KR101857603B1 - 회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 검출 방법에 관한 것으로서, 회전환 증폭을 사용하여 증폭된 표적 miRNA 포함 DNA를 형광 표지된 PNA와 반응시키고, 산화그래핀에 미반응 탐침자를 부착시켜 표적 miRNA를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은, 기존의 qRT-PCR 방법을 이용하는 경우보다 민감도가 뛰어나므로, 표적 miRNA 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 검출 방법{Method for fluorometric detection of microRNA using rolling circle amplication}

본 발명은 회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 회전환 증폭을 통해 표적 miRNA를 포함하도록 중합시킨 DNA와 탐침자를 반응시켜 검출하는 방법에 관한 것이다.

마이크로RNA(miRNA)는 표적 mRNA의 3'비번역 부위(untranslated region)에 결합하여 내생(endogenous) 유전자 조절인자(regulator)와 같이 중요한 역할을 수행하는 단일가닥(ss)의 작은 비-암호화된 25개 이하의 뉴클레오티드로 구성된 RNA이며, 표적 mRNA의 단백질 발현에 있어서 분해(degradation) 및 조절을 일으킨다. 이는 세포의 증식, 분화, 스트레스 저항 및 세포사멸과 같은 다양한 생물학적 프로세스 내에서 수반되기 때문에, miRNA는 악성 종양을 포함하는 인간 질병의 발병과도 밀접하게 연관되어 있다(비특허문헌 1-4).

혈청(serum), 플라즈마 및 혈액 전체에 존재하는 miRNA에 있어서, 이의 검출은 생물학적인 기능을 이해하고 암을 진단하기 위해서 중요하게 여겨진다(비특허문헌 5-6). 노던 블랏(northern blot) 기술 및 마이크로어레이는 실시간 PCR만큼 현재 기본적인 miRNA 검출 방법으로 사용되고 있으나, 감도가 낮고 선택성이 낮으며, 많은 노동력을 필요로 하는 단계라는 한계가 있다(비특허문헌 7-10). miRNA의 독특한 특성으로는, 짧은 길이, 낮은 존재비(abundance) 및 miRNA 패밀리 중에서의 서열 상동성(homology)을 포함하며 이 때문에 분석하기가 어렵다.

최근 분석 감도 및 선택성을 개선하기 위해 개발된, miRNA를 증폭하기 위해 형광 발광 표지 분석 및 나노입자-증폭 검출 방법을 포함하는 몇 가지 화학 또는 효소적 변형(modification) 방법들이 사용되어왔다(비특허문헌 11-15). 특히, 회전환 증폭(RCA)은 DNA, RNA 및 단백질의 검출에 흔히 사용되는 방법이다. RCA는 탠덤 반복(tandem repeats)으로 긴 ssDNA 분자를 합성하는 데 사용되는 등온 효소적 공정이다. 공정의 간소함과 높은 감도 및 특이성으로 인하여, RCA는 바이오센서, 진단 및 유전체학과 같은 다양한 적용분야에 있어서 유망한 DNA 증폭 도구로 간주된다(비특허문헌 16).

그래핀 옥사이드(GO)는 수용성의 그래핀 유도체이며, 탄소, 산소 및 수소로 구성되어있다. GO는 단일가닥 핵산과 수소결합 및 파이-겹침 상호작용(pi-stacking interactions)으로 인해 높은 친화도를 보이지만 핵염기가 이중나선의 내부에 숨어있기 때문에 이중가닥 핵산과의 친화도는 낮다(비특허문헌 17-18). 게다가, GO는 GO 분자의 형광단(fluorophore)으로부터 파이-시스템(pi-system)까지의 장거리(long-range) 에너지 이동을 통해 효율적으로 인근의 형광 발광을 소광(quench)시킨다(비특허문헌 19).

이러한 특성에 따라, 최근 GO는 형광으로 표지된 단일-가닥 올리고 뉴클레오티드를 이중-가닥 핵산으로부터 구별하기 위한 형광 소광 물질로 사용되어왔다(비특허문헌 20-22). DNA 또는 RNA와 유사하도록 인공적으로 합성된 핵산인 단백질 핵산(Peptide nucleic acids, PNA)은 기존에 GO-기반 분석에서 프로브 올리고뉴클레오티드로 사용되었다(비특허문헌 23-24). PNA에서 인산화 그룹(phosphate group)이 부족하면 전하 반발(charge repulsion)의 제거에 의해 그의 상보적 핵산과의 강한 혼성화가 일어난다(비특허문헌 25).

관련 종래기술로서, 한국공개특허 제10-2006-0073815호(2006.06.29.)에서는 헤어핀 구조와 2차 프라이머를 이용하는 회전환 증폭 방법을 개시하고 있으며, 한국공개특허 제10-2013-0044289호(2013.05.02.)에서는 내열성 단백질을 이용하여 고온 등온 조건에서 핵산을 증폭할 수 있는 방법을 개시하고 있다.

한국등록특허 제10-0957057호(2010.05.03.) 한국공개특허 제10-2013-0044289(2013.05.02.) 한국등록특허 제10-1425724호(2014.07.25.) 미국공개특허 제2015-0080251호(2015.03.19.) 한국공개특허 제10-2006-0073815호(2006.06.29.)

Nat. Rev. Cancer. 2006, 6, 259-269 Cancer Res. 2007, 67, 4553-4555 Cancer Chemother. Pharmacol. 2014, 74, 1105-1111. Clin. Lung Cancer. 2009, 10, 42-46. Cell Res. 2008, 18, 997-1006 Mol. Cancer. 2010, 9, 306. Nucleic Acids Res. 2004, 32, e175. Nat. Methods. 2004, 1, 47-53 RNA. 2005, 11, 1461-1470. Nucleic Acids Res. 2005, 33, e179. Chem. Commun. 2015, 51, 2156-2158 Chem. Int. Ed. 2009, 48, 3268-3272 Chem. Commun. 2012, 48, 194-196. Chem. Commun. 2014, 50, 3292-3295 Bioconjug. Chem. 2015, 26, 602-607. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 6330-6337. Nano Lett. 2009, 9, 1058-1063. Analyst. 2013, 138, 1745-1749. Chem. Phys. 2008, 129, 054703. Langmuir 2014, 30, 12587-12595. Chem. Commun. 2015, 51, 5641-5643. Chem. Commun. 2015, 51, 6960-6963. Science. 1991, 254, 1497-1500. Chem. Commun. 2013, 49, 9203-9205. Nature. 1993, 365, 566-568. Oncogene. 2007, 26, 2799-2803.

본 발명자들은 miRNA의 검출 방법에 대하여 연구하던 중, 회전환 증폭 방법을 사용하여 증폭된 miRNA 포함 DNA를 형광 표지된 PNA와 반응시켜 산화그래핀에 미반응 PNA를 부착시키면 검출에 유용하다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 회전환 증폭 방법을 사용하는 miRNA의 형광 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, a) 회전환 증폭 방법을 통해 표적 miRNA를 등온증폭시킨 단일가닥 DNA를 준비하는 단계; b) 상기 단일가닥 DNA를 포함하는 시료에 형광 표지된 PNA 탐침자를 혼합하는 단계; c) 상기 혼합 이후 단일가닥 DNA에 결합되지 않은 PNA 탐침자를 산화그래핀에 흡착시키는 단계; 및 d) 시료의 형광 발현을 측정하는 단계를 포함하는 회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 검출 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭을 위해 표적 miRNA에 상보적으로 설계된 패드락 프로브 DNA(padlock probe DNA)인 회전환 주형에 상기 표적 miRNA가 프라이머로 혼성화될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭에서 DNA 중합에 phi29 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 miRNA는 1 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 상기 형광 표지된 PNA 탐침자는 FITC, ATTO550 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광단으로 표지될 수 있으며, 상기 miRNA는 정량적으로 검출되고, 상기 miRNA의 검출 한계는 0.4 pM일 수 있다.

본 발명의 일 태양에 따라, a) 다수의 시료에 대하여 회전환 증폭 방법을 통해 표적 miRNA를 등온증폭시킨 단일가닥 DNA를 각각 준비하는 단계; b) 상기 단일가닥 DNA를 포함하는 시료에 형광 표지된 PNA 탐침자를 혼합하는 단계; c) 상기 혼합 이후 단일가닥 DNA에 결합되지 않은 PNA 탐침자를 산화그래핀에 흡착시키는 단계; 및 d) 시료의 형광 발현을 측정함으로써 표적 miRNA가 포함된 시료를 선별하는 단계를 포함하는 회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 다중검출 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭을 위해 표적 miRNA에 상보적으로 설계된 패드락 프로브 DNA(padlock probe DNA)인 회전환 주형에 상기 표적 miRNA가 프라이머로 혼성화될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭에서 DNA 중합에 phi29 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 miRNA는 1 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 상기 형광 표지된 PNA 탐침자는 FITC, ATTO550 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광단으로 표지될 수 있으며, 상기 miRNA는 정량적으로 검출되고, 상기 miRNA의 검출 한계는 0.4 pM일 수 있다.

본 발명에 의해, 회전환 증폭을 사용하는 miRNA의 형광 검출 방법이 기존의 qRT-PCR 방법을 이용하는 경우보다 민감도가 뛰어나다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 회전환 증폭을 사용하는 miRNA의 형광 검출 방법은 표적 miRNA 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 RCA-기반의 miRNA 증폭 방법 및 그래핀 옥사이드(GO)-기반의 형광 분석 방법을 사용한 miRNA 검출 공정의 모식도를 나타낸다.
도 2는 회전환 증폭을 통한 GO-기반 형광 분석의 개시를 나타낸다. (a) 회전환 주형의 원형화; (b) 전기영동을 통한 RCA 산물의 확인; 및 (c) RCAP 16 또는 21의 존재 여부에 따른 FITC-표지된 PNA21의 형광 방출을 나타낸 그래프.
도 3은 형광 소광에 필요한 GO의 농도를 시각화한 그래프이다.
도 4는 GO-기반 형광 miRNA 검출의 민감도를 측정하기 위하여 miRNA를 10 nM부터 단계적으로 희석하여 측정한 형광 스펙트럼이다. (a) miRNA의 농도 변화에 따른 형광 방출 스펙트럼; 및 (b) 형광 강도와 miRNA 농도 로그 값 사이의 선형 상관관계.
도 5는 세포 내 RNA 샘플에 존재하는 miRNA21의 검출 결과를 나타낸다. (a) miRNA의 농도 변화에 따른 형광 방출 스펙트럼; 및 (b) 형광 강도와 miRNA 농도 로그 값 사이의 선형 상관관계.
도 6은 qRT-PCR 및 GO-기반 형광분석 두 가지의 방법을 사용한 다양한 농도의 miRNA 검출 비교 결과를 나타낸다. (a) qRT-PCR 방법을 사용한 miRNA21의 농도 증가 대비 형광 강도 증가 그래프; (b) GO-기반 miRNA 형광 검출 방법을 사용한 miRNA21의 농도 증가 대비 형광 강도 증가 그래프; 및 (c) miRNA21의 농도에 따른 상대적 형광 강도의 대조 그래프.
도 7은 RCAP의 전기영동 분석 결과 DNA 밴드의 길이가 회전환 증폭 여부를 나타낸다.
도 8은 멀티웰 플레이트를 이용한 GO-기반 형광 miRNA 검출 시스템의 특이성을 나타낸다. (a) 각각 다른 형광단으로 표지한 F-PNA의 miRNA 특이성 확인 그래프; (b) 각각 다른 형광단으로 표지한 F-PNA의 miRNA 혼합물 중 특이적 miRNA와의 결합 확인 그래프; 및 (c) 멀티웰 플레이트를 사용한 miRNA 다중 검출 결과.
도 9는 단일 염기 서열변이를 포함하는 miRNA를 사용한 GO-기반 형광 miRNA 검출 결과를 나타낸다. (a) 야생형 miRNA 서열, 단일 염기 서열변이(붉은색 서열)된 miRNA 서열 및 이에 부합하는 RCT21 DNA 서열(파란색 서열); (b) 전기영동을 통해 확인한 RCAP 밴드의 길이 확인 결과; 및 (c) RCT21 및 F-PNA21의 결합에 의한 형광 검출 결과.

본 명세서에서, "phi29 DNA 중합효소"라 함은 다른 중합효소와는 달리 가닥변위(strand displacement) 활성을 가지고 있기 때문에 중합이 진행되는 중에 먼저 중합이 진행된 서열을 만나면 그 서열을 분해하는 것이 아니라 단일사슬로 풀어내면서 계속 중합해나가는 효소를 의미한다.

본 발명은 a) 회전환 증폭 방법을 통해 표적 miRNA를 등온증폭시킨 단일가닥 DNA를 준비하는 단계; b) 상기 단일가닥 DNA를 포함하는 시료에 형광 표지된 PNA 탐침자를 혼합하는 단계; c) 상기 혼합 이후 단일가닥 DNA에 결합되지 않은 PNA 탐침자를 산화그래핀에 흡착시키는 단계; 및 d) 시료의 형광 발현을 측정하는 단계를 포함하는 회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭을 위해 표적 miRNA에 상보적으로 설계된 패드락 프로브 DNA(padlock probe DNA)인 회전환 주형에 상기 표적 miRNA가 프라이머로 혼성화될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭에서 DNA 중합에 phi29 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 miRNA는 miRNA21일 수 있다.

상기 miRNA는 1 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 바람직하게는 10 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 더욱 바람직하게는 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 형광 표지된 PNA 탐침자는 FITC, ATTO550 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광단으로 표지될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 miRNA는 정량적으로 검출되고, 상기 miRNA의 검출 한계는 0.4 pM일 수 있다.

본 발명은 a) 다수의 시료에 대하여 회전환 증폭 방법을 통해 표적 miRNA를 등온증폭시킨 단일가닥 DNA를 각각 준비하는 단계; b) 상기 단일가닥 DNA를 포함하는 시료에 형광 표지된 PNA 탐침자를 혼합하는 단계; c) 상기 혼합 이후 단일가닥 DNA에 결합되지 않은 PNA 탐침자를 산화그래핀에 흡착시키는 단계; 및 d) 시료의 형광 발현을 측정함으로써 표적 miRNA가 포함된 시료를 선별하는 단계를 포함하는 회전환 증폭을 이용한 miRNA의 형광 다중검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭을 위해 표적 miRNA에 상보적으로 설계된 패드락 프로브 DNA(padlock probe DNA)인 회전환 주형에 상기 표적 miRNA가 프라이머로 혼성화될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 a)의 회전환 증폭에서 DNA 중합에 phi29 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 miRNA는 miRNA21일 수 있다.

상기 miRNA는 1 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 바람직하게는 10 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있고, 더욱 바람직하게는 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 형광 표지된 PNA 탐침자는 FITC, ATTO550 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광단으로 표지될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 miRNA는 정량적으로 검출되고, 상기 miRNA의 검출 한계는 0.4 pM일 수 있다.

검출을 위해 만들어진 miRNA는 RCA(rolling circle amplification, 회전환 증폭)를 사용하여 등온 증폭된다(도 1). 여기서, 패드락 프로브 DNA(padlock probe DNA)로 작용하는 회전환 주형(RCT, rolling circle template)은 표적 miRNA의 양 말단에 상보적으로 설계된다. 표적 miRNA 존재하에서, RCT는 주형으로 사용되어 혼성화되고, T4 DNA 연결효소의 추가에 의해 원형을 형성할 수 있다.

RCA는 phi29 DNA 중합효소에 의해 개시되고, 상기 원형 DNA를 주형으로 사용하며, miRNA는 DNA 합성의 프라이머가 될 수 있다. RCA 공정에서는, 긴 ssDNA 서열이 합성되고, 표적 miRNA 서열의 다중 카피를 생산할 수 있다. 그러나, 표적 miRNA가 존재하지 않을 경우, 원형의 DNA 형성 및 phi29 DNA 중합효소에 의한 긴 ssDNA의 합성은 일어나지 않는다. 그러므로 표적 miRNA의 존재하에서 합성되는 RCAP(rolling circle amplification product)는 GO 및 F-PNA를 사용하는 형광-소광 플랫폼을 통한 검출 대상이 된다(도 1).

표적 miRNA에 상보적으로 설계된 F-PNA는, F-PNA/RCAP 이원분자(duplex molecule)를 형성하기 위해 RCAP의 다중 부위에서 어닐링(annealing)될 수 있다. miRNA의 존재하에서의 F-PNA/RCAP 혼성체의 형성에 있어서, F-PNA 탐침자와 혼성화된 이원분자 형태는 GO 단일층에 흡착할 수 없고, 그러므로 상기 F-PNA 형광 발광은 소광되지 않는다. 표적 miRNA가 존재하지 않고 이에 따라 부합하는 RCAP가 형성되지 않을 경우, 자유 단일-가닥 F-PNA 탐침자가 GO 단일층 표면에 흡착하게 되고, 유의성 있는 형광이 GO에 의해 발현될 수 있다. 그러므로 miRNA를 포함하는 반응물에 GO를 추가한 후 간단하게 형광 신호를 측정함으로써 정량적인 검출이 가능하다.

상기 분석을 수행하기에 앞서, 본 발명에서 사용되는 GO의 균일한 단일층 구조를 확인하기 위해 원자력현미경(atomic force microscopy, AFM)을 사용할 수 있다. 최고의 실험조건 설정을 위해 표적 miRNA로서 miRNA21을 선택할 수 있는데, 이는 miRNA21이 많은 폐암 환자들로부터 과발현되기 때문이다(비특허문헌 26). miRNA16은 데이터 정상화를 위한 기준 miRNA로 사용된다(비특허문헌 6). 먼저 RCA를 위해 주형과 같은 원형의 DNA를 형성한다. 원형의 DNA는 표적 miRNA(miRNA21)의 존재하에서만 표적 miRNA에 상보적인 선형 DNA(RCT21)의 결찰을 통해서 형성된다(도 2a).

RCT21의 양 말단 전부가 miRNA21에 상보적이기 때문에, RCT21의 말단 단편은 결찰 반응을 통해 연결되고, 원형의 DNA를 형성한다. 반면에, RCT21이 miRNA16과 혼합되면, 단일 RCT21 밴드만이 관찰된다(lane 3). 핵산말단가수분해효소 I을 분해에 사용하여 원형 DNA 형성을 추가적으로 확인할 수 있는데, 이는 3'에서 5'위치에서의 ssDNA를 분해하나 이중-가닥 또는 원형 DNA는 분해하지 못한다. RCT21는 결찰 반응 혼합물(lane 4) 및 온전하게 남겨진 원형 DNA에 부합하는 밴드(lane 2)에 핵산말단가수분해효소 I을 추가함으로써 분해된다. 이는 표적 miRNA의 존재하에서 RCT 특이적으로 발생하는 원형 형성으로 나타난다.

다음으로는 표적 miRNA 서열이 결찰 이후의 RCA를 통해 특이적으로 증폭되는지를 확인할 수 있다. 결찰 및 RCA는 표적 miRNA21 또는 비표적 miRNA16의 존재하에서 일어날 수 있다. 거대한, 고 분자량의 DNA 분자는 miRNA21의 존재하에서만 관찰되고, RCA에 의해 발생 가능한 표적 miRNA21 서열의 다중 카피들을 포함하는 긴 ssDNA인 RCAP를 제시한다(도 2b, lane 3). 반대로, 이 거대한 DNA 산물은 miRNA21의 부재 또는 비표적 miRNA16(lane 1 및 2 각각)의 존재하에서 관찰되지 않을 수 있다. 이러한 결과는 패드락 주형 및 상보적인 서열과 부합하는 miRNA의 존재하에서만 일어나는 결찰 및 RCA 반응에 의한 것일 수 있다.

GO-기반 형광 검출 시스템을 개시하기 위해서, 다양한 RCAP 및 GO를 F-PNA21(F-PNA21; miRNA21에 상보적인) 혼합물에 추가함으로써 FITC-표지된 PNA21에서의 형광 변화를 모니터링할 수 있다(도 2c). F-PNA21만을 포함하는 용액에 GO가 추가되면, 형광이 현저하게 소광될 수 있다. 반면에, F-PNA/RCAP21 혼성체에 GO가 추가되면 형광 소광이 일어나지 않는다.

F-PNA가 부합하는 ssDNA와 혼성화되면, PNA의 형광은 ssPNA보다 더 강해질 수 있다. 음성 대조군으로서, miRNA16 서열 다중 카피의 RCAP15 또한 F-PNA21(RCAP16과 상보적이지 않은)과 함께 인큐베이션하였다. GO 존재하에서 F-PNA21 및 RCAP16의 혼합물의 형광은 F-PNA21 및 RCAP21의 혼합물에 비하여 유의성 있게 소광될 수 있다. 추가적으로, miRNA21이 존재하지 않는 RCA 반응 혼합물에서의 F-PNA의 형광 또한 RCAP16과 유사한 정도로 소광될 수 있다.

F-PNA 탐침자로부터의 백그라운드 형광 및 표적 miRNA 서열과 혼성화된 F-PNA 탐침자의 소광되지 않은 형광 사이의 형광 신호의 차이를 증가시키기 위해서, GO의 최적의 농도를 3 ~ 10 μg/mL로 결정할 수 있다(도 3).

다음으로, GO-기반 miRNA 검출 방법의 민감도를 평가하기 위해, miRNA21의 농도 증가(0 ~ 10 nM)에 따른 형광 강도를 측정할 수 있다. 도 4는 사이의 형광 강도와 miRNA21 농도의 로그 값 사이의 관계를 나타낸다. RCAP21의 형광 강도는 증가하는 miRNA의 농도와 함께 서서히 증가하고, 1 fM에서 50 pM까지 선형의 상관관계를 나타낸다(도 4b). 검출한계(LOD)는 신뢰수준(confidence level)이 1 %인 LOD = 3.3 X (SD/S)의 방정식으로부터 추정되었고, SD는 반응의 표준편차(standard deviation)이며 S는 선형 영역에서의 표준 곡선(standard curve)의 경사이다. LOD는 0.4 pM에서 계산하였으며, 이는 본 발명에 따른 방법이 miRNA를 0.4 pM까지 검출할 수 있음을 나타낸다.

또한 세포 내 RNA의 혼합물 중에서 miRNA21의 양을 정량하였다. 세포 내 전체 RNA는 배양된 폐암 세포(A549 cells)로부터 준비하였고, 1 μg의 샘플은 다양한 농도(0 ~ 100 nM)로 합성된 miRNA21과 배치되었으며, 이후 RCAP21에 상보적인 F-PNA의 형광 강도를 측정하였다. 세포 내 RNA 혼합물에서 miRNA21 농도의 로그 값 증가가 수반하는 F-PNA 형광의 정량적인 증가는 5 fM에서 50 pM까지 선형의 상관관계를 나타냈다(도 5). 전체 RNA 샘플을 위한 GO-기반 miRNA 검출에서 LOD는 0.7 pM이었다. 이러한 결과를 다양한 농도의 miRNA21과 함께 전체 세포의 RNA를 포함하는 동일한 샘플을 사용하여 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)과 비교하였다(도 6). GO-기반 miRNA 검출 시스템은 낮은 농도(100 pM 미만)에서 표적 RNA의 정량 검출을 위한 qRT-PCR보다 뛰어남을 알 수 있었다. 이러한 결과는 miRNA가 현대의 qRT-PCR로는 도달 불가능한 높은 민감도로 RCA에 의한 miRNA 서열의 등온 증폭을 통하여 GO-기반 miRNA 검출에 의해 정량 검출될 수 있음을 나타낸다.

특이성을 평가하기 위해서, 본 발명의 검출 방법을 miRNA21, miRNA16 및 두 개의 다른 miRNA(miRNA31 및 miRNA155)를 사용하여 시험할 수 있다. 패드락 주형 DNA(RCT) 및 다른 형광물질들과 부합하는 PNA 탐침자는 다른 miRNA들의 증폭 및 검출을 위해 설계되었다. 각각 RCT를 그와 부합하는 표적 miRNA와 인큐베이션하면, RCA를 통해서 거대한 고-분자량의 DNA 분자(RCAP)를 빠르게 합성할 수 있고, 이는 아가로즈 겔 전기영동을 통해 결정될 수 있다(도 7).

RCT의 이와 부합하는 표적 miRNA에 대한 특이성을 추가적으로 시험하기 위해서, 각각의 RCT 또는 RCT들(RCT21, RCT31 및 RCT155)의 혼합물을 결찰 및 RCFA 반응에 miRNA(miRNA21, miRNA31 및 miRNA155)와 함께 사용하였다. 각각의 표적 miRNA 및 그에 부합하는 형광 PNA 탐침자에 어닐링되도록 설계된 적절한 RCT를 포함하는 RCA 반응에서 강한 형광 신호가 선택적으로 관찰되었다(도 8a).

다음으로, 각각의 형광 PNA 탐침자의 특이성을 시험하기 위해서, 서로 다른 형광물질(FITC-PNA21, ATTO550-PNA31 및 Cy5-PNA155)로 표지된 PNA의 혼합물을 하나 또는 그 이상이 혼합된 RCAP와 인큐베이션하였다. 강한 형광 신호는 표적 RCAP가 그의 부합하는 형광 PNA로 혼성화된 경우에만 선택적으로 관찰되었다(도 8b). 이러한 결과는 다른 형광물질을 포함하는 다중 탐침자를 적절한 형광 검출 채널을 사용하여 한 번의 반응으로 서로 다른 표적의 다중 검출에 사용할 수 있음을 입증한다.

본 발명에 따른 miRNA 검출 기술을 다중적인 검출 방식에 적용하였고, 시각적인 형광 이미지를 확인하고 96-웰 플레이트에서 정량하였다. 서로 다른 표적 miRNA에 부합하는 각각의 패드락 DNA는 miRNA 어닐링, 결찰 및 이후의 RCA 반응을 위해 각 웰에 위치하였다. 상기 기재된 바와 같이, RCA 이후에 RCA 산물은 FITC-표지된 PNA(F-PNA)와 혼합되고 RCAP 및 F-PNA 사이의 어닐링이 일어날 수 있다. 각 반응 혼합물의 분취물은 GO(5 μg/mL)를 포함하는 96-웰 플레이트로 옮겨졌다. 각각의 miRNA 검출을 위한 RCT 및 F-PNA 세트는 구분된 열에 따라 배열되었다. 단일 또는 혼합된 miRNA 샘플은 각각의 컬럼에서 검출을 시험했으며, 형광 강도는 형광 이미징 시스템을 사용하여 시각화시켰다(도 8c). 강한 형광 신호는 부합하는 F-PNA로 증폭되고 혼성화된 표적 miRNA를 포함하는 웰 안에서 선택적으로 관찰되었다. 그러나, 비표적 miRNA를 포함하는 다중웰 플레이트의 형광은 이원체(duplex)가 형성되지 않으므로 소광되었다.

본 발명에 따른 GO-기반 형광 검출 방법의 특이성을 확인하기 위해 높은 상동성(1 또는 2 뉴클레오티드 차이)의 miRNA 서열을 구분하기 위한 추가적인 시험을 수행하였다. 패드락 DNA 주형 5' 또는 3'말단과의 결합 부위에서, 표적 miRNA의 단일 염기 서열변이를 유도하였다(각각 도 9a의 miRNA21_G 및 miRNA21_A). 결찰 및 RCA는 RCT21을 사용하여 miRNA21 또는 단일 염기 서열변이를 포함하는 miRNA21와 수행되었다. miRNA16(비표적 miRNA) 또한 음성 대조군으로 사용되었다.

도 9b에서 보여지는 바와 같이, 비표적 miRNA16 또는 단일 염기 서열변이를 포함하는 miRNA21의 경우와 달리 야생형 miRNA21의 존재하에서는 고 분자량 산물이 관찰되었다. RCAP는 각각의 miRNA형 존재하에서 발생하였고 이를 miRNA21에만 상보적인 F-PNA21로 96-웰 플레이트에서 형광을 측정하였다. 야생형 miRNA21에서만 강한 형광이 관찰되었고; 단일 염기 서열변이를 포함하는 miRNA21의 형광은 miRNA16에서와 유사하게 나타났다(도 9c). 이러한 결과는 표적 miRNA가 단일 염기의 차이가 있는 다른 miRNA로부터 손쉽게 구분됨을 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 GO-기반 형광 검출 방법은 높은 상동성 miRNA 서열의 정량 검출에 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 올리고뉴클레오티드의 준비

본 발명에서 사용된 RNA 올리고뉴클레오티드(miRNA21, miRNA16, miRNA31 및 miRNA155; 표 1 참조)는 화학적으로 합성(ST Pharm Co. Ltd., Seoul, Korea)되어 HPLC 및 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 정제되었다. DNA 올리고뉴클레오티드(RCT21, RCT16, RCT31 및 RCT155; 표 1 참조) 및 형광 표지된 단백질 핵산(PNA21, PNA16, PNA31, and PNA155; sequences are shown in Table S1)은 화학적으로 합성(Bionics, Seoul, Korea and PANAGENE, Daejeon, Korea, respectively)되어 PAGE에 의해 추가적으로 정제되었다.

Oligonucleotide (nts)	서열 (from 5' to 3 ')
miRNA16 (22)	UAG CAG CAC GUA AAU AUU GGC G
miRNA21 (22)	UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A
miRNA31 (21)	AGG CAA GAU GCU GGC AUA GCU
miRNA155 (23)	UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU
RCT16 (62)	Phosphate - ACG TGC TGC TA T AAC GAC GAG AAA GGG CTG CCA GAT ACT CTT CGC AAT TTT CGC CAA TAT TT
RCT21 (62)	Phosphate - CTG ATA AGC TAT AAC GAC GAG AAA GGG CTG CCA GAT ACT CTT CGC AAT TTT TCA ACA TCA GT
RCT31 (61)	Phosphate - GCA TCT TGC CTT AAC GAC GAG AAA GGG CTG CCA GAT ACT CTT CGC AAT TTT AGC TAT GCC A
RCT155 (63)	Phosphate - GAT TAG CAT TAA TAA CGA CGA GAA AGG GCT GCC AGA TAC TCT TCG CAA TTT TAC CCC TAT CAC
PNA16 (22)	FITC - CGC CAA TAT TTA CGT GCT GCT A
PNA21 (22)	FITC - TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A
PNA31 (21)	ATTO550 - AGC TAT GCC AGC ATC TTG CCT FITC - AGC TAT GCC AGC ATC TTG CCT
PNA155 (23)	Cy5 - ACC CCT ATC ACG ATT AGC ATT AA FITC - ACC CCT ATC ACG ATT AGC ATT AA
miRNA21_G (22)	UAGCUUAUCAUACUGAUGUUGA
miRNA21_A (22)	UAGCUUAUCAGUCUGAUGUUGA
miR21_RT primer (44)	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC
miR21_Forward primer (30)	ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA
miR21_Reverse primer (16)	TGGTGTCGTGGAGTCG
U6 small RNA_RT primer (20)	AAAATATGGAACGCTTCACG
U6 small RNA_Forward primer (32)	CGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAAC
U6 small RNA_Reverse primer (28)	GCTTCACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC

2, GO 및 AFM (atomic force microscopy, 원자력현미경)

Hummer 방법에 의해 준비된 GO(그래핀 옥사이드)는 구매하였다(cat#. SKU-HCGO-W-175, Graphene Supermarket, Graphene Laboratories, Inc., Ronkonkoma, NY, USA). AFM 이미지는 원자력 현미경(NanoScope V controller, Model: Bruker Multimode 8, Bruker AXS Inc., Madison, WI, USA) 을 사용하여 실온에서 태핑(tapping) 모드로 스프링 상수 40 N/m 및 팁 반경(tip radius) ≤ 8 nm 조건하에서 수집하였다. 10 μL의 GO 용액(10 g/mL)을 사용하였고 이는 피라나 세척법(piranha cleaning method)에 의해 세척된 실리콘 웨이퍼(wafer)에 두었다. 시료는 실온에서 건조시켰다. 스캔 속도는 1.0 Hz의 선주파수로 하였고, 원본 이미지는 256 × 256 픽셀 방식으로 추출하였다.

3. RCT DNA의 원형 제작

RCT DNA의 결찰 반응을 1 μL의 10X 결찰 버퍼(660 mM Tris-HCl, pH 7.6, 66 mM MgCl₂, 100 mM DTT 및 1 mM ATP), 1 μL의 T4 DNA 연결효소(175 U/L, Takara, Tokyo, Japan), 1 μL의 RCT DNA(1 μM), 1 μL의 miRNA (1 μM) 및 6 μL의 증류수를 포함하는 10 μL의 반응 혼합물에서 수행하였다. T4 DNA 연결효소 및 결찰 버퍼가 추가되기 전에, RCT 및 miRNA를 85 ℃에서 3분간 가열하였고, 이후 천천히 실온으로 15분 동안 냉각하였다. T4 DNA 연결효소 및 결찰 버퍼를 추가한 후, 반응 혼합물을 25 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

그리고, 10 μL의 결찰 반응 혼합물은 2 U의 핵산말단가수분해효소(exonuclease) I(2U/L, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), 1.5 μL of 10X 핵산말단가수분해효소 I 반응 버퍼(670 mM glycine-KOH, pH 9.5, 100 mM β-mercaptoethanol 및 67 mM MgCl₂) 및 증류수까지 총 부피 15 μL을 포함하는 용액으로 보충되었다. 37 ℃에서 15분 동안 추가적인 인큐베이션을 수행한 후, 25 mM의 NA₂EDTA 및 8 M의 요소(urea)를 포함하는 동일 부피의 겔 로딩 염색시약(gel-loading dye)의 추가에 의해 반응은 소광되었다. 상기 반응 산물은 15 %(w/v)의 변성 PAGE에서 SYBR Gold(Molecular Probes, Life Technologies, Eugene, OR, USA)에 의해 밴드를 시각화시켰다.

4. 회전환 증폭(RCA)

RCT 결찰 반응은 결찰 버퍼, T4 DNA 연결효소 및 각각 RCT21(100 nM) 및 miRNA를 포함하는 10 μL의 반응 혼합물에서 수행하였다. T4 DNA 연결효소 및 결찰 버퍼가 추가되기 전에, RCT 및 miRNA를 85 ℃에서 3분간 가열하였고, 이후 천천히 실온으로 15분 동안 냉각하였다. T4 DNA 연결효소 및 결찰 버퍼를 추가한 후, 반응 혼합물을 25 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 2 μL의 10X RCA 반응 버퍼(500 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂, 100 mM (NH₄)₂SO₄ 및 40 mM DTT), 1 μL의 BSA(2 mg/mL), 6 μL의 dNTP 믹스(각 2.5 mM dNTP) 및 1 μL의 phi29 DNA 중합효소(5 U/μL, New England Biolabs)를 포함하는 10 μL의 RCA 혼합물을 준비하여 10 μL의 결찰 반응 혼합물(총 부피 20 μL)과 혼합하였다. RCA 반응은 30 ℃에서 90분 동안 수행되었고 65 ℃로 10분 동안 가열한 후 종료하였다. RCA 산물(RCAP)은 1 % 아가로즈 겔 전기영동으로 분석하였고(도 2a), DNA 밴드는 에티디움브로마이드(ethidium bromide)를 통해 시각화되었다(도 2b).

5. 형광분석법을 통한 GO의 형광 소광 분석

5 μL의 형광 표지된 PNA(F-PNA; 1 μM), 5 μL의 10X GO 결합 버퍼(50 mM MgCl₂ 및 200 mM Tris-HCl, pH 7.5) 및 40 μL의 증류수를 포함하는 50 μL의 반응 용액을 준비하고 혼합하였다. 반응 용액의 형광 스펙트럼 방출은 495 nm를 여기 상태로 하여 500 ~ 600 nm의 파장 범위에서 형광분광광도계(spectrofluorophotometer, Model RF-53-1PC; Shimadzu Inc., Kyoto, Japan)를 사용하여 측정하였다. 방출된 스펙트럼의 변화는 F-PNA(100 nM) 및 GO 결합 버퍼를 포함하는 반응 용액에 10 ㎍/mL GO를 추가한 후에 스캔하였다. GO-기반의 형광 miRNA 검출 방법의 특이성을 개시하기 위하여, 결찰 및 RCA 반응은 miRNA(100 nM) 및 RCT(100 nM)를 포함하는 반응 혼합물 내에서 수행하였다. 단일-가닥 DNA의 긴 연장(RCAP21 및 RCAP16)은 miRNA21 및 miRNA16 각각의 RCA로부터의 결과이다. 음성 대조군으로서, 표적 miRNA21의 부재하에서 100 nM의 RCT21을 통해 같은 결찰 및 RCA 반응을 수행하였다. 3 μL의 RCAP 반응 혼합물, 5 μL의 F-PNA21(1 μM) 및 7 μL의 증류수는 첫 번째로 85 ℃에서 3분 동안 열처리하고 천천히 15분 동안 실온으로 냉각시킴으로써 각각 혼성화시켰다. 각각의 15 μL의 RCAP/F-PNA 혼성화 반응 혼합물은 10 μL의 GO(50 μg/mL), 5 μL의 10X GO 결합 버퍼 및 20 μL의 증류수를 포함하는 용액으로 보충하였다(총 부피 50 μL). 추가적인 인큐베이션을 25 ℃에서 20분 동안 수행하고, 혼합물(50 μL)의 스펙트럼 방출은 495 nm를 여기 상태로 하여 500 ~ 600 nm의 파장 범위에서 형광분광광도계(Model RF-5301PC)를 사용하여 측정하였다(도 2c).

6. 탐침 PNA의 형광 소광을 위한 GO의 최적화된 농도

결찰 및 RCA 반응은 상기와 같이 10 nM의 miRNA 및 100 nM의 RCT를 포함하는 반응 혼합물 내에서 수행하였다. 합성된 RCAP는 100 nM의 F-PNA와 혼성화되었다. 15 μL의 RCAP/F-PNA 혼성 반응 혼합물은 다양한 농도(0, 3, 5, 10, 20, 30 및 50 μg/mL, 최종 농도)의 35 μL의 GO 용액, GO 결합 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂) 및 증류수를 포함하는 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 25 ℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 형광은 여기 파장 485 nm, 방출 파장 535 nm에서 다중표지 플레이트 리더(multilabel plate reader, VICTOR X3; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 측정하였다(도 3).

7. miRNA 농도 변화에 따른 형광 측정

GO-기반 miRNA 검출 시스템의 민감도를 평가하기 위해, RCT21(100 nM) 및 농도의 증가(0, 1, 5, 100 및 500 fM; 1, 50, 100 및 500 pM; 1, 5 및 10 nM)에 따른 miRNA21에 대한 결찰 반응을 수행하였다(도 4). GO-기반 miRNA 검출 방법의 민감도는 또한 1 μg인 총 세포 RNA에 혼합된 100 nM의 RCT21 및 농도의 증가(0, 1, 5, 100 및 500 fM; 1, 50, 100 및 500 pM; 1, 5 및 10 nM)에 따른 miRNA21과 같은 반응의 수행에 의해 검사하였다(도 5). 총 세포 RNA는 TRIzol^® 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 용해시킨 폐암 세포(A549 cells)로부터 추출하였다. 결찰 및 RCA 반응을 수행하고 RCAP 혼합물은 상기와 같이 100 nM의 F-PNA 혼성화하였다. RCAP/F-PNA 혼성 반응 혼합물(15 μL)는 5 μL의 GO(50 μg/mL), 5 μL의 10X GO 결합 버퍼 및 25 μL의 증류수를 포함하는 용액으로 보충되었다(총 부피 50 μL). 25 ℃에서 20분 동안 추가적으로 인큐베이션한 후, 혼합물(50 μL)의 스펙트럼 방출은 여기 파장 495 nm에서 형광분광광도계(Model RF-5301PC)를 사용하여 스캔하였다.

8. miRNA 검출을 위한 qRT-PCR 분석

miRNA21의 검출을 위하여, 스템-루프(stem-loop) RT-PCR을 수행하였다. 각각의 키트{(PrimeScript^TM 1^st Strand cDNA Synthesis Kit, Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 및 (Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit, Qiagen, Hilden, Germany)}를 이용하여 역전사(Reverse transcription, RT) 및 정량 실시간 PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 수행하였다. 전체 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 A549 세포로부터 추출하였고, 합성된 miRNA21을 다양한 농도(0 및 5 fM; 0.1, 5, 50 및 500 pM; 5, 10, 50 및 100 nM)로 혼합하였다. A549 총 RNA(1 μg)를 포함하는 혼합물 및 다양한 농도의 miRNA21은 키트(PrimeScript^TM 1^st Strand cDNA Synthesis Kit)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 역전사시켰다. qRT-PCR은 시스템(real-time thermocycler Rotor-gene Q system, Qiagen) 내에서 정방향 프라이머(0.5 μM), 역방향 프라이머(0.5 μM) 및 2 μL의 cDNA에 의해 수행되었다. 반응 혼합물은 5분 동안 16 ℃에서 인큐베이션시켰고, 95 ℃로 5초 동안, 60 ℃로 10초 동안, 그리고 72 ℃에서 1초 동안 45 사이클을 반복하였다. 상대적인 강도를 평가하고 U6 snRNA의 발현으로 정상화하였다(도 6a). miRNA21 및 U6 snRNA의 프라이머는 표 1에 나타내었다.

9. GO-기반 형광 miRNA 검출 시스템에서의 RCT DNA 및 F-PNA의 특성

GO-기반 miRNA 검출 시스템의 특성을 평가하기 위해, 여러 miRNA(miRNA21, miRNA16, miRNA31 및 miRNA155)를 준비하였다. RCT 서열 및 PNA 탐침자를 증폭 및 다른 miRNA(표 1 참조)의 검출을 위해 설계된 다양한 형광단(fluorophore)과 일치시켰다. 상기 다양한 형광단은 프로브 PNA를 표지하기 위해 사용되었다{FITC(λ_ex = 495 nm 및 λ_em = 519 nm), ATTO550(λ_ex = 554 nm 및 λ_em = 576 nm) 및 Cy5(λ_ex = 650 nm 및 λ_em = 670 nm)}. 형광단은 PNA21, PNA31 및 PNA155의 5'말단을 각각 표지하였다. RCT의 특성을 평가하기 위해, miRNA의 혼합물(miRNA21, miRNA31 및 miRNA155; 각각 10 nM)을 결찰 또는 RCT 반응을 위해 RCT(RCT21, RCT31 및 RCT155; 각각 100 nM) 중 하나 또는 그 이상의 혼합물과 인큐베이션하였다(도 8a). 음성 대조군으로서, RCT16(100 nM)을 miRNA16을 제외한 miRNA들의 혼합물을 포함하는 반응 혼합물에 추가하였다. 결찰 및 RCA 반응은 상기와 같이 멀티웰-플레이트 조건에서 수행하였다. RCAP의 분취량(3 μL)은 이후 F-PNA(FITC-PNA21, ATTO550-PNA31 및 Cy5-PNA155)와 각각 혼성화되었다. GO-기반 miRNA 검출 방법에서 F-PNA의 특성은 또한 각각의 RCAP에 대한 FITC-PNA21(50 nM), ATTP550-PNA31(50 nM) 및 Cy5-PNA155(50 nM)를 포함하는 F-PNA의 혼합물을 사용하여 확인하였다(도 8b). RCAP21, RCAP16, RCAP31 및 RCAP155은 그와 부합하는 RCT DNA 및 miRNA의 짝을 사용하여 합성되었다. 하나의 또는 그 이상의 혼합된 RCAP(RCAP21, RCAP31 및 RCAP155)를 F-PNA의 혼합물을 사용하여 F-PNA와 혼성화하였다. 음성 대조군으로서, RCAP16은 F-PNA16을 제외한 F-PNA(miRNA16에 상보적인)의 혼합물을 포함하는 반응 혼합물에 추가하였다. RCAP/F-PNA 혼성 반응 혼합물(15 μL)은 이후 35 μL의 GO 용액(5 μg/mL), GO 결합 버퍼 및 증류수를 포함하는 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮겨졌다. 25 ℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후에, 형광을 다중표지 플레이트 리더(multilabel plate reader, VICTOR X3; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 측정하였다.

10. GO-기반 형광 miRNA 검출에서의 다중 검출

다중 검출을 위해서, 네 개의 F-PNA 탐침자를 준비하였다. FITC 형광단은 각각 miRNA16, miRNA21, miRNA31 및 miRNA155에 상보적인 PNA16, PNA21, PNA31 및 PNA155 서열의 5'말단을 표지하였다. 하나 또는 그 이상의 miRNA들(miRNA16, miRNA21, miRNA31 및 miRNA155; 각각 10 nM)은 혼합하여 각각의 RCT(100 nM)와 결찰시켰다. 결찰 반응 후, RCA는 결찰 산물로 수행되었다. 그 후, 3 μL의 RCAP 반응 혼합물은, 5 μL의 FITC-PNA 탐침자(1 μM), 및 7 μL의 증류수를 혼합하여 인큐베이션하고 85 ℃에서 3분 동안 최초 열처리한 후 천천히 15분 동안 실온으로 냉각시켰다. RCT21, RCT31 또는 RCT155를 사용하는 각각의 RCAP 반응 혼합물은 FITC-PNA21, FITC-PNA31 또는 FITC155로 상기와 같이 각각 탐침되었다. 그리고, 15 μL의 RCAP/F-PNA 혼성 반응 혼합물은 35 μL의 GO 용액(5 μg/mL)을 포함하는 96-웰 플레이즈 각각의 웰에 옮겼다. 25 ℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 형광 이미징 시스템(IVIS-Lumina II; Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)을 사용하여 96-웰 플레이트의 형광 이미지를 얻었다(도 8c).

11. 단일 염기 서열변이를 포함하는 miRNA를 사용하는 GO-기반 형광 miRNA 검출 시스템의 특성 확인

RCT 서열에서 5' 또는 3'말단 결합 부위의 단일 염기 서열변이를 포함하는 miRNA21의 변종을 준비하였다(표 1 참조). 결찰 및 RCA 반응은 상기와 같이 야생형 miRNA21(10 nM) 또는 단일 염기 서열변이(100 nM)를 포함하는 miRNA21 변종의 존재하에서 RCT21(100 nM)을 사용하여 수행하였다(도 9a). 대조실험으로서, miRNA16(10 nM)은 같은 반응에서 RCT21에 사용하였다. RCA 산물 DNA 밴드는 1 % 아가로즈 겔 전기영동에 사용하여 에티디움브로마이드로 시각화하였다(도 9b). 형광 검출을 위해서, RCA 산물은 F-PNA21(100 nM)에 혼성화되었고, 혼성체는 상기와 같이 96-웰 플레이트에서 GO 용액(5 μg/mL)과 혼합되었다. 25 ℃에서 20분 동안 인큐베이션한 후, 형광은 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 535 nm에서 다중표지 플레이트 리더(VICTOR X3)로 측정하였다(도 9c).

Claims (12)

1. a) 회전환 증폭 방법을 통해 표적 miRNA를 등온증폭시킨 단일가닥 DNA를 준비하는 단계;
   b) 상기 단일가닥 DNA를 포함하는 시료에 형광 표지된 PNA 탐침자를 혼합하는 단계;
   c) 상기 혼합 이후 단일가닥 DNA에 결합되지 않은 PNA 탐침자를 10 ㎍/mL의 산화그래핀에 흡착시키는 단계; 및
   d) 시료의 형광 발현을 측정하여 miRNA가 포함된 시료를 선별하는 단계
   를 포함하는 회전환 증폭을 이용한, 1 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성된 miRNA의 형광 검출 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 단계 a)의 회전환 증폭을 위해 표적 miRNA에 상보적으로 설계된 패드락 프로브 DNA(padlock probe DNA)인 회전환 주형에 상기 표적 miRNA가 프라이머로 혼성화되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 단계 a)의 회전환 증폭에서 DNA 중합에 phi29 DNA 중합효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
   
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 형광 표지된 PNA 탐침자가 FITC, ATTO550 및 CY5로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광단으로 표지되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 miRNA가 정량적으로 검출되고, 상기 miRNA의 검출 한계가 0.4 pM인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제

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