ES2842505T3 - Corneas acelulares, métodos de producción de las mismas y usos de las mismas - Google Patents
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Abstract
Un método ex vivo para producir una córnea acelular que comprende someter una córnea obtenida de un animal al tratamiento de un fluido supercrítico (SCF) en presencia de un cosolvente, en donde el cosolvente es etanol, que se realiza en presencia de 60% de etanol en volumen a una presión de 35 MPa (350 bar) a una temperatura de 45º C durante 80 min, en donde el método se caracteriza por no tener el paso de tratar la córnea con ninguna de una proteasa, una agente quelante, un detergente, un glicerol o una combinación de los mismos, en donde antes del tratamiento con SCF, la córnea se somete al tratamiento de una solución salina que contiene NaCl 0,5-4,0 M durante por lo menos 24 horas.
Description
DESCRIPCIÓN
Corneas acelulares, métodos de producción de las mismas y usos de las mismas
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere de manera general al campo de los métodos para producir córneas acelulares adecuadas como injertos para trasplantes, y usos de las mismas para tratar a sujetos que padecen afecciones oculares asociadas con daños en la córnea.
2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA
Se conocen una gran cantidad de enfermedades y afecciones que afectan a la función de la córnea, muchas de las cuales son afecciones graves que requieren una acción correctora que incluye la cirugía y el trasplante de tejido de la córnea. Las córneas porcinas se han considerado como el reemplazo más prometedor de la córnea humana, ya que tienen un índice de refracción y un tamaño comparable a las córneas humanas. Sin embargo, se ha informado que el xenoinjerto de córnea porcina induce una respuesta inmune grave (o rechazo del trasplante) en el huésped receptor debido a su estructura y/o conformación inadecuada en comparación con la de una córnea nativa, así como a agentes residuales como agentes químicos y enzimas usados con propósitos de descelularización.
Por consiguiente, en la técnica relacionada hay una necesidad de un proceso mejorado para preparar una córnea, en el que la estructura nativa y la conformación de una córnea nativa se conserven a la vez que se conservan las materias inmunogénicas (por ejemplo, cualquier material celular residual, productos químicos y/o enzimas). reducido a un nivel en el que la córnea así producida puede servir como un andamio tridimensional para que las células huésped crezcan sobre ella después del trasplante sin provocar una respuesta inmune significativa y una neovascularización.
En el documento japonés JP 2007 105081 A se divulga un método de descelularización convencional para extraer células de tejido viable para trasplante sometiendo el tejido a un tratamiento con fluido supercrítico. Dicho documento enseña en los ejemplos del mismo que el tejido (como una aorta de cerdo) se somete a una mezcla de dióxido de carbono supercrítico y etanol a una presión de 15 o 30 MPa, a una temperatura de 37° C durante 30 o 60 minutos para eliminar significativamente las cantidades de fosfolípidos residuales.
RESUMEN
La presente divulgación fue creada por los presentes inventores para superar los problemas indicados anteriormente en la producción de una córnea acelular, y usos de la misma.
El alcance de esta invención está definido por las reivindicaciones. Las realizaciones en la descripción relativas a métodos de tratamiento no están cubiertas por las reivindicaciones. Cualquier "realización" o "ejemplo" que se divulga en la descripción pero que no está cubierto por las reivindicaciones debe considerarse como presentado sólo con propósitos ilustrativos.
Por consiguiente, el primer aspecto de esta divulgación es proporcionar un método ex vivo para producir una córnea acelular. El método comprende someter una córnea de un animal al tratamiento de un fluido supercrítico (SCF); en donde, el método se caracteriza por no tener el paso de tratar la córnea con ninguna proteasa, un agente quelante, un detergente, un glicerol o una combinación de los mismos.
El método incluye además el paso de, antes del tratamiento de SCF, sumergir la córnea en una solución salina que contiene NaCl 0,5-4,0 M durante por lo menos 24 horas.
De acuerdo con la presente divulgación, la córnea se trata con un fluido supercrítico (SCF) en presencia de 60% de etanol en volumen como cosolvente a una presión de 35 MPa (Megapascal), que es 350 bar, a una temperatura de 45° C durante 80 min.
El SCF puede ser cualquiera de un dióxido de carbono supercrítico (ScCO2), un óxido nitroso supercrítico (ScN2O), un alcano supercrítico, un alqueno supercrítico, un alcohol supercrítico, una acetona supercrítica o una combinación de los mismos. En un ejemplo, el SCF es ScCO2. En otro ejemplo, el SCF es ScN2O. El cosolvente es 60% en volumen de etanol.
De acuerdo con la presente invención, el tratamiento con SCF se lleva a cabo en una condición en la que el cosolvente es el 60% en volumen de etanol, la temperatura es de 45° C y la presión es de 35 MPa (350 bar), y el
paso se realiza durante 80 min.
El presente método no incluye el paso de tratar la córnea con una proteasa, un agente quelante, un detergente, una solución de glicerol, o una combinación de los mismos.
De acuerdo con algunas realizaciones, la córnea puede obtenerse de un animal que se selecciona del grupo que consiste de cerdo, vaca, oveja, cabra, conejo, mono o ser humano. Preferiblemente, la córnea se obtiene de cerdo.
Por tanto, el segundo aspecto de la presente divulgación es proporcionar una córnea acelular producida por el método descrito anteriormente.
De acuerdo con realizaciones preferidas, la córnea acelular se deriva de la córnea de cerdo.
Por consiguiente, el tercer aspecto de la presente divulgación se dirige a la córnea acelular producida por el método de la presente divulgación para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece de una afección ocular. Para su uso en el tratamiento de un sujeto con necesidad de ello, la córnea acelular de la presente invención puede implantarse en el ojo del sujeto para reparar el daño de la córnea asociado con la afección ocular.
En realizaciones opcionales, la córnea acelular de la presente invención comprende además células cultivadas en ella antes de que tenga lugar el trasplante. Las células adecuadas para cultivar en la córnea acelular de la presente invención pueden seleccionarse del grupo que consiste de células endoteliales de la córnea, células estromales de la córnea, células epiteliales de la córnea, células madre embrionarias y células madre adultas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente divulgación, las células son autólogas.
De acuerdo con otras realizaciones de la presente divulgación, las células son alogénicas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente divulgación, la afección ocular tratable por la córnea acelular de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste de distrofia de Fuchs, queratocono, distrofia de la córnea en celosía, distrofia mapa-punto-huella, síndrome endotelial iridocorneal, síndrome del nevo del iris (Cogan-Reese), síndrome de Chandler y atrofia esencial del iris.
De acuerdo con otras realizaciones de la presente divulgación, la afección ocular es el resultado de una infección provocada por el virus del herpes simple.
De acuerdo con realizaciones adicionales de la presente divulgación, la afección ocular es el resultado de una infección provocada por Chlamydia trachomatis.
De acuerdo con otras realizaciones más de la presente divulgación, la afección ocular es el resultado de quemaduras químicas.
Los detalles de una o más realizaciones de esta divulgación se establecen en la descripción acompañante a continuación. Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de las descripciones detalladas y de las reivindicaciones.
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada se realizan mediante ejemplos, y se pretende que proporcionen una explicación adicional de la invención de acuerdo con se reivindica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos acompañantes, que se incorporan y constituyen una parte de la memoria descriptiva, ilustran varios sistemas de ejemplo, métodos y otras realizaciones ejemplificadas de varios aspectos de la invención. La presente descripción se comprenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada leída a la luz de los dibujos acompañantes, donde,
La FIG 1 ilustra el análisis SDS PAGE en proteínas totales de córnea solubles extraídas de (A) tejido de córnea normal, y (B) tejido de córnea tratado con scCO2 de acuerdo con una realización de la presente divulgación; La FIG 2A es el análisis de transferencia Western en colágeno de tipo I del tejido de córnea normal y tejido de córnea tratado con scCO2 de acuerdo con una realización de la presente divulgación;
La FIG 2B es el análisis de transferencia Western en colágeno de tipo II del tejido de córnea normal y tejido de córnea tratado con scCO2 de acuerdo con una realización de la presente divulgación;
La FIG. 3 son fotografías de tinción histológica de la córnea acelular de los ejemplos 1.2, respectivamente, con una magnitud de 40 X (A) y 100 X (B); y
La FIG 4 son fotografías SEM de la córnea acelular de los ejemplos 1.2, respectivamente, a una magnitud de 2.000 X (A) antes y (B) después de sembrar hADC de acuerdo con una realización de la presente divulgación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
Se pretende que la descripción detallada proporcionada a continuación en conexión con los dibujos acompañantes sea una descripción de la presente divulgación y no se pretende que represente las únicas formas en las que la presente divulgación puede construirse o utilizarse.
Las formas singulares "un", "uno" y "el" se utilizan en la presente para incluir referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se indican con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en las respectivas mediciones de prueba. Además, como se usa en la presente, el término "aproximadamente" generalmente significa dentro del 10%, 5%, 1% o 0,5% de un valor o intervalo dado. Alternativamente, el término "aproximadamente" significa dentro de un error estándar aceptable de la media cuando lo considera un experto en la técnica. Aparte de los ejemplos de funcionamiento/trabajo, o a menos que se especifique expresamente lo contrario, todos los intervalos numéricos, cantidades, valores y porcentajes, como los de cantidades de materiales, duraciones de tiempo, temperaturas, condiciones operativas, proporciones de cantidades y similares de los mismos divulgados en la presente deben entenderse como modificadas en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la presente divulgación y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar según se desee. Como mínimo, cada parámetro numérico debe interpretarse por lo menos a la luz del número de dígitos significativos notificados y aplicando técnicas de redondeo ordinarias.
La presente divulgación se refiere, entre otros, a un método novedoso para producir una córnea acelular, la córnea acelular producida a partir del mismo, y los usos de la córnea acelular producida de este modo para tratar trastornos oculares y/o afecciones que se benefician de la misma.
El primer aspecto de la presente divulgación implica un método para producir una córnea acelular, en el que se conserva la estructura y la conformación nativas de la córnea, por lo que puede proporcionar un microambiente óptimo para que las células de tejido huésped crezcan en la misma después del trasplante.
Por consiguiente, el presente método ex vivo incluye el paso de, someter una córnea de un animal al tratamiento de un fluido supercrítico (SCF), en donde, el método se caracteriza por no tener el paso de tratar la córnea con una proteasa, una agente quelante, un detergente, una solución de glicerol o una combinación de los mismos.
Antes de comenzar con el presente método, la córnea junto con algo de tejido de la esclerótica se extraen del globo ocular de un animal. Los animales adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, cerdos, ganado, vacas, ovejas, cabras, conejos, monos y humanos. En un ejemplo preferido de la presente divulgación, el globo ocular de un cerdo se mantiene en un anillo de soporte de tejido, luego la córnea junto con algo de tejido de la esclerótica se cortan del globo ocular con la ayuda de un trépano y se usan inmediatamente en el presente método..
La córnea obtenida anteriormente se somete luego a un proceso de descelularización. El proceso de descelularización se realiza con el propósito de eliminar los materiales celulares de la córnea, a la vez que se conservan las propiedades físicas y bioquímicas del tejido de la córnea, para que pueda servir mejor como andamiaje de tejido. Por consiguiente, la córnea se somete al tratamiento de un fluido supercrítico (SCF) en presencia de un 60% de etanol en volumen como cosolvente a una presión de 35 MPa (350 bar) a una temperatura de 45° C durante 80 min.
El SCF puede ser cualquiera de un dióxido de carbono supercrítico (ScCO2), un óxido nitroso supercrítico (ScN2O), un alcano supercrítico, un alqueno supercrítico, un alcohol supercrítico o una acetona supercrítica. En un ejemplo, el SCF es ScCO2. En otro ejemplo preferido, el SCF es ScN2O. De acuerdo con la presente invención, el cosolvente es 60% en volumen de etanol.
El proceso de descelularización se realiza en una condición en la que la presión es de 35 MPa (350 bar); la temperatura es de 45° C; y durante 80 min. En realizaciones preferidas, la córnea tratada con solución del paso (1)
se trata con ScCO2 en presencia de 60% en volumen de etanol a 35 MPa (350 bar), 45° C, durante 80 min. La córnea perdería su transparencia o se volvería opaca después del proceso de descelularización.
El presente método se caracteriza por no tener los pasos de someter la córnea a una digestión enzimática (por ejemplo, tratamiento con proteasa o nucleasa) y/o un tratamiento de quelación de iones (por ejemplo, mediante el uso de un agente quelante de iones), como se describe en el métodos anteriores, ver por ejemplo, Patente CN N° 104001215B y Patente de Estados Unidos N° 8.313.893B2. La córnea de la presente invención tampoco está sujeta al tratamiento de un detergente. La digestión enzimática en la presente se refiere al tratamiento de la córnea con una proteasa que incluye, pero no se limita a, pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína, quimopapaína, bromelina, actinidaína, proteinasa A, proteinasa K, peptidasa, ficina, calpaína, caspasa, y una combinación de las mismas; o una nucleasa, que puede ser una ADN nucleasa o una ARN nucleasa. El tratamiento de quelación de iones en la presente se refiere al tratamiento de la córnea con un agente quelante de iones metálicos que incluye, pero no se limita a, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,1-0-tetrakis(ácido metilenfosfónico) (DOTP), ácido trans-1,2-diaminociclohexanto-etra acético (CDTA), ácido 4,5-dihidroxibenceno-1,3-disulfónico (Tiron), tiourea, ácido 8-hidroxiquinolina-5-sulfónico, 3,6-disulfo-1,8-dihidroxi-naftaleno, Eriochromeschwarz T (ácido 1-(1-hidroxi-2-naftilazo)-2-hidroxi-5-nitro-4-naftalensulfónico) y púrpura de amonio. El tratamiento con detergente en la presente se refiere al tratamiento de la córnea con un detergente, particularmente un detergente líquido que consiste de moléculas anfifílicas, como surfactantes que son catiónicos (por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario), aniónicos (por ejemplo, alquilbencenosulfonatos, ácidos biliares y similares) o no iónicos (por ejemplo, series Tween, Triton y/o Brij). Además, la córnea de la presente invención tampoco necesita sumergirse en una solución de glicerol, como requieren algunos procesos convencionales.
De acuerdo con la presente invención, antes del tratamiento con SCF, la córnea se sumerge en una solución salina, en donde la solución salina es una solución de cloruro de sodio con una concentración de aproximadamente 0,5 a 4 M, como 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 y 4,0 M; preferiblemente, aproximadamente de 1,0 a 3,5 M, como 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4 y 3,5 M; y más preferiblemente, aproximadamente 1,5 M. Preferiblemente, la córnea se empapa en una solución de NaCl 1,5 M, en la que no se añade ningún agente quelante de metal adicional (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), a temperatura ambiente con agitación suave, durante por lo menos 24 horas
Después de tratar con la solución salina, la córnea parece ser opaca o no transparente e hinchada. La condición de este tratamiento con solución salina (por ejemplo, el tiempo de tratamiento y/o la concentración de la sal en el mismo) puede ser fácilmente ajustada por un experto en la técnica de este campo en base a la condición de cada córnea que se sometió a tratamiento, sin experimentación indebida.
Por tanto, un aspecto adicional de la presente divulgación es proporcionar una córnea acelular producida por el método descrito anteriormente. La córnea acelular producida de este modo conserva la integridad de las fibras de colágeno de una córnea nativa y carece de cualquier materia celular que pueda ser inmunogénica para un huésped, por lo que puede servir como un excelente injerto para que las células del huésped, particularmente las células derivadas de la córnea, crezcan sobre ella después trasplante, sin inducir respuestas post-injerto no deseadas a su huésped.
Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente divulgación se dirige a una córnea acelular producida por el método descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece de una enfermedad ocular, en la que el sujeto puede beneficiarse del injerto de la córnea acelular que permite que las células, (por ejemplo, células derivadas de la córnea) crezcan sobre ella y reparar cualquier daño de la córnea como resultado de una enfermedad, una infección o un accidente (por ejemplo, quemaduras químicas).
La córnea acelular de la presente invención puede implantarse en el ojo del sujeto para reparar el daño de la córnea asociado con la afección ocular.
La córnea acelular producida por el método descrito anteriormente es adecuada para su uso como un andamiaje biológico para que las células crezcan sobre ella, por lo tanto, la córnea acelular de la presente divulgación puede precultivarse con células in vitro antes de usarse en trasplante. Las células pueden cultivarse de acuerdo con cualquier técnica de cultivo celular conocida en la técnica. Los ejemplos de células que pueden cultivarse en la misma incluyen, pero no se limitan a, células derivadas de córnea como células endoteliales de córnea, células estromales de la córnea y células epiteliales de la córnea; células madre embrionarias y células madre adultas. Además, las células pueden ser autólogas (es decir, derivadas del huésped que recibe la córnea acelular como un injerto) o alogénicas (es decir, derivadas de un sujeto distinto del huésped).
La córnea acelular, después de cultivarla con células adecuadas, puede trasplantarse a un huésped que padece una afección ocular asociada con un daño de la córnea que requiere un trasplante de córnea. La afección
ocular asociada con un daño en la córnea puede ser el resultado de una enfermedad, una infección o un accidente. De acuerdo con algunas realizaciones, la afección ocular tratable mediante la córnea acelular de la presente invención puede resultar de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de distrofia de Fuchs, queratocono, distrofia corneal en celosía, distrofia mapa-punto-huella, síndrome endotelial iridocorneal, síndrome del nevo del iris (Cogan-Reese), síndrome de Chandler y atrofia del iris esencial, la distrofia de Fuchs se produce cuando se pierden las células endoteliales lo que da como resultado una eliminación ineficaz de líquido del estroma que hace que la córnea se hinche y distorsione la visión; finalmente, la capa epitelial comienza a hincharse, lo que da como resultado una curvatura anormal del globo ocular que da como resultado una mayor distorsión de la visión. El queratocono es un trastorno que da como resultado el adelgazamiento progresivo de la córnea, que se abulta gradualmente hacia afuera dando como resultado una curvatura anormal. Otra enfermedad que puede ser tratada por la córnea acelular de la presente invención es la distrofia en celosía, que da como resultado la acumulación de depósitos de amiloide o fibras proteicas anormales en el estroma que lleva a un aumento de la opacidad que da como resultado una visión reducida. En casos graves, esto puede dar como resultado la erosión de la capa epitelial exterior que da como resultado una condición conocida como erosión epitelial que requiere un trasplante de córnea. La distrofia mapa-punto-huella también se conoce como distrofia de Cogan y es un trastorno degenerado que afecta a la córnea anterior, provocando descubrimientos característicos de la lámpara de la hendidura que lleva a una visión disminuida y/o erosiones corneales recurrentes. El síndrome endotelial iridocorneal es común en mujeres y da como resultado cambios en el color del iris, inflamación de la córnea y desarrollo de glaucoma. El síndrome se define por un grupo de tres condiciones relacionadas denominadas síndrome del nevo del iris; síndrome de Chandler o atrofia esencial del iris. Sin embargo, una característica común de este grupo de enfermedades es la migración de células endoteliales de la córnea al iris. La pérdida de células endoteliales de la córnea da como resultado la hinchazón de la córnea y la distorsión del iris con distorsión de la visión.
En otras realizaciones, la afección ocular asociada con el daño a la córnea está provocada por una serie de agentes patógenos, como una infección viral provocada por el virus del herpes simple; o una infección bacteriana provocada por Chlamydia trachomatis.
En realizaciones adicionales, la afección ocular asociada con el daño a la córnea es el resultado de accidentes, como quemaduras químicas provocadas por agentes químicos a base de ácidos (por ejemplo, ácido muriático, ácido sulfúrico que se encuentra en las baterías) y/o agentes químicos de base alcalina (por ejemplo, cal, limpiadores de hornos, amoniaco). En casos graves, la córnea cicatriza hasta el punto de que la única medida correctiva es el trasplante de córnea.
De acuerdo con un ejemplo ilustrativo de la presente divulgación, la córnea acelular producida por el presente método se aplica directamente a un ojo herido de un animal (es decir, un conejo), en el que el ojo se lesiona hasta el punto que se requiere un trasplante de córnea. En este ejemplo ilustrativo, la córnea acelular no se ha sembrado con células epiteliales. Después de la implantación, el animal sujeto (es decir, el conejo) es capaz de recuperarse por completo (es decir, recuperar la integridad de la córnea herida) en su ojo herido.
La presente invención se describirá ahora más específicamente con referencia a las siguientes realizaciones, que se proporcionan con propósitos de demostración en lugar de limitación. Aunque son típicamente de los que podrían usarse, alternativamente pueden usarse otros procedimientos, metodologías o técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación y caracterización de córnea porcina acelular
1.1 Preparación de córnea porcina acelular (ejemplo de referencia)
El ojo porcino nucleado congelado almacenado a -20° C se descongeló a temperatura ambiente durante menos de 3 minutos antes de sujetarlo y mantenerlo en su lugar mediante un soporte de tejido. La córnea y una parte de la esclerótica se extrajeron del ojo mediante el uso de un trépano (18 mm). La córnea extraída se sumergió en un recipiente (7 cm x 5 cm x 4 cm) que contenía NaCl 1,5 M o solo agua (es decir, sin la adición de ninguna sal, agente quelante o proteasa). El recipiente completado se sometió luego a agitación suave a temperatura ambiente a una velocidad de 100 rpm durante 24 horas, que eliminó la capa de epitelio (aproximadamente 50 pm). En esta etapa, la córnea tratada con NaCl o agua parecía estar hinchada y opaca (es decir, no transparente).
La córnea tratada con NaCl o agua se colocó luego en un soporte de tejido, que luego se insertó en un recipiente de un sistema de ScCO2 (Helix SFE Versión R3U, Applied Separations Inc (Allentown, PA, USA)), en el que había 10 ml de etanol (75%) en el recipiente. El sistema de ScCO2 se hizo funcionar luego a una presión de 12 MPa (120 bar), a 38° C durante 60 min (es decir, un tratamiento con ScCO2 estático y dinámico) para producir córnea acelular.
Luego, la córnea acelular se almacenó esterilizada hasta su uso.
1.2 Preparación de córnea porcina acelular
En este ejemplo, la córnea porcina acelular se preparó de acuerdo con procedimientos similares a los descritos en el ejemplo 1.1, excepto que el sistema de ScCO2 se hizo funcionar a una presión de 35 MPa (350 bar), a 45° C durante 80 min (es decir, un tratamiento con ScCO2 estático y dinámico) para producir córnea acelular.
La córnea acelular obtenida de este modo se almacenó esterilizada hasta su uso.
1.3 Caracterización de la córnea porcina acelular del ejemplo 1.2
La córnea acelular de los ejemplos 1.2 se analizó mediante tinción con hematoxilina y eosina (tinción H&E), tinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), así como análisis SDS-page siguiendo los protocolos estándar.
Los resultados cuantificados de la tinción DAPI indicaron que la córnea normal tenía un nivel relativamente alto de recuentos de ADN, en el que se determinó que la cantidad de ADN era de 37,29 ± 5,3 (ng/mg), mientras que el nivel de ADN en la córnea acelular del ejemplo 1.2 fue simplemente 11,51 ± 0,74 (ng/mg), lo que sugirió que el presente tratamiento con ScCO2 era eficaz para eliminar las materias celulares del tejido de la córnea.
El análisis SDS PAGE también confirmó que las proteínas que permanecieron en la córnea del ejemplo 1.2 después del tratamiento con ScCO2 eran colágenos (FIG 1), en particular, el colágeno de tipo I, como se confirmó por transferencia Western (FIG 2B),.
La FIG. 3 son fotografías de tinción H&E de la córnea del ejemplo 1.2 con un aumento de 40X (panel A) y 100X (panel B), respectivamente. Era evidente que la córnea del ejemplo 1.2 poseía una estructura de fibrillas relativamente intacta, por lo que puede servir como un andamiaje biológico para que las células crezcan sobre ella después del trasplante.
EJEMPLO 2 Regeneración de células adiposas humanas (hADC) en la córnea porcina acelular del ejemplo 1.2
2.1 Aislamiento de hADC
Se aislaron células adiposas humanas (hADC) de tejidos grasos extraídos de pacientes sometidos a cirugía de liposucción. Brevemente, se enjuagaron aproximadamente 50 g de tejido graso con cantidades sobrantes de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar cualquier glóbulo rojo residual. El tejido graso minuciosamente enjuagado se suspendió luego en PBS y se sometió a centrifugación, y se recogió la capa superior. Se repitió la centrifugación una vez y se recogió la capa superior, luego se dividió uniformemente la capa superior recogida en varias porciones. Luego, cada porción del tejido graso se transfirió a otro tubo de ensayo transparente que contenía 40 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), que contenía colagenasa (1 mg/ml), N-acetilcisteína (NAC) (2 mM) y ácido L-ascórbico 2-fosfato (0,2 mM). Los tubos de ensayo se cultivaron a 37° C durante la noche, luego se sometieron respectivamente a centrifugación para eliminar la capa superior que contenía colagenasa. El sedimento de cada tubo se recogió y se cultivó en DMEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, NAC (2 mM) y ácido L-ascórbico 2-fosfato (0,2 mM) al 5% de CO2. Al día siguiente, las células no unidas se enjuagaron con PBS y se añadieron a las mismas 5 ml de K-NAC adicionales. El medio de cultivo se cambió cada dos días hasta que alcanzó la confluencia, lo que llevó aproximadamente 1 semana de tiempo. Las células se recogieron mediante tripsinización y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior.
2.2 La córnea porcina acelular del ejemplo 1.2 soporta el crecimiento de hADCS sobre ella.
Antes de la siembra, la córnea porcina acelular del ejemplo 1.2 se sumergió en una solución de glicerol al 70% que contenía una mezcla de antibióticos (penicilina, estreptomicina y anfotericina B) durante 3 días, se lavó a fondo con PBS, que también contenía la mezcla de antibióticos, luego se sembraron sobre la misma aproximadamente 1x104 de los hADC de ejemplo 2.1, y luego la córnea se cultivó durante 14 días. Se tomaron pequeñas muestras de la córnea los días 1, 3, 7 y 14, respectivamente, y se sometieron a tinción H&E y análisis SEM. En la FIG 4 se muestra un resultado representativo.
Las fotografías SEM en la FIG 4 se toman respectivamente de la córnea acelular del ejemplo 1.2 antes (FIG 4A) y después de sembrar en la misma hADCs durante 7 días (FIG 4B). Es evidente que la córnea porcina acelular del ejemplo 1.2 puede actuar como un andamiaje para soportar el crecimiento de hADCS sobre ella.
Ejemplo 3 Uso de córnea porcina acelular del ejemplo 1.2 en un modelo de trasplante de xenoinjerto de córnea
Se evaluó el efecto de la córnea porcina acelular del ejemplo 1.2 en la reparación de afecciones oculares que requerían un trasplante en un modelo de trasplante de xenoinjerto de córnea.
Con este propósito, los animales usados fueron conejos blancos de Nueva Zelanda (Livestock Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan), y se mantienen en rígido cumplimiuento con las pautas pertinentes sobre el uso de animales en la investigación. Se asigna un ojo aleatoriamente para recibir el injerto de córnea. Se anestesian conejos que pesan entre 2,0 y 3,0 kg mediante inyección intramuscular de 0,5-0,7 ml/kg de cóctel para roedores (100 mg/ml de ketamina, 20 mg/ml de xilacina y 10 mg/ml de acepromacina). Se instilan gotas anestésicas tópicas de clorhidrato de proparacaína (0,5% de Ophthaine, Bristol-Myers Squibb) en el ojo del animal junto con gotas de ciclopentolato (1%, Cyclogyl®, Alcon, Ft. Worth, Texas) y fenilefrina (10,0% CibaVision, Duluth, Ga.) para lograr la máxima dilatación de la pupila. Todas las operaciones se realizan bajo un microscopio quirúrgico. Se creó una lesión de aproximadamente 5 mm en la córnea mediante el uso de los procedimientos DALK (queratoplastia laminar anterior profunda). Luego, se cubrió la herida con la córnea acelular del ejemplo 1.2 (aproximadamente 6 mm de diámetro), que se suturó en la córnea usando sutura de nailon 10-0. Se aplicaron unas gotas para los ojos tópicas que contenían prednisolona al 1% en el ojo 3 veces al día y se continuó durante 7-10 días. Tres semanas después de la cirugía, los ojos se tiñeron con fluoresceína para evaluar la integridad de la córnea. También se tomaron imágenes del ojo, respectivamente, los días 1, 5, 11, 14 y 21. Al final del experimento, los animales se sacrificaron y se tiñeron para detectar células epiteliales recién desarrolladas en la córnea implantada del ejemplo 1.2.
Sorprendente e inesperadamente, se descubrió que el conejo se había sometido a una cirugía DALK y posteriormente se le había implantado la córnea acelular del ejemplo 1.2 era capaz de recuperar la integridad de la córnea, y se descubrió que las células epiteliales recién migradas del área colindante (es decir, el área sin lesión) crecían sobre el injerto de córnea implantado.
Se entenderá que la descripción anterior de las realizaciones se da a modo de ejemplo solamente y que los expertos en la técnica pueden realizar varias modificaciones. La especificación, los ejemplos y los datos anteriores proporcionan una descripción completa de la estructura y el uso de algunos ejemplos ilustrativos de la invención.
Claims (14)
1. Un método ex vivo para producir una córnea acelular que comprende someter una córnea obtenida de un animal al tratamiento de un fluido supercrítico (SCF) en presencia de un cosolvente, en donde el cosolvente es etanol, que se realiza en presencia de 60% de etanol en volumen a una presión de 35 MPa (350 bar) a una temperatura de 45° C durante 80 min, en donde el método se caracteriza por no tener el paso de tratar la córnea con ninguna de una proteasa, una agente quelante, un detergente, un glicerol o una combinación de los mismos, en donde antes del tratamiento con SCF, la córnea se somete al tratamiento de una solución salina que contiene NaCl 0,5-4,0 M durante por lo menos 24 horas.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el SCF es cualquiera de un dióxido de carbono supercrítico (ScCO2), un óxido nitroso supercrítico (ScN2O), un alcano supercrítico, un alqueno supercrítico, un alcohol supercrítico, una acetona supercrítica o una combinación de los mismos.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el SCF es ScCO2 o ScN2O.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el animal del que se obtiene la córnea aislada se selecciona del grupo que consiste de cerdo, vaca, oveja, cabra, conejo, mono o humano.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el animal es un cerdo.
6. Una córnea acelular producida por el método de acuerdo con la reivindicación 1.
7. La córnea acelular de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la córnea se deriva de una córnea de cerdo.
8. La córnea acelular de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de una afección ocular asociada con un daño de la córnea.
9. La córnea acelular para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la córnea acelular comprende además células cultivadas en la misma, en donde las células se seleccionan del grupo que consiste de células endoteliales de la córnea, células estromales de la córnea, células epiteliales de la córnea, células madre embrionarias y células madre adultas.
10. La córnea acelular para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que las células son autólogas o alogénicas.
11. La córnea acelular para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la afección ocular se selecciona del grupo que consiste de distrofia de Fuchs, queratocono, distrofia corneal en celosía, distrofia mapa-punto-huella, síndrome endotelial iridocorneal, síndrome del nevo del iris (Cogan-Reese), Síndrome de Chandlery atrofia esencial del iris.
12. La córnea acelular para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la afección ocular es el resultado de una infección provocada por el virus del herpes simple.
13. La córnea acelular para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la afección ocular es el resultado de una infección provocada por Chlamydia trachomatis.
14. La córnea acelular para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la afección ocular es el resultado de quemaduras químicas.
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