KR20130142696A

KR20130142696A - 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130142696A
Application number: KR1020120066121A
Authority: KR
Inventors: 윤은영; 황재삼; 구태원; 김미애; 최영철; 윤영일
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2013-12-30
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: KR101382400B1

Abstract

본 발명의 목적은 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물 및 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 흰점박이꽃무지를 분말화하여 현탁된 것을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 제조방법은 항염증 효능의 과학적인 입증을 통해 다양한 염증관련 질환에 식약용으로 사용되어 곤충농가 및 산업체 소득 증대를 기대하는데 효과적으로 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising Protaetia brevitarsis for preventing and treating Inflammatory Disorder}

본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 흰점박이꽃무지를 분말화하여 현탁된 것을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

대식세포(macrophage)는 병원체에 반응하여 tumor necrotic factor-α(TNF-α), interleukin-6(IL-6), IL-1β와 같은 염증유발인자(pro-inflammatory cytokine)을 생성하고, inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxygenase-2(COX-2)를 합성하여 NO 및 prostaglandin E2(PGE2)를 생성하여 염증 반응을 나타낸다. 생리학적으로 NO는 세균과 종양을 제거하고 혈압을 조절하거나 신경 전달을 매개하는 등 다양한 역할을 수행한다. 그러나 염증 반응이 일어나면 관련 세포에서 iNOS의 발현이 증가하여 많은 양의 NO가 생성되면 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발하며, 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등의 염증 반응을 촉진 시킨다. PGE2는 통증과 발열에 주로 관여하는 염증 인자로서 염증반응이 일어나면 대식세포의 COX-2에 의해 생성된다. 그러므로, 염증 반응에서 생성되는 물질 중 NO, PGE2와 같은 물질의 생성 억제를 확인하여 항염증 효과를 확인할 수 있다.

흔히 굼벵이로 알려져 있는 제조()는 현재 농가에서 널리 사육되어져 한방이나 민간요법에 사용되고 있으며 딱정벌레목(Coleoptera), 꽃무지과(Cetoniinae) 곤충인 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)가 주종이다. 현대사회의 건강에 대한 관심이 고조됨으로써 중국으로부터 무분별한 수입으로 인해 안전과 효능이 검증되지 않은 각종 천연물과 생약제 들이 국내에 수입되고 있으며 굼벵이 또한 천연 생약제의 하나로써 중국에서 채집 건조된 동정되지 않은 불분명한 종들이 대량으로 사용되고 있다. 이처럼 민간요법으로 사용되는 흰점박이꽃무지의 약효와 관련한 과학적 접근은 거의 이루어지지 아니하였으며, 사염화탄소로 인해 간 손상이 유발된 생쥐에 대하여 triglyceride와 cholesterol의 감소가 보인다는 보고와 항산화 효능 등을 본 연구만 보고되어 있을 뿐 이다.

따라서 흰점박이꽃무지의 효능 및 새로운 용도에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 흰점박이꽃무지의 효능에 대해서 연구한 결과, cytokine 및 염증매개물인 iNOS의 유의적 감소를 확인하였고, 항염증 효과의 기전으로 대식세포의 nuclear factor-κB(NF-κB)의 활성화 억제를 확인하여 본 발명을 완성 하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 흰점박이꽃무지의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은

(a) 흰점박이꽃무지를 급속동결하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 동결된 흰점박이 꽃무지를 동결건조하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 건조물을 분쇄하여 분말을 얻는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 분쇄된 분말을 용매에 현탁 하고 액상분리 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 흰점박이꽃무지 유효성분을 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 흰점박이꽃무지의 유효성분을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis)는 딱정벌레목(Coleoptera), 꽃무지과(Cetoniinae) 곤충이다.

본 발명의 흰점박이 꽃무지는 분말, 추출물, 현탁액 등의 형태로 공급되어질 수 있으며, 바람직하게는 분말을 용매에 현탁한 형태로 공급되어질 수 있다.

본 발명의 흰점박이꽃무지는 염증성 질환의 예방 및 개선 효과가 우수하다.

상기 염증성 질환은 바람직하게는 천식, 치주염, 구내염, 복막염, 위염, 장염, 관절염, 신장염, 간염 및 퇴행성 질환 일 수 있다.

상기 본 발명에 따른 흰점박이꽃무지의 염증성 질환의 예방 및 개선 효과는 본 발명자들에 의해 실험을 통해 확인되었다.

즉, 본 발명의 일실시예에서는 LPS를 통해 염증반응을 유도한 Raw 264.7 세포에 흰점박이꽃무지 분말 현탁액을 처리하여 cytokine 및 iNOS의 전사체 발현량과 세포 외로 분비되는 cytokine 단백질 양을 Real-time PCR과 ELISA를 통해 확인 하였다.

그 결과 각종 염증관련 cytokine과 염증매개물인 iNOS의 수준을 보다 강하게 감소시키는 효과를 전사체 수준에서 확인 하였고, 단백질 수준에서도 cytokine의 발현이 억제됨을 확인 하였다(실시예 3 참조).

따라서 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과가 있다고 알려진 공지의 활성성분과 함께 혼합하여 조성물 형태로 제조 할 수 있으며 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 흰점박이꽃무지 현탁액이 함유된 차, 쥬스 및 드링크 형태로 제조 할 수 있으며, 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 과립화, 캡슐화 또는 분말화하여 섭취할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 상기 흰점박이꽃무지 분말 현탁액과 함께 보조성분으로 비타민 B, C, E나 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 미네랄 함유 화합물이나 레시틴 등의 인지질 또는 말톨, 올리고당, 아미노산 등의 화합물을 사용할 수 있으며, 이 중에서도 비타민 C, E나 베타카로틴, 말톨 등 중에서 2 내지 3 성분을 혼합하여 사용하면 생체 활성효과를 보강할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.

또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋우기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린(Chlorophyllin), 또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋우기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린(Chlorophyllin), 플라보노이드(Flovonoid) 등의 천연색소 및 감미 성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대하여 약 0.01 내지 10중량 %를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 식품 조성물을 포함하는 정제, 과립제, 및 액제로 구성된 그룹에서 선택된 형태의 기능성 식품을 제공한다.

기능성 식품이란 식품성분이 가지는 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 예방과 회복 등 생체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말한다.

상기 기능성 식품 제조는 본 발명의 식품 조성물이 포함되는 것 이외 다른 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제로써 식품별로 필요한 성분을 추가로 함유할 수 있다.

정제는 가루나 결정성 물질을 뭉쳐서 눌러 둥글넓적한 원판이나 원추 모양으로 만든 제형으로 복용하기 쉽고 투여량이 정확하다. 본 발명의 기능성 식품 정제는 이에 제한되지는 아니하나 유당, 전분, 백당, 만니톨, 소르비톨, 무기염 등의 부형제를 포함 할 수 있으며, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

과립제는 둥글고 잔 알갱이 모양의 제형을 말하며, 혼합제제의 경우 항상 일정한 비율을 취할 수 있고 복용하기 쉽다. 본 발명의 과립제에는 필요에 따라 착색제, 방향제 등이 첨가 될 수 있으며, 적당한 제피제 등으로 제피를 할 수 있다. 과립제의 과립은 전제의 20 %가 355 m 이상 1400 m이하의 크기를 가지는 것이 바람직하다.

액제는 액체로 된 제형을 말하며, 본 발명의 필요에 따라 안정제, 교미제, 보존제 등이 첨가 될 수 있다. 또한 본 발명의 기능성 음료조성물은 풍미개선을 위해 과실추출물을 추가로 포함할 수 있다. 과실추출물은 풍미개선과 함께 과실이 지니는 각종 유효성분을 함께 이용할 수 있는 장점을 준다. 상기 과실추출물에 사용되는 과실로는 이에 한정되는 것은 아니나 파인애플, 레몬, 감귤, 오렌지, 사과, 배, 그레이프후르츠, 살구, 딸기, 복숭아, 멜론, 구아바, 레몬, 자두에서 선택된 적어도 1종을 포함 할 수 있다. 기타 본 발명의 기능성 음료조성물에는 공지의 첨가물을 포함할 수 있다. 이들 공지의 첨가물로는 비타민류로는 니코틴산아마이드, 비타민 A, B, C, D, E, 엽산 등이 사용 될 수 있고, 아미노산류로는 L-글리신, L-라이신, DL-메치오닌, L-발린, 비오틴, L-시스테인, L-시스틴, L-트립토판, L-트레오닌, L-페닐알라닌 등이 사용 될 수 있고, 생약제제로는 구기자, 오가피, 백출, 백작약, 녹곽, 홍삼, 인삼, 음양곽, 우황, 황정 등이 사용 될 수 있고, 착향제로는 혼합과일향, 사과향, 요구르트향, 드링크향 등이 사용 될 수 있고, 감미제류는 정백당, 포도당, 과당, 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 말토올리고당, 키토산올리고당, 키토올리고당, 대두올리고당, 자일로올리고당, 이성화당(고과당), 전화당, 아스파탐, 스테비오사이드, 솔비톨, 만니톨 등이 사용될 수 있고, 산미제로는 구연산, DL-사과산, 호박산 등이 사용 될 수 있고, 안정화제로는 소르베이트류 중 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 80 등이 사용 될 수 있고, 보존제류로는 안식향산 및 그의 유도체, 데히드로초산 및 그의 염류, 소르빈산 및 그의 염류 등이 사용 될 수 있다.

또한 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 염증성 질환 예방 및 치료의 목적으로 투여되는 경우에 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다.

일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 메이스리그난에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제,시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식 및 경피 투여 방식에 의한다. 주사 주입 방식의 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 메이스리그난을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피 투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물 중 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 약학적으로 유효한 양으로는 0.1 μg/day/체중kg 내지 200 mg/day/체중kg, 바람직하게는 1 μg/day/체중kg 내지 10 mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 흰점박이꽃무지, 분말, 추출물, 현탁액과 함께 화장료 조성물의 제조 분야에서 일반적으로 사용되는 하나 이상의 부형제 및 첨가제를 포함하여 당 분야의 공지의 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 흰점박이꽃무지, 분말, 추출물, 현탁액을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 흰점박이꽃무지, 분말, 추출물, 현탁액을 포함하는 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 흰점박이꽃무지, 분말, 추출물, 현탁액을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 메이스리그난 또는 육두구 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

한편 본 발명은 (a) 흰점박이꽃무지를 급속동결하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 동결된 흰점박이 꽃무지를 동결건조하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 건조물을 분쇄하여 분말을 얻는 단계; (d) 상기 (c)단계의 분쇄된 분말을 용매에 현탁 하고 액상분리 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 제조방법은

(a) 흰점박이꽃무지를 급속동결하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 건조물을 분쇄하여 분말을 얻는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 분쇄된 분말을 용매에 현탁하고 액상분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

(a) 단계에서는 흰점박이꽃무지를 급속동결한다.

본 발명의 ‘급속동결’은 동결 시 가장 느린 속도로 온도가 낮아지는 식품 중심점의 온도를 -1 ℃에서 -5 ℃까지 내리기 위해서 걸리는 시간이 약 30분 이내인 동결을 의미한다. 급속동결에 사용되는 수단은 한정되어 있지는 않지만 바람직하게는 액체질소를 사용할 수 있다.

본 발명의 흰점박이꽃무지는 상기 설명과 동일한 것이며, 흰점박이꽃무지의 사육방법은 한정되어 있지는 않으나, 바람직하게는 증기로 쪄서 멸균한 참나무 발효톱밥을 먹인 흰점박이꽃무지를 급속동결시키기 이전까지 1 내지 5일간 금식시키는 방법을 사용할 수 있다. 흰점박이꽃무지를 금식시켰을 때의 장점은 대장균을 비롯한 여러 가지 미생물의 제거와 흰점박이꽃무지의 특유의 이미와 이취를 제거하기 위함이다. 이를 뒷받침하기 위해 흰점박이꽃무지의 식도와 항문에 걸친 소화기 해부와 분말로 만든 후 관능평가를 통해 이미와 이치를 제거함을 확인 하였고, 식품위생검사기관의 검사결과 이미와 이취가 없음을 인증기관을 통해 재차 확인 하였다.

본 발명의 일실시예에서 흰점박이꽃무지 분말은 스머프 곤충나라 영농조합법인(남양주시)에서 구매하여 제조하였으며, 증기로 쪄서 멸균한 참나무 발효톱밥을 먹인 흰점박이꽃무지를 3일 동안 굶긴 후 액체질소를 부어서 급속동결한 다음 영하 80 ℃의 초저온 냉동고에 24시간동안 동결 시킨 후 동결건조기에서 수분이 완전히 제거될 때까지 건조 시켰다.(실시예1 참조)

(b)단계에서는 상기 (a)단계의 동결된 흰점박이 꽃무지를 동결건조하였다.

본 발명의 ‘동결건조’는 저온에서 일어나기 때문에 열에 의한 시료의 변질이 적고 또한 건조 후 시료의 수용해성이 좋기 때문에 수용액의 농축에도 적합하다.

본 발명의 일실시예에서 상기 (a)단계의 동결된 흰점박이 꽃무지는 영하 80 ℃의 초저온 냉동고에 24시간동안 동결 시킨 후 동결건조기에서 수분이 완전히 제거될 때까지 건조 시켰다(실시예 1 참조).

(c)단계에서는 상기 (b)단계의 건조물을 분쇄하여 분말을 얻었다.

상기 분쇄공정은 일반적인 분쇄기를 이용한 분쇄공정을 사용할 수 있으며 바람직하게는 깨끗하게 세척이 된 분쇄기에 원형 그대로 건조된 유충을 투입하여 고운 가루분말 형태로 만드는 방법을 사용할 수 있다.

(d)단계에서는 (c)단계의 분쇄된 분말을 용매에 현탁하고 액상분리하였다. 원심분리 시킨 후 상층액을 여과하였다.

본 발명의 ‘용매’로는 한정되어 있지는 않지만 D.W.(멸균수)와 DMSO가 사용될 수 있으며, D.W.는 3차 증류한 물에 고압멸균기를 통하여 멸균한 증류수를 사용할 수 있고, DMSO로는 무색무취의 흡습성의 액체로 각종의 유기물질에 뛰어난 용제로 C₂H₆OS를 사용할 수 있다. 본 발명의 액상분리 공정은 한정되어있지는 않으나 바람직하게는 현탁액을 원심분리 시킨 후 상층액을 여과하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 (c)단계의 분쇄된 분말을 각각 D.W.(멸균수)와 DMSO에 넣은 후 초음파 분쇄기(230 Jule)로 10초간 2회 분쇄 하고, 분쇄된 분말은 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨 후 상층액을 회수한 후 0.25 m 주사기 필터로 여과하였다(실시예 1 참조).

본 제조방법에 의하면 본 발명의 식품 조성물 및 약학적 조성물로 사용하기 적합한 흰점박이꽃무지 현탁액을 유효성분의 효능이 최대한 보호될 수 있게 효과적으로 생산할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 제조방법은 항염증 효능의 과학적인 입증을 통해 다양한 염증관련 질환에 식약용으로 사용되어 곤충농가 및 산업체 소득 증대를 기대하는데 효과적으로 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 각각 다른 농도의 흰점박이꽃무지 현탁액에서의 Raw 264.7 세포의 생존력 측정결과에 관한 것이다.(Cell viability: Raw 264.7 세포 생장률, Con: 현탁액을 0 g/ml 처리한 군, larva1: 현탁액을 1 g/ml 처리한 군, larva10: 현탁액을 10 g/ml 처리한 군, larva100: 현탁액을 100 g/ml 처리한 군, 금식: 3일동안 굶겨서 배변을 시킨 군, 비금식: 배변을 시키지 않은 군, DMSO: 현탁액제조에 DMSO를 사용한 군, D.W.: 현탁액제조에 D.W.를 사용한 군)
도 2는 Real-time PCR에 의한 Raw 264.7 세포 분석에서 흰점박이꽃무지 현탁액의 항염증효과 측정결과에 관한 것이다. (TNF-α: TNF-α primer를 사용한 군, IL-6: IL-6 primer를 사용한 군, INOS: INOS primer를 사용한 군, DMSO: 현탁액제조에 DMSO를 사용한 군, D.W.: 현탁액제조에 D.W.를 사용한 군)
도 3은 ELISA 분석에 의한 Raw 264.7 세포 분석에서 흰점박이꽃무지 현탁액의 항염증효과 측정결과에 관한 것이다. (IL-6 production: cytokine IL-6 단백질의 발현량, larva0: 현탁액을 0 g/ml 처리한 군, larva1: 현탁액을 1 g/ml 처리한 군, larva10: 현탁액을 10 g/ml 처리한 군, larva100: 현탁액을 100 g/ml 처리한 군, 금식: 3일동안 굶겨서 배변을 시킨 군, 비금식: 배변을 시키지 않은 군, DMSO:현탁액제조에 DMSO를 사용한 군 D.W.:현탁액제조에 D.W.를 사용한 군)
도 4는 면역형광염색을 통한 세포내의 NF-κB의 위치확인 결과에 관한 것이다.(DMSO:현탁액제조에 DMSO를 사용한 군 D.W.:현탁액제조에 D.W.를 사용한 군, NF-κB: 면역형광염색을 시행한 군, DAPI: DAPI염색을 시행한 군)
도 5는 세포에서 분리한 핵에서의 NF-κB 발현량을 western blot으로 확인한 결과사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

흰점박이꽃무지 현탁액 제조 및 농도처리별 세포 생장률 측정

흰점박이꽃무지 분말은 스머프 곤충나라 영농조합법인에서 구매하여 제조하였다. 증기로 쪄서 멸균한 참나무 발효톱밥을 먹인 흰점박이꽃무지를 3일 동안 굶긴 후 액체질소를 부어서 급속동결한 다음 영하 80 ℃의 초저온 냉동고에 24시간동안 동결 시킨 후 동결건조기에서 수분이 완전히 제거될 때까지 건조 시켰다. 이 건조된 분말을 분쇄기로 파쇄 하여 가루를 얻은 후 각각 D.W.(멸균수)와 DMSO에 넣은 후 초음파 분쇄기(230 Jule)로 10초간 2회 분쇄 하였다. 분쇄된 분말은 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리 시킨 후 상층액을 회수한 후 0.25 m 주사기 필터로 여과하였다.

Raw 264.7 세포는 Penicillin-Streptomycin 100 unit/ml과 10 % FBS이 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였으며, 2일에 한 번씩 계대 배양을 실시하였다. Raw 264.7 세포를 1× 10⁶/ml 농도로 24 well plate에 각각 분주하고 LPS(lipopolysaccharide, 100 ng/ml)를 처리한 후 흰점박이꽃무지 분말 현탁액을 0, 1, 10 및 100 g/ml 농도로 각각 처리한 후 24시간 배양 하였다.

<실시예 2>

금식일수별 흰점박이꽃무지 현탁액의 세포독성측정

흰점박이꽃무지의 Raw 264.7 세포에 대한 독성 효과를 측정하기 위해 멸균한 톱밥을 먹인 후 3일 동안 굶긴 군과 굶기지 않은 군을 분말을 내서 실험을 수행하였다. 각 실험군과 대조군을 24시간 배양 후 후 MTS 시약을 넣고 4시간 배양하였다. 배양 후 microplate reader (Beckman, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 증기로 쪄서 멸균한 참나무 톱밥을 먹인 후 3일 동안 굶겨 배변을 시킨 그룹과 배변을 시키지 않은 두 그룹으로 나누어서 흰점박이꽃무지 분말을 D.W.와 DMSO에 각각 녹이고 농도별로 Raw 264.7 세포에 처리하였다. CellTiter 96AQueousONE Solution Cell proliferation Assay kit는 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H tetrazolium, inner salt(MTS) solution을 이용한 kit로 이를 이용해서 세포 생장률을 측정하였다. 그 결과 굶긴 그룹과 굶기지 않은 그룹 모두 대조군에 비해 세포 생장률이 저해 되지 않아 뚜렷한 독성이 검출되지 않은 것을 확인 하였다(도 1 참조).

<실시예 3>

흰점박이꽃무지 현탁액의 항염증 효능 분석

<3-1> Real-time PCR 분석

항염증 효능을 분석하기 위해 cytokine 및 염증매개물인 iNOS의 전사체 발현을 Real-time PCR을 통해 확인 하였다. 염증을 유발한 Raw 264.7 세포에 흰점박이꽃무지 분말 현탁액을 처리하여 24시간 배양한 후 세포의 배지를 제거하고 Trizol reagent를 처리한 후 cell scraper를 이용해 세포를 수집하였다. 수집된 세포에 chloroform을 넣고 12,000 g에서 15분 동안 원심 분리하여 회수한 상층액에 isopropanol을 넣어서 RNA를 추출하고 추출된 RNA량을 측정한 후 2 g/l로 농도를 정량하여 cDNA를 합성 하였다. Power SYBR Green Mixture와 제작한 primer를 혼합한 후 Real-time PCR기기(AB, UK)를 통해 cytokine 및 염증매개물인 iNOS의 전사체 발현수준을 조사 하였다. 사용된 primer의 염기서열은 표 1에 표시하였다.

Real - time PCR primers 의 염기서열

Name	Sequence
GAPDH	Forward	5'-GCCTCACCCCATTTGATGTT-3'
GAPDH	Reverse	5'-GGGAAGCCCATCACCATCT-3'
IL-6	Forward	5'-TTGGGAGYGGTATCCTCTGT-3'
IL-6	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'
iNOS	Forward	5'-TGAAGCGTTTCGGGATCTG-3'
iNOS	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'
TNF-a	Forward	5'-ACAGCACCGCAGTACCTGAG-3'
TNF-a	Reverse	5'-CCACGGCCTTCCCTACTTC-3'

<3-2> ELISA 분석

염증을 유발한 Raw 264.7 세포에 흰점박이꽃무지 분말 현탁액을 처리하여 24시간 배양한 후 세포의 배양액을 회수하여 cytokine IL-6 단백질의 발현량은 ELISA kit를 이용하여 측정 하였다. Standard와 배양액을 반응액과 반응 시키고 각각의 항체가 coating된 plate를 이용하여 항체와 반응시키고 발색시킨 후 450 nm에서 microplate reader(Beckman, USA)로 흡광도를 측정하고 cytokine량을 측정하였다.

LPS를 통해 염증반응을 유도한 Raw 264.7 세포에 흰점박이꽃무지 분말 현탁액을 처리하여 cytokine 및 iNOS의 전사체 발현량과 세포 외로 분비되는 cytokine 단백질 양을 real-time PCR과 ELISA를 통해 확인한 결과 DMSO에 녹인 흰점박이꽃무지 분말 현탁액이 농도 의존적으로 각종 염증관련 cytokine과 염증매개물인 iNOS의 수준을 보다 강하게 감소시키는 효과를 전사체 수준에서 확인 하였다. 또한 ELISA 기법을 이용해 단백질 수준에서도 cytokine의 발현이 억제됨을 확인 하였다(도 2, 3 참조).

< 실시예 4>

NF -ĸB발현위치 분석 및 세포의 염증유발 측정

<4-1> NF -ĸB 면역형광염색

세포내의 NF-κB의 위치를 확인하기 위해 면역형광염색을 시행 하였다. Cover slip위에 Raw 264.7 세포를 부착시켜 배양 시킨 후 LPS와 추출물을 넣은 실험군과 LPS와 추출물 모두 무처리한 대조군 및 LPS만 처리한 대조군을 24시간 동안 배양 시켰다. 배지를 제거한 세포는 PBS로 2회 세척한 후 4% formaldehyde로 30분 동안 상온에서 고정 시켰다. 0.1 % Triton x-100으로 15분씩 2회 처리한 후 4% BSA로 1시간 동안 상온에서 blocking 하였다. NF-ĸB 일차 항체는 1:1000의 희석배율로 4℃에서 하루 동안 처리 하였다. 다음날 1× PBS로 20분씩 4회 세척한 후 Alexa flour IgG(1:1,500) 2차 항체로 상온에서 한 시간 동안 반응 시켰다. 그리고 1× PBS로 20분 동안 4회 세척하고 VECTERSHIELD로 핵을 염색한 후 cover slip을 slide glass에 부착시켜 현미경으로 관찰 하였다.

<4-2> Western blot analysis

NF-κB의 세포 내 위치를 확실히 확인하기 위해서 Western blot을 수행하였다. NE-PERNuclear and Cytoplasmic Extraction reagents를 이용하여 세포질과 핵을 분리한 후 분리된 핵을 이용하여 10 % SDS PAGE 후 transfer를 50 V에서 2시간 동안 수행 하였다. 상온에서 1시간 동안 blocking을 수행한 후 NF-ĸB 1차 항체를 1:500의 희석배율로 상온에서 한 시간 반응 시키고 TBST로 세척하였다. 그리고 HRP가 붙어있는 2차 항체(1:10,000)로 상온에서 한 시간 반응 시킨 후 FluorChemFC2(Alpha innotech, USA)를 이용하여 핵에서 NF-κB의 발현여부를 확인하였다.

그 결과, 위와 같이 처리한 Raw 264.7 세포를 전사인자인 NF-κB으로 면역 형광염색을 통해 세포내 발현 위치를 확인 하였다. LPS로 염증이 유도된 세포는 핵에서 뚜렷하게 NF-κB가 확인되는데 D.W.(멸균수)에 녹인 흰점박이꽃무지 분말 현탁액 처리시 NF-κB의 세포핵으로 이동을 막지 못함으로써 핵에서 NF-κB가 발현됨을 확인함으로써 염증에 효과가 없음을 알 수 있었다. 하지만 염증을 유발한 세포에 DMSO에 녹인 흰점박이꽃무지 분말 현탁액을 100 g/ml의 농도로 처리한 경우 핵에서 NF-κB가 발현되지 않고 세포질에서 대부분의 NF-κB가 발현됨을 확인함으로써 염증 신호전달 과정이 활성화되지 않았음을 추정할 수 있었다. 또한 위 결과를 보다 명확하게 확인하기 위해 염증유발 세포에 흰점박이꽃무지 분말 현탁액을 처리한 후 핵을 분리하여 Western blot에 의해 핵에서의 NF-κB의 발현을 확인한 결과 DMSO에 녹인 분말 현탁액을 처리한 경우 저농도인 1 g/ml을 처리한 경우에서도 핵에서 NF-κB가 거의 발현이 되지 않을 뿐만 아니라 농도 의존적으로 더 뚜렷한 발현억제 효과를 확인함으로써 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 뚜렷한 항염증 효과를 확인할 수 있었다(도 4, 5 참조).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 제조방법을 제공한다. 본 발명의 염증성 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 제조방법은 항염증 효능의 과학적인 입증을 통해 다양한 염증관련 질환에 식약용으로 사용되어 곤충농가 및 산업체 소득 증대를 기대하는데 효과적으로 사용할 수 있으며, 지구상에 다수종으로 존재하는 미개발된 다양한 곤충의 기능성을 보다 쉽고 빠르게 검정하는데 효과적으로 사용할 수 있어서 산업상 이용가능성이 크다.

Claims

흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 개선용 식품 조성물.
흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
흰점박이꽃무지를 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 치주염, 구내염, 복막염, 위염, 장염, 관절염, 신장염, 간염 및 퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 흰점박이꽃무지는 분말화하여 현탁된 것임을 특징으로 하는 조성물.
(a) 흰점박이꽃무지를 급속동결하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 동결된 흰점박이 꽃무지를 동결건조하는 단계;
(c) 상기 (b)단계의 건조물을 분쇄하여 분말을 얻는 단계;
(d) 상기 (c)단계의 분쇄된 분말을 용매에 현탁 하고 액상분리 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 제조방법.
제6항에 있어서, (a)단계의 흰점박이꽃무지는 1 내지 5일간 금식 상태의 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 흰점박이꽃무지 분말 현탁액의 제조방법.