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KR101971128B1 - Ｅｒ-베타 효능제로서 6-치환된 데메틸-에스트라디올 유도체 - Google Patents

Ｅｒ-베타 효능제로서 6-치환된 데메틸-에스트라디올 유도체 Download PDF

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KR101971128B1
KR101971128B1 KR1020137009269A KR20137009269A KR101971128B1 KR 101971128 B1 KR101971128 B1 KR 101971128B1 KR 1020137009269 A KR1020137009269 A KR 1020137009269A KR 20137009269 A KR20137009269 A KR 20137009269A KR 101971128 B1 KR101971128 B1 KR 101971128B1
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제임스 지. 야거
스티븐 에이치. 나이
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엔디씨, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 선택적 ＥＲβ 효능제로서 6-치환된 13-데메틸-에스트라디올 유도체들을 개시한다. 또한, 이러한 6-치환된 13-데메틸-에스트라디올 유도체들을 투여하여 통증을 치료하는 방법을 개시한다.

Description

ＥＲ-베타 효능제로서 6-치환된 데메틸-에스트라디올 유도체{6-SUBSTITUTED DEMETHYL-ESTRADIOL DERIVATIVES AS ER-BETA AGONISTS}
본 출원은 2010년 9월 14일에 출원된 미국 가출원 일련번호 61/382,752로부터 우선권을 주장하며, 본 명세서에서 전문이 인용 참조된다.
본 발명은 본 명세서에서 설명되고 표현되는 바와 같이, 6-치환된 13-데메틸-에스트라디올 화합물들 및 이의 약학적으로 수용가능한 염들 또는 그 프로드러그(prodrug)들을 제조하고 이용하는 방법들 및 조성물들에 관한 것이다. 상기 화합물들은 실제적으로 ERα와 기능적 활성을 갖지 않으며, ERβ 특이 효능제들로서 유용한 것으로 예상치 않게 발견되었다. 이와 같이, 본 발명은 또한 신경성 통증(neuropathic pain)의 치료 및 진단 적용을 위해, 생체 외 또는 생체 내에 존재하는 이러한 화합물들을 포함하는 약학적 조성물들에 관한 것이다.
에스트로겐 수용체들의 기능 및 활성, 구조, 그리고 그들의 기능에 대한 연구는 최근 많은 연구논문들의 주제였다. 에스트로겐 수용체들은 구조적으로 관련된 리간드-유도성 전사 인자들의 넓은 군(large family of structurally related ligand-inducible transcription factors)에 속하며, 이는 핵 수용체들로서 알려진 비타민 D 수용체들, 갑상선/레티노이드 수용체들, 스테로이드 수용체들을 포함한다. 핵 수용체들에 대한 실제 리간드가 설명되지 않았지만, 이러한 수용체들에 결합하고 세포 반응을 유발할 수 있는 독특한 저분자(small molecule)들이 존재한다.
에스트로겐들 및 에스트로겐 수용체 조절체들은 두 가지 타입; 즉 α 및 β로 분류되는 에스트로겐 수용체에 결합하여, 타겟 유전자의 발현을 조절함으로써 다면발현성 조직-특이 효과들(pleiotropic tissue-specific effects)을 발휘하는 별개의 분자 착물을 형성한다. 리간드-결합된 에스트로겐 수용체는 다양한 분자 경로에서 중요한 전사 인자로서 작용하며, ER 발현 수준의 조절이 세포 성장 가능성을 결정하는데 중요하다.
이러한 타입의 수용체들은 둘 다 에스트로겐뿐만 아니라, 다른 효능제(agonist) 및 길항제(antagonist)들에도 결합하지만, 두 수용체들은 체내에서 분명히 상이한 편재화 농도(localization concentration)를 갖는다. α 및 β 형 간의 몇몇 구조적 차이들 이외에도, 에스트로겐과의 착물인 경우, 이 둘은 반대 방식으로 신호를 보내는 것으로 나타났으며, 에스트로겐은 에스트로겐 수용체 α(ERα)의 존재 시에 전사를 활성화하고, 에스트로겐 수용체 β(ERβ)의 존재 시에 전사를 억제한다.
에스트로겐은 통증 인식을 포함하는 넓은 범위의 뉴런 기능들을 조절한다. 최근, 야생형(wild type: WT) 및 ERβ 녹아웃(knockout: KO) 쥐들에 수행된 핫플레이트 및 포르말린 테스트들은 통증 억제 메커니즘 및 초기 강직성 통증(early tonic pain)이 ERβ 결실(deficiency)에 의해 완화됨을 입증하였다. Spooner, M.F. 외, Neuroscience 150, 675-680 (2007). Spooner 외 다수는 급성 및 말기 강직성 단계들 동안이 아닌 포르말린 테스트의 간기 및 초기 강직성 단계(II) 동안에는 통각 반응들이 WT 암컷 쥐들에서보다 ERβ KO 암컷 쥐들에서 더 낮음을 알아냈다. 이는, ERβ의 작용을 통하여, 에스트로겐이 척추 통각 뉴런 활동의 증가를 유발하는 초기 단계(II)에 진행된 염증 및/또는 간기 동안의 내생적 통증 조절 메커니즘들의 효능을 낮출 수 있음을 제안한다.
또한, ERb-131, 비-스테로이드 ERβ 리간드는 신경 손상 또는 감작(sensitization)을 수반하는 여러 통증 동물 모델들에서 평가되었다. Piu, F. 외, European Journal of Pharmacology 590, 423-429(2008); Piu, F. 외, European Journal of Pharmacology 592, 158-159(2008). 기능 및 결합 분석들(functional and binding assays)을 이용하여, ERb-131은 강력하고 선택적 ERβ 효능제로서 특성화되었다. 생체 내에서, ERb-131은 쥐의 자궁 비대 반응 분석(rat uterotrophic assay)에서 밝혀진 바와 같이 에스트로겐 수용체 알파 활성이 결여되었다. 또한, ERb-131은 캡사이신에 의해 유도된 촉각 과민통(tactile hyperalgesia)을 경감시켰으며, 척수 신경 결찰(spinal nerve ligation) 및 다양한 화학적 손상들(chemical insults)에 의해 유도된 촉각 이질통(tactile allodynia)을 이겨내게 했다(reversed). 더욱이, ERb-131은 정상의 건강한 동물들의 통증 임계치에 영향을 주지 않았다. 만성 CFA 모델(chronic complete Freund's adjuvant model)에서, ERb-131은 만성 통증의 염증 성분과 과민통 성분을 모두 가라앉혔다(resolved). 따라서, Piu 외 다수는 ERβ 아고니즘(agonism)이 넓은 범위의 비-통각 상태를 약화시키는데 결정적인 효과기(critical effector)임을 입증한다.
따라서, ERβ에 선택적으로 작용하여 통증의 치료를 도울 수 있는 새로운 화합물들에 대한 필요성이 존재한다. 지금까지, 종래 기술 중 어느 것도 이러한 타입의 치료에 사용될 수 있는 치료목적의 6-치환된 13-데메틸 에스트라디올 유도체를 제공하지 않는다.
앞선 내용을 고려하면, 본 발명은 진통성분의 화합물(analgesic compounds), 조성물, 이의 사용 및 제조 방법에 관한 것으로, 앞서 설명된 것들을 포함하여 종래 기술의 다양한 결점 및 단점을 극복한다. 따라서, 본 발명의 제 1 목적은 에스트로겐-의존성 질환의 치료에 유용한 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ERβ에 선택적으로 작용하는 화합물들로 통증을 치료하는 방법들 및 화합물들을 제공하는 것이다. 상기 화합물들은 ERβ의 선택적 효능제 또는 길항제일 수 있다.
본 발명은 화학식 I로 나타낸 화합물들을 포함하며,
Figure 112013031687687-pct00001
이때, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, 할로(halo), 설페이트, 글루쿠로나이드, -OH, 벌키기(bulky group), 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, -N(CH2)n, 포스페이트기, 및 포스피네이트기이며; R11은 H, C1-C6 알킬, 할로겐, 설페이트, 글루쿠로나이드, -SO2NH2, -COOH, -CN, -CH2CN-, -NHCN-, -CHO, =CHOCH3, -COO 염, -OSO2 알킬, -NH2, 및 -NHCO(CH2)n으로 구성된 그룹으로부터 선택되고; X는 수소, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 할로겐, 글루쿠로나이드, -NH2, -SO2NH2, -COOH, -CN, -CH2CN-, -NHCN, -CHO, -COO 염, -OSO2 알킬, -SH, -SCH3, -CH[(CH2)nCH3]C00CH3, -(CH2)mCOOCH3, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, -(CH2)m-NH-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-N-(CH2)nCH3, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-NH2, -(CH2)m-O-NH2, -(CH2)m-S-NH2, -NH(CH2)mCH3, -NH(CH2)mOCH3, -NH(CH2)mCHOH-COOH, -N(CH3)2, -(CH2)m(NH)CH2OH, -NHCOOH, -(CH2)mNHCOOH, -NO2, -SCN, -SO2 알킬, -B(OH)2, -(CH2)mN(CH3)-SO2-NH3, -(CH2)m-NH-SO2-NH2, -NHC(=S)CH3, 및 -NHNH2로 구성된 그룹으로부터 선택되고; Y는 수소, =O, -OCO(R6), 및 -OH으로부터 선택되며; 이때 m은 0과 20 사이의 정수이고, n은 0과 8 사이의 정수이며, ---- 부호는 3 또는 17번 위치에서 케토기를 형성할 수 있는 단일 또는 이중 결합을 나타내고;
Figure 112013031687687-pct00002
부호는 입체화학에 상관없이 여하한 타입의 결합을 나타내며; 상기 화합물의 각각의 거울상이성질체, 다른 입체화학 이성질체, 수화물, 용매화물, 호변이성질체 및 약학적으로 수용가능한 염을 포괄한다.
화학식 I의 화합물들의 특정 예시들이 아래에 도시된다:
Figure 112013031687687-pct00003
적어도 본 발명의 또 다른 실시형태는 치료 활성을 발휘하도록 환자에게 투여된 후 생체 내에서 특정 활성 화합물로 전환될 수 있는 적절한 유사체의 전환을 허용하는 전달 시스템들에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 화합물들은 포유류 대상으로 병용-기반 치료요법적 통증 치료에 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 당업계에 알려진 바와 같은 다른 보조 통증 치료들과 조합하여 화학식 I의 화합물의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 여하한의 화합물은 약물, 프로드러그 또는 심지어 활성 대사물질의 형태로 포유류 대상에게 투여하도록 고려될 수 있다. 본 발명의 치료 방법들에서, "투여"라는 용어는 구체적으로 개시된 화합물, 또는 구체적으로 개시되지는 않지만 환자에게 투여 후 생체 내에서 특정 화합물로 전환되어 치료 활성을 보이는 화합물을 이용하여 설명된 다양한 질환의 치료를 포함할 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 이익 및 장점은 이 발명의 내용(summary)과 몇몇 실시예들의 다음 설명들로부터 분명히 알 수 있을 것이며, 다양한 화학치료 화합물, 방법 및/또는 수술 방식을 알고 있는 당업자라면 쉽게 알 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 화합물들에 대한 다양한 세포주(cell lines)의 화합물들 B, I 및 1, 그리고 타목시펜의 EC50 값의 그래프;
도 2는 ERα 및 ERβ의 I 및 B에 대한 E2 활성의 %를 나타낸 도면; 및
도 3은 루시페라아제 분석에 의해 측정된 ERα 및 ERβ의 (A) 화합물 I 및 (B) 화합물 B의 반응을 나타낸 도면이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 가지며, 아래에 설명되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허문헌은 그 전문이 인용 참조된다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 언급은 라세미 및 다른 혼합물을 포함하는 이러한 모든 이성질체 형태를 포함한다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 언급은 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 이온, 염, 용매화물(예를 들어, 수화물), 보호된 형태, 프로드러그, 및 다른 입체이성질체를 포함한다.
활성 화합물의 대응하는 염, 예를 들어 약학적으로 수용가능한 염을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 약학적으로 수용가능한 염의 예시들은 Berge 외의 "Pharmaceutically Acceptable Salts"(1997, J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19)에 개시되어 있으며, 본 명세서에서도 설명된다.
본 발명의 화합물들은 통증의 치료에 적용되며, 그러므로 본 발명은 통증 완화제 또는 진통제를 또한 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "진통 완화제"는 통증을 치료, 지연, 감소시키고, 및/또는 통증의 내성(tolerance)을 증가시키는 화합물에 관련된다. 진통 효과는 1 이상의 메커니즘 또는 이의 여하한의 조합을 통해 발생할 수 있다.
또한, 본 발명은 치료요법으로 사람 또는 동물의 몸을 치료하는 방법에 사용되는 활성 화합물들을 제공한다. 이러한 방법은 바람직하게는 본 명세서에서 더 설명되는 바와 같은 약학적 조성물의 형태로 치료요법적으로 유효한 양의 활성 화합물을 이러한 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "에스트로겐"이라는 용어는 자연적으로 제조되는 스테로이드 유사 호르몬들을 포함하고, 세포막을 통과하여 에스트로겐 수용체에 결합함으로써 세포 내에서 그 활성을 발휘할 수 있다. 이러한 화합물들의 예시는 에스트라디올, 에스트롤 및 에스테렌을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다.
질환을 치료하는 것과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "치료" 또는 "치료요법"이라는 용어는, 일반적으로 사람이든지 사람이 아닌 동물(예를 들어, 수의과 적용에서)이든지 간에, 어느 정도의 원하는 치료 효과, 예를 들어 질환의 진행의 억제가 달성되는 포유류 대상의 치료 및 치료요법에 관련되며, 진행률의 감소, 진행률의 정지, 질환의 호전, 및/또는 질환의 치유를 포함한다. 또한, 예방 처치로서의 치료도 포함된다. 치료는 병용 치료 및 치료요법을 포함하며, 2 이상의 치료 또는 치료요법이 예를 들어 연속하여 또는 동시에 병용된다. 치료 및 치료요법의 예시들은 화학요법[예를 들어, 약물, 항체(예를 들어, 면역요법에서와 같음), 프로드러그(예를 들어, 위치 3번 또는 17번 위치와 같은 적절한 위치에서의 인산 유도체 및 포스피네이트, 그리고 광역학요법, GDEPT, ADEPT 등에 사용되는 다른 화합물을 포함한 보호기를 이용함)를 포함한 활성제의 투여]; 수술; 방사선요법; 유전자요법; 및 다른 유사한 방법을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 "입체화학 이성질체"라는 용어는 원자가 공간에 배위되는 방식이 서로 다른 이성질체를 칭한다. 본 발명에 특히 중요한 두 개의 입체이성질체는 두 이성질체가 서로 거울상인지 아닌지에 따라 거울상이성질체 및 부분입체이성질체이다. 바람직한 실시예에서, 청구된 제제(claimed formulation)는 분리되고, 분해되며, "다른 이성질체가 실질적으로 없는" 화합물들을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "치료요법적으로 유효한 양"이라는 용어는 적당한 이익/위험 비에 상응하는 어느 정도의 원하는 치료 효과를 생성하는데 효과적인 활성 화합물의 양, 또는 활성 화합물을 포함한 물질, 조성물 또는 투약 형태에 관련된다.
"환자"라는 용어는 포유동물을 포함한 동물, 바람직하게는 사람을 칭한다.
"환자의 부위"이라는 용어는 통증에 시달리는 환자의 특정 영역 또는 부분, 그리고 몇몇 경우에는 환자 전신에 걸친 부위를 칭한다. 이러한 부위의 예시는 폐 부위, 위장 부위, 유방 부위, 신장 부위뿐만 아니라, 다른 신체 부위, 혈관계 및 순환계를 포함한 조직, 림프구, 수용체, 기관 등이 있으며, 또한 암 조직이 있다. "환자의 부위"는, 예를 들어 개시된 화합물 및 조성물로 치료될 부위들을 포함한다. "환자의 부위"는 내부 또는 외부일 수 있다.
"조직"이라는 용어는 일반적으로 특정 기능을 수행할 수 있는 특수 세포를 칭한다. "조직"이라는 용어는 각각의 세포 또는 복수의 세포 또는 세포 응집체, 예를 들어 막, 혈액 또는 기관을 칭할 수 있다. 또한, "조직"이라는 용어는 하나의 비정상 세포 또는 복수의 비정상 세포의 언급을 포함한다. 예시적인 조직들은 유방 세포를 포함한 유방 조직, 내피 및 상피를 포함한 막 조직, 라미나(laminae), 간질 조직을 포함한 결합 조직, 및 종양을 포함한다.
본 명세서에서 "알킬"은 1 내지 20개, 및 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분기형 사슬 알킬 라디칼을 의미한다. 예시들은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 2차-부틸, 3차-부틸, 펜틸, 2-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 2-헥실, 3-헥실, 및 3-메틸펜틸을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다. 각각의 알킬기는, 예를 들어 할로, 하이드록실, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐, 또는 알콕시기 등과 같은 1, 2 또는 3 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.
"아릴"은 단일 고리(예를 들어, 페닐), 다수의 고리(예를 들어, 바이페닐), 또는 적어도 하나가 방향족인 다수의 융합된 고리(fused ring)(예를 들어, 1,2,3,4-테트라하이드로나프틸)을 갖는 방향족 카르보사이클릭 라디칼을 의미한다. 또한, 아릴기는 예를 들어 할로, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 또는 알콕시 등과 선택적으로 일치환, 이치환, 또는 삼치환될 수 있다.
"헤테로아릴"은 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 적어도 1개 및 4개 이하의 헤테로원자를 포함한 오원자, 육원자 또는 칠원자(7-membered) 고리의 하나 또는 다수의 융합된 방향족 고리계를 의미한다. 예시들은 푸라닐, 티에닐, 피리디닐, 피리미디닐, 벤즈이미다졸릴, 및 벤즈옥사졸릴을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다. 또한, 헤테로아릴기는 예를 들어 할로, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 또는 알콕시 등과 선택적으로 일치환, 이치환, 또는 삼치환될 수 있다.
"사이클로알킬"은 단일 고리(예를 들어, 사이클로헥실), 다수의 고리들(예를 들어, 바이사이클로헥실) 또는 다수의 융합된 고리들을 갖는 카르보사이클릭 라디칼을 의미한다. 사이클로알킬기는 1 내지 4 개의 헤테로원자를 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 사이클로알킬기는 1 이상의 이중 결합을 가질 수 있다. 또한, 사이클로알킬기는 예를 들어 할로, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 아릴, 또는 알콕시 등과 선택적으로 일치환, 이치환, 또는 삼치환될 수 있다.
"알콕시"는 알킬 부분을 갖는 옥시-함유 라디칼을 의미한다. 예시들은 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 3차-부톡시를 포함하나, 이로 제한되지는 않는다. 또한, 알콕시기는 예를 들어 할로, 하이드록실, 아릴, 사이클로알킬, 또는 알콕시 등과 선택적으로 일치환, 이치환, 또는 삼치환될 수 있다.
"알케닐"은 2 내지 20개, 및 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자, 및 1 내지 3개의 이중 결합을 갖는 직쇄형 또는 분기형 탄화수소 라디칼을 의미하며, 예를 들어 에테닐, 프로페닐, 1-부트-3-에닐, 1-펜트-3-에닐, 1-헥스-5-에닐을 포함한다. 또한, 알케닐기는 예를 들어 할로, 하이드록실, 아릴, 사이클로알킬, 또는 알콕시 등과 선택적으로 일치환, 이치환, 또는 삼치환될 수 있다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오린, 클로린, 브로민, 또는 아이오딘의 할로겐 라디칼이다.
"글루쿠로나이드"는 글루쿠론산의 글리코사이드 라디칼을 의미한다.
"설페이트"라는 용어는 일반식 -OS(O)2-OR'을 갖는 라디칼을 칭하며, 이때 R'은 수소, 금속 또는 알킬기이다.
"포스페이트"라는 용어는 일반식 -OP(O)(OR')2를 갖는 라디칼을 칭하며, 이때 각각의 R'은 독립적으로 수소, 금속 또는 알킬기이다.
"포스피네이트"라는 용어는 일반식 -OP(O)(R')2를 갖는 라디칼을 칭하며, 이때 각각의 R'은 독립적으로 수소, 금속 또는 알킬기이다.
"벌키기"는 이것이 부착되는 공간에 대해 입체 장애를 생성하는 치환기, 예를 들어 t-부틸기를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "아미노 알킬"이라는 용어는 아미노기가 있는 알킬기, 예를 들어 H2N-CH2-, H2N-CH2CH2-, Me2NCH2- 등을 칭하고, 이때 부착 지점은 알킬 사슬의 탄소이며; 본 명세서에 사용되는 "알킬 아미노"라는 용어는 질소 원자에 알킬기가 부착된 아미노기, 예를 들어 CH3NH-, EtNH-, iPr-NH- 등을 칭하고, 이때 부착 지점은 아미노기의 질소 원자를 통해서이다. 연속적인 라디칼들이 사용되는 모든 다른 용어들은 유사한 규칙을 지킬 것이다.
"데메틸"은 메틸기의 부재를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "증식성 세포 장애"라는 용어는 종양, 원발성 악성 종양 및 다른 이상증식성 질환과 같은 장애들을 칭한다. "원발성 악성 종양(들)" 및 "암(들)"이라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
화합물들
무엇보다도, 본 발명은 에스트라디올의 B 고리의 C-6에서 특정한 변형을 가지며 C 고리의 C-13에서 메틸기가 결여된 13-데메틸 에스트라디올 유도체에 관한 것이다. 본 발명의 적어도 하나의 실시형태는 앞서 나타낸 화학식 I의 일반 구조를 갖는 이러한 화합물들에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 바람직한 화합물들은 아래의 화학식 Ia에 나타낸 일반 구조를 갖는다:
Figure 112013031687687-pct00004
이때, R2, R3, R4, X 및 Y는 화학식 I에 대해 앞서 정의된 바와 같다. 훨씬 더 바람직하게는, Y는 =O 및 -OH로부터 선택되고; R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며; R2는 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고; R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)mCOOCH3, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, -(CH2)m-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-N-(CH2)nCH3, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-NH2, -(CH2)m-S-NH2, -NH(CH2)mCH3, -NH(CH2)mOCH3, -NH(CH2)mCHOH-COOH, -(CH2)m(NH)CH2OH, -(CH2)mNHCOOH, -(CH2)mN(CH3)-SO2-NH3, 및 -(CH2)m-NH-SO2-NH2로부터 선택되고; m은 1 내지 20의 정수이며; n은 0 내지 8의 정수이고; ---- 부호는 단일 또는 이중 결합을 나타낸다. 훨씬 더 바람직하게는, Y는 (S)-OH이고; R4는 수소 또는 알킬로부터 선택되며; R2는 수소이고; R3는 수소이며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되고; m은 1 내지 12의 정수이며; n은 0 내지 4의 정수이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 화학식 Ib의 화학요법 화합물에 관한 것이다:
Figure 112013031687687-pct00005
이때, R1, R2, R3, R4 및 X는 화학식 I에 대해 앞서 정의된 바와 같다. 훨씬 더 바람직하게는, R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고; R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며; R2는 수소 및 할로로부터 선택되고; R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)mCOOCH3, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, -(CH2)m-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-N-(CH2)nCH3, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-NH2, -(CH2)m-S-NH2, -NH(CH2)mCH3, NH(CH2)mOCH3, -NH(CH2)mCHOH-COOH, -(CH2)m(NH)CH2OH, -(CH2)mNHCOOH, -(CH2)mN(CH3)-SO2-NH3, 및 -(CH2)m-NH-SO2-NH2로부터 선택되고; m은 1 내지 20의 정수이며; n은 0 내지 8의 정수이다. 훨씬 더 바람직하게는, R1은 수소이고; R4는 수소 또는 알킬로부터 선택되며; R2는 수소이고; R3는 수소이며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되고; m은 1 내지 12의 정수이며; n은 0 내지 4의 정수이고; C-17 하이드록실은 (S) 배열에 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 화학식 Ic의 화합물에 관한 것이다:
Figure 112013031687687-pct00006
이때, R11, R2, R3, R4 및 X는 화학식 I에 대해 앞서 정의된 바와 같다. 훨씬 더 바람직하게는, R11은 수소 또는 C1-C6 알킬이고; R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며; R2는 수소 및 할로로부터 선택되고; R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)mCOOCH3, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, -(CH2)m-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-N-(CH2)nCH3, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-NH2, -(CH2)m-S-NH2, -NH(CH2)mCH3, NH(CH2)mOCH3, -NH(CH2)mCHOH-COOH, -(CH2)m(NH)CH2OH, -(CH2)mNHCOOH, -(CH2)mN(CH3)-SO2-NH3, 및 -(CH2)m-NH-SO2-NH2로부터 선택되고; m은 1 내지 20의 정수이며; n은 0 내지 8의 정수이다. 훨씬 더 바람직하게는, R11은 수소이고; R4는 수소 또는 알킬로부터 선택되며; R2는 수소이고; R3은 수소이며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되고; m은 1 내지 12의 정수이며; n은 0 내지 4의 정수이고; C-17 하이드록실은 (S) 배열에 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 화학식 Id의 화합물에 관한 것이다:
Figure 112013031687687-pct00007
이때, R1, R2 및 X는 화학식 I에 대해 앞서 정의된 바와 같다. 훨씬 더 바람직하게는, R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고; R2는 수소 및 할로로부터 선택되며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)mCOOCH3, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, -(CH2)m-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-N-(CH2)nCH3, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-NH2, -(CH2)m-S-NH2, -NH(CH2)mCH3, NH(CH2)mOCH3, -NH(CH2)mCHOH-COOH, -(CH2)m(NH)CH2OH, -(CH2)mNHCOOH, -(CH2)mN(CH3)-SO2-NH3, 및 -(CH2)m-NH-SO2-NH2로부터 선택되고; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되며; m은 1 내지 20의 정수이며; n은 0 내지 8의 정수이다. 훨씬 더 바람직하게는, R1, R2, R3 및 R4는 수소이며; m은 1 내지 12의 정수이고; n은 0 내지 4의 정수이며; C-17 하이드록실은 (S) 배열에 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 화학식 Ie의 화합물에 관한 것이다:
Figure 112013031687687-pct00008
이때, m, n, R1, R2, R3 및 R4는 화학식 I에 대해 앞서 정의된 바와 같으며, Z는 -O-, -S-, 및 -NH-로부터 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, m은 1 내지 12이고, n은 0 내지 4이며, R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고; R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며; R2는 수소 및 할로로부터 선택되고; R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며; Z는 -O- 및 -S-로부터 선택되고; C-17 하이드록실은 (S) 배열에 있다.
본 발명의 또 다른 실시예는 화학식 If의 화합물에 관한 것이다:
Figure 112013031687687-pct00009
이때, R1, R2, R3, R4 및 X는 화학식 I에 대해 앞서 정의된 바와 같다. 훨씬 더 바람직하게는, R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고; R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며; R2는 수소 및 할로로부터 선택되고; R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)mCOOCH3, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, -(CH2)m-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알케닐-N-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-O-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-S-(CH2)nCH3, -C2-C8 알키닐-N-(CH2)nCH3, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-O-NH2, -(CH2)m-S-NH2, -NH(CH2)mCH3, NH(CH2)mOCH3, -NH(CH2)mCHOH-COOH, -(CH2)m(NH)CH2OH, -(CH2)mNHCOOH, -(CH2)mN(CH3)-SO2-NH3, 및 -(CH2)m-NH-SO2-NH2로부터 선택되고; X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3으로부터 선택되며; m은 1 내지 20의 정수이고; n은 0 내지 8의 정수이다. 훨씬 더 바람직하게는, R1, R2, R3 및 R4는 수소이고; m은 1 내지 12의 정수이며; n은 0 내지 4의 정수이다.
본 발명의 구현 화합물들은 약학적 조성물에서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 앞서 설명되거나, 아래에서 예시되거나, 또는 본 명세서에서 다른 방식으로 추론되는 것들로부터 선택된 1 이상의 화합물들 및 그 조합들을 포함할 수 있다. 소정 실시예들에서, 이러한 조성물은 약학적으로 수용가능한 담체 성분(carrier component)을 포함할 수 있다. 제한 없이, 이러한 조성물은 화합물들의 라세미 혼합물을 포함할 수 있다. 소정 실시예들에서, 이러한 화합물은 S 및 R 거울상이성질체로서, 바람직하게는 다른 이성질체들이 실질적으로 없는 이들의 분리 및 정제된 형태로서 존재할 수 있으며, R5 또는 R7은 H, C1 내지 C6 알킬 또는 치환된 알킬, 및 할로겐으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 화합물들은 비대칭 중심을 가질 수 있고, 라세메이트, 라세미 혼합물로서, 또는 개개의 정제된 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체로 발생할 수 있으며, 예를 들어 (ChemDraw Ultra, Version 12.0 또는 유사물을 통해 명명되는) (8S,9S,14S,17S)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 2); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(메톡시메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 1); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(6-메톡시헥실)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 3); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(하이드록시메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 4); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-((아미노옥시)메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 5); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(((메톡시메틸)아미노)메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올; 메틸(((6R,8S,9S,14S,17S)-3,17-디하이드록시-13-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-일)메틸)카르바메이트 (화합물 6); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-메톡시-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 7); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(2-메톡시에틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 8); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(4-메톡시부틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 9); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(8-메톡시옥틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 10); (6R,8S,9S,14S,17S)-3-하이드록시-6-(메톡시메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-17-일 스테아레이트 (화합물 11); (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(4-프로폭시부틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (화합물 12); 및 (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(5-에톡시펜틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올이 있다.
본 발명의 일 실시예는 6 치환된 에스트라디올의 R 또는 S 거울상이성질체, 및/또는 R 또는 S 부분입체이성질체의 제조에 관련된다. 이러한 이성질체 형태의 제조(예를 들어, 비대칭 합성) 및 분리(예를 들어, 분별 결정 및 크로마토그래피 수단)를 위한 방법들은 당업계에 일반적으로 알려져 있거나, 본 명세서에 개시된 방법들을 채택함으로써 쉽게 얻어진다. 이러한 방법들은, 예를 들어 미국 특허 7,846,918에 개시되어 있으며, 그 기술내용이 본 명세서에 전부 인용 참조된다.
본 발명의 화합물들은 아래의 반응식들에 나타낸 바와 같은 다음의 방법들에 의해 합성될 수 있다. 데메틸에스트라디올 유도체(1)는 17-온(one) 화합물(C)을 통해 제조되며, 이는 옥심(E)으로 전환된다. E의 d 고리는 순차적으로 개방되어 메틸렌 프로판니트릴(F)을 생성한다. 그 후, 에폭시드(G)가 생성된 다음, 고리 d의 재형성(reformation)이 후속되며, 화합물(H)을 제공한다. 그 후, H가 환원되어 화합물 1을 생성한다.
Figure 112013031687687-pct00010
아래에, 에스트라디올 유도체를 제조하는 반응식, 반응식 2 내지 4가 주어진다. 이러한 방법들은 LIDAKOR/THF/포름알데히드와 에스트라디올의 t-부틸디메틸실릴 유도체의 반응을 포함하여, 6-하이드록실화된 화합물을 얻을 수 있으며, 이어서 (ⅰ) 가수분해하여 에스트라디올의 6-하이드록시메틸 유도체를 얻는 단계; 및/또는 (ⅱ) 디메틸설페이트로의 처리 후 가수분해하여 에스트라디올의 6-메틸옥시메틸 유도체를 얻는 단계와 같은 단계들이 후속된다.
대안적인 접근법에서, 에스트라디올 화합물들은: (ⅰ) 에스트라디올 화합물을 보호하는 단계, (ⅱ) LIDAKOR/부틸-리튬/디이소프로필아민/포타슘 3차-아밀레이트를 이용하여 벤질의 6번 위치에서 보호된 에스트라디올 화합물을 아실화하는 단계, (ⅲ) 6번 위치의 알데히드를 리튬 알루미늄 하이드라이드로 환원시키는 단계, (ⅳ) 에스트라디올 화합물의 보호된 영역들을 탈보호하는(deprotect) 단계와 같은 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조될 수도 있다. 에스트라디올 유도체를 제조하는 반응식은 아래의 반응식 2에 주어진다.
Figure 112013031687687-pct00011
Figure 112013031687687-pct00012
본 발명에 따른 다양한 알킬옥시알킬 유도체는 알킬화제의 선택을 수반한다. 이러한 유도체는 본 발명을 잘 아는 당업자가 이해할 수 있을 것이며, 본 명세서에 설명된 종류의 합성 절차들을 통해 이용가능할 수 있다. 따라서, 제한 없이 다양한 C1 내지 C6 알킬 및 치환된 알킬 시약들이 대응하는 알킬옥시알킬 유도체를 제조하기 위해 본 명세서에 설명된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 에스트라디올의 6-아미노 유도체를 제조하는 방법들이 아래의 반응식에 개시된다. 따라서, 반응식 2 및 3에 설명된 6-메톡실화된 에스트라디올이 이용되고, 그 각각의 아미노 유도체로 전환된다.
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사용 방법
본 발명은 포유류 대상(예를 들어, 사람 환자)의 통증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에서, 상기 대상은 Ia 내지 If를 포함하는 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염 또는 수화물로 치료된다.
본 발명의 적어도 다른 실시형태에서, Ia 내지 If를 포함하는 화학식 I를 갖는 화합물들의 유효량들이 이러한 요법을 필요로 하는 환자들에게 투여된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물들은 앞서 언급된 수용체들 중 하나에만 특정하게 결합한다. 예를 들어, 화학식 I 및 Ia 내지 If의 화합물들은 특정 에스트로겐 수용체의 특정 효능제 및/또는 길항제로서 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 화합물들은 구체적으로 ERβ 효능제로서 사용될 수 있다. 이와 같이, 상기 화합물들은, 예를 들어 통증, 면역 장애 또는 염증과 같이, ERβ에 의해 영향을 받는 질병을 치료하거나 예방하는 방법에 사용될 수도 있다.
또한, 통증의 치료를 위한 본 발명의 화합물들의 투여는 다른 보조 통증 치료들과 조합하여, Ia 내지 If를 포함하는 화학식 I의 화합물의 투여를 포함할 수 있다. ERβ 효능제의 사용을 통한 통증의 조절은, Spooner, M.F. 외, Neuroscience 150, 675-680(2007); Piu, F. 외, European Journal of Pharmacology 590, 423-429(2008); Piu, F. 외, European Journal of Pharmacology 592, 158-159(2008)에 의해 입증된 바와 같이 자세히 개시되어 있으며, 이 모두는 본 명세서에서 전문이 인용 참조된다.
또한, 본 발명의 화합물들은, 예를 들어 후보 숙주가 당해 화합물로의 치료로부터 이점을 얻을 가능성이 있는지를 결정하기 위해 생체 외 분석의 일부로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 여하한의 활성 화합물은 다른 활성 화합물, 다른 항증식제, 다른 항염증제 등을 확인하기 위해, 예를 들어 분석의 표준으로서 사용될 수 있다.
적어도 본 발명의 일 실시형태에서, 후보 화합물들은 그 에스트로겐 수용체 길항제 활성도에 대해 평가된다. 화합물이 에스트로겐 수용체 길항제인지에 대한 평가는 당업계에 알려진 다양한 방법들에 의해 수행될 수 있다. 본 출원에서, 이러한 능력은 본 명세서에 설명된 스크리닝 방법(screening method)에 따라 루시페라아제 결합 분석을 실시함으로써 결정된다.
본 발명의 이 실시형태의 또 다른 실시예에서, 에스트로겐 수용체 결합 능력은 ERE-tk-루시페라아제 리포터 구성물(reporter construct)을 추가하여 ER(α) 또는 ER(β)의 발현 구성물(expression contruct)들과 CV-1 세포들을 일시적으로 형질감염시킴으로써 평가된다. 그 후, 상기 세포들은 대조군 및 후보군으로 나뉘며, 이때 대조군은 치료를 받지 않거나 에스트라디올(1 nM)로만 처리되고, 후보군은 다양한 농도로 본 발명의 화합물을 추가한 에스트라디올을 수용한다. 16 내지 24 시간 후 세포들이 채취되고, 상업적으로 이용가능한 분석 키트를 사용하여 루시페라아제의 활성도를 측정한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 후보 화합물들의 ½(half) 최대 억제 농도 또는 IC50은 생체 내 사용에 대한 약물 효능 및 잠재적인 약주입방식을 평가하기 위해 결정된다. 당업자라면, 통상적으로 알려진 방법들을 이용하여 이러한 정보를 쉽게 알아낼 수 있다. 당업계에서 잘 설명되었던 바와 같이, IC50은 어떠한 생물학적 과정을 50 %까지 억제하는데 얼마나 많은 특정 물질/분자가 필요한지를 나타내고 측정한다. 이러한 경우, 후보 화합물들의 IC50은 매개체 대조군 세포(vehicle control cells)에 비해 50 %의 반응을 유도하는 농도로서 결정된다.
본 명세서에 명시되는 바와 같이, 본 발명의 화합물들의 염은 비-독성의 "약학적으로 수용가능한 염"을 칭한다. 하지만, 다른 염들이 본 발명에 따른 화합물들 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염의 제조에 유용할 수 있다. 본 발명의 화합물들이 염기성 기(basic group)를 포함하는 경우, "약학적으로 수용가능한 염"의 용어에 포함되는 염들은 유리 염기를 적절한 유기산 또는 무기산과 반응시킴으로써 일반적으로 제조되는 비-독성 염들을 칭한다. 대표적인 염들은 당업계에 알려져 있는 여하한의 이러한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물들이 산성 잔기를 가지는 경우, 이의 적절한 약학적으로 수용가능한 염은 알칼리 금속 염, 예를 들어 소듐 또는 포타슘 염; 알칼리 토금속 염, 예를 들어 칼슘 또는 마그네슘 염; 및 적절한 유기 리간드로 형성된 염, 예를 들어 4차 암모늄 염을 포함할 수 있다.
사람 환자와 같은 포유류 대상을 치료하기 위해, 본 발명의 1 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염의 유효량이 통증을 갖는 포유류 대상에 투여된다. 효과적인 투약 형태, 투여 방식 및 투약량(dosage amount)은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정들은 당업계의 기술 내에 있다. 당업계의 내과의, 수의사 또는 임상의라면, 사용된 특정 화합물의 활성도, 통증의 세기, 투여 경로, 화합물의 배출 속도, 환자의 신장 및 간 기능, 치료의 기간, 대상에 투여되는 여하한의 다른 약물의 본성(identity), 나이, 체격 및 의학 분야에 잘 알려져 있는 유사 인자에 따라 투약량이 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 발명의 화합물들은 정제, 캡슐[그 각각은 지속 방출(sustained release) 또는 시간조절 방출(timed release) 제제를 포함함], 알약, 분말, 미크론화된 조성물(micronized composition), 과립, 엘릭시르, 팅크, 현탁액, 시럽 및 유탁액과 같은 경구용 투약 형태로 투여될 수 있다. 또한, 이들은 정맥주사[볼루스(bolus) 또는 인퓨전(infusion)], 복강내, 국소적(예를 들어, 안구 점안액), 피하, 근육내 또는 경피성(예를 들어, 패치) 형태로, 약학 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 형태들을 모두 이용하여 투여될 수도 있다. 또한, 당업계의 내과의, 수의사 또는 임상의는 질환의 진행을 방지, 상쇄 또는 정지시키는데 필요한 약물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다.
지시된 효과를 위해 사용되는 경우, 본 발명의 경구 투약은 하루에 체중 kg당 약 0.01 mg(mg/kg/일) 내지 약 100 mg/kg/일, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg/일, 및 가장 바람직하게는 0.1 내지 5.0 mg/kg/일의 범위일 것이다. 경구 투여에 대해, 조성물들은 바람직하게는 치료받는 환자의 질환에 따른 투약 조절을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100 및 500 mg의 활성 성분을 함유하는 정제의 형태로 제공된다. 약제는 통상적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분, 바람직하게는 약 1 mg 내지 약 100 mg의 활성 성분을 함유한다. 정맥주사로 가장 바람직한 용량은 일정 속도의 인퓨전 시 약 0.1 내지 약 10 mg/kg/분의 범위일 것이다. 본 발명의 화합물들은 하루 한 번의 용량으로 투여될 수 있으며, 또는 하루 총 투약이 하루에 두 번, 세 번, 또는 네 번의 분할량으로 투여될 수 있다.
본 명세서에 명시된 바와 같이, 본 발명의 화합물들은 포유류 대상의 치료 방식을 개선할 다른 통증 완화제 또는 다른 약제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합물의 개별 성분들은 치료 과정 중에 다른 시간에 별도로 투여되거나, 이러한 치료가 필요한 환자 또는 이러한 환자의 부위에 분할 또는 단일 조합물 형태로 동시에 투여될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 이러한 모든 동시 또는 교차 치료를 포괄하는 것으로 이해되어야 하며, "투여"라는 용어는 이에 따라 해석되어야 한다. 표적화된 암 질환을 치료하는데 유용한 다른 약제와 본 발명의 화합물의 조합 범위는 원칙적으로 에스트로겐 기능에 관련된 장애를 치료하는데 유용한 여하한의 약학적 조성물과의 여하한의 조합을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
프로드러그의 형태로 활성 화합물을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "프로드러그"라는 용어는 대사 작용시 원하는 활성 화합물을 수득하거나 그 자체가 활성 화합물인 화합물에 관련된다. 이는, 예를 들어 3, 6, 10 또는 17번 위치와 같은 적절한 위치들에 인산 에스테르 잔기를 첨가하는 것을 포함한다. 전형적으로, 프로드러그는 활성 화합물보다 덜 활성이거나 불활성이지만, 유리한 취급, 투여, 또는 물질대사 특성들을 제공할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 프로드러그는 활성 화합물의 에테르이고; 물질대사 시 에테르기는 활성 약물을 수득하기 위해 쪼개진다. 또한, 몇몇 프로드러그는 활성 화합물, 또는 추가적인 화학 반응 시 활성 화합물을 생성하는 화합물을 수득하기 위해 효소로 활성화된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 본 발명의 치료 방법들에서, "투여"라는 용어는 구체적으로 개시된 화합물, 또는 구체적으로 개시되지는 않지만 환자에게 투여 후 생체 내에서 특정 화합물로 전환되는 화합물로 설명된 다양한 질환들을 치료하는 것을 포함할 것이다. 이러한 화합물들의 대사산물은 본 발명의 화합물을 포유류 대상에 도입할 때 생성되는 활성종을 포함한다.
어떠한 이론에도 구속되지 않고, 에스트라디올이 C17-OH(His 524를 통해); 및 C3-OH(Arg 394 및 Glu 353을 통해)를 통해 에스트로겐 수용체들(ERα 및 ERβ)의 수용체 리간드 포켓에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 에스트라디올과 마찬가지로, 예를 들어 유사한 아미노산 결합을 통해, ERα 및 ERβ, 그리고 바람직하게는 ERβ만의 동일한 리간드 포켓에서 화합물 1 디올의 결합이 발생할 수 있다. 추가적으로, 화합물 1의 C-6 탄소에서 알콕시알킬 치환기의 존재는 정상의 리간드-결합된 수용체의 형태를 변화시켜, 관찰된 항종양 활성을 설명하는 수정된 활성을 유도할 수 있다.
조성물
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조성물"이라는 용어는 특정 양의 특정 성분들을 포함한 생성물뿐만 아니라, 특정 양의 특정 성분들의 조합으로부터 직접 또는 간접적으로 유도되는 여하한의 생성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 약학적 제제들은 입, 코, 국부[볼(buccal) 및 혀밑], 직장, 질 및/또는 비경구적 투여에 적절한 것들을 포함한다. 선택된 투여 경로에 관계없이, 활성 성분(들)은 당업자에게 알려진 종래의 방법들에 의해 약학적으로 수용가능한 투약 형태로 제제화된다.
단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 재료와 조합될 활성 성분(들)의 양은 치료되는 숙주, 특정 투여 방식, 및 앞서 설명된 모든 다른 인자들에 따라 달라질 것이다. 단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 재료와 조합될 활성 성분(들)의 양은, 일반적으로 치료 효과를 산출하기에 유효한 최저량인 활성 성분(들)의 양일 것이다.
약학적 제제 또는 조성물을 제조하는 방법들은 활성 성분(들)을 담체, 및 선택적으로 1 이상의 부 성분과 회합(association)하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분(들)을 액체 담체, 또는 미분된(finely divided) 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 회합한 후, 필요에 따라 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적절한 본 발명의 제제는 캡슐, 카세(cachet), 알약, 정제, 로젠지(lozenge)(향이 나는 주성분, 통상적으로 자당 및 아카시아 또는 트래거캔스를 사용함), 분말, 과립의 형태일 수 있으며, 또는 수성 또는 비수성 액체인 용액 또는 현탁액, 또는 수중유(oil-in-water)형 또는 유중수(water-in-oil)형 액체 유탁액, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 파스틸(pastille)(젤라틴 및 글리세린, 또는 자당 및 아카시아와 같은 불활성 베이스를 사용함), 및/또는 구강 세정제 등일 수 있고, 이는 각각 사전설정된 양의 활성 성분(들)을 함유한다. 또한, 활성 성분(들)은 볼루스, 연약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 본 발명의 고체 투약 형태(캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 프로드러그(들), 활성 성분(들)(미크론화된 형태)은 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 1 이상의 약학적으로 수용가능한 담체, 및/또는 다음 중 어느 것과 혼합된다: (1) 녹말, 젖당, 자당, 포도당, 만니톨, 및/또는 규산과 같은 충전제 또는 증량제; (2) 예를 들어, 카르복시메틸-셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 자당 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 한천, 칼슘 카르보네이트, 감자 또는 타피오카 녹말, 알긴산, 소정 실리케이트, 및 소듐 카르보네이트와 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용액 완염제; (6) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트 클레이와 같은 흡수제; (9) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 이의 혼합물과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약학적 조성물들은 완충제를 포함할 수도 있다. 또한, 유사한 타입의 고체 조성물들이 젖당 또는 유당, 그리고 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 이용하여 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐의 충전제로서 사용될 수 있다.
정제는 선택적으로 1 이상의 부 성분과의 압축 또는 몰딩(molding)에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들어, 소듐 녹말 글리콜레이트 또는 가교-결합된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스), 계면 활성제 또는 분산제를 이용하여 제조될 수 있다. 몰딩된 정제는 불활성 액체 희석제로 흡습(moisten)된 분말 활성 성분(들)의 혼합물을 적절한 기계에서 몰딩함으로써 제조될 수 있다.
정제, 및 본 발명의 약학적 조성물들의 다른 고체 투약 형태, 예를 들어 당의정, 캡슐, 알약 및 과립은 선택적으로 장용 코팅물 및 약학적 제제화 기술에서 잘 알려져 있는 다른 코팅물과 같은 코팅물 및 외피(shell)를 이용하여 제조되거나 스코어링(score)될 수 있다. 또한, 이들은 예를 들어 원하는 방출 프로파일을 제공하는 다양한 비율의 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 리포솜 및/또는 마이크로스페어를 이용하여, 그 안의 활성 성분(들)의 저속 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 이들은, 예를 들어 세균-보유 필터(bacterial-retaining fillter)를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 또한, 이 조성물들은 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 선택적으로 지연 방식으로 위장관의 소정 부위에서 활성 성분(들)만을, 또는 이를 우선적으로 방출시키는 조성물로 구성될 수 있다. 사용될 수 있는 매립(embedding) 조성물의 예시는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 또한, 활성 성분(들)은 마이크로캡슐 형태일 수 있다.
활성 성분(들)의 경구 투여를 위한 액체 투약 형태는 약학적으로 수용가능한 유탁액, 미세유탁액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분(들)에 추가로, 액체 투약 형태는 예를 들어 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸아세테이트, 부틸 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩기름, 옥수수기름, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 아밀 알코올, 테트라하이드로푸릴 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물들과 같이 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유할 수 있다.
또한, 불활성 희석제 외에 경구 조성물들은 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 착향제, 착색제, 방향제 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 활성 성분(들)에 추가로 현탁액은, 예를 들어 에톡실화 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 결정 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트래거캔스, 및 이의 혼합물들과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
직장 및 질 투여를 위한 본 발명의 약학적 조성물들의 제제는 좌약으로서 제시될 수 있으며, 이는 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 또는 살리실레이트를 포함한 1 이상의 적절한 비자극 부형제, 또는 담체와 활성 성분(들)을 혼합함으로써 제조될 수 있고, 실온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로, 직장 또는 질강(vaginal cavity)에서 용융되어 활성 성분(들)을 방출할 것이다. 또한, 질 투여에 적절한 본 발명의 제제는 당업계에서 적절한 것으로 알려져 있는 상기 담체를 함유한 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제제를 포함한다.
활성 성분(들)의 국소적 또는 경피성 투여를 위한 투약 형태는 분말 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분(들)은 멸균 조건 하에서 약학적으로 수용가능한 담체, 그리고 요구될 수 있는 여하한의 완충제 또는 분사제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 활성 성분(들)에 추가로, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 녹말, 트래거캔스, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 징크 옥사이드, 또는 이의 혼합물들과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이는 활성 성분(들)에 추가로, 젖당, 탈크, 규산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아마이드 분말, 또는 이 물질들의 혼합물들과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 스프레이는, 추가적으로 부탄 및 프로판과 같은 휘발성의 비치환된 탄화수소, 및 클로로플루오로 탄화수소와 같은 통상적인 분사제를 함유할 수 있다.
본 발명의 화합물들은 당업자에게 잘 알려진 경피성 피부 패치의 형태들을 이용하여, 경피 경로를 통하거나, 적절한 비강내 매개체의 국소적 사용을 통해 비강내 형태로 투여될 수 있다. 경피성 전달 시스템은 투약 방식(dosage regimen) 내내 지속적인 투여를 제공한다. 경피성 패치는 신체로 활성 성분(들)의 제어된 전달을 제공하는 추가 이점을 갖는다. 이러한 투약 형태는 탄성 중합체 매트릭스 재료와 같은 적절한 매질에 활성 성분(들)을 용해 또는 분산시키거나, 또는 다른 방식으로 첨가함으로써 제조될 수 있다. 또한, 흡수 증진제가 피부를 통한 활성 성분(들)의 플럭스(flux)를 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 플럭스의 속도는 속도-제어막을 제공하거나, 중합체 매트릭스 또는 겔에 활성 성분(들)을 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물들은 소 단일라멜라 소포(small unilamellar vesicle), 거대 단일라멜라 소포, 및 다중라멜라 소포와 같은 리포솜 전달 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 다양한 인지방질로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 화합물들에 대한 또 다른 전달 방식은, 화합물 분자가 커플링되는 개별적인 담체로서 단일클론 항체를 통한 전달일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물들은 표적가능한 약물 담체(targetable drug carriers)로서 가용성 중합체와 커플링될 수 있다. 이러한 중합체들은, 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필메타크릴아마이드-페놀, 폴리하이드록시-에틸아스파르트아미드-페놀, 또는 팔미토일 잔여기(palmitoyl residues)로 치환된 폴리에틸렌옥사이드-폴리라이신을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물들은 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르소에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교결합 또는 양친매성 블록 공중합체와 같은 약물의 제어된 방출을 달성하는데 유용한 생분해성 중합체 클래스(class)에 커플링될 수 있다.
비경구적 투여에 적절한 본 발명의 약학적 조성물들은 1 이상의 약학적으로 수용가능한 멸균 등장성 수용액 또는 비수용액, 현탁액 또는 유탁액, 또는 사용 직전에 멸균 주사액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합한 활성 성분(들)을 포함하며, 이는 항산화제, 완충제, 의도된 수용자(recipient)의 혈액으로 제제를 등장성으로 만드는 용질, 또는 현탁제나 증점제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물들에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예시는 물, 에탄올, (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은) 폴리올, 및 이의 적절한 혼합물들, 올리브 오일과 같은 식물성 유지, 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 재료의 사용, 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동도가 유지될 수 있다.
또한, 이 조성물들은 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 또한, 조성물들에 당, 소듐 클로라이드 등과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 지속적 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약제를 포함함으로써 유도될 수 있다.
몇몇 경우, 활성 성분(들)의 효과를 지속시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 수 용해도가 낮은 결정성 또는 비결정성 재료의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 활성 성분(들)의 흡수 속도는 그 용해 속도에 의존하며, 따라서 이는 결정체 크기 및 결정 형태에 의존할 수 있다. 대안적으로, 비경구적으로 투여된 활성 성분(들)의 지연된 흡수는 오일 매개체에 활성 성분(들)을 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다.
주사가능한 데포(depot) 형태는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체에 활성 성분(들)의 마이크로캡슐화 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 중합체에 대한 활성 성분(들)의 비율 및 사용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 활성 성분(들)의 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예시는 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(안하이드라이드)를 포함한다. 또한, 주사가능한 데포 제제는 신체 조직과 융화되는 미세유탁액 또는 리포솜에 활성 성분(들)을 포괄시킴으로써 제조된다. 주사가능한 재료들은, 예를 들어 세균-보유 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다.
바람직하게는, 주사가능한 투약의 형태로 전달된 조성물은 생체융화성 중합체, 본 명세서에 개시된 화합물들의 융화성 형태, 및 생체융화성 중합체를 가용화하는 생체융화성 용매를 포함하고, 이때 생체융화성 중합체, 상기 화합물 및 생체융화성 용매의 중량%는 완전한 조성물의 총 중량에 기초하며; 또한, 상기 중합체의 충분한 양이 상기 조성물에 사용되어, 맥관 부위로의 전달 시 중합체가 종양 성장을 중단시키기에 충분한 용량으로 활성 화합물의 방출을 촉발(precipitate) 및 허용할 수 있다.
이 실시예의 또 다른 실시형태는 상기 조성물의 적절한 점도에 대해, 바람직하게는 40 ℃에서 약 10 내지 200 cSt의 범위에서 관찰될 것이다.
더 바람직하게는, 상기 조성물은 약 1 내지 95 중량%의 농도의 생체융화성 중합체, 약 5 내지 약 75 중량%의 농도의 활성 화합물, 및 약 5 내지 약 95 중량%의 생체융화성 용매를 포함하며, 이때 모든 성분의 중량%는 완전한 조성물의 총 중량에 기초하고, 또한 조성물은 40℃에서 적어도 10 내지 약 200, 더 바람직하게는 적어도 약 200 cSt의 점도를 갖는다.
생분해성 중합체들이 당업계에 개시되어 있다. 예를 들어, Dunn 외의 미국 특허 4,938,663은 다음과 같은 생분해성 중합체의 예시들을 개시한다: 선형-사슬 중합체, 예를 들어 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리아마이드, 폴리우레탄, 폴리에스테르아마이드, 폴리오르소에스테르, 폴리디옥사논, 폴리아세탈, 폴리케탈, 폴리카르보네이트, 폴리오르소카르보네이트, 폴리포스파젠, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리하이드록시발레르에이트, 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리알킬렌 석시네이트, 폴리(말산), 폴리(아미노산), 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리하이드록시셀룰로스, 키틴, 키토산, 그리고 이의 공중합체, 삼원중합체 및 조합물들. 다른 생분해성 중합체들은, 예를 들어 젤라틴, 콜라겐 등을 포함한다.
적절한 비-생분해성 생체융화성 중합체들은, 예를 들어 셀룰로스 아세테이트, 에틸렌 비닐 알코올 공중합체, 하이드로겔(예를 들어, 아크릴계), 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 니트로셀룰로스, 우레탄/카르보네이트의 공중합체, 스티렌/말레산의 공중합체, 및 이의 혼합물들을 포함한다.
바람직한 생체융화성 중합체들은 아크릴 중합체, 셀룰로스 디아세테이트 및 에틸렌 비닐 알코올 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 키토산, 콜라겐 및 젤라틴을 포함할 수 있다. 이러한 중합체들은 상업적으로 이용가능하거나, 또는 당업계에 인지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 겔투과 크로마토그래피조성에 의해 결정된 수 평균 분자량은 약 5,000 내지 약 200,000, 더 바람직하게는 약 25,000 내지 약 180,000, 훨씬 더 바람직하게는 약 50,000 내지 100,000이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 해당 국소 부위의 임상 진행을 관찰하고 모니터링하기 위해 조성물 내에 생체융화성 조영제를 이용하는 것이다. 이 조영제들은 수용성 조영제 및 불수용성 조영제를 포함한다. 바람직하게는, 불수용성 조영제는 바륨 설페이트, 탄탈륨 분말 및 탄탈륨 옥사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생체융화성 재료이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 생체융화성 용매는 물, 디메틸설폭사이드(DMSO), 에탄올, 에틸 락테이트 또는 아세톤이다.
제제들은 1회-용량 또는 다회-용량 밀폐 용기들, 예를 들어 앰플 및 바이얼(vial)에 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사액 및 현탁액은 앞서 설명된 타입의 멸균 분말, 과립, 나노입자 및 정제로부터 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물들은 다음 용도로 적합해진 제제들을 포함한 수의학적 제제의 형태로 사용될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어 드렌치(drench)(수용액 또는 비수용액, 또는 현탁액), 정제, 볼루스, 분말, 공급 재료(feed stuff)와의 혼합을 위한 과립 또는 펠릿(pellet), 혀에 적용하기 위한 페이스트; (2) 비경구 투여, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액으로서 피하, 근육내 또는 정맥 주사에 의한, 또는 적절하다면 현탁액 또는 용액이 동물의 유두를 통해 그 유방으로 도입되는 유방내 주사에 의한 앰플; (3) 국소 적용, 예를 들어 피부에 도포되는 크림, 연고 또는 스프레이; 또는 (4) 질내 적용, 예를 들어 페서리, 크림 또는 폼, 또는 해당 부위로의 투여를 위해 당업자에 의해 적합화된 여하한의 다른 방법들.
본 발명은 몇몇 실시예들에 대하여 설명되었지만, 당업자라면 본 발명이 제한이 아닌 예시를 위해 제시되었던 설명된 실시예들과 다르게 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 첨부된 청구항들의 범위는 본 명세서에 포함된 실시예들의 설명으로 제한되어서는 안 된다.
Ia 내지 If를 포함하는 화학식 I에 예시된 화합물들의 제조를 위한 반응식들에 주어진 일반적인 방법들은 다음의 예시들에 의해 더 나타내어진다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 출발 재료 및 시약은 표준 상용 등급(standard commercial grade)으로 이루어지고, 추가 정제 없이 사용되거나, 통상적인 방법에 의해 이러한 재료들로부터 쉽게 제조된다. 유기 합성 분야의 당업자라면, 출발 재료 및 반응 조건이 원하는 최종 생성물을 달성하도록 달라질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 모든 화합물들은 ChemBioDraw Ultra 11.0 또는 12.0을 이용하여, 또는 유사한 버전을 이용하여 명명된다.
예시 1
6-하이드록시메틸-안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온을 제조하는 방법.
반응 시스템에서, 충분한 양의 (+)안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온 (ADD), 12.2 당량의 피롤리딘, 촉매 아세트산, 변성 에탄올(95/5 에탄올/메탄올) 및 6-7 % 테트라하이드로푸란 (THF)을 30 내지 40 ℃로 최소 16 시간 동안 가열하여, 1,3-디피롤리디노안드로스타-3,5-디엔-17-온을 형성한다. 일단 ADD 함유량이 HPLC 영역의 3 % 미만에 도달하거나, 정지상태가 되거나 또는 결과적인 디피롤리디노안드로스타디엔이 ADD로 되돌아가기 시작하면, 반응 혼합물을 5 ± 5 ℃로 냉각한다. 그 후, 결과적인 화합물을 수집하고, 차가운 변성 에탄올로 세척한다. 수율은 전형적으로 건조 기준으로 70 내지 80 %이고, 순도는 전형적으로 HPLC 영역 백분율로 90 내지 95 %이다.
그 후, 결과적인 1,3-디피롤리디노안드로스타-3,5-디엔-17-온을 실온에서 10 ml 디클로로메탄/g의 2.6 당량의 포르말린(포름알데히드)과 1 당량을 혼합한다. 그 후, 반응 혼합물을 2 % 황산 용액으로 약 2의 pH로 산성화한다. 따라서, 유기층이 형성되고, 이를 2 % 황산 및 1:1 물/식염수로 세척한다. 그 후, 톨루엔으로의 용매 교환(약 10 ml/g)이 수행되며, 이때 톨루엔 교환이 일어남에 따라 생성물이 결정화된다. 상기 생성물을 수집하고 세척 및 건조하여, 6-하이드록시메틸-안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온이 제공된다. 당업자라면, 필요에 따라 당업계에 알려진 기술을 사용함으로써, 6번 위치에서 입체화학을 더 변경시킬 수 있다.
예시 2
화합물 B 및 B'를 제조하는 방법.
반응식 2에 나타낸 바와 같이, 에스트라디올 화합물 B 및 B'를 다음의 방식으로 합성한다. 보호된 에스트라디올은 톨루엔설폰산 또는 캄포르설폰산을 촉매로 이용하여, THF에서 디하이드로피란과 β-에스트라디올을 반응시킴으로써 제조된다. 당업자라면, 이 반응이 평형반응이고, 이러한 조건 하에서 완료되지 않을 것이라는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이에 따라, 단일-보호된(mono-protected) 에스트라디올은 둘 다 반응 혼합물에서 발견될 수 있다. 이러한 미정제 반응 혼합물은 아세토니트릴로의 분쇄(trituration) 단계를 거쳐, 원하는 비스-THP 에스트라디올을 약 70 % 수율로 결정화하게 한다.
반응식 2에 나타낸 바와 같이, 중간 알데히드는 LiDAKOR라고 칭해지는 강염기 혼합물: 부틸 리튬, 디이소프로필아민, 및 포타슘 3차-아밀레이트로 벤질의 6번 위치에서 아실화하여 얻어진다. 당업자라면, - 70 ℃의 조건 하에서 벤질 위치에서의 프로톤의 제거(abstraction)를 이해할 수 있을 것이다. 그 후, 중간 알데히드를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 약 50 % 수율의 시럽이 제공된다. 과량의 리튬 알루미늄 하이드라이드로의 알데히드의 환원은 유리폼(glassy foam)으로서 높은 수율의 라세미 하이드록시메틸 에스트라디올 화합물을 유도한다.
화합물 B 및 B'를 제조하기 위해, 소듐 하이드라이드 및 메틸 아이오다이드로 라세미 하이드록시메틸 에스트라디올 화합물을 메틸화함으로써, 메톡시메틸 중간 화합물이 제조된다. 메톡시메틸 중간체가 칼럼 크로마토그래피로 정제되어, 유리폼을 제공한다. 보호기의 탈보호는 탈보호된 라세미 6-메톡시메틸 에스트라디올을 제공한다. 키랄 제조용 HPLC를 이용하여 거울상이성질체의 분리가 수행되어, 화합물 B 및 B'를 제공한다. 화합물 B'에 대해, >95:5 R:S인 키랄 순도가 실현된다. 화합물 B'에 대해, 86:14 S:R의 키랄 순도가 실현된다. 6번 위치의 절대적 입체화학을 결정하기 위해 NMR을 사용하는 것은 당업계의 기술 수준에서 충분하며, 이 경우 4- 및 6-프로톤은 진단적이다.
예시 3
화합물 D 및 E을 제조하는 방법.
예시 2에서 설명된 것과 동일한 방법들을 이용하여, 라세미 하이드록시메틸 에스트라디올 화합물을 합성한다. 그 후, 이 화합물의 탈보호가 메탄올에서 촉매 염화수소로 달성되며, 결과적인 라세미 트리올은 키랄 제조용 HPLC에서 분리되어, 하나는 화합물 D가 풍부하고 다른 하나는 화합물 E가 풍부한 두 부분을 제공한다. 각각의 화합물에 대해, >95:5 R:S 및 S:R의 키랄 순도가 각각 실현된다. 6번 위치의 절대적 입체화학은 NMR에 의해 확립되며, 이 경우 4- 및 6-프로톤은 진단적이다.
예시 4
(6R,8R,9S,10R,13S,14S,17S)-17-하이드록시-6-(메톡시메틸)-10,13-디메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온 (A) - 상업적으로 이용가능한 (6R,8R,9S,10R,13S,14S)-6-(메톡시메틸)-10,13-디메틸-7,8,9,10,11,12,13,14,15,16-데카하이드로-3H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17(6H)-디온(200g, 0.608 mol)을 5 L 3구 플라스크에 놓고, 에탄올(1.3 L) 및 물(400 ml)로 용해한다. 결과적인 혼합물을 얼음수조에서 ~0 ℃로 냉각한다. 그 후, NaBH4 용액(40 % NaOH에서 12 중량%, 42.5 ml, 0.182 mol)을 한 방울씩 첨가하여, 5 ℃ 이하의 온도를 유지한다. 결과적인 혼합물을 <10 ℃에서 2 시간 동안 교반한다. ~95 % 전환 + ~5 % 과환원을 나타내는 LC-MS에 의해 반응 혼합물이 검사된다. 그 다음, 반응 혼합물을 물(400 ml)로 급랭하고, 6 N aq. HCl 용액을 첨가하여 pH를 pH 3 내지 4로 조정한다. 후속하여, 상기 혼합물을 3 L 둥근 바닥 플라스크로 옮겨, 감소된 압력 하에서 휘발성분들을 제거한다. 잔여 수성 혼합물을 TBME(3 x 500 ml)로 추출한다. 조합된 유기 층들을 sat. aq. NaHCO3(1 L), 물(1 L) 및 식염수(1 L)로 세척한다. 마지막으로, 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키며, 감소된 압력 하에서 농축시켜, 담황색의 고체로서 디엔온 A를 제공한다. (188 g, cy 94 %). 1HNMR 및 HPLC-MS를 통해 생성물이 확인된다. ~95 % + ~5 % 과환원.
예시 5
(6R,8R,9S,13S,14S)-6-(6-메톡시헥실)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (I)
a) (8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌 - 클로로메틸 메틸 에테르(7.0 mL, 92.0 mmol)를 β-에스트라디올(5 g, 18.4 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(16.0 mL, 92 mmol)의 100 mL의 THF 용액에 첨가한다. 반응 혼합물을 환류로 가열하고, 18 시간 동안 교반한다. THF를 진공 내에서 제거하고, 황색/갈색 오일을 물과 CH2Cl2 사이로 나눈다. 유기층을 분리하고, 식염수로 세척하며, 진공 내에서 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 금색 오일이 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(10 % EtOAc/Hex)에 의한 정제가 점성이 있는 투명한 오일(5.7 g, 86 %)로서 표제 화합물(title compound)을 제공한다.
b) (8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-올 - 아르곤 하에서 -78 ℃로 냉각된 포타슘 3차-부톡사이드(8.87 g, 79.0 mmol) 및 디이소프로필아민(11.2 mL, 79.0 mmol)의 80 mL의 무수 THF 용액에 n-부틸리튬(헥산에서 1.6 M, 49.4 mL, 79.0 mmol)을 한 방울씩 첨가한다. 반응 혼합물을 -78 ℃에서 30 내지 45 분 동안 교반한다. 그 후, a)로부터의 화합물(5.7 g, 15.8 mmol)의 45 mL의 THF 용액을 한 방울씩 첨가하고, 반응 혼합물을 -78 ℃에서 3 시간 동안 교반한다. a)로부터의 화합물을 첨가하는 동안, 반응물은 짙은 적색으로 바뀐다. 그 후, 트리메틸 보레이트(10.6 mL, 94.8 mmol)를 천천히 첨가하며, 혼합물을 0 ℃까지 따뜻하게 하고 2 시간 동안 교반한다. 그 후, 과산화수소(24 mL의 30% 수용액)를 첨가하며, 반응 혼합물을 실온까지 따뜻하게 하고 추가로 1 시간 동안 교반한다. 반응물을 다시 0 ℃로 냉각하고, 10 % Na2S2O3 수용액(70 ml)으로 조심스럽게 급랭한다. 결과적인 혼합물을 EtOAc(2x)로 추출하고, 조합된 유기 추출물을 진공 내에서 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 황색/갈색 오일이 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(25 % EtOAc/Hex)에 의한 정제가 백색 고체(3.5 g, 59 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
c) (8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-온 - 데스-마르틴(Dess-Martin) 퍼아이오디난(9.46 g, 22.3 mmol)을 b)로부터의 화합물(7.0 g, 18.6 mmol)의 300 mL의 CH2Cl2 용액에 나누어 첨가한다. 결과적인 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 혼합물을 물에 붓고, 층들을 분리한다. 수성 층을 CH2Cl2로 추출하고, 조합된 유기 추출물을 식염수로 세척하며, 진공 내에서 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 끈적거리는 갈색 고체가 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(15 % EtOAc/Hex)에 의한 정제가 점성이 있는 담황색 오일(6.0 g, 86%)로서 표제 화합물을 제공한다.
d) 에틸 2-(((8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-일리덴)아세테이트 - 트리에틸 포스포노아세테이트(4.1 mL, 20.8 mmol)를 실온에서 25 mL의 THF에서의 소듐 하이드라이드(832 mg, 20.8 mmol)의 혼합물에 첨가한다. 약 10 분 후, c)로부터의 화합물(3.9 g, 10.4 mmol)의 10 mL의 THF 용액을 한 방울씩 첨가한다. 결과적인 반응 혼합물을 밀봉관에서 72 시간 동안 환류로 가열한다. 상기 혼합물은 진공 내에서 농축되고, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5 % EtOAc/Hex 내지 40 % EtOAc/Hex의 구배)에 의해 정제되어, 점성이 있는 투명한 오일(3.4 g, 74 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
e) 2-((8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-일리덴)에탄올 - d)로부터의 화합물(3.1 g, 6.97 mmol)의 65 mL의 THF 용액을 0 ℃에서 리튬 알루미늄 하이드라이드(THF에서 2 M, 5.2 mL, 10.46 mmol)로 한 방울씩 처리한다. 냉각조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반한다. 상기 반응물을 다시 0 ℃로 냉각하고, 1.3 mL의 물, 2.6 mL의 2N NaOH, 및 1.3 mL의 물을 차례로 조심스럽게 첨가하여 급랭한다. 백색 고체를 형성할 때까지, 상기 혼합물을 힘차게 교반한다. 상기 혼합물을 여과시키고, 여과물을 진공 내에서 농축하여, 투명한 오일(2.8 g, 99 %)로서 표제 화합물이 제공된다.
f) 2-((6S,8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-일)아세트알데히드 - 100 mL의 에틸 아세테이트에서의 10 % Pd/C(500 mg) 및 e)로부터의 화합물(3.09 g, 7.68 mmol)의 혼합물을 40 psi의 H2(g) 하에 실온에서 5 시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 셀라이트는 에틸 아세테이트로 잘 세척한다. 상기 여과물을 진공 하에서 농축하여, 담황색 오일(3.1 g)이 제공된다. 상기 오일을 100 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 데스-마르틴 퍼아이오디난(3.9 g, 9.22 mmol)을 나누어 첨가한다. 결과적인 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반한다. 상기 혼합물을 물에 붓고, CH2Cl2로 추출한다. 조합된 유기 추출물을 식염수로 세척하고, 진공 내에서 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 갈색 고체가 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(15 % EtOAc/Hex)에 의한 정제가 투명한 오일(2.0 g, 65 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
g) 4-((6R,8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-일)부트-2-엔-1-올 - 리튬 비스(트리메틸실릴)아민(THF에서 1.0 M, 18.4 mL, 18.4 mmol)을 0 ℃에서 (2-하이드록시에틸) 트리페닐포스포늄 브로마이드(3.37 g, 8.70 mmol)의 60 mL의 THF 현탁액에 한 방울씩 첨가한다. 1 시간 후, 금갈색 용액을 f)로부터의 화합물(1.4 g, 3.48 mmol)의 10 mL의 THF 용액으로 한 방울씩 처리한다. 결과적인 반응 혼합물을 0 ℃에서 40 분 동안 교반한 후, 포화된 수성 NH4Cl로 급랭한다. 결과적인 혼합물을 EtOAc(2x)로 추출하고, 조합된 유기 추출물을 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 갈색 오일이 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(20 % EtOAc/Hex 내지 75 % EtOAc/Hex의 구배)에 의한 정제가 점성이 있는 황색 오일(680 mg, 45 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
h) 4-((6R,8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-일)부트-2-에날 - 데스-마르틴 퍼아이오디난(437 mg, 1.03 mmol)을 실온에서 g)로부터의 화합물(370 mg, 0.86 mmol)의 15 mL의 CH2Cl2 용액에 첨가한다. 결과적인 반응 혼합물을 10 분 동안 교반한 후, 물에 붓는다. 층들을 분리하고, 수성 층은 CH2Cl2(2x)로 추출한다. 조합된 유기 추출물을 식염수로 세척하고, 진공 내에서 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 갈색 오일이 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5 % EtOAc/CH2Cl2 내지 10 % EtOAc/CH2Cl2의 구배)에 의한 정제가 점성이 있는 담황색 오일(358 mg, 86 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
i) 6-((6R,8R,9S,13S,14S,17S)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-일)헥사-2,4-디엔-1-올 - 리튬 비스(트리메틸실릴)아마이드(THF에서 1.0 M, 4.3 mL, 4.29 mmol)를 0 ℃에서 (2-하이드록시에틸) 트리페닐포스포늄 브로마이드(786 mg, 2.03 mmol)의 14 mL의 THF 현탁액에 한 방울씩 첨가한다. 30 분 후, 금갈색 용액을 h)로부터의 화합물(345 mg, 0.81 mmol)의 2 mL의 THF 용액으로 한 방울씩 처리한다. 결과적인 반응 혼합물을 0 ℃에서 20 분 동안 교반하고, 포화된 수성 NH4Cl로 급랭한다. 결과적인 혼합물을 EtOAc(2x)로 추출하고, 조합된 유기 추출물을 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 갈색 오일이 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5 % EtOAc/CH2Cl2 내지 40 % EtOAc/CH2Cl2의 구배)에 의한 정제가 점성이 있는 황색 오일(140 mg, 38 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
j) (6R,8R,9S,13S,14S,17S)-6-(6-메톡시헥사-2,4-디엔-1-일)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌 - i)의 화합물(135 mg, 0.3 mmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 소듐 하이드라이드(120 mg, 3.0 mmol)를 나누어 첨가한다. 5 내지 10 분 후, 아이오도메탄(0.19 mL, 3.0 mmol)을 한 방울씩 첨가하며, 결과적인 반응 혼합물을 실온까지 따뜻하게 하고 4 시간 동안 교반한다. EtOAc를 첨가하고, 반응물을 물로 조심스럽게 급랭한다. 층들을 분리하고, 유기 층을 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 갈색 오일의 잔여기가 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5 % EtOAc/Hex 내지 20 % EtOAc/Hex의 구배)에 의한 정제가 투명한 오일(92 mg, 65 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
k) (6R,8R,9S,13S,14S,17S)-6-(6-메톡시헥실)-3,17-비스(메톡시메톡시)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌 - 5 내지 10 mL의 에틸 아세테이트에서의 10 % Pd/C(100 mg) 및 j)의 화합물(90 mg, 0.19 mmol)의 혼합물을 한 벌룬의(a balloon of) H2(g) 하에 실온에서 16 시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 셀라이트는 에틸 아세테이트로 잘 세척한다. 여과액을 진공 내에서 농축하여, 투명한 오일(90 mg, 99 %)로서 표제 화합물이 제공된다.
l) (6R,8R,9S,13S,14S)-6-(6-메톡시헥실)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (I) - k)로부터의 화합물(90 mg, 0.19 mmol)의 각각 1.5 mL의 6 N HCl 및THF 용액을 실온에서 5 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, EtOAc(2x)로 추출한다. 조합된 유기 추출물을 진공 내에서 건조(Na2SO4), 여과, 및 증발시켜, 투명한 오일의 잔여기가 제공된다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(CH2Cl2 내지 30 % EtOAc/CH2Cl2의 구배)에 의한 정제가 백색 고체 폼(38 mg, 52 %)으로서 I를 제공하였다.
예시 6
(6R,8R,9S,13S,14S,17S)-6-(메톡시메틸)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 - 20 L 플랜지 플라스크를 가열 코일에 놓고, 상기 플라스크에는 상부에 있는 N2-가스 유입구, 기계 교반기, 교반용 막대 + 날, 및 2 개의 글래스-스토퍼를 갖는 응축 냉각기가 갖추어져 있다. 그 후, 설정물을 190 ℃에서 3 시간 동안 가열하고, 주말동안(over the weekend) N2-분위기 하에 놓는다. N2-가스 유입구를 아르곤 유입구로 교체하고, 설정물을 아르곤 블리드(Argon bleed) 하에 놓는다. 상기 플라스크를 무수 THF로 충전한다(4 L, 새로운 병). 그 후, 리튬 와이어(미네랄 오일에 저장됨, 28.8g, 4.61 mol)를 작은 조각들(~ 0.3 cm)로 절단하고, N2-가스 분위기 하에서 헵탄으로 상기 조각들을 교반하여 오일을 제거한다. 헵탄을 배출하고(decant), 리튬 조각들을 반응 플라스크의 교반된 THF에 첨가한다. 비페닐(175.8 g, 1.14 mol)을 한번에(in one lot) 첨가하고, 이때 녹색을 띄는 리튬 조각들의 표면에 반응이 일어나며, 이는 교반 시 즉시 사라진다. 5 분 교반 후에는, 녹색이 다시 나타난다. 그 후, 디페닐메탄(95.9 g, 0.57 mol)을 한번에 첨가한다. 결과적인 진녹색 혼합물을 환류로 가열하고(먼저, 반응 혼합물이 환류되기 시작할 때까지 130 ℃의 외부 온도로, 그 후 108 ℃의 외부 온도에서 계속 환류됨), 이어서 디엔온 A(188.7 g, 0.57 mol)의 1 L 무수 THF 용액을 한 방울씩 첨가한다. 60 분 후, 첨가를 완료하여, 끈적거리는 황색/갈색 고체가 얻어진다. 가열을 중지하여, 반응 혼합물을 2 시간 내에 <40 ℃로 냉각시킨다. MeOH(300 mL)를 15 분에 걸쳐 첨가하여 반응 혼합물을 급랭시키고, 이때 두껍고 젤리같은 황색 혼합물이 형성된다. 그 다음, 1 시간에 걸쳐 6 M HCl 용액을 한 방울씩 첨가하여 반응 혼합물이 pH 2 내지 4가 되게 한다. 황색 혼합물이 제공된다. 이 혼합물을 물(2 L)로 희석하고 15 분 동안 교반한다. 결과적인 2-상 혼합물을 20 L 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 감소된 압력 하에서 휘발성분(THF/MeOH)을 제거한다. 남아있는 산성 수상(acidic aqueous phase)을 t-부틸 메틸 에테르(TBME)(2 L)로 추출하고, 더 적은 수상을 분리한다(TBME 층은 주로 비페닐 및 디페닐을 함유한다). 유기 상을 물(1 L)로 세척한다. 그 후, 유기 층을 2 M KOH 용액(2 × 1 L) 및 물 (1 L)으로 세척한다. 조합된 염기성 수성 층들의 pH는 6 M HCl의 첨가에 의해 pH 2 내지 4(pH-시험지)가 된다. 적절한 pH에 도달하면, 고체 침전물 및 혼합물은 황백색이 된다. TBME(1500 mL)를 첨가하고, 15 분 동안 교반한 후, 맑은 황색 유기 층 및 탁한 황색빛 수성 층을 형성한다. 상기 혼합물을 분별깔때기로 옮기고, 상기 혼합물을 힘차게 흔들기 전에 추가 1 L TBME를 분별깔때기에 첨가한다. 2 개의 투명한 층들을 분리한다. 수성 층을 TBME(1 L)로 2 회 추출하고, 두 유기 추출 층들을 조합한다. 조합된 유기 층들을 NaHC03 포화 수용액(1 L), 물(1 L) 및 식염수(1 L)로 세척한다. 유기 층을 진공 내에서 건조(Na2SO4), 여과, 및 농축시켜, 담황색 고체 B(117 g, 미정제 생성물)를 제공한다.
예시 7
(6R,8R,9S,13S,14S)-3-하이드록시-6-(메톡시메틸)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,15,16-옥타하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-17(14H)-온 (C) - 5 ℃에서 DMSO(200 mL) 및 디클로로메탄(DCM)(200 mL)의 B(20 g, 60 mmol)의 용액에 트리에틸아민(56 mL 0.4 mol)을 첨가한다. 그 다음, 설퍼 트리옥사이드 피리딘 착물(40 g, 0.25 mol)을 15 분에 걸쳐 천천히 첨가한다. 이 시간 동안, 온도를 0 ℃ 내지 5 ℃로 유지한다. 그 후, 상기 혼합물을 200 mL 물얼음(water-ice)에 첨가하여, 6 N HCL 용액으로 pH <1로 산화한다. 결과적인 혼합물을 DCM으로 4 회 추출한다(4 × 100 mL). 조합된 유기물을 무수 소디움 설페이트로 건조, 여과, 및 농축한다. 이 반응을 4 x 반복한다(출발 재료로서 전체 56 g B). 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(2/3 EtOAc/Hex)에 의해 미정제 재료가 정제되어 백색 고체 43 g (C)(76 %)로서 표제 화합물을 제공한다.
예시 8
(6R,8R,9S,13S,14S)-6-(메톡시메틸)-13-메틸-17-옥소-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 메탄설포네이트 (D) - 메탄설포닐 클로라이드(27 mL, 0.35 mol)를 0 ℃에서 화합물 C(43.6 g, 0.139 mol)의 피리딘(270 mL)의 용액으로 한 방울씩 첨가한다. 반응물을 90 분 동안 실온에서 교반한 후, 물을 첨가한다. 후속하여, 침전물이 생성된다. 여과 후, 상기 고체를 DCM으로 용해하고, 무수 소디움 설페이트로 건조, 여과, 및 농축하여, 백색 고체로서 화합물 D(57.1 g, 정량적)를 제공한다.
예시 9
(6R,8R,9S,13S,14S)-17-(하이드록시이미노)-6-(메톡시메틸)-13-메틸-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 메탄설포네이트 (E) - 하이드록실아민 하이드로클로라이드(30.31 g, 470 mmol) 및 소디움 아세테이트(60 g, 820 mmol)를 화합물 D(57.1 g, 146 mmol)의 무수 에탄올(800 mL) 용액에 첨가한다. 상기 반응물을 90 분 동안 환류하고, 하룻밤 실온으로 냉각한다. 그 후, 상기 반응물을 물 및 에틸 아세테이트로 희석한다. 결과적인 층들을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출한다. 조합된 유기 층들을 포화 수성 소디움 비카르보네이트 및 식염수로 세척한다. 상기 용액을 무수 소디움 설페이트로 건조, 여과, 및 농축하여, 백색 고체로서 표제 화합물 E(47 g, 80%)을 제공한다.
예시 10
(4bS,8S,8aS,10R)-8-(2-시아노에틸)-10-(메톡시메틸)-7-메틸렌-4b,5,6,7,8,8a,9,10-옥타하이드로페난트렌-2-일 메탄설포네이트 (F) - 트리플루오로아세트산(1.3 mL)을 0 ℃ 내지 5 ℃에서 화합물 E(10 g, 24.5 mmol) 및 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(15 g, 73.7 mmol)의 무수 DMSO(50 mL) 및 카본테트라클로라이드(50 mL)의 용액에 한 방울씩 첨가한다. 2.5 시간 후에, 얼음 냉수를 첨가하고, 혼합물을 DCM으로 3 회 추출한다. 조합된 유기 층들을 물, 포화 수성 소디움 비카르보네이트, 및 식염수로 세척한다. 상기 용액을 무수 소디움 설페이트로 건조, 여과, 및 농축한다. 상기 반응은 2x 8 g 스케일 및 2x 5 g 스케일로 수행된다. 조합된 미정제 재료는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(50 % EtOAc/Hex)에 의해 정제되어, 투명한 오일로서 표제 화합물 F(11.9 g, 27 %)를 제공한다. 부산물은 분리되며, HNMR이 이용가능하다.
예시 11
(1'S,4a'S,9'R,lOa'R)-1'-(2-시아노에틸)-9'-(메톡시메틸)-3',4',4a',9',10',10a'-헥사하이드로-1'H-스피로[옥시란-2,2'-페난트렌]-7'-일 메탄설포네이트 (G) - m-클로로퍼옥시벤조산(8 g, 32.3 mmol)을 화합물 F(4.2 g, 11.78 mmol)의 DCM(150 mL)의 용액에 나누어 첨가하고, 반응물을 2 시간 동안 실온에서 교반한다. 상기 반응 혼합물을 10 % 수성 포타슘 아이오다이드, 1 M 수성 소디움 하이드로설파이트, 포화 수성 소디움 비카르보네이트, 및 식염수로 세척한다. 그 후, 상기 용액을 무수 소디움 설페이트로 건조, 여과, 및 농축한다. 상기 반응을 2x 반복한다(3.9 g 및 3.8 g). 조합된 미정제 재료는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(1:4 내지 1:1 EtOAc/Hex)에 의해 정제되어, 표제 화합물 G(8.8 g, 72 % 수율)를 제공한다.
예시 12
(6R,8S,9S,14S)-6-(메톡시메틸)-17-옥소-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일 메탄설포네이트 (H) - 보론 트리플루오라이드 에테레이트(2.28 mL, 16.9 mmol)를 화합물 G(1.36 g, 3.3 mmol)의 무수 톨루엔(22 mL)의 용액에 첨가한다. 상기 반응물을 15 분 동안 마이크로파에서 100 ℃로 가열한다. 실온에서 냉각 후, 경질의 고체가 형성된다. 고체로부터 톨루엔의 분리 후, 상기 고체를 포화 수성 소디움 비카르보네이트 및 에틸 아세테이트(EA)로 처리한다. 유기 층을 무수 소디움 설페이트로 건조, 여과 및 농축한다. 이 반응을 되풀이한다(1.4 g, 0.613 g, 0.87 g, 1.1 x 4 g). 미정제 재료는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(5 내지 50 % EtOAC:/Hex)에 의해 정제되어, 표제 화합물 H(1.41 g, 15 %)을 제공한다.
예시 13
(6R,8S,9S,14S)-6-(메톡시메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로- 6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올 (1) - 리튬 알루미늄 하이드라이드(700 mg, 18.45 mmol)를 0 ℃에서 화합물 H(550 mg, 1.45 mmol)의 THF(10.0 mL)의 용액에 첨가한다. 상기 반응물을 1 시간 동안 환류한다. 그 후, 상기 반응물을 Na/K 타르트레이트로 급랭하고, 에틸 아세테이트(3x100 mL) 및 DCM(3x100 mL)으로 3 회 추출한다. 유기 층을 5 N HCl(10 mL)로 세척하고, 수성 층을 EA(2x 50 mL)로 추출한다. 조합된 유기 층들을 무수 소디움 설페이트로 건조, 여과, 및 농축한다. 미정제 재료는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(0 내지 50% EtOAc/Hex)에 의해 정제되어, 1(220 mg)의 50% 수율의 표제 화합물을 제공한다. 동일한 반응을 510 mg의 화합물 H로 반복하고, 또 다른 150 mg의 생성물을 분리한다.
예시 14
루시페라아제 활성을 이용하여 에스트로겐 수용체 결합 능력을 결정하는 방법들.
에스트로겐 수용체-음성 CV-1 신장 세포를, 37 ℃의 가습된 5 % CO2 분위기에서 10 % 소태아혈청 및 100 units/ml 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 4.5 g/L 글루코스를 갖는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 유지시킨다. 그 후, 10 % 숯-덱스트란-제거된(charcoal-dextran-stripped) 소태아혈청을 함유하는 페놀-레드 없는 둘베코 변형 이글 배지에서 웰(well) 당 2 x 105의 세포 밀도로 6-웰 디쉬에 세포들을 플레이팅(plate)한다. 제조업자의 프로토콜에 따라 LipofectAMINE 시약을 이용하여, CV-1 세포들을 감염시킨다. 형질감염은 1.5 ㎍의 리포터 플라스미드(티미딘 키나아제 프로모터 및 루시페라아제 유전자 상류에 복제된 단일 ERE를 함유한 ERE-tk-루시페라아제를 함유함) 및 0.5 ㎍의 ERα 또는 ERβ 발현 벡터(CMV-ERα 또는 CMV-ERβ의 전체 길이 코딩 시퀀스를 각각 함유함)를 포함한다. 다음날, 세포들은 어떠한 처리(대조군)도 받지 않거나, 에스트라디올 단독(1 nM) 또는 (다양한 농도로) 본 발명의 화합물을 추가한 에스트라디올로 처리된다. 16 내지 24 시간 후 세포들을 수거하고, 루시페라아제 활성에 대해 분석한다.
처음에, 세포 단층을 차가운 인산-완충 식염수로 두 번 세척하고, 250 ㎕의 1X 세포 배양 용해 시약(Promega, Madison, WI)에서 15 분 동안 배양한다. 세포 추출물을 새 튜브로 옮기고, 루시페라아제 분석 시스템(Promega)을 이용하여 분석한다. 각각의 분석에 대해, 10 ㎕의 추출물을 90 ㎕의 1X 세포 배양 용해 시약으로 희석한다. AutoLumat LB953 광도계를 이용하여, 발광(luminescence)을 판독한다.
본 명세서에 설명된 결합 분석법에 의해 확인되는 화합물 또는 이의 염은 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 위치에서 에스트라디올의 결합을 억제하는 화합물이다. 구체적으로, 화합물 또는 이의 염은 세포 증식을 정지시키고, 이에 따라 그 약리적 활성을 발휘할 것으로 고려된다.
CV-1 세포들을 2 개의 플라스미드 구성물, 리포터 구성물 ERE-tk-루시페라아제 및 CMV-ER-β 구성물로 감염시킨다. 감염된 대조군(Ctrl) CV-1 세포들은 처리되지 않는 한편, 에스트라디올 처리된 세포들은 10-9 M(1 nM)로 단독 추가되는 에스트라디올(E2)을 수용한다. 본 발명의 화합물들의 경우, 각각의 화합물은 각각 10-8 M(10 nM)로 단독 추가되거나, 10-9 M 에스트라디올(E2)과 함께 10-8 M 추가된다.
예시 15
후보 화합물들의 IC50 값을 결정하는 방법.
열거된 세포주를 약 5 % CO2, 37 ℃, 95% 상대 습도에서 상기 세포주에 적절한 배지에 유지시킨다. 세포들을 2 내지 3일마다 배양하고, 1 x 104 세포/웰의 밀도로 투명한 바닥의 96-웰 플레이트에 플레이팅하며, 분석을 개시하기 전에 ca. 5 % CO2, 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양한다. 세포 생존도 분석을 시작하기 위해, 세포판의 배지(100 μL)를 새 배지(100 μL)로 교체한다. 실험군 물질(test article)들을 두 부류로(in duplicate) 새 배지에서 1:2로 희석시키고, 총 부피 200 μL에서 0.46, 1.37, 4.12, 12.35, 37.04, 111.1, 333.3 및 1000 μM(≤ 1 % DMSO)의 최종 샘플 농도로 세포들(100 μL)에 첨가한다. 기초 대조군(baseline control)들로는 0.1 % 트리톤-X로 용해된 세포를 함유한 웰들 및 세포를 함유하지 않은 웰들을 사용한다. 각각의 분석을 위해 알려진 대조군으로서 타목시펜을 이용하고, 매개체 대조군으로서는 DMSO만을 이용할 것이다. 샘플들을 ca. 37 ℃의 가습된 5% CO2 분위기에서 72 시간 동안 배양한다. 합류(confluence) 레벨에 대해 특별히 주의하면서, 배양 주기 동안 하루에 한 번 세포판을 모니터링한다. 72 시간 배양 주기가 끝나기 전에 세포들이 합류에 접근하는 경우, 실험을 종료하고 아래에 설명되는 바와 같이 세포 생존도를 측정한다.
세포 생존도는 발광에 의해 ATP 레벨들을 결정하는 상업적으로 이용가능한 키트를 이용하여 결정된다. 간략하게, 세포판의 배지를 제거하고, 100 μL의 새 배지로 교체하며, 완충제 및 동결건조 기질(lyophilized substrate)을 실온으로 평형화한다. 완충제는 세포판의 웰들(웰 당 100 μL)에 추가하기 직전에 기질을 재구성하는데 사용된다. Infinite M200 판 판독기(plate reader)에 상기 판을 배치하고, 10 분 동안 흔든 후 10 분 동안 기다린다. 그 후, 상기 판은 감쇠 없이 0.5 sec의 인티그레이션 시간(integration time)을 이용하여 판독된다.
열등한 기초 대조군들(트리톤 X-100을 갖거나 세포들을 갖지 않는 웰들)은 총 발광으로부터 제거되어, 그 웰에 대한 순 발광이 제공된다. 이 총계를 DMSO만의 대조군에 비교한다. 매개체 제어군 세포들에 비해 50 %의 반응을 유도하는 농도로서 IC50이 계산된다. 따라서, 당업자라면 본 발명에서 주장하는 조성물의 (C-6에서의) R 배열이 다른 입체이성질체보다 우수하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
표 1은 재조합 ERα 및 ERβ를 이용하여 에스트로겐 수용체에 대한 B, I, 1 및 E2의 결합 친화력을 제공한다. 재조합 ER들은 4 ℃에서 하룻밤 동안 테스트 화합물의 존재 또는 부재 하에 3H-E2로 배양된다.
도 1은 본 발명의 화합물들에 대한 다양한 세포주의 B, I, 1 및 타목시펜의 EC50 값들의 그래프이다. 도 2는 ERα 및 ERβ의 I 및 B에 대한 E2의 활성도의 %를 나타낸다.
ERα 및 ERβ의 I 및 B의 반응은 루시페라아제 분석에 의해 측정된다. MDA-MB-231 셀들은 ERα 또는 ERβ를 암호화하는 발현 벡터들로 일시적으로 감염되며, 루시페라아제 리포터 구성물로 함께 감염된다(co-transfected). 셀들을 37 ℃에서 24 시간 동안 처리하여 실험군 물질의 양을 증가시킨다. 비교적으로, 도 3은 ERα 및 ERβ의 l에 대한 E2의 활성도의 %를 나타낸다. 도 2 및 도 3, 그리고 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, l은 놀랍게도 B 및 I에 대해 ERβ 특정 효능제인 것으로 밝혀졌다.
예시 16
NSCL, 췌장 및 난소 종양 세포주들의 화합물들 l, B 및 I의 발현 프로파일링.
본 연구는 3 개의 인체 종양 세포주들: A549, Panc-1, 및 SK-OV-3을 포함한다. 상기 세포주들은 약 40 % 합류로 배양된 2 개의 플라스크들에서 성장된다. 플라스크들 중 하나는 다양한 농도에서 배양 배지에 약물을 첨가하여 처리된다. 다른 하나의 비처리된(mock treated) 플라스크는 약물을 가용화하고 전달하는데 사용되는 매개체로만 처리된다. 처리된 그리고 처리되지 않은 샘플들의 쌍들로부터 추출된 RNA는 애질런트 홀 휴먼 게놈 마이크로어레이(Agilent Whole Human Genome Microarrays)(G4112F)의 마이크로 분석을 거친다. 각각의 분석은 어레이의 41,000 개의 특정 mRNA 검출기들의 각각에 대해 메신저 RNA의 존재비(abundance)의 차이를 보고한다. 각각의 세포주에 대하여 처리된 샘플 대 처리되지 않은 샘플의 이 직접적인 비교는 약물 처리에 기인한 mRNA 존재비의 변화의 극히 민감한 검출을 제공한다. 각각의 세포주 비교가 자기-정규화(self-normalized)됨에 따라, 결과값들이 높은 신뢰도로 샘플들에 대해 비교될 수 있다.
세포 제조
3 개의 인체 종양 세포주들, A549, Panc-1, 및 SK-OV-3는 약 40 % 합류로 배양된 2 개의 플라스크들에서 각각 성장된다. 플라스크들 중 하나는 상기의 표 1에 따른 농도들에서 배양 배지에 화합물 l을 추가하여 처리된다. 다른 하나의 비처리된 플라스크는 약물을 가용화하고 전달하는데 사용되는 매개체로만 처리된다. 모든 플라스크들은 추가 24 시간 동안 배양된 후, 셀들을 긁어내(scraped free) 차가운 PBS로 세척하고 원심 분리를 이용해 수집한다. 이렇게 채취된 셀들을 즉시 동결시키고, - 80 ℃ 이하로 저장한다. 특히 주목할 점은, 처리된 셀들이 처리되지 않은 셀들보다 더 적은 질량을 산출한다는 점이다.
RNA 정제
트리졸-계 세포 용해에 이어, 65 ℃의 고온 페놀 추출 및 RNeasy 크로마토그래피 정제를 이용하여 동결된 조직 샘플들로부터 전체 RNA가 제조된다. 정제된 RNA 샘플들은 분광 광도법으로(spectrophotometrically) 분석된다. RNA의 농축은 260 nm(A260)에서의 흡광도를 측정함으로써 결정된다. 260 nm에서 1 단위의 흡광도가 주어진다면, 이는 pH 11에서 측정될 때 ㎖당 35 ㎍의 RNA에 대응한다.
RNA 품질 평가 - A260/A280 흡광비
260 nm 및 280 nm(A260/A280)에서의 판독치들의 비는 단백질과 같이 UV를 흡수하는 오염물에 대해 RNA의 순도의 평가를 제공한다. RNA는 약 2.1의 이론적인 A260/A280 비(10 mM TrisㆍCl, pH 7.5)를 갖는다. 1.8 이상의 A260/A280 비를 갖는 추출된 RNA는 이 분석에서 우수한 결과를 제공한다.
RNA 품질 평가 - 모세관 전기이동
RNA는 모세관 전기 이동(Agilent BioAnalyzer)을 이용하여 온전한 28S 및 18S 리보솜 RNA의 비를 결정함으로써 상대 무결성에 대해 테스트된다. 완전히 온전한 RNA는 2.2의 28S/18S 비를 갖는다. 어레이 분석에 수용된 모든 RNA는 1을 초과하는 비를 가지며, 변하는 28S/18S 비를 갖는 샘플들 중에서 내부 재현도의 검토에 의해 결정되는 바와 같이 신뢰성 있게 재현가능한 마이크로어레이에 대한 최소 28S/18S 비가 유도된다.
프로브 생성 및 칩 혼성화
모든 RNA는 애질런트 로우 인풋 라벨링 반응(Agilent Low Input Labeling reaction)에 대한 입력으로서 1 마이크로그람의 RNA를 이용하여 표지된다.
테스트 RNA는 Cy5(650 nm 방출체)로 표지되고, 기준 RNA는 Cy3(550 nm 방출체) 뉴클레오티드로 표지된다. 표지, 혼성화 및 후속 세척은 Agilent HlAv2 인체 발현 칩들에서 수행된다. 결과적인 혼성화된 칩들은 애질런트 마이크로어레이 스캐너에서 스캔되고, 각 검출기 스폿에 대한 세기 정보는 애질런트 피처 추출 소프트웨어를 이용하여 스캔된 이미지로부터 추출된다. 각각의 이미지로부터의 추출된 측정들 및 데이터 이미지들의 세트가 공급된다.
혼성화의 품질의 가장 유효한 테스트는 이러한 칩들에 프린트되는 유전자들의 다수의 중복부분들로부터의 보고된 비의 변이도의 레벨이다. 유전자 프로브들의 세트는 각각 어레이에 걸쳐 랜덤한 위치에서 10 번 프린트된다. 모든 세트에 걸쳐 log2 비의 표준 편차의 중간 값은 전체 어레이에 걸쳐 전체 표준 편차의 추정량으로서 사용된다.
데이터 및 분석
3 개의 모든 혼성화에 대한 핵심 데이터는 특정 전사 패턴들을 나타내는 유전자들을 식별할 수 있는 쉬운 검색 방안을 허용하기 위해 FileMaker Pro 관계형 데이터베이스에 수집된다. 보고된 데이터는 적색(처리) 및 녹색(비처리) 배경-제거된 신호들이다. 이는 상기 데이터의 최소 수정된 형태이다. 배경 "표면"은 인간의 DNA에 상보적이지 않은 다수의 프로브들에 기초하여 슬라이드에 대해 추정된다. 이들은 어레이 표면들에 표지된 cRNA의 비-특정적 결합 및 고정된 DNA 올리고머에 표지된 cRNA의 비-특정 결합 둘 모두의 추정량으로서 역할한다. 이 정보를 이용하여, 각 프로브 주위의 국부적 잡음이 추정되며, 어레이의 각각의 특정 프로브 피처(gBGSubSignal, rBGSubSignal)에 대한 올리고 뉴클레오티드 침착의 부위에서 발견된 신호로부터 이를 제외한다. 처리된 세포의 RNA 및 처리되지 않은 세포의 RNA로부터의 신호의 비는 직접비로서 또한 log2 비로서(Ratio, Log2Ratio) 둘 다 보고된다. 비는 각 채널의 세기를 정규화는 반복 공정에서 결정되어, 거의 동일한 전사 레벨을 갖는 다수의 유전자의 세기의 유사성을 최대화하는 스칼라가 발견됨에 따라, 이는 1에 매우 근사한 비를 가져야 한다.
비가 정규화된 데이터에 대해 계산된 후, 다양한 제어군 및 중복 샘플들이 분석되어, 그 결과들이 어떻게 재현가능한지 그리고 이 재현성이 신호 강도 및 잡음에 따라 어떻게 변하는지에 관한 모델을 구축한다. 이 파라미터들로, 적색 및 녹색 세기들이 동일한 세기 분포를 생성하는 단일 공정으로부터 무작위로 도출된 경우 각각의 비가 발생할 수 있었던 가능성의 추정이 생성된다. 이 가능성은 각각의 샘플에 대해 보고되며, 비가 처리된 신호 강도와 처리되지 않은 신호 강도 간의 차이를 나타내는 가능성의 척도이다(PValLogRatio). 이 가능성은 그 결과들을 변화된 유전자 및 변화되지 않은 유전자로 임계화하기 위해 사용될 수 있다. 데이터베이스에서, p ≤ 0.001의 임계값은 처리된 샘플 및 처리되지 않은 샘플 간의 mRNA 존재비의 상당한 변화에 대한 차단점으로서 사용된다(SigO.001). 각 분석에서 조사되는 ~40,000 비가 주어진다면, 이 임계값은 예상되는 거짓 양성(false positives)의 수를 상당한 수준으로 감소시킨다. 처리되지 않은 샘플에 대한 변화의 방향 및 상당한 변화를 나타내는 필드는 분석의 결과를 세 개의 카테고리(trinary categorical)로 감소시킨다: 1, 처리되지 않은 것에 대해 상향 조정됨(up regulated), 0, 처리되지 않은 것에 대해 변화되지 않음, 그리고 -1, 처리되지 않은 것에 대해 하향 조정됨(down regulated)(Tri). 이 표현을 이용하여, 여하한의 단일 또는 다수의 세트의 실험들에서 변화한 유전자를 식별하는 검색들을 쉽게 구성한다.
TREK1 및 TREK2에 관한 유전자 영향은 B 또는 I가 아닌, 1로만 관찰된다(도 2 참조). 구체적으로, TREK1의 유전자 전사는 1의 존재 하에서 2 내지 50 번(fold) 상향 조절되는 반면, TREK2의 유전자 전사는 1의 존재 하에서 8 내지 50 번 상향 조절된다. TREK1는 외상수용기(nociceptor)의 여기가 발생하는 온도 범위들 및 온도 임계값들의 정의에 그리고 이것이 일어날 때 여기의 세기에 중요하다. Noel, J. 외, EMBO J. 28, 1308-1318(2008)은 본 명세서에서 인용 참조된다. 이와 유사하게, TREK2는 신경병증 통증 인식에 중요하다. Huang, D. 외, Medical Hypothesis 70, 618-624(2007). 1이 ERβ의 특정 효능제인 것으로 나타나고 TREK1 및 TREK2 전사에 상당한 영향을 주었기 때문에, 본 발명의 6-치환된 13-데메틸 에스트라디올 유도체들은 통증의 치료에 효과가 있는 것으로 나타났다.
Figure 112013031687687-pct00014
Figure 112013031687687-pct00015

Claims (28)

  1. 하기 화학식의 화합물, 또는 상기 화합물 각각의 거울상이성질체, 입체화학 이성질체, 수화물, 용매 화합물, 호변이성질체 또는 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 신경성 통증(neuropathic pain)의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018126470351-pct00016

    여기서, R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 수소, C1-C6 알킬, 할로, 및 -OH로부터 선택되고;
    R11은 H이며;
    X는 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 할로겐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, 및 -(CH2)m-NH-(CH2)nCH3로부터 선택되고;
    Y는 수소, =O 및 -OH으로부터 선택되며;
    m은 0과 20 사이의 정수이고;
    n은 0과 8 사이의 정수이며;
    ---- 부호는 17번 위치에서 케토기를 형성할 수 있는 단일 또는 이중 결합을 나타내고;
    Figure 112018126470351-pct00017
    부호는 입체화학에 상관없이 여하한 타입의 결합을 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018048560916-pct00018
    .
  3. 제 2 항에 있어서,
    Y는 =O 또는 -OH로부터 선택되고;
    R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2는 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고;
    R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐,-(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, 및 -(CH2)m-NH-(CH2)nCH3로부터 선택되고;
    m은 1 내지 20의 정수이며;
    n은 0 내지 8의 정수이고;
    ---- 부호는 단일 또는 이중 결합을 나타내는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    Y는 (S)-배열된 -OH이고;
    R4는 수소 또는 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2 및 R3은 수소이고;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, -(CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되며;
    m은 1 내지 6의 정수이고;
    n은 0 내지 3의 정수인 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018048560916-pct00019
    .
  6. 제 5 항에 있어서,
    R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고;
    R4는 수소, 할로 또는 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2는 수소 및 할로로부터 선택되고;
    R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, 및 -(CH2)m-NH-(CH2)nCH3로부터 선택되고;
    m은 1 내지 20의 정수이며;
    n은 0 내지 8의 정수인 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    R1은 수소이고;
    R4는 수소 또는 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2 및 R3은 수소이고;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되며;
    m은 1 내지 12의 정수이고;
    n은 0 내지 4의 정수이며;
    C-17 하이드록실은 (S)-배열되는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018126470351-pct00020

    여기서, R11은 H이다.
  9. 제 8 항에 있어서,
    R11은 수소이고;
    R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2는 수소 및 할로로부터 선택되고;
    R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, 및 -(CH2)m-NH-(CH2)nCH3로부터 선택되고;
    m은 1 내지 20의 정수이며;
    n은 0 내지 8의 정수인 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    R4는 수소 또는 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2 및 R3은 수소이고;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, -(CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되며;
    m은 1 내지 12의 정수이고;
    n은 0 내지 4의 정수이며;
    C-17 하이드록실은 (S)-배열되는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018048560916-pct00021
    .
  12. 제 11 항에 있어서,
    R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고;
    R2는 수소 및 할로로부터 선택되며;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, 및 -(CH2)m-NH-(CH2)nCH3로부터 선택되고;
    m은 1 내지 20의 정수이며;
    n은 0 내지 8의 정수인 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    R1 및 R2는 수소이고;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3로부터 선택되며;
    m은 1 내지 12의 정수이고;
    n은 0 내지 4의 정수이며;
    C-17 하이드록실은 (S)-배열되는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018048560916-pct00022

    여기서, Z는 -O-, -S- 및 -NH-로부터 선택된다.
  15. 제 14 항에 있어서,
    m은 1 내지 12이고;
    n은 0 내지 4이며;
    R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고;
    R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2는 수소 및 할로로부터 선택되고;
    R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며;
    Z는 -O- 및 -S-로부터 선택되는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    m은 2 내지 8이고;
    n은 0 내지 3이며;
    R1 내지 R4는 수소이고;
    Z는 -O-이며;
    C-17 하이드록실은 (S)-배열되는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018048560916-pct00023
    .
  18. 제 17 항에 있어서,
    R1은 수소, -OH 및 할로로부터 선택되고;
    R4는 수소, 할로 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;
    R2는 수소 및 할로로부터 선택되고;
    R3는 수소, 할로 및 -OH로부터 선택되며;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, (CH2)m-S-CH3, -(CH2)m-S-(CH2)nCH3, 및 -(CH2)m-NH-(CH2)nCH3로부터 선택되고;
    m은 1 내지 20의 정수이며;
    n은 0 내지 8의 정수인 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    R1, R2, R3 및 R4는 수소이고;
    X는 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, -(CH2)m-O-CH3, -(CH2)m-O-(CH2)nCH3, -(CH2)m-S-CH3, 및 -(CH2)m-S-(CH2)nCH3으로부터 선택되며;
    m은 1 내지 12의 정수이고;
    n은 0 내지 4의 정수인 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  20. 제 1 항에 있어서, 화합물은:
    a) (8S,9S,14S,17S)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    b) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(메톡시메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    c) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(6-메톡시헥실)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    h) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-메톡시-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    i) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(2-메톡시에틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    j) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(4-메톡시부틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    k) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(8-메톡시옥틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    m) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(4-프로폭시부틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올; 및
    n) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(5-에톡시펜틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    로부터 선택되는 것인 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 제 1 항에 있어서, 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  25. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물:
    Figure 112018048560916-pct00027

    여기서, R1, R2, R3 및 R4는 수소;
    Z는 O;
    m은 1과 20 사이의 정수이고;
    n은 0과 8 사이의 정수이다.
  26. 제 25 항에 있어서,
    m은 1 내지 12의 정수이며;
    n은 0 내지 4의 정수인 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서,
    m은 2 내지 8의 정수이고;
    n은 0 내지 3의 정수이며;
    C-17 하이드록실은 (S)-배열되는 화합물을 포함하는 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
  28. 제 25 항에 있어서, 화합물은:
    a) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(메톡시메틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    b) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(6-메톡시헥실)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    c) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(2-메톡시에틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    d) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(4-메톡시부틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    e) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(8-메톡시옥틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    f) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(4-프로폭시부틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올; 및
    g) (6R,8S,9S,14S,17S)-6-(5-에톡시펜틸)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-데카하이드로-6H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,17-디올;
    로부터 선택되는 것인 신경성 통증의 치료용 약학적 조성물.
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