KR101735126B1

KR101735126B1 - 돌연변이체 페니실린 ｇ 아실라제

Info

Publication number: KR101735126B1
Application number: KR1020117017104A
Authority: KR
Inventors: 반 데르 잔 메트스케 라안; 하롤드 몬로 무디; 리차드 케르크만; 반 데르 토마스 도에스
Original assignee: 디에스엠 시노켐 파마슈티칼스 네덜란드 비.브이.
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2017-05-12
Anticipated expiration: 2029-12-22
Also published as: BRPI0922510B8; WO2010072765A3; KR20110099137A; EP2367940A2; US20110256585A1; SI2367940T1; WO2010072765A2; JP2012513196A; LT2367940T; BRPI0922510B1; DK2367940T3; CN103642780B; SMT201800100T1; CN102264904B; NO2367940T3; MX2011006802A; CN103642780A; CN102264904A; US8541199B2; HRP20180318T1

Abstract

본 발명은 돌연변이체가 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제의 아미노산 넘버링에 따른 아미노산 위치 A3, A77, A90, A144, A192, B24, B109, B148, B313, B460 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는, 야생형 페니실린 G 아실라제로부터 유도된 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제에 관한 것이다.

Description

돌연변이체 페니실린 Ｇ 아실라제{MUTANT PENICILLIN G ACYLASES}

본 발명은 돌연변이된 페니실린 아실라제, 및 β-락탐 핵이 돌연변이된 페니실린 아실라제의 존재하에서 활성화된 측쇄에 의해 아실화된 β-락탐 항생물질의 제조 방법에 관한 것이다.

β-락탐 부류의 항생물질은 임상 용도에서 항균 화합물중 가장 중요한 부류이다. 천연 β-락탐 항생물질의 좁은 살균 스펙트럼, 그의 낮은 산 안정성 및 증가하는 내성 문제는 반합성 페니실린(SSP) 및 반합성 세팔로스포린(SSC)과 같은 반합성 항생물질(SSA)의 개발을 촉발시켰다. 일반적으로, 반합성 β-락탐 항생물질의 화학적 합성은 저온에서 반응성 중간체 및 유기 용매를 사용하는 엄격한 조건하에서 수행되어, 높은 후속 공정 비용 및 환경적으로 해로운 공정을 야기한다. 그러므로, 반합성 β-락탐 항생물질의 보다 지속가능한 생산을 위해 전통적인 화학적 공정을 효소적 전환공정으로 대체하기 위한 노력이 진행중이다.

천연 β-락탐은 전형적으로 β-락탐 핵(예를 들면, 6-아미노페니실린산(6-APA), 7-아미노-데스아세톡시-세팔로스포란산(7-ADCA) 등), 및 아미드 결합에 의해 핵에 연결되는 소위 측쇄로 이루어진다. 페니실린 G 아실라제(EC 3.5.1.11)는 페니실린 G(PenG), 세팔로스포린 G(CefG) 및 관련 항생물질의 측쇄를 제거하여 유리된 측쇄(PenG 및 CefG의 경우 페닐아세트산(PAA))와 함께 상응하는 탈아실화 핵 6-APA 및 7-ADCA를 각각 생성하기 위해 광범위하게 사용되는 가수분해 효소이다. 이들 탈아실화 β-락탐 중간체는 암피실린, 아목시실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 세팔렉신, 세파드록실, 세프라딘, 세파클로르, 세프프로질, 세파톡심 등과 같은 SSA의 구성 요소이다. PenG 아실라제에 대한 최근의 고찰은 문헌 [Rajendhran J, and Gunasekaran P., J. Biosci. Bioeng., 97, 1-13 (2004); Arroyo M et al., Appl Microbiol Biotechnol. 60, 507-514 (2003); Sio CF and Quax WJ. Curr Opin Biotenchol., 15, 349-355 (2004); Chandel, A.K. et al. Enzyme and Microbial Technology, 42, pp. 199-207 (2008)]을 참조하시오.

β-락탐 화합물을 탈아실화하는 것 이외에도, PenG 아실라제 및 아미노 에스터 하이드롤라제는 또한 β-락탐 항생물질을 합성하는데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 과정에서, PenG 아실라제는 활성화된 측쇄와 탈아실화된 β-락탐 중간체(예를 들면, 6-APA, 7-ADCA, 7-ACA 등)의 축합을 촉진한다. β-락탐 항생물질의 효소-촉진된 합성은 평형-제어되거나 또는 동력학적으로 제어된 전환 공정으로 수행될 수 있다. 평형-제어 전환 조건하에서, 도달될 수 있는 생성물 축적 수준은 반응의 열역학적 평형에 의해 좌우되며, 이것은 반-합성 항생물질 합성의 경우, 특히 반응이 수성 매질중에서 수행되는 경우에 불리하다. 동력학적으로 제어되는 전환에서는, 효소는 활성화된 측쇄, 즉 아실 공여체로부터 β-락탐 핵, 즉 친핵성 수용체로의 아실기의 전이를 촉진한다. 반합성 페니실린의 제조시, 활성화된 측쇄는 방향족 카복실산의 아미드-유도체 또는 메틸에스터일 수 있다. 이 경우, 생성물 축적 수준은 효소의 촉매성에 의해 좌우되며 아실-전이 생성물의 높은 비-평형 농도가 일시적으로 달성될 수 있다. SSA의 합성에 사용되는 측쇄의 예는 활성화된 페닐글라이신, 활성화된 하이드록시페닐글라이신, 활성화된 다이하이드로-페닐글라이신 등이다.

PenG 아실라제는 아실-효소 중간체를 거쳐 아미드와 에스터의 가수분해를 촉진하는데, 이때 β-서브유닛의 N-말단 세린이 아실기로 에스터화된다. 가수분해의 경우, 물이 아실-효소를 공격하여 가수분해를 완료시킨다. 첨가된 외부 친핵체(예를 들면, 6-APA, 7-ADCA)의 아미노기가 존재하는 경우, 친핵체와 물은 둘 다 아실 효소를 공격하여, 목적하는 아실-전이 생성물(항생물질) 및 바람직하지 않은 가수분해된 아실 공여체를 각각 생성할 수 있다.

아실 트랜스퍼라제로 작용하는, 즉, SSA를 합성하는 PenG 아실라제의 능력은 이미 다양한 반합성 β-락탐 합성물질의 효소적 생성에 있어 산업적 규모로 개발되고 있다. 그러나, SSA의 생성에 있어, 물에 의한 가수분해 반응은 활성화된 전구체 측쇄의 소실로 인해 전이 반응의 효율을 감소시킨다. 합성 속도(S)와 가수분해 속도(H) 사이의 비는 PenG 아실라제의 합성 성능을 평가하기 위한 중요한 파라미터이다. S/H 비는 효소적 아실화 반응동안 규정된 조건에서 가수분해 생성물에 대한 합성된 생성물(SSA)의 몰비와 동등하다. 여기서 합성 생성물은 활성화된 측쇄와 β-락탐 핵으로부터 생성된 β-락탐 항생물질로 정의된다. 여기서 가수분해 생성물은 활성화된 측쇄의 상응하는 산으로 정의된다. 경제적으로 유리한 공정을 위해, S/H 비가 높은 것이 바람직한 동시에, 효소 활성도 또한 충분히 높은 것이 바람직하다.

전환반응에서 관찰된 S/H 비는 반응물, 반응 조건 및 전환반응의 진행에 따라 달라진다. 유시코(Youshko) 등은 S/H 비의 초기 값이 효소의 동력학적 성질 및 친핵성 수용체(예를 들면, 6-APA)의 농도 둘 다에 따라 달라짐을 밝혔다(문헌 [Youshko, M.I. and Svedas, V.K., Biochemistry (Moscow), 65, 1367-1375 (2000) and Youshko, M.I. et al. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1599, 134-140 (2002)] 참조). 고정된 조건 및 친핵체 농도에서, 초기 S/H 비를 이용하여 다양한 PenG 아실라제 및/또는 다양한 PenG 아실라제 돌연변이체의 성능을 비교할 수 있다. 또한, 다양한 PenG 아실라제의 성능은 전환반응동안 합성 및 가수분해를 시간의 함수로서 측정함으로써 비교할 수 있는데, 이에 의해 전환반응의 각각 다른 단계들에서 S/H 비의 계산이 가능하다. 아실화 반응에서 PenG 아실라제의 합성 활성(= 합성 생성물이 생성되는 속도 = 합성 속도 = 생성 속도)은 규정된 조건에서 단위 시간당 아실화 반응에서 생성된 β-락탐 항생물질의 양을 말한다. 바람직하게는, 초기 활성을 측정한다. 초기 효소 활성은 아실화 반응을 수행한 후 합성된 생성물의 양 대 반응 시간의 그래프, 소위 진행 곡선을 작성함으로써 측정될 수 있다. 일반적으로, 전환반응 초기에 생성물 생성 속도는 비교적 일정하며, 활성은 진행 곡선의 기울기로부터 직접 유도할 수 있다. 전환반응 초기에 합성 활성이 이미 감소하기 시작하는 경우, 초기 속도는 진행 곡선의 외삽 및 t=0에서의 기울기 계산에 의해 수득되어야 한다. 다양한 PenG 아실라제의 활성을 비교하기 위해, 합성 활성은 동일한 양의 단백질로 표준화되어야 한다. 합성 초기 속도에 대한 동일한 방법으로, 가수분해된 활성화된 측쇄의 양 대 반응 시간의 그래프로부터 가수분해의 초기 속도를 측정할 수 있다.

PenG 아실라제는 PenG 아실라제 돌연변이체를 포함하는 여러 연구의 주제가 되어 왔다. 공개된 돌연변이의 광범위한 목록이 제공되어 있다[Rajendhran and Gunasekara, J. Biosci. Bioeng., 97, 1-13 (2004)]. 보다 최근에, 또 다른 연구가 발표되었다[Gabor, E.M. and Janssen, D.B., Protein Engineering, Design and Selection, 17, 571-579 (2004); Jager, S.A.W. et al., Journal of Biotechnology, 133, 18-26 (2008); Wang, J., et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 74, 1023-1030 (2007)].

기스트-브로카데스(Gist-brocades)의 국제 특허출원 공개 제 WO96/05318 호는 하나 이상의 아미노산 위치에서 기질 결합 부위를 돌연변이시킴으로써 PenG 아실라제의 특이성이 어떻게 변화될 수 있는지를 교지하고 있다. PenG 아실라제의 S/H 비는 또한 이런 방식으로 조정될 수 있는 것으로 나타났다.

또한, 국제 특허출원 공개 제 WO98/20120 호(브리스톨-메이어스 스퀴브(Bristol-Meyers Squibb)), 국제 특허출원 공개 제 WO03/055998 호(기스트-브로카데스) 및 중국 특허출원 제 CN101177688 호(상하이 생명과학 연구소(Shanghai Institute for Biological Sciences))는 PenG 아실라제 돌연변이체를 사용하여 β-락탐 핵 및 활성화된 측쇄로부터 β-락탐 항생물질을 효소적으로 제조하는 방법을 기술하고 있다. 국제 특허출원 공개 제 WO98/20120 호는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) PenG 아실라제의 α-서브유닛중 아미노산 위치 142 및 146에서, 및 β-서브유닛 중 아미노산 위치 24, 56 또는 177에서의 돌연변이를 개시하고 있다. 특히, 위치 β24에서 돌연변이를 갖는 PenG 아실라제 변이체(Fβ24A)(페닐알라닌이 알라닌으로 치환됨)는 페니실린 및 세팔로스포린 합성에서 훨씬 더 높은 수율을 산출하는 것으로 보인다. 그러나, 국제 특허출원 공개 제 WO03/055998 호에서는, 에스터 전구체 대신에 아미드 전구체를 상기 돌연변이체 Fβ24A와 함께 사용하는 공정에서, S/H 비가 여전히 높지만 효소 활성은 낮아서 상기 돌연변이체의 사용은 경제적으로 훨씬 덜 유리한 것으로 나타났다. 그 대신, 국제 특허출원 공개 제 WO03/055998 호에서는, α-서브유닛중 위치 145에서 아르기닌이 류신(Rα145L), 시스테인(Rα145C) 또는 라이신(Rα145K)으로 치환된 PenG 아실라제 돌연변이체가 또한 개선된 S/H 비를 나타내었으나, 또한 특히 아미드 전구체를 사용하여 더 높은 수준의 합성 활성을 유지한 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고, 모든 상기 돌연변이체들의 합성 활성은 야생형 PenG 아실라제의 합성 활성보다 낮았다.

중국 특허출원 제 CN101177688 호는 바실러스 메가테리움( Bacillus megaterium) PenG 아실라제의 돌연변이체 중에서 또한 S/H 비의 개선이 합성 활성의 감소에 의해 달성되었음을 개시하였다.

유럽 특허 제 EP1418230 호(튜-테크놀로지 게엠베하(TUHH-Technologie GmbH))는 α-서브유닛의 번역 후 성숙이 불완전하여 페니실린 G 및 6-니트로-3-페닐아세트아미드 벤조산(NIPAB로도 지칭됨)에 대해 더 높은 가수분해 활성을 야기한 알칼리제네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis) PenG 아실라제를 개시하고 있다. 상기 α-서브유닛의 불완전한 진행은 α 및 β 서브유닛 사이의 소위 링커 영역에서의 아미노산 치환에 의해 야기되었다. 상기 돌연변이가 또한 합성 활성을 증가시킬 수 있는지 없는지는 기재되지 않았다.

상기에 고찰된 선행 기술은, PenG 아실라제의 다양한 돌연변이체의 S/H 비를 증가시키는 것은 가능하지만, S/H 비의 상기 개선은 야생형 PenG 아실라제에 비해 합성 활성의 감소에 의해 달성됨을 보여준다. 그러므로, 상기 돌연변이체의 불리한 점은 상기 전환반응에서 긴 전환 시간 또는 매우 고농도의 돌연변이체 PenG 아실라제가 필요한데, 불가능한 경우 이로 인해 상기 돌연변이체의 산업적 적용이 경제적으로 불리하게 된다는 것이다.

본 발명의 목적은 산업적 공정에 적합하기 위해 야생형 효소에 비해 합성 활성을 유지하거나 또는 더 바람직하게는 증가시키면서 증가된 S/H 비를 갖는 돌연변이체 PenG 아실라제를 제공하는 것이다.

첫 번째 태양에서, 본 발명은 돌연변이체가 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제의 아미노산 넘버링에 따른 아미노산 위치 A3, A77, A90, A144, A192, B24, B109, B148, B313, B460 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하고, 하기에 나타낸, 야생형 페니실린 G 아실라제로부터 유도된 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 제공한다:

상기 유전자에 의해 암호화된 완전한 폴리펩티드 쇄는 신호 펩티드(26개 아미노산 - 단일선 밑줄 부분), α-서브유닛(209개 아미노산), 연결 펩티드(54개 아미노산 - 이중선 밑줄 부분) 및 β-서브유닛(557개 아미노산)으로 이루어진다. 신호 펩티드 및 연결 펩티드는 둘 다 번역 후 성숙동안 제거되므로, α- 및 β-서브유닛으로 이루어진 효소적으로 활성인 페니실린 G 아실라제가 수득된다. α-서브유닛에서 아미노산은 A1 내지 A209로 번호를 매기고, β-서브유닛에서는 B1에서 B557까지 번호를 매긴다.

본원에서 야생형 페니실린 G 아실라제는 천연 페니실린 G 아실라제로 정의된다. 야생형 페니실린 G 아실라제는 임의의 적당한 야생형 페니실린 G 아실라제일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제, 및 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 30% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 페니실린 G 아실라제로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게, 야생형 페니실린 G 아실라제는 표 1에 요약되어 있고 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에 대해 30% 이상의 상동성을 나타내는 19개의 페니실린 G 아실라제로 이루어진 군에서 선택된다.

군	#	야생형 페니실린 G 아실라제 공급원	최장 동일성 (%)	유니프롯(UNIPROT):ID^*
I	1	에스케리키아 콜라이	100	PAC ECOLX
I	2	클루이베라 크리오크레센스	86	PAC KLUCI
II	3	프로비덴시아 스튜알티 ATCC 2582	64	B2PV17 PROST
II	4	프로비덴시아 레트게리	62	Q7WZI9 PRORE
II	5	아크로모박터 종 CCM 4824	54	Q3ZEF0 9BURK
II	6	미배양 감마 프로테오박테리아	53	Q6PWR5 9GAMM
II	7	아크로모박터 자일로스옥시단스	53	Q83YY8 ALCXX
III	8	파라코커스 데니트리피칸스 PD122	45	A1BBI0 PARDP
III	9	세라티아 프로테아마큘란스 568	45	A8GGK2 SERP5
III	10	알칼리제네스 페칼리스	43	B5TYU3 ALCFA
III	11	알칼리제네스 페칼리스	43	Q8VQG6 ALCFA
III	12	알칼리제네스 페칼리스	42	B1AEQ1 ALCFA
III	13	알칼리제네스 페칼리스	42	O34142 ALCFA
III	14	스핀고모나스 위티치 RW1	41	A5V4S1 SPHWW
IV	15	아시네토박터 바우마니 AYE	39	B0V5B7 ACIBY
IV	16	아시네토박터 바우마니 ACICU	38	B2I261 ACIBC
IV	17	아시네토박터 바우마니 ATCC 17978	38	A3M5T4 ACIBT
IV	18	바실러스 메가테리움	34	PAC BACME
IV	19	바실러스 바디우스	34	Q45TR7 BACBA
IV	20	아트로박터 비스코서스	33	PAC ARTVI
*보편적 단백질 자원(Universal Protein Resource)(http://www.uniprot.org/)

서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 40 내지 100%의 상동성을 나타내는 페니실린 G 아실라제(예를 들면, I 내지 III 군에 속한 페니실린 G 아실라제)가 보다 바람직하며, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 50 내지 100%의 상동성을 나타내는 페니실린 G 아실라제(예를 들면, I 내지 II 군에 속한 페니실린 G 아실라제)가 훨씬 더 바람직하고, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 대해 80 내지 100%의 상동성을 나타내는 페니실린 G 아실라제(예를 들면, I 군에 속한 페니실린 G 아실라제)가 훨씬 더 바람직하다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이로부터의 야생형 페니실린 G 아실라제가 가장 바람직하다.

바람직한 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제는 위치 B24에서 하나 이상의 아미노산 치환 및 A3, A77, A90, A144, A192, B109, B148, B313, B460 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 갖는다. 위치 B24에서의 돌연변이는 당분야에 공지되어 있다. 국제 특허출원 공개 제 WO96/05318 호는 알칼리제네스 페칼리스의 페니실린 G 아실라제에서 B24에서 천연 Phe를 양으로 하전된 아미노산 라이신 또는 아르기닌으로 치환시키는 것을 개시하고 있다. 특히 B:F24K 돌연변이체는 기질 페닐아세틸-류신을 분리시켜 류신을 유리시키고 알칼리제네스 페칼리스의 돌연변이체 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 유전자로 형질전환된 류신-결핍 에스케리키아 콜라이 균주가 성장하게 하는 개선된 능력을 나타내었다. 국제 특허출원 공개 제 WO98/20120 호는 에스케리키아 콜라이의 페니실린 G 아실라제의 위치 B24에서의 모든 가능한 돌연변이를 개시하고 있다. 특히 B24에서 Ala에 의한 천연 Phe의 치환은 세파드록실(Cefadroxil)의 합성동안 S/H 비에 상당한 개선을 제공하였다.

본 발명에 이르러, 놀랍게도, B24에서의 돌연변이와 A3, A77, A90, A144, A192, B148, B109, B313, B460 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이와의 조합은, 위치 B24에서의 돌연변이만을 갖는 페니실린 아실라제 돌연변이체에 비해, 다양한 반합성 세팔로스포린 및 반합성 페니실린의 합성 반응동안 증가된 합성 활성 및 선택적으로 더 개선된 S/H 비를 갖는 페니실린 아실라제 돌연변이체를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 조합체(조합체는 본원에서 야생형 효소에 비해 2개 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 효소로 정의된다)는 위치 [B24+A144] 또는 위치 [B24+B109] 또는 위치 [B24+B460] 또는 위치 [B24+A144+B109] 또는 위치 [B24+B109+B460] 또는 위치 [B24+B144+B460] 또는 위치 [B24+B109+B144+B460]에서 돌연변이를 포함한다. 다른 바람직한 조합체는 위치 [B24+B460+A3+A192] 또는 위치 [B24+B460+A90] 또는 위치 [B24+B148+B460] 또는 위치 [B24+B148+B460+A3+A192] 또는 위치 [B24+B148+B460+A90]에서 돌연변이를 포함한다.

또 다른 바람직한 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제는 위치 B460에서 하나 이상의 아미노산 치환, 및 선택적으로 A3, A77, A90, A144, A192, B24, B148, B109, B313 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 위치 B460과 적어도 위치 B24와의 바람직한 조합체는 상기에 열거하였다. 다른 바람직한 조합체는 위치 [B460+A90] 또는 위치 [B460+B109] 또는 위치 [B460+A144] 또는 위치 [B460+A90+B109] 또는 위치 [B460+A90+A144] 또는 위치 [B460+B109+A144] 또는 위치 [B460+A90+B109+A144]에서 돌연변이를 포함한다. 다른 바람직한 조합체는 위치 [B460+A192] 또는 위치 [B460+A3] 또는 위치 [B460+A192+A3]에서 돌연변이를 포함한다.

매우 바람직한 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 가지며 선택적으로 A3, A77, A90, A192, B148, B313 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환과 함께 위치 [B24+A144] 또는 위치 [B24+B109] 또는 위치 [B24+B460] 또는 위치 [B24+A144+B109] 또는 위치 [B24+B109+B460] 또는 위치 [B24+B144+B460] 또는 위치 [B24+B109+B144+B460]에서 아미노산 치환을 갖는 에스케리키아 콜라이로부터 유도된 페니실린 G 아실라제이다.

또 다른 매우 바람직한 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제는 클루이베로마이세스 크리오크레센스로부터 유도되고 선택적으로 A3, A77, A90, A192, B148, B313 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환과 함께 위치 [B24+A144] 또는 위치 [B24+B109] 또는 위치 [B24+B460] 또는 위치 [B24+A144+B109] 또는 위치 [B24+B109+B460] 또는 위치 [B24+B144+B460] 또는 위치 [B24+B109+B144+B460]에서 아미노산 치환을 갖는 페니실린 G 아실라제이다.

야생형 페니실린 아실라제에서 위치 A3은 상이한 유형의 아미노산들을 포함할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 야생형 효소는 세린을 갖는다. 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 류신, 이소류신, 알라닌 또는 트레오닌에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 A:S3A 또는 A:S3L을 포함한다.

야생형 페니실린 아실라제에서 위치 A77은 상이한 유형의 아미노산, 예를 들면, 양(R, K) 및 음(D, E)으로 하전된 잔기 및 극성 잔기(S, N, Q)를 가질 수 있다. 에스케리키아 콜라이 야생형 효소는 알라닌을 갖는다. 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 트레오닌에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 A:A77T를 포함한다.

20개 야생형 페니실린 G 아실라제에서 위치 A3, A77, A90, A144, A192, B24, B109, B148, B313, B460 및 B488 상의 아미노산의 존재

#

야생형 페니실린 G 아실라제의
공급원

동일성

A3

A
77

A
90

A
144

A
192

B
24

B
109

B
148

B
313

B
460

B
488

1

에스케리키아 콜라이

100%

S

A

M

N

V

F

K

V

S

F

2

클루이베라 크리오크레센스

86%

P

S

K

N

A

F

K

V

N

F

3

프로비덴시아 스튜알티 ATCC 2582

64%

P

S

Q

N

A

F

K

V

D

F

4

프로비덴시아 레트게리

62%

S

Q

N

S

F

K

L

N

F

5

아크로모박터 종 CCM 4824

54%

D

R

N

A

F

K

L

D

L

F

6

미배양 감마 프로테오박테리아

53%

A

R

N

E

F

K

L

D

L

F

7

아크로모박터 자일로스옥시단스

53%

A

R

N

P

F

K

L

D

L

F

8

파라코커스 데니트리피칸스 PD122

45%

T

D

R

G

E

F

K

I

Q

L

F

9

세라티아 프로테아마큘란스 568

45%

A

K

R

N

K

F

K

V

N

L

F

10

알칼리제네스 페칼리스

43%

V

S

R

N

A

F

R

V

D

T

F

11

알칼리제네스 페칼리스

43%

V

S

R

N

A

F

R

V

N

T

F

12

알칼리제네스 페칼리스

42%

V

S

R

N

A

F

R

V

N

T

F

13

알칼리제네스 페칼리스

42%

V

S

R

N

A

F

R

V

N

T

F

14

스핀고모나스 위티치 RW1

41%

Q

S

R

L

G

M

K

V

H

A

F

15

아시네토박터 바우마니 AYE

39%

Q

N

R

N

S

Q

K

I

T

V

L

16

아시네토박터 바우마니 ACICU

38%

Q

N

R

N

S

Q

K

I

T

V

L

17

아시네토박터 바우마니 ATCC 1

38%

H

N

R

N

S

Q

K

I

T

V

L

18

바실러스 메가테리움

34%

N

E

K

Y

S

V

K

A

T

I

M

19

바실러스 바디우스

34%

V

E

K

Y

P

V

R

A

E

I

M

20

아트로박터 비스코서스

33%

N

E

K

Y

S

V

K

A

T

I

M

야생형 페니실린 아실라제에서 위치 A90은 상이한 유형의 아미노산들을 포함할 수 있으나, 주로 양으로 하전된 아미노산(R, K)을 포함할 수 있다. 에스케리키 아 콜라이 야생형 효소는 메티오닌을 갖는다. 라이신을 갖지 않는 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 라이신에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 A:M90K를 포함한다.

야생형 페니실린 아실라제에서 위치 A144는 주로 아스파라긴을 나타낸다. 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 트레오닌에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 또한, 방향족 아미노산인 티로신 또는 페닐알라닌 또는 트립토판이 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 A144에 상응하는 위치에 바람직한 아미노산이다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 A:N144S를 포함한다.

야생형 페니실린 아실라제에서 위치 A192는 상이한 유형의 아미노산들을 포함할 수 있다. 에스케리키아 콜라이 야생형 효소는 발린을 갖는다. 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 세린 또는 트레오닌과 같은 보다 극성인 아미노산, 바람직하게는 아스파트산, 글루탐산, 라이신 또는 아르기닌과 같은 하전된 아미노산에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 A:V192E를 포함한다.

위치 B24는 야생형 페니실린 G 아실라제중에서 고도로 보존된다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제 및 많은 다른 야생형 효소들에서 페닐알라닌이 발견된다. 남은 야생형 효소들도 또한 소수성 잔기(M, V) 또는 극성 잔기(Q)를 갖는다. 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 알라닌 또는 류신에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 B:F24A 또는 B:F24L을 포함한다.

위치 B109는 주로 양으로 하전된 아미노산 라이신 또는 아르기닌을 나타낸다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서는 라이신이 발견된다. 라이신을 갖지 않는 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 아르기닌에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 B:K109R을 포함한다.

야생형 페니실린 아실라제에서 위치 B148은 상이한 유형들을 가질 수 있으나 주로 작은 소수성 잔기(V, L, I, A)를 갖는다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서는 발린이 발견된다. 류신을 갖지 않는 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 류신에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 B:V148L을 포함한다.

야생형 페니실린 아실라제중 위치 B313은 상이한 유형들을 가질 수 있으나 주로 극성 또는 음으로 하전된 잔기(S, N, D, Q, H, T, E)를 갖는다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서는 세린이 발견된다. 아스파라긴 또는 아스파트산을 갖지 않는 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 아스파라긴 또는 아스파트산에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 B:S313N을 포함한다.

위치 B460은 20개 야생형 페니실린 G 아실라제중에서 덜 보존된다. 대부분의 야생형 효소들은 소수성 잔기(F, L, A, V, I)를 갖는다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서는 페닐알라닌이 발견된다. 천연 류신을 갖지 않는 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 류신에 의한 천연 아미노산의 치환이거나 또는 트레오닌, 발린 또는 이소류신에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 B:F460L을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제 B:F460에 상응하는 위치에서 류신을 갖는 페니실린 아실라제에서, 특히 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제 B:F24에 상응하는 위치에서의 돌연변이와 조합될 때, 류신은 알라닌, 트레오닌, 발린 또는 이소류신으로 치환될 수 있다.

위치 B488은 야생형 페니실린 G 아실라제중에서 고도로 보존된다. 에스케리키아 콜라이 페니실린 G 아실라제에서는 페닐알라닌이 발견된다. 류신 또는 메티오닌을 갖지 않는 야생형 페니실린 아실라제에서 바람직한 돌연변이는 류신 또는 메티오닌에 의한 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 에스케리키아 콜라이 G 아실라제에서 매우 바람직한 돌연변이는 B:F488L을 포함한다.

두 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 태양의 돌연변이체 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

세 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 두 번째 태양의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

네 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 세 번째 태양의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

다섯 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 태양의 돌연변이체 페니실린 G 아실라제를 생성하는 방법을 제공한다.

여섯 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 태양의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 사용하는 것을 특징으로 하는, 활성화된 측쇄와 β-락탐 핵의 효소적 커플링을 포함하는 반합성 β-락탐 항생물질의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 반합성 β-락탐 항생물질은 반합성 페니실린 및 반합성 세폴로스포린으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 반합성 페니실린의 예는 아목시실린 및 암피실린이다. 아목시실린은 활성화된 HPG(예를 들면, 아미드 또는 에스터, 바람직하게는 메틸에스터 또는 에틸에스터로서의 활성화된 HPG)와 6-APA의 효소적 커플링에 의해 생성될 수 있는 한편, 암피실린은 활성화된 PG(예를 들면, 아미드 또는 에스터, 바람직하게는 메틸에스터 또는 에틸에스터로서의 활성화된 PG)와 6-APA의 효소적 커플링에 의해 생성될 수 있다. 바람직한 반합성 세팔로스포린의 예는 세파드록실, 세팔렉신 및 세프라딘이다. 세파드록실은 활성화된 HPG(예를 들면, 아미드 또는 에스터, 바람직하게는 메틸에스터 또는 에틸에스터로서의 활성화된 HPG)와 7-ADCA의 효소적 커플링에 의해 생성될 수 있는 한편, 세팔렉신은 활성화된 PG(예를 들면, 아미드 또는 에스터, 바람직하게는 메틸에스터 또는 에틸에스터로서의 활성화된 PG)와 7-ADCA의 효소적 커플링에 의해 생성될 수 있으며, 세프라딘은 활성화된 DHPG(예를 들면, 아미드 또는 에스터, 바람직하게는 메틸에스터 또는 에틸에스터로서의 활성화된 DHPG)와 7-ADCA의 효소적 커플링에 의해 생성될 수 있다.

바람직한 태양에서, 반합성 β-락탐 항생물질을 생성하기 위한 본 발명의 방법은 A3, A77, A90, A144, A192, B148, B109, B313, B460 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 돌연변이와 함께 아미노산 위치 B24에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제의 사용을 포함한다. 바람직한 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제는 위치 [B24+A144] 또는 위치 [B24+B109] 또는 위치 [B24+B460] 또는 위치 [B24+A144+B109] 또는 위치 [B24+B109+B460] 또는 위치 [B24+B144+B460] 또는 위치 [B24+B109+B144+B460]에 돌연변이를 포함한다. 다른 바람직한 조합체는 위치 [B24+B460+A3+A192] 또는 위치 [B24+B460+A90] 또는 위치 [B24+B148+B460] 또는 위치 [B24+B148+B460+A3+A192] 또는 위치 [B24+B148+B460+A90]에서 돌연변이를 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 반합성 β-락탐 항생물질을 생성하기 위한 본 발명의 방법은 아미노산 위치 B460에서의 돌연변이 및 선택적으로 A3, A77, A90, A144, A192, B24, B148, B109, B313 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제의 사용을 포함한다. 위치 B460과 적어도 위치 B24와의 바람직한 조합체는 상기에 열거하였다. 다른 바람직한 조합체는 위치 [B460+A90] 또는 위치 [B460+B109] 또는 위치 [B460+A144] 또는 위치 [B460+A90+B109] 또는 위치 [B460+A90+A144] 또는 위치 [B460+B109+A144] 또는 위치 [B460+A90+B109+A144]에서 돌연변이를 포함한다. 다른 바람직한 조합체는 위치 [B460+A192] 또는 위치 [B460+A3] 또는 위치 [B460+A192+A3]에서 돌연변이를 포함한다. 매우 바람직한 태양은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 가지고 선택적으로 A3, A77, A90, A192, B148, B313 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환과 함께 위치 [B24+A144] 또는 위치 [B24+B109] 또는 위치 [B24+B460] 또는 위치 [B24+A144+B109] 또는 위치 [B24+B109+B460] 또는 위치 [B24+B144+B460] 또는 위치 [B24+B109+B144+B460]에서 아미노산 치환을 갖는, 에스케리키아 콜라이로부터 유도된 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제; 또는 클루이베로마이세스 크리오크레센스로부터 유도되고 선택적으로 위치 A3, A77, A90, A192, B148, B313 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환과 함께 위치 [B24+A144] 또는 위치 [B24+B109] 또는 위치 [B24+B460] 또는 위치 [B24+A144+B109] 또는 위치 [B24+B109+B460] 또는 위치 [B24+B144+B460] 또는 위치 [B24+B109+B144+B460]에서 아미노산 치환을 갖는 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제의 사용을 포함한다.

본 발명의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 사용함으로써 본 발명의 방법의 이점은, 야생형 효소에 비해 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제의 유지, 보다 바람직하게는 증가된 합성 활성 및 더 높은 S/H 비의 결과로, 반합성 β-락탐 항생물질을 생성하기 위한 제조 방법이 매우 효과적이라는 것이다. 반합성 β-락탐 항생물질은 고수율(예를 들면, [생성물 몰수]/[첨가된 β락탐 핵 몰수])로 생성되는 반면, 활성화된 측쇄의 가수분해율은 낮다. 또 다른 이점은 공정이 지금까지 선행 기술에서 보고된 것보다 낮은 [활성화된 측쇄]/[β-락탐 핵] 비로 수행될 수 있다는 것이다.

본 발명은 또한 HPG와 6-APA의 커플링을 촉진하는 효소의 존재하에서 아목시실린을 생성하기 위한 방법을 제공하는데, 이때 6-APA에 대한 활성화된 HPG, 바람직하게는 메틸- 및 에틸에스터로 이루어진 군에서 선택된 에스터의 몰비는 3.0 이하, 보다 바람직하게는 2.5 이하, 보다 바람직하게는 2.0 이하, 보다 바람직하게는 1.5 이하, 보다 바람직하게는 1.4 이하, 보다 바람직하게는 1.3 이하, 보다 바람직하게는 1.2 이하, 보다 바람직하게는 1.1 이하, 보다 바람직하게는 1.09 이하, 보다 바람직하게는 1.08 이하, 보다 바람직하게는 1.07 이하, 보다 바람직하게는 1.06 이하, 보다 바람직하게는 1.05 이하, 보다 바람직하게는 1.04 이하, 보다 바람직하게는 1.03 이하, 가장 바람직하게는 1.02 이하이고, 효소 커플링 반응 후 측정된, 6-APA를 기준으로 한 아목시실린의 수율(몰/몰)은 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상이다.

바람직하게, 아목시실린의 제조 공정에서 효소는, 리터 당 500 밀리몰의 HPGM 및 리터당 530 밀리몰의 6-APA로부터 아목시실린을 생성(즉, 전환)하는 성질을 가지고, 본원에 개시된 바와 같은 시험 A에 기재된 바와 같은 조건하에서 수행된 전환반응 말기에 리터당 5 밀리몰 미만의 6-APA를 생성하는 아실라제, 바람직하게는 페니실린-G 아실라제이다. 표 2에 나타낸 천연 야생형 페니실린 G 아실라제 중 어느 것도 이러한 성질을 갖는 것은 없다. 적당한 야생형 페니실린 G 아실라제는 스크리닝에 의해 찾을 수 있거나, 또는 보다 바람직하게는 하나 이상의 아미노산을 치환시켜 수득할 수 있다.

본 발명 방법의 바람직한 태양에서, 본 발명의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 사용하여 아목시실린을 생성할 수 있다. 사용될 수 있는 매우 바람직한 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이로부터 유도된 페니실린 G 아실라제, 또는 클루이베로마이세스 크리오크레센스로부터 유도되고 선택적으로 A3, A77, A90, A144, A192, B148, B313 및 B488로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환과 함께 위치 [B24+B109] 또는 [B24+B460] 또는 [B109+B460] 또는 [B24+B109+B460] 또는 [B24+B148+B460]에서 아미노산 치환을 갖는 페니실린 G 아실라제이다. 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지고 위치 [B24+B109] 또는 [B24+B460] 또는 [B109+B460] 또는 [B24+B109+B460]에서 아미노산 치환을 갖는, 에스케리키아 콜라이로부터 유도된 페니실린 G 아실라제가 가장 바람직하다.

재료 및 방법

아실라제 돌연변이체의 제조

야생형 및 돌연변이체 페니실린 G 아실라제의 생성, 분리 및 정제는 국제 특허출원 공개 제 WO96/05318 호 및 국제 특허출원 공개 제 WO03/055998 호에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 또는, 돌연변이체 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 유전자는 유전자 합성에 의해 수득될 수 있다.

돌연변이체 페니실린 G 아실라제의 생성은 돌연변이체 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 유전자를 적절한 발현 벡터내에 클로닝하고, 에스케리키아 콜라이와 같은 적당한 숙주를 상기 벡터로 형질전환시키고, 형질전환된 숙주를 돌연변이체 페니실린 G 아실라제의 생성에 적합한 조건하에서 배양함으로써 수득할 수 있다. 돌연변이체의 회수 및 정제는 국제 특허출원 공개 제 WO96/05318 호에 기재된 바와 같이 수행하였다. 또한, 슈퍼덱스(Superdex)200 겔 여과 컬럼이 장착된 액타 정제기(Akta Purifier) 10 시스템 및 TSK겔 3000SWxl 컬럼이 장착된 HPLC 시스템을 사용하여 아실라제를 정제하였다. 두 시스템 모두 1 ml/분의 유량으로 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0)중에서 운전하였다.

아실라제 농도 측정

문헌 [Svedas et al., Bioorg. Khimya[Russ.] 3, 546-553 (1977); and Alkema et al., Anal. Biochem 275, 47-53 (1999)]에 기재된 바와 같이 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)를 사용하여 활성 부위 적정을 수행하여 아실라제 농도를 측정하였다. 활성 부위 적정시 초기 활성 및 잔류 활성은 기질로 NIPAB를 사용하여 측정하였다. 37 ℃에서 0.1M MOPS 완충액(pH 7.4)중에서 NIPAB의 가수분해 후 5-아미노-2-니트로벤조산의 방출로 인한 405 nm에서의 흡광도 증가를 측정한다. 또는, 활성 부위 적정 후 잔류 활성은 세팔렉신의 합성을 이용하여 측정할 수 있다(하기 참조).

아실라제의 고정화

국제 특허출원 공개 제 WO97/04086 호 및 유럽 특허 제 EP0222462 호에 개시된 방법에 따라 다양한 아실라제를 고정화하였다.

세팔로스포린의 검출

세팔렉신 및 세프라딘과 같은 세팔로스포린의 검출은 후지이(Fujii) 방법[Fujii et al., Process Biochemistry, 21-24 (1976)]에 따라 수행하였다. 상기 방법은 고처리량 포맷 스크리닝으로 용이하게 전환될 수 있다.

세팔렉신의 검출

D-페닐글라이신 메틸에스터(PGM) 및 7-ADCA로부터 세팔렉신의 생성을 측정하기 위한 표준 분석법을 다음의 방식으로 수행하였다: 10 ㎕의 페니실린 G 아실라제 용액을 50 g/l PGM 및 50 g/l 7-ADCA로 이루어진 130 ㎕의 기질 혼합물(상기 용액의 제조는 하기 참조)에 가하였다. 이어서 반응 구획을 밀봉하여 증발을 방지하였다. 실온에서 2 시간동안 배양한 후, 140 ㎕의 1M NaOH를 가하여 반응을 중단시키고 발색을 시작하였다. 완전히 혼합시켜 침전을 방지한다. 밀봉된 구획에서 실온에서 2 시간 배양 후 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 블랭크 실험을 위해, 효소 대신 물을 가하였다. 초기 회전율을 측정하는 경우, 효소 농도는 최종 전환율이 1 내지 10%가 되도록 하였다. 전환율을 제어하기 위해 효소 농도를 변화시키는 대신에, 반응 시간을 조정하여 목적하는 전환율을 얻었다. 생성된 세팔렉신의 절대량은 490 nm에서의 OD 대 세팔렉신 농도(알고 있는 양의 세팔렉신을 함유하는 샘플을 사용해 측정)를 플롯팅할 때 수득된 검량선으로부터 측정할 수 있다.

PGM/7-ADCA 기질 혼합물을 제조하기 위해, 50 g의 PGM.MSA(PGM.MSA는 PGM의 메탄 설폰산(MSA) 염이다) 및 50 g의 7-ADCA를 900 ml의 0.1M MOPS 완충액(pH 6.9)에 가하였다. 계속 교반하면서, 4M NaOH 용액을 사용하여 pH를 6.9로 재조정하였다. 완충액을 사용해 부피를 1 리터로 조정하고 pH를 다시 조정하였다. 각 실험을 위해, PGM은 물에서 자발적으로 분해되기 때문에 새로운 용액을 제조해야 한다. MOPS 완충액을 제조하기 위해 20.9 g의 MOPS(시그마(Sigma) M-1254)를 약 900 ml의 밀리큐 워터(MilliQ water)에 용해시켰다. 4M NaOH 용액을 사용하여 pH를 6.9로 조정하고 밀리큐 워터로 부피를 1 L로 조정하였다.

세프라딘의 검출

D-2,5-다이하이드로페닐글라이신 메틸에스터(DHPGM) 및 7-ADCA로부터 세프라딘의 생성을 측정하기 위한 표준 분석법을 세팔렉신에 대해 전술한 바와 같은 방식에 따라 수행하였다. D-2,5-다이하이드로페닐글라이신 메틸에스터(DHPGM.MSA)의 메탄 설폰산염 만을 PGM.MSA 대신 사용하였다.

S/H 비의 측정

β-락탐 항생물질의 합성시 PenG 아실라제의 S/H 비를 측정하기 위해, 전환율을 시간의 함수로 측정하였다. 샘플을 여러 시점에서 취하여 전환반응 혼합물의 조성을 측정하였다. pH를 2.7로 저하시켜 반응을 중지시켰다. 생성된 아실화 항생물질, 항생물질 핵, 가수분해된 측쇄 전구체 및 측쇄 전구체의 농도를 측정하기 위해 UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography, 초고성능 액체 크로마토그래피)로 샘플을 분석하였다.

합성 활성은 생성물의 양 대 반응 시간을 플롯팅하여 수득된 곡선의 기울기로부터 바람직하게는 0 내지 10% 전환율로 측정하였으며, 상기 면적에서 반응 생성물의 생성은 통상적으로 시간에 있어 거의 선형이다. 합성 활성이 반응동안 급속히 감소하는 경우, 초기 속도는 진행 곡선의 외삽 및 t=0에서의 기울기의 계산에 의해 수득할 수 있다.

가수분해 활성은 가수분해된 측쇄 전구체의 양 대 반응 시간을 플롯팅하여 수득된 곡선의 기울기로부터 바람직하게는 0 내지 10% 가수분해율로 측정되며, 상기 면적에서 가수분해된 측쇄 전구체의 생성은 통상적으로 시간에 있어 거의 선형이다. S/H 비는 합성 활성의 기울기를 가수분해 활성의 기울기로 나누어서 계산하였다.

세팔렉신에 대한 S/H 비의 측정은 10 g/l PGM.MSA 및 10 g/l 7-ADCA를 함유하는 반응 혼합물중에서 수행하였으며, 세프라딘에 대한 측정은 10 g/l DHPGM.MSA 및 10 g/l 7-ADCA를 함유하는 반응 혼합물중에서 수행하였다. 페니실린 G 아실라제는 4 시간 후 70 내지 90% 전환율이 수득되도록 가하였다. 20 ㎕의 샘플을 다양한 시점에서 취하고 즉시 800 ㎕의 50mM 인산(pH 2.7)으로 희석하여 반응을 중지시켰다.

DHPGM, DHPG, PMSF, PGM 및 PG의 양은 UPLC 크로마토그래피 동안 210 nm에서 검출하였고 7-ADCA, 세팔렉신 및 세프라딘의 양은 260 nm에서 검출하였으며, 상기 크로마토그래피는 하기 프로토콜에 따라 수행하였다:

액쿼티(ACQUITY)-펌프: 이원 용매 매니저

액쿼티-오토샘플러: 샘플 매니저 및 샘플 기획자

액쿼티-UV 검출기: PDA 검출기(80 Hz)

컬럼: UPLC BEH 페닐 1.7 ㎛ 2.1 x 50 mm(카탈로그 번호 186002884)

유량: 0.9 ml/분

주입량: 2 ㎕(부분 루프)

이동상 A: 50mM 포스페이트 완충액(pH 6.0)

이동상 B: 100% 아세토니트릴

컬럼 온도: 60 ℃

트레이 온도: 10 ℃

파장: 210 및 260 nm

운전시간: 1 분

구배 프로필:

시험 A: 6- APA 및 HPG 메틸에스터로부터 아목시실린의 생성

140 ㎛ 기공을 갖는 체 바닥 및 교반기가 장착된 2 l의 스테인리스 스틸 반응기를 HPGM을 6-APA에 커플링시키는 것을 촉진하기 위해 사용된 고정화 효소로 채웠다. 물을 첨가하여 부피를 1000 ml로 조정하였다. 내용물을 10 ℃로 냉각하고 반응기 내용물을 연동 펌프를 사용하여 체 바닥위로 순환시켰다.

162.2 g의 6-아미노페니실란산을 가한 후 144 g의 HPGM을 가하였다. 물을 첨가하여 부피를 1500 ml로 조정하였다. 혼합물을 교반하고 체 위로 순환시켰다. 온도는 10 ℃에서 유지시켰다. pH를 모니터하였다. 초기에, pH는 약 6.3이었으며, 잠시 후 약 7로 증가하였고 이어서 감소하였다. pH가 6.3 미만이 되는 시점에서, 반응이 거의 종료된다. 그 시점(HPGM 첨가한 지 약 2 시간 후)에서, 샘플을 재순환 라인에서 취하여 여과하고 HPLC로 잔류 6-APA 함량에 대해 분석하였다.

약어 목록

6-APA: 6-아미노페니실란산

7-ADCA: 7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산

AMPI: 암피실린

CEX: 세팔렉신

DHPG: D-2,5-다이하이드로페닐글라이신

DHPGM.MSA: D-2,5-다이하이드로페닐글라이신 메틸에스터 메탄설폰산 염

EDTA: 에틸렌다이아민테트라아세트산

HPGM: D-p-하이드록시페닐글라이신 메틸에스터

PG: D-페닐글라이신

PGA: D-페닐글라이신 아미드

PGM: D-페닐글라이신 메틸에스터

PGM.HCL: D-페닐글라이신 메틸에스터 HCl 염

PGM.MSA: D-페닐글라이신 메틸에스터 메탄설폰산 염

아미노산 명명법

상동성 및 동일성

본원에서 용어 "상동성" 또는 "동일성%"는 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 있어서, 여기서 두 아미노산 서열 또는 두 핵산 서열의 상동성%를 측정하기 위해 최적의 비교 목적으로 서열들을 정렬하는 것으로 정의된다. 두 서열 사이의 정렬을 최적화하기 위해, 비교되는 두 서열중 어느 하나에 갭(gap)을 도입할 수 있다. 상기 정렬은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다. 또는, 상기 정렬은 보다 짧은 길이에 걸쳐, 예를 들면, 약 20, 약 50, 약 100 개 이상의 핵산/염기 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 동일성은 보고된 정렬 영역에 걸쳐 두 서열간에 동일한 쌍의 퍼센트이다.

서열 비교 및 두 서열간 동일성%의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행할 수 있다. 숙련된 자라면 두 서열을 정렬시키고 두 서열간 상동성을 측정하는데 여러 다양한 컴퓨터 프로그램들을 이용할 수 있다는 사실을 인지할 것이다[Kruskal, J.B. An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed.), Time wraps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp.1-44 Addison Wesley (1983)]. 두 아미노산 서열간의 동일성%는 두 서열의 정렬을 위한 니들만(Needleman) 및 브니쉬(Wunsch) 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다[Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)]. 상기 알고리즘은 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 둘 다를 정렬할 수 있다. 니들만-브니쉬 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 니들(NEEDLE)에서 실행되었다. 본 발명에서는 엠보스(EMBOSS) 패키지로부터 니들 프로그램을 이용하였다(버전 2.8.0 이상, 문헌 [EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277 (2000)], http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열의 경우에는 이블로섬(EBLOSUM)62를 치환 행렬에 사용한다. 뉴클레오티드 서열의 경우에는, 에드나풀(EDNAFULL)을 사용한다. 다른 것이 지정될 수 있다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 개방 패널티 및 0.5의 갭 확장 패널티이다. 숙련된 자라면 상이한 알고리즘을 사용하는 경우 모든 상기 다양한 파라미터들이 약간 다른 결과를 제공할 것이지만 두 서열의 전체 동일성%는 별로 변화되지 않음을 인지할 것이다.

포괄적 상동성 정의

상동성 또는 동일성은 임의의 갭을 포함하여 전체 정렬 영역에 걸쳐 두 서열간의 동일한 쌍의 퍼센트이다. 2개의 정렬 서열간 상동성 또는 동일성은 다음과 같이 계산된다: 두 서열 모두에서 동일한 아미노산을 나타내는 정렬에서 상응하는 위치의 수를 갭을 포함한 정렬의 전체 길이로 나눈 값. 본원에서와 같이 정의된 동일성은 니들 프로그램으로부터 수득할 수 있으며, 프로그램 출력시 "동일성(IDENTITY)"으로 표지된다.

최장 동일성 정의

2개의 정렬 서열간 상동성 또는 동일성은 다음과 같이 계산된다: 두 서열 모두에서 동일한 아미노산을 나타내는 정렬에서 상응하는 위치의 수를 정렬중 갭의 총수를 감한 후에 정렬의 전체 길이로 나눈 값. 본원에서와 같이 정의된 동일성은 노브리프(NOBRIEF) 옵션을 이용하여 니들 프로그램으로부터 수득될 수 있으며, 프로그램 출력시 "최장-동일성"으로 표지된다.

실시예

실시예 1

개선된 세팔렉신 합성 활성을 갖는 페니실린 G 아실라제 돌연변이체의 선택

개선된 S/H 비를 갖는 PenG 아실라제 돌연변이체의 활성을 개선시키는 아미노산 위치 및 돌연변이를 찾기 위해, 단백질 수준에 다음의 두 돌연변이: B:F24A 및 B:V148L(계속해서 대조군으로 나타냄)을 이미 함유하는 에스케리키아 콜라이의 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 유전자의 실수유발(error prone) 돌연변이유발에 의해 돌연변이체 라이브러리를 제작하였다. 상기와 같이 수득된 돌연변이체 라이브러리를 대조군에 비해 개선된 세팔렉신 생산성을 나타내는 돌연변이체에 대한 고처리량 스크리닝에 적용하였다. 후지이 방법에 의한 생성된 세팔렉신의 분석 및 검출 방법은 재료 및 방법 부분에 기재되어 있다. 고처리량 스크리닝의 경우, 생산성이란 용어는 특정 시간에 정해진 양의 무세포 추출액(CVE)에 의해 합성된 세팔렉신의 양을 말한다. 통틀어서 약 7000개의 클론을 검사하였다.

다음으로, 해당 돌연변이체 및 대조군 페니실린 아실라제를 발현하는 재조합 에스케리키아 콜라이 세포를 기재된 바와 같이 성장시켰다. 유사한 OD_600nm 값을 갖는 진탕 플라스크를 취하여 배양물을 원심분리하고 -20 ℃에서 냉동시켰다. 무세포 추출액을 제조하기 위해, 펠릿을, 0.1 mg/ml 디에나제(DNase) 및 2 mg/ml 리소자임을 함유하는 추출 완충액, 0.05M MOPS(pH 6.9)에 재현탁하고 배양하였다. 30 분 후, 추출물을 원심분리하고 아실라제 활성을 함유하는 상등액을 세팔렉신 합성 시험에 사용하였다. 2 시간 후 전환반응을 중지시키고 생성된 세팔렉신의 양을 재료 및 방법 부분에 기재된 바와 같이 측정하고 490 nm에서의 OD로 나타내었다.

대조군에 비해 개선된 세팔렉신 생성에 대해 스크리닝하여 돌연변이체 라이브러리로부터 선택된 돌연변이체를 표 3에 요약하였다: S/H 돌연변이체 1 내지 4는 더 높은 활성을 갖는다.

유전자 번호는 cDNA 서열에 의해 암호화된 바와 같은 연속되는 아미노산 위치를 나타내며, 신호 펩티드(26개 아미노산), α-서브유닛(209개 아미노산), 연결 펩티드(54개 아미노산) 및 β-서브유닛(557개 아미노산)을 포함한다. 단백질 번호는 폴리펩티드 서열의 신호 펩티드, α-서브유닛, 연결 펩티드 및 β-서브유닛 각각에서 아미노산 위치를 나타낸다. AA-야생형은 에스케리키아 콜라이의 페니실린 G 아실라제에서 각각의 위치상의 아미노산을 나타낸다. AA-대조군은 에스케리키아 콜라이의 페니실린 G 아실라제에서 돌연변이 B:F24A 및 B:V148L을 갖는 돌연변이체의 아미노산을 나타낸다. 우측 2개의 난은 라이브러리 스크리닝에서 관찰된 바와 같은 돌연변이체 1 내지 돌연변이체 4에 대한 세팔렉신 생산성을 나타낸다. 절대 생산성 및 대조군과 비교한 상대 생산성을 나타내었다.

유전자 번호

11

29

103

116

170

218

313

398

437

602

749

777

절대

상대

단백질 번호

11

A3

A77

A90

A144

A192

B24

B109

B148

B313

B460

B488

AA 야생형

Val

Ser

Ala

Met

Asn

Val

Phe

Lys

Val

Ser

Phe

AA 대조군

Ala

Leu

2.1

1.0

돌연변이체 1

Ala

Leu

Glu

Ala

Leu

4.0

1.9

돌연변이체 2

Lys

Ala

Leu

3.5

1.6

돌연변이체 3

Thr

Ala

Leu

Asn

2.3

1.1

돌연변이체 4

Ala

Leu

2.4

1.1

돌연변이체 5

Ala

Leu

돌연변이체 6

Ser

Ala

Leu

돌연변이체 7

Ser

Ala

Arg

Leu

돌연변이체 8

Ala

Leu

Ser

Glu

Ala

Arg

Leu

돌연변이체 9

Ala

Arg

Leu

돌연변이체 10

Ser

Ala

Arg

Leu

돌연변이체 11

Ala

Leu

Glu

Ala

Arg

Leu

돌연변이체 12

Leu

실시예 2

암피실린 합성에서 개선된 암피실린/6- APA 를 갖는 페니실린 G 아실라제 돌연변이체의 선택

전술한 돌연변이체 라이브러리로부터 약 6000개의 클론을 암피실린 합성에 대해 검사하였다. 에스케리키아 콜라이 클론을 성장시킨 후, 무세포 추출액을 전술한 바와 같이 제조하였다. 이어서, 20 ㎕의 무세포 추출액을 12mM PGM, 4mM 6-APA 및 10mM 암피실린을 함유하는 0.05M MOPS 완충액(pH 6.9) 80 ㎕로 옮겼다. PGM은 유리 염기로 제조하였다. 모든 용액은 매일 새로 제조하였다. 반응을 실온에서 수행하였으며 PMSF로 중지시켰다. 이어서, 샘플을 UPLC 크로마토그래피로 분석하였다.

컬럼: 워터스 액쿼티(Waters Acquity) UPLC BEH 페닐, 50 x 2.1 mm, 입자 크기 1.7 ㎛.

용매 A: 50 mM 암모늄 아세테이트, pH = 5.8

용매 B: 60% 아세토니트릴 + 40% 밀리큐 워터

약한 세척: 5% 아세토니트릴 + 95% 밀리큐 워터

강한 세척: 95% 아세토니트릴 + 5% 밀리큐 워터

구배 표:

워터스 마이크로매스(Waters Micromass) ZQ 2000 LC 질량 분석계를 사용한 질량 분석법, 및 워터스 액쿼티 UPLC 포토다이오드 어레이(PDA) 검출기를 사용한 190 내지 400 nm 범위에서의 UV 측정에 의해 용출된 화합물의 확인 및 정량을 수행하였다. 보정은 적절한 표준물질을 사용하여 행하였다.

클론을 암피실린/6-APA 비에 따라 분류하였다. 대조군에 비해 높은 비를 나타내는 클론은 수회 재검사하였다. 마지막으로 대조군에 비해 암피실린/6-APA 비에 일정한 개선을 나타낸 2개의 클론을 서열화하였다. 2개의 돌연변이체에 대한 전형적인 결과를 표 4에 나타내었다. 클론의 서열은 표 3에 나타내었다.

시간의 함수로서 6-APA의 암피실린으로의 효소적 전환율

시간 (분)	암피실린/6-APA 비
시간 (분)	대조군	돌연변이체 1	돌연변이체 7
0	2.60	2.60	2.60
30	2.62	4.16	2.81
60	2.72	5.79	3.22
90	2.77	6.91	3.42
120	2.78	7.60	3.55

돌연변이체 5 내지 6 및 8 내지 12는 돌연변이를 조합하여 수득되었으며, 실수유발 라이브러리를 스크리닝할 때 확인되었다. 이들 돌연변이체를 시험한 결과는 하기의 실시예에 기재될 것이다.

실시예 3

개선된 세팔렉신 생산성에 대해 선택된 페니실린 G 아실라제 돌연변이체의 세팔렉신 및 세프라딘 합성 활성

실시예 1의 선택된 돌연변이체 1 내지 돌연변이체 4(표 3)의 활성은 생산 숙주의 유사한 성장율에서 거의 유사한 페니실린 G 아실라제 발현이 수득된다(유사한 OD_490nm 대략의 세포 밀도)는 가정을 근거로 한다. 돌연변이체의 발현 수준에 있어 임의의 차이를 교정하기 위해, 무세포 추출액중 페니실린 아실라제의 농도를 재료 및 방법 부분에 기재한 바와 같이 PMSF 적정을 이용하여 측정하였다. PMSF 적정을 기준으로, 활성 페니실린 G 아실라제 함량을 추가의 정제 없이 측정할 수 있으므로, 고유 활성(아실라제 mg 당 단위수)을 보다 정확하게 측정할 수 있다. 세팔렉신 및 세프라딘의 합성에 있어 초기 합성 활성을 측정하기 위해, 전환반응 후 재료 및 방법 부분에 기재된 바와 같이 UPLC를 수행하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.

아실라제 mg 당 임의 단위(AU)로 나타낸, 세팔렉신, 세프라딘의 합성 및 NIPAB의 가수분해(분석 조건은 재료 및 방법 부분 참조)에 대해 실시예 1의 선택된 페니실린 아실라제 돌연변이체의 고유 활성(IF는 개선 인자이고; 대조군의 IF는 정의에 의하면 1이다).

	세팔렉신 합성		세프라딘 합성		NIPAB 가수분해
	AU/mg	IF	AU/mg	IF	AU/mg	IF
대조군	31903	1.0	134	1.0	1.7	1.0
돌연변이체 1	60362	1.9	559	3.0	3.6	2.3
돌연변이체 2	52869	1.7	373	2.5	3.0	1.9
돌연변이체 3	40307	1.3	223	1.5	1.9	1.2
돌연변이체 4	32235	1.0	244	1.6	1.3	0.8

실시예 4

개선된 세팔렉신 생산성에 대해 선택된 페니실린 G 아실라제 돌연변이체의 S/H 비

선택된 돌연변이체 1 내지 4의 S/H 비를 재료 및 방법 부분에 기재한 바와 같이 측정하였다. 세팔렉신 합성 동안 진행 곡선을 기록하였다. 세팔렉신의 합성 및 PGM의 가수분해에 대한 S/H 비를 상기 진행 곡선으로부터 측정하였다. 동일한 돌연변이체에 대해 세프라딘 합성동안 진행 곡선을 기록하였다. 세프라딘 합성 및 다이하이드로페닐글라이신 메틸에스터의 가수분해에 대한 S/H 비를 측정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.

세팔렉신 및 세프라딘의 합성동안 대조군과 비교한 선택된 페니실린 아실라제 돌연변이체 1 내지 4의 S/H 비

아실라제	초기 S/H 비 세팔렉신 합성	IF	초기 S/H 비 세프라딘 합성	IF
대조군	9.4	1.0	1.5	1.0

실시예 5

위치 B460에서의 변형이 페니실린 G 아실라제의 합성 생산성을 증대시키는데 결정적이다

돌연변이체 1을 기준으로 돌연변이체 5 및 12를 설계하였다. 돌연변이체 5는 또한 위치 B460에서 페닐알라닌이 류신으로 치환된 대조군이다. 돌연변이체 5와 마찬가지로, 돌연변이체 12에서, 위치 B460에서의 페닐알라닌도 또한 류신으로 치환되었지만, 그 외에 위치 B24에서의 알라닌이 많은 야생 페니실린 G 아실라제에서 상기 위치에서 관찰되듯이 페닐알라닌으로 뒤바뀌었다. 돌연변이체 5 및 12를 암호화하는 유전자는 유전자 합성에 의해 수득하였으며, 전술한 바와 같이 에스케리키아 콜라이로 형질전환시켜 거기에서 발현시켰다. 발효 후 세포로부터 페니실린-G 아실라제를 방출시키기 위해 에스케리키아 콜라이 세포를 초음파로 처리하였다. 원심분리하여 세포 잔류물을 제거한 후, 상등액중 활성 단백질 농도를 PMSF 적정으로 측정하였다.

돌연변이체 5 및 12는 세팔렉신 합성에 적용한 반면, 야생형 아실라제(서열번호 1), 대조군 아실라제 및 돌연변이체 1은 대조군으로 포함시켰다. 결과는 하기에 나타내었다.

아실라제	IF 세팔렉신 합성 활성(U/mg)	세팔렉신 합성에 대한 초기 S/H
야생형	1.1	3.8
대조군	1.0	10.3
돌연변이체 1	3.3	13.2
돌연변이체 5	3.1	12.7
돌연변이체 12	1.6	3.2

돌연변이체 1, 5 및 12는 공통적으로 위치 B460에서의 페닐알라닌이 류신으로 치환되었다. 3개 돌연변이체 모두에 있어, 상기 변형은 S/H 비의 급격한 감소없이 합성 활성을 증가시킨다. 대부분의 경우에서 S/H비가 훨씬 개선되었다.

실시예 6

세팔렉신 및 세프라딘의 합성에서 다양한 조합체의 성능

돌연변이체 1 및 7은 돌연변이 아실라제를 PGM, 6-APA 및 암피실린의 혼합물에 적용시 개선된 암피실린/6-APA 비에 대해 스크리닝하여 선택하였다. 돌연변이체 1은 또한 세팔렉신의 합성에서 개선된 생산성에 대한 스크리닝으로부터 선택하였다. 돌연변이체 1 및 돌연변이체 7에서 관찰된 돌연변이는 여러 방법으로 조합될 수 있다. 돌연변이체 6 및 8 내지 11은 상기 조합의 예들이다. 돌연변이체는 전술한 바와 같이 에스케리키아 콜라이에서 유전자 합성, 형질전환 및 발현에 의해 수득될 수 있다. 이들 돌연변이체의 일부를 검사한 결과를 표 8에 나타내었다.

모 돌연변이체 1 및 7과 비교한, 세팔렉신 및 세프라딘의 합성에서 조합체 돌연변이체 6 및 8의 성능

아실라제	IF 세팔렉신 합성 활성 (U/Mg)	세팔렉신 합성에 대한 초기 S/H	IF 세프라딘 합성 활성 (U/Mg)	세프라딘 합성에 대한 초기 S/H
대조군	1.0	9.3	1.0	1.3
돌연변이체 1	3.8	10.1	5.2	2.0
돌연변이체 7	2.6	9.8	2.9	1.9
돌연변이체 6	3.8	6.9	6.0	1.8
돌연변이체 8	4.2	6.4	7.0	2.1

돌연변이체 1 및 돌연변이체 7의 돌연변이를 조합하여 얻어진 조합체는 특정한 면에서 상기 하이브리드가 그의 모체의 성능을 능가할 수 있음을 보여준다.

실시예 7

6- APA 및 HPG 메틸에스터로부터 아목시실린의 생성

140 ㎛ 기공을 갖는 체 바닥 및 교반기가 장착된 2 l의 스테인리스 스틸 반응기에 표에 나타낸 고정화 효소를 채웠다. 물을 첨가하여 부피를 1000 ml로 조정하였다. 내용물을 10 ℃로 냉각하고 반응기 내용물을 연동 펌프를 사용하여 체 바닥위로 순환시켰다.

162.2 g의 6-아미노페니실란산을 가한 후 HPGM(표 참조)을 가하였다. 물을 첨가하여 부피를 1500 ml로 조정하였다. 혼합물을 교반하고 체 위로 순환시켰다. 온도는 10 ℃에서 유지시켰다. pH를 모니터하였다. 초기에, pH는 약 6.3이었으며, 잠시후 약 7로 증가하였고 이어서 감소하였다. pH가 6.3 미만이 되는 시점에서, 반응이 거의 종료된다. 그 시점(HPGM 첨가한 지 약 2 시간 후)에서, 샘플을 재순환 라인에서 취하여 여과하고 HPLC로 분석하였다. 다양한 실험의 결과를 표 9에 나타내었다.

돌연변이체 1 및 1.06 당량의 HPGM(표에서 전환공정 10)과의 혼합물을 추가로 처리하였다. 효소 고정화물이 체를 거의 막을 때까지 체 아래로부터 반응 혼합물을 취하였다. 이어서, 스테인리스 스틸 반응기중의 혼합물에 물을 가하는 동시에, 수거된 전체 현탁액이 3000 ml의 부피가 될 때까지 체 아래로부터 혼합물을 취하였다.

반응기에 이미 존재하는 동일한 효소를 사용하면서 동일량의 6-APA 및 HPGM을 가하여 전환 10을 3회 이상 반복하였다. 상기 4개의 연속 전환공정 10의 현탁액을 합하여 재결정화시켰다. 현탁액을 25 ℃로 가열하고, 혼합물을 각각 30 ml의 일련의 5개 교반 용기에 도입하였다. 혼합물을 한개의 교반 용기로부터 다음 용기로 중력 오버플로우에 의해 옮겼다. 현탁액의 유량은 3000 ml/시간이었다. 동시에, 현탁액중 침전물이 일련의 5개 교반 용기에서 용해되는 속도로 첫번째 용기에 35% HCl을 가하였다. 산성 용액을 10 ㎛ 필터상에서 일직선상으로 여과하고 결정기에 도입하였다. 상기 결정기에서, 25% NaOH를 첨가하여 pH를 3.7로 유지시키고 온도는 20 ℃에서 유지시켰다. 제 2 결정기로 중력 오버플로우시켜 부피를 2250 ml로 유지하였다. 상기 결정기에서 pH는 20 ℃에서 25% NaOH를 첨가하여 pH 5.0으로 유지시켰다. 제 2 결정기에서의 부피는 교반 용기로 중력 오버플로우시켜 750 ml로 유지하였다. 상기 용기의 내용물을 3 ℃로 냉각시켰다. 상기 용기에서의 체류 시간은 4 시간이었다. 결정성 현탁액을 여과시키고 물(1.5 l/생성물 kg)로 세척하고 일정 중량에 이를 때까지 35 ℃에서 환기 스토브에서 건조시켰다. 아목시실린 트리하이드레이트의 수율(첨가된 6-APA를 기준으로 계산)은 91%(몰/몰)이었다.

			야생형 에스케리키아 콜라이		대조군		돌연변이체 1
전환공정	HPGM (g)	비^*	[6-APA] (mM)	[HPGM] (mM)	[6-APA] (mM)	[HPGM] (mM)	[6-APA] (mM)	[HPGM] (mM)
1	184.8	1.36	14.0	미검출
2	176.6	1.30	15.3	14.3	1.9	1.0
3	168.5	1.24	32.4	31.5	1.6	0.7
4	160.3	1.18	67.5	61.3	1.5	1.1
5	156.3	1.15			1.2	2.0
6	152.2	1.12			1.3	2.0
7	148.1	1.09			1.3	2.3
8	146.7	1.08					1.0	0.9
9	144.0	1.06			2.1	2.8	1.0	0.9
10	141.3	1.04					1.2	1.0
11	140.2	1.03			33.3	29.8
12	138.6	1.02					1.6	0.6
13	135.9	1.00			46.7	40.3	20.5	8.6
* 6-APA에 대한 HPGM의 몰 당량

실시예 8

D- 페닐글라이신 - 메틸에스터 ( PGM ) 용액의 합성

D-페닐글라이신-메틸에스터(PGM) 용액의 합성을 본질적으로 국제 특허출원 공개 제 WO2008/110527 호에 기개된 바와 같이 수행하였다.

90 g의 PG를 170 ml 메탄올에 현탁시키고 73.2 g의 진한 황산을 가하였다. 혼합물을 약 73 ℃에서 2 시간동안 환류시키고 감압하에 농축하였다(p = 20 mmHg, T = 75 내지 80 ℃). 170 ml 메탄올을 가하고 혼합물을 다시 2 시간동안 환류시키고 감압하에 농축하였다. 다시, 170 ml 메탄올을 가하고 혼합물을 2 시간동안 환류시키고 감압하에 농축하였다. 마지막으로, 125 ml 메탄올을 가하였다. 20 ℃에서, 20 ml 메탄올을 미리 충전시킨 두 번째 반응기내에 용액을 1 시간내에 투입하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 3.5에서 유지시켰다. 고체가 형성되었으며, 이것을 여과시켜 제거하였다. 생성된 모액을 25 ml 물로 희석하고 감압하에 농축하였다(p = 20 mmHg, T = 40 내지 45 ℃). 마지막으로 207.5 g의 PGM 용액을 수득하였다.

실시예 9

세팔렉신의 효소적 합성

175 ㎛의 체 바닥을 갖는 반응기에 지정된 양의 다양한 고정화 아실라제를 채우는데, 이때 고정화 입자의 단백질 부하량은 시험된 모든 아실라제에 대해 동일하였다. 이어서, 25 ℃에서 21.4 g의 7-ADCA 및 95 g의 물을 가하고, 25% 암모니아를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 실시예 8에서와 같이 수득된 38 g의 PGM 용액을 일정 속도로 120 분내에 반응기에 투입하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 7.0에서 유지시켰다. 온도는 25 ℃에서 유지하였다. 30 분 후, 0.25 g의 고체 세팔렉신(씨드)을 가하였다. 세팔렉신의 결정화는 45 분에 시작하였다. 120 분에서 150 분까지, 25% 황산을 사용하여 pH를 7.0에서 유지시켰다. 이어서, 25% 황산을 사용하여 pH를 5.7로 저하시켰다.

위쪽으로 교반하면서 바닥의 체를 통해 반응기를 방출시켰다. 생성된 세팔렉신 현탁액을 유리 필터를 통해 여과시켰다. 생성된 모액을 반응기내로 다시 옮겼다. 상기 순서의 단계들을 5회 반복하였다. 이어서, 효소를 2 x 10 ml 물로 세척하였다. 이러한 방식으로, 98% 이상의 세팔렉신을 고체 생체촉매로부터 분리하였다.

세팔렉신 습윤 케이크, 모액 및 세척수를 합하고, 온도를 2 ℃에서 유지하였다. 합한 습윤 케이크와 모액의 pH는 진한 황산을 사용하여 1.5로 저하시키고 생성된 용액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다.

결정화 반응기에 20 g의 물 및 1.0 g의 세팔렉신(씨드)을 채웠다. 상기 언급한 산성 세팔렉신 용액을 30 ℃에서 결정화 반응기에 80 분내에 투입하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 5.0으로 유지하였다. 이어서, 현탁액을 20 ℃에서 30 분간 더 교반하였다. 현탁액을 유리 필터를 통해 여과하고 습윤 케이크를 2 x 15 ml 물 및 2 x 15 ml 아세톤으로 세척하였다.

실험	아실라제	고정화 아실라제 (g)	세팔렉신 모노하이드레이트 (g)	순도	반응 속도	반응 말기 S/H 비 (180 분)
1	대조군	15	32.6	>99.8%	n.d.	n.d.
1	돌연변이체 1	6	32.4	>99.8%	n.d.	n.d.
2	대조군	10.25	n.a.	n.a.	동일	13.8
2	돌연변이체 1	3.7	n.a.	n.a.	동일	12.9
n.d. = 측정되지 않음; n.a. = 적용할 수 없음

실시예 10

7- ADCA 및 HPG 메틸에스터로부터 세파드록실의 생성

175 ㎛의 체 바닥을 갖는 반응기에 지정된 양의 다양한 고정화 아실라제를 채웠다. 이어서, 17.7 g의 7-ADCA, 15.6 g의 HPGM, 0.02 g의 EDTA 및 123 g의 물을 10 ℃에서 첨가하고, 25% 암모니아를 사용하여 pH를 7.2로 조정하였다. 효소 반응은 10 ℃에서 실행하였으며, pH는 폼산을 사용하여 7.2에서 유지하였다.

실험	아실라제	고정화 아실라제(g)	반응 속도	반응 말기 S/H 비(180분)
1	대조군	20.5	동일	25
1	돌연변이체 1	8.2	동일	22

실시예 11

세프라딘의 효소적 합성

175 ㎛의 체 바닥을 갖는 반응기에 지정된 양의 다양한 고정화 아실라제를 채웠다. 이어서, 14.82 g의 7-ADCA 및 50 g의 물을 20 ℃에서 가하고, 25% 암모니아를 사용하여 pH를 6.9로 조정하였다.

18.5 g의 DHPGM.MSA를 20 ml의 물에 용해시키고 용액을 일정 속도로 150 분이내에 반응기에 투입하였다. pH는 암모니아를 사용하여 7.0에서 유지시켰다. 온도는 20 ℃에서 유지시켰다. 30 분 후, 0.25 g의 고체 세프라딘(씨드)을 가하였다. 460 분에 25% 황산을 사용하여 pH를 저하시켰다. DHPG 측정의 부정확성으로 인해, S/H는 충분한 정확성하에 측정할 수 없었다.

실험	아실라제	고정화 아실라제(g)	반응 속도	반응 말기 S/H 비(180분)
1	대조군	19.3	동일	n.d.
1	돌연변이체 1	7.4	동일

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> MUTANT PENICILLIN G ACYLASES <130> 26942-WO-PCT <140> PCT/EP2009/067752 <141> 2009-12-22 <150> EP 08172831.3 <151> 2008-12-23 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 846 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu 1 5 10 15 Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ser Glu 20 25 30 Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn 35 40 45 Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp 50 55 60 Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val 65 70 75 80 Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg 85 90 95 Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser 100 105 110 Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala 115 120 125 Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln 130 135 140 Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val 145 150 155 160 Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr 165 170 175 Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr 180 185 190 Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val 195 200 205 Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro 210 215 220 Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg 225 230 235 240 Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp 245 250 255 Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Ala 260 265 270 Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr 275 280 285 Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys 290 295 300 Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr 305 310 315 320 Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn 325 330 335 Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile 340 345 350 Ser Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala 355 360 365 Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys 370 375 380 Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly 385 390 395 400 Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu 405 410 415 Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp 420 425 430 Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys 435 440 445 Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu 450 455 460 Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val 465 470 475 480 His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu 485 490 495 Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe 500 505 510 Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn 515 520 525 Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala 530 535 540 Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu 545 550 555 560 Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg 565 570 575 Gln Thr Ser Arg Gln Asp Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu 580 585 590 Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu 595 600 605 Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp 610 615 620 Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Gly Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu 625 630 635 640 Thr Ser Met Leu Lys Arg Thr Val Val Ala Ala Val Pro Met Pro Phe 645 650 655 Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro 660 665 670 Thr Gly Ser Leu Asn Ile Ser Val Gly Ala Lys Ile Leu Tyr Glu Ala 675 680 685 Val Gln Gly Asp Lys Ser Pro Ile Pro Gln Ala Val Asp Leu Phe Ala 690 695 700 Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Thr Trp 705 710 715 720 Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr 725 730 735 Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Phe Gly Val Pro 740 745 750 Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg 755 760 765 Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg 770 775 780 Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile 785 790 795 800 Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met 805 810 815 Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val 820 825 830 Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg 835 840 845

Claims

야생형 페니실린 G 아실라제(acylase)로부터 유도된 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제로서, 상기 야생형 페니실린 G 아실라제가 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 페니실린 G 아실라제이고,
돌연변이체는, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 페니실린 G 아실라제의 아미노산 넘버링에 따라서, B24 위치에서 페닐알라닌에서 알라닌으로의 아미노산 치환, B148 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환 및 B460 위치에서 페닐알라닌에서 류신으로의 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는,
돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제.
삭제
야생형 페니실린 G 아실라제(acylase)로부터 유도된 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제로서, 상기 야생형 페니실린 G 아실라제가 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 페니실린 G 아실라제이고,
돌연변이체는, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 페니실린 G 아실라제의 아미노산 넘버링에 따라서, B24 위치에서 페닐알라닌에서 알라닌으로의 아미노산 치환, B148 위치에서 발린에서 류신으로의 아미노산 치환 및 B460 위치에서 페닐알라닌에서 류신으로의 아미노산 치환을 갖고, 추가로 아래 (1) 내지 (7)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 치환을 갖는 것을 제외하고는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는,
돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제:
(1) 11 위치에서 발린에서 알라닌으로의 아미노산 치환, A3 위치에서 세린에서 류신으로의 아미노산 치환 및 A192 위치에서 발린에서 글루탐산으로의 아미노산 치환,
(2) A90 위치에서 메티오닌에서 라이신으로의 아미노산 치환,
(3) A144 위치에서 아스파라긴에서 세린으로의 아미노산 치환,
(4) 11 위치에서 발린에서 알라닌으로의 아미노산 치환, A3 위치에서 세린에서 류신으로의 아미노산 치환, A144 위치에서 아스파라긴에서 세린으로의 아미노산 치환, A192 위치에서 발린에서 글루탐산으로의 아미노산 치환 및 B109 위치에서 라이신에서 아르기닌으로의 아미노산 치환,
(5) B109 위치에서 라이신에서 아르기닌으로의 아미노산 치환,
(6) A144 위치에서 아스파라긴에서 세린으로의 아미노산 치환 및 B109 위치에서 라이신에서 아르기닌으로의 아미노산 치환,
(7) 11 위치에서 발린에서 알라닌으로의 아미노산 치환, A3 위치에서 세린에서 류신으로의 아미노산 치환, A192 위치에서 발린에서 글루탐산으로의 아미노산 치환 및 B109 위치에서 라이신에서 아르기닌으로의 아미노산 치환.
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제 1 항 또는 제 3 항의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 핵산.
제 7 항의 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
제 8 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1 항 또는 제 3 항의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 제조하는 방법으로서,
상기 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 제조하는 방법.
삭제
활성화된 측쇄와 β-락탐 핵의 효소적 커플링을 포함하는 반합성 β-락탐 항생물질의 제조 방법으로서, 제 1 항 또는 제 3 항의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제를 사용하는 것을 특징으로 하는 반합성 β-락탐 항생물질의 제조 방법.
제 12 항에 있어서,
반합성 β-락탐 항생물질이 반합성 페니실린 및 반합성 세팔로스포린으로 이루어진 군에서 선택되는, 반합성 β-락탐 항생물질의 제조 방법.
제 13 항에 있어서,
반합성 페니실린이 아목시실린 또는 암피실린인, 반합성 β-락탐 항생물질의 제조 방법.
제 13 항에 있어서,
반합성 세팔로스포린이 세팔렉신, 세파드록실 또는 세프라딘인, 반합성 β-락탐 항생물질의 제조 방법.
활성화된 형태의 D-p-하이드록시페닐글라이신(HPG)과 6-아미노페니실란산(6-APA)의 커플링을 촉진하는 제 1 항 또는 제 3 항의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제의 존재하에서 아목시실린을 제조하는 방법으로서, 6-APA에 대한 활성화된 HPG의 몰비가 3.0 이하이고, 효소적 커플링 반응 후 측정된, 6-APA를 기준으로 한 아목시실린의 수율(몰/몰)이 90% 이상인, 아목시실린을 제조하는 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제가, 1 리터당 500 밀리몰의 D-p-하이드록시페닐글라이신 메틸에스터(HPGM) 및 1 리터당 530 밀리몰의 6-APA로부터 아목시실린을 생성(즉, 전환)하는 성질을 나타내고, 시험 A에 기재된 바와 같은 조건하에서 수행된 전환반응 말기에 1 리터당 5 밀리몰 미만의 6-APA를 생성하며,
상기 시험 A는,
140 ㎛ 기공을 갖는 체 바닥 및 교반기가 장착된 2 L의 스테인리스 스틸 반응기를, HPGM을 6-APA에 커플링시키는 것을 촉진하기 위한 고정화된 제 1 항의 돌연변이체 원핵세포 페니실린 G 아실라제로 채우는 단계,
물을 첨가하여 부피를 1000 ml로 조정하는 단계,
내용물을 10 ℃로 냉각하는 단계,
반응기 내용물을 연동 펌프를 사용하여 체 바닥 위로 순환시키는 단계,
162.2 g의 6-아미노페니실란산을 가한 후 144 g의 HPGM을 가하는 단계,
물을 첨가하여 부피를 1500 ml로 조정하는 단계,
온도를 10 ℃로 유지하면서 혼합물을 교반하고 체 위로 순환시키는 단계, 및
pH가 6.3에서 7.0으로 증가하고 이어서 pH가 6.3 미만으로 감소하는 시점을 반응이 종료되는 시점으로 하여 반응을 모니터하는 단계
를 포함하는, 아목시실린을 제조하는 방법.
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