抑制し、
核内のＮＦ-κＢが減少することを確認した（図１０）。これにより、ハマナスの花水抽
出物は、ＳＴＡＴ１とＮＫ-κＢの活性化を抑制して炎症性サイトカインの発現量を減少
させて抗アトピー効果があると予測することができる。

前記のような結果は、本発明のハマナスの花抽出物は、ＩＬ－６媒介性疾患を治療することができ、特に、破骨細胞の分化を効果的に抑制して骨粗しょう症をはじめとする骨代謝疾患、炎症性腸疾患及びアトピー性皮膚炎を効果的に予防及び治療することができることを示唆する。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims

ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６（interleukin-6）媒介性疾患の予防又は治療用薬学的組成物の製造方法であって、前記ＩＬ-６（interleukin-6）媒介性疾患は、骨粗しょう症又は炎症性腸疾患である、薬学的組成物の製造方法。
前記抽出物が、ＳＴＡＴ３（signal transducers and activators of transcription 3）の活性を阻害するものである、請求項１に記載の薬学的組成物の製造方法。
前記抽出物が、破骨細胞の分化を抑制するものである、請求項１に記載の薬学的組成物の製造方法。
ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６（interleukin-6）媒介性疾患の予防又は改善用医薬部外品組成物の製造方法であって、前記ＩＬ-６（interleukin-6）媒介性疾患は、骨粗しょう症、又は、炎症性腸疾患である、医薬部外品組成物の製造方法。
ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６（interleukin-6）媒介性疾患の予防又は改善用飼料組成物の製造方法であって、前記ＩＬ-６（interleukin-6）媒介性疾患は、骨粗しょう症又は炎症性腸疾患である、飼料組成物の製造方法。
ハマナスの花の水又はエタノール抽出物を有効成分として含む、ＩＬ－６（interleukin-6）媒介性疾患の予防又は改善用飲用水添加剤の製造方法であって、前記ＩＬ-６（interleukin-6）媒介性疾患は、骨粗しょう症又は炎症性腸疾患である、飲用水添加剤の製造方法。