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KR101918250B1 - 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR101918250B1
KR101918250B1 KR1020180069736A KR20180069736A KR101918250B1 KR 101918250 B1 KR101918250 B1 KR 101918250B1 KR 1020180069736 A KR1020180069736 A KR 1020180069736A KR 20180069736 A KR20180069736 A KR 20180069736A KR 101918250 B1 KR101918250 B1 KR 101918250B1
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유경남
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주식회사 무진메디
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Abstract

본 발명은 피나스테라이드(finasterid), 미녹시딜(Minoxidil), 두타스테리드(Dutasteride) 등의 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 현재 탈모 치료체로 사용되고 있는 피나스테라이드와 같은 구강 투여제는, 구강투여로 인한 다양한 부작용이 발생하여 두피 도포를 통한 약물 전달이 가장 바람직하지만, 두피 도포만으로는 약물 자체가 모낭세포까지 잘 전달되지 않는다는 단점이 있다. 이 외에 피부 외용제로 사용되는 탈모 치료용 약물에 있어서도 각종 부작용이 있어 그 사용 농도를 보다 더 낮추어야 할 필요성이 있다.
따라서 전달 지지체를 활용하여 피나스테라이드의 약물전달 효율을 높이는 것이 중요하다. 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 이용할 경우, 낮은 농도로 처리되는 탈모 치료용 약물의 전달효율을 증강시킬 수 있어 남성형 탈모의 치료를 매우 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물 {Nanoliposome-microbubble assemblies encapsulating a durg for the treatment of androgenic alopecia, and composition comprising the same for improving or treating hair loss}
본 발명은 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로는 본 발명은 피나스테라이드(finasterid), 미녹시딜(Minoxidil), 두타스테리드(Dutasteride) 등의 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀에 소수성 기체를 포함하는 마이크로버블이 화학적으로 안정적인 상태로 결합되어 있는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유한 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
탈모는 일반적으로 두피의 굵고 검은 머리털이 빠지는 것을 의미한다. 탈모의 원인은 다양하지만 유전적인 원인과 남성 호르몬인 안드로겐(androgen)이 중요한 인자로 생각되고 있다. 그 중에서 60-70% 정도로 큰 비율을 차지하고 있는 남성형 탈모증(androgenic alopecia)은 테스토스테론(testosterone)이 5-알파 환원 효소(5-alpha reductase, SRD5A)에 의해서 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)로 전환되고, 과다하게 생성된 디하이드로테스토스테론이 모유두 진피 세포(dermal papilla cell, DPC)의 남성호르몬 수용체(androgenic receptor, AR)에 결합하여 세포 사멸(apoptosis)을 유발시켜, 모발의 소형화로 인해 탈모가 진행되는 것이다. 5-알파 환원 효소 중 모낭의 모유두와 외측모근초에 주로 분포하는 제 2형 5-알파 환원 효소(5-alpha reductase type 2, SRD5A2) 자체가 많이 발현되어 있는 남성이나 제 2형 5-알파 환원 효소의 활성도가 높은 사람이 디하이드로테스토스테론의 양이 일반 남성보다 상대적으로 많기 때문에 탈모의 발생 가능성이 커지는 것이다. 따라서, 남성형 탈모증의 치료 핵심은 제 2형 5-알파 환원 효소의 양이나 활성도를 낮춰 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 막는데 있다.
현재 탈모 치료제로 프로페시아(Propecia), 미녹시딜(Minoxidil), 두타스테리드(Dutasteride) 등의 약물이 개발되어 있다. 프로페시아는 피나스테라이드(finasterid) 성분의 약물로서, 제2형 5-알파 환원 효소를 직접적으로 억제하고, 두타스테리드는 제1형, 제2형 5-알파 환원 효소를 억제하여 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 억제하여 탈모의 진행을 완화시킨다. 피나스테라이드는 경구용 탈모 치료제로서, 원래 전립선비대증 치료약이었으며, 복용환자들의 발모 부작용이 관찰되어 나중에 남성 탈모치료제로 개발되었다. 하지만, 이러한 약물들은 복용 환자에서 성욕 감퇴, 발기 부전 등과 같은 부작용이 발생하며, 복용 중단 시 탈모가 다시 진행되는 단점을 가진다. 특히, 미국 FDA에서는 불임이나 정자의 수가 적은 남성의 경우 약물 복용을 중단할 것을 권고하고 있다(Myscore V et al., 2012).
한편 세포 내 약물 전달 시스템에서 요구되는 중요 두 가지 성질은 효율성과 세포 독성(안전성)으로서, 콜레스테롤이나 지질 등으로 구성된 나노 리포좀 전달체 기술이 폭넓게 사용되고 있다(Zuris JA et al., 2015). 하지만 이러한 나노 리포좀 기술만으로는 피부 장벽의 역할을 하는 각질층 밑에 존재하는 진피 내로의 약물 전달이 용이하지는 않다(Nemes Z et al., 1999).
마이크로버블은 FDA에 승인된 진단 초음파 조영제로서 소수성 기체로 채워진 마이크로 크기의 기포 형태를 가지고 있다. 초음파에 노출된 마이크로버블은 공동현상(cavitation)이 일어나 주변 세포의 세포막이 일시적으로 기공을 형성하게 되고, 이 기공을 통해 세포 내로 물질이 투과되는 초음파 천공법(sonoporation)으로 나노 리포좀이 세포 내로 전달됨으로써 다른 세포 전달법보다 더 효과적으로 전달할 수 있다.
이에 본 발명자들은 피나스테라이드가 봉입된 나노 리포좀을 진피층까지 효율적으로 전달하기 위해, 피나스테라이드를 나노 리포좀에 봉입하고, 이를 마이크로버블과 결합시킨 조성물을 제조하였다. 따라서 이와 같은 기술을 통해 진피 내로 약물 전달 효율이 좋은 전달체를 제조하고, 이를 탈모 개선 또는 치료용 조성물로 이용함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
대한민국 등록특허 제10-1683463호 (발명의 명칭 : 마이크로버블-리포좀-멜라닌 나노입자 복합체 및 이를 포함하는 조영제, 출원인 : 서울대학교산학협력단, 등록일자 : 2016년12월01일) 대한민국 등록특허 제10-1082391호 (발명의 명칭 : 비타민 Ｃ를 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 나노하이브리드 복합체 및 발모 촉진용 조성물, 출원인 : ㈜씨앤팜 및 이화여자대학교 산학협력단, 등록일자 : 2011년11월04일) 대한민국 등록특허 제10-1054731호 (발명의 명칭 : 난용성 발모 및 육모 생리활성 물질인 피나스테라이드를 포함하는 나노입자 및 이를 함유하는 피부 외용제 조성물, 출원인 : (주)아모레퍼시픽, 등록일자 : 2011년08월01일)
Myscore V et al., Finasteride and sexual side effects, Indian Dermatol Online J, 2012, 3(1), 62-65. Zuris JA et al., Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo, Nat Biotechnol, 2015, 33(1), 73-80.
본 발명의 목적은 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
보다 구체적으로는 본 발명의 목적은 피나스테라이드(finasterid), 미녹시딜(Minoxidil), 두타스테리드(Dutasteride) 등의 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀에 소수성 기체를 포함하는 마이크로버블이 화학적으로 안정적인 결합되어 있는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체와 이를 함유하여 구강 투여로 인한 부작용 없이도 탈모 개선 또는 치료 효과가 우수한 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체에 관한 것이다.
상기 탈모 치료용 약물은 피나스테라이드(finasterid), 미녹시딜(Minoxidil) 및 두타스테리드(Dutasteride)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되어 포함된 것일 수 있다.
또한 상기 탈모 치료용 약물은 제2형 5-알파 환원 효소의 발현 또는 활성을 억제하여 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로의 전환되는 것을 저해하는 효능이 있거나, 모유두 진피 세포의 사멸을 억제하는 효능이 있는 것일 수 있다.
상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤 및 양이온성 인지질을 포함할 수 있다.
상기 마이크로버블은 양쪽성 인지질, 음이온성 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질을 포함할 수 있다.
상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체는 1100~2100nm의 입자크기를 가질 수 있다.
본 발명은 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 함유하는 탈모의 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 하기와 같은 모유두 진피 세포를 선택적으로 인식할 수 있는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 제조방법을 제공한다. 보다 바람직하게는 나노 리포좀과 마이크로버블을 각각 제조한 후 이를 혼합하여 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 제조할 수 있다.
상기 나노 리포좀은 하기의 방법으로 제조할 수 있다.
바람직하게는, 레시틴, 콜레스테롤 및 양이온성 인지질을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
상기 지질 필름 조성물에, 탈모 치료용 약물 용액을 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계; 및,
상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전물 상태의 나노 리포좀을 회수하는 제4단계;를 포함하여 상기 나노 리포좀을 제조할 수 있다.
또한 상기 마이크로버블은 하기의 방법으로 제조할 수 있다.
양쪽성 인지질, 콜레스테롤, 음이온성 지질, 아민기를 갖는 지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질을 클로로포름상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제A단계;
상기 제A단계에 글루코오스 용액을 넣어 초음파 처리하는 제B단계;
상기 제B단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제C단계; 및,
상기 제C단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물에 소수성 기체를 주입하여 마이크로 버블을 제조하는 제D단계;
를 포함하여 상기 마이크로버블을 제조할 수 있다.
이렇게 제조된 마이크로버블에 나노 리포좀을 혼합하여 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 형성할 수 있다.
이하 본 발명을 보다 자세하게 설명한다.
본 발명은 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 탈모 치료용 약물은 피나스테라이드(finasterid), 미녹시딜(Minoxidil), 두타스테리드(Dutasteride) 등에서 선택될 수 있으나, 이들 약물과 같은 기작을 하는 탈모 치료용 약물이라면 이용 가능하다. 또한 상기 탈모 치료용 약물은 바람직하게는 제2형 5-알파 환원 효소의 발현 또는 활성을 억제하여 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로의 전환되는 것을 저해하는 효능이 있는 것이라면 모두 선택될 수 있다.
상기 나노 리포좀은 레시틴(lecithin, α-phosphatidylcholin), 양이온성 인지질 및 콜레스테롤을 포함할 수 있으며, 이를 통해, 상기 레시틴, 양이온성 인지질 및 콜레스테롤이 나노 리포좀을 형성하는 막을 이룰 수 있다.
레시틴은 동/식물계에 널리 분포되어 있어 생체 적합성이 우수하며 그 안정성에 있어서도 이미 검증되어 식품과 제약의 전달체 기술에 널리 활용되고 있다. 또한 나노 리포좀의 크기 조절과 변형을 용이하게 하는 재료로 사용될 수 있다.
상기 양이온성 인지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE)을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 나노 리포좀은 중성의 물, 세포 배양액, 혈액 등에서 수 시간 이상 안정하게 분산될 수 있다.
본 발명의 마이크로버블은 양쪽성 인지질, 음이온성 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질을 포함할 수 있으며, 이들의 혼합물로 이루어진 지질 필름 조성물에 투입된 소수성 기체를 통해 버블을 형성하는 막을 이룸으로써 마이크로버블이 제조된다.
상기 양쪽성 인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1-미리스토일-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, MPPC) 및 1-미리스토일-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-myristoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, MSPC)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)을 사용하는 것이 좋다.
상기 음이온성 인지질은 디세틸 포스페이트(dicetyl phosphate, DCP), 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphate, DEPA), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate, DLPA), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate, DMPA) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate, DOPA)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 디세틸 포스페이트(DCP)를 사용하는 것이 좋다.
상기 양이온성 인지질로는 나노 리포좀 제조시 사용하는 것을 동일하게 사용할 수 있으며, 보다 자세하게는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE)을 사용하는 것이 좋다.
상기 다이설파이드기를 갖는 지질로는 DSPE-PEG-sPDP이라고도 하는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-2000-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 사용하는 것이 좋다.
* DSPE-PEG-sPDP : 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-
N-poly(ethyleneglycol)-2000-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate
DSPE-PEG-sPDP 지질은 하기의 화학식 1의 화학구조를 갖는 지질이다.
[화학식 1]
Figure 112018059479704-pat00001
마이크로버블의 제조를 위한 양쪽성 인지질 : 음이온성 인지질 : 콜레스테롤 : 양이온성 인지질 : 다이설파이드기를 갖는 지질의 혼합비율은 1~3mM : 0.1~0.3mM : 0.5~2mM : 0.1~0.3mM : 0.1~0.3mM일 수 있다. 이 때, 양쪽성 인지질 : 음이온성 인지질 : 콜레스테롤 : 양이온성 인지질 : 다이설파이드기를 갖는 지질로서, DPPC : DCP : cholesterol : DPPE : sPDP이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 DPPC : DCP : cholesterol : DPPE : sPDP이 2.0mM : 0.18mM : 0.9mM : 0.17mM : 0.17mM로 혼합될 수 있다.
마이크로버블 내의 상기 DSPE-PEG-sPDP 지질은 나노 리포좀과 결합할 때 가교제가 되어 나노 리포좀-마이크로버블 결합체로 결합될 수 있다.
상기 마이크로버블은 양쪽성 인지질, 음이온성 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 인지질 및 다이설파이드기를 갖는 지질의 혼합물의 버블링으로 유도된 것일 수 있다. 또한 상기 마이크로버블의 내부는 SF6, CO2, CF4 및 C3F8 에서 선택되는 소수성 기체가 내포된 것일 수 있다. 상기 소수성 기체는 바람직하게는 SF6인 것이 더 좋다.
상기 나노 리포좀은 100~200nm의 입자크기를 가질 수 있다. 나노 리포좀의 크기가 100 nm 미만일 경우, 탈모 치료용 약물이 상기 나노 리포좀에 봉입되기 어려울 수 있으며, 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 200 nm를 초과할 경우에도 상기 나노 리포좀이 포함된 조성물이 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 상기 마이크로버블은 1000~2000nm의 입자크기를 가질 수 있다. 이에 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체는 대략 1100~2200nm의 입자크기를 가질 수 있다.
본 발명은 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 조성물을 함유하는 탈모의 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 조성물은 남성호르몬인 5α리덕타제효소를 억제하여 디히드로테스토스테론(DHT)의 농도를 감소시킴으로써 탈모의 치료에 효과적이다.
본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 조성물의 제조방법에 있어서, 나노 리포좀을 제조하고 마이크로버블을 제조하여 이를 혼합함으로써 상기 결합체를 제조할 수 있다.
나노 리포좀 제조에 있어서, 상기 제1단계의 레시틴, 콜레스테롤 및 양이온성 인지질은 2 : 0.01~0.5 : 0.01~0.5 몰 비로 혼합될 수 있다. 이 때의 혼합비를 벗어나게 되면 나노 리포좀을 구성하는 지질의 제조가 잘 되지 않을 수 있다.
제2단계에서 탈모 치료용 약물은 0.01~1000ng/㎖의 농도로 지질 필름 조성물에 첨가될 수 있다. 탈모 치료용 약물 용액의 용매는 물 또는 알코올 일 수 있으며, 상기 알코올은 바람직하게는 에탄올 또는 이의 수용액일 수 있다.
상기 제3단계에서 동결하고 융해하는 과정은 1~12회 반복할 수 있다. 지질 필름 조성물을 동결하고 융해하는 단계를 반복함으로써 보다 균일한 크기의 나노 리포좀 분산액이 형성될 수 있고, 나노 리포좀의 약물 봉입 효율을 높일 수 있다. 단, 12회를 초과할 경우에는 나노 리포좀의 봉입 효율이 오히려 줄어들 수 있기 때문에 12회 이내가 바람직하다.
나노 리포좀과 마이크로버블의 결합을 위해, 본 발명에서 마이크로버블의 제조 시 제B단계에서 마이크로버블은 글루코오스 용액, 글리세롤 및 플로필렌 글리콜 중 1종 이상의 용액을 사용하여 안정화한 후 나노 리포좀과 혼합할 수 있다. 바람직하게는 글루코오스 용액을 사용하는 것이 좋다. 이 때, 글루코오스 용액은 1~20%(w/v)가 될 수 있다. 글루코오스의 농도가 20%(w/v) 초과될 경우에는 점성이 생겨 마이크로버블의 합성이 되지 않을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 함유하는 약학 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피부도포, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 피나스테라이드(finasterid), 미녹시딜(Minoxidil), 두타스테리드(Dutasteride) 등의 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 현재 탈모 치료체로 사용되고 있는 피나스테라이드와 같은 구강 투여제는, 구강투여로 인한 다양한 부작용이 발생하여 두피 도포를 통한 약물 전달이 가장 바람직하지만, 두피 도포만으로는 약물 자체가 모낭세포까지 잘 전달되지 않는다는 단점이 있다. 이 외에 피부 외용제로 사용되는 탈모 치료용 약물에 있어서도 각종 부작용이 있어 그 사용 농도를 보다 더 낮추어야 할 필요성이 있다.
따라서 전달 지지체를 활용하여 피나스테라이드의 약물전달 효율을 높이는 것이 중요하다. 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 이용할 경우, 낮은 농도로 처리되는 탈모 치료용 약물의 전달효율을 증강시킬 수 있어 남성형 탈모의 치료를 매우 효과적으로 수행할 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-1683463호에는 마이크로버블을 이용한 세포 내 약물전달체 기술이 개시되어 있기는 하지만 이는 항암제에 적용할 수 있는 기술로만 제한되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1054731호에는 피나스테라이드를 포함하는 나노입자와 이를 함유한 피부 외용제 조성물이 개시되어 있지만 나노 리포좀의 구조가 본 발명과는 달라 본 발명은 상기 기술과는 차별화된 기술임을 확인할 수 있다.
도 1은 모유두 진피 세포(dermal papilla cell, DPC)에 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 전달하여 초음파를 가했을 때, 세포막에 천공이 생기고 마이크로버블이 붕괴되면서 나노 리포좀이 세포 안으로 들어가는 것을 나타내는 모식도이다.
도 2의 왼쪽 사진은 200 nm 이하 크기를 나타내는 리포좀의 Cryo-EM 분석 이미지이며, 오른쪽 사진은 1 ~ 2 ㎛ 크기 버블의 광학 현미경 분석 이미지를 나타낸다.
도 3의 오른쪽 사진은 나노 리포좀-마이크로버블 결합체(HTP)를 통해 세포 내로 약물(형광체 포함)이 침투되었음을 나타내는 사진이며, 왼쪽은 이에 대한 대조군 처리 세포의 사진이다. 이 때 세포 사진의 상단 사진은 마이크로버블(HTP)의 초음파 활성 이미지를 나타낸다.
도 4의 왼쪽 그래프는 3T3 세포와 DPC 세포에 각각 테스토스테론(TS)를 처리하여 DPC에 세포독성이 있음을 제시하는 결과이며, 오른쪽 그래프는 DPC 세포에 HTP 단독처리, 또는, HTP와 테스토스테론(TS)을 처리하여도 세포독성이 거의 없음을 제시하는 결과이다.
도 5는 마우스에서 탈모를 유도시킨 후, 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블(HTP)을 마우스에 5회 처리 후, 발모 효과가 나타나는지를 1주 간격으로 사진으로 확인한 결과이다(대조군은 약물 무처리군, TS : 테스토스테론, HTS: 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블, NL : 비교예 1의 리포좀)
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 제작>
실시예 1-1. 나노 리포좀 제작
레시틴(Lecithin, Sigma Aldrich), 콜레스테롤(Cholesterol, Sigma Aldrich) 및 양이온성 인지질로서 DPPE(Sigma Aldrich)를 2 : 0.1 : 0.05 몰 비로 클로로포름(chloroform) 상에서 섞은 후 회전 농축기를 활용하여 지질필름(lipid film)화 하였다.
여기에 피나스테라이드를 넣고 초음파를 가하며 혼합하였다. 액체질소를 활용하여 동결하고 융해하는 과정(freeze thaw cycle)을 5차례 반복하고 이후 초음파(probe 방식) 처리하여 좀 더 작은 사이즈이면서도 균일한 상태의 나노 리포좀 조성물을 제작하였다.
이후 원심분리 방법으로 침전된 나노 리포좀 조성물(lipid의 총량 20.43mg)을 회수하여 5%(w/v) 글루코오스 수용액에 분산시켰다. 한편, 나노 리포좀 제조 전 피나스테라이드 용액과 나노 리포좀 제조 후 남겨지는 용액에서의 피나스테라이드 농도를 확인하여 나노 리포좀 내 약물 봉입율을 계산한 바 60% 이상 되는 것으로 확인되었다.
실시예 2-2. 마이크로버블 제작
양쪽성 인지질로서 DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glyerto-3-phosphocholine, Sigma Aldrich) 15.4mg, 콜레스테롤(Cholesterol, Sigma Aldrich) 3.48mg, 음이온성 인지질로서 DCP(dicetyl phosphate, Sigma-Aldrich) 1mg, 양이온성 인지질로서 DPPE(1,2-dipalmitorysn-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, Sigma Aldrich) 1.2mg 및 다이설파이드기를 갖는 지질로서 DSPE-PEG-sPDP(1,2-distearoly-sn-phosphoethanolamine-N-[PDP(polyethylene glycol)], Avanti polar) 5mg를 클로로포름(chloroform) 1mL 상에서 혼합한 후 회전 농축기를 활용하여 마이크로버블 합성을 위한 지질 필름(lipid film)화 하였다.
그 다음 5%(w/v) 글루코오스 수용액 1㎖을 넣어 초음파를 가하여 혼합하였다. 액체질소를 활용하여 동결하고 융해하는 과정(freeze thaw cycle)을 3차례 반복하고 이후 초음파(probe 방식) 처리한 후, SF6 기체를 충진하여 분산 상태의 마이크로버블 조성물을 제조하였다.
실시예 2-3. 나노 리포좀-마이크로버블 제작
실시예 2-1에서 제조된 나노 리포좀(20.53mg/mL) 1mL과 실시예 2-2의 마이크로버블(26.08mg/mL) 0.5mL을 혼합(2 : 1 부피비)하여 나노 리포좀과 마이크로버블이 글루코오스 수용액에 분산된 상태가 되게하였다.
이 후 장비(Tianjin Iris)를 사용하여 15초 동안 강한 진동 효과[Mixing frequency : 4500 tr/mn (cpm ; 분 당 m3 이송량 단위)]를 주어 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 형성시켰고, 이후 5% 글루코오스 수용액에 분산된 상태로 냉장보관하였다.
이렇게 최종 제조된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 이하 '실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체'또는 Hair loss therapeutic particle (HTP)라 하였다.
<비교예 1. 나노 리포좀>
실시예 2-1에 기재된 방법으로 나노 리포좀을 제조하여(마이크로버블 미결합) 비교예 1의 조성물로 사용하였다.
<실험예 1. 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 크기 및 표면전하 확인>
실시예 2-1과 2-2에서 제조한 나노 리포좀, 마이크로버블을 이미지화하여 도 2에 나타내었다. 도 2의 왼쪽은 나노 리포좀을, 오른쪽은 마이크로버블을 촬영한 사진으로 각각 적절한 크기로 제조된 것을 알 수 있다.
또한 이 나노 리포좀과 마이크로버블을 결합한 나노 리포좀-마이크로버블 결합체들의 크기를 Dynamic Light Scattering(DLS)로 측정한 바, 평균 크기는 1100nm 내외로 확인되었고, 표면전하는 +2.25mV였다. 비교예 1(실시예 2-1)의 마이크로버블 결합체가 붙지 않은 나노 리포좀 자체만의 크기는 98nm였고, 이의 표면 전하는 +1.75mV였다. 모유두 진피 세포 내로 나노 리포좀을 전달하기 위해서는 표면전하값이 양전하인 것이 좋은데, 마이크로버블 결합체 자체가 -0.91mV인 것으로 확인되었음에도 불구하고, 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 표면전하를 낮추지 않고 오히려 더 높은 양전하 값을 가짐을 알 수 있다. 이에 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 세포 전달용 조성물로 이용하기에 적합함을 판단할 수 있다.
<실험예 2. 세포 생존 및 침투 여부 확인>
실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 모유두 진피 세포로의 유입을 확인하기 위해, 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 DPC 세포에 2시간 동안 피나스테라이드 기준 100ng/㎖ 농도로 처리 후 도 3에 공초점 형광 현미경 사진을 나타내었다. 이 때 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 제조 중에 나노 리포좀 지질에 형광체 RITC(red) 형광 dye를 도입하여 이를 확인하였다.
도 3에서 파란색은 DNA 염색 사진, 붉은색은 RITC의 형광사진으로, 대조군에서는 붉은색이 전혀 나타나지 않으나, 오른쪽에서는 세포질 내 붉은색과 핵(DNA) 내의 파란색이 merge 되어 나타난다. 따라서 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 처리로 인해 모유두 진피 세포 내로 피나스테라이드가 봉입된 나노 리포좀이 잘 주입되어 있음을 알 수 있다.
한편, 제조된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체(HTP)에 마이크로버블이 온전히 결합된 상태임을 확인하기 위해 초음파 영상으로 확인하였는데, HTP의 용액에 마이크로버블로 인한 갈색띠가 나타나는 것으로 확인되었다(도 3의 상단 사진).
<실험예 3. 세포 생존율 확인>
세포 생존율의 확인은 WST-1 어세이(EZ-cytox Cell Viability Assay Kit)를 통해 진행하였다. 모유두 진피 세포(DPC)와 3T3 섬유아세포를 96well plate에 1x104/well의 밀도로 24시간 배양하였다. 여기에 테스토스테론이 200μM로 처리된 배지로 교체하고 다시 24시간 후 그대로 WST-1 시약을 첨가하였다. WST-1 시약을 배양액의 10% 넣고, 1시간 후에 460 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존 및 증식을 대조군(비처리군)과 비교하였다. 세포 생존 평가는 테스토스테론 처리 후 4일 동안 24시간을 주기로 측정하였다.
이 결과는 도 4의 왼쪽에 나타내었는데, DPC 세포가 3T3 세포에 비해 시간이 흐를수록 사멸하는 정도가 크게 증가하여 테스토스테론의 증가에 따른 탈모과정을 제시할 수 있는 모델이 잘 확립되었음을 알 수 있다.
다음으로는 같은 방법에서 테스토스테론 처리 전 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체(HTP) 처리 후, 테스토스테론이 200μM로 처리된 배지로 교체하고 이후의 과정을 동일하게 하여 세포의 상태를 확인하였다. 비교군에는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체(HTP)만 단독 처리하였다.
이에, 도 4의 오른쪽 그래프를 확인하면, 이 때, 나노 리포좀-마이크로버블 결합체(HTP) 단독 처리군에서나 나노 리포좀-마이크로버블 결합체와 테스토스테론이 모두 처리된 군(TS+HTP)에서도 독성없이 세포가 잘 자람을 보여주고 있다.
따라서 이러한 결과는 본 발명의 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 내에 피나스테라이드가 잘 봉입되어 이 약물이 갖는 기능성을 최적으로 발휘할 수 있는 상태임을 보여주며, 또한 상기 결합체가 모유두 세포에서 테스토스테론에 의한 세포 사멸로 인한 탈모과정을 효과적으로 억제할 수 있음을 뜻한다.
<실험예 4. 마우스 모델에서의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 탈모 억제 효과 확인>
6주령 마우스(C57BL/6J)를 동물용 제모기(philips)와 제모크림(Veet)를 이용하여 마우스 등의 털을 제모한 후, 테스토스테론을 프로필렌글리콜과 에탄올의 혼합용액(3 : 7(v : v))에 녹이되, 30㎍/㎖ 농도로 매일 도포하여 사람의 탈모와 유사한 환경으로 만들어주었다.
이 실험에서 각 실험군은 하기와 같다(테스토스테론은 모두 피부도포 함).
① 대조군(무처리군);
② 테스토스테론 처리군;
③ 테스토스테론 처리 이 후 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 피부도포 처리군;
④ 테스토스테론 처리 이 후 시판 피나스테라이드 용액 경구투여 처리군;
⑤ 테스토스테론 처리 이 후 시판 피나스테라이드 용액 피부도포 처리군;
⑥ 테스토스테론 처리 이 후 비교예 1의 나노 리포좀 피부도포 처리군;
⑦ 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 피부도포 처리군;
나노 리포좀-마이크로버블 결합체(HTP)로는 나노 리포좀과 마이크로버블 2 : 1 비율로 결합되어 분산된 것을 사용하였다. 이것을 피나스테라이드 총량으로 1㎍씩 마우스의 제모된 등 전체에 플라스틱 스패츌러로 200㎕씩 도포하고 3분 후, 의료용 초음파 기기를 이용하여 초음파에 노출시켰다. 이 때, 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체는 1일 간격으로 5회 처리하였다. 같은 조건이되 실시예 2나 비교예 1의 용액 대신 시판 피나스테라이드 용액을 처리한 군에서는 총 피나스테라이드의 함량을 맞추었다.
이 때, 상기 나노 리포좀-마이크로버블 결합체는 1일 간격으로 5회 처리하였다. 같은 조건이되 실시예 2나 비교예 1의 용액 대신 시판 피나스테라이드 용액을 처리한 군에서는 총 피나스테라이드의 함량을 맞추었다. 시판 피나스테라이드 용액이 경구투여제이기 때문에 이를 비교하기 위한 경구투여군에는 바르는 용량보다 10배의 용량을 투여하였고, 피부도포하는 것과 투여시간과 횟수를 동일하게 하였다.
이에 대한 결과는 도 5에 나타내었는데, 도 5에서, 대조군은 약물 무처리군이고, 각 약어 중, TS : 테스토스테론, HTS: 실시예 2의 나노 리포좀-마이크로버블, NL : 비교예 1의 리포좀을 나타낸다.
도 5의 결과를 참고하면, 대조군(①)에서는 아무 처리도 되지 않아 시간의 흐름에 따라 털이 자연스럽게 자랐고, 테스토스테론만 처리한 군(②)에서는 털이 거의 자라지 않았다.
반면 테스토스테론 처리 후 실시예 2 조성물을 처리한 군(③)에서는 털이 잘 자라고 있는 것을 확인할 수가 있었다.
이와 달리 테스토스테론 처리 후 시판 피나스테라이드 약물을 경구투여한 군(④) 또는 피부도포한 군(⑤)은 7주 째에 막 털이 자라려고 하는 것이 보였을 뿐이었다.
테스토스테론 처리 후 마이크로버블이 결합되지 않은 비교예 1의 리포좀을 처리한 군(⑥)에서는 테스토스테론만 처리한 비교군처럼 털이 거의 자라지 않은 것을 알 수 있는데, 이는 탈모 치료 약물이 리포좀에 봉입되어 있어서 시판 약물보다 체내전달력이 오히려 더 떨어지기 때문인 것으로 확인되었다. 이 결과를 통해 리포좀이 마이크로버블을 통해 생체막 내로 전달되어 약물을 전달하는 과정이 필수적임을 입증할 수 있다.
도 5의 사진 상에는 나타나지 않았지만 실시예 2 조성물(HTP)만 처리한 군도 대조군과 유사하게 털이 자라 특별한 독성 등의 부작용은 보이지 않는 것으로 나타났다.
따라서, 이상과 같은 결과는 본 발명의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체가 남성형 탈모의 치료에 매우 효과적임을 제시한다.

Claims (7)

  1. 피나스테라이드(finasterid) 및 두타스테리드(Dutasteride) 중에서 1종 이상 선택된 탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체로서,
    상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이 포함된 것이고,
    상기 마이크로버블은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 디세틸 포스페이트, 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-2000-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 포함하는 것이며,
    상기 결합체가 1100~2100nm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 탈모 치료용 약물은 제2형 5-알파 환원 효소의 발현 또는 활성을 억제하여 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론으로의 전환되는 것을 저해하는 효능이 있거나,
    모유두 진피 세포의 사멸을 억제하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 따른 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 함유하는 것을 특징으로 하는 탈모 치료용 약학 조성물.
  7. 레시틴, 콜레스테롤 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
    상기 지질 필름 조성물에, 피나스테라이드(finasterid) 및 두타스테리드(Dutasteride) 중에서 1종 이상 선택된 탈모 치료용 약물 용액을 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
    상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계; 및,
    상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전물 상태의 나노 리포좀을 회수하는 제4단계;
    를 포함하여 제조된 나노 리포좀과,
    1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 콜레스테롤, 디세틸 포스페이트, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-폴리(에틸렌글리콜)-2000-N-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 클로로포름상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제A단계;
    상기 제A단계에 글루코오스 용액을 넣어 초음파 처리하는 제B단계;
    상기 제B단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제C단계; 및,
    상기 제C단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물에 소수성 기체를 주입하여 마이크로 버블을 제조하는 제D단계;
    를 포함하여 제조된 마이크로버블을 혼합하여 1100~2100nm의 입자크기를 갖는 나노 리포좀-마이크로버블 결합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 제1항의 나노 리포좀-마이크로버블 결합체의 제조 방법.
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