KR101184355B1 - 코디셉스 밀리타리스 ｋｃｔｃ 11455 ｂｐ로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 조성물에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 약학적 조성물 및 식품 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 조성물들은 조혈기능을 개선시키고 면역기능을 증강시키는 바, 이를 복용 시 조혈기능 장애 및 조혈 관련 질환에 효과적이며, 면역기능 증강을 통한 체질 개선 및 건강증진에 유용하다.

Description

코디셉스 밀리타리스 ＫＣＴＣ 11455 ＢＰ로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 조성물 및 그 제조방법{Composition for enhancement of immune function and improvement of hematopoiesis which comprises antler fermented with Cordyceps militaris KCTC 11455BP as an active ingredient, and a preparation method thereof}

본 발명은 녹용 발효 활성을 갖는 신규한 코디셉스 속의 균주로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 포함하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.

녹용(antler, Cervus cornu parvum)은 매화록(Cervus nippon Temminck) 또는 마록(Cervus elaphus Linnaeus) 및 동속 근연동물의 털이 밀생되고 골질화되지 않은 어린 뿔로 동양의학의 중요 약재로 중국 및 일본 등의 동양권 국가에서 오래 전부터 활용되고 있는 양록산업의 주 생산물이다. 녹용은 전 세계 생산량의 80%를 한국에서 소비한다고 알려져 있는데(Choi et al., 2005), 현재 국내에서 이용되는 녹용(녹각도 포함한다)은 대부분 수입에 의존하고 있으며, 2000년에 의약용으로 녹용 159톤을 수입하여 1,600만 달러가 지출되었고, 국내 생산 생녹용은 75 kg에 불과한 실정이다. 한국은 전세계에서 가장 큰 녹용 수입국으로, 대부분 국내에서 소비되고 있다.

녹용은 인삼과 더불어 오래 전부터 가장 대표적인 강장 생약재로 한국, 중국, 일본을 중심으로 애용되어 왔으며, 현대에 와서 녹용에는 혈압강하, 조혈기능, 고콜레스테롤 혈증 개선, 항스트레스 효과가 있다는 것이 밝혀지고 있다(Kim and Park, 1982; Yong, 1976; Han 1970; Kang and Kim, 1989). 인삼, 녹용과 같이 강장효과를 가진 생약재의 약성은 특정 장기에만 선택적으로 작용하여 강한 효과를 나타내는 것이 아니라 비록 그 효과는 단일 성분 의약품에 비해 약하나 신체 전반에 걸쳐 복합적으로 효능을 나타내는 것이 특징이다(Kim et al., 1994).

최근들어 녹용의 생리활성 성분에 대한 활발한 연구가 진행되고 있는데, 녹용 추출물은 면역기능 증진, 항산화, 항피로, 항혈전, 항노화, 혈압강하, 항염증작용 등 매우 다양한 효능이 있는 것으로 보고되었다(Cho 등, 2005).

그러나, 녹용은 설사 등의 부작용이 있어, 한방에서 수렴작용이 있는 한약과 병용하여 사용하게 되며, 이 경우 기대했던 효과가 상실되거나 감소될 수 있다. 또한, 한방의 유용한 자원인 녹용은 한약에 이용하기 위해 알코올에 담근 후, 이를 세절하여 사용하게 되는데, 이 과정에서 녹용의 많은 유효성분이 소실되는 문제점이 있다.

한편, 지금까지 녹용을 코디셉스 밀리타리스 속 곰팡이 균주를 이용하여 발효시킨 경우는 찾아볼 수 없다. 이에, 본 발명자들은 발효녹용의 유효성분 효율을 높이고 새로운 약리작용을 일으키기 위하여, 코디셉스 속 미생물을 분리하고자 본 연구를 수행한 결과, 버섯 자실체로부터 새롭게 분리한 균주인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 녹용을 발효시킬 경우 종래의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 비하여 발효추출물의 수율이 훨씬 높고 유효성분의 함량을 크게 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

또한 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 로 발효시킨 녹용 발효물에 대하여 연구를 계속한 결과, 상기 녹용 발효물이 항보체활성이 높고, 대식세포의 사이토카인(cytokine) 생산량을 증가시키며, 림프구를 증식시킨다는 것을 알아내었으며, 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 녹용발효물이 혈액 내 적혈구 및 백혈구 증식을 촉진할 뿐 아니라 조혈모세포의 증식 역시 증가시킴으로써 조혈기능 개선 효과가 있다는 것을 확인하였다.

면역계는 생체내에서 자연적으로 발생하거나 외부인자(항원)들에 기인한 각종 이상 현상을 제거하여 신체의 항성성(homeostasis)을 유지시키는 생명현상으로 항원에 대한 특이성에 따라 선천면역(innate immunity, nonspecific immunity)과 후천면역(adaptive immunity, specific immunity)으로 구분된다. 선천면역은 항원에 비특이적으로 작용하며 피부나 점막과 같은 물리적 방어막 이외에도 보체계(complement system) 활성화의 부경로(alternative pathway)와 대식세포(macrophage), 자연 살해세포(NK cell) 등의 면역세포들이 관여한다. 이에 반해 후천면역은 선천면역계를 통과한 항원들에 특이적으로 작용하는 면역체계로 이는 다시 체액성 면역(humoral immunity)과 세포성 면역(cellular immunity)으로 분류되는데, 체액성 면역은 B cell에서 생성되는 항체에 의한 혈액 내 반응으로 여기에는 보체계 활성화의 고전적 경로(classical pathway)가 관여하고 있음이 알려져 있다. 한편 세포성 면역은 cytotoxic T cell(T_C), helper T cell(T_H), suppressor T cell(T_S) 등이 관여하는데 T_C는 표면 항원과 결합한 이후 lymphokine을 방출하여 다른 T cell의 작용을 활성화 하거나 macrophage를 유인한다. 또한 T_H는 B cell의 활성화를 촉진하며, T_S는 면역 반응을 억제시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Kuby, 2006; Playfair, 1992). 이러한 면역체계는 다양한 종류의 cytokine에 의해 긴밀한 상호 활성화와 엄밀한 제어(cytokine network)가 이루어진다(Benjamini, 2000). Macrophage는 lysosome이 발달한 단핵 세포로서 조직 내에서 탐식작용이 왕성하고, 선천면역과 후천면역 모두에 관여하는 면역세포이다. macrophage는 탐식한 항원을 소화(processing)하여 분해된 항원의 일부를 자신의 표면에 제시(presentation)함으로써 후천면역세포가 이를 인식, 활성화 되도록 유도하는 antigen-presenting(APC)로서의 역할을 수행하며(Cebra and Shroff, 1994; James and Zeitz, 1994), 종양과 같은 자가세포에 대한 상해능도 갖는다(Kuby, 2006).

보체계(complement system)는 약 20여종의 혈중 순환 단백질들이 관여하여 작용하는 체액성 면역계로서 항원에 대하여 비특이적으로 활성화되어 MAC(membrane attack complex)를 형성, 세균 및 virus의 표면을 공격하여 삼투용혈을 유발함으로써 표적세포를 사멸하는 것으로 알려져 있다(Bienenstock and Befus, 1980; Hames and Glover, 1983). 특히 이들은 인체 내 여러 면역 system중 항원에 가장 신속하게 작용하는 생체 방어기구로 평가되고 있으며(Moon et al., 1990), 보체계의 활성화는 중추적 역할을 하는 C₃ 인자의 활성화(C₃a, C₃b 형성)에 이르는 경로에 따라 고전경로(classical pathway)와 부경로(alternative pathway) 및 lectin경로(lectin pathway)로 나누어진다. 고전경로에 의한 C₃ 인자의 활성은 항원과 특이항체(IgM, IgG)의 면역 복합체(immune complex) 형성에 의해 C₁인자를 시작으로 차례로 활성화 되어 C₃인자가 C₃a와 C₃b를 형성하는 경로이며, 부경로에 의한 활성화는 면역 복합체의 형성 없이 C₃b와 B factor의 결합을 시작으로 D factor에 의하여 C₃이 활성화되는 경로이다. 또한 lectin pathway는 혈액 중 mannan-binding lectin이 세균이나 virus의 표면에 존재하는 mannose를 포함한 다당체와 결합함으로써 C₃이 활성화되는 경로이다(Janaeway, 2000; Kim 1986). 고전경로에는 Ca⁺⁺과 Mg⁺⁺ 이온이 부경로에는 Mg⁺⁺ 이온 각각 선택적으로 관여하고 있음이 알려져 있다(Janaeway, 1968). 한편 보체계는 감염방어, 염증방어, 알레르기 반응 등에 작용하고 있다고 알려져 있으며, 이러한 보체계를 활성화하는 물질들이 macrophage의 활성화에도 작용하여 항암효과를 나타냄으로써 보체계의 활성화와 항암효과간의 상호 밀접한 관련이 있다는 연구 결과가 보고되기도 하였다(Ito, 1986; Okuda et al., 1972).

Macrophage는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러가지 cytokine을 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 세포로서, 항원제시와 림프구의 비특이적 면역작용에 관계하며, 종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다. 또한 TLR(tool-like receptor)에 반응하는 물질(LPS 혹은 천연물)은 macrophage를 활성화하여 T세포와 B 세포의 증식, 식균 작용을 위한 대식세포의 활성, 미생물 감염에 대한 방어 등의 2차 면역반응을 조절할 수 있는 IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 및 TNF-α와 같은 cytokine을 생산한다고 알려져 있다.

IL-1, IL-6 및 TNF-α는 macrophage에 의해 유도되는 대표적인 cytokine 으로 세균감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며 염증병소에서 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. IL-6는 IL-1과 협동적으로 작용하여 T 세포와 B 세포의 분화에 관여하고 항암효과가 있다고 보고되었으며, TNF-α은 특정암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 한편, IL-12는 NK cell의 활성화 및 Th1 type의 면역 반응을 유도하는 cytokine으로써 암세포와 같은 세포성 외래물질에 대한 반응성을 높이는 작용을 한다고 알려져 있다. 또한 IL-10은 macrophage에 의한 TNF, IL-1, chemokine 및 IL-12의 생성을 교차조절(cross--regulation)함으로써 T 림프구 활성화에 있어 대식세포의 부수적 기능(T 림프구 매개성 특이면역염증반응)을 저해한다고 알려져 있다.

최근 보체계 활성화 물질들의 질병 예방과 치료에 대한 효과적 이용 가능성이 제시됨으로써 생체 면역부전상태 개선 및 치료를 목적으로 하는 면역요법제로의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.

한편 빈혈은 순환 적혈구의 결핍 또는 적혈구 내 헤모글로빈양의 감소로 산소운반 능력이 감소하여 생기는 질환으로 순환 혈액 내 적혈구수(RBC), 혈색소량(hemoglobin) 또는 적혈구 용적(hemotocrit)이 정상 이하로 감소된다(Bruner et al., 1996). 발생 원인에 따라 출혈성 빈혈(hemorrhagic anemia), 혈색소 감소성 빈혈(hypochromic anemia), 재생 불량성 빈혈(aplastic anemia), 용혈성 빈혈(hemolytic anemia) 등으로 분류된다(Medical College of Seoul University. 1993). 빈혈동물 모델은 저 철분 식이, 비타민 B12 및 엽산 결핍과 같은 식이성 요인으로 유도할 수 있으나 장기간의 유도시간이 소요되므로 일반적으로 항암제로 사용되는 cyclophosphamide(CYP)나 phenylhydrazine(PHZ)을 이용하여 빈혈을 유도하고 있다(Chakrabarti et al., 1995; Valley, 2002). PHZ은 강한 산화제로, 자동산화로 생성된 ROS와 phenyldiazene, phenylhydrazyl radical, benzenediazonium ions 등의 PHZ 대사물은 적혈구의 단백질과 인지질 막에 산화적 손상을 일으키고, 헤모글로빈을 산화시켜 심각한 용혈성 빈혈을 일으킨다(Itano et al., 1975; Arduini et al., 1989; Hashmi and Saleemuddin, 1996). 일반적으로 빈혈 치료는 수혈 또는 합성된 recombinant human erythropoietin(rHuEPO)이 사용되고 있으며, 약물의 투여로 혈구증가 및 증세 호전의 효과는 기대할 수 있으나, 그 효과가 일시적이어서 근본적인 질환의 호전은 기대할 수 없다(Feusner and Hastings, 2002).

본 발명의 목적은 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 조성물, 식품 조성물 및 약학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 조성물 및 그 제조방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 식품 조성물, 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 약학적 조성물을 제공하며, 이들의 제조 방법들을 제공한다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 조성물은 투약자의 조혈기능을 개선시키고 면역기능을 증강시키는 바, 이를 복용 시 조혈기능 장애 및 조혈 관련 질환에 효과적이며, 면역기능 증강을 통한 체질 개선 및 건강증진에 효과가 있다.

도 1은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 녹용 발효물의 발효시간에 따른 S-GAG 및 Salic acid의 함량 변화이다.
도 2는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 녹용 발효물의 발효시간에 따른 total sugar 및 uronic acid의 함량 변화이다.
도 3은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP의 배양시간에 따른 항보체활성의 변화를 나타낸다.
도 4는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 녹용 발효물의 항보체 활성에 칼슘 및 마그네슘이 미치는 영향을 나타낸다.
(A) GVB＋＋ (Ca＋＋and Mg＋＋)
(B) Mg＋＋--EGTA--GVB- -(Mg＋＋ only)
(C) EDTA--GVB --(divalent metal ion free)
항보체 활성은 Mayer 방법에 의하여 총보체용혈 50 %의 억제로써 나타내며, Coriolus versicolor 유래의 공지의 면역증강성 다당류인 Polysaccharide-K(PSK)을 양성 대조군으로 이용하였다. 각 수치는 3번 측정한 평균±SD 으로 나타내었다.
도 5는 Ca 이온 존재 하, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물에 의한 C3 인자 분해의 교차=면역전기영동상(Cross-immunoelectrophoretic patterns)을 나타낸다. 정상적인 인간 혈청을 37℃ 에서 30분 간, GVB++(A), MG++--EGTA--GVB--(B) 및 EDTA--GVB--(C) 이 존재하는 샘플 내에서 배양하였다.항인간 C3 항체를 이용하여 혈청을 면역전기영동을 수행하였다. Anode는 왼쪽이다.
도 6은 녹용 비발효 추출물의 림프구 증식 활성을 나타낸다.
도 7는 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 림프구 증식 활성을 나타낸다.
도 8은 녹용 비발효 추출물의 투여시 IL-6 생산량을 나타낸다.
도 9은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 투여시 IL-6 생산량을 나타낸다.
도 10은 녹용 비발효 추출물의 투여시 IL-12 생산량을 나타낸다.
도 11은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 투여시 IL-12 생산량을 나타낸다.
도 12는 녹용 비발효 추출물의 투여시 TNF-alpha 생산량을 나타낸다.
도 13은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 투여시 TNF-alpha 생산량을 나타낸다.
도 14는 PHZ로 유도한 용혈성 빈혈에 있어서, 녹용 발효물이 혈중 헤모글로빈 및 헤마토크리트에 미치는 영향을 나타낸다.
도 15는 PHZ로 유도한 용혈성 빈혈 래트에 있어, 녹용 발효물이 erythropoietin 함량에 미치는 영향을 나타낸다.

본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계를 포함하는 면역기능 증강용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 조혈기능 개선용 조성물을 제공한다.

아울러 본 발명은 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계를 포함하는 조혈기능 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 녹용을 발효시키는 경우에 있어서, 상기 녹용은 녹용 또는 녹각이 될 수 있으며, 국산, 일본, 러시아, 중국, 미국, 캐나다 등 녹용의 산지는 어느 것이든 무방하다. 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시 녹용은 분말 또는 추출액의 형태로 발효될 수 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강용 및/또는 조혈기능 개선용 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물이 될 수 있다.

상기 면역기능 증강용 식품 및/또는 약학적 조성물은 암, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 크론씨병, 당뇨병과 같은 자가면역질환 또는 천식, 알레르기성 비염, 결막염, 아토피 피부염과 같은 알레르기 등 자가면역질환에 효과적이다. 그러나 이런 특정 질환이 아니어도 본 발명의 면역기능 증강용 식품 및/또는 약학적 조성물은 신체의 전반적인 면역력을 증강시킴으로써 각종 박테리아 및 바이러스성 질환에의 감염 및 발병 가능성을 낮출 수 있다.

본 발명의 면역기능 증강용 약학적 조성물은 Zadaxin(Thymosinalpha-1), EP-HBS

(HBV Therapeutic Vaccine), HBV Core Antigen Vaccine, LPS, Con. A와 같은 면역자극제 또는 Intron A(Interferon alpha-2b), Pegasys(Peginterferon alfa-2a)과 같은 면역조절제와 함께 투약될 수 있다. 또한 본 발명의 면역기능 증강용 약학적 조성물은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강용 조성물과 함께 상기 면역자극제 또는 면역조절제를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조혈기능 개선용 식품 및/또는 약학적 조성물은 조혈기능을 개선하여 빈혈, 적혈구 감소증 또는 조혈을 치료 또는 완화할 수 있으며, 신체 전반적인 조혈활성을 증진시킴으로써, 체력을 증강시키고 건강을 유지하는데 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 조혈기능 개선용 약학적 조성물은 EPO(erythropoietin), darbepoetin alfa, Aranesp, filgrastim, lenograstim, dextran 40, recombinant human erythropoietin, methoxypolyethyleneglycol-epoetin beta, magnesium chloride, oprelvekin, sargramostim, hydroxyethyl starch 등과 같은 조혈자극제, 조혈제와 함께 투약될 수 있다. 또한 본 발명의 조혈기능 개선용 약학적 조성물은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 조혈기능 개선용 조성물과 함께 상기 조혈자극제를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강 및/또는 조혈기능 개선용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강 및/또는 조혈기능 개선용 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 바람직하게는 10 mg 내지 1g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강 및 조혈기능 개선용 식품 조성물은 건강기능식품, 건강보조식품, 기능성식품 또는 영양제 등이 될 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 식품 조성물은 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 포함하는 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 60 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 식품 조성물에 있어서, 상기 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강 및/또는 조혈기능 개선용 조성물을 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강 및/또는 조혈기능 개선용 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계를 포함하는 상기 면역기능 증강용 및/또는 조혈기능 개선용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

상기 면역기능 증강용 조성물의 제조방법은 상기 면역자극제를 가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역자극제를 가하는 단계는 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 녹용을 발효시키는 단계 전 또는 후에 추가될 수 있으며, 녹용 발효와 함께 면역자극제 첨가가 이루어질 수도 있다.

또한 상기 조혈기능 개선용 조성물의 제조방법은 상기 조혈자극제를 가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조혈자극제를 가하는 단계는 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 녹용을 발효시키는 단계 전 또는 후에 추가될 수 있으며, 녹용 발효와 함께 조혈자극제 첨가가 이루어질 수도 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP의 분리

1. 야생버섯 5종의 균주로부터 성장이 좋은 균주 검정

가. 야생 버섯으로부터 균주의 분리

야생 채집균은 2-3% Sodium hypochloride로 소독한 자실체를 페트리 디쉬 뚜껑에 멸균테이프로 고정 후 water agar(WA) 배지상에 떨어진 하기 표 1에 기재된 버섯의 자낭 포자를 분리하여 각각 감자한천배지(Potato dextrose agar, PDA)에서 정치배양하여 균주를 분리하였다.

나. 균주의 배양

나-1. 녹용 분말 고체배지에서의 배양

녹용분말 4 g에 증류수 200 mL를 가하여 현탁 후 agar 4 g을 가하여 121 ℃에서 15분간 고압 멸균하여 페트리 디쉬에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 분리된 균주를 각각 도말하여 25 ℃에서 5일간 배양하면서 균주의 성장 여부를 확인하였다.

나-2. 녹용 추출물 함유 고체배지에서의 배양

녹용 10 g에 증류수 200 mL를 가하여 100 ℃에서 3시간 환류 추출하였다. 원심분리하여 추출액을 회수하였으며, 원심분리에 의하여 얻은 침전에 증류수 150 mL를 가하여 2차 환류 추출하였다. 원심 분리에 의하여 얻은 2차 환류 추출액과 1차 추출액을 혼합 농축하여 농축액(7.5 brix) 80 mL을 얻었다. 농축 추출액 80 mL에 증류수 120 mL와 agar 4 g을 가하여 121 ℃에서 15분간 고압 멸균하여 petri-dish에 담아 고체 배지로 사용하여 상기 분리된 균주를 각각 도말하여 25 ℃에서 5일간 배양하면서 균주의 성장여부를 확인하였다.

다. 성장정도 측정 및 균주 선정

상기의 녹용 분말 고체 배지와 녹용 추출물 고체 배지에서 성장 정도에 따라 균주의 성장 여부를 측정하여 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.

균주 성장이 매우 왕성: +++

균주 성장이 왕성 : ++

균주 성장이 보통 : +

균주 성장이 약함 : -+

전혀 성장하지 않음 : -

녹용 추출물 함유 고체 배지에서의 균주 성장 정도

녹용 분말 함유 고체 배지에서의 균주 성장 정도

라. 균주의 동정

상기 표 1 및 표 2 모두에서 성장이 매우 왕성한 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)로부터 균주를 선정, 분리하고 genomic DNA preparation Kit(SGD62S120, Solgent Co. Ltd., Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출한 다음 유니버셜 프라이머(universal primer) ITS 1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS 4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'), EF-Tag(SEF16 R250, Solgent Co. Ltd., Korea)으로 PCR(Applied Biosystem 9700, CA, USA)를 실시하여 증폭시켰다. 아세테이트와 70% 에탄올을 이용하여 정제한 다음 시퀀싱 키트(Big dye terminator cycle sequencing ready reaction kit)와 ABI Prism 3730XL DNA analyzer(Applied Biosystems, CA, USA)로 염기서열을 결정하였다. 분리균주의 18S rRNA 염기서열은 EMBL/DDBJ/PDB/GenBank 시쿼스 데이터베이스로부터 얻은 유연균주의 서열과 정렬시키고 상동성을 비교하여 표 3에 나타내었으며, 그 결과 녹용분말 고체배지와 녹용 추출물 고체배지 모두 성장이 매우 왕성한 균주는 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris)였다.

상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 균주를 2009년 1월 16일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁번호 KCTC 11455BP로 기탁하였다.

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP의 16S rDNA 염기서열 및 서열의 상동성

마. 분리 균주의 균학적 특성

본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주는 곰팡이 균주이므로 일반적인 세균의 균학적 성질을 규명하는 것과는 다르게 기존 공지된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 속 균주와 탄소원에 대한 영양 요구성을 대비하여 균학적 특성을 비교실험하였다.

한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 분양이 가능한 코디셉스 밀리타리스속 균주는 약 3가지 정도에 불과하고, 그 중에서 식물자원으로부터 유래된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) 균주는 KCTC 6472(IFO 30377) 하나에 불과하며 분양이 가능한 균주이므로, 하기 실험에서는 생물자원센터에서 분양받은 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472를 공지균주로 비교실험을 실시하였다.

본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주와 코디셉스 밀리타리(Cordyceps militaris) KCTC 6472 균주를 균학적 특성을 비교하기 위하여 하기의 방법을 통하여 탄소원에 대한 영양요구도를 측정하였다.

Lily 배지(Maltose 9.5 g/ℓ, aspargine 2.0 g/ℓ, KH₂PO₄ 1.0 g/ℓ, MgSO₄7H₂O 0.5 g/ℓ, Agar 20.0 g/ℓ)를 기본배지로 사용하여, 탄소원(10 g/ℓ)에 대한 두 균주의 영양요구도를 측정하였다. 배지를 121 ℃에서 20 분간 고압멸균 후 상기 균주들을 5 mm cork borer를 사용하여 균총을 떼어내어 접종하였다. 접종균은 25 ℃ 배양기에서 15일간 정치배양한 후 colony 직경 및 균사밀도를 측정하여 표 4에 나타내었다.

탄소원에 대한 영양 요구도

aColony diameter(mm): 25℃에서 15일 후 측정

cMycelial density: +, thin:TT, moderate:+++, compact

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 각 탄소원에 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472의 균사체를 같은 조건에서 배양한 결과 여러 탄소원에 대한 균사체 성장 정도는 유사하였으며, 아라비노스에서 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472는 균사체의 성장 정도가 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP보다 높았으나, 균사체가 자란 밀도는 오히려 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP가 훨씬 높았다.

이상의 결과에서 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP와 공지균주인 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472는 아라비노스에 첨가시 탄소원에 대한 이용도가 상이함을 알 수 있어 양 균주는 균학적 특성이 다른 것을 확인할 수 있다.

<실시예 2> 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP에 의한 녹용 발효

PDB(potato dextrose broth) 배지 20 mL를 이용하여 상기 실시예 2에서 분리된 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주를 25 ℃에서 5일 배양한 것을 전 배양으로 하였다.

녹용분말 4 g에 50 mM phosphate buffer(pH 6.0) 30 mL를 가하여 121 ℃에서 15분간 고압 멸균하여 25 ℃로 냉각한 후 상기 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주의 전 배양액 1 mL를 가하여 25 ℃에서 5일간 배양하였다. 배양액에 증류수 60 mL를 가하여 100 ℃에서 3시간 환류 추출 후 원심분리하여 녹용 발효추출물을 얻었다.

<비교예 1> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 6472에 의한 녹용 발효

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 공지 균주인 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 6472 균주를 이용하여 녹용 발효추출물을 제조하여 비교예 1로 하였다.

<실험예 1> 녹용 추출물의 수율 비교

상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 추출물의 수율을 측정하여 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율은 공지의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 의한 녹용 발효추출물의 수율보다 2배 정도의 수율이 향상되었음을 알 수 있다.

<실험예 2> 녹용발효 추출물의 유효성분 함량 비교

녹용의 유효성분인 S-GAG(sulgated-glycosaminglycan) 성분은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방 효과, 관절염 치료제의 지표물질로 관심이 증대된 물질이며, Sialic acid는 Gangliosides의 종류를 결정하는 주요 지표 성분이고, Gangliosides는 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, 상기 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

녹용 발효추출물에 대한 유효성분의 분석은 아래와 같은 방법으로 측정하였다. Total sugar는 phenol-sulfuric acid 법(Omran 등 1989)으로 측정하였으며, Sulfated-glycosaminoglycan(S-GAG) 측정을 Dimethyl-methylene blue dye binding 방법(Farndale 등, 1982)에 의하여 540 nm에서 측정하였고, Siallic acid 측정은 80 ℃에서 1 시간 동안 0.1 N 황산으로 가수 분해한 후에 Warren 방법(Warren, 1959)에 의해서 549 nm에서 측정하여 표 6에 나타내었다.

녹용 발효추출물에 대한 유효성분의 분석

녹용 발효추출물의 유효성분 함량을 분석한 결과, 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 유효성분인 Total sugar, S-GAG의 함량 및 Sialic acid의 함량은 발효 전 및 공지의 코디셉스 밀리타리스속 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 유사하였으나, 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

그러므로 본 발명에 따른 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 114455BP 균주에 의한 녹용 발효추출물은 조골세포 성장 촉진, 파골세포 억제, 골다공증 예방효과, 관절염 치료제, 기억력과 학습능력 증진 세포의 신경 전달계에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

<실험예 3> 녹용 발효추출물의 항산화 효과

본 발명에 의한 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 녹용 발효추출물의 항산화 활성효과를 알아보기 위하여 하기 시험을 실시하였다.

항산화 활성은 DPPH 라디칼에 대한 소거활성 및 ABTS 소거활성 두 가지를 측정하였다. DPPH 라디칼에 대한 소거활성은 Blois(1958)의 방법으로 측정하였다. 에탄올 적정량에 시료 0.2 mL과 4 × 10^-4 M DPPH 용액 0.8 mL를 가하여 10초간 혼합하고 10분간 방치 후 525 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.

ABTS 소거활성은 Arnao 등(Arnao et al. 2001)의 방법을 변형하여 측정하였다. 1.0 mM의 AAPH(2,2'-azobis(2-amodino-propane)dihydrochloride)은 100 mM PBS buffer에 녹인 2.5 mM의 ABTS(2,2'-azino-bis 3-ethylbenzenothiazolin-6-sulfonic acid)와 혼합한 후 68 ℃에서 12분 동안 반응시켰다. ABTS 용액의 농도는 734 nm에서 0.650±10.2가 되도록 조정하였다. 여러 가지 농도의 시료 20 ㎕와 980 ㎕ ABTS 용액을 37 ℃ water bath에서 10분간 반응시키면서 734 nm에서 감소하는 흡광도 정도를 측정하였다. 이때 라디칼 50 %를 소거하는 추출물의 양의 농도(IC₅₀)를 구하였다.

상기 DPPH 라디칼에 대한 소거활성과 ABTS 소거활성을 즉정한 결과는 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에서 알 수 있듯이, 녹용 발효추출물의 라디칼 소거능의 정도를 표시한 IC₅₀ 값은 ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능 모두에서 본 발명에 따른 녹용 발효추출물이 기존 공지의 균주로부터 얻어진 녹용 발효추출물보다 약 2-3배의 항산화 활성 효과가 현저히 우수함을 확인할 수 있었다

<실시예 3> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 성분 변화

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP에 의한 녹용 발효물 제조시의 성분변화를 측정한 결과, S-GAG의 함량은 배양시간이 증가할수록 증가한 반면(도 1), sialic acid 함량은 배양시간이 증가할 때 다소 감소하다가 다시 증가하는 경향을 보였는데, 특히 배양 60-72시간까지는 증가하다가 그 이후 감소하였다(도 1, 표 9). 배양시간에 따른 total sugar와 uronic acid함량은 배양시간에 따라 증가하는 경향을 보였는데, 배양 36시간 이후 증가하는 경향이 뚜렷하였으며, 증가경향은 total sugar 함량에서 뚜렷하게 보였다(도 2). 배양시간 별 pH는 배양시간이 경과할수록 증가하는 경향을 보였다(표 8). 그러므로,코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 이용하여 녹용을 발효하는 경우 72시간이 가장 적합한 것으로 보인다.

Time (h)	0	12	24	36	48	60	72	84
pH	7.4	7.41	7.5	7.68	7.96	8.19	8.51	8.74

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 이용한 녹용 발효 시간에 따른 pH 변화

구 분	0 H	24H	36H	48H	60 H	72 H	84 H
Uronic acid	106.1±10.2	74.9±3.6	90±0.6	129.4±0.6	146±0.3	153.5±3.3	165.7±1.4
S-GAG	103.4±10.6	264.2±4.4	290.5±3.6	276.3±4.2	312.8±20.6	358.3±9.7	354±4.1
Sialic acid	16.53±0.15	15.87±0.65	15.6±0	12.77±0.75	20.8±0	20.1±0.8	15±0.9

표준 물질: Total sugar as glucose, Uronic acid as galacturonic acid, Sulfated-GAGs (glycosaminoglycan) as chondroitin sulfate, sialic acid as N-acetylneuraminic acid

<실시예 4> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP의 면역기능 증강 활성

<실험예 1> 재료 및 방법

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455 BP 녹용 발효물의 제조

본 실험에 사용한 녹용은 광동제약으로부터 한약규격집 기준에 적합한 원료를 제공받아 녹용의 분골, 상대, 중대, 하대를 마쇄기로 분쇄하여 혼합 후 사용하였다. 녹용 발효물은 녹용 분말 40 g을 50 mM phosphate buffer(pH 6.0) 300 mL에 넣고 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 접종한 후 25-30℃에서 7일간 발효시킨 것을 시료로 하였으며 녹용 비발효물은 동일한 농도의 발효시키지 않은 녹용 분말액을 시료로 하였다. 각각 시료에 300 mL의 물을 가하고 100℃에서 3시간 동안 환류 추출한 후 8,000 × g에서 20분간 원심분리한 상징액을 회수하였다. 이를 2회 반복하여 회수한 추출물을 농축하고 동결건조를 행하여 각각 발효 녹용 시료 및 비발효 녹용 시료로 하였다.　　　

시약 및 실험동물

림프구 증식과 macrophage 활성 측정 실험에 사용된 RPMI medium 1640, Penicillin/Streptomycin, Fungizone 등은 Gibco BRL (Grand Island Co, NR, USA)사에서 구입하여 사용하였고, 세포 증식 능 측정에 사용한 CCK-8 (cell counting kit-8)은 일본 Dojindo사에서 구입하여 사용하였다. 면역활성 대조군으로 사용된 LPS (Lipopolysaccharide from E-coli 0127:B8)는 Sigma사의 제품을 사용하였고, PSK (polysaccharide-K from Coriolus versicolor)는 한국 광동제약에서 시판하는 코포랑^?으로부터 가용획분을 정제하여 사용하였다. 한편 항보체 활성에서 사용된 양의 감작적혈구 (IgM-hemolysis sensitized, EA cell)는 일본의 Biotest사 제품을, 교차 면역 전기영동에 사용된 anti-human C₃은 Sigma사의 제품을 사용하였다. 그 외 본 실험에서 사용된 모든 시약은 시판 1급 이상의 분석용 제품이 사용되었다.

또한 본 실험에 사용된 실험동물 BALB/c mouse (5~6주령)는 Korea Animal Tech사에서 구입하여 일주일간 적응을 거친 후 실험을 실시하였다. 사육 조건은 23±3℃, 습도 55~70%, 물과 사료는 자유 급식형태로 유지하였다.

<실험예 2> 코디셉스 밀리타리스 11455BP 녹용 발효에 따른 면역활성의 변화

정상인 혈청( normal human serum , NHS )의 제조

건강한 성인의 혈액을 채취하여 실온에서 약 15분간 방치하여 응고시킨 후, 응고된 혈액을 절단하고 약 5분간 상온에서 방치시킨다. 이 혈액을 다시 4℃에서 약 20분간 방치한 다음 원심분리(3,000 rpm, 20분, 4℃)하여 혈청을 분리한 뒤 미량 원심분리용 튜브에 1 mL씩 분주하여 -70℃에서 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.

발효 시간 및 농도 별 항보체 활성 측정

Mayer법을 이용하여 시료에 의한 보체 소비(complement consumption) 후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 complement fixation test 방법으로 항보체 활성을 측정하였다.

여러 농도로 증류수에 용해시킨 시료를 GVB⁺⁺(gelatin veronal buffer, pH 7.4, 0.1% gelatin, 0.15 mM Ca⁺⁺, 0.5 mM Mg⁺⁺ 함유) 및 정상인의 혈청과 각각 50 ㎕씩 혼합하여 37℃에서 30분간 1차 반응 시켰다. 동 반응액에 GVB⁺⁺ 350 ㎕를 가하고, 이를 10~160배 까지 연속 희석시킨 후, 750 ㎕의 GVB⁺⁺와 양의 감작적혈구 (IgM -sensitizated sheep erythrocyte, EA cell, 1× 10⁸ cells/mL)를 250 ㎕를 가하여 37℃에서 60분간 2차 반응시키고, PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4) 2.5 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하였으며, 얻어진 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정하였다. 항보체 활성은 정상인의 혈청과 GVB⁺⁺, 증류수만을 반응시킨 음성대조군의 총보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH₅₀, %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH₅₀, %)로써 나타내었다. 양성대조군으로는 운지버섯 유래 면역증강제인 PSK (polysaccharide-K)를 사용하여 비교하였다.

<식 1>

ITCH₅₀ (%)=TCH₅₀ of sample / TCH₅₀ of control × 100

항보체 활성은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 배양 1일차에부터 대조군의 활성에 약 2배에 이르는 높은 활성을 보였으며 이후 7일차까지 활성이 지속적으로 증가하였다. 상기 실험에서 배양 3일차에 활성물질의 추출량이 최대였던 점으로 보아, 면역활성이 높은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 얻기 위하여는, 최소 3일 이상 배양하는 것이 바람직하다(도 3).

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 농도별 면역 활성화 양상을 측정하기 위하여, Mayer의 방법에 따라 농도별 항보체 활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 운지버섯(Coriolus versicolor) 유래 면역 활성 다당체인 PSK(polysaccharide-K)를 사용하였으며, 음성대조군으로써 시료를 첨가하지 않은 증류수를 이용하였다. 음성대조군에서의 활성화 정도를 ITCH₅₀ 0으로 하여 활성화능을 확인하였다. 그 결과, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물은 1,000 μg/mL의 농도에서 약 40%이상의 비교적 양호한 활성을 나타내었으며, 이는 동일 농도를 가한 양성대조군보다는 낮은 활성이었다 (도 4). 일반적으로 1,000 μg/mL의 농도에서 40% 이상의 항보체 활성을 나타내는 다당체는 그 약리성이 통상적으로 인정된다고 알려져 있기 때문에(Kabat and Meyer, 1964), 본 발효 추출물은 보체계 활성화능이 우수한 것으로 판단된다. 또한 1,000, 500, 100 μg/mL로 발효물의 농도를 달리하여 실험한 결과 항보체 활성이 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 농도에 비례하여 증가하는 것이 확인되었다(도 4).

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455 BP 녹용 발효물의 보체계 활성화 경로의 검토

1. 금속 이온의 존재를 이용한 보체계 활성화 경로 검토

보체계의 활성 경로를 확인하기 위해 GVB⁺⁺ buffer와 Ca⁺⁺이온이 선택적으로 제거된 Mg⁺⁺-EGTA-GVB^-- buffer, Ca⁺⁺과 Mg⁺⁺ 이온이 모두 제거된 EDTA-GVB^-- buffer를 제조하여 시료 및 NHS와 각각 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 각 반응액은 37℃에서 60분간 재차 보체를 활성화 시키고, PBS 2.5 mL를 가한 후 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정함으로써 보체계 활성화능을 비교하였다.

보체계의 활성화 경로는 크게 고전경로(classical pathway)와 부경로(alternative pathway)로 구성되어 있으며(Wang et al., 2003), 고전경로의 활성에는 Ca⁺⁺및 Mg⁺⁺ 모두가 관여하고(Tsukagosh et al., 1984) 부경로에는 Mg⁺⁺만이 선택적으로 관여하고 있다고 보고되어있다(Marcus et al., 1971). 따라서 특정 금속이온이 제거된 반응계와 기본 반응계의 활성을 비교할 경우, 시료의 보체계 활성화 경로를 예측할 수 있게 된다. 보체계 활성능이 우수한 것으로 확인된 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효한 녹용 추출물을 대상으로 특정 금속이온을 제거한 반응계에서 항보체 활성을 측정하였다.

도 5에서 보는 바와 같이 Ca⁺⁺가 선택적으로 제거된 반응계에서는 Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺가 모두 존재하는 기본 반응계에 비해 약 20% 정도의 활성이 농도 의존적으로 나타났으며, Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 모두가 제거된 반응계에서는 활성이 거의 소실됨을 확인하였다. 이는 녹용추출물의 보체계 활성화가 고전경로와 부경로 모두를 경유하여 이루어진다는 것을 의미한다.

2. 2차원 면역전기영동을 이용한 보체계 활성화 경로 검토

Shimura 등의 방법에 따라 보체계 활성화 경로의 확인을 위한 2차원 면역전기영동을 실시하였다. GVB⁺⁺ buffer, Mg⁺⁺-EGTA-GVB^-- buffer와 EDTA-GVB^-- buffer에 각각 정상인의 혈청과 정제 다당 시료를 동량(50 ㎕) 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 냉각하였다. 반응액을 barbital buffer(pH 8.6)에 용해시켜 만든 1% agarose gel plate(5×5 ㎝)의 well에 5 ㎕씩 loading하고, 4℃에서 약 3시간 동안 1차 전기영동(75mA/plate)을 실시하였다. 이 후 1% anti-human C₃이 함유된 agarose gel plate 상에서 4℃, 약 15시간 동안 2차 전기영동(25mA/plate)을 실시하였다. 전개된 gel은 bromophenol blue로 약 10분간 염색 후 탈색하여 침강선(precipitation line)을 확인함으로써 C₃의 활성화 여부를 관찰하였다.

Mayer법에 의한 항보체 활성 측정법은 1차 반응단계에서 시료 성분의 보체계 활성화에 의한 보체의 소모정도를 측정하는 방법으로, 만일 시료 중 보체의 활성화가 아닌 특정한 저해성분이 존재할 경우에도 높은 항보체 활성을 나타낼 수 있는 문제점을 갖고 있다(Kim et al., 2002)]. 일반적으로 보체계의 고전경로 및 부경로가 활성화 되면 보체계 활성화에서 가장 중요한 성분인 C₃이 C₃a와 C₃b로 분해되고 이 후 연속적으로 C₅의 활성화, C₆~C₉의 항원으로의 결합반응을 진행하여 보체계가 활성화된다. 따라서 2차원 면역전기영동을 이용해 C₃의 활성화 여부를 확인함으로써 Mayer법에 의해 확인된 시료의 항보체 활성이 보체계 활성화에 기인한 것인지, 혹은 보체 저해인자에 의한 결과인지를 확인할 수 있다.

코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효한 녹용 추출물을 기본 반응계와 특정 금속이온이 제거된 반응계에서 각각 반응시킨 후 C₃인자의 분해여부를 관찰한 결과, Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺가 모두 존재하는 정상 반응계에서는 well로부터의 첫 번째 침강선에 비해 두 번째 침강선이 높게 나타났다. Well로부터 첫 번째 침강선은 C₃, 두 번째 침강선은 C₃a와 C₃b에 의해 기인하는바, 이는 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효한 녹용 추출물의 항보체 활성이 보체 저해인자에 의한 것이 아니라는 것을 의미한다. 반면 금속이온이 모두 제거된 반응계에서는 첫 번째 침강선 만이 뚜렷하게 나타나고 두 번째 침강선은 나타나지 않았다. 또한 Ca⁺⁺만이 선택적으로 제거된 반응계에서는 정상 반응계에서 보다 두 번째 침강선의 높이가 상대적으로 낮아진 것을 확인할 수 있었다. 이는 고전경로가 저해된 상태에서도 C₃의 활성화가 일어났다는 것을 가리키며, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효한 녹용 추출물의 보체계 활성이 고전경로 및 부경로 모두를 경유하여 나타남을 재차 확인시켜주는 결과이다.

<실험예 3> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 림프구 증식 활성

BALB/c (♀, 6 주령) mouse를 경구탈구법으로 치사시킨 후 무균 상태에서 비장(spleen)을 적출하여 stainless steel mesh를 이용, PBS 상에서 마쇄(100 mesh) 및 여과(200 mesh)하여 림프세포를 획득하였다. 0.2% NaCl 5 mL을 15~30초 동안 가하여 혼입된 적혈구를 파괴하고 RPMI 1640으로 2~3회 세척 후 Hemacytometer를 이용하여 세포수를 1×10⁶ cells/mL이 되도록 조정하였다. 림프세포의 수는 0.2 % trypan blue (Sigma Chemical. Co. Ltd., USA)로 염색하여 살아있는 세포만을 계수하였다. 분리된 비장 림프세포 180 ㎕와 PBS에 용해한 시료 20 ㎕를 flat-bottomed 96-well microplate에 분주(1.44×10⁵ cells/0.2mL/well)한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 72 시간 동안 배양하였다. 림프구 증식자극 활성의 측정은 CCK-8 (cell counting kit-8, Dojindo Co. Ltd., Japan)을 well당 10 ㎕ 씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 1~4 시간 반응시켜 450 nm에서 흡광도를 측정하여 증식 정도를 확인하였다.

BALB/c mouse의 비장으로부터 획득한 림프세포에 비발효 녹용추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물을 가하여 그 증식 정도를 측정한 결과는 각각 도 6 및 도 7과 같다. media만을 가하여 배양하였을 시의 림프구의 증식정도(양성대조군)를 100%라 할 때 비발효 녹용 추출물의 경우 어떠한 증식도 관찰되지 않았으며 이는 면역자극제인LPS 및 conA로 boosting한 경우도 동일한 양상을 보였는바, 단순 녹용추출물은 림프구 증식활성이 없는 것이 확인되었다. 반면, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물은 농도 의존적으로 림프구 증식이 증가하였으며, 특히 500 μg에서는 무첨가 대조군에 비해 약 30%이상의 증식 활성을 나타내었다. 이러한 림프구 증식 활성은 LPS 및 conA와 함께 첨가 시, 더욱 뚜렷하였는데, 이러한 결과는 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물이 성숙된 면역세포를 직접 증식시키는 mitogen 활성이 있음을 보여주는 것이다. 그러므로 외부로부터 항원에 노출 시, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물을 투여함으로써, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 작동세포의 수를 증가시켜 항원에 대한 방어를 효과적으로 유도할 수 있을 것이다.

<실험예 4> 코디셉스 밀리타리스 11455BP 녹용 발효물이 대식세포의 cytokine 생산에 미치는 영향

대식세포 배양액의 준비

PBS를 이용, 1 mg/mL 농도로 조제한 녹용발효물 시료 용액에 RPMI 1640를 가하여 500 μg/mL에서 0.12 μg/mL의 농도가 되도록 2배수로 연속 희석하고 flat-bottomed 96-well microplate에 100 ㎕씩 분주하였다. 여기에 BALB/c(♀, 6 weeks) mouse의 복강에 5% thioglycollate medium 2 mL 주입하여 72시간 동안 유도된 대식세포(macrophage)(2.25×10⁵ cells/mL of RPMI 1640) 100 ㎕를 가한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 1,500 rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포배양액 150 ㎕를 회수하고 상등액 중에 유도된 cytokine의 함량을 측정하였다.

샌드위치 ELISA 에 의한 cytokine 측정

샌드위치 ELISA(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 대식세포에 의하여 생산된 cytokine의 함량을 분석하였다.

각 cytokine의 항체는 coating buffer에 희석하여 flat-bottomed 96- well microplate에 coating한 후 4℃에서 12시간 방치하였다. Coating이 완료된 microplate는 washing buffer(PBS with 0.05% tween 20, PBST)를 이용하여 3차례 세척하고, assay diluent(PBS with 10% FBS or 2% skin milk) 200 ㎕를 가하여 1 시간 동안 방치하여 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하였다. blocking 완료 후 각 well은 washing buffer를 이용하여 재차 3회 세척하고, 각 well에 연속 희석한 표준물질(recombinant mouse cytokine)과 면역세포배양액을 각각 50 ㎕씩 분주하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 washing buffer로 세척하고 detection antibody (in assay diluent) 100 ㎕를 처리하여 실온에서 1시간 방치한 후 재차 세척하였다. Enzyme reagent (avidin-horseradish peroxidase conjugate) 100 ㎕를 처리하여 실온에서 30분간 결합시킨 후 substrate solution [tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide] 100 ㎕를 가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 50 ㎕의 stop solution[(1 M H₃PO₄ or 2 N NH₂SO₄)]을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과

비발효 녹용추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물의 직접적인 자극에 의한 대식세포의 사이토카인 생산을 in vitro에서 측정한 결과, 비발효 녹용 추출물은 IL-6, IL-10, IL--12 및 TNF--α의 생산을 전혀 자극하지 못한 반면(도 8, 도 10 및 도 12), 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 경우, IL-6, IL-10, IL-12 및 TNF-α의 생산을 촉진하였으며 이러한 사이토카인의 생산량은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 농도에 비례하는 것이 확인되었다.

IL-6의 경우 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물은0.49 μg/mL 농도부터 증가하기 시작하여 7.81 μg/mL의 저농도에서 최대 생산량을 보였다(도 9, 표 10).

group	normal	sample concentration(pg/mL)							LPS
		0.12	0.49	1.95	7.81	31.25	125	500
비발효 녹용 추출물	0	0	0	0	0	0	0	32.3±1.2	2100±110.4
코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물	0	0	150.3 ±10.2	1650.8 ±0.5	2110.3 ±10.3	2000.8 ±50.4	1981.3 ±30.5	1950.7± 20.3	2100 ±110.4

비발효 녹용 추출물 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용추출물의 IL-6 생산 유도능 비교

IL-10의 경우 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP로 발효한 녹용 추출물은 고농도에서 생산능을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 IL--12의 경우 비발효 녹용추출물은 생산 유도능을 거의 나타내지 않은 반면(도 10), 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물은 약 2 μg/mL이상의 농도에서부터 농도의 증가에 따라 급격한 IL--12생산의 증가를 보였으며 500 μg/mL에서는 대조군인 LPS의 생산량에 2.2배에 이르는 많은 생산량이 관찰되었다(도 11, 표 11). 그러므로 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물이 NK cell의 활성화 및 Th1 type의 면역 반응 유도를 통한 cytotoxic T lymphocyte(CTL)의 활성화와 같은 세포매개성 면역에 있어 활성을 가질 것으로 보인다.

Group	Normal	Sample concentration (pg/mL)							LPS
		0.12	0.49	1.95	7.81	31.25	125	500
비발효 녹용 추출물	20.5 ±2.3	20.2 ±1.9	19.6 ±2.3	17.6 ±1.2	20.8 ±2.1	21.3 ±0.9	21.9 ±1.4	20.9 ±1.0	310.0 ±3.8
코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물	20.5 ±2.3	21.4 ±0.5	20.4 ±0.3	50.9 ±2.4	136.9 ±20.3	192.3 ±10.4	339.7 ±5.7	662.4 ±2.5	310.0 ±3.8

비발효 녹용 추출물 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용추출물의 IL-12 생산 유도능 비교

TNF--α 역시 비발효 녹용 추출물에서는 생산 유도능이 관찰되지 않았으나(도 12), 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP녹용 발효물의 경우 약 2 μg/mL 이상에서 농도의존적으로 생산 유도능이 증가하였다(도 13, 표 12).

Group	Normal	Sample concentration (pg/mL)							LPS
		0.12	0.49	1.95	7.81	31.25	125	500
비발효 녹용 추출물	0 ±12.3	0	0	0	0	0	0	0	1210.2 ±20.4
코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물	0 ±12.3	0	0	0	290.3 ±12.6	618.2 ±3.7	821.8 ±4.2	980.6 ±4.5	1210.2 ±20.4

비발효 녹용 추출물 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용추출물의 TNF-알파 생산 유도능 비교

<실시예 5> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 조혈 기능 개선 활성

<실험예 1> 재료 및 방법

실험동물

4 주령의 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐를 ㈜나라바이텍(대전, 대한민국)에서 구입하여 표준사료와 물을 충분히 공급하면서 항온항습 환경인 온도 20±2 ℃, 습도 50±5%, 12시간 주기로(08:00~20:00) 명암을 자동 조절하여 실험실 환경에 적응시켰다.

녹용 추출물 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455 BP 녹용 발효물의 제조

녹용 발효물은 녹용 분말 40 g을 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) 300 mL에 넣고 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP를 접종한 후 25-30 ℃에서 5 일간 발효시킨 것을 시료로 하였으며, 녹용 비발효물은 동일한 농도의 발효시키지 않은 녹용 분말액을 시료로 하여 각각 300 mL의 물을 가하고 100℃에서 3시간 동안 환류 추출한 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리한 상징액을 회수하였다. 추출 후 잔사에 물 150 mL을 가하여 3시간 환류 추출하였다. 이러한 과정을 2회 반복하여 회수한 추출물을 농축하여 농축액 100 mL(7.5 brix)을 얻었으며 이를 각각 발효 녹용 추출액과 비발효 녹용 추출액으로 하여 이후 실험의 시료로 사용하였다.　　　　

빈혈유발 및 약물투여

실험군은 정상 대조군(Control), PHZ 처치 빈혈 대조군(PHZ-control), PHZ 처치 녹용 추출물 투여군(PHZ-AE), PHZ 처치 녹용 발효물(코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물, PHZ-FAB) 투여군, 즉, PHZ 처치 후 각 녹용 추출물, 녹용 발효물을 각각 200 mg/kg을 투여한 군으로 하여4군으로 나누었다. PHZ 처치군은 생리식염수에 녹인 PHZ을 10 mg/kg의 농도로 흰쥐의 꼬리정맥에 4 일간 주사하였으며, 녹용 추출물 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물은 PHZ 투여기간이 끝난 후 일주일 동안 경구 투여하였다.

통계처리

통계처리는 SPSS 통계 package program(statistical package social science, version 14.0)을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였고, 처리군 간의 유의성은 Duncan’s multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시 하였다.

<실험예 2> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물이 식이효율에 미치는 영향

모든 실험동물의 식이와 물의 공급은 자유 섭취 방법으로 하였다. 실험기간 동안 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 2일 간격으로 측정하였다. 식이효율(Food efficiency ratio, FER)은 실험 시작일로부터 종료일까지 총 실험 기간 동안의 체중증가량을 식이섭취량으로 나누어 산출하였다.

실험종료 후 최종 체중과 식이섭취량 및 식이효율을 표 13에 나타내었다. 체중 증가량은 PHZ을 투여한 빈혈 유발군(PHZ-control)이 다소 감소하였으나, 유의적인 차이를 보이지 않았다. 녹용 추출물 투여군에서는 대조군과 비슷한 증가량을 보였고, 녹용추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군에서 체중증가가 높았으나 유의적인 차이는 없었다. 본 연구의 결과에서 PHZ군의 체중감소와 식이효율 감소는 화학 약물인 cyclophosphamide로 빈혈을 유발한 실험에서 체중 감소와 저 식이효율을 보인 Han 등의 연구(Han et al., 2003)와 유사한 결과를 보였으며, 강한 산화제인 PHZ의 자동산화 결과 생성된 활성산소와 여러 라디칼의 반응으로 조직의 산화적 손상을 일으켜 영양상태를 악화시킨 것으로 판단되었다(Nicolas et al., 2002).

실험군	Control	PHZ-control	PHZ-AE	PHZ-FAC
식이섭취량 (g/day)	10.87±2.23	10.21±1.08	10.52±1.13	10.17±1.16
체중 증가량 (g/day)	5.21±0.57	5.01±0.75	5.48±0.67	5.52±0.83
식이효율	0.48±0.03	0.49±0.07	0.52±0.06	0.54±0.07

대조군: 비처리군, PHZ-control: 4일간 PHZ·HCl (10 mg/kg, i.v.)을 처리한 군, PHZ-AE: 녹용 추출물, PHZ-FAC:코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 PHZ 투약 후 1 주 후에 투여한 군(200 mg/kg, p.o.) (p<0.05에서 유의하게 다른 수치는 다른 문자로 기재하였으며, 수치는 평균±SD (n=6)), 식이효율=체중 증가량/식이섭취량

<실험예 2> 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물이 혈액에 미치는 영향

항응고제인 EDTA가 코팅되어 있는 vacutainne에 혈액을 채취하였다. 전혈(whole blood)은 적혈구수(red blood cell, RBC), 혈색소(hemoglobin, Hb), 적혈구 용적(hematocrit, Hct), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 적혈구 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC) 등을 automatic blood cell counter (ADVIA 120, Bayer, Tarrytown, NY, USA)를 사용하여 측정하였다.

헤모글로빈 함량 및 헤마토크리트 수치

도 14는 항응고제를 처리한 전혈에서 헤모글로빈(Hemoglobin)과 헤마토크리트(적혈구 용적률(Hematocrit)) 수치를 측정한 결과이다. 헤모글로빈 농도는 PHZ 을 4일간 투여하여 용혈성 빈혈을 유도한 PHZ군은 12.47±2.12 g/dL 이었으나, 용혈성 빈혈이 유발되지 않은 대조군은 13.21±2.32 g/dL 로 다소 높은 수치를 보였다. PHZ으로 빈혈을 유발한 후 녹용 추출물을 투여한 결과, 14.97±1.05 g/dL이었으며, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군인 PHZ-FAC 군은 15.81±0.83 g/dL로 PHZ군보다 헤모글로빈 수치가 유의적으로 증가하였다(p<0.05).

전혈에서 적혈구가 차지하는 용적을 백분율로 나타낸 헤마토크리트 수치는 PHZ 처리군이 37.3±1.31%로 대조군 40.2±2.41%보다 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 반면, 녹용 추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 처리한 군은 PHZ 처리군보다 헤마토크리티 수치가 유의적으로 증가하였으며, 특히 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군의 경우 수치 증가 효과가 두드러졌다(표 14).

그러므로 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효PHZ에 의한 적혈구 막단백질의 산화와 혈장막의 지질과산화를 막아 적혈구의 손상을 억제하여 정상적인 조혈작용이 이루어지도록 하였다.

Group	헤모글로빈 (g/dL)	헤마토크리트 (%)
Control	13.21±2.32ab	40.2±2.41b
PHZ-control	12.47±2.12a	37.3±1.31a
PHZ-AE	14.97±1.05ab	42.4±1.24bc
PHZ-FAC	15.81±0.83b	43.6±1.06c

대조군: 비처리군, PHZ-control: 4일간 PHZ·HCl (10 mg/kg, i.v.)을 처리한 군, PHZ-AE: 녹용 추출물, PHZ-FAC: 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 PHZ 투약 후 1 주 후에 투여한 군(200 mg/kg, p.o.) (p<0.05에서 유의하게 다른 수치는 다른 문자로 기재하였으며, 수치는 평균±SD (n=6))

혈액학적 분석

항응고제를 처리한 전혈의 혈액학적 지표에 대한 측정 결과는 표 15와 같다. 연구에서 PHZ 투여군의 적혈구수는 대조군보다 감소하여 유의적인 차이를 보였다(p<0.05). 적혈구 감소로 인한 헤모글로빈 양과 헤마토크리트 수치의 감소 현상은 표 14에서 살펴본 바와 같다. 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군인 PHZ-FAC군에서는 적혈구수가 PHZ군보다 유의적으로 증가하였고(p<0.05), 녹용 추출물인 PHZ-AE와 빈혈 유도된 PHZ-control과는 유의적인 차이가 없었다. 또한 녹용발효물과 녹용추출물 사이에도 유의적인 차이가 없었다.

백혈구수는 각 군 사이에 유의적인 차이가 없었다. 녹용 추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여는 PHZ군에서보다 백혈구 수치의 증가가 적었으며, 정상 대조군과 비슷한 수치로 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

망상 적혈구는 일반적으로 실혈성 빈혈이나 용혈성 빈혈로 인한 만성적 헤모글로빈 감소가 있을 때 그 수가 증가하는 것으로 알려졌다(Xiea et al., 2006). PHZ으로 빈혈을 유발한 PHZ-control 에서의 망상 적혈구(Reticulocyte)수는 10.25±1.51%로 정상 대조군(control)의 6.51±1.10% 보다 높은 수치를 보였다(p<0.05). 녹용 추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 투여하였을 때의 망상 적혈구수는 PHZ 투여군보다 감소하여 정상적으로 회복되는 것을 관찰할 수 있었는바, 녹용 추출물과 녹용발효물 투여군이 망상 적혈구수 증가 억제 효과를 보였다. 그 외의 평균혈구 혈색소(MCH)와 평균 혈구 부피(MCV), 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(MCHC)는 그룹 간 차이를 보이지 않았다.

	Control	PHZ	PHZ-AE	PHZ-FAC
적혈구 (106 mm3)	6.85±0.55c	5.71±0.17a	6.09±0.11ab	6.44±0.36bc
백혈구(103 mm3)	4.61±1.10	5.53±1.69	5.18±1.37	4.62±1.89
망상 적혈구 (%)	6.51±1.10a	10.25±1.51b	8.90±1.20ab	7.85±1.98ab
MCH (pg)	18.88±0.58	18.60±0.42	18.97±0.45	18.42±0.67
MCV (fL)	65.65±2.10	64.05±1.66	66.67±0.89	65.26±2.13
MCHC (g/dL)	27.31±0.44	26.73±1.08	26.77±0.87	26.56±0.75

대조군: 비처리군, PHZ-control: 4일간 phenylhydrazine·HCl (10 mg/kg, i.v.)을 처리한 군, PHZ-AE: 녹용 추출물, PHZ-FAC: 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 PHZ 투약 후 1 주 후에 투여한 군(200 mg/kg, p.o.) (p<0.05에서 유의하게 다른 수치는 다른 문자로 기재하였으며, 수치는 평균±SD (n=6))

Erythropoietin ( EPO ) 함량

혈청 EPO 농도 측정은 EPO-TracTM 1251 RIA kit(DiaSorin, Stillwater, USA)를 이용하여 RIA 방법(Radioimmunoassay)으로 분석하였으며(COBRA 5010 II, Quantum,Packard, Meriden, USA), 간조직의 δ-aminolevulinic acid dehydrates(ALAD)활성 Russell과 Coleman의 방법(Russell and Coleman, 1963)을 변형하여 10% 간 조직액을 사용하였다. 0.3 M glutathione 50 ㎕와 0.1 M phosphate buffer(pH 6.8) 400 ㎕를 함유한 tube에 150 ㎕의 간조직액을 가하여 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 기질용액인 0.1 M δ-aminolevulinic acid 150 ㎕를 가하여 30분간 반응시킨 후 10% 1.5 mL TCA(0.1 M HgCl₂ 함유)을 넣어 반응을 종결시켰다. 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 0.5 mL 상등액에 5% TCA 1.5 mL와 1.5 mL Ehrlich 시약을 넣고 10분간 정치한 후 555 nm에서 흡광도를 측정하였다.

빈혈 시에는 적혈구 및 헤모글로빈이 감소하여 동맥 혈중 산소 분압이 감소하고 이로 인해 신장에서 erythropoietin이 증가되어 골수에서의 적혈구 생산을 촉진하게 된다(Mc Mullin et al., 1989). 혈청 EPO 함량에 대한 녹용 추출물의 효과는 도 15에 나타내었다. PHZ 투여로 용혈성 빈혈을 유도한 PHZ군의 혈청 EPO 함량은 42.93±3.94 mU/mL로 정상 대조군 37.21±2.72 mU/mL보다 증가하였다(p<0.05). PHZ 투여로 적혈구 조혈인자인 erythropoietin의 증가는 골수의 적혈구 생성을 증가시켜 망상적혈구 수치를 증가시킨다.

용혈성 빈혈에 대한 녹용 추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 투여 효과를 검토한 결과, 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군(PHZ-FAC)에서의 혈청 EPO 함량은 32.48±2.48 mU/mL인 반면, 녹용 추출물 투여군(PHZ-AE)는 36.89±1.89 mU/mL였다. 그러므로 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물은 용혈성 빈혈에 있어, EPO 감소 효과가 우수한 것으로 확인되었다(표 16).

Group	Control	PHZ-control	PHZ-AE	PHZ-FAC
EPO (mU/mL)	37.21±2.72b	42.93±3.94c	36.89±0.89b	32.48±2.48ab

대조군: 비처리군, PHZ-control: 4일간 PHZ·HCl (10 mg/kg, i.v.)을 처리한 군, PHZ-AE: 녹용 추출물, PHZ-FAB: 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 PHZ 투약 후 1 주 후에 투여한 군(200 mg/kg, p.o.) (p<0.05에서 유의하게 다른 수치는 다른 문자로 기재하였으며, 수치는 평균±SD (n=6))

δ- Aminolevulinic acid dehydrates ( ALAD ) 활성

δ-Aminolevulinic acid dehydrates는 혈색소의 합성초기 과정인 δ-aminolevulinic acid로부터 porphobilinogen이 합성되는 경로를 촉매하는 효소이다. 적혈구 용혈로 인한 빈혈은 헤모글로빈 합성에 관여하는 δ-aminolevulinic acid dehydrates(ALAD)의 활성을 저해하여 aminolevulinic acid(ALA)의 뇨 중 배설을 증가시켜 조혈작용을 저해하는 것으로 알려졌다(Thompson et al., 1977).

PHZ으로 유발한 용혈성 빈혈에 대한 녹용 추출물 및 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 효과를 검토한 결과, PHZ투여 빈혈 유도군의 ALAD활성의 흡광도 값은 정상 대조군보다 낮은 0.410±0.030인 반면 녹용 추출물 투여 시 ALAD 효소 활성이 증가하였다. 또한, 녹용 추출물보다 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여 시 ALAD 효소 활성의 증가 폭이 높았고, 상기 녹용 발효물은 정상 대조군과 유사한 ALAD 효소 활성을 보였다(표 17).

Group	Control	PHZ-control	PHZ-AE	PHZ-FAC
OD value/mg protein	0.410±0.030c	0.332±0.010a	0.377±0.008b	0.381±0.009bc

대조군: 비처리군, PHZ-control: 4일간 PHZ·HCl (10 mg/kg, i.v.)을 처리한 군, PHZ-AE: 녹용 추출물, PHZ-FAB: 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물을 PHZ 투약 후 1 주 후에 투여한 군(200 mg/kg, p.o.) (p<0.05에서 유의하게 다른 수치는 다른 문자로 기재하였으며, 수치는 평균±SD (n=6))

결론

이상의 결과에 의하면 PHZ에 의해 유발된 용혈성 빈혈 유발군인 PHZ군은 헤모글로빈 수치, 헤마토크리트 수치, 적혈구수가 대조군에 비해 유의적으로 감소하였고, 망상적 혈구수는 유의적으로 증가하였다. 반면, 녹용 추출물과 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군에서는 헤모글로빈 수치, 헤마토크리트 수치, 적혈구수가 PHZ 투여군보다 증가하였으며, 특히 녹용 발효물 투여군에서의 증가량이 더욱 뛰어났다.

PHZ 투여로 증가된 혈청 EPO 함량은 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물 투여군에서 상당히 회복된 것으로 확인되었으며, δ-ALAD 활성 또한 녹용 발효물에서 우수하였다. 따라서 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물은 조혈에 있어, 우수한 효과를 보이는 것으로 확인되었다.

<실시예 6> 독성검사

상기 실시예 5의 실험예 1의 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 녹용 발효물의 급성독성검사 결과, 경구 투여 및 복강 내 주사 시 50% 치사량이 체중 kg 당 2 g 이상으로 독성효과는 없었다.

본 발명의 코디셉스 밀리타리스 KCTC 11455BP 로 발효시킨 녹용을 유효성분으로 함유하는 조성물은 투약자의 조혈기능을 개선시키고 면역기능을 증강시키는 바, 이를 복용 시 조혈기능 장애 및 조혈 관련 질환에 효과적이며, 면역기능 증강을 통한 체질 개선 및 건강증진에 도움이 될 것으로 기대된다.

한국생명공학연구원 KCTC11455 20090116

Claims (12)

1. 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강용 식품 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 식품은 건강기능식품, 건강 보조식품, 기능성식품 또는 영양제인 것을 특징으로 하는 면역기능 증강용 식품 조성물.
   
3. 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능 증강용 약학적 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 면역자극제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역기능 증강용 약학적 조성물.
   
5. 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계;및
   상기 녹용 발효물을 추출하는 단계를 포함하는 면역기능 증강용 식품 조성물의 제조방법.
   
6. 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계;및
   상기 녹용 발효물을 추출하는 단계를 포함하는 면역기능 증강용 약학적 조성물의 제조방법.
   
7. 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 추출물을 유효성분으로 함유하는 조혈기능 개선용 식품 조성물.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 식품은 건강기능식품, 건강 보조식품, 기능성식품 또는 영양제인 것을 특징으로 하는 조혈기능 개선용 식품 조성물.
   
9. 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시킨 녹용의 추출물을 유효성분으로 함유하는 조혈기능 개선용 약학적 조성물.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 조혈자극제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조혈기능 개선용 약학적 조성물.
    
11. 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계;및
    상기 녹용 발효물을 추출하는 단계를 포함하는 조혈기능 개선용 식품 조성물의 제조방법.
    
12. 녹용을 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris) KCTC 11455BP로 발효시키는 단계;및
    상기 녹용 발효물을 추출하는 단계를 포함하는 조혈기능 개선용 약학적 조성물의 제조방법.
    
    

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