KR101084942B1 - 천우슬을 이용한 관절염 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 천우슬 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체는 연골세포에서 관절 연골 파괴에 가장 중추적인 역할을 하는 MMP-13의 발현 저해 효과를 보이며, 토끼 연골조직 배양(rabbit cartilage tissue culture)을 통하여 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 생성 억제효과를 재확인하였고, 최종적으로 이러한 항염증작용을 in vivo 동물모델에서 확인한 바, MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

천우슬, 세스퀴테르펜(sesquiterpene), 연골세포, MMP-13, 항염증, 관절염, 5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one, atractylenoide Ⅰ

Description

천우슬을 이용한 관절염 치료제 {Anti―arthritic agent using Cyathula officinalis}

본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] 중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000

[문헌 2] Zhou et al., Chemical study on Cyathula officinalis Kuan, Journal of Asian Natural Products Research, 7, pp.245-252, 2005

[문헌 3] Okuzumi et al., Structural elucidation of cyasterone stereoisomers isolated from Cyathula officinalis, Organic Biomolecular Chemistry, 3, pp.1227-1232, 2005

[문헌 4] Zhou et al., Glycosides from Roots of Cyathula officinalis Kuan, Journal of Integrative Biology, 47(3), pp.368-374, 2005

[문헌 5] Chen et al., Structural elucidation and antitumor activity of a fructan from Cyathula officinalis Kuan, Carbohydrate Research, 338, pp.1235-1241, 2003

[문헌 6] 약전분과위원회, 제 9개정 대한약전해설서, p.1159, 2008

[문헌 7] Nishikawa et al., Yakugaku Zasshi, 97, pp.515-518, 1977

[문헌 8] Endo et al., Chem . Phram . Bull., 27, pp.2594-2958, 1979

[문헌 9] Pachaly et al., Planta Med., 55, pp.59-61, 1989

[문헌 10] Pei et al., Osteoarthritis Cartilage, 14, pp.749-758, 2006

[문헌 11] Baek et al., Biol. Pharm. Bull. 29, pp.1423-1430, 2006

[문헌 12] Winter et al., Proc. Soc. Exp. Bil. Med. 111, pp.544-547, 1962

[문헌 13] Kim et al., Planta Med. 65, pp.465-467, 1999

[문헌 14] Guingamp et al., Arthritis Rheum. 40, pp.1670-1679, 1997

관절염에는 여러 종류가 있으나, 이중 가장 많은 환자들이 겪는 퇴행성관절염(골관절염, osteoarthritis)은 관절의 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환이다. 이 질환은 주로 노인 인구에 발생하여 삶의 질을 현저히 떨어뜨리는데, 손, 발, 척추와 체중부과를 많이 받는 관절, 즉, 고관절이나, 무릎관절에서 많이 발생한다. 또한, 류마티스성 관절염은 면역체계의 이상으로부터 발병하는 자가면역 질환이다. 이들 관절염증질환의 원인은 서로 다르고, 아직 모든 것이 다 밝혀져 있지 않지만, 질병의 진행을 도우며 악화시키는 매개체(mediator)들에 관하여는 많은 부분이 밝혀져 있다. 즉, 인터루킨-1(interleukin-1) 등의 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine), 에이코사노이드(eicosanoid)(프로스타글란딘(prostaglandins) 및 류코트리엔(leukotrienes)) 및 이들을 다량 생합성하는 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2), 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase) 등의 효소류들이 관련되어 있다. 최종적으로는 이들 매개체들의 작용으로 기질성 금속단백분해효소(matrix metalloproteinase; MMP)가 과발현되고, 이들의 작용으로 결국 연골 및 관절의 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 파괴가 일어나, 질병을 진행시키며 서서히 악화되는데, MMP 중 관절에서는 MMP-13(포유류 콜라겐분해효소(mammalian collagenase))이 가장 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다.

연골의 성분인 ECM은 크게 프로테오글리칸(proteoglycan)과 당단백질(glycoprotein)로 대별할 수 있다. 이것은 관절연골에 있는 연골세 포(chondrocyte)와 염증의 진행에 따라 모이는 활막(synovial membrane)의 섬유아세포 유사 활막세포(fibroblast-like synoviocyte; FLS)에서 생합성되어 세포외로 분비되며, 이들의 turn-over를 위하여 따로 MMP를 생산하여 분비한다. 즉, 이들 세포가 한쪽으로는 ECM을 생합성하며, 한쪽으로는 MMP를 생산하여 이들의 균형을 잡아 관절의 건강과 유연함을 유지한다. 그러나 관절염 상황에서는 위에서 설명한 매개체들의 자극에 의하여 이들 세포로부터 MMP가 높은 농도로 유도 발현되고, 이들이 ECM을 병적으로 공격하여 관절이 서서히 파괴된다.

천우슬(Cyathula officinalis)은 비름과(Amaranthaceae)에 속하는 다년생 초본으로 건조한 뿌리를 약용하며 월경부조의 치료 및 이뇨제로 중국에서 사용되고 있다(중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000). 천우슬의 성분연구로는 Zhou등(Zhou et al., Chemical study on Cyathula officinalis Kuan, Journal of Asian Natural Products Research, 7, pp.245-252, 2005)이 4-[(1-ethoxy-2-hydroxy)ethyl]phenol, 2,3-isoproplylidene cyasterone, 24-hydroxycyasterone, 2,3-isopropylidene isocycasterone, N-[(3,4,5-trimethoxy)phenyl]formamide, 6,7-dimethoxycoumarin, butanedioic acid, p-hydroxybenzoic acid, betavulgarin, daidzin, puerarin, phenyl 1-β-D-glucopyranoside, cyasterone, sengosterone, amarasterone A, precyasterone, isocyasterone 및 makisterone B 등을 분리, 보고하였으며, Okuzumi 등(Okuzumi et al., Structural elucidation of cyasterone stereoisomers isolated from Cyathula officinalis, Organic Biomolecular Chemistry, 3, pp.1227-1232, 2005)이 Cyasterone, 28-Epi-cyasterone 및 25-Epi- 28-epi-cyasterone 등을 분리, 보고하였다. 또한, Zhou등[Zhou et al., Glycosides from Roots of Cyathula officinalis Kuan, Journal of Integrative Biology, 47(3), pp.368-374, 2005)은 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(n-butyl-β-D-glucopyranosiduronate)]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid, 3-O-(methyl-β-D-glucopyranosiduronate)-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic aicd, 3-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid, 3-O-β-D-glucuronopyranosyl oleanolic acid, 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(β-D-glucuronopyranosyl)] oleanolic acid, 3-O-(β-D-glucuronopyranosyl)-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic aicd, 28-O-β-D-glucuronopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl hederagenin, 3-O-[α-L-rhamopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 및 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rahmnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 등을 분리하였고, MDA-MB-231(a human breast cancer cell line)에 대한 세포독성(cytotoxicity)을 측정하여 활성물질로 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(n-butyl-β-D-glucopyranosiduronate)]-28-O-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid와 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-(β-D-glucuronopyranosyl)] oleanolic acid를 보고하였으며, Chen등(Chen et al., Structural elucidation and antitumor activity of a fructan from Cyathula officinalis Kuan, Carbohydrate Research, 338, pp.1235-1241, 2003)은 폴리사카라이드(polysacccharide)인 fructan계열의 화합물을 분리하여 구조를 동정하고 Lewis pulmonary carcinoma cells을 대상으로 항암활성을 측정 하여 보고하였다.

천우슬(Cyathula officinalis)은 국내에서 자생하는 우슬[쇠무릎(Achyranthes japonica Nakai)의 뿌리]과는 완전히 다른 기원의 식물이다(중화인민공화국약전, 중국약전위원회, 1부, p.28, 2000; 약전분과위원회, 제 9개정 대한약전해설서, p.1159, 2008). 우슬의 염증관련 저해작용에 대하여는 여러 논문을 통하여 잘 알려져 있으나, 천우슬에 대해서는 관련된 학술보고 및 특허가 전무하다. 그러므로 천우슬의 염증 억제작용 특히 관절염 억제작용은 현대 과학적으로 증명된 것이 없으며, 작용기전에 대한 보고도 전무하다.

이에 본 발명자들은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체에 의한 관절파괴 저해작용, 관절염의 예방 및 치료 효과 및 그 작용기전에 대해 지속적으로 연구한 결과, 연골세포에서 관절 연골 파괴에 가장 중추적인 역할을 하는 MMP-13의 발현 저해 효과, 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 생성 억제효과를 확인하였고, 토끼 연골조직 배양(rabbit cartilage tissue culture)을 통하여 상기 작용을 재확인 하였으며, 최종적으로 이러한 항염증작용을 in vivo 동물모델에서 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성 분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체는 하기 구조식 (Ⅰ)의 5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one 또는 구조식 (Ⅱ)의 atractylenoide Ⅰ임을 특징으로 한다:

:

본원에서 정의되는 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매에 용해된 상태의 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 분획물은 천우슬의 극성용매 가용 분획물 또는 비극성용매 가용 분획물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 극성용매 가용 분획물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올에 용해된 상태의 분획물을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 비극성용매 가용 분획물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린 또는 부틸렌글리콜, 바람직하게는 헥산 또는 메틸렌클로라이드에 용해된 상태의 분획물을 포함한다.

본원에서 정의되는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환은 급.만성 염증성 질환, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 척추관절병증, 강직성 척추염, 루푸스(Lupus) 관절염, 신경계의 수초탈락 질환, 치근막 질환, 당뇨성 망막변성, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 원추 각막 또는 쇼그렌 증후군, 바람직하게는 급.만성 염증성 질환, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 척추관절병증, 강직성 척추염 또는 루푸스(Lupus) 관절염, 보다 바람직하게는 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염이다.

이하, 본 발명의 천우슬 추출물 및 분획물을 수득하는 방법 및 이로부터 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 분리하는 방법을 상세히 설명한다.

천우슬(Cyathula officinalis)에 추출용매로서 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 클로로포름 또는 이들의 혼합용매를 시료 중량의 1 내지 1000배, 바람직하게는 10 내지 500배(v/w) 가하여 4 내지 40℃, 바람직하게는 10 내지 33℃에서 1 내지 5시간, 바람직하게는 3시간씩 2회 연속 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열추출 등으로 추출한 후, 감압에서 건조하여 본 발명의 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 분획물은 상기에서 얻은 추출물, 바람직하게는 천우슬 에탄올 추출물을 추출물 중량의 0.1 내지 1000배, 바람직하게는 1 내지 500배 부피(v/w)의 물에 현탁시킨 후, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 부탄올을 순차적으로 가하여 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 4회 분획하여 헥산, 메틸렌클로라이드 등의 비극성 용매에 용해된 상태의 비극성 용매 가용 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 용해된 상태의 극성 용매 가용 분획물을 수득할 수 있다.

또한, 천우슬의 뿌리를 물 및 에탄올 혼합용매로 가열추출하는 제 1단계; 수득한 추출물에 클로로포름과 증류수를 가하고 분획하여 클로로포름 가용성 분획물을 수득하는 제 2단계; 클로로포름 가용성 분획물을 클로로포름 : 메탄올 = 15 : 1을 용매로 오픈 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 5개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계에서 수득한 분획을 대상으로 헥산 : 에틸아세테이트 = 4 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 6개의 소분획으로 나누는 제 4단계; 상기 제 4단계에서 수득한 소분획을 대상으로 헥산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 4개의 소분획으로 나누는 제 5단계; 상기 제 5단계에서 수득한 소분획을 대상으로 물 및 메탄올 혼합용매 또는 클로로포름을 용매로 ODS 컬럼 크로마토그래피 또는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하는 제 6단계의 제조공정을 통하여 본 발명의 화합물을 분리정제 할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 천우슬(Cyathula officinalis) 추출 물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물을 함유하는 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물, 분획물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물, 분획물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 유효성분으로 함유하는 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물을 포함하는 조성물은 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물, 분획물 또는 화합물은 MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물, 분획물 또는 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물, 분획물 또는 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 천우슬(Cyathula officinalis) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체는 연골세포에서 관절 연골 파괴에 가장 중추적인 역할을 하는 MMP-13의 발현 저해 효과를 보였으며, 토끼 연골조직 배양(rabbit cartilage tissue culture)을 통하여 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 생성 억제효과를 확인하였고, 최종적으로 이러한 항염증작용을 in vivo 동물모델에서 확인한 바, MMP-13 과다발현에 기인한 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

비교예 1. 국산 우슬 추출물의 제조

경동시장에서 구입한 국산 우슬(Achyranthes japonica Nakai) 100g에 100% 에탄올을 1ℓ가하여 20℃에서 3시간씩 2번 연속적으로 냉침추출한 후, 감압에서 건조하여 국산 우슬 추출물을 5.4g 수득하여 하기 실험예의 비교용 시료로 사용하였다.

실시예 1. 천우슬 추출물의 제조

경동시장에서 구입한 천우슬(Cyathula officinalis) 각각 100g씩에 증류수, 5 내지 100% 수용성 에탄올, 100% 메탄올, 헥산, 메틸렌클로라이드_, 클로로포름, 에틸아세테이트를 1ℓ씩 각각 가하여 20℃에서 3시간씩 2번 연속적으로 냉침추출한 후, 감압에서 건조하여 본 발명의 천우슬 추출물을 수득하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다. 각각의 추출물의 수율은 하기 표 1에 나타내었다.

추출조건	% 수율 (w/w)
증류수 추출물 (CO-W)	15.3%
5% 에탄올 추출물 (CO-5-EtOH)	10.7%
10% 에탄올 추출물 (CO-10-EtOH)	11.4%
25% 에탄올 추출물 (CO-25-EtOH)	13.8%
50% 에탄올 추출물 (CO-50-EtOH)	25.1%
75% 에탄올 추출물 (CO-75-EtOH)	22.0%
100% 에탄올 추출물 (CO-EtOH)	20.9%
100% 메탄올 추출물 (CO-MeOH)	21.9%
헥산 추출물 (CO-hexane)	2.2%
메틸렌클로라이드 추출물 (CO-DCM)	3.5%
클로로포름 추출물 (CO-CF)	4.1%
에틸아세테이트 추출물 (CO-Ethylacetate)	7.2%

실시예 2. 천우슬 극성용매 및 비극성용매 가용 분획물의 제조

상기 실시예 1을 반복하여 수득한 100% 에탄올 추출물(CO-EtOH) 100 g을 물 0.2ℓ에 넣은 후, 분획깔대기에서 각각 0.5ℓ의 헥산, 메틸렌클로라이드, 부탄올로 차례로 3회 분획하여 헥산 분획물(5.4g), 메틸렌클로라이드 분획물(9.2g), 부탄올 분획물(21.7g) 및 나머지 물 분획물(36.2g)을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다. 각각의 분획물의 수율은 하기 표 2에 나타내었다.

추출조건	% 수율 (w/w)
헥산 분획물 (CO-F-hexane)	5.4%
메틸렌클로라이드 분획물 (CO-F-DCM)	9.2%
부탄올 분획물 (CO-F-BuOH)	21.7%

실시예 3. 천우슬로부터 세스퀴테르펜 ( sesquiterpene ) 유도체의 분리 및 동정

천우슬의 뿌리로부터 활성 화합물을 분리하기 위하여 천우슬의 뿌리 6 ㎏을 95% 에탄올 18ℓ로 가열추출하여 에탄올 추출물 1.2 ㎏을 수득하였다. 수득한 에탄올 추출물에 클로로포름 4ℓ과 증류수 2ℓ를 가하고 분획하여 클로로포름 가용성 분획물 10 g을 수득하였다. 활성-추적 분리(Activity-guided separation)기술을 이용하여, 계속적으로 클로로포름 가용성 분획물 10 g을 실리카겔(silica gel) 200 g을 충진제로 사용하고, 유리 분리관(glass column; φ5× 50㎝)을 이용하여, 클로로포름 : 메탄올 = 15 : 1을 용매로 오픈 컬럼 크로마토그래피(open column chromatography)를 실시하여 5개의 분획(Ⅰ~Ⅴ)으로 나누었다. 분획 Ⅱ를 대상으로 헥산 : 에틸아세테이트 = 4 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography; φ3×40㎝)를 실시하여 6개의 소분획(Ⅱ-1 ~ Ⅱ-6)으로 나누었다. 소분획 Ⅱ-2를 다시 헥산 : 에틸아세테이트 = 9 : 1을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(φ3×40㎝)를 실시하여 4개의 소분획(Ⅱ-2-1 ~ Ⅱ-2-4)으로 나누었다. 소분획 Ⅱ-2-2를 80% 메탄올을 용매로 ODS 컬럼 크로마토그래피(φ3×20㎝)를 실시하여 화합물 1을 10 ㎎ 수득하였다. 또한, 소분획 Ⅱ-2-3을 100% 클로로포름을 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(φ3×20㎝)를 실시하여 화합물 2를 17 ㎎ 수득하였다.

화합물 1 - ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 0.77 (3H, s), 1.82 (3H, s), 1.99 (3H, s), 4.61 (1H, s), 4.86 (1H, s) ; ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ : 17.33 (C-15), 22.32 (C-13), 23.14 (C-2), 23.26 (C-12), 29.19 (C-6), 36.78 (C-1 or C-3), 38.20 (C-10), 41.25 (C-1 or C-3), 47.06 (C-5), 57.61 (C-9), 106.95 (C-14), 131.55 (C-7), 142.74 (C-11), 149.08 (C-4), 203.83 (C-8)

화합물 2 - ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ : 0.93 (3H, s, CH₃), 1.89 (3H, d, J=1.2 Hz, CH₃), 4.62 (1H, s, C=CH₂), 4.90 (1H, s, C=CH₂), 5.59 (1H, s, C=CH); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ : 8.46 (C-13), 18.57 (C-14), 22.66 (C-6), 23.00 (C-2), 36.18 (C-3), 38.13 (C-10), 39.10 (C-1), 48.41 (C-5), 107.48 (C-15), 119.16 (C-9), 120.45 (C-11), 147.99 (C-4), 148.09 (C-8), 148.34 (C-7), 171.38 (C-12)

상기 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 문헌(Nishikawa et al., Yakugaku Zasshi, 97, pp.515-518, 1977)과 비교하여 화합물 1은 그 구조를 5α-H-10-β-Selina-4(14),7(11)-dien-8-one으로, 화합물 2는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 문헌(Endo et al., Chem . Phram . Bull., 27, pp.2594-2958, 1979; Pachaly et al., Planta Med., 55, pp.59-61, 1989)과 비교하여 그 구조를 Atractylenoide Ⅰ으로 각각 동정하였다.

참고예 1. 토끼 관절의 연골 조직 배양 및 활성화

Baek등의 방법에 따라(Baek et al., Biol. Pharm. Bull. 29, pp.1423-1430, 2006), 토끼 관절의 연골 조직(rabbit articular cartilage slice)을 잘라내고 complete DMEM 배지에서 14일 동안 배양하였다. 그 후 연골(cartilage)을 잘라 각각 48-웰 플레이트에 넣고, IL-1α 10ng/ml을 처리하여 25일간 배양하였다. 이때, 검체를 여러 농도로 처리하여 배양한 후, 3, 7, 14 및 28일에 상등액을 얻어, 하기 실험예 2에서 사용하였다.

실험예 1. 천우슬의 MMP -13 발현 저해 효과

상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 MMP-13 발현 저해 효과를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다(Pei et al., Osteoarthritis Cartilage, 14, pp.749-758, 2006).

인간 연골육종 세포주(Human chondrosarcoma cell line)인 SW1353(ATCC사)을 10% FBS와 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민이 첨가된 DMEM을 사용하여 배양하였다. 배지 내로 분비되는 MMP-13의 발현을 확인하기 위해서 serum-free DMEM 조건하에서 IL-1β를 10 ng/ml 농도로 처리하고 24시간 경과 후, 상등액을 얻어 다음의 방법과 같이 웨스턴 블랏(western blot)을 시행하여 이들 MMP의 양을 확인하였다. 세포배양 상등액에 트라이클로로아세트산(trichloroacetic acid, Sigma)을 최종농도 15%로 첨가하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음, 상등액을 버리고 아세톤(acetone)을 1 ml 첨가한 후, vortex하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 다시 상등액을 버리고 실온에서 30분 이상 건조시킨 다음, 1X sample buffer를 20 ul 넣고 vortex한 후 3분간 가열하여 10% gel에 전기영동시켰다. PVDF로 1시간 transfer시킨 후, anti-MMP-13 antibody(Sigma, M4052)를 1:5000으로 5% 탈지유(skim milk)에 희석하여 1시간 반응시키고, anti-rabbit antibody(Cell signaling)를 1:2000으로 5% 탈지유(skim milk)에 희석하여 1시간 반응시켰다. ECL 용액(Amersham)을 첨가하여 x-ray film에 감광시켰다.

상기 비교예에서 수득한 국산 우슬 추출물 및 실시예 1 내지 실시예 3에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 화합물들을 각각 SW1353(1×10⁶ cells/well)에 처리한 후, MMP-13의 양을 검정하였고, 그 결과는 blot의 scanning(HP Lajerjet 3052)을 통하여 정량적으로 하기 표 3 및 도 1에 나타내었다.

실험군	농도	% 저해능
증류수 추출물 (CO-W)	200 ug/ml	10.3%
5% 에탄올 추출물 (CO-5-EtOH)	200 ug/ml	15.5%
10% 에탄올 추출물 (CO-10-EtOH)	200 ug/ml	22.3%
25% 에탄올 추출물 (CO-25-EtOH)	200 ug/ml	42.9%
50% 에탄올 추출물 (CO-50-EtOH)	200 ug/ml	60.1%
75% 에탄올 추출물 (CO-75-EtOH)	200 ug/ml	72.4%
100% 에탄올 추출물 (CO-EtOH)	200 ug/ml	98.0%
100% 에탄올 추출물 (CO-EtOH)	50 ug/ml	15.6%
100% 메탄올 추출물 (CO-MeOH)	200 ug/ml	97.7%
100% 메탄올 추출물 (CO-MeOH)	50 ug/ml	12.3%
헥산 분획물 (CO-F-hexane)	50 ug/ml	94.4%
메틸렌클로라이드 분획물 (CO-F-DCM)	50 ug/ml	82.2%
부탄올 분획물 (CO-F-BuOH)	50 ug/ml	32.8%
헥산 추출물 (CO-hexane)	50 ug/ml	98.1%
메틸렌클로라이드 추출물 (CO-DCM)	50 ug/ml	96.7%
클로로포름 추출물 (CO-CF)	50 ug/ml	95.5%
에틸아세테이트 추출물 (CO-Ethylacetate)	50 ug/ml	97.4%
국산 우슬 100% 에탄올 추출물	200 ug/ml	-
화합물 1, [5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one]	20 uM	72.2%
화합물 2, atratylenolide I	20 uM	52.3%
실험 결과는 3회 실험의 평균값으로 나타냄

실험결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 비교예에서 수득한 국산 우슬의 100% 에탄올 추출물은 MMP-13 저해 효과가 전혀 없었던 반면에, 천우슬의 추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용 분획물의 MMP-13의 저해능이 월등히 높음을 확인할 수 있었다. 또한, 천우슬의 비극성 분획으로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체 화합물 1 및 화합물 2가 활성물질임을 확인할 수 있었다. 이 결과는 천우슬의 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물이 관절에서의 ECM의 분해를 억제하여 관절염치료제로 작용할 것이라는 예상이 가능하게 하였다.

실험예 2. 글라이코스아미노글라이칸 및 콜라겐 분해 산물의 측정

상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 MMP 발현 저해에 따른 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)의 양에 미치는 영향을 다음과 같이 확인하였다.

연골 글라이코스아미노글라이칸(Cartilage glycosaminoglycan)의 분해율(degradation)을 측정하기 위하여는 1,9-dimethylene blue 용액을 사용하여 535nm에서 글라이코스아미노글라이칸을 정량하였고, 그 결과를 하기 수학식 1을 이용하여 분해율을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다.

또한, 연골의 콜라겐 분해율을 측정하기 위하여, 상기 참고예 1에서 준비한 배양 21일째의 상등액에 들어 있는 type II 콜라겐 분해 산물(collagen degradation product)을 sircol collagen type II cleavage ELISA assay를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 수학식 1을 이용하여 분해율을 계산하여 하기 표 4에 나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(50 uM)을 사용하였다.

분해율(%)= [IL-1 및 샘플 처리군의 분해량/IL-1 처리군의 분해량]× 100

실험군	농도	% 글라이코스아미노글라이칸의 분해	% 콜라겐의 분해
Control	-	22.7 ± 4.5	30.5 ± 5.1
IL-1-treated	-	100.0 ± 3.1	100.0 ± 4.4
Prednisolone	50 uM	38.1 ± 4.8*	47.1 ± 3.6*
CO-EtOH	1 ug/ml	89.9 ± 7.1	92.6 ± 3.7
	5 ug/ml	77.5 ± 4.1*	82.4 ± 5.3
	20 ug/ml	45.5 ± 3.7*	55.9 ± 3.4*
CO-F-DCM	1 ug/ml	63.6 ± 3.2*	67.8 ± 2.9*
	5 ug/ml	44.9 ± 2.4*	51.7 ± 3.1*
CO-CF	1 ug/ml	68.2 ± 4.4*	69.0 ± 2.1*
	5 ug/ml	50.4 ± 3.7*	49.2 ± 3.7*
화합물 1	1 uM	82.3 ± 4.7*	88.2 ± 5.7*
	10 uM	50.4 ± 5.2*	55.1 ± 2.6*
유의성평가는 IL-1-treated군에 대한 각 실험군을 Student t-test(n = 3)를 실시하여 구하였으며, *p < 0.01로 표시하였다.

실험결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물, 클로로포름 추출물 및 화합물 1은 유의적으로 ECM의 분해를 억제하였고, 관절연골의 분해가 저해되는 결과를 확인할 수 있었다.

실험예 3. 급성염증 동물모델(in vivo)에서의 항염증작용

상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물 및 이로부터 분리한 화합물의 항염증효과를 확인하기 위하여, 급성염증의 모델로써 carrageenan-유도 발 부종(paw edema) ICR 마우스(20-22 g, Orient-Bio 사)를 사용하여 하기와 같이 실험하였다(Winter et al., Proc. Soc. Exp. Bil. Med. 111, pp.544-547, 1962).

천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물을 경구투여하고, 1시간 후, 1% λ-carrageenan(CGN) 용액을 오른쪽 발바닥에 주사하였다. 5시간 후에 발 부종(paw edema)을 물-치환법(water-displacement)으로 측정하였으며, 표 5에 나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(sigma, 5 mg/kg)을 사용하였다.

실험군	용량( mg / kg )	증가된 오른쪽 발 부피( ml )	저해능 (%)
CGN-treated	-	0.153 ± 0.022	-
Prednisolone	5	0.083 ± 0.012	45.8
CO-EtOH	10	0.144 ± 0.038	5.9
	100	0.135 ± 0.027	11.8
	400	0.102 ± 0.018*	33.3
CO-F-DCM	100	0.124 ± 0.032	19.0
	400	0.098 ± 0.020*	35.9
CO-CF	100	0.118 ± 0.028	22.9
	400	0.100 ± 0.019*	34.6
화합물 1	10	0.130 ± 0.037	15.0
	100	0.106 ± 0.017*	30.7
유의성평가는 CGN-treated군에 대한 각 실험군을 Student t-test(n = 3)를 실시하여 구하였으며, *p < 0.01로 표시하였다.

실험결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물, 클로로포름 추출물 및 화합물 1은 급성염증 동물모델에서 유의적으로 항염증작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 만성염증 동물모델( in vivo )에서의 류마티스관절염 억제작용

상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 항염증효과를 확인하기 위하여, 만성염증의 모델로써 열처리된 건조 우락균(Mycobacterium butyricum)을 오른쪽 발바닥에 주사한 웅성의 SD rat(200-220 g, Orient-Bio사)를 사용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim et al., Planta Med. 65, pp.465-467, 1999).

천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물을 매일 경구투여하고, 2차 염증(Secondary inflammation)인 후기 단계(late phase)의 부종(16일째)과 adjuvant를 투여하지 않은 발(왼쪽 발)의 부종을 관절 염증(arthritic inflammation)으로 하여 저해능을 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 양성대조군으로는 Prednisolone(5 mg/kg/day)을 사용하였다.

실험군	용량( mg / kg / day )	16일째, 증가된 왼쪽 발 부피( ml )	저해능 (%)
adjuvant-treated	-	0.177 ± 0.028	-
Prednisolone	5	0.052 ± 0.010*	70.6
CO-EtOH	100	0.167 ± 0.042	5.6
	400	0.103 ± 0.025*	41.8
CO-F-DCM	100	0.143 ± 0.026	19.2
	400	0.090 ± 0.024*	49.2
CO-CF	100	0.157 ± 0.038	11.3
	400	0.129 ± 0.045	27.1
화합물 1	10	0.158 ± 0.042	10.7
	100	0.114 ± 0.026*	35.6
유의성평가는 adjuvant-treated군에 대한 각 실험군을 Student t-test(n = 3)를 실시하여 구하였으며, *p < 0.01로 표시하였다.

실험결과, 표 6에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물, 메틸렌클로라이드 분획물 및 화합물 1은 만성염증 동물모델에서 류마티스성 관절염을 유의적으로 억제하는 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 5.퇴행성관절염모델(in vivo)에서의 퇴행성관절염 억제작용

상기 실시예에서 수득한 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물의 퇴행성관절염 억제활성을 확인하기 위하여, in vivo 동물모델로서 rat model을 사용하여 하기와 같이 실험하였다(Guingamp et al., Arthritis Rheum. 40, pp.1670-1679, 1997).

요오드 초산(Iodoacetic acid) 30 ul을 SD rat(200-220 g, Orient-Bio사)의 오른다리 무릎에 관절강주사로 투여하였다. 천우슬 추출물, 분획물 및 이로부터 분리한 화합물을 5일/week씩 매일 1회 경구 투여하였다. 요오드 초산 투여 4주 후에 rat를 희생시키고 무릎관절을 절개한 후, 조직학적(histology) 방법에 따라 조직을 고정하고, 사프라닌 O(safranin O) 염색한 다음, 현미경 관찰하여 결과를 도 2에 나타내었다.

실험결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 천우슬 100% 에탄올 추출물(300 mg/kg/day) 및 천우슬 메틸렌클로라이드 분획물(100 mg/kg/day)은 in vivo에서 퇴행성관절염 저해작용을 보였고, 관절의 파괴를 억제하였음을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 급성독성실험

식약청의 규정에 따라 급성독성시험을 ICR 마우스를 대상으로 하기와 같이 실시하였다.

상기 실시예 1 내지 실시예 3에서 수득한 천우슬 100% 에탄올 추출물(CO-EtOH, 2 g/kg까지), 천우슬 메틸렌클로라이드 분획물(CO-F-DCM, 1 g/kg까지), 천우슬 클로로포름 추출물(CO-CF, 1 g/kg까지), 화합물 1(5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one, 400 mg/kg까지)을 0.1% 카르복시 메틸 셀룰로오스(CMC)에 녹인 후, 2배씩 희석한 검체를 경구투여하고 3일 동안 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

실험결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 발견되지 않아, 이들은 인체에 안전하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

하기에 본 발명의 천우슬 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 유도체를 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

CO-EtOH 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

CO-F-DCM 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

CO-CF 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

화합물 1(5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one) 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO4,12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

화합물 2(atratylenolide I) 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

CO-EtOH 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

CO-F-DCM 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 MMP-13의 발현 저해능(E: CO-EtOH(200 ug/ml), 1: CO-F-BuOH(50 ug/ml), 2: CO-F-hexane(50 ug/ml), 3: CO-F-DCM(50 ug/ml), 4: 물 분획물(50 ug/ml), Co-1: 5α-H-10-β-selina-4(14),7(11)-dien-8-one, Co-2: atractylenolide I)을 나타낸 도이고,

도 2는 조직 검사 결과(a: Control, b: Iodoacetate-treated, c: CO-EtOH(300 mg/kg/day), d: CO-F-DCM(100 mg/kg/day))를 나타낸 도이다.

Claims (10)

1. 천우슬(Cyathula officinalis)의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매에 용해된 상태의 추출물; 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 또는 에틸아세테이트에 용해된 상태의 분획물; 또는 이로부터 분리한 5α-H-10-β-selina-4(14), 7(11)-dien-8-one 또는 atractylenoide Ⅰ를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 천우슬(Cyathula officinalis)의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매에 용해된 상태의 추출물; 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 또는 에틸아세테이트에 용해된 상태의 분획물; 또는 이로부터 분리한 5α-H-10-β-selina-4(14), 7(11)-dien-8-one 또는 atractylenoide Ⅰ를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 관절염 또는 류마티스 관절염의 예방 및 개선용 건강기능식품.
10. 삭제

Images