KR102059160B1

KR102059160B1 - 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102059160B1
Application number: KR1020170152487A
Authority: KR
Inventors: 김원곤; 한백수; 변정수; 응옌반민; 최하영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2019-12-24
Anticipated expiration: 2037-11-15
Also published as: KR20190055600A

Abstract

본 발명은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 Nurr1 단백질을 활성화시키고, 염증 반응을 억제함으로써 Nurr1 단백질의 활성 억제로 인해 유발되는 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising daphnane or phobor diterpenoid compound}

본 발명은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

천연물로부터 분리되는 천연 생리활성물질의 다양한 생체조절기능이 알려지면서, 천연 생리활성물질을 이용한 신약 개발, 건강기능식품 등의 분야에서의 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 천연물에는 매우 다양한 종류의 생리활성물질이 포함되어 있는데, 각각의 물질마다 물리적, 화학적 성질이 상이하여 동일한 천연물을 대상으로 추출하더라도 추출 용매의 종류에 따라 분리되는 생리활성물질의 종류가 상이하다. 또한, 동일한 천연물에서 분리된 생리활성물질이라고 하더라도 종류에 따라 나타내는 활성 및 그 효과가 상이한 특성이 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 최근에는 동일한 천연물을 대상으로 추출 용매를 달리하여 기존에 알려지지 않은 새로운 갖는 생리활성물질을 분리하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)은 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 종종 사멸하는 경우의 증상들과 관련된다. 신경퇴행성 질환을 가진 환자들은 인지(cognitive) 또는 운동(motor) 능력에 있어서 극심한 퇴화를 겪을 수 있고, 이들 질환은 주로 진행성이기 때문에 결과적으로 그들의 삶의 질 및 삶에 대한 기대는 현저히 감소될 수 있다.

이들 질환은 파킨슨병(Parkinson's Disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP) 및 다른 질병들을 포함한다.

한편, 상당수의 신경퇴행성 질환은 Nurr1 단백질과 상당한 관련성이 있다. 구체적으로, 미국공개특허 제2009-0226401호에서는 신경퇴행성 질환의 한 종류인 파킨슨 병은 도파민 신경세포와 관련된 질환임을 개시하면서, Nurr1이 활성화되는 경우 파킨슨 병의 치료 효과를 나타냄을 개시하고 있다. 또한, 국제특허공개공고 WO2010-04221호에서는 Nurr1이 도파민을 활성화시키는데 필수적인 역할을 하며, Nurr1을 활성화하고 도파민을 활성화하는 신경전달을 조절하여 파킨슨 병을 치료하는 방법을 개시하고 있다.

상기 Nurr1의 기능장애에 의하여 유발되는 대표적인 신경퇴행성 질환은 파킨슨병이다. 파킨슨병은 떨림, 경직, 운동 완만 및 보행 이상증 등을 주된 증상으로 하는 현대 고령화 사회에 있어서 중요한 질환 중 하나로, 뇌의 흑색질(substantia nigra)과 선조체(corpus striatum) 부위에서 도파민(dopamin)이라는 신경전달물질이 부족하게 되어 생기는 만성질환이다.

이와 같은 파킨슨병의 치료를 위한 약물로는 엘-도파(L-dopa) 제제, 도파민 수용체 작용제, 항콜린 약제, 엘데프릴(Eldepryl) 등이 알려져 있으며, 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 하는 것이므로 지속적인 약물의 복용을 필요로 한다. 지금까지 파킨슨병 치료제로 많은 약들이 만들어져 상용화되고 있으나, 파킨슨병을 완전히 치료하기 위한 본질적인 치료제는 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자는 팥꽃나무(Daphne genkwa)의 줄기 및 뿌리로부터 다양한 추출 및 분획 용매를 사용하여 수득한 화합물들이 Nurr1을 활성화시키고, 염증 반응을 억제하는 효과를 확인하여, Nurr1 기능장애에 의해 유발되는 파킨슨병을 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환에 대한 치료 효과가 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

미국공개특허 제2009-0226401호 국제특허공개공고 WO2010-04221호

본 발명은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 하나의 양태로서 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 하기 화학식 1 내지 6을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 하기 화학식 1 내지 6으로 표시되는 화합물, 구체적으로 acutilonine F (화학식 1), wikstroemia factor M1 (화학식 2), yuanhuadine (화학식 3), yuanhuatine (화학식 4), prostratin Q (화학식 5) 또는 12-O-n-deca-2,4,6-trienoyl-phorbol-(13)-acetate (화학식 6)일 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

상기 화학식 1의 화합물인 acutilonine F는 (2S,3aR,3cS,4aR,5S,5aS,6S,7S,8bR,9R,10aR)-5,5a-dihydroxy-4a-(hydroxymethyl)-7,9-dimethyl-2-phenyl-10a-(prop-1-en-2-yl)dodecahydro-6H-2,8b-epoxyoxireno[2'',3'':6',7']azuleno[5',4':3,4]benzo[1,2-d][1,3]dioxol-6-yl (2E,4E,6E)-deca-2,4,6-trienoate, 화학식 2의 화합물인 wikstroemia factor M1은 (2S,3aR,3cS,4aR,5S,5aS,6S,7S,8bR,9R,10aR)-5,5a-dihydroxy-4a-(hydroxymethyl)-7,9-dimethyl-2-phenyl-10a-(prop-1-en-2-yl)dodecahydro-6H-2,8b-epoxyoxireno[2'',3'':6',7']azuleno[5',4':3,4]benzo[1,2-d][1,3]dioxol-6-yl (2E,4E)-deca-2,4-dienoate, 화학식 3의 화합물인 yuanhuadine은 (2S,3aR,3cS,4aR,5S,5aS,8bR,9R,10R,10aS)-5,5a-dihydroxy-4a-(hydroxymethyl)-7,9-dimethyl-6-oxo-2-phenyl-10a-(prop-1-en-2-yl)dodecahydro-6H-2,8b-epoxyoxireno[2'',3'':6',7']azuleno[5',4':3,4]benzo[1,2-d][1,3]dioxol-10-yl benzoate , 화학식 4의 화합물인 yuanhuatine은 (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-9a-acetoxy-4a,7b-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-5-oxo-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-decahydro-1H-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulen-9-yl (2E,4E)-deca-2,4-dienoate, 화학식 5의 화합물인 prostratin Q는 (2S,3aR,3bS,3cS,4aR,5S,5aS,8aR,8bR,9R,10R,10aS)-5,5a-dihydroxy-4a-(hydroxymethyl)-7,9-dimethyl-2-((1E,3E)-nona-1,3-dien-1-yl)-6-oxo-10a-(prop-1-en-2-yl)-3a,3b,3c,4a,5,5a,8a,9,10,10a-decahydro-6H-2,8b-epoxyoxireno[2'',3'':6',7']azuleno[5',4':3,4]benzo[1,2-d][1,3]dioxol-10-yl acetate 및 화학식 6의 화합물인 12-O-n-deca-2,4,6-trienoyl-phorbol-(13)-acetate는 (4aR,7bS,8R,9R,9aS)-9a-acetoxy-4a,7b-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-5-oxo-1a,1b,4,4a,5,7a,7b,8,9,9a-decahydro-1H-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulen-9-yl (2E,4E,6E)-deca-2,4,6-trienoate의 IUPAC name으로 명명된다.

상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 당업자에게 공지된 방법으로 제조될 수 있고, 상업적으로 시판되는 화합물을 구입하거나 합성하여 제조할 수 있으며, 당업계에 공지된 식물로부터 극성 또는 비극성 용매를 사용하여 분리 정제할 수 있다. 구체적으로, 상기 화합물은 팥꽃나무 줄기 및 뿌리로부터 추출 및 분리할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 화합물은 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물에서 분리할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "팥꽃나무(Daphne genkwa)"는 쌍떡잎식물 도금양목 팥꽃나무과의 낙엽관목을 의미한다. 조기꽃나무, 이팥나무라고도 하며, 주로 바닷가 근처에서 성장하는 특성을 갖는다.

본 발명의 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물은 팥꽃나무의 줄기 및 뿌리로부터 수득한 추출물을 의미한다. 구체적으로, 상기 추출물은 팥꽃나무의 줄기 및 뿌리를 물 또는 유기용매로 추출하여 수득한 추출물일 수 있고, 보다 구체적으로 물, C1 내지 C5의 저급 알킬알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득한 추출물일 수 있다. 상기 알킬알코올은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 알킬알코올일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물은 바람직하게는 80% 에탄올로 추출한 추출물이다.

상기 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물은 추출물의 분획물일 수 있으며, 상기 분획물은 특정 용매를 사용하여 상기 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물로부터 본 발명의 화합물을 분획하여 얻은 활성 분획물(fraction)을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 수득한 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물을 헥산, 에틸 아세테이트 또는 증류수 등의 유기용매의 혼합용매를 이용하여 각 용매의 분획층을 분리하여 수득하고, 크로마토그래피 등의 당업계에 공지된 분리방법을 이용하여 본 발명의 화합물을 고순도로 분리 정제하여 분획물을 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 화학식 1 내지 6의 화합물을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄 술폰산, p-톨루엔 술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 화학식 1 내지 6의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 거의 포함한다. 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적 조성물은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 용도로 제공될 수 있다. 구체적으로, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 화학식 1 내지 6의 화합물은 Nurr1 단백질의 활성도를 증가시키고(표 1), 신경세포에서의 산화질소의 생성을 억제하며(표 2), 신경세포에서의 전염증성 사이토카인의 생성을 억제함을 확인하였다(도 1). 구체적으로, 화학식 3, 4 및 6의 화합물은 보다 우수한 Nurr1 단백질의 활성 증가 효과를 나타내고, 보다 구체적으로 화학식 4는 Nurr1 단백질의 활성 증가 효과 뿐만 아니라, 보다 우수한 산화질소 생성 억제 활성을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 화학식 1 내지 6의 화합물을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물, 또는 이의 염을 포함하는 약학적 조성물은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 약학적 조성물에 포함되는 화합물은 화학식 1 내지 6의 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 구체적으로 화학식 3, 4 또는 6의 화합물, 보다 구체적으로 화학식 4의 화합물일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 투여로 신경퇴행성 질환의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 신경퇴행성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 약학적 조성물은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토 덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적 조성물의 전체의 중량을 기준으로 0.01 중량％ 내지 90.00 중량％로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 90.00 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 중량% 내지 70 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 중량% 내지 50중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 투여 대상의 상태, 구체적인 병증의 종류, 진행 정도 등에 따라 다양하게 변경될 수 있다. 필요한 경우, 약학적 조성물의 전체 함량으로도 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

치료를 위한 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 비율로 질환을 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 유효한 양은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 대하여 0.01 ㎎/day/체중㎏ 내지 100 ㎎/day/체중㎏, 구체적으로 0.1 ㎎/day/체중㎏ 내지 10 ㎎/day/체중㎏이다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한 없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 사용하여도 우수한 효과를 발휘할 수 있으나, 치료 효율을 증가시키기 위하여 추가적으로 방사선 요법, 화학 요법 등의 다양한 암 치료 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 Nurr1 기능 장애에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 상기 화학식 1 내지 6을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "Nurr1(nuclear receptor related 1)"은 NR4A2(nuclear receptor subfamily [0037] 4, group A, member 2)라고도 알려져 있는 핵수용체 관련 1 단백질을 의미하며, 이는 사람의 NR4A2 유전자에 의해 암호화되는 것으로 알려져 있다. 또한 상당수의 신경퇴행성 질환에는 관련된 것으로 알려져 있다. 비록, 상기 Nurr1 단백질은 고아 핵 수용체(orphan nuclear receptor)로서, 아직까지는 상기 단백질에 대한 리간드가 규명되어 있지 않지만, 상기 Nurr1은 세포 내 전사인자의 핵 수용체 패밀리에 속하는 단백질로서, 뇌에서 도파민 시스템(dopaminergic system)을 유지하는 핵심적인 역할을 수행함이 규명되었다. 상기 Nurr1 기능 장애에 의해 유발되는 질환은 이에 제한되지 않으나 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP) 등의 신경퇴행성 질환과 도파민 기능장애로 유발되는 류마티스 관절염, 정신분열증, 조울증 등의 광범위한 염증성 질환을 포함한다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 상기 화학식 1 내지 6을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.

본 발명의 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 건강기능식품(또는 건강기능 음료 첨가물)으로 사용할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 화합물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품은 소세지, 육류, 빵, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 신규한 유산균 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올일 수 있다.

본 발명은 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 개체는 신경퇴행성 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 인간을 제외한 개체일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로써, 신경퇴행성 질환의 치료에 우수한 효과를 보인다.

본 발명은 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 신경퇴행성 질환의 치료에 사용하기 위한 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다프난 또는 포볼 다이터펜 화합물은 Nurr1 단백질 활성을 향상시키고, 신경세포에서의 염증반응을 억제하는 효과를 나타냄으로써, Nurr1 단백질의 활성 억제로 인해 유발되는 파킨슨병을 비롯한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 효율적으로 사용될 수 있다.

도 1은 신경세포인 BV-2 세포에서 본 발명의 화합물이 염증 관련 인자의 발현을 억제함을 확인한 도이다; 도 1A는 IL-1b의 발현을 억제함을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 도이다. 도 1B는 IL-1b의 mRNA 발현을 억제함을 PCR을 통해 확인한 그래프이다. 도 1C는 IL-6의 mRNA 발현을 억제함을 PCR을 통해 확인한 그래프이다. 도 1D는 TNF-a의 mRNA 발현을 억제함을 PCR을 통해 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 팥꽃나무 추출물의 제조

팥꽃나무(Daphne genkwa)의 줄기와 뿌리 4.47 kg을 세절한 다음, 12 L 80% 에탄올에 4시간 동안 침지하고, 여과하여 고형분과 1차 액상성분을 분리하였다. 상기 분리된 고형분을 다시 12 L 80% 에탄올에 4시간 동안 침지하고, 여과하여 2차 액상성분을 수득하였다. 상기 수득한 1차 액상성분과 2차 액상성분을 혼합하고, 상기 혼합물을 감압하에서 농축시킨 다음, 잔사를 동결건조하여 255.1 g의 팥꽃나무 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 팥꽃나무 추출물로부터 다양한 용매에 의한 활성성분의 분리

상기 실시예 1에서 수득한 팥꽃나무 추출물을 200 mL의 증류수와 헥산의 1:1 혼합용매에 녹여 분획하여 헥산층을 얻었다. 같은 방법으로 2번 더 실시하여 얻은 헥산층을 감압농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 이렇게 얻은 헥산 분획물(20 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 헥산과 에틸 아세테이트의 구배(gradient) 혼합용매(10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2)로 용리시켜 총 3개의 분획 (Fr. I, II, III)을 얻었다.

이중 Fr. I (577 mg)을 75% 아세토니트릴 조건으로 역상 실리카겔 프렙 TLC(reverse phase silica gel prep TLC)를 실시하여 활성밴드를 얻었다. 이 활성밴드를 유속 3 mL/분의 83% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 수행하여 머무름 시간(retention time) 15.2 분과 18.5분에서 각각 acutilonine F (14.0 mg, 화학식 1의 화합물)와 wikstroemia factor M1 (7.0 mg, 화학식 2의 화합물)을 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]²⁰ _D데이터를 근거로 구조를 동정하였다.

[화학식 1]

[α]²⁰ _D-32.1(c 1.3, MeOH);

ESI-MS, m/z 635.6 [M+H]⁺, 657.7 [M+Na]⁺;

¹HNMR(CD₃OD,500MHz): δ_H, 7.70(2H, dd, J=7.35, 2.22Hz, H-3', H-7'), 7.37(1H, m, H-5'), 7.36(2H, m, H-4', H-6'), 7.35(1H, m, H-3''), 6.64(1H, dd, J=14.82, 10.75Hz, H-5''), 6.34(1H, dd, J=14.79, 11.40Hz, H-4''), 6.22(1H, dd, J=15.16, 10.69Hz, H-6''), 6.01(1H, m, H-7''), 6.00(1H, m, H-2''), 5.06(1H, brs, H-16a), 5.03(1H, d, J=4.52Hz, H-3), 4.90(1H, brs, H-16b), 4.56(1H, d, J=2.66Hz, H-14), 3.98(1H, d, J=12.19Hz, H-20a), 3.92(1H, s, H-5), 3.59(1H, d, J=12.20Hz, H-20b), 3.41(1H, brs, H-7), 3.07(1H, d, J=2.69Hz, H-8), 2.83(1H, dd, J=13.03, 5.32Hz, H-10), 2.59(1H, m, H-11), 2.29(2H, m, H-12), 2.15(2H, m, H-8''), 1.82(3H, s, H-17), 1.78(1H, m, H-2), 1.71(2H, m, H-1), 1.47(2H, m, H-9''), 1.31(3H, d, J=6.89Hz, H-18), 0.99(3H, d, J=5.77Hz, H-19), 0.94(3H, t, J=7.39Hz, H-10'');

¹³CNMR values in ppm (CD₃OD, 126Hz): δ_C169.4(C, C-1''), 148.5(C, C-15), 147.2(CH, C-3''), 143.3(CH, C-5''), 141.9(CH, C-7''), 138.2(C, C-2'), 131.6(CH, C-6''), 130.3(CH, C-5'), 129.2(CH, C-4''), 128.9(CH, C-4', C-6'), 127.4(CH, C-3', C-7'), 120.7(CH, C-2''), 118.7(C, C-1'), 111.4(CH₂, C-16), 86.1(C, C-13), 84.0(CH, C-14), 82.9(C, C-4), 82.3(CH, C-3), 82.1(C, C-9), 74.1(CH, C-5), 66.1(CH₂, C-20), 65.1(CH, C-7), 63.0(C, C-6), 37.9(CH, C-8), 37.7(CH, C-2), 37.3(CH₂, C-1), 37.1(CH₂, C-12), 36.5(CH, C-11), 36.2(CH₂, C-8''), 23.4(CH₂, C-9''), 21.6(CH₃, C-18), 19.6(CH₃, C-17), 14.1(CH₃, C-10''), 13.8(CH₃, C-19).

[화학식 2]

[α]²⁰ _D+18.9 (c 1.0, MeOH);

ESI-MS, m/z 637.6 [M+H]⁺, 659.4 [M+Na]⁺, 635.2 [M-H]^-;

¹HNMR(CDCl₃, 500MHz): δ_H7.75(2H, m, H-3', H-7'), 7.36(3H, m, H-4', H-5', H-6'), 7.34(1H, dd, J=15.4 and 10.2, H-3''), 6.21(1H, dd, J=14.8 and 10.4, H-4''), 5.90(1H, d, J=15.2, H-2''), 5.05(1H, brs, H-16a), 4.92(1H, brs, H-16b), 4.69(1H, d, J=5.19, H-3), 4.51(1H, d, J=2.76, H-14), 4.06(1H, s, H-5), 3.88(1H, d, J=12.2, H-20a), 3.77(1H, d, J=12.2, H-20b), 3.44(1H, s, H-7), 2.96(1H, d, J=2.8, H-8), 2.82(1H, dd, J=13.2, 5.5, H-10), 2.48(1H, m, H-11), 2.20(2H, overlapped, H-6''), 2.20(1H, overlapped, H-12a), 1.93(1H, m, H-1a), 1.83(3H, s, H-17), 1.78(1H, m, H-12b), 1.73(1H, m, H-1b), 1.71(1H, m, H-2), 1.45(2H, m, H-7''), 1.33(3H, d, J=6.9, H-18), 1.32(2H, overlapped, H-9''), 1.31(2H, overlapped, H-8''), 1.06(3H, d, J=6.5, H-19), 0.91(3H, t, J=6.9, H-10'');

¹³CNMR(CDCl₃, 126Hz): δ_C169.6(C, C-1''), 147.4(CH, C-3''), 146.8(CH, C-5''), 146.7(C, C-15), 136.4(C, C-2'), 129.4(CH, C-5'), 128.4(CH, C-4''), 128.2(CH, C-4', C-6'), 126.3(CH, C-3', C-7'), 118.0(CH, C-2''), 117.6(C, C-1'), 111.4(CH₂, C-16), 84.5(C, C-13), 82.7(CH, C-14), 82.2(CH, C-3), 81.7(C, C-4), 80.5(C, C-9), 75.0(CH, C-5), 66.3(CH₂, C-20), 64.2(CH, C-7), 60.6(C, C-6), 48.9(CH, C-10), 36.6(CH, C-8), 36.4(CH, C-2), 36.3(CH₂, C-12), 36.0(CH₂, C-1), 35.5(CH, C-11), 33.3(CH₂, C-6''), 31.6(CH₂, C-8''), 28.5(CH₂, C-7''), 22.7(CH₂, C-9''), 21.1(CH₃, C-18), 19.4(CH₃, C-17), 14.2(CH₃, C-10''), 13.3(CH₃, C-19).

또한, Fr. III (400 mg)을 75% 아세토니트릴 조건으로 역상 실리카겔 프렙 TLC(reverse phase silica gel prep TLC)를 실시하여 활성밴드를 얻었다. 이 활성밴드를 CHCl3-MeOH(50:1) 조건으로 순상 실리카겔 프렙 TLC(silica gel prep TLC)를 실시하여 Rf 0.4 과 0.25 에서 두 개의 소 분획물(sub-fraction)로 각각 Fr.III-1 과 Fr.III-2 를 얻었다. Fr.III-1을 유속 3 mL/분의 65% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 수행하여 머무름 시간(retention time) 17.2 분과 23.4 분에서 각각 prostratin Q (2.1 mg, 화학식 3의 화합물) 와 yuanhuadine (4.0 mg, 화학식 4의 화합물)을 흰색 파우더 형태로 얻었다. Fr.III-2는 Fr.III-1과 같은 방법으로 ODS HPLC를 수행하여 머무름 시간(retention time) 19.0 분과 21.4 분에서 각각 yuanhuatine (4.4 mg, 화학식 5의 화합물) 과 12-O-n-deca-2,4,6-trienoyl-phorbol-(13)-acetate (1.8 mg, 화학식 6의 화합물)를 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]²⁰ _D데이터를 근거로 구조를 동정하였다.

[화학식 3]

[α]²⁰ _D+14.1 (c 0.03, MeOH);

ESI-MS, m/z 579.5 [M+Na]⁺;

¹HNM(CDCl₃, 500MHz): δ_H7.60(1H, s, H-1), 7.24(1H, m, H-3''), 6.19(1H, m, H-4''), 6.15(1H, m, H-5''), 5.79(1H, d, J=15.41Hz, H-2''), 5.70(1H, d, J=4.71Hz, H-7), 5.47(1H, d, J=10.27Hz, H-12), 4.03(2H, q, J=13.04Hz, H-20), 3.26(2H, overlapped, H-8, H-10), 2.53(2H, m, H-5), 2.17(2H, overlapped, H-6''), 2.17(1H, overlapped, H-11), 2.11(3H, s, H-2'), 1.78(3H, s, H-19), 1.44(2H, m, H-7''), 1.32(2H, m, H-9''), 1.31(2H, m, H-8''), 1.27(3H, s, H-16), 1.22(3H, s, H-17), 1.10(1H, d, J=5.20Hz, H-14), 0.91(3H, d, J=6.93Hz, H-18), 0.90(3H, t, J=7.06Hz, H-10'');

¹³CNMR values in ppm(CDCl₃, 126Hz):δ_C209.1(C, C-3), 174.1(C, C-1'), 167.3(C, C-1''), 161.0(CH, C-1), 145.8(CH, C-3''), 145.5(CH, C-5''), 140.7(C, C-6), 133.1(C, C-2), 129.5(CH, C-7), 128.5(CH, C-4''), 119.1(CH, C-2''), 78.4(C, C-9), 74.0(C, C-4), 68.2(CH₂, C-20), 65.9(C, C-13), 56.4(CH, C-10), 43.4(CH, C-11), 39.3(CH, C-8), 38.9(CH₂, C-5), 36.6(CH, C-14), 33.2(CH₂, C-6''), 31.6(CH₂, C-8''), 28.6(CH₂, C-7''), 25.9(C, C-15), 24.0(CH₃, C-17), 22.7(CH₂, C-9''), 21.3(CH₃, C-2'), 17.0(CH₃, C-16), 14.2(CH₃, C-10''), 10.3(CH₃, C-19).

[화학식 4]

[α]²⁰ _D+7.5 (c 1.3, CH₂Cl₂);

ESI-MS, m/z 587.6 [M+H]⁺and 609.5 [M+Na]⁺;

¹H NMR (CDCl₃, 500MHz): δ_H7.58(1H, s, H-1), 6.67(1H, dd, J=15.45, 10.66Hz, H-3'), 6.05(1H, dd ,J=15.14, 10.71Hz, H-4'), 5.86(1H, m, H-5'), 5.65(1H, d, J=15.46Hz, H-2'), 5.02(1H, brs, H-16a), 4.99(1H, brs, H-12), 4.96(1H, brs, H-16b), 4.76(1H, d, J=2.47Hz, H-14), 4.26(1H, brs, H-7), 3.94(1H, dd, J=12.34, 5.86Hz, H-20a), 3.82(1H, m, H-10), 3.80(1H, m, H-20b), 3.56(1H, s, H-5), 3.52(1H, d, J=2.45Hz, H-8), 2.38(1H, q, J=7.22Hz, H-11), 2.10(2H, q, J=7.20Hz, H-6'), 2.00(3H, s, H-2''), 1.84(3H, s, H-17), 1.80(3H, d, J=1.31Hz, H-19), 1.39(2H, dt, J=14.26, 7.28Hz, H-7'), 1.30(2H, m, H-9'), 1.27(2H, m, H-8'), 0.89(3H, t, J=6.93Hz, H-10');

¹³CNMR values in ppm(CDCl₃, 126Hz): δ_C209.7(C, C-3), 169.9(C, C-1''), 160.6(CH, C-1), 143.3(C, C-15), 139.6(CH, C-5'), 137.1(C, C-2), 135.3(CH, C-3'), 128.8(CH, C-4'), 122.5(CH, C-2'), 117.2(C, C-1'), 113.5(CH₂, C-16), 83.9(C, C-13), 80.7(CH, C-14), 78.5(CH, C-12), 78.3(C, C-9), 72.5(C, C-4), 72.2(CH, C-5), 65.3(CH₂, C-20), 64.5(C-7), 60.7(C-6), 47.7(CH, C-10), 44.3(CH, C-11), 35.6(CH, C-8), 32.9(CH₂, C-6'), 31.5(CH₂, C-8'), 28.9(CH₂, C-7'), 22.7(CH₂, C-9'), 21.4(CH₃, C-2''), 18.9(CH₃, C-17), 18.5(CH₃, C-18), 14.2(CH₃, C-10'), 10.1(CH₃, C-19).

[화학식 5]

[α]²⁰ _D+52.8 (c 0.5, MeOH);

ESI-MS, m/z 605.5 [M+H]⁺, 627.4 [M+Na]⁺, 603.3 [M-H]^-;

¹HNMR(CDCl₃, 500MHz): δ_H7.94(2H, m, H-3'', H-7''), 7.75(2H, m, H-3', H-7'), 7.60(1H, t, J=7.4, H-5''), 7.48(2H, m, H-4'', H-6''), 7.40(3H, m, H-4', H-5', H-6'), 5.42(1H, brs, H-12), 5.07(1H, brs, H-16a), 5.03(1H, brs, H-16b), 4.99(1H, d, J=2.8, H-14), 4.10(1H, s, H-5), 3.90(1H, d, J=12.4, H-20a), 3.85(1H, d, J=12.3, H-20b), 3.69(1H, d, J=2.8, H-8), 3.67(1H, brs, H-7), 3.06(1H, dd, J=13.3 and 5.9, H-10), 2.59(1H, q, J=6.9, H-11), 2.40(1H, m, H-1a), 2.28(1H, m, H-2), 1.92(3H, s, H-17), 1.63(1H, m, H-1b), 1.51(3H, d, J=6.9, H-18), 1.12(3H, d, J=6.6, H-19);

¹³CNMR(CDCl₃, 126Hz): δ_C220.4(C, C-3), 165.8(C, C-1''), 143.2(C, C-15), 135.7(C, C-2'), 133.5(CH, C-5''), 130.0(CH, C-5'), 129.8(C, C-2''), 129.7(CH, C-3'', C-7''), 128.9(CH, C-4'', C-6''), 128.3(CH, C-4', C-6'), 126.2(CH, C-3', C-7'), 118.4(C, C-1'), 113.8(CH₂, C-16), 83.9(C, C-13), 81.4(CH, C-14), 79.3(C, C-9), 78.7(CH, C-12), 75.2(C, C-4), 71.5(CH, C-5), 65.3(CH₂, C-20), 64.5(CH, C-7), 61.0(C, C-6), 44.3(CH, C-11), 44.2(CH, C-10), 43.1(CH, C-2), 36.3(CH, C-8), 33.6(CH₂, C-1), 19.0(CH₃, C-17, C-18), 12.6(CH₃, C-19).

[화학식 6]

[α]²⁰ _D-15.1 (c 0.2, CHCl₃);

ESI-MS, m/z 577.5 [M+Na]⁺, 553.4 [M-H]^-;

¹HNMR (CDCl₃, 500MHz): δ_H7.61(1H, s, H-1), 7.28(1H, dd, J=15.3 and 11.22, H-3''), 6.54(1H, dd, J=14.9 and 10.7, H-5''), 6.23(1H, dd, J=14.8 and 11.4, H-4''), 6.15(1H, dd, J=15.1 and 10.8, H-6''), 5.95(1H, m, H-7''), 5.84(1H, d, J=15.3, H-2''), 5.70(1H, d, J=4.8, H-7), 5.47(1H, d, J=10.3, H-12), 4.05(1H, d, J=12.9, H-20a), 4.00(1H, d, J=12.9, H-20b), 3.26(1H, overlapped, H-10), 3.26(1H, overlapped, H-8), 2.52(2H, m, H-5), 2.17(1H, m, H-11), 2.13(2H, overlapped, H-8''), 2.11(3H, s, H-2'), 1.78(3H, d, J=1.5, H-19), 1.45(2H, dq, J=14.6 and 7.3, H-9''), 1.27(3H, s, H-16), 1.22(3H, s, H-17), 1.10(1H, d, J=5.1, H-14), 0.93(3H, t, J=7.3, H-10''), 0.91(3H, d, J=6.4, H-18);

¹³CNMR(CDCl₃, 126Hz): δ_C209.2(C, C-3), 174.1(C, C-1'), 167.2(C, C-1''), 161.0(CH, C-1), 145.6(CH, C-3''), 141.8(CH, C-5''), 141.0(CH, C-7''), 140.7(C, C-6), 133.1(C, C-2), 130.2(CH, C-6''), 129.5(CH, C-7), 127.9(CH, C-4''), 119.9(CH, C-2''), 78.5(C, C-9), 76.9(CH, C-12), 74.0(C, C-4), 68.2(CH₂, C-20), 65.9(C, C-13), 56.4(CH, C-10), 43.4(CH, C-11), 39.3(CH, C-8), 38.8(CH₂, C-5), 36.6(CH, C-14), 35.5(CH₂, C-8''), 26.0(C, C-15), 24.0(CH₃, C-17), 22.4(CH₂, C-9''), 21.3(CH₃, C-2'), 17.0(CH₃, C-16), 14.6(CH₃, C-18), 13.9(CH₃, C-10''), 10.3(CH₃, C-19).

실시예 3: Nurr1 단백질 활성에 대한 화합물의 효과

상기 실시예 2와 같이 팥꽃나무 추출물에서 분리한 다프난 및 포볼 다이터펜계 화합물의 농도에 따른 Nurr1 단백질 활성도를 루시퍼라제 분석을 통하여 확인하였다.

구체적으로, GLA4 유전자가 결합할 수 있는 염기서열(5'-CTCGGAGGACAGTACTCCG-3', 서열번호 1)이 8회 반복된 유전자를 리포터 유전자인 루시퍼라제에 결합시킨 벡터를 합성한 후, Nurr1-LBD를 포함한 DNA와 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)를 가진 DNA 등 3종의 플라스미드 DNA를 BE(2)C 세포에 주입(transfection)하였다. 6시간 후, 상기 실시예 2에서 분리한 화합물 1 내지 6을 농도별로 처리하였다. 이렇게 처리한 세포를 20시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후, 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 대조군으로는 0.1% DMSO를 사용하였고, 이때의 활성에 배수로 활성도의 증가를 나타내었으며, 양성대조군으로 Amodiaquine을 사용하였다.

분석 결과, 하기 표 1과 같이, 화합물 3 및 4의 prostratin Q 및 yuanhuadine은 0.003 μM의 저농도에서도 Nurr1을 활성화시켰으며, 상기 화합물 3 및 4와 더불어 화합물 6의 12-O-n-deca-2,4,6-trienoyl-phorbol-(13)-acetate은 0.03 μM에서 유의적으로 Nurr1를 활성화함을 확인하였다. 또한, 화합물 1의 acutilonine F, 화합물 2의 wikstroemia factor M1 및 화합물 5의 yuanhuatine은 각각 1, 0.2 및 0.3 μM에서 유의적으로 Nurr1를 활성화시킴을 확인하였다. 이를 통해, 팥꽃나무 추출물에서 분리된 화합물들이 Nurr1을 활성화시킴과 동시에, 화합물의 구조에 따라 활성이 상이할 수 있음을 알 수 있었다.

농도 (μM)	양성대조군	화합물1	화합물2	화합물3	화합물4	화합물5	화합물6
0.003	-	-	-	1.23±0.09	1.03±0.15	-	-
0.01	-	-	-	1.35±0.28	0.94±0.04	-	-
0.03	-	1.28±0.18	1.4±0.18	*1.47±0.17	*1.63±0.18	1.17±0.22	*1.42±0.15
0.1	-	1.16±0.16	**1.29±0.04	*1.42±0.14	**1.68±0.11	1.28±0.35	*1.68±0.43
0.3	-	1.32±0.13	*1.33±0.06	*1.65±0.2	**1.62±0.11	**1.59±0.08	*1.82±0.51
1	0.8±0.03	*1.76±0.08	*1.62±0.21	**1.47±0.02	*1.67±0.32	*2.12±0.37	**1.53±0.07
5	1.1±0.15	-	-	-	-	-	-
10	**1.6±0.03	-	-	-	-	-	-
20	**2.7±0.37	-	-	-	-	-	-

(*P < 0.05, **P < 0.01 대조군 처리 대비)

실시예 4: 마이크로글리아 BV-2 세포에서 산화질소 생성 억제활성

마이크로글리아 세포(microglia cell)에서 염증반응에 의한 뇌신경세포의 사멸은 치매, 파킨슨 병과 같은 퇴행성 뇌질환의 주요한 원인중의 하나로 보고되어 있다(Sarkar S et al., Neurotoxicology, 44, 250-262 (2014); Bower JH et al., Neurology, 67, 494-496 (2006)) 따라서, 마이크로글리아에서 상기 실시예 2에서 분리한 화합물들을 대상으로 대표적인 염증인자인 산화 질소(nitric oxide, NO)의 생성억제 활성을 조사하였다. 구체적으로, 마이크로글리아 BV-2 세포를 96 웰 플레이트에 5×10⁴ 세포/웰로 넣고, 2일 배양한 다음, LPS (1 mg/mL)를 상기 실시예 2에서 분리한 화합물과 함께 24시간 배양하였다. 배양 상등액을 Griess 시약을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 아질산염(nitrite)를 정량함으로서 산화질소의 생성량을 조사하였다. 양성대조군으로는 Minocyline을 사용하였다.

조사 결과, 하기 표 2와 같이, 모든 화합물들이 낮은 농도에서 산화질소의 생성을 저해함을 확인하였다. 특히, 화합물 4의 yuanhuadine은 1.03 μM의 매우 낮은 농도에서 산화질소 생성의 저해 활성을 나타냄을 확인하였다.

	양성대조군	화합물1	화합물2	화합물3	화합물4	화합물5	화합물6
IC50 (μM)	29.9	3.49	2.3	1.8	1.03	3.73	1.78

실시예 5: 마이크로글리아 BV -2 세포에서 전염증성 사이토카인 생성 억제활성

마이크로글리아에서의 대표적인 염증인자인 IL-1b, IL-6 및 TNFa에 대한 화합물의 생성억제활성을 조사하였다. 마이크로글리아 BV-2 세포를 96 웰 플레이트에 1 × 10⁵ 세포/웰로 넣고, LPS (1 mg/mL)를 화합물과 함께 5시간 배양하였다. 각 웰에서 세포를 회수하여 웨스턴 블롯팅과 real-time PCR 을 실시하였다.

구체적으로, IL-1b 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다. 1차 항체로 rabbit anti-IL-1b [Cell Signaling (Danvers, MA, USA); 1:1000])를 사용하였고, control로 mouse anti-actin (Sigma 1:5000)을 사용하였다. 2차 항체로 horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse 또는 anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) antibody (Amersham, Piscataway, NY, USA)를 사용하였고, enhanced-chemiluminescent substrate (Amersham)로 발색하여 관찰하였다.

또한, IL-1b, IL-6, TNF-a 의 mRNA 발현량을 Real-time quantatitive PCR 로 분석하였다. 모든 쥐의 사이토카인과 GAPDH의 프라이머는 Invitrogen에서 구입하였고, 사이토카인 mRNA 발현량을 GAPDH mRNA 발현량으로 정규화(normalized)하여 구하였다.

웨스턴 블롯팅 및 PCR 수행 결과, 도 1A 및 1B와 같이, 모든 화합물의 투여군에서 IL-1b의 발현량이 감소함을 확인하였다. 또한, PCR 수행 결과, 도 1C 및 1D와 같이, 모든 화합물의 투여군에서 IL-6 및 TNF-a의 발현량 역시 감소함을 확인하였다.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising daphnane or phobor diterpenoid compound <130> P17-163-KRI <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLA4 binding gene <400> 1 ctcggaggac agtactccg 19

Claims

다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 하기 화학식 1 내지 6을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]
제1항에 있어서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 화학식 3, 4 또는 6의 화합물인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 화학식 4의 화합물인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 팥꽃나무 줄기 및 뿌리 추출물로부터 분리된 화합물인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서, 상기 다프난 또는 포볼 다이터펜계 화합물은 하기 화학식 1 내지 6을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]
제7항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제7항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)인, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.