KR101136361B1 - 참당귀로부터 분리된 신규 생리 활성 물질, 이의 추출 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 약학 조성물, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 개선용 건강기능식품 및 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 추출하는 방법에 관한 것이다.

당귀, 치매, 약학 조성물, 건강기능식품, 아세틸콜린에스테라아제

Description

참당귀로부터 분리된 신규 생리 활성 물질, 이의 추출 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물{Novel bioactive substance extracted from Anegelica gigas Nakai, method of extracting the same, and pharmaceutical composition containing the same}

본 발명은 참당귀로부터 분리된 신규 생리 활성 물질, 이의 추출 방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

인구 고령화에 따른 노인성 질환인 만성퇴행성 질환의 유병률과 발생률이 증가하고 있으며 국민건강보험 지출 증대 등 국민의료비의 재정적 부담이 가중되고 있다. 또한 생활수준의 향상과 더불어 건강지향 욕구가 증대되어 대체의약과 자가 치료 지식축적 등의 증가로 인한 건강기능성 식품 시장이 확대되고 있는 상황이다. 특히 치매 관련 질병은 국내 역학조사에서 미국보다 조금 낮지만 여전히 우리에게 무서운 공포의 대상이다. 우리나라에서는 한국보건사회연구원의 98년 치매노인 실태조사 및 관리 대책 보고서에서 고령화 현상으로 인해 치매인구가 급증하여 95년 치매 유병률은 65세 이상 노인 중 8.3%이지만 2020년에는 이보다 0.7% 늘어난 9%가 될 것이라고 밝혔다. 또한 치매 유병률을 통계청이 추계인구에 적용한 결과, 2000 년 치매 노인수는 27만7천명(65세 이상 노인인구의 8.3%), 2015년 52만7천명(9%), 2020년 61만9천명(9%)에 이를 것이라고 밝혔다. 또 치매노인의 증상은 가벼운 경우가 59.2%, 중증인 경우가 27.2%, 아주 심한 경우가 13.6%로 분석됐으나, 치료를 통해 완치되는 환자는 14%에 불과했고, 증세의 단순지연이 20%였으며 66%는 치료가 불가능한 것으로 드러났다. 치매와 같은 정신 및 행동장애로 사망하는 경우가 60% 정도의 증가율을 기록했으며 계속적으로 증가 추세에 있다.

또한 한국의 최근 한 농촌지역을 중심으로 한 연구보고에 의하면 농촌지역 60세 이상의 인구에서 약 21%가 치매양상을 보이고 이 중 63%가 알츠하이머성 치매인 것으로 보고되고 있다. 이러한 사태의 심각성으로 인하여 1907년 Alois Alzheimer에 의해 처음으로 보고된 이래로, 많은 생물학자들이 알츠하이머성 치매의 원인 규명과 치료를 위한 다각적인 노력을 수행하였음에도 불구하고 아직 질환의 발병기전이 알려져 있지 않다. 또한 치매 질환의 치료를 위한 의약품이나 기능성 식품을 개발하기 위하여 여러 가지 연구가 진행되고 있기는 하지만 극히 일부 연구에서 어느 정도 효능을 보이는 정도의 치료제가 있을 뿐이지, 치료효과가 뚜렷한 의약품이 아직까지 개발되고 있지 못하다. 치료제 개발의 예로는 ACh(acetylcholine) 와 관련한 신경기능의 현저한 저하가 치매증에 있어서 기억장해의 원인이라는 발견을 기초로, ACh를 활성화시킴으로써 치매증상을 개선하는 치료제가 개발되고 있다. 지금까지 개발된 ACh 억제제로 타크린, 코그넥스, 도네피질, 리바스티그민 등이 있다. 이들 약품들은 치매를 다스리는 작용기전이 중추신경전달계에 중심적인 역할을 하는 아세틸콜린에스테라아제(AChE)의 활성억제를 통해 신경전달물질인 아세틸콜린(ACh)의 농도를 증가시킴으로써 알츠하이머 질환을 예방 및 치료하는 약제로 알려지고 있다. 그러나 이러한 AChE 억제 약물들은 콜린성 신경이 기능적으로 손상되지 않았을 때 가장 효과적이다. 즉, 이들 약품의 효능은 콜린성 신경 기능의 감퇴와 함께 감소되기 때문에, 경증이나 중등도의 노인성 치매의 초기 단계에만 효과가 있다. 또한, 대부분 말초신경의 콜린성 부작용을 나타내며, 반감기가 짧고, 간독성 등의 심각한 부작용이 있다. 특히 코그넥스는 경구 투여 시, 지각능력 향상을 보이기는 하지만 떨림증, 어지럼증, 간 독성 등의 심각한 부작용을 수반하고 있어 널리 활용되지 못하고 있는 실정이다.

이와 같이 종래의 치매 치료용 조성물의 경우, 그 부작용이 가장 커다란 문제가 되고 있으며, 특히 생약제의 경우 다른 약물에 비하여 부작용이 크게 적은 특징을 보여주고는 있으나 경우에 따라서는 또 다른 부작용이 우려되고 치료효과도 아직까지는 충분하지 않아서 효과적인 임상적 효능의 증진이 필요한 시점이다.

당귀(Anegelica gigas Nakai)는 신농본초경 중품에 수록된 이래 보혈작용과 관련해서 빈혈회복효과, 면역증강작용이 보고 되었고 활혈작용과 관련해서는 혈관수축 억제효과 및 혈소판응집억제, 혈관신생촉진, 항산화 작용, 혈중 알콜농도 감소, 항산화능 및 항혈전 기능, 진통작용, 간기능 보호작용, 항암작용, 중추억제 작용, 혈관이완효과, 미백효과에 대한 연구가 보고 되었다.

당귀는 산형과(Apiaceae) 당귀속(genus Angelica Linnaeus)에 속한 다년생 초본 식물로서 한국에서는 국내에서 흔하게 자생하는 참당귀 (Anegelica gigas Nakai)의 뿌리를 쓰고 있고 중국에서는 중국당귀(Angelica sinensis Diels), 일본 에서는 일본당귀(Angelica acutiloba Kitagawa)의 뿌리를 주로 사용하는데 임상에서는 다빈도로 활용하는 한약 중 하나라고 볼 수 있다.

한국특허등록 제10-0336182호에는 하이드록시신남산 유도체 또는 이를 포함하는 당귀추출물을 함유하는 치매 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0569089호에는 당귀추출물을 포함하는 뇌기능 및 인지 기능 개선 활성을 갖는 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-0804480호에는 당귀 혼합 추출물을 함유하는 기억력 증진 조성물이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 부작용에 대한 우려가 없으며 AChE의 효과적인 억제를 통한 치매환자 특히, 알츠하이머병 환자의 인지능력 개선 효능을 가지는 것으로 알려진 참당귀의 유용성분을 추출 분리하여 치매관련 건강 기능성 식품을 개발하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 참당귀 추출물인 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 기존에 치매 치료제로 알려진 참당귀 추출물인 데커신(decurcin) 성분보다 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성이 더욱 우수한 물질로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 치매 예방 및 치료제로서 이용될 수 있 다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1의 화합물은 참당귀로부터 엷은 갈색 시럽으로서 분리되었으며, 분자식은 C₁₉H₂₀O₆ 이며, 화합물명은 3'(S)-senecioyloxy-4'(R)-hydroxy-3',4'-dihydroxanthyletin 이다 (이후, ANG7으로 통칭함).

상기 화학식 2의 화합물은 참당귀로부터 엷은 갈색 시럽으로서 분리되었으며, 분자식은 C₁₉H₂₀O₆ 이며, 화합물명은 3'(S)-angeloyloxy-4'(R)-hydroxy-3',4'-dihydroxanthyletin 이다 (이후, ANG8로 통칭함).

상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 통상적인 방법에 따라, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염 및 칼슘염과 같은 무기염, 안젤산(angelic acid), 라이신, 에탄올아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민 및 α-토코페롤과의 유기염, 및 트리테르펜 알콜(triterpene alcohol) 또는 식물 스테롤(plant sterols), 예를 들어, 사이클로아테놀(cycloartenol)과의 에스테르(오리자놀(oryzanol)) 등 당업계에 공지된 다양한 약학적으로 허용되는 염의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 당귀의 예로서는 상기 화합물을 함유하는 참당귀(Angelica gigas Nakai)외에도, 일본당귀(Angelica acutiloba Kitagawa), 중국당귀(Angelica sinensis Diels) 등을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 하기 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 또한, 하기 화학식 2의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 2]

참당귀는 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 치매의 예방 및 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로 즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 하기 화학식 2의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

[화학식 2]

한편, 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물은 치매 예방 또는 개선 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 치매 예방 식품 개발을 위하여 본 발명의 ANG7 또는 ANG8 또는 이를 포함하는 당귀 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합 성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 또한, 건조된 참당귀 뿌리를 에탄올에 침지하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계;

상기 추출물을 감압농축하여 증류수와 에틸아세테이트로 분배하여 수용성 분획과 유기분획으로 분리하는 단계;

상기 유기분획을 실리카겔 오픈 칼럼을 이용하여 헥산에서 에틸아세테이트 농도를 점진적으로 높여 용출 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; 및

상기 에틸아세테이트 분획물을 역상 실리카겔 고압액체크로마토그래피(HPLC)를 실시하는 단계를 포함하는, 참당귀로부터 하기 화학식 1의 화합물을 추출하는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 또한, 건조된 참당귀 뿌리를 에탄올에 침지하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계;

상기 추출물을 감압농축하여 증류수와 에틸아세테이트로 분배하여 수용성 분획과 유기분획으로 분리하는 단계;

상기 유기분획을 실리카겔 오픈 칼럼을 이용하여 헥산에서 에틸아세테이트 농도를 점진적으로 높여 용출 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; 및

상기 에틸아세테이트 분획물을 역상 실리카겔 고압액체크로마토그래피(HPLC)를 실시하는 단계를 포함하는, 참당귀로부터 하기 화학식 2의 화합물을 추출하는 방법을 제공한다.

[화학식 2]

본 발명의 일 구현예에 따른 추출 방법에서, 상기 에탄올 추출은 에탄올 95%에서 수행하는 것이 바람직하다. 이는 에탄올 95% 조건이 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성이 가장 높기 때문이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

아세틸콜린 함량의 측정

아세틸콜린의 측정은 Galgani 등(1992, Mar Ecol Prog Ser, (19), p 1-6)의 방법에 의하여 알칼리 히드록실아민(alkaline hydroxylamine)을 가진 o-아실 유도물의 반응을 기초로 측정하였다. 시료를 50㎕를 취하여 1% 히드록실아민 50㎕를 첨가 혼합한 후 HCl을 이용하여 pH를 1.2±0.2로 조절하였다. FeCl₃ (10% in 0.1 N HCl)을 500㎕ 첨가 후 혼합하고 530nm에서 흡광도를 측정하여 아세틸콜린의 활성(ng/mg 단백질)을 측정하였다.

아세틸콜린에스테라아제 효소의 활성 측정

뇌조직에서 아세틸콜린에스테라이제 활성의 측정은 Galgani 등(1992, Mar Ecol Prog Ser, (19), p 1-6)과 Giacobini(1987, Neuropharmacol, (26), 521-530)의 방법을 조합하여 측정하였다. 각 마이크로플레이트 웰에 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 8.0)을 200㎕, 0.01M 디티오니트로벤조산 20㎕, 아세틸콜린에스테라아제 10㎕, 뇌조직 균질물 10㎕을 연속적으로 첨가하고 37℃에서 10분간 반응 후에 기질인 0.1M 아세틸콜린 클로라이드 20㎕를 첨가하고 37℃에서 3분 동안 반응시킨 후 96 웰 마이크로플레이트 리더를 이용하여 412nm에서 흡광도 변화를 5분 동안 관찰하여 아세틸콜린에스테라아제의 활성(unit/min/mg 단백질)을 측정하였다.

모노아민옥시다아제-B 효소의 활성 측정

모노아민 옥시다아제(Monoamine oxidase)-B 활성 측정은 Kalaria 등(1987, Proc Natl Acad, 84, 3521-3525)의 방법에 따라 H₂O₂의 생성능을 기초로 측정하였다. 각 시험관에 100mM Na-Pi 완충액 460㎕, 30mM 소듐 아자이드 용액 70㎕, 뇌조직 균질물 100㎕를 넣은 후 기질 시약인 10mM 벤질아민 70㎕을 넣으면서 37℃ 항온수조에서 30분간 가온시킨다. 그 후 시험관을 꺼내면서 1.8 mM 2,2'-아지노-비스(3-에틸 벤즈티아졸린-6-설폰산) 500㎕을 넣고 5초 후 저온상태로 보관되어 있는 5 유닛의 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 50㎕을 넣고 잘 혼합하였다. 10초가 지난 후 0.75M HCl(5% SDS 함유) 250㎕을 각 시험관에 넣으면서 혼합하고 기질 시약인 10mM 벤질아민을 넣지 않은 blank 대조로 하여 414nm에 흡광도를 측정함으로써 모노아민옥시다아제의 활성(nmol/mg 단백질/ 30min)을 측정하였다.

실험동물

체중이 22g~24g 내외의 5주령 ICR 마우스 30마리를 중앙실험동물에서 구입하 여 온도 23±2℃, 습도 50±5%, 12시간 암/명 사이클 조건을 유지한 사육실에서 AIN-93M 분말사료로 1주간 적응시켰다. 이후 평균 체중이 비슷하게 임의로 10마리씩 세 군으로 나누어 micro ventilation cage system에서 2마리씩 넣고 물과 사료는 무제한 급여하였다. 세 군 중 한 군을 대조군으로, 나머지 두 군을 실험군으로 하여 각각 스코폴라민(scopolamine) 단독 투여군과 5%의 당귀 추출물을 첨가한 식이를 공급한 스코폴라민 투여군으로 나누었다. 실험기간인 10주 동안 식이섭취량은 매일 1회, 체중은 1주일에 한 번 일정시간에 측정하였다.

실험식이

실험식이는 AIN-93M diet를 기본으로 하여 당귀를 표 1과 같이 배합하여 분말 사료를 제조하였다. 당귀는 한국산으로 (강원도 평창군 진부면에서 재배한 원료) 추출하여 동결건조한 후 믹서에 갈아 분말화하여 사용하였다. 탄수화물과 급원으로는 (주)삼양제넥스의 전분과 (주)대정화학의 수크로스를 사용하였으며 단백질 급원으로는 (주)대정화학의 카세인을 사용하였다. 식이 내 3대 열량 영양소인 당, 단백질, 지방의 열량비는 58%, 20%, 22%이고 당귀의 함량은 AIN-93M diet의 단백질과 탄수화물함량비와 비슷하도록 조정하였다.

표 1. 실험식이의 조성(% of diet)

¹⁾AIN-93M-MX

²⁾AIN-93M-VX

시료수집

실험동물을 희생시키기 3일전에 12시간동안 절식시킨 후 모세관으로 안와 채혈하여 채취한 혈장으로부터 트리아실글리세롤을 분석하였다. 실험 종료일에 절식시키지 않은 상태의 실험동물을 에틸 에테르로 가볍게 마취하여 심장에서 전혈을 채혈하였으며 4℃에서 30분 방치 후 3,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈장을 취해 냉동 보관하였다가 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, alkaline phosphatase (ALP), ALT, AST를 측정에 사용하였다. 심장 채혈 후 바로 개복하여 간을 취해 0℃ 생리 식염수로 혈액을 씻어 흡습지에서 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다. 신장과 비장 조직도 간 조직과 같은 방법으로 취하여 막과 지방을 제거한 후 신장은 좌, 우 각각 무게를 측정하였다. 뇌 조직은 간 조직과 같은 방법으로 취하여 무게를 측정한 후 pH 8.0의 트리스 완충액에 넣고 바로 균질화하여 효소 측정을 위해 -70℃에 보관하였다.

시료분석

(1) 식이 섭취량, 체중증가량 및 식이효율

식이 섭취량은 매일 한 번씩 일정한 시간에 측정하였으며 체중은 일주일에 한 번씩 측정하였다.

(2) 혈장 성분 분석

① 중성지질 농도 측정

혈장 중 중성지질 농도는 희생하기 3일전 금식시킨 상태에서 혈액을 채취하여 4℃에서 30분 방치 후 3,000rpm에 10분간 원심 분리하여 혈장에서 중성지질측정용 키트 시약(STANBIO LABORATORY, TX USA)을 사용하여 혈액 자동분석기(ARCO, Biotechnical사, Italy)로 분석하였다.

② 총콜레스테롤 농도 측정

중성지질 농도 측정 방법과 동일하게 혈장을 분리하여 총콜레스테롤 측정용 키트 시약(STANBIO LABORATORY, TX USA)을 사용하여 혈액 자동분석기(ARCO, Biotechnical사, Italy)에서 측정하였다.

③ HDL-콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 농도 측정

혈장 HDL-콜레스테롤과 농도는 각각 HDL-콜레스테롤 측정용 키트 시약(아산제약)을 사용하여 HDL-콜레스테롤 시약 200㎕와 혈장 200㎕를 혼합한 후 실온에 5분간 방치하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 HDL 분획을 준비하였다. 상층액 100㎕와 증류수 100㎕, 표준액 100㎕에 콜레스테롤 발색시약 3㎖을 첨가하여 잘 혼합한 후 37℃에서 5분간 배양시킨 후 60분 이내에 500nm에서 흡광도를 측정하였다.

LDL-콜레스테롤은 위의 혈청 분석치로 다음과 같이 계산하였다.

LDL-콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - (HDL-콜레스테롤 + 1/5×중성지질)

④ Alkaline phosphatase 활성 측정

원심 분리하여 얻은 혈장에서 alkaline phosphatase 측정용 키트 시약(STANBIO LABORATORY, TX USA)을 사용하여 혈액 자동분석기(ARCO, Biotechnical사, Italy)에서 측정하였다.

⑤ AST와 ALT 농도 측정

혈장에서 AST와 ALT 측정용 키트 시약(STANBIO LABORATORY, TX USA)을 사용하여 혈액 자동분석기(SARCO, Biotechnical사, Italy)에서 측정하였다.

⑥ 총 단백질 농도 측정

혈장 중의 총 단백질은 총 단백질 측정용 키트 시약(STANBIO LABORATORY, TX USA)을 사용하여 혈액 자동분석기(SARCO, Biotechnical사, Italy)에서 측정하였다.

⑦ 알부민 농도 측정

혈장 중의 알부민은 알부민 측정용 키트 시약(STANBIO LABORATORY, TX USA) 을 사용하여 혈액 자동분석기(SARCO, Biotechnical사, Italy)에서 측정하였다.

⑧ 총 빌리루빈

혈장 중의 총 빌리루빈은 총 빌리루빈 측정용 키트 시약(STANBIO LABORATORY, TX USA)을 사용하여 혈액 자동분석기(SARCO, Biotechnical사, Italy) 측정하였다.

기억?학습 장애의 유발

마우스의 기억?학습 장애 유발을 위하여 스코폴라민(Sigma, USA) 2mg/kg BW를 복강 투여하였다. 스코폴라민은 무스카린 수용체 저해제(muscarinic receptor antagonist)로 주의력 저하, 기억력 저하를 일으키는 인지능력 저해제로 알려져 있다 (Broks et al. 1998. Neuropsychologia 26: 685-700).

수중미로측정(Water maze test)

수중미로 측정장치는 설치류를 이용하여 공간학습 및 기억력을 측정하는 장비로서 공간학습 및 기억력 측정 연구에서 많이 이용하고 있는 측정 방법이다. 수중 미로로 이용되는 수조는 지름이 180㎝, 높이가 50㎝인 원형수조 안에 물을 약 30㎝ 높이로 채워지게 하였으며 물의 온도는 23±2℃로 맞추었다. 도피대는 직경이 12㎝인 원형 투명 유리병으로 하였고 수면보다 1.5㎝ 낮게 위치시켰다. 수중 미로는 사분면으로 나누어져서 북동(NE), 북서(NW), 남동(SE), 남서(SW)로 구분되고 이 중 북동 사분원의 중심부에 도피대가 놓여지고, 나머지 중 하나가 출발위치로 사용되었다. 실험동물을 수조에 넣어서 도피대에 도달하는 시간을 180초 동안 측정하였다. 만약 흰쥐가 180초 내에 도피대에 도달하지 못하면 꺼내어 도피대에 올려놓고 15초 동안 방치하였다. 다시 30초 후에 흰쥐를 수조에 넣고 도피대에 도달하는 시간을 기록하였다. 1일 2회씩 오전 오후로 나누어 실시하였다. 5일간 훈련을 받았으며(acquisition test) 5일째 마지막 시행이 끝난 후 대조군은 식염수를 복강투여하였으며 스코폴라민 단독투여군과 당귀섭취 후 스코폴라민 투여군에는 2mg/kg 체중의 스코폴라민을 복강투여하였고 투여 30분 후에 훈련방법과 같은 방법으로 도피대에 도달하는 시간을 측정하였으며 5분이상은 측정하지 않았다.

Y-미로측정 (Y-maze test)

약물 투여는 수중미로측정에서와 같은 방법으로 실시하였다. Y-미로측정에 이용되는 기구는 3개의 가지로 구성되어 있으며 가지의 길이는 42㎝, 넓이는 3㎝, 높이는 12㎝이고 세 팔이 접하는 각도는 120°로 하였다. 모든 실험 장치는 검정색 폴리비닐 플라스틱으로 구성되어 있다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 흰쥐를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 이때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점 (실제 변경. actual alternation)씩 부여하였고, 연속으로 들어가지 않으면 점수를 부여하지 않았다. 교차 행동력(spontaneous alternation)은 위의 측정된 점수 를 총 교차한 횟수에서 2를 뺀 수로 나누어 확률로 환산한 값으로 나타내었다 (Sarter et al. 1998. Psycopharmacology 94: 491).

통계방법

실험결과는 SPSS/Windows 14.0을 이용하여 통계 처리하였고 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차를 구하였다. 당귀를 섭취한 세 그룹간의 평균치에 대한 유의성은 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 한 후, Duncan's multiple range test로 변인간의 차이를 검증하였다. 모든 통계적인 유의성은 α=0.05 수준에서 실시하였다.

실시예 1: 참당귀에서 아세틸콜린에스테라아제 저해물질인 ANG7와 ANG8의 분리

건조된 참당귀 뿌리 1 kg (충남금산에서 구입)을 90% 수용성 에탄올 3 L 로 일주일간 침지하여 추출물을 얻었다. 이 추출물을 30℃에서 감압농축하여 에탄올과 물이 제거된 추출물 70 g을 90% 증류수와 에틸아세테이트로 분배하여 수용성 분획과 유기분획(30g)으로 분리하였다. 유기분획을 감압농축하여 얻은 분획물 (10 g)을 실리카겔 오픈칼럼을 이용하여 헥산에서 에틸아세테이트 농도를 점진적으로 높여 용출 분획하여 40% 에틸아세테이트 분획물 156.5 mg을 얻었다. 40% 에틸아세테이트 분획물을 역상 실리카겔 고압액체크로마토그래피(HPLC, 0.05% TFA 완충액, 10~50% 아세토니트릴)를 하여 엷은 갈색 시럽 12 mg (ANG7)과 갈색 시럽 15 mg (ANG8)을 단리하였다.

실시예 2: 추출 조건에 따른 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성 측정

참당귀 추출 조건 탐색을 위해 에탄올 농도를 각각 25%, 50%, 70%, 95% 추출 및 열수 추출을 하여 아세틸콜린에스테라아제 효소 활성을 측정한 결과, 95% 에탄올 조건에서 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성이 가장 높게 나타나 에탄올 95%가 최적 추출조건임을 알 수 있었다 (표 2).

표 2. 참당귀 추출 조건 탐색

실시예 3: 기기분석에 의한 ANG7와 ANG8의 구조결정

상기 실시예 1을 통하여 분리한 물질은 핵자기 공명 (NMR) 분석 (Varian Mercury 400)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, dept, COSY, HSQC, HMBC 스펙트럼을 얻어 구조를 결정하였다.

그 결과는 하기와 같다.

ANG7 [3'(S)-senecioyloxy-4'(R)-hydroxy-3',4'-dihydroxanthyletin]

1) 물성 : 엷은 갈색 시럽

2) 선광도 : [α]_D ²⁰ + 105.1° (c:0.3, MeOH)

3) 분자식 : C₁₉H₂₀O₆

4) ¹H-NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 7.88 (1H, d, J=9.6, H-4), 7.70 (1H, d, J=1.2, H-5), 6.74 (1H, s, H-8), 6.25 (1H, d, J=9.6, H-3), 5.79 (1H, t, J=1.2, H_sene-2), 5.12 (1H, d, J=7.6, H-3'), 4.70 (1H, dd, J=7.6, 1.2, H-4'), 2.19 (3H, d, J=1.2, H_sene-3Me), 1.95 (3H, d, J=0.8, H_sene-4), 1.40 (3H, s, H-2'Me), 1.32 (3H, s, H-2'Me).

5) ¹³C-NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 167.1 (C_sene-1), 163.2 (C-2), 160.3 (C_sene-3) 157.4 (C-7), 156.4 (C-9), 145.8 (C-4), 130.2 (C-5), 123.4 (C-6), 116.5 (C_sene-2), 114.8 (C-10), 114.0 (C-3), 105.0 (C-8), 80.0 (C-2'), 75.7 (C-3'), 67.6 (C-4'), 27.7 (C_sene-4), 26.4 (C-2'Me), 21.7 (C-2'Me), 20.6 (C_sene-3Me).

상기와 같은 분석에 의해, 실시예 1을 통해 참당귀로부터 분리한 활성 물질은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 쿠마린계 화합물로 밝혀졌다.

ANG8 [3'(S)-angeloyloxy-4'(R)-hydroxy-3',4'-dihydroxanthyletin]

1) 물성 : 엷은 갈색 시럽

2) 선광도 : [α]_D ²⁰ + 35.1° (c:0.3, MeOH)

3) 분자식 : C₁₉H₂₀O₆

4) ¹H-NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 7.89 (1H, d, J=9.6, H-4), 7.71 (1H, d, J=1.2, H-5), 6.75 (1H, s, H-8), 6.25 (1H, d, J=9.6, H-3), 6.20 (1H, qq, J=7.2, 1.2, H_angel-3), 5.20 (1H, d, J=7.6, H-3'), 4.73 (1H, dd, J=7.6, 1.2, H-4'), 1.98 (3H, dq, J=7.2, 1.2, H_angel-4), 1.92 (3H, qin, J=1.2, H_angel-2Me), 1.42 (3H, s, H-2'Me), 1.34 (3H, s, H-2'Me).

5) ¹³C-NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 168.3 (C_angel-1), 163.2 (C-2), 157.3 (C-7), 156.4 (C-9), 145.8 (C-4), 140.4 (C_angel-3), 130.2 (C-5), 128.8 (C_angel-2), 123.4 (C-6), 114.9 (C-10), 114.1 (C-3), 105.0 (C-8), 79.8 (C-2'), 76.4 (C-3'), 67.6 (C-4'), 26.4 (C-2'Me), 21.9 (C-2'Me), 20.9 (C_angel-2Me), 16.2 (C_angel-4).

상기와 같은 분석에 의해, 실시예 1을 통해 참당귀로부터 분리한 활성 물질은 상기 화학식 2의 구조를 갖는 쿠마린계 화합물로 밝혀졌다.

실시예 4: 본 발명의 참당귀 추출물과 기존의 아세틸콜린에스테라아제 저해 물질의 활성 비교

본 발명의 참당귀 추출물 ANG7과 기존의 아세틸콜린에스테라아제 저해 물질인 데커신(decurcin), 지실 추출물 및 원지 추출물의 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성을 비교하였다 (표 3).

표 3. 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성 비교

상기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 참당귀 추출물 ANG7이 기존의 아세틸콜린에스테라아제 저해 물질인 데커신보다 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성이 높았다.

실시예 5: 아세틸콜린의 함량 변화

아세틸콜린(ACh)은 뇌조직중에 존재하는 가장 중요한 신경전달물질로 아세틸 CoA와 콜린 아세틸트랜스퍼라아제 (ChAT) 효소의 작용을 받아 합성되며 이것은 다시 AChE 효소의 작용을 받아 아세테이트와 콜린으로 분해된다. 아세틸콜린(ACh) 생성에 미치는 참당귀 추출물 투여 효과를 비교하여 도 13에 제시하였는데 5% 참당귀 추출물 급여군에서 102.7 (ng/mg 단백질)로서 대조군 대비 33.5% 증가하는 경향을 보였다.

실시예 6: 아세틸콜린에스테라아제 효소활성의 변화

아세틸콜린의 합성과 분해에 관련된 효소로는 콜린 아세틸트랜스퍼라아제(ChAT)와 아세틸콜린에스테라아제(AChE)가 있다. 따라서 체내의 신경전달이 원활하게 이루어지려면 ACh 수준에 영향을 미치는 ChAT와 AChE 효소활성이 매우 중요하다. 치매의 50% 이상을 차지하고 있는 노인성 치매 환자의 경우 ChAT가 감소하는 경향을 나타내고 있으며 치매 환자의 치료에 있어 AChE 효소를 억제해 체내의 ACh의 농도를 증가시키는 방법이 이용되고 있다. 따라서 아세틸콜린에스테라아제 효소 활성에 미치는 참당귀 추출 분말 투여 효과를 비교하여 보면 도 14와 같다. 5% 참당귀 추출물 투여군의 AChE 효소 활성은 237.8 (unit/mg 단백질/min)으로서 대조군에 대비 88%로 참당귀 분말 투여에 의한 AChE 효소 활성이 유의적으로 감소하였다.

실시예 7: 모노아민옥시다아제(MAO)-B 효소활성의 변화

MAO는 도파민(dopamine:DA)이나 세로토닌(seritonin,5-hydroxytryptamine: 5-HT), 노르아드레날린(noradrenaline:NA)등 카테콜라민계 신경전달물질을 파괴하는 효소로 알려져 있는데, MAO 효소 중 MAO-B 효소활성에 미치는 참당귀 추출 분말 투여효과를 비교하여 도 15에 제시하였다. 5% 참당귀 추출 분말 투여군의 MAO-B 효소 활성은 10.9(nmol/mg 단백질/min)으로서 대조군에 대비 92.6%로서 5% 참당귀 추출 분말에 의해 MAO-B 효소활성 억제효과가 인정되었다.

실시예 8: 체중 증가 및 사료 효율

실험 기간 10주 동안의 체중 변화, 총 식이 섭취량 및 식이 효율의 결과는 표 4에 나타내었다. 10주 동안의 식이 섭취량은 D5 군이 N과 SC 군보다 유의적으로 낮았지만 체중증가량이나 식이 효율은 유의적인 차이가 없었다.

표 4. 체중 증가, 총 식이 섭취량 및 식이 효율

¹⁾ 식이 효율 = 체중 증가(g)/식이 섭취량(g)

²⁾ N; normal, SC; 스코폴라민 단독투여군, D5; 5% 당귀 섭취 후 스코폴라민 투여군

³⁾ 상이한 윗첨자는 던칸 다중 검정에 의한 군 사이의 유의차를 나타낸다.

⁴⁾ 평균 ± S.D

실시예 9: 체중 및 장기 무게

실험동물의 장기 무게를 조사한 결과는 표 5에 나타내었다. 체중은 세 군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으며 체중 g당 장기 무게는 간이 N군과 SC군의 35.90±2.59g과 38.20±3.65g보다 D5군이 57.63±4.60g으로 유의적으로 높게 나타났다. 나머지 장기에서는 세군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

표 5. 간, 신장, 뇌 및 비장의 무게

¹⁾ 평균 ± S.D

²⁾ 상이한 윗첨자는 던칸 다중 검정에 의한 군 사이의 유의차를 나타낸다

실시예 10: 혈액 분석

혈장 지질 분석 결과는 표 6에 나타내었다. 총콜레스테롤이 D5 군이 193.90 ±36.45mg/dl로 N 군의 148.73±30.57mg/dl 보다 유의적으로 높게 나타지만 다른 혈장 지질 분석 결과에서는 세 군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

표 6. 혈장 지질 농도

¹⁾ 금식

²⁾ AI: 동맥경화지수(Atherogenic Index) = (총 콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤) / HDL-콜레스테롤

³⁾ 상이한 윗첨자는 던칸 다중 검정에 의한 군 사이의 유의차를 나타낸다

⁴⁾ 평균 ± S.D

기타 혈액 생화학적 분석은 표 7에 나타내었다. 분석한 혈액 분석치 모두에서 세 군간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다.

표 7. 총 단백질, 알부민, 알칼리 포스파타아제의 활성, 총 빌리루빈, AST 및 ALT의 혈장 수준

¹⁾ 평균 ± S.D

실시예 11: 수중미로측정(Water maze test)

수중미로 테스트를 이용하여 당귀 섭취가 학습과 기억력에 영향을 미치는지를 검사한 결과를 표 8에 나타내었다. Learning trial을 하루에 2회씩 각 군에 대하여 5일 동안 실시를 하면 대부분의 흰쥐들이 빠른 시간 내에 도피대를 찾아서 머무르게 되는데 이것은 학습을 흰쥐들이 정상적으로 하고 있다는 것을 의미한다. 본 실험에서도 5일째에 대부분의 동물들이 15초 이내에 도피대에 도착하였다. 스코폴라민(2mg/kg BW) 단독 투여 군과 식염수 투여군 또는 당귀 섭취 후 스코폴라민 투여 군에서 도피대를 찾아가는 시간이 식염수 또는 당귀 섭취 후 스코폴라민을 투여한 군보다 스코폴라민을 단독 투여한 군의 도피대 찾는 시간이 유의적으로 증가하였다. 이러한 결과는 당귀가 신경전달물질인 아세틸콜린의 작용을 향상시켜 공간기억력 손상을 억제하는 효과가 있음을 보여주는 것이다 (도 16).

표 8. 수중미로측정의 기억력 시험에서 스코폴라민 처리된 마우스의 수행에 대한 당귀의 긍정적인 효과

¹⁾ 평균 ± S.D

²⁾ 상이한 윗첨자는 던칸 다중 검정에 의한 군 사이의 유의차를 나타낸다

실시예 12: Y-미로측정

Y-미로측정 결과는 표 9에 나타내었다. 총 교차횟수는 스코폴라민 단독 투여군이 38.10±14.54회로 당귀 섭취 후 스코폴라민 투여군의 26.30±9.70 보다 유의적으로 통과 횟수가 높았고 교차행동력에서는 세 군간에 유의적인 차이를 보이지 않았지만 대조군과 당귀섭취 후 스코폴라민 투여군이 68.68±7.80(%)과 58.75±19.23(%)로 스코폴라민 단독 투여군의 52.02±16.26(%)에 비하여 공간 인지력이 향상되는 경향을 보여주었다.

표 9. Y-미로측정에 대한 당귀의 기억력 증진 효과

¹⁾ 상이한 윗첨자는 던칸 다중 검정에 의한 군 사이의 유의차를 나타낸다

²⁾ 평균 ± S.D

본 연구에서 당귀를 섭취한 군의 수중미로의 도피대를 찾는 시간이 유의적으로 감소한 것과 교차행동력이 높은 경향을 보이는 결과는 당귀가 뇌에서 신경절달물질인 아세틸콜린의 작용을 향상시킴으로써 학습과 기억력을 개선해 줄 수 있는 물질로 개발할 만한 가치가 있는 것으로 사료된다.

도 1는 ANG7의 1H-NMR 스펙트럼이다.

도 2는 ANG7의 13C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 ANG7의 gCOSY 스펙트럼이다.

도 4는 ANG7의 gHMBC 스펙트럼이다.

도 5는 ANG7의 gHSQC 스펙트럼이다.

도 6은 ANG7의 ROESY 스펙트럼이다.

도 7은 ANG8의 1H-NMR 스펙트럼이다.

도 8은 ANG8의 13C-NMR 스펙트럼이다.

도 9는 ANG8의 gCOSY 스펙트럼이다.

도 10은 ANG8의 gHMBC 스펙트럼이다.

도 11은 ANG8의 gHSQC 스펙트럼이다.

도 12는 ANG8의 ROESY 스펙트럼이다.

도 13은 아세틸콜린 함량 비교 결과이다.

도 14는 아세틸콜린에스테라아제 효소 활성 비교 결과이다.

도 15는 모노아민 옥시다아제 효소 활성 비교 결과이다.

도 16은 수중미로측정의 기억력 시험에서 스코폴라민 처리된 마우스의 수행에 대한 당귀의 긍정적인 효과를 보여준다.

Claims (8)

1. 삭제
2. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

   [화학식 2]

   
3. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 약학 조성물.

   [화학식 1]

   
4. 삭제
5. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 참당귀 추출물을 함유하는 치매의 예방 및 개선용 건강기능식품.

   [화학식 1]

   
6. 삭제
7. 건조된 참당귀 뿌리를 에탄올에 침지하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계;

   상기 추출물을 감압농축하여 증류수와 에틸아세테이트로 분배하여 수용성 분획과 유기분획으로 분리하는 단계;

   상기 유기분획을 실리카겔 오픈 칼럼을 이용하여 헥산에서 에틸아세테이트 농도를 점진적으로 높여 용출 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; 및

   상기 에틸아세테이트 분획물을 역상 실리카겔 고압액체크로마토그래피(HPLC)를 실시하는 단계를 포함하는, 참당귀로부터 하기 화학식 1의 화합물을 추출하는 방법:

   [화학식 1]

   
8. 건조된 참당귀 뿌리를 에탄올에 침지하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계;

   상기 추출물을 감압농축하여 증류수와 에틸아세테이트로 분배하여 수용성 분획과 유기분획으로 분리하는 단계;

   상기 유기분획을 실리카겔 오픈 칼럼을 이용하여 헥산에서 에틸아세테이트 농도를 점진적으로 높여 용출 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; 및

   상기 에틸아세테이트 분획물을 역상 실리카겔 고압액체크로마토그래피(HPLC)를 실시하는 단계를 포함하는, 참당귀로부터 하기 화학식 2의 화합물을 추출하는 방법:

   [화학식 2]

   

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