KR101132625B1

KR101132625B1 - 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법

Info

Publication number: KR101132625B1
Application number: KR1020100009921A
Authority: KR
Inventors: 양은경; 정삼현; 김성포; 주지훈; 이종원; 홍종명; 김재찬; 전연숙; 이성춘; 백광일
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2010-02-03
Filing date: 2010-02-03
Publication date: 2012-04-02
Anticipated expiration: 2030-02-03
Also published as: CN102138841A; US20110189301A1; KR20110090242A

Abstract

본 발명은 봉합이나 접착물질 없이 안구표면질환의 치료에 사용될 수 있는 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법 및 이로부터 제조된 양막 드레싱에 관한 것으로서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱은 종래 양막 봉합시 문제점인 고도의 봉합기술의 필요, 수술시간 지연, 봉합 농양, 육아종 형성 또는 조직 괴사의 발생, 및 환자의 불편함을 해결할 수 있으며, 지지체 사용시 문제점인 눈의 깜박임에 의한 탈락, 지지부위의 찢어짐 및 눈의 불편함을 원천적으로 제거할 수 있는 장점이 있으므로, 양막표면질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법{Method for preparing contact lens-shaped amniotic dressing}

본 발명은 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 봉합이나 접착물질 없이 안구표면질환의 치료에 사용될 수 있는 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법에 관한 것이다.

양막은 0.02 내지 0.5 mm의 두께를 갖는 태반의 가장 안쪽 막으로 상피세포, 기저막, 치밀층(compact layer), 섬유모세포층(fibroblast layer), 해면층(sponge layer)으로 이루어져 있으며, 무혈관성 조직으로 조직적합성 항원이 표현되지 않아서 이식을 하여도 거부반응이 없다(Akle CA et al. Lancet, 1981;2:1003-5; Dua HS et al. Br . J. Opthalmol., 1999;83:748-52). 양막의 기저막은 4형 콜라겐(type IV collagen), 라미닌(laminin), α6/β4 인테그린으로 이루어져 있고, 간질은 주로 콜라겐Ⅰ, Ⅲ, 히알루론산, 피브로넥틴, α5/β1 인테그린으로 구성되어 있어 세포의 분열 및 이동을 촉진시킬 수 있다.

이러한 양막은 1940년 De Rotth가 결막 결손에 대한 재건술로 융모막과 양막을 같이 사용하면서 최초로 안과에 이용되었고(De Rotth A. Arch . Opthalmol ., 1940;23:525-5), 이후 1990년대에 들어오기까지 양막의 이용에 대한 안과 영역에서의 보고가 없었다가 1993년에 Batle과 Perdomo가 결막 대체조직으로서의 양막의 활용을 보고하였다(Batle JF, Perdomo FJ. Ophthalmol., 1993;100:107). 나아가, 1995년 Kim과 Tseng이 각막상피 제거 및 각막윤부 층판 절제술을 시행한 토끼 모델에서 양막을 사용하여 성공적인 안구 표면의 재형성을 보고한 이래 최근에 여러 안과 질환에서 활발히 적용되고 있다(Kim JC, Tseng SC. Cornea, 1995;14:473-84).

양막은 각막과 결막의 재상피화를 촉진하는 기능 및 염증을 억제하는 기능이 매우 우수한 것으로 알려져 있어서, 지속적인 각막 상피 결손이 있거나 각막궤양 등의 염증을 동반하는 질환에서 양막 이식을 시행하여 훌륭한 임상 결과를 얻고 있다. 양막은 각막 및 결막간 세포의 성장과 그 특성을 유지시킬 수 있는 기저막으로 작용하므로 상피의 이동을 촉진시키고, 상피 기저층의 유착을 강화시키며, 상피의 분화를 촉진시키고, 상피의 세포 자멸사를 억제하여 창상 치유시 상피재생을 촉진시킨다. 또한 염증세포를 흡착하고 염증세포의 침윤을 막는 막의 역할을 하여 항염증작용을 보인다. 이러한 양막의 특성을 이용하여 각막궤양, 군날개와 검구유착, 화학화상 등 여러 안구표면질환의 치료에 응용되고 있다. 더욱이, 양막 내에는 상처치유에 도움을 주는 것으로 알려진 EGF, TGF-α, KGF, HGF, bFGF, TGF-β1, β2 등의 여러 가지 성장인자들이 함유되어 있으며, 이러한 성장인자들은 양막의 상피세포층을 제거한 이후에도 남아있는 것이 보고되고 있다(Noriko Koizumi et al. Current Eye Research, vol.20, No. 3, 173-177, 2000). 이것은 동종 및 이종 세포들을 포함하는 양막을 임상에 적용하는 경우 생길 수 있는 염증 반응이나 면역 반응의 잠재적 위험성을 피하기 위해, 세포들을 제거하는 생체조직이식재의 일반적인 제조 방법을 사용하여 세포가 남아있으므로 해서 우려되는 잠재적 위험성을 제거함과 동시에, 양막 내에 성장인자들이 남아 있으므로, 기존의 임상에 적용하여도 유사한 치유 효과를 얻을 수 있는 더욱 안전한 생체이식재의 유용성을 확보할 수 있음을 시사한다.

각막상피세포의 결손을 보이는 각막의 치료에 있어서 가장 중요한 물리적인 요인들을 크게 세 가지로 요약할 수 있다. 첫째는 상피세포에 지속적인 산소공급, 둘째는 각막상피의 충분한 수화, 셋째는 상피세포에 마찰을 주는 요인의 제거이다. 위 세 가지 요인이 만족되면 기저막에 장애가 없는 한 상피세포의 증식은 이루어진다. 양막을 이용한 방법을 제외한 기존에 알려진 방법들은 세 가지 인자를 동시에 만족시키지 못한다. 그러나 양막 이식은 막 자체가 갖는 함수성 때문에 각막표면에 수분을 유지시키며, 눈꺼풀에 의한 기계적 마찰로부터 눈을 보호해주는 특성을 갖는다. 또한 합성 폴리머 재질의 치료용 렌즈보다도 산소투과도가 높아 각막상피세포의 재건에 훌륭한 효과를 볼 수 있다.

하지만, 기존의 양막을 안구 표면질환의 치료를 목적으로 적용하기 위해서는 10-0 나일론 봉합을 시행해야 하는데, 이는 수술시 고난이도의 외과 수술 기술이 필요하고, 수술 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 또한 봉합에 따르는 여러 가지 부작용, 예를 들어 봉합 농양, 육아종 형성, 조직 괴사 등이 발생하기도 한다. 나아가, 수술 후 봉합사를 제거하는 과정에서 환자가 고통을 느끼고 봉합부위에서 환자가 불편함을 느끼는 등의 단점이 있어 양막 사용이 제한되어 왔다.

이러한 봉합 실시에 따른 문제점 및 불편함을 해소하기 노력으로, 미국 등록특허 제7,494,802호에는 지지체에 양막을 고정한 예가 개시되어 있으며, 이는 Prokera^TM(USA, BioTissue)라는 이름으로 상품화되어 있다. 상기 제품은 안과용 외과 수술 후 사용할 목적으로 폴리카보네이트의 경성 재질이며, 형태는 윗부분에 15~16 mm의 구멍을 가진 몸체에 O-링을 이용하여 양막을 고정시킨 형태이다. 하지만, 상기 제품의 적용시 안구 구조상 돌출되어 있는 각막의 주변부가 양막에 밀착되지 않는 부위가 생기고, 깜박임에 의해 탈락이 되거나, 양막이 기구 몸체와 링에 고정된 부위가 눈꺼풀의 상하 운동에 의해 상피세포가 성장하여 들어오기 전에 찢어짐이 발생한다. 또한 경성 재질에서 오는 눈의 불편함 등의 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 지지체 사용에 대한 문제점을 해결하기 위하여, 양막 외에 다른 어떤 지지장치의 결합 없이 눈에 고정될 수 있는, 콘택트 렌즈 형태로 양막 드레싱을 제조하는 방법을 개발하고 본 발명을 완성하였다.

미국등록특허제7,494,802호. 대한민국특허출원번호10-2008-0013379호.

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따라서, 본 발명의 목적은 양막을 이용하여 콘택트 렌즈 형태의 드레싱을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 원통부 및 상기 원통부의 상부에 형성된 둥근 볼록부를 구비한 주형(mold)의 상기 볼록부 위에 양막을 얹는 단계; 2) 양막이 얹혀진 상기 볼록부에 링을 끼워 상기 링을 원통부의 옆면까지 끼우는 단계; 3) 상기 양막을 가교결합 처리하는 단계: 및 4) 상기 주형의 볼록부와 원통부 간의 라인 경계상에 위치한 양막을 절단하여, 렌즈 형상의 양막을 얻는 단계를 포함하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 안구표면질환 치료용 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱을 제공한다.

본 발명의 양막 드레싱은 종래 양막 봉합시 문제점인 고도의 봉합기술의 필요, 수술시간 지연, 봉합 농양, 육아종 형성 또는 조직 괴사의 발생, 및 환자의 불편함을 해결할 수 있으며, 지지체 사용시 문제점인 눈의 깜박임에 의한 탈락, 지지부위의 찢어짐, 및 눈의 불편함을 원천적으로 제거할 수 있는 장점이 있으므로, 안구표면질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조에 사용된 주형의 단면도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조에 사용된 삽입링의 사시도를 나타낸 것이다.
도 3은 양막 및 주형 복합체의 평면도를 나타낸 것이다.
도 4는 양막 및 주형 복합체를 선반을 이용하여 회전 절삭 가공하는 방식을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 사진이다.
도 6은 양막 가운데에 시야 확보를 위한 구멍을 형성시킨 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 평면도를 나타낸 것이다.
도 7은 양막 가운데에 시야 확보를 위한 구멍을 형성시킨 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 사진이다.
도 8은 양막 가운데에 시야 확보를 위한 다수의 구멍을 형성시킨 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 평면도를 나타낸 것이다.
도 9는 양막 가운데에 시야 확보를 위한 다수의 구멍을 형성시킨 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 사진이다.
도 10은 가교결합 처리를 하지 않은 양막 드레싱 및 가교결합 처리를 한 양막 드레싱의 수화에 따른 형태 유지를 살펴본 결과이다.
도 11은 소 양막으로부터 HMDI를 사용하여 제조된 양막 드레싱의 동물이식 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 각막상피의 화상을 유발한 토끼에 사람 양막, 무세포 소 양막 및 대조군인 치료용 렌즈로 처리한 후의 각막 혼탁도 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 각막상피의 화상을 유발한 토끼에 사람 양막, 무세포 소 양막 및 대조군인 치료용 렌즈로 처리한 후의 각막 실질 내 염증세포를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명에 사용된 용어 "양막 드레싱(dressing)"은 양막을 재질로 하여 제조된 위생재료 중 하나로서, 특히 안구 표면질환의 치료를 목적으로 각막과 접촉되는 재료를 가리킨다. 또한, 본 발명에 사용된 "콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱"은 콘택트 렌즈와 같은 경도를 유지하는 드레싱으로서 봉합이나 접착제 없이 콘택트 렌즈와 같은 방식으로 각막에 접촉하여 사용되는 것을 가리킨다. 상기 용어는 "양막 콘택트 렌즈"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 1) 원통부 및 상기 원통부의 상부에 형성된 둥근 볼록부를 구비한 주형(mold)의 상기 볼록부 위에 양막을 얹는 단계; 2) 양막이 얹혀진 상기 볼록부에 링을 끼워 상기 링을 원통부의 옆면까지 끼우는 단계; 3) 상기 양막을 가교결합 처리하는 단계: 및 4) 상기 주형의 볼록부와 원통부 간의 라인 경계상에 위치한 양막을 절단하여, 렌즈 형상의 양막을 얻는 단계를 포함하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계 1)은 원통부 및 상기 원통부의 상부에 형성된 둥근 볼록부를 구비한 주형(mold)의 상기 볼록부 위에 양막을 얹는 단계이다.

상기 주형은 원통부 및 볼록부를 포함하며, 콘택트 렌즈 형태의 성형을 위하여 적절한 직경 및 곡률반경(base curve)을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로, 주형의 원통부는 8 내지 22 mm의 직경을 갖는 것이 바람직하며, 상기 볼록부는 6.0 내지 10.0 mm의 곡률반경을 갖는 것이 바람직하다. 상기 주형은 양막의 밀착 및 고정을 위한 원통부 하부에 끼워진 링을 받치는 받침부를 추가로 구비할 수 있으며, 또한 받침부 바닥면 중앙에 연결된 손잡이부를 추가로 구비할 수 있다. 본 발명의 실시예에 있어서, 도 1에 개시된 주형을 사용할 수 있다. 상기 주형의 재질은 아크릴, 아세탈, 폴리테트라플루오로에틸렌(Teflon), 스테인레스 스틸 또는 티타늄으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 주형에 얹혀지는 양막은 포유류부터 수득한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간 또는 소로부터 수득한 것일 수 있다. 상기 양막은 세척된 양막 또는 세포를 제거한 양막일 수 있고, 여기서, 양막의 세척은 Kim 및 Tseng의 문헌(Kim JC, Tseng SC. Cornea, 1995;14:473-84)에 개시된 방법 또는 이를 응용하여 수행할 수 있으며, 양막 세포의 제거는 염증 반응이나 면역반응의 잠재적 위험성을 제거하기 위한 것으로서 당해 분야의 숙련자에 의해, 공지된 적절한 용액을 이용하여 세포를 제거할 수 있다. 상기 단계 1)에서 사용한 양막은 사용전까지 냉장 상태에서 보관한다.

사용되는 양막의 개수는 양막의 두께, 양막의 강도 및 양막의 불투명도 등에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 한 겹을 사용하나 원하는 양막 드레싱의 강도를 얻기 위하여 두 겹 이상 주형의 볼록부에 중첩시킬 수 있다. 또한, 양막 자체의 불투명성으로 인한 시야확보의 어려움을 개선하기 위하여, 상기 단계 1) 이후 양막 중앙에 직경 1 내지 7 mm 크기의 원형의 구멍을 성형하거나, 양막 중앙에 레이저를 이용하여 약 100 내지 1000 ㎛의 구멍을 둘 이상, 바람직하게는 수십 개 성형할 수 있다. 추가로, 상기 구멍(hole)에 의한 굴곡에 의해 야기될 수 있는 통증 또는 이물감을 개선하기 위해 한 겹 이상의 양막을 덧씌울 수도 있다.

본 발명의 단계 2)는 양막이 얹혀진 상기 볼록부에 링을 끼워 상기 링을 원통부의 옆면까지 끼우는 단계이다.

상기 링(또는 삽입링)은 주형에 양막을 밀착 및 고정시키기 위한 용도를 갖는 것으로서, 주형의 원통부의 직경에 맞도록 제작하는 것이 바람직하며, 재질은 아크릴, 아세탈, 폴리테트라플루오로에틸렌(Teflon), 폴리우레탄, 고무, 실리콘 또는 퍼플러로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같이 주형에 고정된 양막은 당해 기술분야에서 널리 알려진 다양한 건조 방법, 예를 들어 자연건조, 동결건조 또는 진공건조의 방법을 이용하여 건조될 수 있다.

본 방법의 단계 3)은 상기 양막을 가교결합(cross-linking) 처리하는 단계이다.

단계 2)의 건조과정만 거친 양막은 수화되는 경우 콘택트 렌즈 형태가 무너져 원래의 상태로 되돌아가게 되므로, 이를 방지하기 위하여 가교를 수행한다. 가교는 물리적 또는 화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 물리적 가교는 자외선 조사 또는 탈수 열처리(dehydrothermal treatment)에 의해서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 자외선 조사는 254 내지 305 nm의 파장의 자외선을 10 내지 240분 동안 양막에 조사함으로써 수행할 수 있고, 탈수 열처리는 90 내지 105℃, 100 mTorr 이하의 진공상태에서 60분 내지 72시간 동안 방치함으로써 수행할 수 있다. 한편, 화학적 가교는 카르보디이미드(carbodiimide), EDC(또는 EDAC; 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 포름알데하이드(formaldehyde), 헥사메틸렌 디이소시아네이트(hexamethylene diisocyanate, HMDI), 덱스트란(dextran) 또는 글루코스 용액에 침지하여 수행할 수 있다.

본 발명의 단계 4)은 상기 주형의 볼록부와 원통부 간의 라인 경계상에 위치한 양막을 절단하여, 렌즈 형상의 양막을 얻는 단계이다.

콘택트 렌즈 형태를 얻기 위하여, 볼록부와 원통부 간의 라인 경계상에 위치한 양막을 회전커팅방식에 의해 절단하게 되며, 이때 상기 절단은 선반(lathe) 및 레이저를 이용하여 수행된다(도 4 참조).

추가적으로, 상기 단계를 통해 얻어진 양막 드레싱은 사용시 안전성을 확보하기 위하여, 상기 단계 4) 이후 감마선 조사 또는 전자빔조사에 의해 멸균하는 단계를 거칠 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 안구표면질환 치료용 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 등을 들어 상세히 설명하지만, 이들 실시예 등은 본 발명의 이해를 보다 용이하게 하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 등으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 양막 조직의 처리

<1-1> 사람 양막의 처리

사람의 양막은 Kim 및 Tseng의 방법(Kim JC, Tseng SC. Cornea, 1995;14:473-84)을 응용하여 처리하였다. 구체적으로 B, C형 간염, HIV, 매독 등의 혈청검사결과 음성인 산모의 정규 제왕절개술 후 얻어진 태반에서 양막을 분리하였다. 분리된 양막 조직의 일부를 샘플링하여 미생물 검사를 시행하고, 이후 멸균 생리식염수 및 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 수회 반복 세척하고, 최종적으로 정제수에 반복 세척한 후, 사용 전까지 냉장(2~8℃) 상태로 보관하였다.

<1-2> 소 양막의 처리

소의 양막은 하기와 같이 처리하였다. 구체적으로, 갓 출산한 소의 태반을 회수하여 양막을 분리한 후, 식염수로 수차례 반복 세척하여, 이물이나 혈흔을 깨끗이 제거하였다. 그리고 나서, 멸균 생리식염수 및 차아염소산나트륨 용액에서 수회 반복 세척한 후 양막의 기질층을 스크래퍼(scraper)를 이용하여 제거하고 다시 멸균 생리식염수와 정제수로 반복 세척하여 사용 전까지 냉장(2~8℃) 상태로 보관하였다.

<1-3> 염증 및 면역원성 물질의 제거를 위한 양막의 처리

염증 반응이나 면역반응의 잠재적 위험성을 제거하기 위하여 양막을 하기와 같이 처리하여 염증 및 면역원성 물질이 제거된 양막을 제조하였다. 구체적으로, 사람이나 소의 태반으로부터 분리한 양막을 멸균 식염수에 넣어 냉장 보관하여 사용하였다. 분리된 500 cm² 면적의 양막을 1L의 95% 에탄올에 넣어 냉장상태로 하룻밤 동안 보관하여 양막의 지질 성분을 제거하였다. 상기 양막을 정제수 1L에 넣고 10분 동안 3회 반복 세척한 후, 스크래퍼를 이용하여 양막의 기질층을 제거하였다. 기질이 제거된 양막을 1L의 70% 에탄올에 넣어 1일 이상 냉장 상태로 보관하여 바이러스를 불활화한 후, 0.2% EDTA 및 0.9% 염화나트륨을 함유하는 pH 11.0의 EDTA/염화나트륨 용액 1L에 넣고 150 rpm에서 1시간 동안 처리하여 알칼리 가용성 불순물을 제거하였다. 이어, 0.05% 트립신, 0.02% EDTA 및 0.9% 염화나트륨을 함유하는 pH 7.4의 트립신/EDTA/염화나트륨 용액에 넣어 37℃에서 1시간 동안 효소반응시켰다. 효소반응이 완료된 양막을 70% 에탄올 1L에 넣고 1시간 동안 150 rpm에서 교반하여 남아 있는 지질을 제거하였다. 이를 다시 상기의 pH 11.0의 알칼리 용액에서 150 rpm에서 1시간 동안 반응시킨 후, 0.2% EDTA가 첨가된 pH 2.0의 산 용액에서 150 rpm에서 1시간 동안 반응시켜 조직을 충분히 팽윤시킨 후, 정제수 1L로 150 rpm에서 30분씩 3회 세척하여, 사용 전까지 냉장(2~8℃) 상태로 보관하였다.

실시예 2: 주형( mold ) 및 링의 제작

콘택트 렌즈 형태로 성형하기 위한 주형과 양막을 주형에 밀착시키기 위한 링(또는 삽입링)을 각각 도 1 및 도 2에 나타낸 형태로 제작하였다. 주형의 경우, 원통부, 볼록부, 받침부 및 손잡이부로 구성하였고, 주형의 볼록부는 8.4 내지 8.8 mm의 곡률반경(base curve)을 갖도록 하였고, 원통부는 14 mm의 직경을 갖도록 하였다. 받침부는 양막의 밀착 및 고정을 위한 링을 받치는 받침부를 구비하고, 손잡이부는 상기 받침부 바닥면 중앙에 연결된 원기둥 모양을 갖도록 하였다. 상기 주형의 재질은 아세탈을 사용하였다. 한편, 도 2에 나타낸 삽입링은 렌즈 주형 각각의 곡률반경을 갖는 직경에 맞도록 제조하였다. 삽입링은 테프론(내경 14.1 mm) 또는 신축성 재질인 퍼플러(내경 12 mm)로 제조하였다.

실시예 3: 양막의 배치

상기 실시예 <1-1> 내지 <1-3>에서 얻은 양막조직을 콘택트 렌즈 형태로 만들기 위하여, 상기 양막조직을 실시예 2에서 제작한 콘택트 렌즈 형태의 주형에 얹은 후, 삽입링(O-ring)을 끼워 고정시켰다.

구체적으로, 양막조직을 적절한 렌즈 주형의 크기로 절단한 후, 양막의 표피층이 아래로 향하게 하여 양막을 주형(도 1)의 둥근 볼록부 위에 얹었다. 여러 겹으로 중첩할 경우 최종적으로 마지막 양막은 표피층이 바깥쪽으로 오도록 하였다. 이어 중첩된 양막에 최종적으로 삽입링(도 2)을 끼워 렌즈 주형에 양막이 완전히 밀착되도록 한 후, 클린 벤치 내에서 자연건조, 동결건조 또는 진공건조하였다. 상기 건조된 양막(주형 포함)의 평면도를 도 3에 나타내었다.

실시예 4: 양막 드레싱의 콘택트 렌즈 형태의 고정

<4-1> 물리적 가교를 이용한 형태 고정

상기 실시예 3의 과정을 통해 건조된 양막은 수화(hydration)되면 렌즈 형태를 유지하지 못하고 원래의 편평하면서 흐물흐물한 막 형태로 돌아간다. 이를 방지하기 위하여, 본 실시예에서는 렌즈 주형, 삽입링 및 양막의 복합체에 물리적 가교(cross-linking)를 수행하였다. 구체적으로, 95℃, 100℃ 또는 105℃, 및 100 mTorr 이하의 진공상태에서 48 내지 72시간동안 방치하였다.

<4-2> 화학적 가교를 이용한 형태 고정

실시예 <4-1>의 방법보다 높은 가교 효과를 얻기 위하여, 하기와 같이 HMDI를 가교제로 사용하여 화학적 가교를 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3에서 건조시킨 렌즈 주형, 삽입링 및 양막의 복합체를 0.2% HMDI가 녹아있는 메탄올(99.5%) 용액에 30분에서 12시간 동안 침지시킨 후, 메탄올로 잔류 HMDI를 세척하고, 클린 벤치 내에서 자연건조하였다. 상기 가교 용액 대신에 HMDI가 0.1~3% 녹아 있는 0.9% 생리식염수 완충용액, 에탄올(10~100%) 또는 메탄올(10%~100%), 혹은 0.9% 생리식염수에 트윈 80 또는 트리톤 x-100이 0.1%~5% 함유된 용액을 사용할 수 있다.

실시예 5: 양막의 절단, 세척 및 멸균

실시예 4에서 가교시킨 렌즈 주형, 삽입링 및 양막의 복합체에서 콘택트 렌즈 형태만을 분리하기 위하여, 도 4와 같이 렌즈 주형과 양막의 복합체를 선반의 회전체에 결합하여 고속회전을 실시하고, 1/100 ~ 1/1000 mm 의 정밀도를 가진 다이아몬드 커팅 날을 이용하여 절단하였다(도 4). 절단된 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱에서 화학 가교제의 잔류물을 완전하게 제거하기 위하여 트윈 80 용액 또는 트리톤 x-100 용액(0.1~5%)에 세척하고, 식염수로 반복 세척한 후 최종적으로 3차 정제수로 세척하였다. 이후, 건조하여 밀봉 포장한 후, 10~25 kGy 선량의 감마선 또는 동일선량의 전자빔을 조사하여 멸균하였다. 한편, 상기 제조된 양막 콘택트 렌즈를 도 5에 나타내었다.

실시예 6: 시야 확보를 위한 구멍(hole) 형성

양막 자체는 어느 정도의 투명성이 보장되지만, 두 겹 이상 중첩되었을 경우 불투명도가 증가하여 또렷한 시야확보가 어려워지게 된다. 이러한 중첩된 렌즈 형태의 양막 드레싱의 시야확보의 어려움을 개선하기 위하여, 상기 실시예 3에서 건조된 양막의 중앙 부위에 직경 1~7 mm 범위의 구멍을 선반 또는 CO₂ 레이저(GC111; 이오테크닉스, 한국)을 이용하여 천공시켰다(도 6 및 7). 또한, 상기와 같이 중앙에 하나의 구멍을 뚫는 대신에, 렌즈 중앙부위에 약 100 내지 1000 ㎛의 다수의 구멍을 뚫어서 시야를 확보한 렌즈를 제조하였다(도 8 및 도 9).

상기 CO₂ 레이저 이외에 그린레이저, UV 레이저 등이 사용될 수 있다.

한편, 상기와 같이 천공된 양막 드레싱은 천공된 부위에 굴곡이 생기게 되어서 실제로 안구에 착용하는 경우 눈의 깜박거림으로 인하여 눈꺼풀의 안쪽면이 자극되어 통증 및 이물감이 생길 수 있다. 따라서, 천공 후 그 위에 한 겹의 양막을 덧씌울 수 있다.

실험예 1: 양막 드레싱의 가교에 따른 효과 검증

본 발명의 실시예 4의 가교결합 처리에 따른 형태 고정효과를 검증하기 위하여, 실시예 3에서 건조된 양막을 가교결합 처리하지 않고 절단한 것(대조군)과 실시예 3에서 건조된 양막을 가교결합 처리(화학적 가교 처리) 후 절단한 것(실험군)을 대상으로 하기와 같이 실험하였다. 상기 대조군 및 실험군 양막을 각각 실온에서 생리식염수에 30분 동안 침지시킨 후 형태를 관찰한 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 가교결합 처리를 하지 않은 대조군은 수화에 의해 콘택트 렌즈 형태가 무너졌지만, 이에 반해 가교결합 처리를 한 실험군은 수화에도 불구하고 그 형태를 유지하고 있음을 알 수 있었다. 따라서, 가교 결합에 의하여 양막 드레싱의 형태를 효과적으로 유지시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

실험예 2: 양막 내 성장인자의 정량

양막 내 성장인자(growth factor)의 존재 및 그 양을 확인하기 위하여, 여러 가지 성장인자 중 소와 사람 간에 교차반응(cross reactivity)이 가능한 bFGF와 KGF를 ELISA 정량키트(R & D system사, USA)로 측정하였다. 실험용 시료는 실시예 <1-1> 내지 <1-3>에서 제조한 사람 양막, 소 양막 및 무세포 소 양막을 사용하였다. 상기 시료를 모두 동결건조하고, 동결분쇄기(freezer mill, Spex사, USA)를 이용하여 분말화하였다. 분말화된 시료 60 mg을 각각 인산완충용액(pH 7.4) 2 mL가 들어있는 튜브 속에 넣어서 균질기를 이용하여 10,000 rpm 하에서 냉장상태로 1분씩 간헐적으로 5회 반복 추출하고, 13,000rpm, 4℃ 및 20분 동안 원심분리를 실시한 후 상등액을 취하여 ELISA 정량 키트로 성장인자를 정량하였다. 또한 브래드포드 분석법(Bradford assay)을 이용하여 총단백질의 양을 측정하였고, 총단백질양을 기준으로 추출된 각각의 성장인자의 양을 환산하였다. 측정결과를 하기 표 1에 나타내었다.

양막 내 성장인자의 함량
실험대상	bFGF (pg/㎍)	KGF (pg/㎍)
사람 양막 (실시예 <1-1>)	420.71 ±23.23	70.13 ±11.48
소 양막 (실시예 <1-2>)	606.82 ±28.93	29.13 ±2.92
무세포 소 양막 (실시예 <1-3>)	41.67 ±23.57	238.64 ±40.18

상기 표 1에서 보는 바와 같이, bFGF의 경우 사람 양막과 소 양막에서 420.71±23.23 pg/㎍, 606.82±28.93 pg/㎍이 함유되어 있었고, 무세포 소 양막의 경우 41.67±23.57 pg/㎍이 함유되어 있었다. KGF의 경우 사람 양막, 소 양막 및 무세포 소 양막에서 70.13±11.48pg/㎍, 29.13±2.92pg/㎍, 238.64±40.18 pg/㎍이 각각 함유된 것으로 나타났다. 결론적으로, 상대적인 양의 차이는 있지만, 세포의 유무에 상관없이 성장인자인 bFGF와 KGF가 존재함을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 양막 드레싱의 생체적합성 실험-기니피그 피하 이식실험

본 발명의 양막 드레싱의 생체 적합성을 확인하기 위하여, 소 양막으로 HMDI(hexamethylene diisocyanate)을 화학적 가교제로 사용하여 실시예 3 및 4의 방법에 의해 제조된 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱을 대상으로 실험하였다. 대조군으로 실시예 <1-3>의 방법에 의해 제조된 무세포 소 양막을 감마조사 방법으로 멸균한 시료를 실험에 사용하였다. 각각의 시료를 기니피그의 등에 피하 이식함으로써 염증정도 및 이물반응 등을 비교하였다. 이식 후 3일 및 7일 후에 조직을 채취하여 포르말린으로 고정, 수세 및 파라핀 포매 과정을 거친 후 5 ㎛ 두께로 박절하여 H&E(Hematoxyline & eosin) 염색하고, 광학 현미경으로 관찰하였다. 조직검사 결과, 이식 3일째와 이식 7일째에서 대조군과 시험군 모두 어떠한 염증반응이나 이물반응을 보이지 않았으며, 이것은 HMDI를 화학적 가교제로 이용한 렌즈 형태의 양막 드레싱이, 소 양막 자체(대조군)와 마찬가지로 생체에 적합함을 확인할 수 있었다(도 11).

실험예 4: 사람 양막과 무세포 소 양막의 토끼 각막화학화상에서의 유효성 실험

실시예 <1-1> 및 <1-3>에서 수득한 사람 양막과 무세포 소 양막의 각막 상피 치유효과를 살펴보기 위하여, 양성 대조군으로 치료용 렌즈(Focus, CIBA Vision Corporation)와 함께 다음과 같이 토끼 각막에 적용하였다.

구체적으로, 뉴질랜드 흰토끼 16마리(32안)를 실험동물로 사용하였다. 각막상피의 화상을 유발하기 위하여 0.1N NaOH 를 침적시킨 직경 6.5mm 원형여과지를 토끼의 각막 위에 25초 동안 접촉시켰다가 제거한 후, 식염수로 충분히 세척하였다. 토끼 1마리(2안)는 자연경과를 보기 위해 별다른 치료 없이 그대로 방치하면서 관찰하였고, 나머지 15마리(30안)는 각 군별로 10안씩 적용한 후 모두 6-0 블랙 실크(black silk)를 이용하여 눈꺼풀 봉합술을 시행하였다. 수술 후 cravit(levofloxaxacin) 안약을 하루 4번, maxitrol 물약을 4번 점안했다. 수술 후 매일 각막상피 치유 정도를 세극등(Slit lamp)으로 확인하면서 각막 상피가 치유될 때까지 각 실험군에 시료들을 착용시켰다. 임상 양상의 평가는 수술 후 1주, 4주 및 8주에 1) 각막 상피 치유 시간, 2) 각막 부종 정도, 및 3) 각막 혼탁도를 평가하였다. 각막 부종의 평가는 각막두께측정기(Pachymeter)를 이용하여 중심각막 두께를 측정하였고, 각막 혼탁도는 Fantes 등급을 이용하여 0점(투명)에서 4점(완전불투명 혼탁)으로 점수화하였다. 또한, 수술 후 1주에 각막 조직을 채취하여 H&E 염색을 한 후 연속된 5개의 현미경 시야(배율 200배)에서 4) 각막 내 염증 세포수를 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 2 내지 5에 나타내었다.

각막 상피 치유시간 결과
	사람 양막군	무세포 소 양막군	치료용 렌즈군
각막 상피 치유시간 (일)	3.2±0.42일	3.3±0.48일	3.3±0.48일

각막 상피 치유시간에서는 실험군 간의 유의한 차이는 없었다.

각막 두께 결과
	1주	4주	8주
사람 양막군	754.4±47.6 ㎛	691±57.3 ㎛	636.9±45.2 ㎛
무세포 소 양막군	775±44.4 ㎛	724.6±45.4 ㎛	659.6±46.3 ㎛
치료용 렌즈군	814.2±56.9 ㎛	773.1±55.0 ㎛	716.1±52.5 ㎛

각막 두께의 측정은 각막부종을 관찰하고자 측정하는 것인데, 사람 양막군과 무세포 소 양막군의 경우에서는 4주 이후에 각막부종이 유의하게 호전되는 양상을 보였다.

각막 혼탁도 결과
	1주	4주	8주
사람 양막군	3.7±0.48	3.0±0.47	2.5±0.53
무세포 소 양막군	3.8±0.42	3.2±0.32	2.8±0.52
치료용 렌즈군	3.9±0.32	3.6±0.52	3.1±0.32

각막 혼탁도 측정 결과, 표 4 및 도 10에서와 같이 4주 이후에 사람 양막군과 무세포 소 양막군에서 유의하게 호전되었다.

각막 실질 내 염증세포 수
	사람 양막군	무세포 소 양막군	치료용 렌즈군
염증세포수	9.2±2.7	9.4±3.1	15.3±5.3

각막 실질 내 염증세포의 수는 표 5 및 도 11에서와 같이 각막 실질 내 염증세포 수 역시 치료용렌즈군에 비하여 사람 양막군과 무세포 소 양막군에서 유의하게 감소하였다.

상기 결과를 종합하여 볼 때, 토끼의 각막상피에 화학화상을 유발시킨 후, 세포가 보존되어 있는 사람 양막군과 세포를 모두 제거한 무세포 소 양막군의 각막상피의 치유시간 및 치유품질을 치료용 렌즈군과 함께 비교 평가해본 결과, 각막상피의 치유시간은 유의한 차이 없이 비슷했으나, 사람 양막군과 무세포 소 양막군 모두 항염증 작용을 나타내어 각막 부종과 각막 혼탁을 억제하는 것으로 나타났다.

Claims

1) 원통부 및 상기 원통부의 상부에 형성된 둥근 볼록부를 구비한 주형(mold)의 상기 볼록부 위에 양막을 얹는 단계;
2) 양막이 얹혀진 상기 볼록부에 링을 끼워 상기 링을 원통부의 옆면까지 끼우는 단계;
3) 상기 양막을 가교결합 처리하는 단계: 및
4) 상기 주형의 볼록부와 원통부 간의 라인 경계상에 위치한 양막을 절단하여, 렌즈 형상의 양막을 얻는 단계
를 포함하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 주형의 원통부는 8 내지 22 mm의 직경을 가지며, 상기 볼록부는 6.0 내지 10.0 mm의 곡률반경을 갖는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 주형은 아크릴, 아세탈, 폴리테트라플루오로에틸렌(Teflon), 스테인레스 스틸 또는 티타늄으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 주형은 원통부 옆면까지 끼워진 상기 링을 받치는 받침부를 추가로 구비하는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 양막은 인간 또는 소로부터 수득한 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 양막은 세척된 양막 또는 세포를 제거한 양막인 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 양막이 두 겹 이상 주형의 볼록부에 중첩되는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 링이 아크릴, 아세탈, 폴리테트라플루오로에틸렌(Teflon), 폴리우레탄, 고무, 실리콘 또는 퍼플러로 제조되는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 가교결합 처리가 자외선 조사 또는 탈수 열처리(dehydrothermal treatment)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 가교결합 처리가 카르보디이미드(carbodiimide), EDC(또는 EDAC; 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 포름알데하이드(formaldehyde), 헥사메틸렌 디이소시아네이트(hexamethylene diisocyanate, HMDI), 덱스트란(dextran) 또는 글루코스 용액에 침지시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 절단이 선반(lathe) 및 레이저를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 단계 4) 이후에 양막 드레싱을 감마선 조사에 의해 멸균하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제1항에 있어서,
상기 단계 1) 이후 양막의 중앙에 직경 1 내지 7 mm 크기의 원형의 구멍을 형성시키거나, 직경 100 내지 1,000 μm의 둘 이상의 구멍을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

제13항에 있어서,
상기 단계 이후에, 하나 이상의 양막을 덧씌우는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 콘택트 렌즈 형태의 양막 드레싱의 제조 방법.

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