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CN102348811A - 单细胞核酸分析 - Google Patents

单细胞核酸分析 Download PDF

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CN102348811A
CN102348811A CN2010800114267A CN201080011426A CN102348811A CN 102348811 A CN102348811 A CN 102348811A CN 2010800114267 A CN2010800114267 A CN 2010800114267A CN 201080011426 A CN201080011426 A CN 201080011426A CN 102348811 A CN102348811 A CN 102348811A
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林敏�
阿兰·米尔
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Abstract

本发明提供分析小样品或甚至单细胞的基因组DNA和/或RNA的方法。分析基因组DNA的方法可能需要全基因组扩增(WGA)，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。分析RNA的方法可能需要期望的RNA的逆转录，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。

Description

单细胞核酸分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年1月13日提交的美国临时申请号61/144,416、2009年1月22日提交的美国临时申请号61/146,583和2009年12月15日提交的美国临时申请号61/284,309的优先权，通过引用的方式将它们的全文结合至本文。
技术领域
本发明涉及用于分析小细胞群或单细胞的核酸，如基因组DNA或RNA(如非编码RNA或mRNA)的方法。
背景技术
快速及可靠地分析小样品或单细胞的基因组DNA或RNA(如非编码RNA或mRNA)的障碍是常规聚合酶链式反应(PCR)的重复性已经不适于保证所有感兴趣的目标核酸被充分扩增以被检测。
发明内容
在一些实施方式中，本发明提供分析单细胞核酸的方法。在特定实施方式中，所述单细胞是哺乳动物细胞，如植入前胚胎的细胞、干细胞、疑似癌细胞、致病生物的细胞和/或犯罪现场获得的细胞。在示例的实施方式中，所述细胞是人卵裂球(如来自八细胞期胚胎)或人干细胞。
例如，一种用于基因型分析单细胞的示例的方法需要：
(a)对单细胞的基因组进行全基因组扩增以产生扩增的基因组；
(b)预扩增所述扩增的基因组以产生预扩增反应混合物，所述混合物包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸(基因座)的扩增子；和
(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。
在一些实施方式中，实施全基因组扩增(WGA)以使得达不到反应平台期。典型地，WGA进行多于两个扩增循环，并且在特定实施方式中，小于大约10个循环(如，大约4和8个循环之间，包括4和8个循环)。
合适的WGA技术包括引物延伸PCR(PEP)、简并寡核苷酸引物PCR、连接介导PCR(LMP)、基于T7的DNA线性扩增(TLAD)和多重置换扩增(MDA)。
一种分析单细胞RNA的示例的方法需要：
(a)从单细胞的RNA制备DNA；
(b)预扩增所述DNA以产生预扩增反应混合物，所述混合物包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸(目标RNA)的扩增子；和
(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。
在特定实施方式中，通过逆转录或扩增mRNA制备cDNA。在其它实施方式中，通过逆转录或扩增非编码RNA制备DNA。例如，所述非编码RNA可以是小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和/或与Piwi蛋白相作用RNA(piRNA)。
可以对从单细胞的基因组DNA或RNA产生的核酸进行预扩增。当从RNA(如通过逆转录)制备DNA时，然后可以在同样的反应混合物中实施预扩增。在一些实施方式中，使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸(如基因座)的引物对实现预扩增。在特定实施方式中，预扩增可以进行8-18个循环。在特定实施方式中，扩增混合物中不存在探针。
在一些实施方式中，通过预扩增产生的扩增子可以通过进一步扩增而被检测。在特定实施方式中，所述进一步扩增通过使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸(基因座)的引物对而实现。这些引物对可以和用于预扩增的那些引物对相同或不同。
在示例的实施方式中，可以进行所述预扩增，且得到的预扩增混合物可以在扩增之前分布在微流体装置的分离室中。合适的微流体装置包括(至少部分地包括)由弹性材料制成的那些。
在一些实施方式中，通过聚合酶链式反应(PCR)完成所述预扩增和/或扩增。当通过PCR完成所述扩增时，扩增产物的存在可以通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)测定。在这样的实施方式中，通用的qPCR探针，如双链DNA(dsDNA)染料可以用在扩增混合物中以检测扩增产物。可选地或另外地，可以使用一种或多种目标特异的qPCR探针以检测扩增产物。在示例的实施方式中，使用荧光核酸酶检测测定扩增产物的存在。例如，可以使用双标记的荧光寡核苷酸探针检测扩增产物的存在。
在预扩增和/或扩增中使用的引物对可以扩增单核苷酸多态性(SNP)。在特定实施方式中，这些可以与一种或多种遗传缺陷的存在相关联。
附图说明
图1：达到94个单独细胞的BioMark基因型分析软件SNP基因型分析簇图。
图2：来自96个独特SNP TaqMan检测对94个单细胞的BioMark基因型分析软件的全SNP簇图。
图3：产生于源自多种总RNA起始水平的特定目标扩增(STA)模板的miRNA 30C检测线性“标准曲线”，如在实施例2B中描述的进行分析。用Ct对相对浓度表示数据。EFF显示了稀释系列的PCR效率。
图4：取自同样STA稀释，但来自不同的总RNA起始量的U6检测线性的标准曲线，如在实施例2B中描述的进行分析。检测证明了来自通过STA的RT步骤和最终在集成流体通路(IFC)中的显著的反应线性。根据Ct值比总RNA数量的ng表示数据。EFF显示了稀释系列的PCR效率。
图5：miRNA表达数据的48.48Ct热度图(实施例2B)。使用不同的总RNA输入量得出数据。STA进行15-18个循环。
图6：miRNA表达数据的96.96Ct热度图。使用不同的总RNA输入量得出数据。STA进行15-18个循环。
具体实施方式
在如评估与体外受精(IVF)相关的样品、CTC和肿瘤一致性研究中，分析核酸(如小样品的基因组DNA)的能力是重要的。单细胞的基因型是多种情况，包括发育生物学、突变检测和细菌学中所感兴趣的。例如，在理解分化、发育、疾病和对多种刺激的细胞应答的分子基础中，编码RNA(mRNA)和非编码RNA的表达模式同样是感兴趣的。
在一些实施方式中，本发明包括基于全基因组扩增(WGA)的应用的方法，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。WGA的应用在预扩增步骤之前提供了多拷贝基因组，增加了所有感兴趣的目标核酸的完全预扩增的可能性。在其它实施方式中，制备RNA的DNA表现型，例如，从mRNA制备cDNA，后续选择的目标核酸的预扩增和扩增。
定义
除非另有说明，在本权利要求书和说明书中使用的术语如下述所定义。
术语“核酸”指核苷酸多聚体，且除非另有限制，包括已知的天然核苷酸的类似物，所述类似物能够以与天然存在核苷酸相似的方式发挥作用(如杂交)。
所述术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如，基因组DNA；互补DNA(cDNA)，其是mRNA的DNA表现型，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增获得；合成地或通过扩增产生的DNA分子；和mRNA。
所述术语核酸包括双链核酸或三链核酸，以及单链分子。在双链核酸或三链核酸中，所述核酸链不需要共延伸(即，双链核酸不需要沿两条链的全部长度双链延伸)。
所述术语核酸还包括它们的任何化学修饰，如通过甲基化和/或通过加帽。核酸修饰可以包括添加化学基，所述化学基对个别核酸碱基、磷酸二酯键或整个核酸合并了额外的电荷、极性、氢键、静电交感和特性。这样的修饰可以包括如2’位糖修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰的碱基修饰，胞嘧啶环外胺修饰，5-溴尿嘧啶的取代，骨架修饰，如异碱基异胞嘧啶和异鸟嘌呤的非常规碱基对组合，等等。
更具体地，在一些实施方式中，核酸可以包括多聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)，多聚核糖核苷酸(包含D-核糖)和嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型核酸，以及其它包含非核苷酸骨架的聚合物，如聚酰胺(如肽核酸(PNA))和聚吗啉(购自Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，及Neugene)聚合物，和其它合成的序列特异的核酸聚合物，假设所述聚合物包含在结构上允许碱基配对和碱基堆积(如在DNA和RNA中所发现的)的核碱基(nucleobase)。所述术语核酸还包含连接的核酸(LNA)，在美国专利号6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中描述，出于它们关于LNA的公开内容，通过引用的方式全文结合至本文。
所述核酸可以源自完全地化学合成过程(如固相介导的化学反应)，源自生物来源(如分离自产生核酸的任何物种)，或源自包括通过分子生物学方法处理核酸的过程，如DNA复制、PCR扩增、逆转录，或源自这些过程的组合。
本文中使用的术语“目标核酸”指在本文描述的方法中被检测的特定核酸。目标核酸包括，例如，在基因型分析研究中的感兴趣的基因座(如，单核苷酸多态性)、在表达研究中的感兴趣的mRNA、以及非编码RNA。初始地(即，在实验干涉之前)以RNA形式发现的目标核酸也是本文定义的“目标RNA”。
非编码RNA包括非必要翻译成蛋白的那些RNA种类。这些包括但不限于：转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)，以及RNA如：小核仁RNA(snoRNA；如与甲基化或假尿苷酸化关联的那些)、微小RNA(miRNA；其调节基因表达)、小干扰RNA(siRNA；其涉及RNA干扰(RNAi)途径，其中它们干扰特定基因的表达，但同样已经显示出作为抗病毒剂和在基因组的染色质结构成形中显示)和与Piwi蛋白相作用RNA(piRNA；其通过与Piwi蛋白相互作用形成RNA-蛋白复合体，这些piRNA复合体已经与生殖系细胞中的逆转座子和其它遗传元件的转录基因沉默关联，特别是精子发生的那些)和长非编码RNA(长ncRNA；它们是非编码转录本，典型地长于大约200个核苷酸)。
本文中使用的术语“目标核苷酸序列”指具有目标核酸的核苷酸序列的分子，如，通过扩增目标核酸获得的扩增产物或基于mRNA目标核酸的逆转录而制备的cDNA。
本文中使用的术语“互补的”指在两个核苷酸之间配对的能力。即，如果核酸给定位置的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸氢键结合，则这两个核酸被认为是在那个位置彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补(沃森-克里克或非经典配对)可以是“部分地”，其中仅一些核苷酸结合，或者当在单链分子之间存在全部互补，其可以是完全的。核酸链之间的互补程度明显影响核酸链之间的杂交效率和强度以及后续的堆积作用。
“特异杂交”指在限定的严格条件下，核酸结合至目标核苷酸序列而不实质结合至在杂交混合物中存在的其它核苷酸序列。本领域技术人员公认放松杂交条件的严格性能够容许序列错配。
在特定实施方式中，在严格杂交条件下完成杂交。所述短语“严格杂交条件”一般指在限定的离子强度和pH值下比特定序列的解链温度(Tm)低大约5℃至大约20℃或25℃范围内的温度。如在本文中所使用的，所述Tm是双链核酸分子群变成半解离成单链的温度。计算核酸Tm的方法是本领域已知的(见，如Berger和Kimmel(1987)METHODS INENZYMOLOGY，VOL.152：GUIDE TO MOLECULAR CLONINGTECHNIQUES，San Diego：Academic Press，Inc.和Sambrook等(1989)MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL第2版第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory)，均通过引用的方式结合至本文)。如由权威参考文献所显示的，Tm值的简单估测可以通过等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算，其中核酸处于1M NaCl水溶液中(见，如，Anderson和Young，Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION(1985))。杂交物的解链温度(和因此的严格杂交的条件)由多种因素影响，如所述引物或探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和所述目标核酸的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等等)，以及盐的浓度和其它成分(如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)。这些因素的影响是公知的并在本领域的权威参考文献中被讨论。适于完成大部分序列的特异杂交的示例的严格条件是：至少大约60℃的温度和pH7的大约0.2摩尔的盐浓度。
术语“寡核苷酸”被用于指相对短的、通常短于200个核苷酸、更具体地短于100个核苷酸、更具体地短于50个核苷酸的核酸。典型地，寡核苷酸是单链DNA分子，但是也可以产生双链寡核苷酸。
术语“引物”指在适当的缓冲液和合适的温度、在适当的条件(即，存在四种不同的三磷酸核苷和用于聚合的试剂(如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶))下能够与核酸杂交(也被定义为“退火”)并作为核苷酸(RNA或DNA)聚合的起始位置的寡核苷酸。所述引物的合适长度依赖于所述引物的计划用途，但引物典型地至少6个核苷酸长以及，更典型地范围在10至30个核苷酸长度，或甚至更典型地15-30个核苷酸长度。其它引物可以稍微长一些，如30-50个核苷酸长。在本文中，“引物长度”指与互补的“目标”序列杂交并引导核苷酸合成的寡核苷酸或核酸部分。短引物分子通常需要较冷的温度以与所述模板形成足够稳定的杂交复合体。引物不必反映所述模板的精确序列但必须充分互补以与模板杂交。所述术语“引物位置”或“引物结合位置”指与引物杂交的目标核酸片段。
引物可以包括核苷酸标签，如，添加至它的5’末端。本文中使用的术语“核苷酸标签”指添加至目标核苷酸序列的预确定的核苷酸序列。所述核苷酸标签可以编码一则关于目标核苷酸序列的信息，如所述目标核苷酸序列的性质，所述序列源自的染色体，或者所述目标核苷酸序列源自的样品的性质。核苷酸标签通常不用作第一轮扩增的引物结合位置。
如果引物或其一部分与核酸中的核苷酸序列特异杂交，则引物被称为与另一条核酸退火。引物与特定核苷酸序列杂交的陈述并不意味着暗示所述引物完全地或专门地与那条核苷酸序列杂交。
术语“引物对”指一组引物，包括与将要被扩增的DNA序列的5’末端的互补序列杂交的5’“上游引物”或“正向引物”和与将要被扩增的序列的3’末端杂交的3’“下游引物”或“反向引物”。本领域技术人员将意识到，所述术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”并不意味着限定，而是在特定实施方式中提供示例性的方向。
如果一种引物对可以被用于特定扩增给出的扩增混合物中特定的目标核苷酸序列，则所述引物对被称为是“独特的”。
“探针”是能够通过一种或多种类型化学键，一般是通过互补碱基配对，通常是通过氢键形成(但也通过同序号金属络合物(co-ordinal metalcomplexe))结合互补序列的目标核酸而因此形成双链结构的核酸。所述探针与“探针结合位置”结合或杂交。可以用可检测的标记物标记所述探针以允许容易地检测所述探针，特别是当所述探针已经与它的互补目标杂交时。但是，可选地，所述探针可以是未标记的，但是可以通过特异结合被标记的配基而检测到，直接地或间接地检测到探针。探针的大小可以明显变化。通常，探针的长度是至少6至15个核苷酸。其它探针至少是20、30或40个核苷酸长。其它探针是稍微更长的，至少是50、60、70、80或90个核苷酸长。其它探针更长，至少是100、150、200或更多个核苷酸长。探针还可以是任何上述值所限定的任何范围内的任何长度(如，长度是15-20个核苷酸)。引物同样可以作为探针起作用。
所述引物或探针可以与目标核酸序列完全互补或可以是小于完全互补。在一些实施方式中，在至少7个核苷酸的序列上、更典型地在10-30个核苷酸范围的序列上、和通常至少14-25个核苷酸的序列上，所述引物与目标核酸序列的互补序列具有至少65％的一致性，更通常地具有至少75％的一致性、至少85％的一致性、至少90％的一致性、或至少95％、96％、97％、98％或99％的一致性。应当理解，通常期望一些碱基(如引物的3’碱基)与目标核酸序列的相应碱基完全互补。引物和探针典型地在严格杂交条件下与目标序列最特异退火。
根据本发明的教导的扩增包括至少一种目标核酸的至少一部分典型地以模板依赖方式被拷贝的任何方法，包括但不限于，用于线形地或指数地扩增核酸序列的广泛范围技术。用于实施扩增步骤的示例性方法包括连接酶链式反应(LCR)、连接酶检测反应(LDR)、后续Q-复制酶扩增的连接、PCR、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多元扩增、滚环扩增(RCA)等等，包括它们多种形式和组合，例如但不限于，OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(同样被认为是组合的链式反应-CCR)等等。在其它资源中，这些技术的描述可以在以下中找到：Ausbel等；PCR Primer：A LaboratoryManual，Diffenbach，Ed.，Cold Spring Harbor Press(1995)；The ElectronicProtocol Book，Chang Bioscience(2002)；Msuih等，J.Clin.Micro.34：501-07(1996)；The Nucleic Acid Protocols Handbook，R.Rapley，ed.，Humana Press，Totowa，NJ.(2002)；Abramson等，Curr Opin Biotechnol.1993年2月；4(1)：41-7，美国专利号6,027,998；美国专利号6,605,451，Barany等，PCT公开号WO 97/31256；Wenz等，PCT公开号WO 01/92579；Day等，Genomics，29(1)：152-162(1995)，Ehrlich等，Science 252：1643-50(1991)；Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，AcademicPress(1990)；Favis等，Nature Biotechnology 18：561-64(2000)；和Rabenau等，Infection 28：97-102(2000)；Belgrader，Barany和Lubin，Development ofa Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay，SixthInternational Symposium on Human Identification，1995(可从互联网：promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-中获得)；LCR试剂盒使用说明书手册C at.#200520，Rev.#050002，Stratagene，2002；Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：188-93(1991)；Bi和Sambrook，Nucl.AcidsRes.25：2924-2951(1997)；Zirvi等，Nucl.Acid Res.27：e40i-viii(1999)；Dean等，Proc Natl Acad Sci USA 99：5261-66(2002)；Barany和Gelfand，Gene 109：1-11(1991)；Walker等，Nucl.Acid Res.20：1691-96(1992)；Polstra等，BMC Inf.Dis.2：18-(2002)；Lage等，Genome Res.2003年2月13(2)：294-307，和Landegren等，Science 241：1077-80(1988)，Demidov，V.，Expert Rev MoI Diagn.2002年11月2(6)：542-8.，Cook等，J MicrobiolMethods.2003年5月53(2)：165-74，Schweitzer等，Curr Opin Biotechnol.2001年2月12(1)：21-7，美国专利号5,830,711，美国专利号6,027,889，美国专利号5,686,243，PCT公开号WO0056927A3和PCT公开号WO9803673A1。
在一些实施方式中，扩增包括至少一个循环的所述连续过程：至少一个引物与至少一个目标核酸中互补或基本上互补序列退火，使用聚合酶以模板依赖模式合成核苷酸的至少一条链，对新形成的核酸双链体变性以分开链。可以重复或不重复该循环。扩增可以包括热循环或可以等温实施。
因此，如本文中所使用的，术语扩增包括等温扩增方法。等温扩增使用恒定温度而不是在变性和退火/延伸步骤间循环。一些链分离方法(如酶)被用于代替热变性。等温扩增的例子包括：超支化链置换扩增(Groathouse，N.，等(2006)″Isothermal Amplification and Molecular Typingof the Obligate Intracellular Pathogen Mycobacterium leprae Isolated fromTissues of Unknown Origins″J.Clin.Micro.44(4)：1502-1508)，依赖解旋酶的扩增(Vincent，M.等(2004)″Helicase-dependent isothermal DNAamplification″EMBO Rep.5(8)：795-800)，多重置换扩增(MDA；Luthra，R.和Medeiros，J.(2004)″Isothermal Multiple Displacement Amplification″JMol Diagn.6(3)：236-242)，环介导的等温扩增(Notomi，T.等(2000)NucleicAcids Research 28(1)，PAN-AC(David，F.和Turlotte，E.，(1998)″AnIsothermal Amplification Metho d″C.R.Acad.Sci Paris，Life Science 321(1)：909-14)，链置换扩增(SDA；Nycz，C等(1998)Analytical Biochemistry 259(2)：226-234)，滚环扩增(RCA；Lizardi，P.等(1998)″Mutation detection andsingle-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification″Nature Genetics 19：225-232)，基于核酸链的扩增(NASBA；Van Der Vliet，G.等(1993)″Nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)for theidentification of mycobacteria″Journal of General Microbiology 139(10)：2423-2429)和重组酶聚合酶扩增(美国专利号7,485,428、7,399,590、7,270,981和7,270,951，它们全部内容，特别是关于重组酶聚合酶扩增的描述通过引用的方式结合至本文)。
本文中使用的术语“qPCR”指定量实时聚合酶链式反应(PCR)，也被认为是“实时PCR”或“动力学聚合酶链式反应”。
“反应物”广泛地指除了分析物(如被分析的核酸)外，在反应中使用的任何试剂。用于核酸扩增反应的示例反应物包括但不限于：缓冲液、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、核苷酸、标记物、染料、核酸酶等等。用于酶反应的反应物包括例如酶、底物、辅因子、缓冲液、金属离子、抑制剂和活化剂。
本文使用的术语“通用检测探针”指除了识别产物中存在的目标核苷酸序列外，鉴定扩增产物的存在的任何探针。
本文使用的术语“通用qPCR探针”指鉴定qPCR过程中扩增产物存在的任何探针。在一些实施方式中，一种或多种扩增引物可以包括与检测探针(如通用qPCR探针)结合的核苷酸序列。以这种方式，一个、两个或更多个探针结合位置可以在本文描述的方法的扩增步骤中添加至扩增产物。本领域技术人员公认在预扩增(如果进行)和扩增过程中引入多个探针结合位置的可能性促进多元检测，其中可以在给出的扩增混合物或它的等份中检测到两个或更多个不同的扩增产物。
术语“通用检测探针”同样意味包括标记有可检测标记物(如，荧光标记物)的引物，以及非序列特异探针，如DNA结合染料，包括双链DNA(dsDNA)染料，如SYBR绿。
本文使用的术语“目标特异qPCR探针”指基于qPCR探针与产物中存在的目标核苷酸序列的杂交，鉴定qPCR过程中扩增产物的存在的qPCR探针。
“水解探针”在美国专利号5,210,015中概括描述，出于水解探针的描述，所述专利通过引用的方式全部结合至本文。水解探针利用存在于典型地在PCR反应中使用的热稳定Taq聚合酶的5’-核酸酶活性(TAQMAN
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探针技术，Applied Biosystems，Foster City CA)。所述水解探针标记有如荧光素的荧光检测染料和受体染料或猝光剂。通常，所述荧光染料共价连接至所述探针的5’末端，所述猝光剂连接至所述探针的3’末端，且当探针是完整的，所述检测染料的荧光性通过荧光能量共振转移(FRET)猝灭。所述探针退火一个引物的下游，所述引物定义了PCR反应中目标核酸的一个末端。使用Taq酶的聚合酶活性，所述目标核酸的扩增由处于所述探针上游的一个引物和处于所述探针下游但与目标核酸的相反链退火的第二个引物引导。由于所述上游引物被延伸，所述Taq聚合酶到达被标记的探针退火的区域，识别探针-模板杂交物作为底物并水解所述探针的磷酸二酯键。所述水解反应不可逆转地释放了所述猝光剂染料对受体染料的猝灭效果，因此导致每一个连续的PCR循环增加检测荧光。特别地，适于在本文描述的方法中使用的水解探针能够检测在人和其它基因组和/或转录物组中共同的8-mer或9-mer基序并具有通过使用连接的核酸(LNA)相似物而激活的大约70℃的高Tm值。
本文中使用的术语“标记物”指可以用于提供可检测的和/或可以计量的信号的任何原子、部分或分子。特别地，所述标记物可以直接地或间接地连接至核酸或蛋白。可以连接至探针的合适的标记物包括但不限于：放射性同位素、荧光团、发色团、质量标记、电子致密粒子、磁性粒子、自旋标记物、放射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。
本文中使用的术语“染料”通常指在大于或等于300nm的波长处吸收电磁辐射的任何有机或无机分子。
本文中使用的术语“荧光染料”通常指基于电磁辐射源(如灯、光电二极管或激光)的照射、通过荧光机制放射更长波长的电磁辐射的任何染料。
术语“弹性体”具有本领域通用的含义。因此，例如，Allcock等(Contemporary Polymer Chemistry，第二版)大体上描述了作为存在于它们玻璃转变温度和液化温度之间的温度的聚合物的弹性体。弹性材料展示了弹性性质，因为所述聚合物链容易地进行扭力运动以允许在应答压力时所述骨架链解开，在没有压力时所述骨架链重新盘绕以采用开始的形状。通常，当有压力时，弹性体变形；但当移除压力时，又返回至它们初始的形状。
“多肽标记物”或“多肽性位点”是发生核苷酸序列变异的位点。示例的标记物具有至少两个等位基因，在选择的群体中，每一个发生的频率大于1％和更典型地大于10％或20％。多肽性位点可以小至一个碱基对。多肽标记物包括限制性片段长度多态性(RFLPs)、可变数量的串联重复(VNTR’s)、超变区域、微卫星、二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、简单序列重复、缺失和插入元件如Alu。第一个被鉴定的等位基因形式被任意地指定为参考形式，其它等位基因形式被指定为可选的或可变的等位基因。在选择群体中最大频率发生的所述等位基因形式有时被引证为野生型形式。二倍体生物对于等位基因形式可以是纯合的或杂合的。双等位基因多态性具有两个形式。三等位基因多态性具有三个形式。
“单核苷酸多态性”(SNP)发生在由单核苷酸占据的多态性位点处，其是等位基因序列之间变化的位点。该位点之前和之后通常都有高度保守的等位基因序列(如，小于群体中1/100或1/1000个成员变化的序列)。通常由于在多态性位点处由一个核苷酸取代另一个核苷酸而出现SNP。转换是一种嘌呤取代另一种嘌呤或一种嘧啶取代另一种嘧啶。颠换是嘌呤由嘧啶取代，反之亦然。SNP同样可以由相对于参考等位基因的核苷酸缺失或核苷酸插入而出现。
“锁定的核酸”通常指不易得到的RNA，是一种修饰的RNA核苷酸。锁定的核酸核苷酸的核糖部分由连接2’和4’碳的额外桥所修饰。所述桥将核糖“锁”在3’内部结构构造中，其通常在A型DNA或RNA中发现。锁定的核酸核苷酸可以与寡核苷酸中的DNA或RNA碱基在任何需要的时候混合。所述锁定的核糖构造增强了碱基堆积和骨架预组织。这明显增加了寡核苷酸的热稳定性(解链温度)。见，如，Kaur，H；Arora，A；Wengel，J；Maiti，S(2006).″Thermodynamic，Counterion，and Hydration Effects forthe Incorporation of Locked Nucleic Acid Nucleotides into DNA Duplexes，″Biochemistry 45(23)：7347-55。
分析小细胞群或单细胞的核酸的方法
适于分析的样品/细胞
包含核酸的样品或单细胞可以从生物来源中获得并使用本领域已知的常规方法制备。具体地，在本文描述的方法中有用的DNA或RNA可以从任何来源提取和/或扩增，包括细菌、原生生物、真菌、病毒、细胞器以及更高等的生物如植物或动物，如哺乳动物和更具体地人。合适的核酸同样可以从环境来源(如，池塘水)、人造产物(如，食物)、法庭材料等获得。可以通过任何多种标准技术从细胞、体液(如血液、血液部分、尿液等)或组织样品中提取或扩增核酸。细胞可以培养或来自如临床样品的初始分离物。示例的样品包括血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹腔液、胸腔液、口腔液和皮肤外部部分的样品；来自呼吸道、肠道、生殖道和尿道的样品；眼泪、唾液、血细胞、干细胞或肿瘤的样品。例如，胎儿DNA样品可以从胚胎(如，从一个或几个胚胎细胞或胎儿细胞)或母本血液中获得。样品可以从活的或死的生物或体外培养物中获得。示例的样品可以包括单细胞、石蜡包埋的组织样品和针取活检。本文描述的方法中使用的核酸还可以源自一个或多个核酸库，包括cDNA、粘粒、YAC、BAC、P1、PAC库等等。
样品可以表现特定状态，如细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、疾病、接触刺激和/或时期，如发育时期。
在特定实施方式中，本文描述的方法可以基于植入前胚胎的单细胞、干细胞、疑似癌细胞、致病生物细胞和/或从犯罪现场获得的细胞而实现。例如，可以分析人卵裂球(如来自八细胞期胚胎或之后的胚胎)以测定所述基因组是否包括一种或多种遗传缺陷。
可以使用本领域熟知的方法分离感兴趣的核酸，特定方法的选择依赖于核酸的来源和性质，和相似因素。所述样品核酸不需要是纯的形式，但需要是典型地足够纯净以使得本文描述的方法的扩增步骤得以实现。当目标核酸是mRNA时，所述RNA可以通过本领域已知的和如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Vol.1，2，3(1989)中描述的标准方法逆转录成cDNA。然后可以根据本文描述的方法分析所述cDNA。
在一些实施方式中，单细胞可以直接添加至合适的WGA反应混合物中并完成WGA。在其它实施方式中，单细胞的RNA可以转变成DNA(如cDNA)或直接扩增RNA。
目标核酸
可以扩增的任何目标核酸可以使用本文描述的方法检测。在一些实施方式中，至少一些核苷酸序列将被认为是目标核酸。例如，如果PCR用于预扩增/扩增目标核酸，对于给出的目标核酸的每一末端，典型地可利用足够的序列信息以允许设计合适的扩增引物，虽然，本领域技术人员意识到，如同mRNA(如使用寡聚dT)，未知序列的目标核酸可以被扩增(如，使用简并引物池或组合引物池，如随机六聚体)。
所述目标可以包括，如与病原体如病毒、细菌、原生生物或真菌相关的核酸；RNA，如过表达或欠表达是疾病的预示的那些，以组织特异模式或发育特异模式表达的那些；或由特定刺激诱导的那些；基因组DNA，如，在基因型分析中可以被用于分析特定多态性(如SNP)、等位基因或单体型的那些。特别感兴趣的是在遗传疾病或其它病理学中改变(如扩增、缺失和/或突变)的基因组DNA；与期望的或非期望的性状相关的序列；和/或唯一地鉴定个体的序列(如，在法庭或父权鉴定中)。
在特定实施方式中，所述目标核酸包括多态性，如单核苷酸多态性(SNP)。这种情况下，所述扩增引物可以是SNP特异的，意思是至少一个引物杂交SNP，使得仅当SNP存在于样品核酸中时产生扩增子。
在一些实施方式中，为了表征特定状态(细胞增殖、细胞分化、细胞死亡、疾病、刺激接触)和/或时期(如发育时期)，可能期望扩增目标核酸的收集物，如SNP、mRNA、非编码RNA(如miRNA)的收集物。例如，目标核酸，如miRNA的收集物可以被扩增和分析与特定基因表达模式的关系。
引物设计
适于核酸扩增的引物是足够长以在聚合试剂的存在下启动延伸产物的合成。所述引物的精确长度和组成将取决于多种因素，包括例如，退火反应的温度、引物的来源和组成，以及使用探针时，探针退火位置和引物退火位置的接近度和引物：探针浓度的比例。例如，取决于目标核酸序列的复杂度，寡核苷酸引物典型地包含大约15至大约30个核苷酸的范围，尽管它可能包含更多或更少的核苷酸。所述引物应当与它们各自的链充分互补以选择性退火并形成稳定的双链体。引物还可以如在初始扩增中(如预扩增)具有核苷酸标签(其并非必要地意味着结合目标核酸)。本领域技术人员知道如何选择合适的引物对以扩增感兴趣的目标核酸。
例如，可以通过使用任何商业可利用的软件或开放资源软件，如Primer3(见，如Rozen和Skaletsky(2000)Meth.Mol.Biol，132：365-386；www.broad.mit.edu/node/1060等等)或通过访问Roche UPL网站设计PCR引物。将所述扩增子序列输入至Primer3程序中(其中URL探针序列加括号)以确认所述Primer3程序将设计在括起来的探针序列两侧的引物。
可以通过任何合适的方式制备引物，包括例如，克隆和限制合适的序列或通过以下方法直接化学合成，如Narang等(1979)Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯法、Brown等(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯法、Beaucage等(1981)Tetra.Lett，22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺法、美国专利号4,458,066的固相支撑法等等，或可以由商业来源提供。可选地，RNA引物可以源自用RNA酶III切割双链RNA。
可以使用Sephadex柱(Amersham Biosciences，Inc.，Piscataway，NJ)或本领域技术人员已知的其它方法纯化引物。引物纯化可以提高本文描述的方法的灵敏度。
基因组DNA分析——全基因组扩增
为分析基因组DNA，可以使用全基因组扩增(WGA)方法扩增样品核酸。合适的WGA的方法包括：
引物延伸PCR(PEP)和改进的PEP(I-PEP)-PEP典型地使用Taq聚合酶和在低严格温度下退火的15个碱基随机引物。Taq聚合酶的使用意味着最大的产物长度是大约3kb。
简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)-DOP-PCR是已建立的、广泛接受的和技术上易懂的方法。DOP-PCR使用Taq聚合酶和半简并寡核苷酸(CGACTCGAGNNNNNNATGTGG；SEQ ID NO：1)，所述半简并寡核苷酸在低退火温度下在人基因组大约一百万个位置上结合。第一批循环之后跟着更高退火温度下的大量循环，使得仅扩增在第一步骤中被标记的片段。如同PEP，DOP-PCR产生平均400-500bp的片段，其最大大小是3kb，尽管已经描述了能够产生高达10kb的片段的DOP-PCR方法。
连接介导PCR(LMP)-LMP使用核酸内切酶或化学裂解将基因组DNA样品分成片段，和连接物及引物用于它的扩增。它首先由Ludecke和合作者们描述，然后被改变以适用于小量gDNA和单细胞的WGA。Rubicon Genomics商品化了使得RNA、DNA和甲基化的DNA序列扩增的不同试剂盒(Omniplex)。有益之处包括所述方法能够扩增降解的DNA以及所有的步骤在同一个试管中完成。一个限制是它产生的片段仅到达2kb。
基于T7的DNA线性扩增(TLAD)-TLAD是最初被设计用于扩增mRNA的方案的变化形式，已经适用于WGA。它使用Alu I限制性内切酶消化并使用末端转移酶将多聚T尾添加至3’末端。然后引物与5’T7启动子和3’多聚A区一起使用，所述Taq聚合酶用于合成第二条链。所述样品然后经体外转录反应和后续的逆转录反应。主要优势是TLAD不引入序列和长度依赖的偏好。
多重置换扩增(MDA)-MDA是基于非PCR的等温方法，其基于随机六聚体与变性DNA的退火，后续在恒定温度下的链置换合成。它已经被用于小基因组DNA样品，导致合成具有有限序列代表性偏差的高分子量DNA。由于DNA通过链置换合成，启动事件的数量逐渐增加，形成超支化DNA结构的网络。所述反应可以由Phi29DNA聚合酶催化或由Bst DNA聚合酶的大片段催化。所述Phi29DNA聚合酶具有链置换活性和校正活性，导致比Taq聚合酶的错误率小100倍。
WGA试剂盒可以购自如Qiagen，Inc.(Valencia，CA USA)、Sigma-Aldrich(Rubicon Genomics；如Sigma GenomePlexSingle CellWhole Genome Amplification Kit，PN WGA4-50RXN)。本文描述的方法的WGA步骤可以使用任何可利用的试剂盒根据生产商的说明而完成。
在特定实施方式中，WGA步骤是限制的WGA，即，WGA在达到反应平台期之前停止。典型地，WGA进行多于两个扩增循环。在一些实施方式中，WGA进行小于大约10个扩增循环，例如4至8个循环之间，包括4和8个循环。但是，WGA可以进行3、4、5、6、7、8或9个循环，或者落入由任意这些值限定的范围内的一些循环。
RNA的分析
在一些实施方式中，可以分析单细胞或小细胞群的RNA中一种或多种RNA目标。合适的RNA目标包括mRNA，以及非编码RNA，如小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和与Piwi蛋白相作用RNA(piRNA)。在特定实施方式中，感兴趣的RNA如通过逆转录或扩增被转化成DNA。
例如，为分析单细胞或小细胞群的mRNA，所述mRNA通常被转化成mRNA群的DNA表现型。在一些实施方式中，使用的方法优选地产生cDNA群，其中每一种cDNA的相对量与样品群中对应的mRNA的相对量大致相同。
在特定实施方式中，根据标准方法使用逆转录酶，可以通过逆转录从mRNA模板生产cDNA。该酶(其存在于所有的逆转录病毒(如鸟类成髓细胞瘤病毒)中)将脱氧核糖核苷酸添加至引物的3’末端(Varmus，Science 240：1427-1435(1988))。通过使用如特异引物、寡聚dT或随机引物可以启动细胞mRNA群的逆转录。为分析代表细胞mRNA的cDNA库，可以使用逆转录酶合成与样品细胞RNA互补的cDNA第一链。这可以使用商业可利用的BRL Superscript II试剂盒(BRL，Gaithersburg，Md)或任何其它商业可利用的试剂盒完成。逆转录酶优选地使用RNA作为模板，但也可以使用单链DNA模板。因此，可以使用逆转录酶和合适的引物(如，多聚A、随机引物等等)完成cDNA第二链的合成。还可以使用E.coli DNA聚合酶I完成第二链合成。可以在第二cDNA链合成的同时或之后移除所述RNA。这可以通过例如用降解RNA的RNA酶(如E.coli RNA酶H)处理混合物而完成。如上所述，Rubicon Genomics出售使得RNA扩增的试剂盒(Omniplex)。
在其它实施方式中，使用扩增方法从mRNA模板生产cDNA。在这样的实施方式中，典型地使用生产代表mRNA群的cDNA群的扩增方法。
单细胞或小细胞群的非编码RNA的分析典型地起始于感兴趣的RNA转化成DNA。该转化可以通过逆转录或扩增完成。在一些实施方式中，使用的方法优选地产生DNA群，其中每一种DNA的相对量与样品群中对应的mRNA的相对量大致相同。使用优先与感兴趣的RNA退火的引物可以选择性地逆转录或扩增所述目标RNA。合适的引物可以商业获得或由本领域技术人员设计。例如，Applied Biosystems出售用于微小RNA(miRNA)目标的MegaPlexTM引物池。这些引物可以用于逆转录(RT)和特定目标扩增(STA)。见，如实施例2B。
预扩增
在特定实施方式中，预扩增由WGA产生的扩增的基因组或从RNA产生的DNA(如cDNA)以生产预扩增反应混合物，所述预扩增反应混合物包含一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸的扩增子。在一些实施方式中，使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸的引物对完成预扩增。典型地，使用预扩增引物、合适的缓冲液系统、核苷酸和DNA聚合酶(如修改为用于“热启动”条件的聚合酶)完成预扩增。然后进一步在终点检测或实时检测中对由所述方法制备的扩增子进行PCR分析。
用于预扩增的示例的反应混合物包含合适的缓冲液、镁离子(Mg2+)源(范围是大约1至大约10mM，优选地范围是大约2至大约8mM)、核苷酸和可选地去垢剂和稳定剂。合适的缓冲液的一个例子是浓度大约5mM至大约85mM、优选浓度是10mM至30mM的TRIS缓冲液。在一种实施方式中，在反应混合物双倍浓度(2X)形式中所述TRIS缓冲液浓度是20mM。所述反应混合物的pH值范围可以是大约7.5至大约9.0，典型的pH范围是大约8.0至大约8.5。核苷酸的浓度可以是范围在大约25mM至大约1000mM，典型地范围在大约100mM至大约800mM。dNTP的浓度的例子是100、200、300、400、500、600、700和800mM。所述反应混合物中同样包括去垢剂如吐温20、Triton X100和Nonidet P40。还可以包括稳定剂如二硫苏糖醇(DTT，Cleland′s反应物)或巯基乙醇。
在特定实施方式中，所述预扩增引物是与在制备所述样品的扩增实验中使用的那些相同的序列，尽管通常是以减少的浓度。所述引物浓度可以是如比在扩增实验中使用的引物浓度少大约10至大约250倍。实施方式包括使用比在扩增实验中的引物浓度少大约10、20、35、50、65、75、100、125、150、175和200倍的引物。在预扩增中使用的引物包括随机引物、多聚A尾和/或被设计扩增感兴趣的目标核酸的特异引物。所述反应混合物可选择地包含用于标准化后续的实时定量PCR分析结果的参考染料。常规商业可用的参考染料的例子是ROX。包含ROX染料的商业可用的反应混合物是CellsDirect 2X反应混合物，目录号11754-100和11754-500，购自Invitrogen Corporation。
还可以向反应混合物中添加Taq聚合酶。Platinum
Figure BPA00001431244400201
Taq DNA是结合有在环境温度下抑制聚合酶活性的抗体的重组Taq DNA聚合酶。假如“热启动”时，在PCR的变性步骤之后，全聚合酶活性恢复。
在特定实施方式中，预扩增至少进行两个循环。在一些实施方式中，预扩增进行少于大约20个循环，如8和18个循环之间，包括8和18个循环。但是，预扩增可以进行3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个循环或者落入任何这些值限定的范围内的一些循环。在一种示例的实施方式中，预扩增可以进行大约14个循环以将被检测的扩增子增加大约16,000倍。
扩增
基于预扩增产生的扩增子方便地通过如PCR的扩增方法分析。在特定实施方式中，来自单细胞或小细胞群的预扩增样品可以用于在低体积PCR反应设备中实施的许多分离的PCR反应。在一些实施方式中，使用一种或多种特异于一种或多种感兴趣的目标核酸的引物对实施预扩增。因此，低体积PCR反应设备可以包括用每一引物对进行扩增的分离的反应室，使得在特定反应室中扩增子的生产显示了对应的目标核酸存在于样品中。
进行低体积PCR的反应室可以是大约2nL至大约500nL。所述反应室体积越小，可能进行的单独实验的数量越大(使用不同探针或引物组或作为相同探针和引物组的复制或多种复制和多种不同实验的任何排列)。在一种实施方式中，所述反应室是大约2nL至大约50nL，优选地2nL至大约25nL，更优选地大约4nL至大约15nL。在一些实施方式中，所述反应室体积是5nL、6nL、7nL、8nL、9nL、10nL、11nL或12nL。
所述反应室可以由不反应的材料构造，如玻璃、塑料、硅、弹性聚合物如聚二甲硅氧烷、聚氨酯或其它聚合物。
在特定实施方式中，可以使用BioMarkTM系统(Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA)分析预扩增产物。所述BioMark系统使用提供对多种样品运行多个检测的聚二甲硅氧烷微流体装置。例如，一种32×32矩阵芯片具有对32个单独样品进行32个单独检测的能力。一种48×48矩阵芯片具有对48个单独样品进行48个单独检测的能力。一种96×96矩阵芯片具有对96个单独样品进行96个单独检测的能力。所述96×96矩阵芯片在共同未决的美国临时申请号61/044,417中更加详细地描述，出于它对96×96芯片的设计、制作和使用的描述，其因此通过引用的方式结合至本文。
在例示的实施方式中，实施5至96个单独的PCR检测、具体地大约5至48个检测、更具体地大约8至大约48个检测以及更具体地大约10至大约48个检测以检测感兴趣的扩增子。在其它实施方式中，对从单细胞制备的样品实施多于10个、多于12个、多于15个、多于17个、多于20个、多于23个、多于25个、多于28个、多于30个、多于33个、多于35个、多于37个、多于40个、多于45个、多于48个、多于50个、多于53个、多于55个、多于58个、多于60个、多于63个、多于65个、多于68个、多于70个、多于73个、多于75个、多于78个、多于80个、多于83个、多于85个、多于88个、多于90个、多于93个或多于96个PCR检测。在一些实施方式中，特别是在定量PCR实验中，在预扩增混合物中的引物应当是有限的，并且扩增循环的数量应当是有限的，以使得对所有感兴趣的目标核酸提供相等的扩增。
对于运行实时PCR反应，反应混合物通常包含合适的缓冲液、范围在大约1至大约10mM(如大约2至大约8mM的范围)的镁离子(Mg2+)源、核苷酸和可选地去垢剂和稳定剂。合适的缓冲液的一个例子是浓度大约5mM至大约85mM、优选浓度是10mM至30mM的TRIS缓冲液。在一种实施方式中，在反应混合物双倍浓度(2X)形式中所述TRIS缓冲液浓度是20mM。所述反应混合物的pH值范围可以是大约7.5至大约9.0，典型的pH值范围是大约8.0至大约8.5。核苷酸的浓度可以是在大约25mM至大约1000mM的范围，典型地在大约100mM至大约800mM的范围。dNTP的浓度的例子是100、200、300、400、500、600、700和800mM。所述反应混合物中同样包括去垢剂如吐温20、Triton X100和Nonidet P40。还可以包括稳定剂如二硫苏糖醇(DTT，Cleland′s反应物)或巯基乙醇。此外，主要的混合物可能可选地包含dUTP以及尿嘧啶DNA糖基化酶(尿嘧啶-N-糖基化酶，UNG)。UNG是Escherichia coli ung基因的产物，已经被克隆、测序并在E.coli中表达。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)从DNA(单链或双链)中移除尿嘧啶残基而不首先破坏DNA糖-磷酸二酯骨架，因此防止它作为杂交目标或DNA聚合酶的模板的应用。得到的无碱基位点侧翼的磷酸二酯酶键在提高的温度下变得易受水解分裂的影响。因此，尿嘧啶碱基的移除通常伴随着DNA的分裂。Duncan，B.K.和Chambers，J.A.(1984)GENE 28，211，Varshney，U.，Hutcheon，T.和vande Sande，J.H.(1988)J.Biol.Chem.263，7776。主要混合物购自AppliedBiosystems，Foster City，CA，(TaqMan通用主要混合物，目录号4304437、4318157和4326708)。
PCR主要混合物还可以包含结构不稳定的碱基相似物，如7-去氮杂鸟嘌以阻止Hoogsteen键形成。这个的结果是实现不依赖结构扩增的可能性。见，如USPN 5,091,310，由Innis等于2992年2月25日出版。
在特定方面，可以制备预样品混合物，其可以包含TaqMan通用主要混合物、AmpliTaq-Gold
Figure BPA00001431244400222
(大约5单位/μl)、20×GT缓冲液和水。所述预样品混合物可以与感兴趣的核酸和合适的引物结合。
在本发明的一个方面，1×GT缓冲液可以包含范围在大约0.1M至大约0.8M的甜菜碱、范围在大约1mg/ml至大约4mg/ml的BSA、范围在大约1％至大约5％的甘油、范围在大约1％至大约5％的PEG 20,000、范围在大约0.05％至大约5％的PEG MME550、范围在大约1％至大约5％的MME5000、范围在大约1％至大约15％的PBS中的Superblock
Figure BPA00001431244400223
范围在大约1％至大约10％的SuperblockT20和范围在大约0.1％至大约3％的吐温20。在一种具体的方面，所述1×GT缓冲液可以包含大约0.4M甜菜碱、2mg/ml的BSA、大约2.5％的甘油、大约2％的PEG 20,000、大约1％的PEG MME550、大约2.5％的MME5000、大约10％的PBS中的Superblock
Figure BPA00001431244400231
大约5％的Superblock
Figure BPA00001431244400232
T20和大约0.5％的吐温20。在一种更具体的实施方式中，所述1×GT缓冲液可能包含大约0.4M甜菜碱、4mg/ml的BSA、大约5％的甘油、大约2％的PEG 20,000、大约1％的PEGMME550、大约2.5％的MME5000、大约10％的PBS中的Superblock
Figure BPA00001431244400233
大约10％的Superblock
Figure BPA00001431244400234
T20和大约1％的吐温20。
在本发明的另一方面，可以制备20×GT缓冲液，并在反应混合物中稀释为1×的终浓度。例如，20×GT缓冲液中可以包含范围在大约lM至大约10M的甜菜碱、范围在大约5mg/ml至大约15mg/ml的BSA、范围在大约20％至大约65％的Superblock
Figure BPA00001431244400235
T20(TBS中)。在一种特定的方面，所述GT缓冲液可以包含大约5M甜菜碱、大约10mg/ml的BSA和大约57％的TBS中的Superblock
Figure BPA00001431244400236
T20。本领域技术人员知晓，所述20×GT缓冲液可以在终反应混合物中稀释至1×。
在特定的实施方式中，所述检测通常具有的动态范围是至少3个数量级、更通常地是至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个数量级。
检测
扩增子的检测可以通过本领域已知的任何方法实现。荧光核酸酶检测是可以在本文描述的方法中成功使用的实时定量方法的一个特定例子。所述监测扩增产物形成的方法包括使用双标记荧光寡核苷酸探针连续测量PCR产物累积量——一种在文献中经常被指为“TaqMan
Figure BPA00001431244400237
方法”的手段。见美国专利号5,723,591；Heid等，1996，Real-time quantitative PCRGenome Res.6：986-94，均通过引用的方式全文结合至本文，特别是它们关于双标记荧光寡核苷酸探针的使用的公开内容。应当意识到，虽然“TaqMan
Figure BPA00001431244400238
探针”对于qPCR是最广泛使用的，本发明并不限制于使用这些探针；可以使用任何合适的探针。在具体的实施方式中，可以使用探针是双标记荧光寡核苷酸探针的任何检测方法。
在具体的实施方式中，可以用作探针的可检测标记物的荧光团包括，但不限于：若丹明、花青素3(Cy3)、花青素5(Cy5)、荧光素、VicTM、LizTM.、TamraTM、5-FamTM、6-FamTM和德克萨斯红(分子探针)。(VicTM、LizTM.、TamraTM、5-FamTM、6-FamTM全部购自Applied Biosystems，FosterCity，Calif.)。
在一些实施方式中，所述在应答激发光时给出荧光信号的标记探针的量典型地涉及在扩增反应中产生的核酸的量。因此，在这样实施方式中，荧光信号的量与在扩增反应中产生的产物的量有关。在这样实施方式中，可以因此通过测量荧光指示剂的荧光信号的强度来测量扩增产物的量。根据一些实施方式，可以使用内部标准来量化由荧光信号指示的扩增产物。见，如美国专利号5,736,333。
已经开发了装置，所述装置可以实施使用包含荧光指示剂的组合物的热循环反应、发射特定波长的光束、读出荧光染料的强度和在每一次循环后显示荧光强度。包括热循环仪、光束发射器和荧光信号检测器的装置已经在如美国专利号5,928,907、6,015,674和6,174,670中描述。
在一些实施方式中，每一个这些功能可以由分开的装置实施。例如，如果使用Q-β复制酶反应进行扩增，所述反应可以不在热循环仪中进行，但是可以包括在特定波长处发射的光束、检测荧光信号和计算并显示扩增产物的量。
在特定的实施方式中，组合的热循环和荧光检测装置可以用于精确量化目标核酸。在一些实施方式中，可以在一个或多个热循环之间和/或之后检测和显示荧光信号，因此使得可以在反应发生时“实时”监测扩增产物。在一些实施方式中，可以使用扩增产物的量和扩增循环数来计算在扩增前所述样品中有多少目标核酸序列。
根据一些实施方式，可以在预定的循环数后简单地监测扩增产物量，所述预定的循环数足以显示样品中目标核酸序列的存在。对于任何给出的样品类型、引物序列和反应条件，本领域技术人员可以容易地确定多少循环足以测定给出的目标核酸的存在。
通过在不同温度下获得荧光性，可能进行杂交的扩展。此外，PCR产物杂交的温度依赖可以用于鉴定和/或量化PCR产物。因此，本文描述的方法包括了解链曲线分析在检测和/或量化扩增子中的应用。解链曲线分析是熟知的并在例如美国专利号6,174,670、6472156和6,569,627中描述，每一篇都通过引用的方式全文结合至本文，特别是它们对于应用解链曲线分析以检测和/或量化扩增产物的描述。在示例的实施方式中，使用双链DNA染料，如SYBR绿、Eva绿、Pico绿(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、溴化乙锭等等(见Zhu等，1994，Anal.Chem.66：1941-48)实现解链曲线分析。
标记策略
任何合适的标记策略可以用于本文描述的方法中。当所述扩增混合物被分成等份且分析了每一等份中单一扩增产物的存在时，可以在扩增混合物中使用通用检测探针。在特定实施方式中，可以使用通用qPCR探针完成实时PCR检测。合适的通用qPCR探针包括双链DNA染料，如SYBR绿、Eva绿或Pico绿或结合至在所有扩增产物中存在的核苷酸序列的序列特异探针。序列特异探针的结合位置可以在预扩增和/或扩增时容易地引入至目标核酸中。
可选地，在扩增混合物中使用一种或多种目标特异qPCR探针(即，特异于被检测的目标核苷酸序列)以检测扩增产物。例如，当在大量样品中仅一些目标核酸被检测出，目标特异探针可以是有用的。例如，如果仅三个目标被检测出，可以使用对于每一个目标具有不同荧光标记物的目标特异探针。通过谨慎选择标记物，可以在单一反应中在不同波长处激发和/或检测不同标记物时进行分析。见，如Fluorescence Spectroscopy(Pesce等，Eds.)Marcel Dekker，New York，(1971)；White等，FluorescenceAnalysis：A Practical Approach，Marcel Dekker，New York，(1970)；Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，第2版，AcademicPress，New York，(1971)；Griffiths，Colour和Constitution of OrganicMolecules，Academic Press，New York，(1976)；Indicators(Bishop，Ed.).Pergamon Press，Oxford，19723；和Haugland，Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals，Molecular Probes，Eugene(1992)。
不期望的反应组分的去除
应当意识到，包含核酸的复杂混合物的、其中发生一些反应步骤的反应可以导致多种未结合的反应组分，且通过任何多种清除程序来去除这样未结合的反应组分或减少它们的浓度可以提高后续发生的反应的效率和特异性。例如，可以期望，在一些实施方式中，在实施本文描述的扩增步骤之前，去除预扩增引物或减少预扩增引物的浓度。
在一些实施方式中，可以通过简单稀释减少不期望的组分的浓度。例如，在扩增之前，预扩增的样品可以稀释大约5、10、20、50、100倍(或由任意的这些值限定的范围内的任何程度)以提高后续扩增步骤的特异性。
在一些实施方式中，可以通过多种酶的方式去除不期望的组分。合适的酶的方式的例子包括消化单链核酸的酶，如E.coli外切核酸酶I。扩增反应后剩余的过量dNTP可以通过用虾碱性磷酸酶(SAP)处理而“去除”，其从dNTP上去除了磷酸基。尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)(AmpErase
Figure BPA00001431244400261
来自Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)可以用于阻止来自初始扩增反应的不期望的引物遗留物，所述反应中所述引物中包含dUTP代替dTTP。UNG降解包含U的引物。
可选地，未反应的引物和dNTP可以通过柱层析去除。例如，出于这个目的，可以使用通过Sephadex的凝胶过滤。
在特定的实施方式中，清除包括核酸的选择性固定。例如，期望的核酸可以优先地固定在固相支撑物上。在例举的实施方式中，光-生物素(photo-biotin)连接至期望的核酸上，得到的生物素标记的核酸固定在包含如链霉亲和素的亲和基粘结剂的固相支撑物上。可选地，不期望的核酸可以被固定在固相支撑物上并通过清洗收获期望的核酸。
应用
本文描述的方法可应用于目标是检测核酸样品中一种或多种目标核酸的存在或量的任何技术。因此，例如，这些方法可应用于鉴定特定多态性(如SNP)、等位基因或单体型、或染色体异常(如扩增、缺失或非整倍体)的存在。这些方法可以用于在多种环境中实施的基因型分析中，包括遗传疾病或失调的诊断、药物基因组学(个性化医学)、农业品质控制(如，用于种子或家畜)、植物和动物群体的研究和管理(如，在水产养殖或渔业管理中或在群体多样性的测定中)、或父权或法庭鉴定。本文描述的方法可以用于生物学或环境样品中显示特定环境或有机体的序列的鉴定。例如，所述方法可以用于鉴定病原体，如病毒、细菌和真菌。所述方法还可以用于表征环境或微环境，如，表征人肠道中微生物物种。
这些方法还可以用于测定DNA或RNA(如mRNA、miRNA)拷贝数。基因组DNA中异常DNA拷贝数的测定用于例如遗传缺陷和疾病(如，癌)的诊断和/或预测。RNA“拷贝数”(即表达水平)的测定用于感兴趣的基因如在不同条件(如不同的外界刺激或疾病时期)和/或在不同的发育时期在不同个体、组织或细胞中的表达监测。
试剂盒
根据本发明的试剂盒可以包括一种或多种用于实践一种或多种本文描述的实验方法的试剂。一个试剂盒通常包括一个含有一个或多个盛有反应物(如引物和/或探针)的容器的包装盒，如一种或多种分离的成分或可选地允许反应物相兼容的混合物。所述试剂盒还可以包括从使用者立场上所期望的其它材料，如缓冲液、稀释剂、标准物和/或用于所述实验的样品处理、清洗或进行任何其它步骤的任何其它材料。
试剂盒通常包括实施本文描述的一种或多种方法的说明书。包括在试剂盒中的说明书可以附在包装盒材料上或可以作为包装盒内容物。当所述说明书是典型地书写或打印的材料，它们并不限制于此。本发明可以考虑能够储存这样的说明书并使它们与最终使用者沟通的任何媒介。这样的媒介包括但不限于电子存储媒介(如，磁盘、录音磁带、胶卷盒、芯片)、光学媒介(如CD ROM)、RF标签等等。本文中使用的术语“说明书”可以包括提供说明书的互联网位置的地址。
应当理解，本发明描述的实施例和实施方式仅是出于示例目的，考虑到的多种修饰或变化将建议给本领域技术人员并包括在本申请的精神和范围内以及后附的权利要求书的范围内。
此外，出于所有目的，引用本文的所有其它出版物、专利和专利申请通过引用的方式全文结合至本文。
实施例
实施例1
预扩增和扩增由全基因组扩增单细胞所产生的样品的方案
通过全基因组扩增的方法扩增单细胞DNA，后续预扩增，然后放置在富鲁达(Fluidigm)矩阵芯片上并通过使用BioMarkTM系统的定量实时聚合酶链式反应(qPCR)来分析DNA。所述预扩增和芯片上扩增以下述方式完成。
实施初始扩增以获得单细胞的预扩增样品。通过将2.5μl单细胞样品与缓冲液(全基因组扩增之后)、2.5μl汇集的实验物(包含各180nMol的正向引物和反向引物和50nMol的探针的192种实验物)和5μl的2XTaqMan
Figure BPA00001431244400281
PreAmp主要混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA)组合实施所述初始扩增。所述反应通过95℃、10分钟进行，然后进行14个循环的95℃、15秒和60℃、4分钟。
所述扩增在富鲁达动态阵列芯片上进行。加入至96.96阵列(FluidigmCorporation，South San Francisco，CA)的实验注入孔(inlet)中的所述溶液由浓度是9μM的引物和浓度是2.5μM的探针、1μl的50X ROX(Invitrogen)和0.25％的吐温20组成。通过混合2.5的预扩增的样品、3μL2×TaqMan
Figure BPA00001431244400282
通用主要混合物(Applied Biosystems，Foster City，CA)、0.1μL的AmpliTaq金聚合酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)、0.3μL20×GT样品上样缓冲液(Fluidigm Corporation，South San Francisco)和0.1μl无DNA水制备添加至样品注入孔的溶液。使用NanoFlexTM IFC控制器(Fluidigm Corporation，South San Francisco)上样后，在BioMarkTM系统(Fluidigm Corporation，South San Francisco，CA)中进行PCR和荧光检测以进行遗传分析。所述热循环方案由50℃ 2分钟、70℃ 30分钟、25℃ 10分钟、50℃ 2分钟、95℃ 10分钟后续40个循环的95℃ 15秒和60℃ 1分钟组成。所述阵列的反应室的最终浓度是各900nM的正向引物和反向引物和250nM的探针。
实施例2
使用富鲁达微流体装置和单细胞核酸量检测信使RNA、微小RNA 或小RNA种类的方法和方案
该实施例描述了用于获得信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和/或其它小RNA种类的动力学扩增子“实时”检测所需要的方法学，所述方法学使用少量的核酸样品，使用48.48或96.96动态阵列集成流体通路(IFC)。该实施例着眼于检测这些源自小量细胞或单细胞的核酸。使用48.48 Dynamic ArrayTM IFC，它可能分析达到48个单独样品的48个目标。使用96.96 Dynamic ArrayTM IFC，它可能分析达到96个单独样品的96个目标。可以采用相关的方案以分析48或96芯片上的甚至更多的样品和/或目标，如在共同未决的2006年8月26日提交的USSN12/548,132中所描述的，出于所有的目的，且特别是它的关于对样品加标签的方法和/或对多元分析的目标检测的描述，该文献通过引用的方式结合至本文。
A)mRNA的检测
一种示例的方案需要使用BioMark48.48动态阵列和实时PCR分析单细胞基因表达。该方案使用BioMarkTM和48.48IFC，在下文中被描述成一种获得达到单细胞48种基因的基因表达数据的新的和有效的方法。该方案能够利用最少的样品准备时间和花费测定细胞的内容物。该方案使用Invitrogen CellsDirectTM一步qRT-PCR试剂盒(目录号11753-100和11753-500)和特定目标扩增(STA)程序，覆盖了实施单细胞基因表达研究的实验室程序和试剂要求。该方法结合了单细胞检测的逆转录和特定目标扩增。该方法可以被用于分析任何核酸目标及用于分析小量样品以及单细胞样品。
分析单细胞中mRNA种类的反应物
●CellsDirectTM一步qRT-PCR试剂盒(Invitrogen，目录号：11753-100和11753-500)
●可选的：SUPERase-InTM(Ambion，PN AM2694)
●TaqMan
Figure BPA00001431244400291
通用PCR主要混合物(Applied Biosystems，PN4304437)
●TE缓冲液(Technova)
用于单细胞实验的单步RT-STA(预扩增)
1、使用者可以通过使用如在富鲁达的STA快速参考卡片(PN68000133RevB)中描述的20x常备实验物(包括引物)开始。
2、汇集所有的实时实验物并用TE缓冲液稀释以使得每一个实验物的终浓度是0.2x。这是0.2x实验混合物。
3、通过混合以下成分制备样品RT-STA主要混合物
Figure BPA00001431244400301
注意：如果在RT-STA前储存细胞或者如果怀疑RNA酶活性，向RT-STA主要混合物中加入0.1μL的Ambion的SUPERaseIn。
4、等分9μl的RT-STA主要化合物至每一个管子中或多孔板的反应孔中。通过荧光激活细胞分选术(FACS)将细胞分选至每一个单独的管子或反应孔中。(这些步骤可以根据研究者的需要变化)。
5、拍打所述管子或平板以混合。
6、直接使用或存贮在-20℃。
注解1：如果细胞分选可以在5μl的反应体积中完成，所述体积可以减少至5μl。
注解2：除非不可避免，在STA中使用探针是可选的，因为所述探针同样存在于制备的实验混合物中。当实施大量的具有低分子起始数的STA时，探针可以省略。在该步骤中省略探针可能导致更多耐用的基础消减。
注解3：包含单细胞的反应混合物可以转移至热循环仪以立即开始RT/STA热循环。
7、50℃时将RNA逆转录成cDNA 15分钟。
8、通过将样品处于95℃2分钟灭活RT酶并激活Taq。
9、特定目标扩增(STA)cDNA18个循环：95℃15秒，60℃4分钟。
10、用TE缓冲液按1∶5稀释得到的预扩增cDNA产物。
通过实时PCR(扩增)的检测
1、根据下表制备实时反应混合物
2、混合然后吸取实时反应混合物至富鲁达动态阵列(DA)的样品注入孔中。
3、吸取10x实验物至DA上的实验注入孔中。
4、按照BioMark实时PCR分析软件快速参考卡(PN 68000089)完全运行实时实验指示。
B)检测微小RNA和/或小RNA
一种分开的示例的方案需要使用BioMark 48.48动态阵列和实时PCR(PN 100-1616 A1)分析单细胞中的微小RNA。该方案允许从低浓度的总核酸中检测miRNA。miRNA和小RNA种类(U6)都可以被检测。该方案描述了在15-18个特定目标扩增(STA)循环之后分析少至100皮克的总RNA(～10个细胞)中miRNA和/或小RNA的实验室程序和反应物要求。在这个实施例中，所述方案使用了来自Applied Biosystem的用于逆转录(RT)和特定目标扩增(STA)的MegaPlexTM方法。MegaPlexTMA和B汇集物每一个包括达到381个单一引物对，使得它可以使用同样的样品分析具有最小样品输入量的许多不同的miRNA。
分析miRNA种类的反应物
●CellsDirectTM一步qRT-PCR试剂盒(Invitrogen，目录号11753-100和11753-500)
●可选的：SUPERase-InTM(Ambion，PN AM2694)
●TaqMan通用PCR主要混合物(Applied Biosystems，PN 4304437)
●TE缓冲液(Technova)
制备Megaplex(RT)反应混合物及RNA的逆转录
1、根据下表在1.5mL微离心管中制备RT反应混合物
Figure BPA00001431244400322
2、轻柔地混合所述管子几次以彻底地混合；简短地离心以收集内容物。
3、将RT反应混合物等分成4.5μL至多孔板的每一个反应孔中。
4、将3.5μl(100pg至350ng)的总RNA添加至包含反应物混合物的每一个孔中。
5、混合并离心。
6、在冰上孵育板5分钟。
7、按照下表描述热循环所述反应：
  状态   温度   时间   循环
  退火   16℃  2分钟   1
  延伸   42℃  1分钟   40
  50℃  1秒   40
  酶失活   85℃  5分钟   1
  保持   4℃  保持   -
注解：所述cDNA可以存储在-15℃至-25℃至少一周。
特定目标扩增(也被认为是预扩增)
1、根据下表在1.5mL微离心管中制备STA反应混合物：
Figure BPA00001431244400331
2、混合并离心STA反应混合物。
3、将所述STA反应混合物等分成3μL至多孔板的每一个反应孔中。
4、向每一个反应中加入2μL的上述逆转录RNA。
5、振动所述反应板并缓慢离心汇集反应混合物。
6、在冰上孵育所述板5分钟。
7、根据下表运行所述STA方案
  状态   温度   时间   循环
  热启动   95℃   10分钟   1
  退火   55℃   2分钟   1
  延伸   72℃   2分钟   1
  变性   95℃   15秒   15-18
  退火/延伸   60℃   4分钟   15-18
  保持   99.9℃   10分钟   1
  保持   4℃   保持   1
8、通过加入45μl的低EDTA TE缓冲液至每一个反应中以～1∶10比例稀释模板，最终体积为50μl。
注解：STA循环数仅是建议。实施的STA循环的可选数量将需要按经验决定，且取决于每一样品中miRNA量。
通过实时PCR(扩增)的检测
参考富鲁达48.48实时PCR工作流程快速参考卡(PN 68000089)或富鲁达96.96实时PCR工作流程快速参考卡(PN 68000130)关于制备用于分析的实验物和样品的完整说明。
当运行48.48动态阵列IFC时：如果使用汇集物A的RT引物和STA引物，则可以选择来自汇集物A的达到48个单独TaqMan微小RNA实验物用于在DA上运行。如果使用汇集物B的RT引物和STA引物，则可以选择来自汇集物B的达到48个单独TaqMan微小RNA实验物用于在DA上运行。
当运行96.96动态阵列IFC时：如果使用汇集物A的RT引物和STA引物，则可以选择来自汇集物A的达到96个单独TaqMan微小RNA实验物用于在DA上运行。如果使用汇集物B的RT引物和STA引物，则可以选择来自汇集物B的达到96个单独TaqMan微小RNA实验物用于在DA上运行。
结果
使用富鲁达DA获得典型miRNA表达数据(miRNA 30C，图3或对照小RNA U6，图4)。不同循环数的STA之后，使用变化的总RNA输入量测量miRNA或小RNA浓度。EFF显示了在稀释系列上PCR效率。下面的图5和6展示了使用m48和m96DA产生的Ct热度图数据。
图3显示了从不同总RNA起始水平的STA扩增的模板产生的标准曲线。STA反应之后，对标准物进行稀释以证明由动态阵列PCR观察到的线性。从起始材料的不同水平中保持所述线性。
图4显示了源自同样STA稀释，但是来自不同的总RNA起始量的标准曲线，证明了来自通过STA的RT步骤和最终在动态阵列PCR中的显著的实验线性。
C)方案/方法学变化
1、样品量和反应物体积的变化。
2、增加STA热循环数，达到24个循环。
3、从STA反应中去除探针以改进基础荧光的积聚。
4、使用DNA结合染料如SYBR绿或Eva绿的交替的动态扩增子检测方法。
5、非STA(即，非预扩增的)材料的应用。示例的非STA方法可以包括，如在Eberwine-style最后一次转录之前所有非rRNA的多聚腺苷酸化。更具体地，总RNA的一部分转录本不必要地包含多聚A尾；因此，它们将被多聚ARNA阳性选择技术排斥，除非添加多聚A尾。一种rRNA减少的方法可以使得所述方案在处理较小量总RNA样品时更加耐用。在一种示例的方案中，设计4种生物素化的LNA RiboMinus探针以特异结合至高丰度18S和28S rRNA种类(18S和28S rRNA每一种2种探针)。在生物素化的探针和总RNA样品中的rRNA分子杂交之后，通过加入包覆链霉亲和素的RiboMinus磁珠从所述样品中有效去除rRNA。该过程通常由Affymetrix公司使用。见www.affymetrix.com/support/help/faqs/wt.../faq_l.jsp。实施该过程的试剂盒购自Invitrogen(RiboMinusTMTechnology)。
6、具有引物或其它具有修饰的核苷酸或磷酸二酯键的引物的锁定的核酸的应用(即，Exiqon型方法)。在该情况下，不需要预扩增。
7、交替的单细胞裂解方法的应用，包括CelluLyser裂解和cDNA合成试剂盒(购自TATAA Biocenter AB，Odinsgatan 28411 03
Figure BPA00001431244400351
瑞典)的应用以促进RNA的变性并加强提高的逆转录。

Claims (32)

1.一种用于基因型分析单细胞的方法，所述方法包括：
(a)对单细胞基因组进行全基因组扩增以产生扩增的基因组；
(b)预扩增所述扩增的基因组以产生包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸的扩增子的预扩增反应混合物；和
(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。
2.一种分析单细胞RNA的方法，所述方法包括：
(a)从单细胞二RNA制备DNA；
(b)预扩增所述DNA以产生包含一种或多种特异于一种或多种目标核酸的扩增子的预扩增反应混合物；和
(c)扩增并检测所述一种或多种扩增子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述单细胞包括哺乳动物细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述单细胞选自植入前胚胎的细胞、干细胞、疑似癌细胞、致病生物的细胞和在犯罪现场获得的细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞包括人卵裂球。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述人卵裂球来自八细胞期胚胎。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞包括人干细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实施所述全基因组扩增使得达不到反应平台期。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全基因组扩增进行多于两个扩增循环。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全基因组扩增进行少于大约10个扩增循环。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述全基因组扩增进行4和8个循环之间，包括4和8个循环。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述全基因组扩增使用选自以下的技术完成：引物延伸PCR(PEP)、简并寡核苷酸引物PCR、连接介导PCR(LMP)、基于T7的DNA线性扩增(TLAD)和多重置换扩增(MDA)。
13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA是通过mRNA的逆转录或扩增制备的cDNA。
14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述RNA包括非编码RNA。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述非编码RNA选自小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和与Piwi蛋白相作用RNA(piRNA)。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，DNA通过逆转录或扩增非编码RNA制备。
17.根据前述权利要求任意一项所述的方法，其特征在于，使用一种或多种特异于所述一种或多种目标核酸的引物对完成所述预扩增。
18.根据前述权利要求任意一项所述的方法，其特征在于，所述预扩增进行8-18个循环。
19.根据前述权利要求任意一项所述的方法，其特征在于，使用一种或多种特异于所述一种或多种目标核酸的引物对完成所述扩增。
20.根据权利要求13或16所述的方法，其特征在于，DNA通过逆转录制备，后续在同样反应混合物中的预扩增。
21.根据权利要求13、16或20所述的方法，其特征在于，在所述预扩增混合物中不存在探针。
22.根据权利要求17或19所述的方法，其特征在于，所述一种或多种引物对扩增一种或多种单核苷酸多态性(SNP)。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述一种或多种SNP的存在与一种或多种遗传缺陷的存在相关联。
24.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在扩增之前，所述预扩增混合物分布至微流体装置的分离室中。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述微流体装置由弹性材料制成，或至少部分地由弹性材料制成。
26.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过聚合酶链式反应(PCR)完成所述预扩增和/或所述扩增。
27.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)测定扩增产物的存在。
28.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述扩增混合物中使用通用的qPCR探针以检测扩增产物。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述通用qPCR探针包括双链DNA(dsDNA)染料。
30.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述扩增混合物中使用一种或多种目标特异qPCR探针以检测扩增产物。
31.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用荧光核酸酶检测测定扩增产物的存在。
32.根据权利要求31所述的检测方法，其特征在于，使用双标记的荧光寡核苷酸探针检测扩增产物的存在。
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